CN108486037A - 一种利用小分子化合物诱导人多能干细胞分化为肝细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种诱导人多能干细胞分化为肝细胞的方法。本方法步骤为：诱导人多能干细胞分化为限定性内胚层细胞；诱导限定性内胚层细胞分化为肝祖细胞；诱导肝祖细胞分化成熟为肝细胞。本发明与现有技术相比，诱导分化过程全部采用小分子化合物和成分明确的培养基及添加剂，避免使用细胞因子和成分不明确的培养基，体系稳定、可重复性好；小分子化合物比细胞因子的成本低，与传统的细胞因子方法比较，可以降低2/3的成本，所以整个诱导分化过程更加低廉，有利于将来进一步的扩大分化应用；诱导分化过程耗时13天，是目前国内外报道的诱导分化方案中耗时最短的全小分子诱导分化方案；使用DMSO浓度低，对于细胞的毒性小。

Description

一种利用小分子化合物诱导人多能干细胞分化为肝细胞的 方法
技术领域
本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，具体地，涉及一种利用小分子化合物诱导人多能干细胞(包括人iPS细胞和人胚胎干细胞)分化为肝细胞的方法。
背景技术
对于各种终末期肝病，肝移植是迄今为止最有效的治疗手段。但供肝严重短缺成为限制其发展的全球性难题。因此，寻找合适的替代疗法迫在眉睫。肝细胞移植从某种程度上可以缓解这一难题，但同样存在肝细胞资源缺乏并且体外扩增困难等问题。近年来，随着干细胞和再生医学研究如火如荼地开展起来，一系列进展为人类攻克肝脏疾病的治疗难题带来了新希望。人多潜能干细胞作为一类具有自我更新和多向分化特性的细胞，可以源源不竭地在体外被诱导分化为成熟的具有功能的肝细胞，动物实验初步验证的诱导分化的肝细胞是安全有效的。另外这些诱导分化的肝细胞还可以被用来进行药物筛选、生物人工肝治疗和构建肝脏疾病模型。
但是目前常用的诱导分化方案包括细胞因子诱导分化(通过在不同的分化培养基中加入细胞因子，包括Wnt3a，ActivinA，FGF，BMP4，HGF，OSM等)、利用慢/腺病毒技术将肝脏特异性转录因子导入多能干细胞中诱导其分化，另外还有细胞共培养的方法等，以上诱导分化方法都存在诸多不足和问题，比如诱导分化效率受限、时间长、成本高、可控性和稳定性差等。而近年来小分子化合物在干细胞研究领域的应用越来越广泛，小分子化合物自身众多优势是细胞因子等诱导分化方法所无可比拟的，有望在诱导肝分化领域大展用武之地。
与传统的细胞因子相比，小分子化合物有如下优势：①小分子化合物可直接穿过细胞膜作用于相应的靶点上，因此起效较快；②小分子化合物的靶点不仅限于信号通路，还可以直接影响表观遗传学状态；③小分子化合物具有相对特异的靶点，利于深入研究其机制；④小分子化合物不仅起效迅速，而且其效应是可逆的，便于操控，可实现对基因表达和蛋白质功能进行精准调控；⑤小分子化合物的获取方便，而且比较稳定，便于将来标准化和规模化地应用。
目前，尽管小分子化合物在干细胞研究领域应用较多，但是可用于诱导人多潜能干细胞分化为肝细胞的小分子化合物方案寥寥无几。
现有利用小分子化合物诱导人多能干细胞分化为肝细胞的方法为Small-Molecule-Driven Hepatocyte Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells(Stem Cell Reports(2015)，Richard Siller,Sebastian Greenhough,Elena Naumovska,1and Gareth J.Sullivan.)，该方法分为四个主要阶段：中内胚层分化、限定性内胚层诱导形成、肝谱系特化和肝细胞分化成熟。但是该方法存在以下缺陷：诱导时间较长(17天)；实验体系不稳定，细胞损伤较重(1％DMSO有较重的细胞毒性)；实验可重复性差(第一阶段仅仅通过调控Wnt信号通路难以高效率地诱导限定性内胚层分化；第二阶段仅仅通过DMSO难以定向地诱导限定性内胚层细胞分化为肝系细胞)。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种利用小分子化合物诱导人多能干细胞分化为肝细胞的方法。
本发明的第二个目的是所述方法在定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述方法在制备定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞的试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种诱导人多能干细胞分化为肝细胞的方法，分为以下三个步骤：
S1.诱导人多能干细胞分化为限定性内胚层细胞；
S2.诱导限定性内胚层细胞分化为肝祖细胞；
S3.诱导肝祖细胞分化成熟为肝细胞。
优选地，人多能干细胞，包括人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞。
其中，胚胎干细胞包括已商品化建系的WiCell Research Institute,Inc.中的H1细胞系(WA01)，H7细胞系(WA07)，H9细胞系(WA09)等，还包括其他已建系的商品化胚胎干细胞系；
其中，诱导多能干细胞包括但不限于商品化或经诱导加工，已稳定建系或未建系的诱导多能干细胞。
优选地，步骤S1是通过抑制PI3K/AKT信号通路并且激活Wnt信号通路，使人多能干细胞分化为限定性内胚层细胞。
优选地，步骤S1中，包括以下步骤：
S11.使用人胚胎干细胞培养基mTeSRTM加DMSO，将人多能干细胞预培养22～26小时；
S12.将RPMI1640培养基中加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂和CHIR99021，利用所得培养基替换S11的培养基后继续培养22～26小时；
S13.再将S12的培养基更换为含有无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基，继续培养22～26小时。
优选地，S11～S13每一步的培养时间为24小时。
