CN113736730A - 一种培养脐带组织间充质细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
一种培养脐带组织间充质细胞的方法，它涉及细胞培养领域。本发明提供一种采用外泌体培养脐带组织间充质细胞的方法。本发明从脐带组织中获取华通式胶，然后从脐带间充质干细胞获取得到外泌体，利用所获取的外泌体加入到培养基中培养华通式胶，以缩短培养周期，并在短时间内提高细胞数量。本发明应用于脐带组织间充质细胞培养领域。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种培养脐带组织间充质细胞的方法。
背景技术
脐带为新生儿与母体链接的纽带，新生儿出生后废弃的组织，在脐带内含有大量的华通式胶，华通式胶内含有大量的脐带间充质干细胞，脐带间充质干细胞是细胞生物学中干细胞家族中的重要组成成员，其来源于发育早期的胚胎的中胚层和外胚层，其最初在人群的骨髓中发现，主要临床特征为具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床使用越来越引起人群的重视。在体内或体外一定的诱导条件下可分化为脂肪、肌肉、心肌、肌腱、韧带、肝、骨、软骨、内皮等多种人体组织细胞，采用连续传代培养以及冷冻保存的方法可依然具有多向分化的潜能，临床常作为理想组织器官损伤修复，尤其是神经损伤。脐带间充质干细胞具有自我更新、多向分化、造血支持、免疫调控等特点，其临床应用中被重视。对于成人来说，干细胞主要来源于脂肪和骨髓，脂肪干细胞具有来源充足，取材方便，对人体造成的创伤也较小，可反复取材，容易分离，获取细胞量大，也是临床应用的重要种子细胞的来源。临床研究证实，采用间充质干细胞还可以治疗多种血液系统疾病、心血管疾病。间充质干细胞在皮肤修复与再生领域取得了很多进展，干细胞主要通过旁分泌的方式来促进皮肤创伤的修复。由于脐带为新生儿废弃物，并且不存在伦理问题，所以脐带间充质干细胞的获取日益被重视和研究，通过添加外泌体对脐带组织华通式胶进行培养从而能够快速分离出大量脐带间充质干细胞目前很少被研究和报道。
外泌体作为一种由细胞分泌的亚细胞成份，能够参与细胞之间的交流，属于细胞外囊泡的范畴，细胞外囊泡是细胞旁分泌产生的一种亚细胞成份，是一组纳米级颗粒，包括外泌体，微粒，微囊泡，凋亡小体等，外泌体广泛存在于体液中，如血液，淋巴液，脑脊液等。在电镜下呈杯状或双凹圆盘状，直径为30-150nm，具有一定的疏水性，外泌体内含多种蛋白及核酸成分，蛋白质是外泌体发挥功能的重要载体。外泌体是细胞间通讯的基本媒介，因为多种miRNAs、蛋白质、细胞因子都存在于外泌体中，因此外泌体可以通过运输受体与配体或者相关的遗传物质，在长距离或短距离的细胞信号和物质传递中均起重要作用，干细胞来源的外泌体还具有稳定性高、无免疫排斥、归巢效应、剂量和浓度易于控制等优点，正是由于外泌体的这种特殊功能，推断在细胞代谢，培养及冻存过程中能够较好的维持细胞所需的营养和生长环境，保持细胞的干性和活性。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种采用外泌体培养脐带间充质细胞的方法，以缩短培养周期，并在短时间内提高细胞数量。
本发明的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，它是按照以下步骤进行的：
一、脐带组织间充质细胞分离：
采集脐带组织，消毒、清洗后，剪成长度为2～3cm的段，剥离华通式胶，剪碎至1～2mm3的块状，备用；
二、外泌体的制备：
选择P3-P5代的脐带间充质干细胞，使用无血清培养基培养48-72h后，收集培养上清，离心后，经0.45μm无菌滤膜过滤，然后再离心，收集上清得外泌体浓缩液，加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，离心，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，离心，收集固相物，经0.22μL滤膜过滤除菌，得外泌体浓缩液蛋白，-80℃冷藏备用；
三、将步骤一分离得到的华通式胶加入到含有步骤二外泌体浓缩液蛋白的培养基中培养，培养期间每隔3-5天换液一次，共换液2次；所述的含有步骤二外泌体浓缩液蛋白的培养基是由浓度为20～30ml/L的外泌体浓缩液蛋白液、20-25ml/L的血小板裂解液、0.8-1ml/L的低分子肝素钠和1.5-1.8g/L的海藻糖组成；其中，华通式胶与培养基的比例为(2-3)g：(11-15)mL培养基，即完成所述的培养脐带组织间充质细胞的方法。
