CN111500525B - 一种组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种组合物及其应用，利用组合物制备培养基用于诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，本发明通过筛选活性组分，优化组分配比，向分化的细胞加入GSK3‑beta抑制剂、Nodal激活剂、BMP激活剂、BMP抑制剂和Hedgehog激活剂，诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，过程简洁高效，阳性细胞含量高，降低了细胞分化所需的成本，用于药物研发和再生医学治疗相关研究和应用，应用前景广阔。

Description

一种组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种组合物及其应用，尤其涉及一种组合物及其用于制备诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞的细胞培养基的用途。
背景技术
肝脏是人体最大的器官和腺体，承担着重要的内分泌和外分泌功能。目前肝脏疾病有着较高的致病率和致死率。根据2014年的报道，全球的肝病患者多于13亿，而且我国的肝病患者多达3亿。肝脏疾病包括病毒性肝炎，酒精性脂肪肝炎和非酒精性脂肪肝炎。终末期的肝病(肝硬化，肝癌)是不可逆的。而且临床上，尚未发现有效药物治疗肝硬化和肝癌。以上原因导致了肝病致死率较高。
目前，治疗终末期肝病的有效方法为肝移植。但是肝移植受限于供体的短缺和机体的免疫排斥反应。研究者主要采取两种手段，以减少来源短缺的问题。一方面，研究者使用肝细胞移植代替肝移植，使得操作更简单、使用的时机更灵活。然而，原代肝细胞不但难以在体外扩增，更是难以维持代谢功能。于是，研究者尝试使用干细胞来源的肝前体细胞(hepatic progenitor cell)或者肝样细胞(hepatocyte-like cell)替代原代肝细胞，将其用于治疗肝损伤。其中，肝前体细胞具有增殖能力和肝胆双向分化的潜能。因此，移植肝前体细胞治疗肝脏疾病逐渐成为再生医学领域的研究热点。
获取肝前体细胞主要包括以下方法：从肝脏中提取获得；将干细胞分化为肝前体细胞。受限于肝脏的来源短缺，难以获取到足够的原代肝前体细胞用于临床治疗。因为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stemcell，iPSC)具有无限增殖和多向分化的潜能，所以将其分化为肝前体细胞将能够解决来源短缺的问题。
肝前体细胞的分化可分为两个阶段，定型内胚层诱导(definitive endoderminduction，DE induction)和肝特化阶段(hepatic differentiation)。定型内胚层的诱导过程中，Wnt，Activin/Nodal，PI3K等信号通路起着关键的调控作用。肝特化阶段主要依赖于BMP和FGF信号通路。
虽然使用生长因子将干细胞分化为肝前体细胞的技术已日渐完善，但是生长因子的大量使用使得分化的成本高昂。此外，生长因子在长期存放的过程中容易失活，影响实验的可重复性。以上原因阻碍了干细胞来源的肝前体细胞在临床的大量使用。
因此，本领域亟需建立一种新的、高效的、基于小分子化合物的分化方案，降低干细胞分化为肝前体细胞的成本。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种组合物及其应用，通过向分化的细胞加入所述组合物，诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，简洁高效快速，降低了细胞分化所需的成本，可用于药物研发和再生医学治疗相关研究和应用，应用前景广阔。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包括基础培养基，所述组合物还包括GSK3-beta抑制剂、Nodal激活剂、BMP激活剂、BMP抑制剂、Hedgehog激活剂或血清替代物中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，发明人在长期科研实践过程中，为解决现有技术诱导人多能干细胞分化肝前体细胞的缺点，通过筛选活性组分，优化组分配比，向分化的细胞加入GSK3-beta抑制剂，Nodal激活剂，BMP激活剂，BMP抑制剂，Hedgehog激活剂，诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，过程简洁高效，阳性细胞含量高，降低了细胞分化所需的成本，用于药物研发和再生医学治疗相关研究和应用，应用前景广阔。
