CN112680405A - 一种人内胚层分化培养基以及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人内胚层诱导分化培养基，所述培养基由以下培养基A和培养基B组成：培养基A由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和ChIR99021；培养基B由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和LDN‑193189。同时还提供了一种体外诱导干细胞向内胚层细胞分化的方法，使用本发明的诱导分化获得的内胚层可在体外分化为肝细胞，胰腺前体细胞和肺前体细胞，在体内畸胎瘤实验中亦发现可向肺，胃肠道上皮细胞分化，表明此方法分化而来的内胚层具有分为肝，肺和胰腺的潜力。

Description

一种人内胚层分化培养基以及培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种人内胚层分化培养基以及培养方法。

背景技术

根据胚胎的早期发育机制，目前已有很多种将hPSCs分化为内胚层的方法。但目前还没有无异原性，全合成，低成本的方法出现。2005年Emmanuel E Baetge研究组使用含有2％FBS的RPMI-1640作为基础培养基，通过加入Activin A和Wnt3A诱导内胚层分化，分化效率可达80％，但使用了血清和细胞因子，含有外源性成分血清，成本高(D'Amour et al.,2005)。2009年Douglas A.Melton研究组通过筛选4000多种小分子化合物发现IDE1和IDE2可以取代Activin A诱导内胚层分化，但是后续没有课题组可以重复出来，同时这种方法使用FBS含有外源性成分(Bogacheva et al.,2018；Borowiak et al.,2009)。2014年RohitN.Kulkarni研究组使用通过在不含血清的基础培养基中加入Wnt3A和BMP4成功将hPSCs分化为内胚层，但仍然使用了细胞因子，成本较高(Teo et al.,2014)。2015年Shoen Kume研究组通过加入DMSO将Activin A的浓度从100ng/ml降至6.25ng/ml，分化的内胚层可分化为肠上皮细胞。降低了诱导成本，但是分化的基础培养基中含有B27，B27中含有异源性成分BSA(Ogaki et al.,2015)。2017年Heiko Lickert研究组通过筛选23406种小分子化合物，发现84种化合物可促进内胚层分化，从中选取了Fasudil和RKI-1447进行验证，发现它们诱导内胚层的效率在50％以上。虽然不使用细胞因子，但是基础培养基中使用0.5％BSA，有异源性成分，而且分化效率比较低(Korostylev et al.,2017)。2019年Falk F.R.Buettner研究组通过三维培养建立了成分明确，无异原性B27诱导内胚层分化，但要使用50ng/mlActivin A，成本仍然很高(Diekmann et al.,2019)。2019年Danwei Huangfu研究组通过CRISPR-Cas9全基因组筛选发现JNK通路抑制内胚层分化，使用JNK通路抑制剂JNK-IN-8可使Activin A使用浓度从100nM/ml降至10ng/ml，减少了成本，但使用了BSA，含有外源性成分(Li et al.,2019)。

因此，目前还能完全做到兼顾全合成、高效率、低成本、无异源性物质的有效方法用于体外人多能干细胞向内胚层诱导。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种无异源性，无血清，无生长因子，小分子人内胚层分化培养基，通过该培养基诱导人多能干细胞定向分化为内胚层细胞，并能进一步形成肝细胞，肺前体细胞，胰腺前体细胞。

本发明通过以下技术方案实现：

一种人内胚层诱导分化培养基，由以下培养基A和培养基B组成：培养基A由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和ChIR99021；培养基B由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和LDN-193189。

优选地，所述维生素C的浓度为50～100mg/ml。更优选地，所述维生素C的浓度为71mg/ml。

优选地，所述ChIR99021的浓度为1～6μM。更优选地，所述ChIR99021的浓度为3μM。

优选地，所述LDN-193189的浓度为0.05～2μM。更优选地，所述LDN-193189的浓度为0.1μM。

本发明还提供体外诱导干细胞向内胚层细胞分化的方法，包括以下步骤：

S1预处理阶段：以Vitronectin作为细胞培养的基质胶，将干细胞在含有Y-27632的E8培养基中培养，待细胞汇合度为80～90％时开始内胚层诱导；

S2内胚层诱导阶段包括以下步骤：

(a)将步骤S1得到的干细胞在如权利要求1所述的A培养基中诱导培养24h，每天换液；

(b)在如权利要求1所述的B培养基中诱导培养48h，每天换液；得到由干细胞分化的内胚层细胞。

优选地，所述干细胞为人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞。

优选地，所述培养基A由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和ChIR99021；培养基B由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和LDN-193189。