无胰岛素的B-27细胞培养添加剂即为B-27TMSupplement,minus insulin。
DMSO，即二甲基亚砜，是一种小分子化合物，CAS号为：67-68-5；分子式：C2H6OS。
CHIR99021是一种小分子化合物，CAS号为：252917-06-9；分子式：C22H18Cl2N8。
优选地，步骤S11和S12中，RPMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为100～49:1。
更优选地，步骤S11和S12中，RPMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49:1。
优选地，步骤S11中，DMSO的体积浓度为0.25～1.5％。
更优选地，步骤S11中，DMSO的体积浓度为0.5％。
优选地，步骤S12中，CHIR99021的浓度为2～5μM。
更优选地，步骤S12中，CHIR99021的浓度为3μM。
优选地，步骤S2中，诱导限定性内胚层细胞分化为肝祖细胞的同时，抑制限定性内胚层细胞分化为胰腺祖细胞。
优选地，步骤S2中，使用DMSO、小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂和丁酸钠诱导分化。
优选地，步骤S2中，所述小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂为A83-01。
丁酸钠是一种小分子化合物，CAS号为：156-54-7；分子式：C4H7NaO2。
A83-01是一种小分子化合物，CAS号为：909910-43-6；分子式：C25H19N5S。
优选地，步骤S2中，DMSO的体积浓度为0.25～1.5％；小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂为A83-01，其浓度为0.25～1.5μM；丁酸钠的浓度为100～500nM。
优选地，步骤S2中，DMSO的体积浓度为0.5％；小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂为A83-01，其浓度为0.5μM；丁酸钠的浓度为250nM。
优选地，步骤S2中，培养时间为5天。
优选地，步骤S3中，抑制胆管上皮细胞的分化，同时促进肝细胞成熟和增殖。
优选地，步骤S3中，小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂抑制胆管上皮细胞的分化；地塞米松、氢化可的松、FH1和FPH1促进肝祖细胞分化为成熟肝细胞。
地塞米松是一种小分子化合物，CAS号为：50-02-2；分子式：C22H29FO5。
氢化可的松一种小分子化合物，CAS号为：50-23-7；分子式：C21H30O5。
FH1(BRD-K4477)是一种小分子化合物，CAS号为：2719-5-3；分子式：C17H18N2O2；SMILES：CC(＝O)NC1＝CC＝C(C＝C1)CC2＝CC＝C(C＝C2)NC(＝O)C。
FPH1(BRD-6125)是一种小分子化合物，CAS号为：708219-39-0；分子式：C16H15ClF2N2O3S；SMILES：
CC1＝C(C＝C(C＝C1)Cl)N(CC(＝O)NC2＝C(C＝CC＝C2F)F)S(＝O)(＝O)C。
优选地，步骤S3中，小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂为A83-01。
优选地，步骤S3中，A83-01的浓度为0.25～1.5μM。
优选地，步骤S3中，A83-01的浓度为0.5μM。
优选地，步骤S3中，FH1的浓度为5～30μM。
优选地，步骤S3中，FH1的浓度为15μM。
优选地，步骤S3中，FPH1的浓度为5～30μM。
优选地，步骤S3中，FPH1的浓度为15μM。
优选地，步骤S3中，地塞米松的浓度为20～200nM。
优选地，步骤S3中，地塞米松的浓度为100nM。
优选地，步骤S3中，氢化可的松的浓度为5～50μM。
优选地，步骤S3中，氢化可的松的浓度为10μM。
优选地，步骤S3中，培养时间为5天。
优选地，步骤S3中，每天更换新鲜培养基。
优选地，步骤S2和S3中，培养基为添加有GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)的基础培养基Advanced DMEM/F12；其中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
优选地，步骤S2和S3中，基础培养基Advanced DMEM/F12培养基中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined LipidConcentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为85～95：1～3：1～3：1～3：1～3：1～3；其中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
优选地，步骤S2和S3中，基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined LipidConcentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1；其中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
优选地，诱导过程分为以下三个步骤：
S1，人多能干细胞分化为限定性内胚层，使用人胚胎干细胞培养基加0.5％的DMSO预培养24小时，之后使用RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂和CHIR99021 3μM培养24小时，最后更换为含有无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基，继续培养24小时；
S2，限定性内胚层分化为肝祖细胞，使用DMSO、TGF-β信号通路抑制剂A83-01和丁酸钠诱导分化；
