CN111876380B - 使人胚胎干细胞分化成间充质干细胞的诱导培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一组人胚胎干细胞(hESC)分化成间充质干细胞(MSCs)的诱导培养基，所述培养基包括原条(PS)细胞诱导培养基、外侧中胚层诱导培养基和MSCs诱导培养基。采用所述诱导培养基使hESC诱导分化成MSCs，主要涉及三个阶段，包括PS细胞的诱导，向外侧中胚层细胞的分化以及MSCs的分化。通过所述诱导培养基进行分阶段分化，整个分化过程可以追踪并质控，成本较低，且操作简单；获得hESC诱导分化成MSCs的中间产物，包括PS细胞、外侧中胚层细胞和MSCs；可以高效产生数量更多的MSCs，倍增时间更短，并且可重复，最短仅需17天即可获得成熟的MSCs；其中前两个阶段的分化诱导培养基为成分明确的无血清培养基，使分化出来的MSCs免受外源物质的污染，保证了其均一性和临床适用性。

Description

使人胚胎干细胞分化成间充质干细胞的诱导培养基
技术领域
本发明涉及生物与医药技术领域，具体而言，本发明涉及使人胚胎干细胞(hESC)分化成间充质干细胞(MSCs)的诱导培养基。
背景技术
MSCs由于具有多向分化能力和免疫调节特性(Le et al.，2012)，已被尝试用于治疗多种外伤性、退行性、炎症性疾病(Shi et al.，2018)和肿瘤，如关节软骨损伤、移植物抗宿主病和心肌缺血等等。可应用的MSCs来源广泛，几乎在所有成体结缔组织中都可以分离出，例如脐带、外周血、羊膜、子宫内膜、体液、胎盘、骨髓、脂肪和牙髓等。然而，成体来源的MSCs受细胞数量、异质性和生物安全性等问题的限制，限制了其临床治疗应用潜力的发挥。不仅如此，成体来源的MSCs也有传播供体病原体(Parekkadan et al.，2010)和遗传性疾病的风险。近年来，许多文章已经报道可以将人胚胎来源的干细胞(hESCs)诱导分化产生MSCs，为其用于临床治疗提供可能性。
人胚胎干细胞来源的MSCs(hESC-MSCs)具有与人成体来源的MSCs相似的生物学特性和功能。相对于成体来源的MSCs来说，hESC-MSCs具有以下优点：(1)来源无限并且一致，不受细胞数量的限制；(2)具有更高的纯度和更快的增殖速度；(3)具有较低的免疫原性，即更高的免疫安全性；(4)不受供者年龄和原有疾病(尤其是遗传性疾病)的影响；(5)可以像药品一样，事先备好，随取随用，易质控。
现有的从ESC产生MSCs的方法主要有：OP9共培养法(Barberi et al.，2005，Olivier et al.，2006)、三维胚状体(EB)诱导法(Brown et al.，2009，Wei et al.，2012)和培养基直接诱导法(Gonzalo-Gil et al.，2016，Harkness et al.，2011)。这些方法尽管取得了一定的进展，但大多数策略都需要费力的操作，包括刮取、手工挑选、细胞分选或连续传代(Fukuta et al.，2014；Gibson et al.，2017；Kopher et al.，2010)，培养时间长等，仍然存在局限性。而且在采用的培养基方面，全过程采用同样的培养基进行粗放性培养，无法对中间过程进行精准质控；此外，培养基中还使用未明确的成分(例如胎牛血清或OP9饲养细胞)，导致不同批次间分化的细胞质量差异，进而极大地损害临床适用性(Barberi et al.,2005,Hwang et al.,2008,Olivier et al.,2006)。
CN104487568B公开了一种利用胚胎干细胞经过中间产物滋养细胞分化成MSCs的方法，并且所述分化的滋养细胞进而向hESCs-T-MSCs或T-MSCs分化。方法采用的hESCs需在已被辐射的小鼠胚胎成纤维细胞做饲养细胞的条件下培养(见实施例1)，对后期的细胞移植存在潜在的动物来源抗原成分或病原体传播的危险性；在采用的培养基方面，由于从滋养层细胞分化到MSCs过程中采用统一培养基，无法对从滋养层细胞分化到MSCs过程中的中间产物阶段Pre-T-MSC进行质控，因此导致分化过程难以稳定，难以得到质量均一的MSCs。
