CN111235094A - 一种人多能干细胞向内胚层分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人多能干细胞向内胚层分化的方法，属于干细胞分化培养技术领域，包括将人多能干细胞经完全培养基重悬后接种于载体中，24h后更换内胚层分化第一阶段培养基；诱导培养24h后，更换内胚层分化第二阶段培养基，再诱导培养24～48h后，实现人多能干细胞的内胚层分化；内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括血清白蛋白和CHIR99021；内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括血清白蛋白和二甲基亚砜。本发明细胞接种后，只需2次换液，只含有三种成分，无需昂贵的血清和细胞因子，实验周期短，结果特异性好。

Description

一种人多能干细胞向内胚层分化的方法
技术领域
本发明属于干细胞分化培养技术领域，尤其涉及一种人多能干细胞向内胚层分化的方法。
背景技术
多能干细胞(pluripotent stem cell，PSC)，包括胚胎干细胞(embryonic stemcell，ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)，是一类具有自我更新以及多向分化潜能的细胞群体，是研究调控细胞命运转换以及动物发育分子机制的模型，也可以在体外诱导分化成功能细胞之后，用于组织或器官再生和药物筛选。PSC在多种细胞因子相互作用下，可分化形成内、中、外3个胚层。内胚层的进一步分化是形成消化道、呼吸道，以及甲状腺、肝脏、胰脏、肺等器官的基础，此外还可以形成胆囊以及卵黄囊的胚外成分。PSC向内胚层的分化是定向分化为相应器官细胞类型的第一步，也是作为验证PSC多向分化潜能的一个重要指标，对于PSC质量检测和转化应用具有重要意义。
目前常用的PSC胚层分化方法包括：1)类胚体(embryoid body，EB)自发分化法；2)单层细胞因子诱导法(monolayer based)。EB自发分化法是最早使用的用于PSC多能性鉴定的方法，通常使用高密度的PSC在低贴附的培养皿中自发聚集形成类胚体，类胚体在含20％胎牛血清的培养基中悬浮培养5-7天后，接种到包被了明胶(gelatin)或基质胶(matrigel)的培养皿中，继续在含10％胎牛血清培养基中培养7天后，进行胚层标志物的免疫荧光染色，从混合物中找到表达特定胚层标志物的细胞。该方法存在周期长(2周)、过程复杂(悬浮转贴壁)、培养成本高(一个分化实验需换液不少于7次，且使用高浓度血清培养基)、分化效果不确定(存在找不到特定胚层细胞的风险)等缺点，逐渐被人们所摒弃。与EB自发分化法相比，单层诱导培养法则提供了一种相对简单和快速的方式诱导胚层分化，目前比较流行的是STEMCELL Technology公司的STEMdiff Trilineage Differentiation Kit产品，该产品采用PSC单细胞高密度种植在基质胶包被的培养皿中，每天更换分化培养基，可以在5天时间实现内胚层分化的诱导。然而该产品成本昂贵，起始种植细胞密度要求高(2×105/cm2)，且分化过程中每天均需要换液，通常一个试剂盒(100mL)只能做25个孔的PSC分化实验，时间和人力成本也较高。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人多能干细胞向内胚层分化的方法，采用本发明提供的方法人多能干细胞接种后只进行2次换液，不需要昂贵的血清和细胞因子，分化周期短。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种人多能干细胞向内胚层分化的方法，包括以下步骤：
1)将人多能干细胞经完全培养基重悬后接种于载体中，24h后更换内胚层分化第一阶段培养基；
2)诱导培养24h后，更换内胚层分化第二阶段培养基，再诱导培养24～48h后，实现人多能干细胞的内胚层分化；
所述内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和1～5μM CHIR99021；
所述内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜；
所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
优选的，所述人多能干细胞经TrypLEselect或Accutase消化成单细胞后接种于载体中。
优选的，所述完全培养基为含5～10μM Y27632的E8完全培养基或含5～10μMY27632的mTeSR1完全培养基。
优选的，所述载体包括培养板。
优选的，所述培养板中包被有层粘连蛋白521、基质胶、层粘连蛋白511、Geltrex或玻连蛋白。
优选的，所述人多能干细胞的接种量为1～2×104个/cm2。
优选的，所述步骤1)诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的CO2浓度为5％。
优选的，所述步骤2)诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的CO2浓度为5％。
本发明提供了一种人多能干细胞向内胚层分化的方法，包括以下步骤：1)将人多能干细胞经完全培养基重悬后接种于载体中，24h后更换内胚层分化第一阶段培养基；2)诱导培养24h后，更换内胚层分化第二阶段培养基，再诱导培养24～48h后，实现人多能干细胞的内胚层分化；所述内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和1～5μM CHIR99021；所述内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜；所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
