CN102038977A - 以opf水凝胶为载体的组织工程化心肌及其制备方法 - Google Patents

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王海滨
刘志强
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Abstract

本发明属于组织工程与再生医学领域，公开了一种以低聚乙二醇延胡索酸酯水凝胶为支架材料的可注射性组织工程化心肌，含有OPF水凝胶和iPS细胞或iPS细胞来源的心肌细胞。具体是将OPF与交联剂加入到PBS溶液；然后加入过硫酸铵溶液和TEMED溶液；再加入含有iPS细胞的PBS悬液，轻轻混匀即可。本发明还公开了组织工程化心肌的制备方法和用途。本发明采用OPF水凝胶作为载体，提高了iPS细胞的滞留率和存活率，对梗死区心脏功能修复效果好；其次，本发明可以注射使用，操作方便；此外，本发明采用iPS细胞作为种子细胞，不存在伦理道德和免疫排斥反应问题。本发明制备方法简单、实施条件温和。

Description

以OPF水凝胶为载体的组织工程化心肌及其制备方法 
技术领域
本发明属于组织工程与再生医学领域，具体涉及一种以低聚乙二醇延胡索酸酯(OPF)水凝胶为支架材料的可注射性组织工程化心肌，以及该组织工程化心肌的制备方法。 
背景技术
缺血性心脏病引起心肌坏死，进而导致心力衰竭，具有很高的发病率和死亡率。干细胞移植能够在一定程度上修复受损心肌组织并改善心脏的功能。然而，注射到心梗部位的细胞滞留率低以及细胞移植后死亡限制了该方法的应用。利用可注射组织工程心肌，将干细胞与可注射性支架材料复合直接注射到心肌损伤部位进行损伤的修复，能有效解决单纯干细胞移植所面临的问题(Wang HB等.J Cell Mol Med 2010；14：1044-55)。目前，已有多种可注射性生物材料被用于携带干细胞进行心梗移植修复的研究，并获得较好的效果，如纤维蛋白胶、胶原、Matrigel等(Ryu JH等.Biomaterials.2005；26：319-26。Laflamme MA等.Nat Biotechnol.2007；25：1015-24。KutschkaI等.Circulation.2006；114(1Suppl)：I 167-73)。 
低聚乙二醇延胡索酸酯(英文名称为：oligo(poly(ethyl ene glycol)fumarate)hydrogels，简称OPF，以下同)是一种具有良好生物相容性与可生物降解能力的新型生物材料。OPF是一种水溶性大单体，由聚乙二醇和延胡索酸酯交替组成，具有很好的亲水性。OPF水凝胶能够携带多种不同的细胞与生长因子，是一种优良的可注射性载体。OPF水凝胶主要应用于软骨、骨与角膜组织工程的研究与应用(Park H等.Biomacromolecules.2009；10(3)：541-6。Guo X等.Biomaterials.2009；30(14)：2741-52。TemenoffJS等.Biomacromolecules.2004；5(1)：5-10。Zhang MW等.Tissue Eng PartC Methods.2010Apr；16(2)：261-7)。本发明人在专利申请《一种基于OPF水凝胶为液态支架的可注射性心肌工程产品》(公开号为：CN101618235A)中公开了利用OPF水凝胶作为液态支架携带胚胎干细胞构建的可注射性组织工 程化心肌，能显著提高心梗大鼠的心脏功能。但是由于胚胎干细胞的应用存在伦理道德以及免疫排斥反应的问题，使其应用受到限制。 
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)具有与胚胎干细胞类似的无限或几乎无限的自我更新能力以及向心肌细胞分化的潜力，而且由于其可以来源于患者本身，因而避免了免疫排斥问题以及伦理问题(YuJ等.Science，2007，318(5858)：1917-1920.)。因而iPS细胞有可能成为组织工程化心肌的细胞来源。 
发明内容
本发明目的在于提供一种以OPF水凝胶为载体的组织工程化心肌。该组织工程化心肌可改善心梗心脏功能。 
本发明另一目的在于提供上述组织工程化心肌的制备方法。 
本发明第三目的在于提供上述组织工程化心肌的用途。 
实现本发明的技术方案如下： 
