CN117305222A - 多能干细胞分化为肾祖细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法。该方法将诱导多能干细胞接种于基质胶中，分阶段加入含有Y‑27632、CHIR 99021、KOSR血清替代物、NEAA、retinoic acid、FGF9和/或Activin A等试剂的培养基诱导细胞分化而得到肾祖细胞。本发明所述的方法，无需用到胎牛血清，降低了NPC用于人体因血清残留而产生的异种免疫反应风险，而且IPSC分化为NPC比较完全，残留的IPSC比较少。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法。
背景技术
肾祖细胞（nephron progenitor cells, NPC）存在于胚胎发育过程中的一个短暂阶段，肾祖细胞会继续分化形成肾单位。研究发现，肾祖细胞(Pax-2+)有助于肾脏损伤修复，具有治疗肾脏疾病的应用前景。
目前，现有技术将人诱导多能干细胞（IPSC）分化获得肾祖细胞样细胞（NPC）的方法耗时比较长，而且难以将细胞完全定向分化，获得的NPC细胞纯度比较低，存在一定量未分化的IPCS。另一方面，现有技术中在体外培养IPSC诱导分化为NPC均要加入胎牛血清，胎牛血清中含有牛外泌体和外源性细胞外囊泡，以及多种未知成分，对细胞培养难免会引起一些其他的生物活性，细胞残留胎牛血清，若用于人体会诱发异种免疫反应。其次，胎牛血清作为动物源生物制品，可能携带支原体、病毒等传染性物质，难以去除。还有胎牛血清批次间较大的质量差异，难以保障多批次之间的细胞质量稳定性。
发明内容
为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法。
本发明提供了一种由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，其包括如下步骤：
S1. 接种诱导多能干细胞于基质胶中，加入含有Y-27632的TeSR-AOF培养基培养细胞20~50h；
S2. 将TeSR-AOF培养基更换成RPMI1640培养基培养细胞，往培养基中加入KOSR血清替代物、NEAA以及CHIR 99021，培养细胞20~50h；
S3. 更换新的RPMI1640培养基培养细胞，往培养基加入KOSR血清替代物、NEAA以及retinoic acid，培养细胞20~50h；
S4. 更换新RPMI1640培养基培养细胞，往培养基中加入血清替代物、NEAA、FGF9和Activin A，培养细胞150~220h，其中每20~50h换液一次。
优选地，所述诱导多能干细胞为人源。
优选地，步骤S1所述的基质胶为Vitronectin XF基质胶或Laminin 521基质胶。
优选地，步骤S1所述Y-27632的工作浓度为2~25μM。
优选地，步骤S2~S4中KOSR血清替代物在培养基中的体积占比>5%。
优选地，步骤S2~S4中KOSR血清替代物在培养基中的体积占比7.5~10%。
优选地，步骤S2所述NEAA工作浓度为1X，CHIR 99021工作浓度为1~10μM；步骤S3所述NEAA工作浓度为1X，retinoic acid工作浓度为1~10μM；步骤S4所述NEAA工作浓度为1X、FGF9工作浓度为25~300 ng/mL，Activin A工作浓度为5-20ng/mL。
本发明还通过了一种由上述方法制备得到的肾祖细胞。
有益效果
（1）本发明提供了一种由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法；该方法没有使用到含胎牛血清等动物源成分的培养基，降低支原体、病毒污染的风险，降低NPC用于人体时产生异种免疫反应的风险；
（2）本发明由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法效率高，IPSC分化为NPC比较完全，残留的IPS比较少。
此外，发明人需要说明的是：在本发明所述的方法中，血清替代物的选择尤为关键；采用其它血清替代物，在细胞培养过程中要么造成细胞凋亡，要么造成Vitronectin XF基质胶出现“卷边现象”，不能使得IPSC分化成NPC；而采用KOSR血清替代物，可以抑制Vitronectin XF基质胶出现“卷边现象”，在细胞培养过程中不会造成细胞凋亡，进而使得IPSC能够分化成NPC。
此外，发明人需要说明的是：在本发明所述的方法中，KOSR血清替代物的添加量同样也是十分关键，在KOSR占培养基体积分数比较低（≤5%）的条件下，Vitronectin XF基质胶也会出现“卷边现象”，使得细胞无法继续培养。
此外，发明人需要说明的是：在本发明所述的方法，在不同阶段选用不同的培养基，才能使得IPSC分化为NPC比较完全；否则IPSC残留比较多。
附图说明
图1为按照实施例1所述的方法获得的NPC的照片。
图2为按实施例1的方法，IPSC分化为NPC前，以及IPSC经步骤S1-S4分化为NPC后，检测其IPSC标志基因OCT4、NANOG、SOX2和NPC标志基因WT1、ITGA8的表达结果图。
图3为按照实施例2所述的方法获得的NPC的照片。
图4为按实施例2的方法，IPSC分化为NPC前，以及IPSC经步骤S1-S4分化为NPC后，检测其IPSC标志基因OCT4、NANOG、SOX2和NPC标志基因WT1、ITGA8的表达结果图。
