CN116536250B - 人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法，该方法分化得到的肝细胞更具备原代肝细胞的形态特征，ALB阳性细胞占95%以上，CYP3A4表达超过80%，说明在诱导效率得到保证的前提下，实现肝细胞的高成熟度。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞生物学及再生医学领域，尤其是涉及一种人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法。
背景技术
肝脏是人体最重要的药物代谢器官，而药物的肝脏毒性是上市药品下架的主要原因之一。然而，目前临床前/临床仍缺乏一个适合广泛应用的肝脏药物代谢模型：1）动物模型中，药物清除率及肝脏毒性的预测与临床结果的相关性较差；2）人原代肝细胞，虽然作为药物代谢的金标准，但来源的短缺使其应用大大受限；且功能只能在体外保持2周；3）针对肝细胞在体外无法扩增的问题，研究人员开发了几种永生化细胞系；然而，这些细胞系或迅速在体外去分化，或丧失了关键代谢酶的酶活，难以应用于药物研发。综上，目前亟需开发一个合适的肝脏药筛工具，以满足肝病药物开发与靶标发现的迫切需求。
PSC（多能干细胞）是一类具有自我增殖能力与分化潜能的细胞，理论上可分化为组成身体的各类细胞，有望替代原代细胞实现多种临床/临床前的应用。近年来随着再生医学的快速发展，已有多种细胞谱系的分化方案相继被建立；2017年3月美国FDA在华盛顿DC宣布，启动“以hiPSC来源的细胞/组织作为药物代谢的新工具”的研究与实施计划。
PSC向肝细胞的体外分化技术最早于2007年由Duan Y等人建立（Duan Y et al,Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonicstem cells in vitro and in vivo；Stem cells 25.12 (2007): 3058-3068.）；随后5年，该方法经过一系列的改良，逐步形成了以定型内胚层、肝祖细胞、以及肝细胞三个基本分化阶段构成的定向分化方案。截至2017年，肝细胞分的分化效率已由最初的50%，一路提升至最高90%（Hay DC et al; Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-likeCells from Human Pluripotent Stem Cells; JoVE，121 (2017): e55355.）。然而，这些肝细胞的成熟度普遍较差，远不及原代肝细胞的水平；无法达到药物筛选的要求（ZakikhanK et al.; In Vitro Generated Hepatocyte-Like Cells: A Novel Tool inRegenerative Medicine and Drug Discovery; Cell J. 2017 Jul-Sep;19(2):204-217）。
对于目前同类型技术，即由多能干细胞体外诱导分化为肝细胞，缺点如下：1.诱导效率无法实现突破；目前大部分的体外诱导方案，分化效率为50-90%（Goldring C et al.,Stem cell-derived models to improve mechanistic understanding and predictionof human drug-induced liver injury; Hepatology, 2017, 65(2): 710-721.），无法实现进一步突破；2.肝细胞中的代谢酶CYP3A4（细胞色素P450家族3A4酶）负责代谢市面上40%以上的药物，是肝细胞成熟的关键标志物。现有体外诱导方案，CYP3A4的表达效率普遍低于30%（Shi Q et al., Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Hepatocyte-LikeCells as a Potential New Tool to Understand Small Molecule Kinase InhibitorsInduced Hepatotoxicity; American Pharmaceutical Review, 2017, 20: 64-67.）。
因此，如何在维持高分化效率的前提下，进一步提高其成熟度，尤其是关键药物代谢酶的表达，是目前需要解决的重要技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法，以解决上述问题。
为达到上述目的，本发明的技术方案实现方式如下：