本发明一种以OPF水凝胶为载体的组织工程化心肌，含有OPF水凝胶和iPS细胞或iPS细胞来源的心肌细胞。 
上述组织工程化心肌，按照如下方法制作：将固态OPF暴露于环氧乙烷中16小时灭菌；然后将OPF与交联剂之间以2∶1的重量比加入到PBS溶液中，混合；然后加入过硫酸铵溶液，加入N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)溶液，搅拌均匀；再加入含有iPS细胞的PBS悬液，轻轻混匀，即得组织工程化心肌；其中所述的PBS溶液、过硫酸铵溶液、TEMED溶液、含有iPS细胞的PBS悬液之间的体积比为19∶3∶3∶5；所述的OPF的终浓度为0.167g/mL；所述的过硫酸铵溶液与TEMED溶液的终浓度为25mM；所述的iPS细胞终浓度为1×107个细胞/mL。 
上述组织工程化心肌中所述的交联剂是指聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)，其分子量大小为1～6kDa。 
上述组织工程化心肌中所述的固态OPF的分子量大小为10kDa。 
上述组织工程化心肌中所述的OPF，按照如下方法制备：将聚乙二醇溶解在甲苯中，共沸蒸馏；然后将聚乙二醇溶解在无水的二氯甲烷中，得聚乙二醇溶液；将富马酰氯和三乙胺逐滴加入到聚乙二醇溶液中，滴加时反应烧瓶维持在0℃，之后室温下搅拌反应物1～2天；然后通过旋转蒸发除去二氯 甲烷，加入乙酸乙酯溶解反应产物；过滤，除去反应中氯离子与三乙胺生成的盐；所得产物在乙酸乙酯中重结晶两次；加入乙醚，将最后纯化的OPF沉淀出来，真空干燥得到固体粉末状的OPF；其中所述的聚乙二醇(PEG)、富马酰氯和三乙胺之间的摩尔比为1∶0.9∶0.9。 
所述的iPS细胞或iPS细胞来源的心肌细胞按照常规方法制备即可。所述的iPS细胞可以是人或动物来源的iPS细胞。所述的动物是指所有动物，如小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马或猴等。也可以是野生动物。 
上述组织工程化心肌的制备方法，按照如下步骤进行：将固态OPF暴露于环氧乙烷中16小时灭菌；然后将OPF与交联剂之间以2∶1的重量比加入到PBS溶液中，混合；然后加入过硫酸铵溶液，加入N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)溶液，搅拌均匀；再加入含有iPS细胞的PBS悬液，轻轻混匀，即得组织工程化心肌；其中所述的PBS溶液、过硫酸铵溶液、TEMED溶液、含有iPS细胞的PBS悬液之间的体积比为19∶3∶3∶5，OPF的终浓度为0.167g/mL，过硫酸铵溶液与TEMED溶液的终浓度为25mM，iPS细胞终浓度为1×107个细胞/mL。 
上述制备方法中所述的固态OPF的分子量大小为10kDa。 
上述制备方法中所述的交联剂是指聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA)，其分子量大小为1～6kDa。 
所述的iPS细胞或iPS细胞来源的心肌细胞按照常规方法制备即可。所述的iPS细胞可以是人或动物来源的iPS细胞。所述的动物是指所有动物，如小鼠、大鼠、猪、牛、羊、马或猴等。也可以是野生动物。 
本发明组织工程化心肌在制备治疗心肌梗死药物上的应用。 
上述应用中所述的心肌梗死是指急性心肌梗死或陈旧性心肌梗死。 
本发明组织工程化心肌的使用方法，将上述所制备的组织工程化心肌注射到心梗部位即可。5～10分钟即可形成固态凝胶。 
与现有技术相比，本发明具有的优点：(1)本发明采用iPS细胞作为种子细胞，不存在胚胎干细胞那样的伦理道德问题，并且由于iPS细胞可来源于患者本身，避免了免疫排斥反应和材料来源困难的的问题；(2)本发明采用OPF水凝胶作为可注射性液态支架，提高了iPS细胞的滞留率和存活率，对梗死区左心室壁起到物理的支撑作用，并最终改善心脏功能；(3)本发明可以注射使用，操作方便，避免心脏停跳、体外循环等操作所带来的风险；(4) 本发明制备方法简单、实施条件温和，为心肌组织工程提供了一种新的方法与手段。 
附图说明
图1.固体粉末状的OPF。 
图2.可注射性组织工程化心肌的光学显微镜图像。(×200) 
图3.大鼠心梗模型的心电图。箭头指示ST段抬高。 
