CN102834505A - 用于人胚胎干细胞分化的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
描述了用于诱导将人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的方法，所述的方法包括将所述的细胞或细胞群与GSK-3抑制剂进行温育。还描述了用于诱导将定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法，以及用于诱导将人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法。还描述了由所述方法得到的细胞和该细胞在治疗及毒性筛选中的用途。
Description
发明背景
本发明涉及用于人胚胎干细胞分化的组合物和方法，具体地涉及用于将人胚胎干细胞向定形内胚层细胞分化的组合物和方法。
人胚胎干细胞（ESC）具有卓越的无限自我更新能力以及分化成为包括发育中胚胎的三个胚层的所有细胞的潜力，这使得其作为用于再生性药物中的细胞来源和作为早期人发育模型都是有吸引力的。
通过与糖原合成酶激酶（GSK-3）抑制剂温育，可以将鼠胚胎干细胞保持在自我更新的状态。例如，Bone等人（2009）中，描述了多种GSK-3抑制剂，所述抑制剂能够促进鼠胚胎干细胞的自我更新。
在体内正常发育过程中发生的事件的顺序可能为理解ESC分化的控制提供了重要的线索。定形内胚层（DE）在早期胚胎发生的原肠胚形成阶段，当原胚层、中胚层、内胚层和外胚层的形成发生时出现。在这一阶段，未分化的上胚层细胞通过称作原条（primitive streak）（PS）的结构迁移。所述的中胚层和DE指定在PS的前部区域，并且认为是从普通的祖细胞群体，中内胚层产生（Tada等人，2005）。
有效地产生定形内胚层的能力具有很大的临床重要性，所述的定形内胚层是产生内胚层衍生的细胞谱系的前体细胞类型，所述的内胚层衍生的细胞谱系包括肝脏胰腺、肺、甲状腺和肠的那些。具体地，从治疗和药学的观点看，需要衍生具有肝脏潜能的内胚层。对于移植疗法来说，缺少可用的供体肝脏。除此之外，需要用于预测毒理学的功能性肝细胞。当前，将原代人肝细胞用于药学筛选，但是伴随细胞的缺乏，以及该细胞类型的增殖和维持不充分，必须发现可替换的来源，并且来自人ESC的肝细胞带来巨大的希望。
发明概述
根据本发明的一个方面，提供了用于将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的方法，该方法包括将所述的细胞或者细胞群与GSK-3抑制剂温育。
引人注目的是，发现了与GSK-3抑制剂在促进鼠胚胎干细胞的自我更新中的作用直接相比，当给予到人胚胎干细胞时GSK-3抑制剂能够诱导分化。
根据本发明的另一个方面，提供了GSK-3抑制剂用于将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了人胚胎干细胞分化组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂，其中所述的组合物能够将将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化。
同样地，在一个实施方案中，提供了将人胚胎干细胞向定形内胚层细胞分化的组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂。
根据本发明的另一个方面，提供了诱导定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群分化的方法，所述的方法包括将所述的细胞或细胞群与GSK-3抑制剂温育。
根据本发明的另一个方面，提供了GSK-3抑制剂用于诱导定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群分化的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了定形内胚层分化组合物，所述的组合物含有GSK-3抑制剂，其中所述的组合物能够将定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群分化。
同样地，在一个实施方案中，提供了定形内胚层向肝细胞样细胞分化的组合物，所述组合物包含GSK-3抑制剂。
根据本发明的又一个方面，提供了用于诱导人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法，所述的方法包括将所述的细胞或细胞群与GSK-3抑制剂温育。
根据本发明的另一个方面，提供了GSK-3抑制剂用于诱导人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的用途。
根据本发明的另一个方面，提供了人胚胎干细胞分化组合物，所述组合物包含GSK-3抑制剂，其中该组合物能够将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化。
同样地，在一个实施方案中，提供了人胚胎干细胞向肝细胞样细胞分化的组合物，所述组合物含有GSK-3抑制剂。
优选地，所述的方法是体外方法。
在本发明的另一个实施方案种，提供了包含在本文中描述的组合物的培养基。优选的培养基的实例包括mTeSR1（RTM）化学限定hESC培养基（来自Stem Cell Technologies）和补加了KO血清替代物的KnockOut（KO）达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基（DMEM；Invitrogen）。
同样地，在一个实施方案中，提供了人胚胎干细胞向定形内胚层分化的培养基，所述培养基包含GSK-3抑制剂。
在另一个实施方案中，提供了定形内胚层向肝细胞样细胞分化的培养基，所述培养基包含GSK-3抑制剂。
在再一个实施方案中，提供了人胚胎干细胞向肝细胞样细胞分化的培养基，所述培养基包含GSK-3抑制剂。