优选地，所述基础培养基包括RPMI 1640、Dulbecco's Modified Eagle Medium、Ham’s F12、DMEM/F12、Ham's F-12K Medium，HepatoZYME-SFM、William’s E Medium、Waymouth’s Medium或Hepatocyte Culture Medium中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述GSK3-beta抑制剂包括CHIR99021HCL、CHIR99021或BIO中的任意一种或至少两种的组合，优选为CHIR99021HCL。
优选地，所述CHIR99021HCL的浓度为0.5-4.5μM，例如可以是0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM或4.5μM。
最终培养基中CHIR99021HCL的浓度为0.5-4.5μM，例如可以是0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM或4.5μM。
优选地，所述Nodal激活剂包括IDE1和/或IDE2。
优选地，所述IDE1的浓度为0.5-4μM，例如可以是0.5μM、1μM、2μM、3μM或4μM。
最终培养基中IDE1的浓度为0.5-4μM，例如可以是0.5μM、1μM、2μM、3μM或4μM。
优选地，所述BMP激活剂包括异甘草素、4-羟基查耳酮或kartogenin中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述BMP激活剂的浓度为1-20μM，例如可以是1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM或20μM。
最终培养基中4-羟基查耳酮的浓度为1-20μM，例如可以是1μM、2μM、4μM、6μM、8μM、10μM、12μM、14μM、16μM、18μM或20μM。
优选地，所述BMP抑制剂包括dorsomorphin 2HCl、dorsomorphin或LDN-193189中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述BMP抑制剂dorsomorphin 2HCl的浓度为0-1μM，例如可以是0μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM或1μM。
最终培养基中dorsomorphin 2HCl浓度为0-1μM，例如可以是0μM、0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM或1μM。
优选地，所述Hedgehog激活剂包括Smoothened Agonist HCl；
优选地，所述Hedgehog激活剂的浓度为0.2-1μM，例如可以是0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM或1μM。
最终培养基中Smoothened Agonist HCl浓度为0.2-1μM，例如可以是0.2μM、0.4μM、0.6μM、0.8μM或1μM。
优选地，所述血清替代物包括不含胰岛素的B27和/或含胰岛素的B27。
优选地，所述血清替代物的体积浓度为0-3％，例如可以是0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％或3％。
最终培养基中使用的小分子化合物见表1。
表1小分子化合物的中英文名称及其CAS编号
Figure BDA0001963302740000041
Figure BDA0001963302740000051
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的组合物用于制备诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞的细胞培养基的用途。
优选地，所述人多能干细胞包括人胚胎干细胞系和人诱导多能干细胞系。