本发明还提供了一种体外诱导干细胞向肝细胞分化的方法，包括以下步骤：

S1将权利要求5所述的步骤(b)得到的内胚层细胞在含有20ng/ml BMP2、30ng/mlFGF4和B27^TM Supplement(50X)的RPMI-1640培养基中培养96h，每天换液；

S2接着在含有20ng/ml HGF、20ng/ml KGF和B27^TM Supplement(50X)的RPMI-1640培养基培养144h，每天换液；

S3继续在含有20ng/ml Oncostatin M的HCM^TM Hepatocyte Culture MediumBulletKit^TM的培养液中培养；每天换液，培养192h，每天换液；得到由干细胞分化的肝细胞。

本发明还提供了一种体外诱导干细胞向胰腺前体细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求5所述的步骤(b)得到的内胚层细胞在含有2μM Retinoic acid、1μMDorsomorphin、10μM SB431542和B27^TM Supplement(50X)的DMEM/F12培养基，培养192h，隔天换液，得到由干细胞分化的胰腺前体细胞。

本发明还提供了一种体外诱导干细胞向肺前体细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1将权利要求5所述的步骤(b)在如权利要求1所述的B培养基中诱导培养24h的内胚层细胞制备成单细胞悬液，加入含10μM SB431542和2μM Dorsomorphin的肺前体分化基础培养基，传代后，加入浓度为10μM的Y-27632，培养24h；

S2在含有10μM SB431542和2μM Dorsomorphin的肺前体分化基础培养基，培养144h；

S3在含有3μM CHIR99021、10ng/ml BMP4和100nM Retinoic acid的肺前体细胞基础培养基中培养216h，隔天换液，得到由干细胞分化的肺前体细胞。

本发明中所使用的试剂信息如下：

ChIR99021：GSK-3α/β抑制剂CAS No.:252917-06-9

LDN-193189：BMP4受体抑制剂CAS No.:1062368-24-4

Vitronectin:玻连蛋白

Y-27632:ROCK-I和ROCK-II抑制剂CAS No.:146986-50-7

BMP2：骨形态发生蛋白-2

FGF4：人成纤维细胞生长因子4

B27^TM Supplement(50X),serum free，厂家：ThermoFisher货号:17504044规格:10mL；

HGF：人类生长因子

KGF：成纤维母细胞生长因子

Oncostatin M：抑瘤素M

HCM^TM Hepatocyte Culture Medium BulletKit^TM：肝细胞维持培养基，厂家:Lonza货号：CC-3198

规格：1x HBM^TM(CC-3199)Bottle Basal Medium,500mL

1x HCM^TM(CC-4182)SingleQuots^TM Supplement Pack containing：

1x Transferrin,0.50mL

1x Ascorbic Acid,0.50mL

1x HEGF,0.50mL

1x Insulin,0.50mL

1x Hydrocortisone,0.50mL

1x BSA(Fatty Acid Free),10.5mL

1x GA-1000(Gentamicin sulfate-Amphotericin),0.50mL

Retinoic acid：维甲酸CAS No.:302-79-4

Dorsomorphin：AMPK抑制剂CAS No.:866405-64-3

本发明的有益效果为：(1)本发明只需要加有维生素C的DMEM/F12培养基即可以诱导内胚层分化，效率在20％左右。(2)Matrigel来自鼠EHS瘤是异源性成分，且具有批次效应，我们发现全合成的Vitronectin可以替代Matrigel，同时将内胚层的诱导效率提高到50％以上。(3)以上述培养条件为基础，以LDN-193189完全代替Activin A，结合CHIR99021即可促进内胚层分化，分化效率可达90％以上。使用本发明的诱导分化获得的内胚层可在体外分化为肝细胞，胰腺前体细胞和肺前体细胞，在体内畸胎瘤实验中亦发现可向肺，胃肠道上皮细胞分化，表明此方法分化而来的内胚层具有分为肝，肺和胰腺的潜力。