本方法缩短分化周期的机理是：在维持干细胞生长最基本的条件下，在无血清的条件下，加入诱导内胚层分化所需的特异信号通路的激活剂，能够减少血清等复杂成分对分化特异性的影响，提高诱导效率，缩短分化时间。
本发明的有益效果：
1、操作简单：细胞接种后，只需2次换液；
2、成分简单：只含有三种成分，无需昂贵的血清和细胞因子；
3、实验周期短：接种后只需2～3天即可完成人诱导多能干细胞的内胚层分化检测；
4、结果特异性好：只表达内胚层特异标志物，不表达中胚层和外胚层基因；
5、结果可靠：经过多次重复实验，结果一致。
附图说明
图1为实施例1的分化细胞的免疫荧光染色图；
图2为实施例2的分化细胞的免疫荧光染色图；
图3为实施例3的分化细胞的免疫荧光染色图；
图4为实施例3的qRT-PCR的检测结果；
图5为实施例4的分化细胞的免疫荧光染色图。
具体实施方式
本发明提供了一种人多能干细胞向内胚层分化的方法，包括以下步骤：
1)将人多能干细胞经完全培养基重悬后接种于载体中，24h后更换内胚层分化第一阶段培养基；
2)诱导培养24h后，更换内胚层分化第二阶段培养基，再诱导培养24～48h后，实现人多能干细胞的内胚层分化；
所述内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和1～5μM CHIR99021；
所述内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜；所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
在本发明中，所述人多能干细胞优选经TrypLE select或Accutase消化成单细胞后接种于载体中，所述完全培养基优选为含5～10μM Y27632的E8完全培养基或含5～10μMY27632的mTeSR1完全培养基。在本发明中，所述TrypLE select的购买信息为Gibco，12563029美国；所述Accutase的购买信息为：stem cell technology，加拿大。在本发明中，所述载体优选包括培养板，所述培养板中优选包被有层粘连蛋白521、基质胶、层粘连蛋白511、Geltrex或玻连蛋白。本发明对所述培养板的规格没有特殊限定，采用常规培养人多能干细胞的培养板即可，本发明对培养板中包被的物质的含量和包被的方法没有特殊限定，采用常规即可。在本发明中，所述人多能干细胞的接种量为1～2×104个/cm2，所述人多能干细胞接种到培养板中，优选在37℃、5％CO2下培养过夜。
在本发明中，所述内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和1～5μM CHIR99021，所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在本发明中，所述DMEM/F12培养基优选购买于Gibco公司，所述血清白蛋白优选购买于Sigma公司，所述CHIR99021优选购买于MedChemExpress公司。在本发明中，所述诱导培养的温度优选为37℃，所述诱导培养的CO2浓度优选为5％。该诱导培养是将干细胞从多能性状态，向内胚层方向转变。
在本发明中，所述内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜，所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白或人血清白蛋白。在本发明中，所述DMEM/F12培养基优选购买于Gibco公司，所述血清白蛋白优选购买于Sigma公司，所述二甲基亚砜优选购买于Sigma公司。在本发明中，所述诱导培养的温度优选为37℃，所述诱导培养的CO2浓度优选为5％。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
人多能干细胞向内胚层分化的方法：
Day-1：人iPS细胞用TrypLEselect消化成单细胞，用含5μM Y27632的E8完全培养基重悬计数，按照2×104个/cm2接种到层粘连蛋白521包被的培养板中，37℃5％CO2培养过夜；
Day0：24小时后，更换为内胚层分化第一阶段培养基；内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有1mg/ml牛血清白蛋白和2μM CHIR99021；
Day1：诱导培养24h后，更换为内胚层分化第二阶段培养基；内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml牛血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜；
Day2：再诱导培养24h后，使用内胚层特异标志物SOX17和FOXA2的抗体，对细胞进行免疫荧光染色，结果见图1，图1中显示，经过内胚层定向分化的细胞，内胚层标志物SOX17和FOXA2染色阳性(10×)。
实施例2
人多能干细胞向内胚层分化的方法：
Day-1：人iPS细胞用TrypLEselect消化成单细胞，用含5μM Y27632的mTeSR1完全培养基重悬计数，按照2×104个/cm2接种到层粘连蛋白521包被的培养板中，37℃5％CO2培养过夜；