CN108753711A公开了一种在人多能干细胞(hPSC)的培养体系，通过低糖培养基对hPSC连续进行处理，无法对中间过程进行精准质控，随后用明胶包被培养系统对细胞进行压力筛选，并通过胰蛋白酶对细胞连续单细胞传代，从而将hPSC分化为MSCs。该培养体系耗时长，需1个月，并且还需明胶包被培养系统对细胞进行压力筛选，操作复杂。
因此，开发快速和高效的方法并采用特定培养基来诱导hESC分化为MSCs变得至关重要。如何在统一的培养体系中，以较为简单、较低的花费、高效地将hPSC转化为功能性、可以临床使用的hMSCs仍需进一步研究。
与分化策略发展的进步形成鲜明对比的是，关于分化过程背后的分子特征和机制知之甚少(Deng et al.，2016；Luzzani和Miriuka，2017)。这在很大程度上归因于以下事实，即大多数分化方法需要数周的时间才能从hPSC生成均质MSCs，因此解析基本的分化路径较为困难。近来研究报道用SB431542抑制转化生长因子β(TGF-β)信号传导也增强了MSC的生成(Fukuta et al.，2014；Mahmood et al.，2010)。添加骨形态发生蛋白4(BMP4)，生长因子(如bFGF、EGF和PDGF-AB等)和抗坏血酸显著加强了iPSC向MSC分化(Liu et al.,2020)。联合添加BMP4和A83-01(TGF-β/ALK5抑制剂)可促进hESC向MSC分化(Wang et al.,2018)。也有报道称抑制核因子κB(NF-kB)信号传导或EZH2增强了hPSC向MSCs的分化(Denget al.，2016；Yu et al.，2017)。
最近，有报道称胚胎中胚层祖细胞在多种发育信号通路的影响下，在成年肢体中产生长骨，其中也伴随着MSCs的生成。并且该文章绘制了ESC向长骨分化的图谱。首先，hESC在ACTIVINA的作用下分化成为PS细胞，随后在TGF-β抑制的作用下产生外侧中胚层，而后产生肢芽中胚层和长骨，并且有MSCs产生(Kyle et al.,2016)。
目前关于hESC诱导分化成MSCs的方法，由于对其中间过程不了解，都是用同样的培养基粗放性培养，无法对中间过程进行精准质控，从而难以获得质量均一的MSCs。本发明拟将hESC按照发育学原理分阶段逐步诱导分化成MSCs，中间过程包括PS细胞阶段、外侧中胚层细胞阶段。从而建立一个高效、稳定、可质控的分化体系，获得稳定、质量均一的MSCs用于治疗。
发明内容
本发明创建了一个过程明确的hESC来源MSCs的体外三阶段分化培养基。
通过对不同阶段的分化培养基进行质控，可以短时间内高效地产生大量来源明确、质量均一稳定的MSCs。该方法使用的培养基无血清且成分明确，操作简单，无需分选，生产成本低，克服了现有技术的不足。
为实现上述发明目的，本发明提供了一组诱导hESC分化成MSCs的诱导培养基，包含PS诱导培养基、外侧中胚层诱导培养基和MSCs诱导培养基。
进一步地，所述的PS诱导培养基采用以mTeSR1 no selected factors、低糖DMEM培养基或DMEM/F12中的一种作为基础培养基，添加激活素A，CHIR99021(GSK-3α/β抑制剂)，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)和PIK90(磷酸肌醇3激酶抑制剂)。
进一步地，所述的激活素A浓度为20～35ng/mL，CHIR99021浓度为2～5μM，bFGF浓度为15～20ng/mL，PIK90浓度为20～100nM。
进一步地，所述的外侧中胚层诱导培养基采用mTeSR1 no selected factors、低糖DMEM培养基或DMEM/F12中的一种作为基础培养基，添加有A-83-01(ALK5-TD的抑制剂)，LDN-193189(选择性的BMP信号通路抑制剂)，BMP4(骨形态发生蛋白4)，CHIR99021(GSK-3α/β抑制剂)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)。