附图说明

图1为LDN-193189诱导内胚层分化浓度优化结果示意图，图A为不同浓度LDN-193189化合物诱导内胚层的效率；图B为0.1uM LDN-193189化合物诱导的内胚层中SOX17，FOXA2和PAX6的表达水平。

图2为LDN-193189化合物诱导内胚层分化结果示意图，图A显示免疫荧光检测诱导内胚层中SOX17和FOXA2的表达；图B显示LDN-193189化合物诱导不同hPSCs细胞系向内胚层分化的效率。

图3为LDN-193189化合物加入时间点优化结果示意图，图A显示LDN-193189化合物加入不同时间点时SOX17和FOXA2双阳性的比例；图B显示免疫荧光检测LDN-193189化合物加入不同时间点SOX17和FOXA2的表达。图C显示流式细胞术分析LDN-193189化合物加入不同时间点时内胚层标志基因CXCR4阳性细胞的比例。

图4为内胚层分化为肝细胞的免疫荧光检测结果示意图。

图5为内胚层分化为肺前体细胞的免疫荧光检测结果示意图。

图6为内胚层分化为胰腺前体细胞的免疫荧光检测结果示意图。

图7为内胚层细胞形成的畸胎瘤HE染色结果示意图。图A为肠上皮细胞，图B为胃粘膜上皮细胞，图C为气管上皮细胞。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1人胚胎干细胞定形内胚层分化培养

1.人多能干细胞的复苏、培养及传代

使用人胚胎干细胞(hPSCs)H1和H9，人诱导性多能干细胞WTC和WTB，均由E8培养基进行培养。

细胞复苏和培养：6孔板加入1ml Vitronectin(Corning)室温孵育1h。将冻存的hPSCs在37℃水浴锅中解冻，取出加入到含等体积E8培养基的15ml离心管中，200g室温离心5min，弃上清，加入1ml E8重悬细胞沉淀，弃培养板中的包被胶加入1ml E8培养基，加入1ml细胞悬液，再加入Y-27632(Selleck)至终浓度为0.5μM。摇匀放入5％CO₂，37℃培养箱中培养。第二天吸除培养基，加入每孔2ml新鲜E8培养基，此后每天换液，待细胞汇合度为80～90％时传代。

细胞传代：6孔板加入1ml Vitronectin(Corning)室温孵育1h。从待传代细胞培养孔中吸除培养基，加入600ul 0.05mM EDTA室温孵育4min，吸除消化液加入1ml E8吹打重悬细胞，将细胞转移至15ml离心管中。加入800ul DMEM/F12重悬细胞，200g室温离心5min，弃上清，加入1ml E8重悬细胞沉淀。

2.定形内胚层分化

12孔板加入500ul Vitronectin(Corning)室温孵育1h。hPSCs汇合度为80～90％时使用Accutase消化成单细胞，计数，按20万细胞/孔接种细胞。第一天加入Y-27632至终浓度为1μM；第二天换液。待细胞汇合度到80-90％时开始内胚层分化诱导培养，具体步骤如下：

分化第一天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和3μM ChIR99021，培养24h。

分化第二天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和0.1μM LDN-193189，培养24h。

分化第三天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和0.1μM LDN-193189，培养24h。

其中，所述分化基础培养基为：添加了71mg/ml维生素C的DMEM/F12培养基。

实施例2检测hPSCs定形内胚层的分化效率

1、免疫荧光检测

hPSCs向内胚层分化至第三天时，吸除上述实施2中12孔细胞培养板中的培养基，PBS洗一次，加入4％多聚甲醛固定细胞，室温处理30min。吸除固定液，PBS洗3次，每次5min。加入0.2％Triton X-100通透，室温处理30min。吸除通透液，PBS洗3次，每次5min。加入3％BSA进行封闭，室温处理2h。吸除封闭液加入使用含有3％BSA和0.2％Triton X-100稀释液稀释的一抗(双染内胚层特异性标记物FOXA2、SOX17)，4℃过夜。吸除一抗，PBS洗3次，每次5min。加入相应的二抗，室温避光孵育1h。吸除二抗，PBS洗3次，每次5min。加入终浓度为1ug/ml的DAPI染色液，室温避光孵育5min。吸除DAPI染色液，PBS洗2次，每次5min。使用Perkin Elmer Operetta CLS高内涵成像分析系统进行拍照和分析。