进一步地，步骤一中所述的脐带组织为病毒检测合格的脐带组织。
进一步地，步骤二中所述的收集培养上清，离心后，经0.45μm无菌滤膜过滤是指：收集培养上清，在转速为1 000-1300×g条件下离心10-15min后，经0.45μm无菌滤膜过滤。
进一步地，步骤二中所述的然后再离心，收集上清得外泌体浓缩液是指：以100000×g转速、4℃的条件下离心40-50min，收集上清得外泌体浓缩液，0.22μL滤膜过滤除菌，于-80℃冷藏备用。
进一步地，步骤二中所述的加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，离心，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，离心，收集固相物是指：加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，以100000×g转速、4℃的条件下离心40-50min，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，以100000×g转速离心40-50min，收集固相物。
进一步地，步骤二中所述的培养上清与蔗糖溶液的体积比为30～40:1.5。
本发明包含以下有益效果：
本发明通过不同成分的培养基对脐带间充质干细胞进行培养，发现含有外泌体成分的培养基培较其他种类的培养基对比，培养后的P0代细胞生长速度快，周期短。
1)外泌体是一种非传统的化学添加物，成份多样化，含有细胞因子的种类多，可促进
细胞的增殖，没有危害，对其纯度可以精确测定，容易把控；
2)本发明获取脐带间充质干细胞的方法能够获取数量较大的脐带间充质干细胞，细胞生长周期短，可用于构建临床用的主细胞库和工作细胞库；
3)外泌体与添加的细胞因子相比，外泌体更能够促进细胞的增殖和扩增；
4)使用干细胞来源的外泌体用于脐带组织间充质细胞培养，安全性高，不含动物源性因子和其它外源成份，可用于临床研究和使用；
5)外泌体来源简单，通过细胞本身获取的外泌体，成分明确，在用到同种细胞本身培养，脐带组织间充质细胞容易适应培养环境，生长比较快，细胞数量多；
6)使用外泌体配制的培养基成本低，成份明确，简单，供临床研究使用的细胞更安全。
附图说明
图1为脐带间充质干细胞形态图。
具体实施方式
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
实施例1
本实施例的一种采用外泌体培养脐带组织间充质细胞的方法，是按照以下步骤进行的：
一、脐带组织间充质细胞分离：
采集病毒检测合格的脐带组织，24h内完成分离制备。在无菌工作台内，将脐带通过体积百分浓度75％的酒精消毒处理，然后用生理盐水清洗2次，将清洗后的脐带剪成长度为2～3cm的段，然后放在平皿内，剥离华通式胶，将华通式胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪碎至1～2mm3的块状；
二、外泌体的制备：
选择P3-P5代的脐带间充质干细胞，使用无血清培养基培养48-72h后，收集培养上清30-40mL，在1 000-1300×g条件下离心10-15min，除去细胞碎片等，再经0.45μm无菌滤膜过滤到超滤离心管中，在4℃，1000-1300×g条件下离心40-50min，收集外泌体浓缩液，加入1500μL质量浓度为300g/L蔗糖的超速离心管中，在4℃，100 000×g条件下离心40-50min，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，在100000×g条件下离心40min，最后将收集的外泌体浓缩液蛋白定量，0.22μL滤膜过滤除菌，于-80℃冷藏备用；
三、细胞的培养方法：
分离后的脐带华通式胶组织块剪碎，与培养基混匀，接种到培养瓶内，培养3-5天换液一次，共换液2次，根据细胞融合度进行传代继续扩增，传代时分别对不同培养基培养的细胞和培养时间进行计算，并按照一定浓度接种至T175培养瓶内，取脐带间充质细胞进行生长曲线测定克隆和分化潜能检测。同样培养方法分别使用含外泌体25mL，血小板裂解液20mL，低分子肝素钠1mL，海藻糖1.5g混匀的培养基中(培养基I)。
将步骤三的培养基替换成：血小板裂解液20mL，低分子肝素钠1mL，海藻糖1.5g，EGF 0.2mg，IGF-1 0.1mg，FGF 0.4mg的培养基(培养基II)；作为对照组一。
将步骤四的培养基替换成：血小板裂解液20mL，低分子肝素钠1mL，海藻糖1.5g的培养基培养(培养基III)；作为对照组二。