S3，TGF-β信号通路抑制剂A83-01、地塞米松、氢化可的松、FH1和FPH1促进肝祖细胞分化为成熟肝细胞；
其中，步骤S2和S3中，使用Advanced DMEM/F12作为基础培养基，再添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined LipidConcentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
最优选地，诱导过程分为以下三个步骤：
S1.人多能干细胞分化为限定性内胚层细胞，使用人胚胎干细胞培养基mTeSRTM加0.5％的DMSO预培养24小时，之后使用体积比为49:1的RPMI1640培养基和无胰岛素的B-27细胞培养添加剂进行培养，并添加3μM的CHIR99021培养24小时后，然后更换为含有无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基，继续培养24小时；
S2.限定性内胚层细胞分化为肝祖细胞，培养基中添加体积浓度为0.5％的DMSO、0.5μM A83-01和250nM丁酸钠诱导限定性内胚层细胞分化为肝祖细胞，培养5天；
S3.肝祖细胞分化为肝细胞，培养基中添加0.5μM A83-01+15μM FH1+15μM FPH1+100nM地塞米松+10μM氢化可的松促进肝祖细胞分化为肝细胞。，连续培养5天，每天更换新鲜培养基，
其中，步骤S2和S3中，基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined LipidConcentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。。
所述方法在定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
所述方法在制备定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
一种定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞的试剂盒，含有以下组分：CHIR99021、小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂、丁酸钠、地塞米松、氢化可的松、FH1、FPH1和DMSO。
优选地，所述试剂盒还含有：人胚胎干细胞培养基mTeSRTM、DMSO、RPMI1640培养基、无胰岛素的B-27细胞培养添加剂、添加有GlutaMAX、非必需氨基酸、脂肪酸复合物和血清替代物的基础培养基Advanced DMEM/F12；其中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
优选地，所述试剂盒包括：
培养基A：人胚胎干细胞培养基mTeSRTM加DMSO；
培养基B：RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂和CHIR99021；
培养基C：RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂；
培养基D：添加有GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerumReplacement)的基础培养基Advanced DMEM/F12加上DMSO、小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂和丁酸钠。
培养基E：添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerumReplacement)的基础培养基Advanced DMEM/F12加上小分子化合物加上TGF-β信号通路抑制剂、地塞米松、氢化可的松、FH1和FPH1；
其中，培养基D和E中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
优选地，小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂为A83-01。
优选地，添加有B-27细胞培养添加物、GlutaMAX添加物、非必需氨基酸、脂肪酸复合物和血清替代物的基础培养基，具体为Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined LipidConcentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1，其中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
优选地，RPMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为100～49:1。
更优选地，RPMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49:1。
优选地，DMSO的体积浓度为0.25～1.5％。
更优选地，DMSO的体积浓度为0.5％。
优选地，CHIR99021的浓度为2～5μM。
更优选地，CHIR99021的浓度为3μM。
优选地，A83-01的浓度为0.25～1.5μM。
更优选地，A83-01的浓度为0.5μM。
优选地，丁酸钠的浓度为100～500nM。
更优选地，丁酸钠的浓度为250nM。
优选地，步骤S3中，FH1的浓度为5～30μM。
优选地，步骤S3中，FH1的浓度为15μM。
优选地，步骤S3中，FPH1的浓度为5～30μM。
优选地，步骤S3中，FPH1的浓度为15μM。
优选地，步骤S3中，地塞米松的浓度为20～200nM。
优选地，步骤S3中，地塞米松的浓度为100nM。
优选地，步骤S3中，氢化可的松的浓度为5～50μM。
优选地，步骤S3中，氢化可的松的浓度为10μM。
最优选的，优选地，所述试剂盒包括：
培养基A：人胚胎干细胞培养基mTeSRTM，加入体积浓度为0.5％的DMSO；