2、流式细胞分选检测

使用Accutase消化诱导至上述实施例2中第三天时的内胚层细胞，37℃孵育10min，加入等体积的DMEM/F12，吹打细胞成单细胞，200g室温离心5min，弃上清，加入含2％FBS的PBS重悬细胞，使用血球计数板计数，取50万细胞，加入1μl内胚层特异性标记物(CXCR4)抗APC-CXCR4抗体，避光冰上孵育30min，50万细胞不加抗体作为阴性对照。200g室温离心5min，弃上清。PBS洗2次，加入终浓度为1μg/ml的DAPI染色液重悬细胞，使用CytoFLEX S(Beckman)流式细胞仪进行检测。

3、RNA提取和定量PCR检测

RNA提取：总RNA使用

(MRC)提取。细胞消化后，200g室温离心5min，弃上清，留沉淀。加入RNAzol试剂完全裂解细胞。加入0.4倍RNAzol体积的DNAase、RNase-freeddH₂O，室温静置10min，12000g室温离心15min。转移上清至新的1.5ml EP管中，加入等体积的异丙醇，室温静置15min。12000g离心10min。弃上清，留沉淀，加入400ul 75％乙醇进行洗涤，4000g离心3min，弃上清，再洗涤一次，留沉淀，待沉淀干后，加入DNAase，RNase-freeddH₂O溶解沉淀，测浓度。

RNA反转录：使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme)将RNA反转录为cDNA，1μg total RNA加DNAase，RNase-free ddH₂O至8ul，65℃5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。加入2μl 5×gDNA wiper Mix，吹打混匀，42℃2min。加入2μl 10×RT Mix，2μl HiScript III Enzyme Mix，1μl Oligo(dT)20VN和5μlDNAase，RNase-free ddH₂O，吹打混匀。25℃5min，37℃45min，85℃5s。获得内胚层细胞的cDNA。

定量PCR：检测内胚层标志基因FOXA2和SOX17，及神经外胚层标志物PAX6的表达。在定量PCR管中配制混合液，10μl 2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，0.4ul上游引物(10μM)，0.4ul下游引物(10μM)，1μl cDNA，加ddH₂O补体积至20μl。使用Roche AppliedScience LightCycler 480进行反应，反应条件如下：95℃ 5min，95℃ 10s,60℃ 30s,95℃15s,60℃ 30s,95℃ 15s。使用2-ΔΔCt法确定基因的相对表达量。以GAPDH作为内参。

实施例3LDN-193189诱导内胚层分化浓度优化

为了验证LDN-193189化合物可促进内胚层分化，同时确定LDN-193189化合物的最优分化浓度，我们分别使用2.0μM、1μM、0.5μM、0.1μM、0μM浓度的LDN-193189化合物诱导人胚胎干细胞(hPSCs)H1向内胚层分化。我们发现LDN-193189化合物浓度为0.1μM时SOX17⁺/FOXA2⁺(％)内胚层的比例可达90％以上(图1A)，Q-PCR分析发现加入0.1μM LDN-193189化合物后，内胚层标志基因SOX17和FOXA2表达量显著升高，外胚层标志基因PAX6的表达量显著降低(图2)，说明LDN-193189可促进内胚层的分化，以及抑制向外胚层分化。

实施例4LDN-193189加入的时间点进行优化

为进一步优化内胚层诱导法的条件，我们对LDN-193189化合物加入的时间点进行优化。因此，本实施例设计了LDN-193189加入的不同时间点，具体如下：

方案1(仅在分化第一天加入LDN-193189，后续培养过程中不添加)：

分化第一天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和0.1μM LDN-193189与3μMChIR99021，培养24h。