优选地，所述人胚胎干细胞系包括WA01(H1)和/或WA09(H9)。
优选地，所述人诱导多能干细胞系包括UiPSC-013(UC-013)和/或UiPSC-015(UC-015)。
所述肝前体细胞是由多能干细胞分化获得表达甲胎蛋白(AFP)和HNF4α的细胞，其具有向肝实质细胞分化的潜能。
本发明提供的肝前体细胞，是由人干细胞分化获得表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)，甲胎蛋白(AFP)，肝细胞核因子4α(HNF4α)的肝前体细胞，其能够在体外分化为肝细胞和胆管细胞，也能够在体内修复免疫缺陷小鼠的受损肝脏。
第三方面，本发明提供一种诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞的细胞培养基，所述细胞培养基由第一方面所述的组合物制备得到。
优选地，所述细胞培养基包括内胚层诱导培养基Ⅰ、内胚层诱导培养基Ⅱ、内胚层诱导培养基Ⅲ或肝前体细胞诱导培养基中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述内胚层诱导培养基Ⅰ含有体积浓度为0-3％的不含胰岛素的B27、1-4.5μM的CHIR99021HCL、0.5-4μM的IDE1、1-20μM的异甘草素和基础培养基。其中不含胰岛素的B27的含量优选为1％-2％，尤其优选为2％；CHIR99021HCL的浓度优选为2-4μM，尤其优选为3μM；IDE1的浓度优选为0.5-2μM，尤其优选为1μM；异甘草素的浓度优选为1-5μM，尤其优选为2.5μM。
优选地，所述内胚层诱导培养基Ⅱ含有体积浓度为0-3％的不含胰岛素的B27、0.5-3μM的CHIR99021HCL、0.5-4μM的IDE1，1-20μM的异甘草素和基础培养基。其中不含胰岛素的B27的含量优选为1％-2％，尤其优选为2％；CHIR99021HCL的浓度优选为0.5-2μM，尤其优选为1μM；IDE1的浓度优选为0.5-2μM，尤其优选为1μM；异甘草素的浓度优选为1-5μM，尤其优选为2.5μM。
优选地，所述内胚层诱导培养基Ⅲ含有体积浓度为0-3％的不含胰岛素的B27、0.5-3μM的CHIR99021HCL、0.5-4μM的IDE1，0-1μM的dorsomorphin 2HCl和基础培养基；其中不含胰岛素的B27的含量优选为1％-2％，尤其优选为2％；CHIR99021HCL的浓度优选为0.5-2μM，尤其优选为1μM；IDE1的浓度优选为0.5-2μM，尤其优选为1μM；dorsomorphin 2HCl的浓度优选为0-0.5μM，尤其优选为0.2μM。
优选地，所述肝前体培养基含有体积浓度为0-3％的B27、1-20μM的异甘草素、1-20μM的4-羟基查耳酮、0-2μM的Smoothened Agonist HCl和基础培养基。其中B27的含量优选为1％-2％，尤其优选为2％；异甘草素的浓度优选为2-10μM，尤其优选为2.5μM；4-羟基查耳酮的浓度优选为2-10μM，尤其优选为2.5μM；Smoothened Agonist HCl的浓度优选为0-1μM，尤其优选为0.5μM。
其中，其中内胚层诱导培养基的基础培养基优选为RPMI 1640；肝前体培养基的基础培养基优选为HepatoZYME-SFM。
第四方面，本发明提供一种诱导多能干细胞分化为肝前体细胞的方法，采用如第三方面所述的细胞培养基。
作为优选技术方案，一种诱导多能干细胞分化为肝前体细胞的方法，具体包括如下步骤：
(1)使用内胚层诱导培养基Ⅰ，培养多能干细胞；
(2)使用内胚层诱导培养基Ⅱ，培养步骤(1)获得的细胞；
(3)使用内胚层诱导培养基Ⅲ，培养步骤(2)获得的细胞；
(4)使用肝前体细胞诱导培养基，培养步骤(3)获得的细胞，获得肝前体细胞；
(5)检测分析获得的肝前体细胞；
优选地，步骤(5)所述检测分析的方法为：采用荧光定量PCR、免疫荧光或者流式细胞术检查肝前体细胞标志物的表达；
优选地，所述肝前体细胞标志物包括AFP、HNF4α或EPCAM中的任意一种或至少两种的组合。
上述方法中，使用内胚层诱导培养基Ⅰ培养人多能干细胞24小时；上述方法中，使用内胚层诱导培养基Ⅱ培养步骤(1)获得的细胞48小时；上述方法中，使用内胚层诱导培养基Ⅲ培养步骤(2)获得的细胞24小时；上述方法中，使用肝前体细胞诱导培养基培养步骤(3)获得的细胞5天。