图4.检测心功能(二尖瓣水平短轴切面)的超声心动图；图4A为左心室缩短分数(LVFS)，图4B为左心室射血分数(LVEF)。其中横坐标上PBS表示单纯注射PBS；OPF表示单纯注射OPF水凝胶；PBS+iPS表示PBS携带iPS细胞注射；OPF+iPS表示OPF水凝胶携带iPS细胞注射；纵坐标LVFS表示左心室缩短分数；LVEF表示左心室射血分数；“*”表示与PBS组相比具有显著性差异，p＜0.01；“#”表示与OPF组相比具有显著性差异，p＜0.01；“$”表示与iPS组相比具有显著性差异，p＜0.01。 
具体实施方式
现在以实施例的方式进一步描述本发明。但是应当理解，下面的实施例仅仅是作为例证的，不应以任何方式当作对上述本发明总体的限制。 
除非另有说明，本发明实施例中所涉及的技术都是本领域技术人员熟知的，并在文献中有详细解释。如参见Lanza等.″Principles of TissueEngineering″(2006)；Atala等.″Methods of Tissue Engineering″(2006)。 
实施例1：本发明以OPF水凝胶为载体的组织工程化心肌的制备 
按照如下方法进行： 
(1)OPF的制备： 
将分子量为10kDa的聚乙二醇30g溶解在250ml甲苯中，共沸蒸馏后，将聚乙二醇溶解在250mL无水的二氯甲烷中，得聚乙二醇溶液；在5小时内将富马酰氯(0.3mol)和三乙胺逐滴加入到聚乙二醇溶液中，滴加时反应烧瓶维持在0℃，之后室温下搅拌反应物1～2天；然后通过旋转蒸发除去二氯甲烷，加入500mL乙酸乙酯溶解反应产物；过滤，除去反应中氯离子与三乙胺生成的盐；所得产物在乙酸乙酯中重结晶两次；加入乙醚，将最后纯化的OPF沉淀出来。真空干燥(＜1mmHg)得到固体粉末状的OPF(图1)。纯化的OPF储存在-20℃。 
(2)小鼠诱导多能干细胞(iPS)的制备。按照常规iPS细胞培养的的方法制备，具体方法如下： 
(a)小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonal fibroblast cell，MEF)饲养层的制备：处死孕13～15d的BALB/C小鼠，无菌条件下取胚胎后去其头部和内脏，用PBS缓冲液充分洗涤，并将其剪碎后悬浮于0.25％胰酶溶液中分阶段消化。适时终止消化，吸取上层悬液并离心，收集细胞。台盼蓝拒染法鉴定细胞活力，计数后以5×108个细胞/L重悬于含10％胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)的H-DMEM培养基中，37℃、5％CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养过夜；次日将细胞冻存备用或直接制备为饲养层细胞：用含10mg/L丝裂霉素C的培养基处理MEF 2.5～3h，用PBS缓冲液充分洗涤以去除残留成分；加入含10％胎牛血清的H-DMEM培养基即为MEF饲养层。 
(b)小鼠iPS细胞的培养与扩增：将iPS细胞接种于(a)所得的MEF饲养层，加入含20％胎牛血清、0.1mmol/L β-巯基乙醇、1％非必需氨基酸和1×106U/L白血病抑制因子(LIF)的H-DMEM培养基维持培养；为保持其理想的未分化状态，当iPS细胞集落达到60～70％融合时传代。 
(3)基于OPF水凝胶与iPS细胞的可注射性组织工程化心肌的制备 
将OPF与聚乙二醇-二丙烯酸酯(PEG-DA，2K)以2∶1的重量比混合于380μL的PBS缓冲液中；加入25mM的过硫酸铵溶液60μL，并加入25mM的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺溶液60μL，搅拌均匀；加入100μLiPS细胞悬液(6.0×107个iPS细胞/mL的PBS缓冲液)，使iPS细胞终浓度达到1×107个细胞/mL，轻轻混匀，即得组织工程化心肌。在光学显微镜下观察(图2)可见iPS细胞均匀分布在OPF水凝胶中。 
实施例2：组织工程化心肌移植与心脏功能检测试验 
(1)动物心梗模型的制备： 
用戊巴比妥钠(40mg/kg体重)对实验用S-D大鼠(225-300g左右)进行腹腔麻醉，与动物微量呼吸机连接。行开胸术，剪开心包，充分暴露心脏；在左心耳下缘2mm处，用0-7号丝线缝扎；结扎后左室壁变苍白，室壁运动减弱。心电监护((见图3))见I、II导联的ST段明显抬高，表明冠状动脉梗死动物模型制备成功。 