根据本发明又一个方面，提供了按照本文所描述的方法得到的细胞或者细胞群。
本发明的再一个方面涉及人胚胎干细胞和GSK-3抑制剂在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及定形内胚层细胞和GSK-3抑制剂在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的药物中的用途。
本发明的又一个方面涉及本文所描述的细胞或细胞群在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的药物中的用途。
本发明的另一个方面涉及在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的方法，所述的方法包括向受试者给予含有人胚胎干细胞和GSK-3抑制剂的组合物。
本发明的又一个方面涉及用于在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的方法，所述的方法包括向受试者给予含有定形内胚层细胞和GSK-3抑制剂的组合物。
本发明的再一个方面涉及在受试者中治疗肝脏疾病，或者重建受损肝脏的方法，所述的方法包括向受试者中给予组合物，所述组合物包含本文所描述的细胞或细胞群。
优选地，所述的肝脏疾病与肝脏组织的损失、损伤或者缺少相关联。肝脏疾病的实例包括肝炎、肝硬化、血色素沉着症、Wilson病、苯丙酮尿症或者影响肝脏的遗传性疾病（例如Crigler-Najjar综合征）。
损伤的肝脏可以导致，例如，随后患肝脏疾病的延长或者随后去除部分或者全部肝脏的手术。同样地，术语“重建受损肝脏”可以指在受试者中重建全部或者部分的肝脏。
优选地，所述的受试者是患肝脏疾病的患者，或者经历手术以去除全部或部分肝脏的患者。优选地，所述的受试者是人。
给予根据本发明的药物所需要的步骤取决于牵涉的肝脏疾病或者肝脏重建的性质。该规程对于本领域技术人员来说是已知的，并且可以相应地进行实施。例如，其可以将本发明的药物或者组合物通过注射直接给予到需要的部位。作为选择，所述的药物或者组合物可以在外科手术过程中给予，例如在从患者中去除一部分肝脏之后。
根据本发明的又一个方面，还提供了在本文中描述的细胞或细胞群用于筛选药物毒性的用途。例如，在本文中描述的肝细胞样细胞可以用于药物毒性的筛选方法中。
在本发明的一个方面，提供了评估化合物对肝脏细胞毒性的方法，所述的方法包括：
（i）将所述的化合物与本文所述的细胞或者细胞群温育；并且
（ii）评估该化合物对所属细胞或者细胞群的毒性，
其中所述的毒性指示了肝脏毒性。
毒性可以通过本领域技术人员已知的方法来测量。在一个实例中，细胞死亡指示了化合物对于细胞的毒性。在一个实例中，测量从裂解的细胞释放的乳酸脱氢酶（LDH）指示了毒性。在另一个实例中，细胞形态学的改变指示毒性。
在一个实例中，样品中有活力细胞的数量的降低指示了化合物的毒性。在样品中，有活力细胞的数量可以在使用活体染料染色之后进行计数。细胞毒性检测试剂盒可在市场上买到，并且该试剂盒的实例是来自Sigma Aldrich的TOX1细胞毒性比色测定试剂盒（TOX1Cell toxicity Colorimetric AssayKit），其通过线粒体脱氢酶来测量活细胞的活性。
优选地，所述的细胞或细胞群是如本文所述的肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群。
同样地，在一个实施方案中，提供了如本文所述的肝细胞样细胞或者肝细胞样细胞群用于评价化合物对肝脏细胞毒性的用途。
优选地，所述的方法是体外方法。优选地，所述的方法指示该化合物的体内肝脏毒性。
优选地，所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
其中，
R1是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；
R2是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；或者
R1和R2一起是未经取代的或者由OR6或者R7取代的-(CH2)n-，或者是-(CH2CH2O)m(CH2)2-；
R3是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R4是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R5是H或者CH2芳香基，其中芳香基是未经取代的或者由烷氧基（优选甲氧基）取代的；
R6是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
R7是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
n是6、7、8、9、10或11；
m是3或4；
X和Y独立地是C或者N。
SitBuPh2意思是叔丁基二苯基甲硅烷基
优选地，R1和R2一起是-(CH2)pCH(OR6)(CH2)q-或者-CH(R7)(CH2)q-，其中p是1、2、3或4，以及q是4、5、6、7或8。
优选的GSK-3抑制剂的结构可以清楚地从表3中引用上式A的情况下得出。
在尤其优选的实施方案中，所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
在另一个实施方案中，所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
其中，
R5是H或CH2Ph；
R6是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；并且
R7是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
在其他的实施方案中，所述的GSK-3抑制剂是BIO，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物。BIO是市场上可得到的GSK-3抑制剂，其具有以下的结构：