本发明中，发明人在第一方面所述组合物的基础上，针对诱导多能干细胞分化为肝前体细胞的技术难点和细胞生长分化的营养需求，配制得到四种培养基，分别在不同阶段采用不同培养基，各培养基与培养时间相互配合，协同增效，过程简洁高效，阳性细胞含量高，降低了细胞分化所需的成本，用于药物研发和再生医学治疗相关研究和应用，应用前景广阔。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本申请所述的基于组合物制备的细胞培养基的诱导方法可在9天使人多能干细胞分化为人肝前体细胞，且诱导效率在80％以上；诱导的肝前体细胞可进一步分化为肝细胞或胆管细胞；诱导的肝细胞能够表达肝细胞的标志基因和蛋白，能够表达P450酶系代谢药物，也能够储存糖原；提高人干细胞向肝前体细胞的分化效率，诱导方案能够降低分化的成本，为日后临床使用干细胞来源的肝前体细胞奠定基础。
附图说明
图1为本发明的分化过程中细胞的形态变化图；
图2(A)为本发明的诱导的肝前体细胞表达相关的标志基因的定量RT-PCR图；
图2(B)为本发明的诱导的肝前体细胞表达标志蛋白甲胎蛋白(AFP)的流式细胞术图；
图2(C)为本发明的肝前体细胞同时表达标志蛋白AFP和肝细胞核因子4α(HNF4α)的免疫荧光图；
图3(A)为本发明的肝细胞同时表达标志蛋白白蛋白(ALB)和α-抗胰蛋白酶(AAT)的免疫荧光图；
图3(B)为本发明的肝细胞具有糖原储存，吲哚菁绿(ICG)摄入和低密度脂蛋白(LDL)摄入的能力的结果图；
图3(C)为本发明的肝细胞表达相关的标志基因的定量RT-PCR图；
图3(D)为本发明的肝细胞能够表达白蛋白的ELISA实验结果图；
图3(E)为本发明的肝细胞有CYP3A4的活性的质谱结果图；
图3(F)为本发明的肝细胞有CYP2C9的活性的质谱结果图；
图3(G)为本发明的细胞有CYP2D6的活性的质谱结果图；
图4(A)为本发明的胆管细胞表达相关的标志基因的定量RT-PCR结果图；
图4(B)为本发明的胆管细胞同时表达标志蛋白肌动蛋白微丝(F-ACTIN)和细胞角蛋白19(CK19)的免疫荧光图；
图5(A)为本发明的流式分选EPCAM+，C-KIT-细胞用于移植的结果图；
图5(B)为本发明的移植7天后，可于小鼠肝脏检测表达人白蛋白的肝细胞的结果图；
图6为本发明的完整实验流程图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
定义
胚胎干细胞：源于早期胚胎中内细胞团的初始未分化细胞，可在体外“无限制地”自我更新，并具有向三胚层细胞分化潜能的干细胞；本发明主要指人胚胎干细胞系H1，编号WA01和H9，编号WA09。
诱导多能干细胞：一类通过细胞重编程技术人工诱导获得、具有类似胚胎干细胞特性的干细胞；本发明主要指尿液细胞重编程获得的诱导多能干细胞UC-013，编号UiPSC-013和UC-015，编号UiPSC-015。
多能干细胞：能够分化成多种类型细胞的干细胞；本发明主要指胚胎干细胞和诱导多能干细胞。
基础培养基：能够支持细胞生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。基础培养基能够提供细胞所需的碳水化合物、氨基酸、维生素、微量元素和水等几大类物质；可以用于本发明的基础培养基包括但不限于RPMI1640，Dulbecco's Modified EagleMedium，Ham’s F12，DMEM/F12，Ham's F-12K Medium，HepatoZYME-SFM，William’s EMedium，Waymouth’s Medium，Hepatocyte Culture Medium；其中，内胚层诱导培养基优选为RPMI 1640；肝前体细胞诱导培养基优选为Hepatozyme-SFM。
小分子化合物：主要指化学合成物质，通常分子量小于1000；本发明所用的小分子化合物主要指GSK3-beta抑制剂，BMP抑制剂，Nodal激活剂，BMP激活剂，Hedgehog激活剂。
GSK3-beta抑制剂：指能够抑制GSK3β信号通路的化合物，包括但不限于CHIR99021HCL、CHIR99021、BIO。
BMP抑制剂：指能够抑制BMP信号通路的化合物，包括但不限于dorsomorphin2HCl，dorsomorphin，LDN-193189。
Nodal激活剂：指能够激活Nodal信号通路的化合物，包括但不限于IDE1，IDE2。
BMP激活剂：指能够激活BMP信号通路的化合物，包括但不限于异甘草素、4-羟基查耳酮、kartogenin。