(2)组织工程化心肌的移植与心脏功能检测 
将步骤(1)中的心梗模型制备成功的S-D大鼠40只，随机分为OPF水凝胶携带iPS细胞注射组、PBS携带iPS细胞注射组、OPF水凝胶注射组、PBS注射组，每组10只。心梗模型制作后1周，按照35mg/kg体重的剂量腹腔注射戊巴比妥钠，将各组大鼠麻醉，与动物微量呼吸机连接；开胸后在心肌缺血处分别进行PBS注射、OPF水凝胶注射、PBS携带iPS细胞注射以及OPF水凝胶携带iPS细胞(实施例1制备)注射。随后关胸，单笼饲养。术后4周对各大鼠心脏进行超声检查，统计心脏功能。 
结果(见图4)与注射PBS的对照组相比，单纯OPF注射、PBS携带iPS注射以及OPF水凝胶携带iPS细胞注射均能显著改善心梗大鼠的心脏功能(p＜0.01)；但是OPF水凝胶携带iPS细胞注射与单纯OPF注射以及PBS携带iPS注射相比，对心功能改善效果更佳(p＜0.01)。说明基于OPF水凝胶与iPS细胞的可注射性组织工程化心肌对心梗心脏的功能修复有更好的效果。 

Claims (10)

1.一种以OPF水凝胶为载体的组织工程化心肌，其特征在于含有低聚乙二醇延胡索酸酯水凝胶和iPS细胞或iPS细胞来源的心肌细胞。
2.按照权利要求1所述的组织工程化心肌，其特征在于按照如下方法制作：将固态低聚乙二醇延胡索酸酯暴露于环氧乙烷中16小时灭菌；然后将低聚乙二醇延胡索酸酯与交联剂之间以2∶1的重量比加入到PBS溶液中，混合；然后加入过硫酸铵溶液，加入TEMED溶液，搅拌均匀；再加入含有iPS细胞的PBS悬液，轻轻混匀，即得组织工程化心肌；其中所述的PBS溶液、过硫酸铵溶液、TEMED溶液、含有iPS细胞的PBS悬液之间的体积比为19∶3∶3∶5；所述的低聚乙二醇延胡索酸酯的终浓度为0.167g/mL；所述的过硫酸铵溶液与TEMED溶液的终浓度为25mM；所述的iPS细胞终浓度为1×107个细胞/mL。
3.按照权利要求2所述的组织工程化心肌，其特征在于所述的交联剂是指聚乙二醇-二丙烯酸酯，其分子量大小为1～6kDa。
4.按照权利要求2或3所述的组织工程化心肌，其特征在于所述的低聚乙二醇延胡索酸酯的分子量大小为10kDa。
5.按照权利要求2所述的组织工程化心肌，其特征在于所述的低聚乙二醇延胡索酸酯的制备如下：将聚乙二醇溶解在甲苯中，共沸蒸馏；然后将聚乙二醇溶解在无水的二氯甲烷中，得聚乙二醇溶液；将富马酰氯和三乙胺逐滴加入到聚乙二醇溶液中，滴加时反应烧瓶维持在0℃，之后室温下搅拌反应物1～2天；然后通过旋转蒸发除去二氯甲烷，加入乙酸乙酯溶解反应产物；过滤，除去反应中氯离子与三乙胺生成的盐；所得产物在乙酸乙酯中重结晶两次；加入乙醚，将最后纯化的低聚乙二醇延胡索酸酯沉淀出来，真空干燥得到固体粉末状的低聚乙二醇延胡索酸酯；其中所述的聚乙二醇、富马酰氯和三乙胺之间的摩尔比为1∶0.9∶0.9。
6.权利要求1或2所述的组织工程化心肌的制备方法，其特征在于所述按照如下步骤进行：将固态低聚乙二醇延胡索酸酯暴露于环氧乙烷中16小时灭菌；然后将低聚乙二醇延胡索酸酯与交联剂之间以2∶1的重量比加入到PBS溶液中，混合；然后加入过硫酸铵溶液，加入TEMED溶液，搅拌均匀；再加入含有iPS细胞的PBS悬液，轻轻混匀，即得组织工程化心肌；其中所述的PBS溶液、过硫酸铵溶液、TEMED溶液、含有iPS细胞的PBS悬液之间的体积比为19∶3∶3∶5；所述的低聚乙二醇延胡索酸酯的终浓度为0.167g/mL；所述的过硫酸铵溶液与TEMED溶液的终浓度为25mM；所述的iPS细胞终浓度为1×107个细胞/mL。
7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的低聚乙二醇延胡索酸酯的分子量大小为10kDa。
8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的交联剂是指聚乙二醇-二丙烯酸酯，其分子量大小为1～6kDa。
9.权利要求1或2所述的组织工程化心肌在制备治疗心肌梗死药物上的应用。
10.按照权利要求9所述的应用，其特征在于所述的心肌梗死是指急性心肌梗死或陈旧性心肌梗死。
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