培养基B：RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂和CHIR99021，PMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49:1，CHIR99021的浓度为3μM；
培养基C：RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂，PMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49:1；
培养基D：基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1，再添加体积浓度为0.5％的DMSO、0.5μMA83-01和250nM丁酸钠；
培养基E：基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1，再添加0.5μM A83-01+15μM FH1+15μM FPH1+100nM地塞米松+10μM氢化可的松；
其中，培养基D和E中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
以上所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
S1.使用培养基A预培养人多能干细胞22～26小时；
S2.更换为培养基B继续培养22～26小时；
S3.更换为培养基C继续培养22～26小时；
S4.更换为培养基D继续培养5天，每天更换新鲜培养基；
S5.更换为培养基E继续培养5天，每天更换新鲜培养基。
优选地，步骤S1到S3的培养时间均为24小时。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、诱导分化过程全部采用小分子化合物(8种)和成分明确的培养基及添加剂，避免使用细胞因子和成分不明确的培养基，因此体系稳定、可重复性好。
2、由于小分子化合物比细胞因子的成本低，与传统的细胞因子方法比较，小分子化合物可以降低2/3的成本，所以整个诱导分化过程更加低廉，有利于将来进一步的扩大分化应用。
3、诱导分化过程耗时13天，是目前国内外报道的诱导分化方案中耗时最短的全小分子诱导分化方案。
4、使用DMSO浓度低，对于细胞的毒性小。
附图说明
图1为诱导人多能干细胞分化为肝细胞的流程图。
图2为不同的基础培养基对干细胞多能性和内胚层分化的影响。
图3为人多潜能干细胞经过不同浓度的CHIR99021培养不同时间，多能性特异性转录因子(A)和限定性内胚层(B)、中胚层(C)、外胚层(D)特异性标志物的变化。
图4为不同培养方案诱导干细胞分化的效率比较。
图5为人诱导多能干细胞分化前后的形态改变。
图6为Q-PCR检测人iPSC经分化后基因表达变化。
图7为免疫荧光检测人诱导多能干细胞经分化培养前多能性标志物的表达和分化后限定性内胚层特异性标志物表达(bar＝100μm)。
图8为流式细胞术检测人诱导多能干细胞经分化培养后限定性内胚层特异性标志物表达水平。
图9为人胚胎多能干细胞经分化培养后基因表达变化。
图10为免疫荧光检测限定性内胚层特异性标志物的表达(bar＝50μm)。
图11为诱导分化第二阶段，比较小分子化合物(SM)和细胞因子(GF)分别诱导人诱导干细胞形成为肝祖细胞的效率，hiPSC和HepG2均作用对照，比较不同分化方案诱导形成的肝祖细表达特异性标志物基因的表达变化。
图12为诱导分化第二阶段，通过激光共聚焦检测肝祖细胞特异性标志物的蛋白表达，比较小分子化合物(SM)和细胞因子(GF)分别诱导人iPS细胞形成为肝祖细胞的效率，hiPSC和HepG2均作用对照(bar＝50μm)，
图13为ELISA检测细胞培养上清液中肝祖细胞标志物甲胎蛋白分泌水平。
图14为Q-PCR检测诱导人胚胎干细胞分化的肝祖细胞特异性标志物基因的表达。
图15为激光共聚焦检测诱导人胚胎干细胞分化的肝祖细胞特异性标志物蛋白的表达。
图16为显微镜下诱导人多潜能干细胞分化形成的肝细胞形态。
图17为Q-PCR检测肝细胞标志物的基因表达水平，hiPSC和hPH(人原代肝细胞)均作为对照。
图18为激光共聚焦检测诱导人多潜能干细胞分化形成的肝细胞标志物的表达(bar＝50μm)。
图19为Q-PCR诱导人胚胎干细胞分化形成的肝细胞的标志性基因表达。
图20为激光共聚焦检测肝细胞的标志性蛋白表达(bar＝50μm)。
图21为PAS染色检测肝细胞糖原储存能力
图22为Western blot检测肝细胞表达白蛋白。
图23为ELISA检测肝细胞分泌白蛋白。
图24为肝细胞细胞色素代谢酶CYP1A2功能活性检测。
图25为肝细胞摄取/排泌吲哚箐绿的检测(bar＝100μm)。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中用到的qPCR引物序列示于表1；上述相关试剂示于表2；使用的相关抗体示于表3。
实施例1诱导人多功能干细胞分化为肝细胞
一种诱导人多功能干细胞分化为肝细胞的方法(分化过程的流程图见图1)，分为以下三个步骤：
S1.诱导人多能干细胞分化为限定性内胚层
方法：(0.5％DMSO+人胚胎干细胞培养基mTeSR)预培养24小时，再用(RPMI1640+无胰岛素的B-27细胞培养添加剂+CHIR99021(3μM))培养24小时，然后更换为含有无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基，继续培养24小时，经过一共72小时培养。
具体方案为：
(1)提前24h进行诱导分化的准备工作：用基质胶包被六孔板，放入37度培养箱中；人多能干细胞汇合度为70～90％，使用消化液消化，传代至预先用基质胶包被好的孔板中，用干细胞培养基培养24小时后进行诱导分化，应使培养后的细胞融合度在30～50％。