在其他的实施方案中，所述的GSK-3抑制剂是CHIR99021，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物。CHIR99021是市场上可得到的GSK-3抑制剂，其具有以下的结构：
其他的GSK抑制剂对于本领域技术人员而言是已知的。此外，本领域技术人员能够通过常规的方法确定化合物是否能作为GSK-3抑制剂起作用，例如在Bone等人（2009）中所描述的。
应当认识到，在本文中所描述的人胚胎干细胞可以从干细胞库中得到。同样地应当认识到，为了重复在此限定的本发明，不要求破坏人的胚胎。除了从干细胞库（例如UKSCB）获得人胚胎干细胞之外，应当认识到存在其他非胚胎的来源。例如许多组所描述的，可以将成年的细胞重新编程成为等价于胚胎干细胞的多能性细胞。其一个实例如Takahashi等人（2007）描述的。因此，在本文中指代胚胎干细胞时，其意图覆盖等价于胚胎干细胞的重新编程细胞，即诱导型多能干细胞。
本发明的示例性实施方案在此结合所附的图进行描述。
附图的简要说明
图1显示了hESC使用1M处理诱导了分化。将人的ESC[SHEF3]使用指明浓度的BIO或者化合物1M处理，或者左侧未经处理作为对照，并且培养7天。（A）图像显示了在指明的处理之后形成的典型的群体。度量标尺代表1mm。（B）在使用针对多能性标志物Tra-1-60或者SSEA4的抗体进行免疫染色之后，通过流式细胞法分析的ESC的直方图。在表1中给出了阳性细胞的百分比和平均荧光强度。（C）从细胞中提取RNA，并且使用对多能性基因OCT4和NANOG，以及对持家基因β-肌动蛋白有特异性的引物进行RT-PCR分析。（D）将从细胞中提取的蛋白质进行蛋白质印迹分析，并且使用对Oct4有特异性的抗体进行免疫印迹。将印迹去除，并使用抗-Grapdh抗体重新探测，从而评估等量的加载。（E）化合物1O也诱导人ESC的分化。将SHEF3细胞使用标明浓度的1O处理7天。图像显示了典型的群体形态。（F）使用Tra-1-60和SSEA4抗体染色之后通过流式细胞法分析的ESC的直方图。在图上标明了阳性细胞的百分比和平均荧光强度的分析。（G）OCT4和NANOG表达的RT-PCR分析。各个基因的条带来自除去了干扰样品的同一块凝胶。（H）OCT蛋白表达的蛋白质印迹分析。蛋白质的条带来自除去了干扰样品的同一免疫印迹。
图2显示了hESC使用化合物1M处理抑制了GSK-3介导的信号传导。（A）将ESC[SHEF3]在mTeSR1（RTM）培养基中的MEF上或者在Matrigel（RTM）上进行培养，并且使用BIO或者1M处理30分钟。制备蛋白质提取物，并且使用检测β-联蛋白的磷酸化形式的抗体来进行免疫印迹。重复检测总β-联蛋白在各个情况下的相同免疫印迹，从而评估负载。（B）使用BIO或者1M在标明的浓度下处理24小时的ESC[SHEF1]的TOPFlash荧光素酶报告基因检测。荧光素酶活性表示为和未经处理的（Con）细胞中归一化的TOPFlash荧光素酶活性相比，激活的归一化的TOPFlash荧光素酶活性的增长倍数。数据代表了三次独立试验的平均值+/-SEM。类似的结果在SHEF3ESC中观察到，
图3显示了1M处理诱导向定形内胚层的分化。人ESC[SHEF3]在化学限定的mTeSR1（RTM）培养基中的Martrigel（RTM）上无饲养地进行保持，并且使用2μM的1M处理标明的天数。（A）内胚层标志物FoxA2、Sox17和HNF4α的表达通过免疫荧光进行分析。使用化合物1M处理在7天处理后导致了所有标志物的表达。度量标尺代表50μm。（B）在使用1M处理标明的天数之后，于第7天收获ESC。提取RNA，并且使用对所标明的基因有选择性的引物进行RT-PCR分析。在SHEF1人ESC中观察到了类似的结果。（C）BIO诱导向DE的分化。将SGEF3ESC使用2μM的BIO处理标明的时间，并且使用针对内胚层标志物FOXA2、SOX17和HNF4α的抗体进行免疫染色。（D）化合物1L也诱导向DE的分化。将SHEF1ESC使用2μM的1L处理标明的时间，并且使用针对内胚层标志物FOXA2和HNF4α的抗体进行免疫染色。
图4显示1M诱导激活素/Nodal途径的激活。（A）从培养了7天的ESC[SHEF1]中提取RNA，所述的ESC[SHEF1]在2μM的1M存在下培养标明的天数。使用对所标明的基因有选择性的引物进行RT-PCR分析。（B）使用单独的2μM的1M或者与10μM的SB43125（S）联合处理ESC[SHEF1]标明的天数，并且对提取的RNA进行RT-PCR。（C）ESF[SHEF3]使用单独的1M处理，或者与100mg/ml的激活素A（A）联合进行处理标明的天数并且进行RT-PCR。（D）.ESC[SHEF1]使用2μM的1M，或者100mg/ml的激活素A（A）单独地，或者与1M联合处理5天。通过免疫荧光来分析内胚层标志物FoxA2和NHF4α。标出了由三个+/-SD视野中平均的阳性细胞的百分比的数目。度量标尺代表50μm。（E）ESC[SHEF1]使用2μM的1M，或者100mg/ml的激活素A（A）单独地，或者与1M联合处理5天。通过流式细胞法来分析DE标志物CXCR4的表达。
图5显示了人ESC分化成肝细胞样细胞。（A）分化方案的示意图。（B）第II阶段（d14）和第III阶段（d25）的分化细胞的图像。（C）从标明的分化阶段的细胞制备的RNA的RT-PCR表达分析，RT-PCR表达分析使用对所标明的基因特异性的引物。使用从人肝脏中提取的RNA作为阳性对照。使用β-肌动蛋白作为持家基因。（D）通过免疫荧光来分析在分化的第II阶段和第III阶段细胞中的FoxA2和早期肝脏标志物HNF4α，AFP和TTR。度量标尺代表50μm。（E）通过使用针对AFP的抗体进行免疫印迹分析来自适应48小时的第III阶段（d25）细胞的培养基（1μL），以及来自单独培养基（MA）的对照。纯化的AFP和适应HUH7细胞的培养基用作对照。（F）来自第III阶段（d25）培养基的人白蛋白的ELISA分析。（G）BIO-衍生的DE细胞分化成肝细胞样细胞。将SHEF3ESC使用2μM BIO处理5天来诱导向DE的分化。随后将ESC在肝诱导下并且在实验步骤和图5A中列出的成熟条件下培养。在分化的第II阶段及第III阶段的ESC中的FOXA2和早期肝标志物NHF4α、AFP和TTR通过免疫荧光进行分析。度量标尺代表50μm。（H）在BIO诱导的DE分化之后，使用对标明的基因有特异性的引物对从标明分化阶段的细胞中制备的RNA进行RT-PCR表达分析。