Hedghog激活剂：指能够激活Hedgehog信号通路的化合物，包括但不限于Smoothened Agonist HCl。
通用方法
1)人多能干细胞冻存和复苏
细胞长至80％-90％汇合度时，吸走培养基，使用RPMI1640培养基洗涤2次，加入适量的恢复至室温的Accutase，37℃消化；显微镜下观察，细胞部分脱落或者细胞间隙变大时，吸走Accutase，加入RPMI1640培养基轻柔地吹打，使细胞全部脱落；将细胞转移至15mL离心管，200g，离心4min；弃去上清后，加入1mL冻存液CS10重悬；加入适量冻存液，使细胞密度为2×106-107/mL，加入终浓度为5μM的Y27632充分混匀后，分装至冻存管，每管500μL，管壁上标记细胞种类、代数和冻存时间；将细胞放置恢复至室温的程序降温盒，-80℃过夜，细胞转移至液氮罐长期保存。
复苏干细胞前，使用体积浓度为1％的Matrigel工作液包被培养板，于37℃放置至少1小时；将细胞从液氮罐中取出，待液氮挥发后，置于37℃水浴锅晃动冻存管使细胞快速溶解；将细胞从冻存管转移至15mL离心管，逐滴滴加培养基，同时轻轻晃动离心管，使培养基于细胞充分混匀；加入培养基至5-6mL，200g，离心4min；去除上清，加入1mL mTeSR重悬细胞；加入适量的培养基至细胞密度达到实验要求，加入终浓度为5μM的Y27632，将细胞种植于培养板中，在37℃，5％CO2条件下培养。
2)人多能干细胞培养和传代
细胞种植于包被了1％体积浓度的Matrigel培养板，于37℃，5％CO2条件下培养，每日更换mTeSR培养基。
细胞长至80％-90％汇合度时，吸走培养基，使用RPMI1640培养基洗涤2次，加入适量的恢复至室温的Accutase，37℃消化；显微镜下观察，细胞部分脱落或者细胞间隙变大时，吸走Accutase，加入RPMI1640培养基轻柔地吹打，使细胞全部脱落；将细胞转移至15mL离心管，200g，离心4min。弃去上清后，加入1mL mTeSR培养基重悬；加入适量的培养基至细胞密度达到实验需要，加入终浓度为5μM Y27632，将细胞种于包被了Matrigel的培养板中，于37℃，5％CO2的条件下培养。
3)RT-PCR检测基因表达
Trizol裂解待检测细胞，提取RNA，将RNA逆转录为cDNA；使用RT-PCR分析肝前体细胞、肝细胞、胆管细胞的特异基因，引物序列见表2。
表2RT-PCR使用的引物序列
Figure BDA0001963302740000121
Figure BDA0001963302740000131
Figure BDA0001963302740000141
Figure BDA0001963302740000151
Figure BDA0001963302740000161
4)免疫荧光检测蛋白表达
细胞固定：使用4％多聚甲醛(PFA)固定待检测细胞，4℃过夜，弃去PFA，加入PBS洗涤3次，每次5分钟。
封闭通透：弃去PBS，加入含有10％FBS和0.2％Triton的PBS，室温处理1小时，弃去封闭通透液，加入PBS洗涤3次，每次5分钟。
孵育一抗：根据抗体说明书，选择合适的稀释倍数，稀释一抗，4℃孵育一抗过夜；弃去一抗，使用PBS洗涤3次，每次15分钟。
孵育二抗：根据一抗种属，选择合适的二抗，稀释二抗，室温孵育二抗1小时；弃去二抗，使用PBS洗涤3次，每次15分钟。
染核：使用合适浓度的DAPI，室温孵育5分钟，弃去DAPI，使用PBS洗涤3次，每次15分钟。
观察：将细胞置于荧光显微镜下观察；
5)流式细胞术检测蛋白表达
细胞消化：弃去待检测细胞的培养基，PBS洗涤3次后，加入适量的恢复至室温的Accutase或胰酶，37℃消化，显微镜下观察，细胞消化为单细胞时，加入10％FBS终止消化，将细胞收集至Ep管，离心250g，4min，去上清；
细胞固定通透：检测胞内蛋白时，细胞需固定并通透，加入50μL PBS重悬，加入250μL Fixation/Permeablization溶液，冰上处理20min，加入PBS至1mL，离心250g，4min，去上清；
封闭：加入10％FBS重悬至1mL，室温孵育10min，离心250g，4min，去上清；
洗涤：加入PBS重悬至1mL，离心250g，4min，去上清，重复此步骤一次；
孵育抗体：按照说明书，稀释抗体，冰上孵育30min，加入PBS重悬至1mL，离心250g，4min，去上清，再次加入PBS重悬至1mL，离心250g，4min，去上清；