(2)诱导分化第1天换成含有体积浓度为0.5％DMSO的干细胞培养基预诱导24小时，第2天使用RPMI1640培养基+无胰岛素的B-27细胞培养添加剂培养，并添加3μM的CHIR99021进行诱导，诱导24小时后，第三天单独使用无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基培养24小时，其中，RPMI1640培养基+无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49：1。
S2.诱导限定性内胚层分化为肝祖细胞
限定性内胚层细胞至于添加0.5％的DMSO、TGF-β信号通路抑制剂和丁酸钠的Advanced DMEM/F-12基础培养基上诱导5天，具体做法为：
(1)培养基为基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1。
(2)培养基中添加体积浓度为0.5％DMSO以及0.5μM A83-01和250nM丁酸钠。
(3)培养5天，每天更换新鲜培养基，诱导限定性内胚层分化为肝祖细胞。
S3.诱导肝祖细胞分化成熟为肝细胞
使用TGF-β信号通路抑制剂、地塞米松、氢化可的松、FH1和FPH1五种小分子化合物培养肝祖细胞5天，促进肝祖细胞分化为成熟肝细胞。
具体做法为：
(1)培养基为基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1。
(2)培养基中添加五种小分子化合物：A83-01(0.5μM)+FH1(15μM)+FPH1(15μM)+地塞米松(100nM)+氢化可的松(10μM)。
(3)连续培养5天，每天更换新鲜培养基，促进肝祖细胞分化为肝细胞。实施例2诱导人多能干细胞分化为限定性内胚层的条件优化
一、不同的基础培养基对干细胞多能性和内胚层分化的影响
比较两种培养基对干细胞多能性和内胚层分化对影响
培养基1：Essential 8TMMedium
培养基2：1640B27培养基，含有无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基，其中，RPMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49:1。
1，操作方法
(1)提前24h将胚胎干细胞H1接种于6孔板中，使其在诱导前的细胞融合度达到30～50％；
(2)诱导分化时在Essential8和1640B27培养基中加入3μM CHIR99021分别诱导细胞分化24h，48h和72h；
(3)使用qPCR分别检测相应的多能干细胞表达基因和限定性内胚层表达基因的情况，对比在不同培养基中细胞的分化效果。其中选用的引物为Invitrogen公司产品，其中包括：多能干细胞相关基因OCT4，NANOG；限定性内胚层基因FOXA2，SOX17，CXCR4，GATA4。其引物序列示于表1。
2，结果
通过对比试验发现：与Essential8基础培养基相比，1640B27基础培养基能更高效率地诱导限定性内胚层分化形成(见图2)。以Essential8作为基础培养基时，SOX17升高不明显；而根据文献报道，。以1640B27作为分化培养基时，限定性内胚层特异性转录因子SOX17(SOX17对于限定性内胚层的形成是非常关键的转录因子)、FOXA2均明显升高。
二、CHIR99021的浓度培养时间的选择
1、操作方法：
(1)提前24h将胚胎干细胞H1接种于6孔板中，使其在诱导前的细胞融合度达到30～50％；
(2)诱导分化时在1640B27培养基中加入1μM或3μM CHIR99021分别诱导细胞分化24h,48h和72h；
(3)使用qPCR分别检测相应的多能干细胞表达基因和限定性内胚层表达基因的情况，对比在不同培养基中细胞的分化效果。其中选用的引物为Invitrogen公司产品，其中包括：多能干细胞相关基因OCT4，NANOG；限定性内胚层基因FOXA2，SOX17；中胚层基因HAND1，BRA；外胚层基因GAP，ZIC1。其引物序列示于表1。
2、结果
通过对比试验发现：CHIR99021对多潜能干细胞的干性因子OCT4、NANOG的抑制呈明显的剂量和时间依赖性。但是，通过对内胚层、中胚层和外胚层特异性标志物的检测分析发现：CHIR99021内胚层特异性标志物的升高呈现明显的剂量依赖性，但是随着培养时间延长，72小时则呈现出抑制内胚层分化、促进中胚层分化的趋势；CHIR99021对外胚层分化则无明显促进作用(见图3)。
三、诱导分化方案的确定
为了建立一个相对最佳的诱导分化方案，同时也为了与传统的细胞因子(参考北京大学邓宏魁教授课题组发表在Heptology和Robert Lanza教授课题组发表咋Stem Cells上的ActivinA诱导分化方法)诱导分化方法作对比，本发明比较六种不同的诱导分化方案诱导分化的效果：①GF组(即growth factor细胞因子组)培养基添加100ng/ml Activin A，连续诱导72小时；②培养基添加CHIR99021(3μM)诱导24小时；③培养基添加CHIR99021(3μM)连续诱导48小时；④培养基添加CHIR99021(3μM)诱导24小时后，仅用基础分化培养基再继续培养24小时，整个阶段为48h；⑤培养基添加CHIR99021(3μM)连续培养48小时后，仅用基础分化培养基再继续培养24小时，整个阶段为72h；⑥培养基添加CHIR99021(3μM)连续培养72小时。
1、操作方法：
(1)提前24h将胚胎干细胞H1接种于6孔板中，使其在诱导前的细胞融合度达到30～50％；
(2)诱导分化时分别按上述6种方案在1640B27基础诱导培养基中添加相应诱导分子进行分化诱导；
(3)使用qPCR分别检测相应的多能干细胞表达基因和限定性内胚层表达基因的情况，对比在不同培养基中细胞的分化效果。其中选用的引物为Invitrogen公司产品，其中包括：多能干细胞相关基因OCT4，NANOG；限定性内胚层基因FOXA2，SOX17，GATA4；中胚层基因HAND1，BMP5。其引物序列示于表1。
2、结果
通过对比试验发现：，根据基因表达结果分析第④种分化方案诱导效率最佳。当CHIR99021培养时间超过48小时后则发现：虽然多能性因子进一步降低表达，但内胚层特异性转录因子的表达水平反而有所降低的趋势，中胚层特异性转录因子的表达水平则开始升高，说明一定时间范围内的Wnt信号通路激活对于人多潜能干细胞向限定性内胚层分化是必须的，但是长时间的激活Wnt信号通路则会导致中胚层分化(见图4)。