进一步地，所述的A-83-01浓度为0.5～1.5μM，LDN-193189浓度为200～300nM，BMP4浓度为10～20ng/mL，CHIR99021浓度为2～4μM，bFGF浓度为15～25ng/mL。
进一步地，所述的MSCs诱导培养基采用低糖DMEM(Gibco，C11885500BT)作为基础培养基，添加FBS，青霉素-链霉素溶液，谷氨酰胺，bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，PDGF-AB(血小板衍生生长因子)，EGF(表皮细胞生长因子)和抗坏血酸。
进一步地，所述的FBS浓度为10％，青霉素-链霉素溶液浓度为1％，谷氨酰胺浓度为1～5mM，bFGF浓度为5～10ng/ml，PDGF-AB浓度为3～8ng/ml，EGF浓度为8～15ng/ml，抗坏血酸浓度为20～50μg/ml。
本发明所述的hESC诱导分化成MSCs的方法，包含以下步骤：
1)hESC在PS诱导培养基中培养，获得PS；
2)PS在外侧中胚层诱导培养基中培养，获得外侧中胚层细胞；
3)外侧中胚层细胞在MSCs诱导培养基中培养，获得MSCs。
进一步地，步骤1)所述的PS诱导培养基培养时间为24小时。
其中，研究小组经过大量实验证明，PS诱导培养基中的各种成分作用如下：激活素A(ACTIVINA)的加入能够帮助启动PS和中胚层分化；CHIR99021的加入能够诱导造骨细胞；碱性成纤维生长因子(bFGF)的加入能够促进细胞分化，迁移；磷酸肌醇3激酶抑制剂(PIK90)的加入能够抑制细胞增殖，促分化。
进一步地，步骤2)所述的外侧中胚层诱导培养基培养时间为2天。
其中，研究小组经过大量实验证明，外侧中胚层诱导培养基中的各种成分作用如下：A-83-01和LDN-193189为转化生长因子-β(TGF-β)抑制剂；骨形态发生蛋白4(BMP4)，骨形成蛋白，刺激DNA的合成和细胞的复制；CHIR99021，诱导造骨细胞；碱性成纤维生长因子(bFGF)，促进细胞分化，迁移。
进一步地，步骤3)所述的MSCs诱导培养基培养时间为3-6天。
本发明提供的方法可以直接获得在人类胚胎中以前无法接近的中间细胞，包括PS细胞、外侧中胚层细胞和MSCs，这三种细胞可以有效地全面概括MSCs发展的每个主要阶段，并能通过三种细胞的状态来测试MSCs长期自我更新过程中各种小分子的作用，为hESC分化过程背后的分子特征和机制的进一步研究提供指导依据，进一步推动hESC来源的MSCs在细胞治疗、再生医学和精准医疗等领域的发展。本发明总耗时17天，能产生高产量和高纯度的MSCs。
进一步地，步骤1)包括：
a)将hESC用Accutase解离成单细胞；
b)1：10接种在基质胶Matrigel包被的6孔板中，每孔含2ml的mTeSR1培养基，其中TeSR1培养基中添加有ROCK抑制剂Y-27632；
c)培养过夜，丢弃原有培养基，用DMEM/F12短暂清洗hESC；
d)加入PS诱导培养基，培养24小时，获得PS细胞。
进一步地，步骤2)包括：
a)丢弃步骤1)的培养基，用DMEM/F12短暂清洗hESC；
b)加入外侧中胚层诱导培养基，培养2天，每天更换外侧中胚层诱导培养基，细胞生长至90％以上，获得外侧中胚层细胞。
进一步地，步骤3)包括：
a)将外侧中胚层细胞1：6传代至Matrigel包被的6孔板中，每孔含2ml的外侧中胚层培养基，过夜后，丢弃原有培养基，用无钙离子和镁离子的D-PBS清洗孔；
b)加入MSCs诱导培养基，培养3-6天，每天更换一半新鲜培养基；
c)待细胞生长至80-90％时，1：3传代至明胶包被的6孔板中，每孔含有2ml MSCs诱导培养基，过夜，丢弃原有培养基，用钙离子和镁离子的D-PBS清洗孔；
d)加入MSCs传代培养基，每3-4天更换新鲜培养基，培养5-8天，获得成熟的MSCs。