一种人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法，通过添加人重组肝生长因子（HGF）诱导多能干细胞分化获得定型内胚层，人重组肝生长因子（HGF）的加入使得产生的内胚层具备更好的肝向诱导分化潜能；之后在定型内胚层继续分化得到肝祖细胞后，连续使用两种分化培养基依次培养，使得在定型内胚层阶段累积的肝向分化潜能进一步放大，最终产生极高纯度的成熟肝细胞；其中，第一种分化培养基包括TGF-β抑制剂、4,4'-二乙酰胺基二苯基甲烷（FH1）、2-[(5-氯-2-甲基苯基)(甲基磺酰基)氨基]-N-(2,6-二氟苯基)乙酰胺（FPH1），第二种分化培养基在第一种分化培养基的基础上还包括石胆酸（LCA）和甲萘醌4 （MK4）。
优选地，HGF的使用浓度为 2-20ng/ml。
优选地，TGF-β抑制剂为A83-01与其盐化物或SB-431542中的任一种。其中，盐化物可以是A83-01钠盐。
优选地，TGF-β抑制剂的使用浓度为0.2-1μM；4,4'-二乙酰胺基二苯基甲烷FH1的使用浓度为10-20μM，2-[(5-氯-2-甲基苯基)(甲基磺酰基)氨基]-N-(2,6-二氟苯基)乙酰胺FPH1的使用浓度为10-20μM，石胆酸LCA的使用浓度为5-15μM，甲萘醌4 MK4的使用浓度为5-16μM。
优选地，两种分化培养基中还包括地塞米松DEX和氢化可的松HH。
优选地，地塞米松的使用浓度为0.1-1μM，氢化可的松的使用浓度为3-30μM。
优选地，两种分化培养基中还包括Advanced DMEM/F12、0.2-2%非必须氨基酸、0.2-2%L-谷氨酰胺、0.5-2% B27营养补充物和0.2-10%血清替代物 KSR。
优选地，定型内胚层分化得到肝祖细胞的培养基包括含有0.2-2%非必须氨基酸、0.2-2%L-谷氨酰胺、5-50%血清替代物KSR的IMDM基础培养基和添加剂0.3-2%二甲基亚砜、0.05-0.3mMβ-巯基乙醇。
优选地，多能干细胞分化为定型内胚层的天数为2-3天，定型内胚层分化为肝祖细胞的天数为5-6天，细胞在第一种分化培养基中培养的天数为5-6天，细胞在第二种分化培养基中培养的天数为12-13天。
本发明还提供了由上述所述的方法构建的成熟肝细胞，所述成熟肝细胞的ALB阳性细胞占95%以上，CYP3A4表达超过80%。
相对于现有技术，本发明所述的人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法具有以下优势：
本发明所述的人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法能够在维持高分化效率的前提下，进一步提高其成熟度，尤其是关键药物代谢酶的表达；即，本发明的肝细胞诱导效率可达95%以上，CYP3A4表达率超过80%，意味着肝细胞在整体上很成熟，使得由本技术分化得到的肝细胞具备更好的药物筛选潜力。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明分化得到的肝细胞更具备原代肝细胞的形态特征；（a）为成熟的肝细胞；（b）为标志物ALB荧光检测结果图；（c）为标志物CYP3A4荧光检测结果图；
图2为S1阶段产物AFP表达水平分析；AFP为肝祖细胞标志物；生物学重复n=4；**，p＜0.01；
图3为S1阶段HGF对终产物的成熟肝细胞标志物表达水平分析；NTCP、G6PC、ATGL、CYP3A4分别为肝细胞胆汁酸代谢标志物、糖代谢标志物、脂质代谢标志物以及药物代谢标志物；其均为成熟肝细胞标志物；生物学重复n=4；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；
图4为S3和S4阶段关键因子对终产物的成熟肝细胞标志物表达水平分析；方案a-e为在其他条件不变的情况下，去除S3阶段的关键因子后，成熟肝细胞标志物CYP3A4的表达水平变化；方案h-l为在其他条件不变的情况下，去除S4阶段的关键因子后，成熟肝细胞标志物CYP3A4的表达水平变化；生物学重复n=4；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；
图5为Hay DC的肝细胞分化方案得到的肝细胞的形态特征；（a）为肝细胞；（b）为标志物ALB荧光检测结果图；（c）为标志物CYP3A4荧光检测结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明提供了一种人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法，该方法包括如下步骤：
S1、通过添加人重组肝生长因子HGF诱导多能干细胞分化获得定型内胚层，人重组肝生长因子HGF的加入使得产生的内胚层具备更好的肝向诱导分化潜能；HGF的使用浓度为2-20ng/ml；在该范围内均可以实现本发明目标，优选地，HGF的使用浓度为10ng/ml；培养天数为2-3天。
其中，S1使用的培养基中还包括含有1%GlutaMax、2% B27（-In）的RPMI1640基础培养基和添加剂20-200ng/ml Activin A、20-100ng/ml Wnt3a；优选地，Activin A为100ng/ml，Wnt3a为50ng/ml。