四、最优选方案
1，方法：(0.5％DMSO+人胚胎干细胞培养基mTeSR)预培养24小时，再用(RPMI1640+无胰岛素的B-27细胞培养添加剂+CHIR99021(3μM))培养24小时，然后更换为含有无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基，继续培养24小时，经过一共72小时培养。
具体方案为：
(1)提前24h进行诱导分化的准备工作：用基质胶包被六孔板，放入37度培养箱中；人多能干细胞汇合度为70～90％，使用消化液消化，传代至预先用基质胶包被好的孔板中，用干细胞培养基培养24小时后进行诱导分化，应使培养后的细胞融合度在30～50％。
(2)诱导分化第1天换成含有体积浓度为0.5％DMSO的干细胞培养基预诱导24小时，第2天使用RPMI1640培养基+无胰岛素的B-27细胞培养添加剂培养，并添加3μM的CHIR99021进行诱导，诱导24小时后，第三天单独使用无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基培养24小时，其中，RPMI1640培养基+无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49：1。
2，结论：
对于人诱导干细胞的诱导分化效果：细胞形态明显改变(图5)，细胞由典型的致密的干细胞变为逐渐松散，成为花瓣状排布的细胞集落，细胞体积增大，核质比降低；基因表达变化(图6)，与未分化的干细胞相比，分化培养后的细胞多能性因子OCT4、NANOG明显降低表达，限定性内胚层特异性转录因子SOX17、FOXA2、LGR5、GATA4、CXCR4明显升高；干细胞明显高表达多能性因子OCT4、NANOG，而分化的细胞则明显高表达SOX17、FOXA2；流式细胞术显示(图7，8)，限定性内胚层标志性转录因子的表达，SOX17、FOXA2双阳性细胞比例达68％±2.5％。
对于人胚胎干细胞的诱导分化效果：①基因表达(图9)：与未分化的干细胞相比，分化培养后的细胞多能性因子OCT4、NANOG明显降低表达，限定性内胚层特异性转录因子SOX17、FOXA2、GATA4、CXCR4明显升高；②蛋白表达(图10)：干细胞明显高表达多能性因子OCT4、NANOG，而分化的细胞则明显高表达SOX17、FOXA2。
通过以上一系列结果证明通过第一阶段的诱导分化方案，确实可以将诱导多潜能干细胞分化至限定性内胚细胞。
实施例3诱导限定性内胚层分化为肝祖细胞的条件优化
为了确定(A83-01+NaB+DMSO)三者联用诱导肝祖细胞形成的效果，设计了传统的细胞因子组(BMP4+FGF4)作为对比。
一、操作方法
胚胎干细胞H1按上述最优方案诱导为限定性内胚层后，将培养基更换为肝组细胞诱导培养基：Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积为95：1：1：1：1：1。其中，传统细胞因子组添加10ng/ML的BMP4和10ng/ML的FGF4；小分子化合物诱导组添加0.5μM A83-01，200nM NaB和0.5％DMSO。诱导时间为5天，每天更换新鲜的诱导培养基。通过荧光定量PCR、细胞免疫荧光和ELISA检测甲胎蛋白分泌的方法鉴定肝祖细胞的分化形成。
二、结果
对于人诱导干细胞的诱导分化效果：基因表达分析显示(图11)，与未分化的细胞相比，分化第八天的细胞明显高表达肝祖细胞特异性标志物AFP、HNF4α、ALB、CK18、CK19，并且，由小分子化合物诱导的肝祖细胞标志物表达水平高于细胞因子组；激光共聚焦实验分析这些标志物的蛋白表达水平(图12)，小分子化合物诱导的肝祖细胞标志物表达水平确实高于细胞因子组(大约80％VS65％)；肝祖细胞标志物甲胎蛋白(图13)，每24小时每百万细胞大约分泌40-60ng/ml甲胎蛋白。
对于人胚胎干细胞的诱导分化效果：基因表达分析显示(图14)，与未分化的细胞相比，分化第八天的细胞明显高表达肝祖细胞特异性标志物AFP、HNF4α、TTR、TBX3、CK18、CK19；激光共聚焦实验分析标志物的蛋白表达水平(图15)，小分子化合物诱导的肝祖细胞标志物表达水平确实高于细胞因子组。
以上结果均说明：(A83-01+NaB+DMSO)三者联用确实可以诱导肝祖细胞形成。
三、最优选方案
限定性内胚层细胞至于添加0.5％的DMSO、TGF-β信号通路抑制剂和丁酸钠的Advanced DMEM/F-12基础培养基上诱导5天，具体做法为：
(1)培养基为基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1。
(2)培养基中添加体积浓度为0.5％DMSO以及0.5μM A83-01和250nM丁酸钠。
(3)培养5天，每天更换新鲜培养基，诱导限定性内胚层分化为肝祖细胞。
实施例4诱导肝祖细胞分化为有功能的肝细胞的条件优化
该阶段主要有两个需要解决的问题：一是如何诱导肝祖细胞单向地分化为肝细胞而不是胆管上皮细胞；二是如何促进肝细胞的功能成熟。
对于第一个问题，通过TGF-β信号通路抑制剂A83-01抑制胆管上皮细胞的分化；对于第二个问题，利用FH1和FPH1，并联合应用糖皮质激素地塞米松和氢化可的松共同促进肝细胞成熟和增殖。
一、操作方法
人多能干细胞按上述最优方案诱导为肝组细胞后，将培养基更换为肝细胞诱导培养基：Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerumReplacement)，其体积为95：1：1：1：1：1。其中，小分子化合物诱导组添加五种小分子化合物：A83-01(0.5μM)+FH1(15μM)+FPH1(15μM)+地塞米松(100nM)+氢化可的松(10μM)；对比组为细胞因子诱导分化组，添加HGF(10ng/ml)+OSM(10ng/ml)+地塞米松(100nM)。诱导时间为5天，每天更换新鲜的诱导培养基。
通过荧光定量PCR、细胞免疫荧光和Western Blot的方法鉴定肝细胞的表型。
二、结果