发明详述
本发明涉及GSK-3抑制剂在指导人胚胎干细胞向定形内胚层的细胞和具有肝细胞表型的细胞分化的用途。
小分子抑制剂的使用代表了有效地和再现性指导ESC向想要的细胞类型分化的强大方法。此前合成和表征了一组在小鼠ESC中抑制GSK-3的化合物，其导致自我更新提高（Bone等人，2009）。如本文所描述的，将人ESC使用这些GSK-3抑制剂中的一种，1M处理，出人意料地导致了向DE分化，以及在延长的处理下导致了显示早期肝特征的细胞群的产生。有趣的是，IM能活化Nodal信号传导途径，并且在促进分化上比激活素A更好。重要的是，得自1M的内胚层能够在确定的培养条件下产生具有更成熟肝细胞表型的细胞。使用在结构上无关的GSK-3抑制剂BIO得到了类似的结果，所述的BIO也能够诱导人ESC向DE分化。
此外，1M同系列的化合物例如1O和1L显示出与化合物1L指导向DE的分化的类似的能力。
本文中描述的结果证明了本发明方法相对于已知的方法具有多个优点；其简单并且稳健，需要单个的化学实体来指导远至成肝细胞的分化，其依靠基于单层的步骤，使用化学限定的培养基，适于区分hESC系并且容易放大。
本发明中和本发明的具体实例中使用的方法在下文中进行陈述。
在本说明书中，以使要撰写的说明书能够清楚和简要的方式来描述实施方案，但是期待并且应当认识到的是，实施方案可以进行多种组合或者分开，而不脱离本发明。
在本说明书中，术语“包含（comprises）”和“包含（comprising）”解释为意思是“包括，除了其他的以外”。这些术语不期待解释为“仅由……构成”。
提及GSK-3抑制时是指抑制一种或多种GSK-3酶。因此GSK-3抑制剂可以抑制GSK-3酶家族中的一个成员、几个成员或者全部成员。GSK-3酶家族是公知的，并且包括但不限于GSK-3α和GSK-3β。本领域技术人员能够通过常规方法来确定化合物是否可以作为GSK-3抑制剂起作用，例如在Bone等人（2009）中描述的以及结合图2所描述的那些。
术语“定形内胚层”是指在动物胚胎发育过程中形成的胚层之一。所述的定形内胚层在早期胚胎发育的原肠胚形成阶段出现，其在当原始胚层、中胚层、内胚层和外胚层形成时发生。
在本说明书中，如果细胞对于标志物FoxA2、Sox17和CXCR4是阳性的，则可以将其限定为是“定形内胚层”特有的或者是“定形内胚层细胞”。
在本说明书中，如果细胞对于标志物HNF4、AFP、白蛋白和运甲状腺素蛋白是阳性的，可以将其限定为是“肝细胞样细胞”。
在本说明书中，术语“约”意思是加或减20%，更优选地加或减10%，甚至更优选地加或减5%，最优选地加或减2%。
除了上文所列出的化合物的用途之外，本发明还意图涵盖该化合物的功能性同系物、衍生物和类似物的用途。在此环境下，同系物是与上文所描述的化合物具有大体上的结构类似性的分子，而类似物是不管是否有结构类似性，具有大体上生物类似性的分子。术语“衍生物”是指从上文所述的化合物衍生的分子。所述的衍生物可以例如是上文所述的化合物进行化学消化的产物，或者上文所述的化合物在合成上改变的衍生物。如果能抑制GSK-3，所述的同系物、衍生物和类似物被称为功能性同系物、衍生物和类似物。
结果
使用GSK-3抑制剂1M处理诱导人ESC的分化
在Bone等人，2009中描述了一组在小鼠ESC中抑制GSK-3的化合物。所述的化合物比市场上可得的抑制剂例如BIO具有更好的选择性，并且导致自我更新的提高。
现在发现了，与在小鼠中观察到的结果相比，使用GSK03抑制剂1M处理不保持人ESC的自我更新，而是诱导其分化。这一点真的是令人惊讶的和出乎意料的。
将人ESC使用2μM的化合物1M处理7天的时间导致了增殖和分化上引人注目的增加，所述的处理是在KO DMEM中的MEF上或者在无饲养的化学限定的系统中在mTeSR1（RTM）培养基中的Matrigel（RTM）上培养（图1）。这一点在通过流式细胞法分析表面标志物中体现，所述的流式细胞法显示出在使用1M处理之后多能性标志物Tra-1-60和SSEA4的表达引人注目地降低（图1B；表1）。基因表达分析还显示了多能性标志物OCT4和NANOG（图1C）的损失，并且Oct4蛋白的表达也有损失（图1D）。这些结果在SHEF1和SHEF3两者细胞系中均观察到，并且表明GSK-3抑制剂1M对人ESC具有稳健的和引人注目的效果，其导致多能性的损失和增殖的提高。此外，将SHEF3ESC使用化合物1O处理在两种培养条件下也诱导了类似的分化（图1E）。再一次地，这一点是通过流式细胞法测定的Tra-1-60和SSEA4表达下降（图1F），OCT4和NANOG基因表达的损失（图1G）和OCT4蛋白表达的损失（图1H）证明的。
由于化合物1M稳健地促进人ESC的分化，与此前在小鼠ESC中观察到的自我更新相反，目前也证实了该化合物在人ESC中抑制GSK-3的能力。结果显示在图2中。
人ESC的1M处理诱导向DE分化
观察到使用小分子的GSK-3抑制剂1M处理人ESC促进分化，随后确定了向该细胞正在分化的谱系分化。