Day0：24小时后，更换为内胚层分化第一阶段培养基；内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有1mg/ml人血清白蛋白和2μM CHIR99021；
Day1：诱导培养24h后，更换为内胚层分化第二阶段培养基；内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml人血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜；
Day2：再诱导培养24h后，使用内胚层特异标志物SOX17和FOXA2的抗体，对细胞进行免疫荧光染色，结果见图2，图2中显示，经过内胚层定向分化的细胞，内胚层标志物SOX17和FOXA2染色阳性(10×)。
实施例3
人多能干细胞向内胚层分化的方法：
Day-1：人iPS细胞用TrypLEselect消化成单细胞，用含5μM Y27632的E8完全培养基重悬计数，按照2×104个/cm2接种到层粘连蛋白521包被的培养板中，37℃5％CO2培养过夜；
Day0：24小时后，更换为内胚层分化第一阶段培养基；内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有1mg/ml牛血清白蛋白和2μMCHIR99021；
Day1：诱导培养24h后，更换为内胚层分化第二阶段培养基；内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml牛血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜；
Day2：再诱导培养48h后，使用内胚层特异标志物SOX17和FOXA2的抗体，对细胞进行免疫荧光染色，结果见图3，图3中显示，经过内胚层定向分化的细胞，内胚层标志物SOX17和FOXA2染色阳性(10×)。
收集细胞，提取总RNA，进行qRT-PCR检测。检测基因：人多能干细胞标志基因Oct4和Nanog，内胚层标志基因Sox17。结果如图4，结果显示，与人iPS相比，经过内胚层定向分化的细胞，其多能干细胞标志基因表达明显下降，而内胚层标志基因表达则增加了约9倍。
实施例4
人多能干细胞向内胚层分化的方法：
Day-1：人iPS细胞用TrypLE select消化成单细胞，用含5μM Y27632的mTeSR1完全培养基重悬计数，按照2×104个/cm2接种到层粘连蛋白521包被的培养板中，37℃5％CO2培养过夜；
Day0：24小时后，更换为内胚层分化第一阶段培养基；内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，含有1mg/ml人血清白蛋白和2μMCHIR99021；
Day1：诱导培养24h后，更换为内胚层分化第二阶段培养基；内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml人血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜；
Day2：再诱导培养48h后，使用内胚层特异标志物SOX17和FOXA2的抗体，对细胞进行免疫荧光染色，结果见图5，图5中显示，经过内胚层定向分化的细胞，内胚层标志物SOX17和FOXA2染色阳性(10×)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种人多能干细胞向内胚层分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将人多能干细胞经完全培养基重悬后接种于载体中，24h后更换内胚层分化第一阶段培养基；
2)诱导培养24h后，更换内胚层分化第二阶段培养基，再诱导培养24～48h后，实现人多能干细胞的内胚层分化；
所述内胚层分化第一阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和1～5μM CHIR99021；
所述内胚层分化第二阶段培养基以DMEM/F12培养基为基础培养基，包括1mg/ml血清白蛋白和质量百分含量为0.1％的二甲基亚砜；
所述血清白蛋白包括牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人多能干细胞经TrypLE select或Accutase消化成单细胞后接种于载体中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述完全培养基为含5～10μMY27632的E8完全培养基或含5～10μMY27632的mTeSR1完全培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体包括培养板。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养板中包被有层粘连蛋白521、基质胶、层粘连蛋白511、Geltrex或玻连蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人多能干细胞的接种量为1～2×104个/cm2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的CO2浓度为5％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)诱导培养的温度为37℃，所述诱导培养的CO2浓度为5％。
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