将步骤四的培养基替换成：含有血小板裂解液20ml，低分子肝素钠1ml的培养基中培养(培养基IV)；作为对照组三。
实施例1与对照组的脐带组织间充质细胞培养结果如下表1所示。
表1不同培养基培养脐带间充质干细胞生长周期对比
| 培养基 | 生长周期(天) | 获取的细胞数量(*10<sup>6</sup>) |
| 培养基I | 9.5±0.21 | 8.38 |
| 培养基II | 11.2±0.19 | 7.10 |
| 培养基III | 15.2±0.13 | 6.34 |
| 培养基IV | 18.4±0.48 | 6.28 |
由表1可知，本实施例采用外泌体培养间充质细胞能够有效缩短P0代脐带组织间充质细胞培养生长周期，并在短周期内获得数量较多的脐带组织间充质细胞。
表2脐带间充质干细胞克隆形成数量
按照每个克隆细胞团的细胞数量大于等于15个单个细胞计算，其中不同添加物的培养基形成的克隆团和每个细胞团内细胞数不同，可推断不同添加物的培养基培养的细胞的增殖功能不同。
表3脐带间充质细胞分化潜能定量检测(单位：590nm OD)
不同培养基培养的间充质干细胞均有较强的分化功能。对分化后的细胞镜下观察和通过在590nm波长下检测成骨，成脂，成软骨分化后的吸光度值表明，不同培养基培养的细胞分化功能略有不同。
综上，上述实施例通过不同成份的培养基对脐带间充质干细胞进行培养，发现含有外泌体成份的培养基培较其他种类的培养基对比，培养后的脐带间充质干细胞生长速度快，周期短。
Claims (6)
1.一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于它是按照以下步骤进行的：
一、脐带组织间充质细胞分离：
采集脐带组织，消毒、清洗后，剪成长度为2～3cm的段，剥离华通式胶，剪碎至1～2mm3的块状，备用；
二、外泌体的制备：
选择P3-P5代的脐带间充质干细胞，使用无血清培养基培养48-72h后，收集培养上清，离心后，经0.45μm无菌滤膜过滤，然后再离心，收集上清得外泌体浓缩液，加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，离心，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，离心，收集固相物，经0.22μL滤膜过滤除菌，得外泌体浓缩液蛋白，-80℃冷藏备用；
三、将步骤一分离得到的华通式胶加入到含有步骤二外泌体浓缩液蛋白的培养基中培养，培养期间每隔3-5天换液一次，共换液2次；所述的含有步骤二外泌体浓缩液蛋白的培养基是由浓度为20～30ml/L的外泌体浓缩液蛋白液、20-25ml/L的血小板裂解液、0.8-1ml/L的低分子肝素钠和1.5-1.8g/L的海藻糖组成；其中，华通式胶与培养基的比例为(2-3)g：(11-15)mL培养基，即完成所述的培养脐带组织间充质细胞的方法。
2.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤一中所述的脐带组织为病毒检测合格的脐带组织。
3.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤二中所述的收集培养上清，离心后，经0.45μm无菌滤膜过滤是指：收集培养上清，在转速为1000-1300×g条件下离心10-15min后，经0.45μm无菌滤膜过滤。
4.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤二中所述的然后再离心，收集上清得外泌体浓缩液是指：以1 000-1300×g转速、4℃的条件下离心40-50min，收集上清得外泌体浓缩液。
5.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤二中所述的加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，离心，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，离心，收集固相物是指：加入质量浓度为300g/L蔗糖溶液混匀后，以100000×g转速、4℃的条件下离心40-50min，弃上清，取沉淀，加PBS稀释，以100000×g转速离心40-50min，收集固相物。
6.根据权利要求1所述的一种培养脐带组织间充质细胞的方法，其特征在于步骤二中所述的培养上清与蔗糖溶液的体积比为30～40:1.5。
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