以下的实验均对人ESC进行，所述的人ESC在化学限定的mTeSR1（RTM）培养基中的Matrigel（RTM）上进行无饲养培养。该体系具有简单和可靠的优点，这导致细胞培养和分化具有一致性和再现性。将1M处理的人ESC使用针对转录因子的抗体进行免疫染色，标明了该细胞以时间依赖的方式（图3A）向DE分化，所述的转录因子是在DE、FoxA2、Sox17和肝细胞核因子4α（HNF4α）中表达的转录因子。分化的7天中的基因表达分析显示了分化通过PS向DE的进展（图3B）。分化的诱导是通过OCT4和NANOG表达的损失来表明的。观察到了最初Brachyury（T）的上调，所述Brachyury（T）的上调定义了PS的形成，并且观察到了它在DE中的下调。其他的原条标志物goosecoid（GSC）和MIXL1类似地在早期的时间点被上调。随后肝细胞核因子（HNF）3β（FOXA2）和CXCR4，以及DE标志物SOX17进行表达，所述的肝细胞核因子（HNF）3β（FOXA2）和CXCR4在PS中表达，并且在DE的祖细胞中保持。SOX17和FOXA2不仅在DE中被表达，而且也在原始内胚层中被表达。然而，CXCR4在DE和中胚层中表达，但是不在原始内胚层中表达（McGrath等人，1999），并且其用作在小鼠（Yasunaga，2005）和人（D’Amour等人，2005）的ESC中区分原始内胚层和定形内胚层的标志物。重要的是，ESC（富含表面受体CXCR4）分化成具有肝细胞表型（Gouon-Evans等人，2006）或者胰腺内分泌细胞（D’Amour等人，2006）的内胚层细胞。SOX17、GSC和FOXA2的表达不是分化到原始内胚层的结果。有趣的是，在使用1M处理7天之后，观察到了HNF4α的表达和α-胎蛋白（AFP）的表达。尽管AFP是原始（内脏的）内胚层在发育的早期阶段的标志物，在较晚期其标志了肝脏谱系的最早期指标。HNF4α是调节肝脏特异性转录的级联性（cascade）的关键转录因子。总之，AFP和NHF4α到第7天为止的表达表明DE特有的细胞向早期肝脏谱系的熟化。
如使用针对DE标志物FOXA2、SOX17和NHF4α的抗体进行免疫染色表明的，使用BIO处理也诱导了向DE的分化（图3C）。类似地，使用化合物1L处理SHEF3ESC也诱导了向DE的分化（图3D）。
在1M诱导的DE中激活素/Nodal信号传导的涉及
在早期胚胎发育过程中，TGFβ信号传导路径牵涉到PS、中胚层和DE的形成中。在前体细胞通过PS的前区转化后，内胚层的特殊化需要高水平的Nodal，TGFβ超家族的成员。激活素是TGFβ超家族的另一个成员，所述的激活素结合与Nodal相同的受体，并用于在体外模拟Nodal活性。在人ESC中，DE的产生依赖于激活素/Nodal路径的活化（D’Amour等人，2005）。因此，随后确定1M化合物是否也激活Nodal路径。实际上，使用1M仅处理1天之后，观察到了NODAL基因表达的增加，该表达维持了长达3天，并且到第7天降低到基线水平（而不管培养基使用新鲜化合物每隔一天进行更换）（图4）。NODAL表达的诱导仅仅部分地被激活素受体样激酶4/5/7（ALK）抑制剂SB43125所抑制（图4B）。然而，使用SB34125处理引人注目地降低了1M-诱导的GSC和FOXA2表达，该表达是Nodal信号传导的下游靶。这些数据表明，1M是直接地或间接地活化Nodal信号传导路径，该路径对于1M诱导的DE形成是需要的。
随后研究了1M诱导的DE形成和单独激活素A处理相比，以及与1M联合处理相比的效率。基因表达分析（图4C）表明，在3天处理后，1M所诱导的PS标志物T和GSC的表达水平与单独激活素A诱导的水平相似；尽管看起来与激活素A联合进行诱导的表达略微更高。在诱导7天后，在1M单独处理之后观察到少的或者没有观察到T或者GSC表达，这表明通过PS的转化。GSC表达在激活素A的存在下被维持（所述的激活素单独或者与1M联合），由于GSC是Nodal信号传导的下游转录靶。DE标志物SOX17和FOXA2的表达和早期肝脏特异性转录因子HNF4α的表达在使用1M单独处理，或者与激活素A联合处理后显示为类似的。有趣的是，在激活素A的存在下，1M诱导的AFP表达缺失。Nodal信号传导在原肠胚形成期间持续，直到DE形成，在DE形成之后表达降低使得熟化并且形成肠道管（Collingnon等人，1996）。近期，在小鼠的ESC中，诱导的Nodal表达导致了DE特异化和随后Nodal的下调促进了DE的熟化（Takenaga等人，2007）。在此，1M诱导的AFP表达也与下降的Nodal基因表达相关。通过持续的激活素/Nodal信号传导抑制DE成熟可以是OCT表达维持的结果。Nodal信号传导牵涉到多能性的维持中，并且在原肠胚形成中维持OCT4表达是关键的。在使用激活素A处理7天之后，多能性标志物NANOG和OCT4两者都维持。然而，在1M的存在下，激活素A诱导的OCT4和NANOG的表达不维持，尽管上升水瓶的GSC说明，在激活素A的存在下，PS阶段1M诱导的熟化被抑制。这些结果说明了1M诱导的短暂Nodal信号传导途径的活化导致了对DE的特异化，并且所述DE随后熟化成早期肝脏表型。
为了进一步研究DE形成的效率，通过免疫荧光分析了FoxA2和HNF4α的表达（图4D）。使用1M处理5天导致细胞簇高比例表达FoxA2（73%的阳性），然而FOXA2在整个群体中的表达为35-40%。激活素A处理产生低比例的表达FOXA2的细胞（平均为8%），这是在整个群体中分布的。
加入激活素A未进一步提高1M诱导的FoxA2表达。化合物1M（20%）也显示出比激活素A单独（3%）产生更多的NHF4α-表达细胞。有趣的是，激活素A表现出抑制1M诱导的NHF4α-表达细胞的生成。通过流式细胞法分析CXCR4表达（图4E）表明，使用1M处理导致与激活素A单独处理（26.5%）相比，提高了CXCR4的表达（53.0%），然而1M与激活素A联合处理进一步提高CXCR4表达（85.0%）。
所得到的结果显示，在本文中所描述的培养条件下，与激活素A单独相比，1M诱导的DE形成的效率相似或更好。通过CXCR4表达评估，1M处理与激活素A联合可以导致DE形成增加，但是抑制向早期肝脏表型的进一步分化，所述进一步分化中HNF4α和AFP表达损失。
1M诱导的DE在体外具有肝细胞样潜力