重悬：使用PBS重悬细胞，上机前过滤，使用流式细胞分析仪检测；
数据分析：使用FLowjo分析数据。
实施例1定型内胚层细胞的获取
第0天：细胞长至50％-80％汇合度时，开始进行定向分化实验，弃去mTeSR培养基，用基础培养基RPMI1640洗涤2次，加入内胚层诱导培养基Ⅰ，内胚层诱导培养基Ⅰ以RPMI1640为基础，添加终浓度为2％的不含胰岛素的B27，3μM的CHIR99021，1μM的IDE1，2.5μM的异甘草素；
第1-2天：弃去培养基，加入内胚层诱导培养基Ⅱ，内胚层诱导培养基Ⅱ以RPMI1640为基础，添加终浓度为2％的不含胰岛素的B27，1μM的CHIR99021，1μM的IDE1，2.5μM的异甘草素；
第3天：弃去培养基，加入内胚层诱导培养基Ⅲ，内胚层诱导培养基Ⅲ以RPMI 1640为基础，添加终浓度为2％的不含胰岛素的B27，1μM的CHIR99021，1μM的IDE1，0.2μMdorsomorphin 2HCl；
第4天：获取定型内胚层细胞，可用于鉴定或后续分化。
实施例2、肝前体细胞的获取
第4-8天：期间每天重复此步骤，弃去培养基，加入肝前体培养基，肝前体培养基以HepatoZYME-SFM为基础，添加终浓度为2％的B27，2.5μM异甘草素，2.5μM 4-羟基查耳酮，0-2μM Smoothened Agonist HCl；
第9天：获取肝前体细胞，可用于鉴定或后续分化；
标志基因和蛋白的鉴定：使用RT-PCR检测肝前体细胞特异表达的基因，如AFP、HNF4α等；使用流式细胞术检测肝前体细胞特异表达的蛋白AFP；使用免疫荧光检测肝前体细胞特异表达的蛋白AFP和HNF4α，分化过程中细胞的形态变化见图1，小分子化合物诱导的肝前体细胞(HPCs)结果见图2(A)-图2(B)；
根据以上鉴定结果，小分子诱导方案可以获得80％以上阳性率的肝前体细胞。
实施例3、肝前体细胞分化潜能的验证
1)将肝前体细胞分化为肝细胞
第9-13天；期间每天重复此步骤，弃去培养基，加入肝诱导培养基Ⅰ。肝诱导培养基Ⅰ以HepatoZYME-SFM为基础，添加终浓度为2％的B27，20ng/mL HGF，20ng/mL KGF；
第14天-18天：期间每天重复此步骤，弃去培养基，加入肝诱导培养基Ⅱ。肝诱导培养基Ⅱ以HepatoZYME-SFM为基础，添加终浓度为2％的B27，0.1μM地塞米松，10ng/mL OSM；
第19天：获取肝细胞，用于鉴定；
分化过程中细胞的形态变化见图1；
标志基因和蛋白鉴定：使用RT-PCR检测肝细胞特异表达的基因，如ALB、AAT等；使用免疫荧光检测肝细胞特异表达的蛋白ALB和AAT；
功能鉴定：使用PAS染色检测糖原合成能力；使用ICG和LDL摄入实验检测肝功能；使用ELISA实验检测白蛋白表达能力；使用质谱检测CYP3A4，CYP2C9，CYP2D6，结果见图3(A)-图3(G)；
根据以上鉴定结果，小分子诱导的肝前体细胞能够在合适的诱导条件下分化为有功能的肝细胞；
2)将肝前体细胞分化为胆管细胞
第9-15天：期间每天重复此步骤，弃去培养基，加入胆管诱导培养基。胆管诱导培养基以William’s E培养基为基础，添加终浓度为2％的B27，50ng/mL EGF，20ng/mL HGF，5ng/mL TGFβ1；
第16天：获取胆管细胞，用于鉴定；
标志基因和蛋白鉴定：使用RT-PCR检测胆管细胞特异表达的基因，如CK19、CFTR等；使用免疫荧光检测胆管细胞特异表达的蛋白F-ACTIN和CK19，结果见图4(A)-图4(B)；
根据以上鉴定结果，小分子诱导的肝前体细胞能够在合适的诱导条件下分化为胆管细胞。
实施例4、移植肝前体细胞修复小鼠肝脏
构建急性肝损伤小鼠模型：腹腔注射8mg/kg体重的二甲基亚硝胺(DMN)，连续注射两天，使免疫缺陷小鼠NSI(NOD/SCID/IL2rg-/-)患急性肝损伤，构建模型3天后，移植肝前体细胞；
肝前体细胞移植：将1×106的EPCAM+，C-KIT-的肝前体细胞注射至小鼠脾脏，饲养一周后，取肝脏分析检验。
使用免疫荧光检测小鼠肝脏，结果见图5(A)-图5(B)，结果显示小鼠肝脏有表达人白蛋白的肝细胞，这说明了小分子诱导的肝前体细胞能够在小鼠肝脏进一步分化为肝细胞。