经过5天的继续诱导分化培养，细胞形态发生明显改变：细胞与细胞之间间隙明显，细胞较大，呈多边形，细胞核明显，可见双核细胞，细胞质丰富(图16)。以上细胞形态符合肝细胞典型形态，与其它课题组用细胞因子诱导分化得到的肝细胞无异。
通过荧光定量PCR检测肝细胞特异性标志物的表达发现：仅用地塞米松、氢化可的松和A83-01虽然可以促进肝细胞特异性标志物的基因表达升高，但是大部分关键基因的升高并达不到我们的预期和成熟肝细胞的要求；而加入FH1和FPH1这两种小分子化合物联用后，确实可以明显提高肝细胞分化形成的效果；分化的细胞高表达ALB、A1AT、APOA2、TTR、HNF4α；重要的是我们发现分化的细胞高表达CYP1A1、CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4(图17)。
这些结果提示：通过本发明的小分子化合物诱导分化方案可以得到肝细胞。进而通过激光共聚焦检测蛋白表达的结果显示诱导分化的细胞明显高表达肝细胞特异性标志物ALB、A1AT、HNF4α、E-cadherin(图18)。
对于人胚胎干细胞的诱导分化效果：基因表达检测结果显示(图19)，分化的细胞不仅高表达ALB、A1AT、APOA2、ASGR1、HNF4α，而且分化的细胞高表达CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4，表示分化细胞高表达细胞色素氧化酶CYP450，高表达FXR，NTCP这些与肝炎病毒感染肝细胞密切相关的基因(图19)；激光共聚焦检测蛋白表达显示(图20)，诱导分化的细胞明显高表达肝细胞特异性标志物ALB、A1AT。
三、最优选方案
使用TGF-β信号通路抑制剂、地塞米松、氢化可的松、FH1和FPH1五种小分子化合物培养肝祖细胞5天，促进肝祖细胞分化为成熟肝细胞。
具体做法为：
(1)培养基为基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸(NEAA)、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物(Chemically Defined Lipid Concentrate)和血清替代物(KnockoutTMSerum Replacement)，其体积比为95：1：1：1：1：1。
(2)培养基中添加五种小分子化合物：A83-01(0.5μM)+FH1(15μM)+FPH1(15μM)+地塞米松(100nM)+氢化可的松(10μM)。
(3)连续培养5天，每天更换新鲜培养基，促进肝祖细胞分化为肝细胞。
实施例5诱导分化的肝细胞功能检测
考虑到将来的临床或者药物筛选方面的应用，我们最需要考虑的问题是这些诱导分化的细胞是否具有肝功能。采用常用的鉴定肝细胞功能的检测方法：白蛋白的分泌；糖原储存；细胞色素P450亚酶1A2活性检测；吲哚箐绿的吞噬摄取和排出等，来鉴定细胞的肝功能。
一、实验方法
1、白蛋白的分泌检测
操作方法为：
(1)将人多能干细胞按照实施例1最优方案诱导为肝细胞；
(2)收集细胞培养的上清液用于白蛋白酶联免疫吸附实验(ELISA)，将所有的细胞消化后进行计数定量；
(3)按照白蛋白ELISA检测试剂盒的相关操作步骤检测上清中白蛋白的含量。
2、糖原储存
操作方法为：
(1)将人多能干细胞按照实施例1最优方案诱导为肝细胞；
(2)细胞弃上清后使用PBS溶液清洗1～3次后加入4％多聚甲醛固定15分钟；
(3)固定后的细胞按照糖原染色(PAS)染色系统试剂盒的相关操作说明进行染色检测。
3、细胞色素P450亚酶1A2活性检测
(1)将人多能干细胞按照实施例1最优方案诱导为肝细胞；
(2)在分化得到的肝细胞培养基中加入奥美拉唑(100μM)诱导72小时后收集细胞并裂解萃取蛋白，酶标仪测蛋白浓度定量为100微克；
(3)按照细胞色素P450亚酶1A2活性荧光定量检测试剂盒的相关操作步骤检测CYP1A2的活性。
4、吲哚箐绿的吞噬摄取和排出。
操作方法为：
(1)将人多能干细胞按照实施例1最优方案诱导为肝细胞；
(2)细胞在检测前更换为新鲜的培养基，将吲哚菁绿(ICG)溶解在无菌水中，按1mg/ml添加到细胞培养基中；
(3)细胞在37℃培养箱中孵育30min后，弃上清，用PBS清洗3次后，用光镜检测细胞对ICG的摄取；
(4)观察后细胞更换新鲜的培养基，在37℃放置6h后，显微镜下观察细胞排出ICG的情况。
二、实验结果
收集了分化细胞的上清液，PAS染色(Periodic Acid-Schiff stain)的阳性结果说明分化的细胞具有糖原储存能力(图21)。通过收集分化细胞的总蛋白，通过WesternBlot检测到分化细胞明显表达白蛋白(图22)；通过ELISA的方法检测其中肝细胞分泌的白蛋白的水平可达到100-150ng/ml/天/106细胞(图23)。细胞色素P450亚酶1A2活性荧光定量检测证明分化得到的肝细胞具有一定的药物代谢能力(图24)。将1mg/ml的ICG(吲哚箐绿)加入到培养基中，30分钟ICG可被后分化的细胞所吞噬摄取；6个小时后，ICG可被这些细胞吐出(图25)。
通过以上实验证明：小分子化合物的组合可以高效地诱导肝祖细胞分化为有一定功能的肝细胞。
表1引物序列
表2试剂列表
表3实验抗体列表

Claims (13)

1.一种诱导人多能干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于，分为以下三个步骤：
S1. 诱导人多能干细胞分化为限定性内胚层细胞；
S2. 诱导限定性内胚层细胞分化为肝祖细胞；
S3. 诱导肝祖细胞分化为肝细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1是通过抑制PI3K/AKT信号通路并且激活Wnt信号通路，使人多能干细胞分化为限定性内胚层细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：
S11. 使用人胚胎干细胞培养基mTeSR™加DMSO，将人多能干细胞预培养22～26小时；
S12. 将RPMI1640培养基中加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂和CHIR99021，利用所得培养基替换S11的培养基后继续培养22～26小时；