随后，研究了化学诱导的DE产生肝细胞样细胞（HLC）的潜力。产生HLC的能力向指示化学上得到的DE的发育潜力提供产生功能HLC的终极目标。为了开始得到此潜力，采用了基于Argawal等人，2008工作（Argawal等人，2008）的分化方案，从而按照其实验步骤和图5A中所列出的来产生HLC。在1M诱导产生DE之后，通过将其在肝细胞生长因子（HGF）和成纤维生长因子4（FGF4）中培养来引发肝脏诱导，随后使用HGF、FGF4、制瘤素M（OSM）和地塞米松（Dex）的混合物来诱导HLC的成熟。在肝脏诱导（第II阶段）之后，细胞开始具有肝脏的特征（图5B）。其表达提高水平的AFP，并且表达白蛋白（ALB）、转铁蛋白（TFN）和转甲状腺激素蛋白（transthyrettin）（TTR）开始出现，这与最初的肝脏分化相关（图5C）。在肝脏的熟化步骤之后，第III阶段的细胞具有肝细胞的特征，所述肝细胞具有多边形形态、具有1或2个显著核仁的明显的圆形核，并且许多是双细胞核的。与第II阶段的细胞相比，成熟的细胞的ALB基因表达提高（图5C）并且如免疫染色所检测的HNF4α、AFP和TTR蛋白质提高（图5D）。为了评价肝脏特异性的功能，测定了关键血清蛋白，AFP和白蛋白的分泌。AFP和白蛋白两者均在得自1M诱导的DE的第III阶段细胞中检测到（图5E和5F）。这些结果表明，得自1M的定形内胚层具有分化成有肝细胞特征的细胞的潜力。使用得自BIO的DE细胞也产生了类似的结果（图5G和H）。
试验步骤
细胞培养
SHEF1和SHEF3人ESC得自UKSCB并且按照其方案中所概述的进行培养。简单地说，将ESC在丝裂霉素C-灭活的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层上保持，所述的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层位于KnockOut（KO）达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基（DMEM；Invitrogen）中，该培养基补加了KO血清替代物（KOSR，Invitrogen）、1mM的非必需氨基酸（NEAA；Invitrogen）、1mM的谷氨酰胺（Invitrogen）、0.1M的2-巯基乙醇（BioRad）、青霉素/链霉素，以及4ng/ml的重组人FGF2（Peprotech）。将培养物使用1mg/ml胶原蛋白酶以1:8到1:12的比例每7天进行传代。根据Stem CellTechnologies的方案，将培养物转移到在mTeSR1(RTM)（Stem CellTechnologies）培养基中的无饲养的化学限定培养系统中，所述的培养系统在ESC-限定的Martrigel（RTM）（BD）涂布的板上。
分化成定形内胚层和肝细胞样细胞
将ESC在mTeSR1（RTM）培养基中的Matrigel（RTM）涂布的板上，无饲养培养7天，并且每隔一天更新培养基，所述的培养基补加了2μM的化合物1M。定形内胚层培养物使用胶原蛋白酶（1mg/ml）进行传代，并且按1:10的比例在KO DMEM中的Matrigel（RTM）上铺板，所述的KO DMEM补加了谷氨酰胺、青霉素/链霉素、NEAA、2%（v/v KOSR）、10ng/ml HGF（Peprotech）和10ng/ml的FGF4，并且培养7天，并且每隔一天更新培养基。为了使HLC熟化，在上述培养基中添加10ng/ml的制瘤素和10-7的地塞米松（SIGMA），并且将该细胞培养额外的7天，每隔一天更新培养基。
反转录-聚合酶链式反应
使用TRIzol试剂（Invitrogen）按照生产商的说明书分离和纯化总RNA。cDNA合成之前，将所有的RNA样品使用DNase I（Ambion）处理，从而消除任何的污染基因组DNA。使用寡(dT)15（Promega）和SuperScript II（Invitrogen）将RNA（1μg）反转录成cDNA。使用表2中列出的引物和退火温度进行基因特异性的PCR。
免疫印迹法
制备了细胞裂解液（20μg），通过SDS-PAGE进行分离并且转移到此前描述的硝酸纤维网（Welham等人，1994）上。使用按如下稀释的一抗来进行免疫印迹：1：5,000抗-Oct4（Santa Cruz Biotechnology；sc-9081）；1:2,000抗-GAPDH（sc-20357）；1:10,000抗-磷酸化（Ser33/37/Thr41）β联蛋白（CellSignaling Technology；CST 9561）；1:1000抗β连环素（CST 9562）。使用1:10,000的缀合了辣根过氧化酶（DAKO）的抗-兔抗体，并且使用ECLAdvance（GE Healthcare）或者ChemiGlow（Alpha Innotech）根据生产商的指导来产生印迹。捕获图像，并且使用ImageQuant RT ECL系统（GEHealthcare）进行分析。将印迹去除，并如前文所述地重新探测（Welham等人，1994）。
流式细胞法
将ESC在37℃下胰蛋白酶解（0.05%胰蛋白酶-EDTA）10分钟，并且再悬浮到含有2%（v/v）的FBS（FBS/PBS）的PBS中。随后将细胞在冰上使用针对Tra-1-60（10μg/ml；Abcam）、SSEA4（15μg/ml；克隆MC813Abcam）或者藻红蛋白（PE）-缀合抗-CXCR4（1:100；克隆12G5；R&D Systems）的抗体染色45分钟。
将细胞洗涤，并且如果需要的话，使用缀合了荧光素异硫氰酸酯（FITC）的二抗（SIGMA）再染色30分钟。使用FACSCanto细胞计数器（BectonDickenson）执行流式细胞法，并且数据使用FACSDiva软件进行分析。根据正向和侧面的分布参数将死亡细胞从分析中排除。
用于测量β-联蛋白介导的转录活性的荧光素酶报告基因分析