综上所述，本发明提供了一种组合物及其应用，利用组合物制备培养基用于诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，通过筛选活性组分，优化组分配比，向分化的细胞加入GSK3-beta抑制剂、Nodal激活剂、BMP激活剂、BMP抑制剂和Hedgehog激活剂，诱导人多能干细胞分化为肝前体细胞，过程简洁高效，阳性细胞含量高，降低了细胞分化所需的成本，用于药物研发和再生医学治疗相关研究和应用，应用前景广阔。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 一种组合物及其应用
<130> 2019年
<160> 44
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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ctgtaggcga tctgttgggg 20

Claims (8)

1.一种诱导多能干细胞分化为肝前体细胞的方法，其特征在于，
包括如下步骤：
（1）第0天，使用内胚层诱导培养基Ⅰ，培养多能干细胞；所述内胚层诱导培养基Ⅰ的组成为体积浓度为1-2%的不含胰岛素的B27、2-4μM的CHIR99021 HCL、0.5-2μM 的IDE1、1-5μM的异甘草素和基础培养基；
（2）第1-2天：使用内胚层诱导培养基Ⅱ，培养步骤（1）获得的细胞；所述内胚层诱导培养基Ⅱ的组成为1%-2%的不含胰岛素的B27、0.5-2μM的CHIR99021 HCL、0.5-2μM的IDE1，1-5μM的异甘草素和基础培养基；
 （3）第3天：使用内胚层诱导培养基Ⅲ，培养步骤（2）获得的细胞；所述内胚层诱导培养基Ⅲ的组成为体积浓度为1%-2%的不含胰岛素的B27、1μM的CHIR99021 HCL、1μM的IDE1，0.2-0.5μM的dorsomorphin 2HCl和基础培养基；
（4）第4-8天：第4天获得定型内胚层细胞；使用肝前体细胞诱导培养基，培养获得的定型内胚层细胞，获得肝前体细胞；所述肝前体细胞诱导培养基的组成为体积浓度为1%-2%的B27、2-10μM的异甘草素、2-10μM的4-羟基查耳酮、0.5-2μM的Smoothened Agonist HCl和基础培养基；
（5）检测分析获得的肝前体细胞；
所述多能干细胞为人胚胎干细胞系或人诱导多能干细胞系；
所述内胚层诱导培养基Ⅰ、所述内胚层诱导培养基Ⅱ、所述内胚层诱导培养基Ⅲ中的基础培养基为RPMI 1640；
所述肝前体细胞诱导培养基的基础培养基为Hepatozyme-SFM；
所述人胚胎干细胞系为WA01或WA09。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内胚层诱导培养基Ⅰ含有体积浓度为2%的不含胰岛素的B27、3μM的CHIR99021 HCL、1μM 的IDE1、2.5μM的异甘草素和基础培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内胚层诱导培养基Ⅱ含有体积浓度为2%的不含胰岛素的B27、1μM的CHIR99021 HCL、1μM的IDE1，2.5μM的异甘草素和基础培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述内胚层诱导培养基Ⅲ含有体积浓度为2%的不含胰岛素的B27、1μM的CHIR99021 HCL、1μM的IDE1，0.2μM的dorsomorphin 2HCl和基础培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝前体细胞诱导培养基含有体积浓度为2%的B27、2.5μM的异甘草素、2.5μM的4-羟基查耳酮、0.5μM的Smoothened Agonist HCl和基础培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人诱导多能干细胞系为UiPSC-013或UiPSC-015。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）所述检测分析的方法为：采用荧光定量PCR、免疫荧光或者流式细胞术检查肝前体细胞标志物的表达。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝前体细胞标志物包括AFP、HNF4α或EPCAM中的任意一种或至少两种的组合。
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