S13. 再将S12的培养基更换为含有无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的RPMI1640培养基，继续培养22～26小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，诱导限定性内胚层细胞分化为肝祖细胞的同时，抑制限定性内胚层细胞分化为胰腺祖细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S2中，使用DMSO、小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂和丁酸钠诱导分化。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中，抑制胆管上皮细胞的分化，同时促进肝细胞成熟和增殖。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S3中，小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂抑制胆管上皮细胞的分化；地塞米松、氢化可的松、FH1和FPH1促进肝祖细胞分化为成熟肝细胞。
8.权利要求1所述的方法在定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞中的应用。
9.权利要求1所述的方法在制备定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞的试剂盒中的应用。
10.一种定向诱导人多能干细胞分化为肝细胞的试剂盒，其特征在于，含有以下组分：CHIR99021、小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂、丁酸钠、地塞米松、氢化可的松、FH1、FPH1和DMSO。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的还含有：人胚胎干细胞培养基mTeSR™、DMSO、RPMI1640培养基、无胰岛素的B-27细胞培养添加剂、添加有GlutaMAX、非必需氨基酸、脂肪酸复合物和血清替代物的基础培养基Advanced DMEM/F12；其中GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
12.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：培养基A，培养基B、培养基C、培养基D、培养基E；
培养基A：添加人胚胎干细胞培养基mTeSR™，加入DMSO；
培养基B：RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂和CHIR99021；
培养基C：RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂；
培养基D：添加有GlutaMAX、非必需氨基酸NEAA、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物Chemically Defined Lipid Concentrate和血清替代物Knockout™ Serum Replacement的基础培养基Advanced DMEM/F12，加上DMSO、小分子化合物TGF-β信号通路抑制剂和丁酸钠；
培养基E：添加有GlutaMAX、非必需氨基酸NEAA、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物Chemically Defined Lipid Concentrate和血清替代物Knockout™ Serum Replacement的基础培养基Advanced DMEM/F12，加上小分子化合物加上TGF-β信号通路抑制剂、地塞米松、氢化可的松、FH1和FPH1；
其中，培养基D和E中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：培养基A，培养基B、培养基C、培养基D、培养基E；
培养基A：人胚胎干细胞培养基mTeSR™，加入体积浓度为0.5%的DMSO；
培养基B：RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂和CHIR99021，PMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49:1，CHIR99021的浓度为3μM；
培养基C：RPMI1640培养基，加入无胰岛素的B-27细胞培养添加剂，PMI1640培养基与无胰岛素的B-27细胞培养添加剂的体积比为49:1；
培养基D：基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸NEAA、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物Chemically Defined Lipid Concentrate和血清替代物Knockout™ Serum Replacement，其体积比为95：1：1：1：1：1，再添加体积浓度为0.5%的DMSO、0.5μMA83-01和250nM丁酸钠；
培养基E：基础培养基Advanced DMEM/F12中添加GlutaMAX、非必需氨基酸NEAA、B-27细胞培养添加剂、脂肪酸复合物Chemically Defined Lipid Concentrate和血清替代物Knockout™ Serum Replacement，其体积比为95：1：1：1：1：1，再添加0.5μM A83-01+15μMFH1+15μM FPH1+100nM 地塞米松+10μM 氢化可的松；
其中，培养基D和E中，GlutaMAX可以替换为谷氨酰胺。
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