TOPFlash荧光素酶报告基因质粒（在c-fos最小启动子上游有四个一致的TCF结合位点，其驱动萤火虫荧光素酶报告基因的表达）和其阴性对照质粒FOPFlash（含有四个突变的TCF结合位点）是由Dr.C.Dani（CNRS，Nice，France）提供的。为了将该分析归一化，使用Renilla荧光素酶对照载体phRL-TK（Promega）作为内部对照。将ESC在Matrigel（RTM）-涂布的24孔板上铺板5天，并且随后使用0.6μg的TOPFlash（或者FOPFlash）以及混合了3μl的脂质体2000（Invitrogen）的0.144μg phRL-TK进行转染。将转染混合物（0.1ml）加入到0.5ml新鲜TeSR1（RTM）的细胞中。24小时后，替换培养基，所述的培养基包含所标明的化合物，并且使其再培养24小时。制备细胞提取物，并且使用双重荧光素酶报告基因分析系统根据生产商（Promega）的说明书测定萤火虫和海肾荧光素酶活性。TOPFlash（FOPFlash）荧光素酶活性针对共转染了phRL-TK海肾荧光素酶活性进行归一。数据表示为相对于未经刺激的对照FOPFlash数值的增长倍数。
免疫荧光
将ESC在Matrigel（RTM）-涂布的lummox（Greiner Bio One）盘上培养，并且使用4%的多聚甲醛（PFA）在室温下固定20分钟。将细胞在PBST（具有0.1%的Triton X-100）渗透并且在10%的封闭试剂（Roche）中进行封闭，随后使用2%封闭试剂中的一抗在4℃下过夜温育。在用PBS洗涤之后，将细胞与缀合了FITC的二抗（Vector Labs）在室温下温育3小时。进一步洗涤之后，将细胞使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（SIGMA）进行染色，再次洗涤并且在MOWIOL中装配。使用了以下的抗体和稀释：山羊抗FoxA2（1:100，R&D Systems），小鼠抗Sox17（1:50，R&D Systems），兔抗HNF4α（1:100，Santa Cruz），兔-抗AFP（1：100，DAKO），兔抗TTR（1：100，DAKO）。在Zeiss 510Meta共聚焦显微镜上使用40x的目镜捕获图像。
表1：使用BIO和化合物1M处理的人ESC的流式细胞分析
表2:PCR引物
表3：优选的GSK-3抑制剂
小分子抑制剂的使用代表了指导胚胎干细胞（ESC）向特定的细胞类型分化的强大方法。定形内胚层特有的细胞的产生是化学指导分化的有吸引力的目标，肝脏和胰脏从所述的定形内胚层发育而来。具体地，产生肝细胞的能力不仅对于再生性药物是感兴趣的，还提供了药物毒性筛选的平台。目前证实了，使用GSK-3抑制剂处理促进人ESC向DE分化，延长的处理导致显示出肝细胞特征的细胞群的产生。反过来，这些细胞在确定的条件下具有进展成更为成熟的干细胞表型的能力。
应当理解，在本文中描述的这些优选实施方案的多种变化和修饰对于本领域技术人员来说是显而易见的。该变化和修饰可以在不背离本发明的精神和范围下，并且在不减少其所伴随的优点下进行。因此期待该变化和修饰认为被所附的权利要求所覆盖。
在本文中所引用的全部参考文献的内容都在此将其全文引入作为参考。
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Claims (27)
1.一种用于诱导将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的方法，该方法包括将所述的细胞或者细胞群与GSK-3抑制剂温育。
2.一种用于诱导将定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法，该方法包括将所述的细胞或者细胞群与GSK-3抑制剂温育。
3.一种用于诱导将人胚胎干细胞或者人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的方法，该方法包括将所述的细胞或者细胞群与GSK-3抑制剂温育。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
其中，
R1是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；
R2是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；或者
R1和R2一起是未经取代的或者由OR6或者R7取代的-(CH2)n-，或者是-(CH2CH2O)m(CH2)2-；
R3是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R4是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R5是H或者CH2芳香基，其中芳香基是未经取代的或者由烷氧基（优选甲氧基）取代的；
R6是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
R7是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
n是6、7、8、9、10或11；
m是3或4；
X和Y独立地是C或者N。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
6.通过根据前述权利要求中任一项所述的方法得到的细胞或细胞群。
7.GSK-3抑制剂用于诱导人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向定形内胚层特有的细胞或细胞群分化的用途。
8.GSK-3抑制剂用于诱导定形内胚层特有的细胞或细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的用途。
9.GSK-3抑制剂用于诱导人胚胎干细胞或人胚胎干细胞群向肝细胞样细胞或肝细胞样细胞群分化的用途。
10.人胚胎肝细胞和GSK-3抑制剂在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的药物中的用途。
11.定形内胚层细胞和GSK-3抑制剂在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的药物中的用途。
12.根据权利要求7到11中任一项所述的用途，其中所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