另外，S1的培养基还可以在其他定型内胚层分化培养基的基础上添加HGF，同样，HGF的加入能使得S1阶段产生的内胚层具备更好的肝向系诱导分化潜能，但最终得到的效率与本发明略有不同。
HGF信号是肝脏早期发育过程中，由间质细胞分泌而来，是决定肝细胞命运的关键信号。我们推测，如果在诱导分化之初就加入HGF，或许有助于提高内胚层向肝系诱导分化的潜能。
S2、之后定型内胚层继续分化得到肝祖细胞，培养天数为5-6天；
其中，S2使用的培养基中还包括含有0.2-2%非必须氨基酸、0.2-2%L-谷氨酰胺、5-50%血清替代物KSR的IMDM基础培养基和添加剂0.3-2%二甲基亚砜、0.05-0.3mMβ-巯基乙醇。
优选地，培养基包括含有1%非必须氨基酸、1%L-谷氨酰胺、20%血清替代物KSR的IMDM基础培养基和添加剂1%二甲基亚砜、0.1mMβ-巯基乙醇。
S3、将得到的肝祖细胞在第一种分化培养基中培养5-6天；
第一种分化培养基包括TGF-β抑制剂、4,4'-二乙酰胺基二苯基甲烷FH1、2-[(5-氯-2-甲基苯基)(甲基磺酰基)氨基]-N-(2,6-二氟苯基)乙酰胺FPH1。
其中，TGF-β抑制剂为A83-01与其盐化物或SB-431542中的任一种，优选地，TGF-β抑制剂为A83-01；TGF-β抑制剂的使用浓度为0.2-1μM，在该范围内均可以实现本发明目标，优选地，浓度为0.5μM；FH1的使用浓度为10-20μM，在该范围内均可以实现本发明目标，优选地，浓度为15μM；FPH1的使用浓度为10-20μM，在该范围内均可以实现本发明目标，优选地，浓度为15μM。
肝祖细胞一旦产生，其具备两种方向的分化潜能：一种是肝细胞，一种是胆细胞。而A83-01作为TGF-β信号的抑制剂，有助于抑制向胆系的分化，从而偏向肝系分化。因此，我们加入TGF-β。
FH1与FPH1是肝细胞的促成熟剂，我们在A83-01的基础上加入，为促进肝细胞成熟。
优选地，第一种分化培养基还包括地塞米松DEX和氢化可的松HH；地塞米松的使用浓度为0.1-1μM，在该范围内均可以实现本发明目标，优选地，浓度为0.1μM；氢化可的松的使用浓度为3-30μM，在该范围内均可以实现本发明目标，优选地，浓度为10μM。
DEX和HH是上皮细胞的广谱促成熟剂，因此，我们在上述的基础上加入，助力肝细胞的成熟。
更优选地，第一种分化培养基还包括Advanced DMEM/F12、0.2-2%非必须氨基酸、0.2-2%L-谷氨酰胺、0.5-2% B27营养补充物和0.2-10%血清替代物 KSR。
具体地，培养基还可包括Advanced DMEM/F12、1%非必须氨基酸、1% L-谷氨酰胺、1% B27营养补充物和1%血清替代物 KSR。
S4、将上述得到的细胞在第二种分化培养基中继续培养12-13天。
第二种分化培养基在第一种分化培养基的基础上还包括石胆酸LCA和甲萘醌4MK4。
其中，LCA的使用浓度为5-15μM，在该范围内均可以实现本发明目标，优选地，浓度为10μM；MK4的使用浓度为5-16μM，在该范围内均可以实现本发明目标，优选地，浓度为10μM。
通过LCA与MK4激活肝细胞药物代谢酶的核心调控因子PXR的表达，从而提高药物代谢酶的表达水平。
连续使用上述两种分化培养基依次培养，使得在定型内胚层阶段累积的肝向分化潜能进一步放大，最终产生极高纯度的成熟肝细胞。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
然而，以下实施例仅用于说明本发明，本发明的内容不限于此。
实施例中用到的相关试剂示于表3。
实施例参照肝脏发育线索，以人多能干细胞为分化起点，在体外依次模拟定型内胚层的形成、肝祖细胞的形成、不成熟肝细胞的形成、以及成熟肝细胞的形成等4个关键发育阶段，从而在26天内高效地实现成熟成肝细胞的获取。
实施例
具体方法如下：
分化前，以1.3×105个细胞/cm2的接种密度进行细胞接种，24h后，细胞汇合度达30-40%，即满足诱导分化的启动要求，开始以下分化操作：
S1：多能干细胞分化为定型内胚层（第1-3天）
培养基包括基础培养基和添加剂：
基础培养基为含有1%GlutaMax、2% B27（-In）的RPMI1640；
添加剂包括：100ng/ml Activin A、50ng/ml Wnt3a、10ng/ml HGF。
S2：定型内胚层分化为肝祖细胞（第4-8天）
培养基包括基础培养基和添加剂：
基础培养基为含有1%NEAA、1%GlutaMax、20% KSR的IMDM；
添加剂包括：1% DMSO、0.1 mM β-ME。
S3：肝祖细胞分化为不成熟肝细胞（第9-13天）
培养基包括基础培养基和添加剂：
基础培养基为含有1%NEAA、1%GlutaMax、1% B27、1% KSR的Advanced DMEM/F12；
添加剂包括：0.5μM A83-01、15μM FH1、15μM FPH1、0.1μM DEX、10μM HH。
S4：不成熟肝细胞分化为成熟肝细胞（第14-26天）
培养基包括基础培养基和添加剂：