进一步地，所述的MSCs传代培养基培养，包括低糖DMEM为基础培养基，添加FBS，青霉素-链霉素溶液和谷氨酰胺。
进一步地，所述的MSCs传代培养基培养，包括低糖DMEM为基础培养基，添加10％FBS，1％青霉素-链霉素溶液和2mM谷氨酰胺。
进一步地，步骤1)完成后，采用免疫荧光染色显示，检测多能性标志物OCT4和PS标志物T的表达量，观察PS细胞诱导效果。
OCT4阳性表达是hESC细胞保持其全能性的标志，T阳性表达是PS的标志。PS诱导后，第2天，免疫荧光染色显示，多能性标志物OCT4开始消失，PS标志物T大量表达，阳性率是99.73％，表明PS诱导成功。
进一步地，步骤2)完成后，采用免疫荧光染色显示，检测外侧中胚层标志物HAND1的表达量，判断外侧中胚层细胞诱导效果。
HAND1阳性表达是外侧中胚层细胞的标志。外侧中胚层诱导后，第4天，免疫荧光染色显示，外侧中胚层标志物HAND1大量表达，阳性率是92.47％，表明外侧中胚层诱导成功。
进一步地，步骤3)完成后，采用免疫荧光和流式的结果显示，检测CD73,CD90和CD105的表达量，判断MSCs诱导效果和传代效果；以及成脂、成骨和成软骨三系分化染色结果显示，判断其成脂、成骨和成软骨能力。
MSCs的鉴定可通过检测细胞表面标记CD73、CD90和CD105，免疫荧光和流式的结果显示，第17天时，即可获得表达CD73、CD90和CD105的MSCs，CD73、CD90和CD105的阳性率分别是91.2％、87.2％和96.9％；第21天，CD73、CD90和CD105的阳性率分别是97.8％、97.4％和98.8％，CD34和CD45阳性率均低于2％，符合MSCs的标准。三系分化染色结果显示，本发明所述方法得到的MSCs具有成脂、成骨和成软骨的能力，符合MSCs标准。
另一方面，本发明还提供了一组混合物用于制备诱导hESC分化成PS细胞的PS细胞诱导培养基的用途，其特征在于，所述混合物包括以mTeSR1 no selected factors、低糖DMEM培养基或DMEM/F12中的一种作为基础培养基，添加激活素A，CHIR99021，bFGF和PIK90。
再一方面，本发明还提供了一组混合物用于制备诱导PS细胞分化成外侧中胚层细胞的外侧中胚层细胞诱导培养基的用途，其特征在于，所述混合物包括以mTeSR1 noselected factors、低糖DMEM培养基或DMEM/F12中的一种作为基础培养基，添加有A-83-01，LDN-193189，BMP4，CHIR99021和bFGF。
再一方面，本发明还提供了一组混合物用于制备诱导外侧中胚层细胞分化成MSCs的MSCs诱导培养基的用途，其特征在于，其特征在于，所述混合物采用低糖DMEM作为基础培养基，添加FBS，青霉素-链霉素溶液，谷氨酰胺，bFGF，PDGF-AB，EGF和抗坏血酸。
本发明提供了一组诱导hESC分化成MSCs的诱导培养基，并采用所述诱导培养基，促使hESC诱导分化成MSCs，主要有以下有益效果：
1、通过分阶段的三种诱导培养基，进行依序分化，使整个分化过程可以追踪并质控，并且没有涉及到滋养层细胞共培养，胚状体产生，流式细胞分选和额外的培养设备的使用，成本相对较低，且操作简单。
2、获得hESC诱导分化成MSCs的中间产物，包括PS细胞、外侧中胚层细胞和MSCs。
3、完成了在分阶段分化过程中，对培养基中各组分作用的测试和分析。
4、可以高效产生数量更多的hESC-MSCs，倍增时间更短，并且可重复，最短仅需17天即可获得成熟的MSCs。
5、分化诱导培养基为成分明确的无血清培养基，使分化出来的MSCs免受外源物质的污染，保证了其一致性和临床适用性。
附图说明
图1为hESC经过PS诱导，向外侧中胚层祖细胞的分化以及MSCs的分化，最后获得成熟MSCs的流程图，每个分化阶段诱导培养基需要添加的成分以及相关的关键生物标记如图所示
图2为实施例1中PS诱导后对多能性标志物OCT4和PS标记物T进行免疫荧光染色法检测结果图