图5为按实施例2的方法，IPSC分化为NPC前，以及IPSC经步骤S1-S4分化为NPC后，检测其中步骤S2-S4中KOSR体积浓度对NPC标志基因WT1、PAX2、PAX8表达的影响的结果图。
图6为实施例和对比例所述方法培养过程中是否出现“卷边现象”的观察照片；其中，图6中的A为对比例1的照片，图6中的B为对比例2的照片，图6中的C为实施例3的照片，图6中的D为实施例1的照片，图6中的E为对比例3的照片，图6中的F为对比例4的照片。
图7为按照对比例7所述的方法获得的NPC的照片。
图8为检测按照对比例7所述的方法获得的NPC中IPSC标志基因OCT4、NANOG、SOX2和NPC标志基因WT1、ITGA8的检测结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。下述细胞的培养环境如无特殊说明，均在37℃，5%CO2环境下培养。
实施例1
由人诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法包括如下步骤：
步骤S1：在6孔板中每孔加入1 mL Vitronectin XF基质胶，37℃孵育6孔板2小时；每孔接种3.8X105个IPSC于基质胶中，加入TeSR-AOF培养基（培养基中含有工作浓度为25μM的Y-27632）培养IPSC 24小时。
S2：更换RPMI1640培养基培养细胞，往RPMI1640培养基中加入KOSR血清替代物（KOSR体积占比10%），KOSR血清替代物的品牌为KNOCKOUTTM SR XenoFree CTSTM；加入NEAA(Non-Essential Amino Acids)和CHIR 99021，NEAA工作浓度为1X，CHIR 99021工作浓度为2 μM，培养细胞24小时；
S3：更换新的RPMI1640培养基培养细胞，往RPMI1640培养基中加入KOSR血清替代物（KOSR体积占比10%），加入NEAA和RA(Retinoic Acid)，NEAA的工作浓度为1X，RA的工作浓度为10 μM，培养细胞24小时；
S4：更换新的RPMI1640培养基培养细胞，往RPMI1640培养基中加入KOSR血清替代物（KOSR体积占比10%），加入NEAA、FGF9(Human FGF9)和Activin A，NEAA的工作浓度为1X，FGF9工作浓度为300 ng/mL，Activin A的工作浓度为10 ng/mL，培养细胞168小时（每24小时换液一次，指更换新的培养基、KOSR、NEAA、FGF9和Activin A）。
结果：步骤S4培养168小时后，获得的NPC如图1所示，图中没有明显的IPSC细胞残留（IPSC细胞残留少）。将步骤4所得细胞收集，检测IPSC标志基因OCT4、NANOG、SOX2和检测NPC标志基因WT1、ITGA8，内参为GAPDH，检测方法根据qPCR试剂盒说明书操作。qPCR结果如图2所示，从qPCR结果可知，分化后IPSC干性基因在步骤S4后显著下降，NPC标志基因显著上升，证明IPSC分化为NPC比较完全。
实施例2
由人诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法包括如下步骤：
步骤S1：在6孔板中每孔加入1 mL的Laminin 521基质胶，37℃孵育6孔板2小时；每孔接种3.8X105个IPSC于基质胶中，所用培养基为TeSR-AOF（培养基中含有工作浓度为2μM的Y-27632）培养IPSC 24小时；
S2：更换RPMI1640无血清培养基培养细胞，往RPMI1640培养基中加入KOSR血清替代物（KOSR体积占比10%）；加入NEAA和CHIR 99021，NEAA工作浓度为1X，CHIR 99021工作浓度为10 μM，培养细胞48小时；
S3：更换新的RPMI1640培养基培养细胞，往RPMI1640培养基中加入KOSR血清替代物（KOSR体积占比10%），加入NEAA和RA(Retinoic Acid)，NEAA的工作浓度为1X，RA的工作浓度为1 uM，培养细胞48小时。
S4：更换新的RPMI1640培养基培养细胞，往RPMI1640培养基中加入KOSR血清替代物（KOSR体积占比10%），加入NEAA、FGF9和Activin A，其中NEAA的工作浓度为1X，FGF9工作浓度为25 ng/mL，Activin A的工作浓度为10 ng/mL，培养细胞216小时（每24小时换液一次）。
结果：步骤S4培养细胞216小时后，获得的NPC如图3所示，图中没有明显的IPSC细胞残留（IPSC细胞残留少）。将步骤4所得细胞收集，检测IPSC标志基因OCT4、NANOG、SOX2和检测NPC标志基因WT1、ITGA8，结果如图4所示。qPCR结果如图4所示，从qPCR结果可知IPSC干性基因在步骤S4后显著下降，NPC标志基因显著上升，证明IPSC分化为NPC比较完全。
另一方面，基于实施例2的方法，我们也考察了KOSR浓度对NPC其它标志基因的影响，发现控制步骤S2-S4的KOSR体积浓度维持在5-7.5%之间，基因WT1、PAX-2和PAX-8表达较高，如图5所示。
实施例3
实施例3的IPSC分化为NPC的方法和实施例1基本一致，区别在于步骤S2-S4所用的KOSR在培养基中的体积占比为7.5%。
对比例1
对比例1的IPSC分化为NPC的方法和实施例1基本一致，区别在于步骤S2-S4所用的KOSR在培养基中的体积占比为2.5%。