基础培养基为含有1%NEAA、1%GlutaMax、1% B27、1% KSR的Advanced DMEM/F12；
添加剂包括：0.5μM A83-01、15μM FH1 、15μM FPH1、10μM LCA、10μM MK4、0.1μMDEX、10μM HH。
S1-S4期间，每日更换培养基。
对比例1
经典方法分化方法（即不加HGF），研究HGF的作用。
对比例2
在添加HGF的基础上，研究本方法S3与S4阶段诱导分化培养基中的关键因子组合（A83-01、FH1、FPH1、LCA以及MK4）对最终肝细胞的成熟度的影响。
表1 S3阶段因子组合方案
表2 S4阶段因子组合方案
其中，“+”代表添加，“-”代表未添加。
对比例3
Hay DC的肝细胞分化方案是目前分化效率最高的方案，也是最被广泛应用的分化方案之一（Hay DC et al; Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-likeCells from Human Pluripotent Stem Cells; JoVE，121 (2017): e55355.）。
与该方案比较肝细胞的成熟度。
Hay DC的肝细胞分化方案为：
S1内胚层：
100ng/ml Activin A、50ng/ml Wnt3a in 1%GlutaMax/2% B27/RPMI1640。
S2肝祖：
1% DMSO、0.1mM β-ME in 1%NEAA/1%GlutaMax/20% KSR/Knockout DMEM。
S3成肝细胞：10ng/ml HGF、20ng/ml OSM、10μM HH in 1%GlutaMax/HepatoZEME。
结果分析：
1、如图1，为本发明分化得到的肝细胞，更具备原代肝细胞的形态特征：1）清晰的细胞核、2）更多的双核细胞数量、3）有的细胞上有脂滴等；肝细胞比例更高（ALB阳性细胞比例97%）；且成熟的肝细胞更多（CYP3A4阳性细胞比例87%）。
2、如图2所示，与既往的经典方法相比，在S1阶段加入HGF，确实可以增加该阶段衍生物中肝系基因的表达水平。
加入HGF使得其S1衍生物的肝祖细胞标志物的表达量更高，提示该条件使得衍生物更具备向肝系诱导分化的潜能。
而分化至终末的比对结果（如图3所示）亦证明：S1加入HGF使得产生的肝细胞更成熟：一系列成熟标志物表达水平均显著更高，包括肝细胞胆汁酸代谢标志物NTCP、糖代谢标志物G6PC、脂质代谢标志物ATGL、以及药物代谢标志物CYP3A4。
3、通过图4可知，分别在S3或S4去除某个或某些关键因子，均会导致肝细胞成熟标志物CYP3A4表达量的降低，说明了2种分化培养基在获得成熟肝细胞中的重要性。
而且S3和S4缺一不可，S4是S3的进一步成熟化，缺少任一步、任一种主要成分都会影响肝细胞的成熟度。
4、图5为Hay DC的肝细胞分化方案得到的肝细胞的形态特征，通过与图1相比，本发明的肝细胞比例更高（ALB阳性细胞比例97% vs 92%），成熟的肝细胞更多（CYP3A4阳性细胞比例87% vs 48%）。
表3 相关试剂
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
S1、将多能干细胞分化为定型内胚层，分化天数为2-3天；
培养基包括基础培养基和添加剂：
基础培养基为含有1% L-谷氨酰胺、2%无胰岛素B27营养补充物的RPMI1640；
添加剂包括：100ng/ml Activin A、50ng/ml Wnt3a、10ng/ml HGF；
S2：将定型内胚层分化为肝祖细胞，分化天数为5-6天；
培养基包括基础培养基和添加剂：
基础培养基为含有1%非必须氨基酸、1% L-谷氨酰胺、20% KSR的IMDM；
添加剂包括：1%二甲基亚砜、0.1 mM β-巯基乙醇；
S3：将肝祖细胞分化为不成熟肝细胞，分化天数为5-6天；
培养基包括基础培养基和添加剂：
基础培养基为含有1%非必须氨基酸、1% L-谷氨酰胺、1% B27营养补充物、1% KSR的Advanced DMEM/F12；
添加剂包括：0.5μM A83-01、15μM FH1、15μM FPH1、0.1μM地塞米松、10μM 氢化可的松；
S4：将不成熟肝细胞分化为成熟肝细胞，分化天数为12-13天；
培养基包括基础培养基和添加剂：
基础培养基为含有1%非必须氨基酸、1% L-谷氨酰胺、1% B27营养补充物、1% KSR的Advanced DMEM/F12；
添加剂包括：0.5μM A83-01、15μM FH1 、15μM FPH1、10μM石胆酸、10μM甲萘醌4、0.1μM地塞米松、10μM氢化可的松。
2.根据权利要求1所述的人多能干细胞向成熟肝细胞体外定向分化的高效方法，其特征在于：多能干细胞分化为定型内胚层的天数为3天，定型内胚层分化为肝祖细胞的天数为5天，肝祖细胞分化为不成熟肝细胞的天数为5天，不成熟肝细胞分化为成熟肝细胞的天数为13天。
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