图3为实施例1中PS诱导后表达PS标记物T的细胞比率。
图4为实施例2中外侧中胚层诱导后对外侧中胚层细胞标志HAND1进行免疫荧光染色法检测结果图
图5为实施例2中外侧中胚层诱导后不同时间点表达外侧中胚层细胞标志HAND1的细胞比率
图6为实施例3中第17和23天获得的MSCs的细胞表面标记CD105进行荧光染色法检测结果图
图7为实施例3中第7、11、17、21天获得的MSCs的细胞表面标记CD73、CD90和CD105流式细胞术分析结果图，以及第21天获得的MSCs的细胞表面标记CD34、CD45流式细胞术分析结果图
图8为实施例3中hESC分化为MSCs过程中第7、11、17、21天的显微镜下形态学照片
图9为实施例4中MSCs具有成脂肪、成骨、成软骨分化能力鉴定图
图10为实施例5中对第21天采用PSC商业的分化培养基诱导分化所得的MSCs与实施例3所得的MSCs进行流式细胞术分析结果图
图11为实施例5中本发明所述方法诱导分化获得成熟的MSCs和PSC商业的分化培养基进行诱导分化获得成熟的MSCs传代的倍增时间示意图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。实施例中未注明具体条件者按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过市售购买获得的常规产品。
实施例1PS诱导阶段，获得PS细胞
本实施例中使用的hESC系为WA09，购买自WiCell研究中心，并签署相关条例。
(1)将hESC用Accutase解离成单细胞，1：10接种在基质胶(Matrigel)包被的6孔板中，每孔含2ml的mTeSR1培养基(其中添加有ROCK抑制剂Y-27632)。
(2)培养过夜后，丢弃原有的培养基，用DMEM/F12短暂清洗hESC，加入PS诱导培养基(mTeSR1 no selected factors(Promega Stemcell公司，货号05896)作为基础培养基，添加有35ng/mL激活素A(R&D Systems公司，货号：338-AC)+4μM CHIR99021(Selleckchem公司，货号：S1263)+19ng/mL bFGF(Peprotech公司，货号：100-18B)+60nM PIK90(Selleckchem公司，货号：S1187))培养24小时。
(3)OCT4阳性表达是hESC细胞保持其全能性的标志，T阳性表达是PS细胞的标志。诱导后第2天进行免疫荧光染色法检测，0.01M PBST漂洗5分钟，10％BSA37湿盒内封闭30分钟，在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体，防淬灭封片剂封片，避光保存，荧光显微镜观察拍照，免疫荧光染色结果显示如图2所示(其中DAPI为染细胞核的染料，merge图是免疫荧光图和DAPI图的叠加)，多能性标志物OCT4开始消失，PS标志物T大量表达。PS诱导后表达PS标记物T的细胞比率如图3所示，可见PS诱导后，标志物T的阳性率是99.73％，表明PS细胞诱导成功，获得均一的PS细胞。
实施例2外侧中胚层诱导阶段，获得外侧中胚层细胞
(1)取实施例1获得的PS，丢弃原有的培养基，用DMEM/F12短暂清洗hESC，加入外侧中胚层诱导培养基(mTeSR1 no selected factors(Promega Stemcell公司，货号05896))作为基础培养基，添加有1.2μM A-83-01(Selleckchem公司，货号：S7692)+260nM LDN-193189(Selleckchem公司，货号：S2618)+16ng/mL BMP4(Peprotech公司，货号：120-05)+3μM CHIR99021(Selleckchem公司，货号：S1263)+21ng/mL bFGF(Peprotech货号：100-18B))，培养2天。每天更换培养基，细胞生长至90％以上时，进行传代。