对比例2
对比例2的IPSC分化为NPC的方法和实施例1基本一致，区别在于步骤S2-S4所用的KOSR在培养基中的体积占比为5%。
对比例3
对比例3的IPSC分化为NPC的方法和实施例1基本一致，区别在于步骤S2、步骤S3和步骤S4所用的血清替代物为EvaCell。
对比例4
对比例4的IPSC分化为NPC的方法和实施例1基本一致，区别在于步骤S2-S4采用的培养基为内含牛血清白蛋白（FBS）的advanced RPMI 1640培养基，没有加入血清替代物。
结果：KOSR占培养基体积分数比较低（≤5%）的条件下，Vitronectin XF基质胶在步骤4中出现如图6所示的“卷边现象”，细胞无法继续培养，细胞损失较多。而用EvaCell作为血清替代物，或者采用FBS培养细胞，Vitronectin XF基质胶也会出现“卷边现象”。虽然Vitronectin XF基质胶出现卷边现象的原理暂时未明，但至少证明KOSR能抑制Vitronectin XF基质胶出现卷边。
对比例5
对比例5的IPSC分化为NPC的方法和实施例2基本一致，区别在于步骤S2、步骤S3和步骤S4所用的KOSR被替换成UltroserTMG血清替代物。
结果：细胞在步骤S4的72小时内逐渐凋亡，72小时内暂没有发现卷边现象。UltroserTMG血清替代物在该培养体系下不能满足IPSC分化为NPC所需的成分。
对比例6
对比例6的IPSC分化为NPC的方法和实施例2基本一致，区别在于步骤S2、步骤S3和步骤S4所用的KOSR被替换成UltraGROTM-Advanced（GMP Grade）。
结果：细胞在步骤S4的72小时内逐渐凋亡，72小时内暂没有发现卷边现象。UltraGROTM-Advanced（GMP Grade）不能满足维持IPSC分化为NPC。
对比例7
对比例7的人多能干细胞分化为肾祖细胞的方法和实施例2基本一致，区别在于步骤S2-S4；其使用的培养基为DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/NutrientMixture F-12)培养基。
结果：获得的NPC如图7所示。将步骤4所得细胞收集，检测IPSC标志基因OCT4、 NANOG、SOX2和检测NPC标志基因WT1、ITGA8，结果如图8所示，步骤S4所得细胞，其OCT4、 NANOG和SOX2基因表达仍然很高，IPSC未完全分化为NPC。
Claims (8)
1.一种由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.接种诱导多能干细胞于基质胶中，加入含有Y-27632的TeSR-AOF培养基培养细胞20~50h；
S2. 将TeSR-AOF培养基更换成RPMI1640培养基培养细胞，往培养基中加入KOSR血清替代物、NEAA以及CHIR 99021，培养细胞20~50h；
S3. 更换新的RPMI1640培养基培养细胞，往培养基加入KOSR血清替代物、NEAA以及retinoic acid，培养细胞20~50h；
S4. 更换新RPMI1640培养基培养细胞，往培养基中加入血清替代物、NEAA、FGF9和Activin A，培养细胞150~220h，其中每20~50h换液一次。
2.根据权利要求1所述的由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，其特征在于，所述诱导多能干细胞为人源。
3.根据权利要求1所述的由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，其特征在于，步骤S1所述的基质胶为Vitronectin XF基质胶或Laminin 521基质胶。
4.根据权利要求3所述的由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，其特征在于，步骤S1所述Y-27632的工作浓度为2~25μM。
5.根据权利要求3所述的由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，其特征在于，步骤S2~S4中KOSR血清替代物在培养基中的体积占比>5%。
6.根据权利要求5所述的由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，其特征在于，步骤S2~S4中KOSR血清替代物在培养基中的体积占比7.5~10%。
7.根据权利要求5所述的由诱导多能干细胞分化为肾祖细胞的方法，其特征在于，步骤S2所述NEAA工作浓度为1X，CHIR 99021工作浓度为1~10μM；步骤S3所述NEAA工作浓度为1X，retinoic acid工作浓度为1~10μM；步骤S4所述NEAA工作浓度为1X、FGF9工作浓度为25~300ng/mL，Activin A工作浓度为5-20ng/mL。
8.权利要求 1~7任一方法制备得到的肾祖细胞。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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2023
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