其中，
R1是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；
R2是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；或者
R1和R2一起是未经取代的或者由OR6或者R7取代的-(CH2)n-，或者是-(CH2CH2O)m(CH2)2-；
R3是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R4是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R5是H或者CH2芳香基，其中芳香基是未经取代的或者由烷氧基（优选甲氧基）取代的；
R6是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
R7是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
n是6、7、8、9、10或11；
m是3或4；
X和Y独立地是C或者N。
13.根据权利要求12所述的用途，其中所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
14.一种将人胚胎干细胞向定形内胚层细胞分化的组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂。
15.一种将定形内胚层向肝细胞样细胞分化的组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂。
16.一种将人胚胎干细胞向肝细胞样细胞分化的组合物，所述的组合物包含GSK-3抑制剂。
17.根据权利要求14到16中任一项所述的组合物，其中所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
其中，
R1是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；
R2是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；或者
R1和R2一起是未经取代的或者由OR6或者R7取代的-(CH2)n-，或者是-(CH2CH2O)m(CH2)2-；
R3是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R4是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R5是H或者CH2芳香基，其中芳香基是未经取代的或者由烷氧基（优选甲氧基）取代的；
R6是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
R7是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
n是6、7、8、9、10或11；
m是3或4；
X和Y独立地是C或者N。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
19.一种培养基，其包含根据权利要求14到18中任一项所述的组合物。
20.一种用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的方法，该方法包括向受试者给予包含人胚胎干细胞和GSK-3抑制剂的组合物。
21.一种用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的方法，该方法包括向受试者给予包含定形内胚层细胞和GSK-3抑制剂的组合物。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述的GSK-3抑制剂是具有以下结构的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
其中，
R1是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；
R2是H、C1-C6的烷基（优选CH3）或者CH2O(CH2)2SiCH3；或者
R1和R2一起是未经取代的或者由OR6或者R7取代的-(CH2)n-，或者是-(CH2CH2O)m(CH2)2-；
R3是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R4是H或者C1-C6的烷基（优选CH3）；
R5是H或者CH2芳香基，其中芳香基是未经取代的或者由烷氧基（优选甲氧基）取代的；
R6是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
R7是H、CH2CH=CH2、CH2CH2CH=CH2、CH2OCH2CH=CH2或者SitBuPh2；
n是6、7、8、9、10或11；
m是3或4；
X和Y独立地是C或者N。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的GSK-3抑制剂选自具有以下结构之一的化合物，或者其功能性衍生物、类似物或者同系物：
24.根据权利要求6所述的细胞或细胞群在制备用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的药物中的用途。
25.一种用于在受试者中治疗肝脏疾病或者重建受损肝脏的方法，该方法包括向受试者给予组合物，所述的组合物包含根据权利要求6所述的细胞或细胞群。
26.根据权利要求6所述的细胞或细胞群用于筛选药物毒性的用途。
27.一种用于评估化合物对肝脏细胞的毒性的方法，该方法包括：
（i）将所述的化合物与根据权利要求6所述的细胞或细胞群温育；并且
（ii）评估所述化合物对所述细胞或细胞群的毒性，
其中所述的毒性指示了肝脏毒性。
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