(2)HAND1阳性表达是外侧中胚层细胞的标志。外侧中胚层诱导后，第4天，进行免疫荧光染色法检测，用0.01M PBST漂洗5分钟，10％BSA37湿盒内封闭30分钟，在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体，防淬灭封片剂封片，避光保存，荧光显微镜观察拍照，免疫荧光染色显示结果如图4所示，外侧中胚层标志物HAND1大量表达。外侧中胚层诱导后不同时间点表达外侧中胚层细胞标志HAND1的细胞比率如图5所示。由图5可以看出，外侧中胚层诱导后，标志物HAND1的阳性率是92.47％，表明外侧中胚层诱导成功，获得均一的外侧中胚层细胞。
实施例3MSCs诱导阶段，获得成熟的MSCs
(1)取实施例2获得的外侧中胚层细胞，将外侧中胚层细胞1：6传代至Matrigel包被的6孔板中，每孔含2ml的外侧中胚层培养基。过夜后，丢弃原有的培养基，用D-PBS(无钙离子和镁离子)清洗孔，加入MSCs诱导培养基(低糖DMEM(GIBCO公司，货号C11885500BT)+10％FBS+1％青霉素-链霉素溶液+4mM谷氨酰胺+8ng/ml bFGF(Peprotech货号：100-18B)+6ng/ml PDGF-AB(Peprotech货号：100-00AB)+11ng/ml EGF(Peprotech货号：100-61)+35μg/ml抗坏血酸)，培养3-6天，每天更换一半的新鲜培养基。待细胞生长至80-90％时，进行传代。
(2)将细胞1：3传代至明胶包被的6孔板中，每孔含有2ml MSCs诱导培养基，过夜后，丢弃原有的培养基，用D-PBS(无钙离子和镁离子)清洗孔，加入MSCs传代培养基(低糖DMEM+10％FBS+1％青霉素-链霉素溶液+2mM谷氨酰胺)，每3-4天进行换液和传代，培养至第17-21天，即可获得成熟的MSCs。图8为第7、11、17和21天的显微镜照片，从照片可以看出，第17-21天，MSCs已分化完成。
(3)MSCs的鉴定可通过检测细胞表面标记CD73、CD90和CD105，使用进行免疫荧光染色法检测和流式细胞术分析，免疫荧光染色法检测，用0.01M PBST漂洗5分钟，10％BSA37湿盒内封闭30分钟，在标本片上滴加适当稀释的荧光标记抗体，防淬灭封片剂封片，避光保存，17天和23天的荧光显微镜观察拍照，结果如图6所示，细胞表面标记CD105大量表达。进一步采用Cytoflex流式细胞仪(Beckman Coulter)染色分析本实施例获得的MSCs，使用含2％的BSA的PBS清洗和封闭细胞，并根据厂商说明书使用抗体对各种细胞表面标记染色，所述标记有CD73、CD90和CD105，使用CytExpert 2.3收集和分析数据，结果如图7所示，第7天时，MSCs中已开始表达CD73、CD90和CD105；第17天时，MSCs中87.2％细胞表达CD90，91.2％细胞表达CD73，96.9％细胞表达CD105；第21天时，MSCs中97.4％细胞表达CD90，97.8％细胞表达CD73，98.8％细胞表达CD105，低于2％的细胞表达CD34，低于2％的细胞表达CD45。
实施例4MSCs多能性分化检测
使用实施例3获得的成熟MSCs进行多能性分化检测。
1、成脂肪分化鉴定
MSCs在传代的同时以2×104/cm2的密度接种于24孔板中，每孔加入15％FBS，1ng/ml bFGF的低糖DMEM培养液0.8ml；待细胞达80％融合，换为诱导培养液(高糖DMEM，10％FBS，氢化可的松，异丁基甲基黄嘌呤，吲哚美辛)，以后每3～4d换一次液；诱导2周后进行油红O染色鉴定。结果如图9所示，可见本发明诱导得到的MSCs具有成脂肪分化能力。
2、成骨分化鉴定
MSCs在传代的同时按1×104/cm2的密度接种于24孔板中，十字混匀，待24小时细胞贴壁后，每孔换成0.5ml成骨诱导液(高糖DMEM,10％FBS,β甘油磷酸钠，地塞米松，抗坏血酸)，并每2-3天换液，并在显微镜下观察诱导情况；第21天收样，进行茜素红染色，吸去培养基，用1xPBS洗3遍用95％乙醇固定10分钟，双蒸水冲洗3遍加入200ul2％PH＝4.2的茜素红染料，室温染30分钟，用双蒸水洗去多余的染料，显微镜观察。结果如图9所示，可见本发明诱导得到的MSCs具有成骨分化能力。
3、成软骨分化鉴定
诱导培养基：高糖DMEM+1％青霉素-链霉素溶液+丙酮酸钠+抗坏血酸+地塞米松+1％ITS+TGF-β3。细胞培养：取2x10^5cell细胞悬液分装到15ml离心管，重新离心并小心去除上清，轻轻沿着管壁加入软骨诱导液，放入CO2培养箱，先旋紧管盖，再旋松半圈；每3天换一次液，并观察诱导情况，第21天进行阿利新蓝染色，弃去培养基，用1xPBS洗3次，用4％多聚甲醛固定30分钟，用1xPBS洗3次，用阿利新蓝染料染色过夜(200ul/管)，1xPBS洗3次，洗至不褪色，在体视镜下拍摄4.5X图片。结果如图9所示，可见本发明诱导得到的MSCs具有成软骨分化能力。
实施例5与PSC商业的分化培养基对比
PSC商业的分化培养基是赛贝生物开发的一种适用于无饲养层培养、化学成分明确、并且不含动物源蛋白的人多潜能干细胞完全培养基。
本发明所述的hESC诱导分化为MSCs的方法，与直接采用PSC商业的分化培养基进行诱导分化相比，本发明所述方法成本较低，每10次hESC诱导分化成本约为2500元，而直接采用PSC商业的分化培养基的成本为8000元。
采用PSC商业的分化培养基进行诱导分化获得成熟的MSCs需要21天，且MSCs传代的倍增时间为28.8天，而本发明所述方法诱导分化获得成熟的MSCs只需17天，且MSCs传代的倍增时间为22.65天(如图11所示)
采用PSC商业的分化培养基诱导分化所得的MSCs与实施例3所得的MSCs进行流式细胞术染色分析，使用Cytoflex流式细胞仪(Beckman Coulter)，使用含2％的BSA的PBS清洗和封闭细胞，并根据厂商说明书使用抗体对各种细胞表面标记染色，所述标记有CD73、CD90和CD105，使用CytExpert 2.3收集和分析数据，结果如图10所示，第21天时，采用PSC商业的分化培养基诱导分化所得的MSC中98.5％细胞表达CD73，95.6％细胞表达CD90，82.4％细胞表达CD105；实施例3所得的MSC中99.5％细胞表达CD73，96.5％细胞表达CD90，99.6％细胞表达CD105，可见采用本发明所述方法诱导hESC分化得到的MSCs数量更多。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (2)

1.诱导hESC分化成MSCs的诱导培养基，其特征在于，由PS细胞诱导培养基、外侧中胚层诱导培养基和MSCs诱导培养基组成；所述的PS细胞诱导培养基由mTeSR1 no selectedfactors、35ng/mL激活素A，4μM CHIR99021，19ng/mL bFGF和60nM PIK90组成；所述的外侧中胚层诱导培养基由mTeSR1 no selected factors、1.2μM A-83-01，200~300nM LDN-193189，10~20ng/mL BMP4，2~4μM CHIR99021和15~25ng/mL bFGF组成；所述的MSCs诱导培养基由低糖DMEM基础培养基， 10% FBS、1%青霉素-链霉素溶液、1~5mM谷氨酰胺、5~10ng/mlbFGF、3~8ng/ml PDGF-AB、8~15ng/ml EGF和20~50μg/ml抗坏血酸组成。
2.一组混合物用于制备诱导PS细胞分化成外侧中胚层细胞的外侧中胚层细胞诱导培养基的用途，其特征在于，所述混合物由mTeSR1 no selected factors、1.2μM A-83-01，200~300nM LDN-193189，10~20ng/mL BMP4，2~4μM CHIR99021和15~25ng/mL bFGF组成。
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