分化第二天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基，培养24h。

分化第三天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基，培养24h。

方案2(在分化第一天加入LDN-193189，后续培养过程中全程添加)：

分化第一天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和0.1μM LDN-193189与3μMChIR99021，培养24h。

分化第二天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和0.1μM LDN-193189，培养24h。

分化第三天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和0.1μM LDN-193189，培养24h。

方案3(在分化第二天加入LDN-193189，后续培养过程中全程添加)：

分化第一天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和3μM ChIR99021，培养24h。

分化第二天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和0.1μM LDN-193189，培养24h。

分化第三天，换液，每孔加入1ml分化基础培养基和0.1μM LDN-193189，培养24h。

经免疫荧光分析发现，LDN-193189仅在中内胚层向内胚层分化过程中(方案3)加入即可达到与全程添加LDN-193189化合物(方案2)相仿的诱导效率。而LDN-193189化合物若仅在hPSCs向中内胚层分化阶段(方案1)加入，分化效率将会显著降低(图3A、B)。因此，在中内胚层向内胚层分化过程中(方案3)加入，即诱导第二天及第三天加入LDN-193189，为本发明最佳诱导培养方案(图3C)。

实施例5内胚层细胞的肝细胞分化

本实施例提供一种内胚层细胞的肝细胞分化培养方法，具体步骤如下：

将实施例2分化至第三天的内胚层细胞，继续进行分化：

第3天～第6天加入含有20ng/ml BMP2(R&D)，30ng/ml FGF4(R&D)和B27^TMSupplement(50X)的RPMI-1640培养基；每天换液，培养96h。

第7天～第12天加入含有20ng/ml HGF(R&D)，20ng/ml KGF(R&D)和B27^TMSupplement(50X)的RPMI-1640培养基；每天换液，培养144h；。

第13天～第20天加入含有20ng/ml Oncostatin M(R&D)的HCM^TM HepatocyteCulture Medium BulletKit^TM培养液中培养；每天换液，培养192h。

第21天使用免疫荧光检测肝细胞的分化效率。

免疫荧光检测发现内胚层诱导的肝细胞表达肝细胞的标志基因AFP和HNF4α，且比例达到90％以上(图4)。

实施例6内胚层细胞的胰腺前体细胞分化

本实施例提供一种内胚层细胞的胰腺前体细胞分化培养方法，具体步骤如下：

将实施例2分化至第三天的内胚层细胞，继续进行分化：

第3天～第9天加入含有2μM Retinoic acid(Selleck)、1μM Dorsomorphin(Selleck)、10μM SB431542(Selleck)和B27^TM Supplement(50X)的DMEM/F12培养基，隔天换液，培养192h。

免疫荧光检测发现内胚层诱导的肺前体细胞表达肺前体细胞的标志基因NKX2-1，比例达到95％以上(图5)。

实施例7内胚层细胞的肺前体细胞分化

本实施例提供一种内胚层细胞的肺前体细胞分化培养方法，具体步骤如下：在12孔板加入450ul Matrigel(Corning)37℃孵育30min，将实施例2分化至第二天的内胚层细胞，使用Gentle Cell Dissociation Reagent(GCDR)室温孵育2min，吸除GCDR，加入1ml含10μM SB431542和2μM Dorsomorphin的肺前体分化基础培养基。1:4传代，加入Y-27632至终浓度为10μM，培养24h。

第2天换成含10μM SB431542和2μM Dorsomorphin的肺前体分化基础培养基，培养至第六天(培养144h)。

第7天～第15天换成含有3μM CHIR99021、10ng/ml BMP4(R&D)和100nM Retinoicacid的肺前体细胞基础培养基。隔天换液，培养216h。

第16天检测肺前体细胞的诱导效率。

免疫荧光检测发现内胚层诱导的胰腺前体细胞表达胰腺前体细胞的标志基因PDX1，比例高达99％(图6)。

实施例8进一步分化功能

将实施例1得到的内胚层移植到NOD/SCID小鼠体内形成畸胎瘤，HE染色发现畸胎瘤中具有来源于内胚层的胃粘膜上皮细胞，肠上皮细胞和气管上皮细胞，而没有其他胚层来源的相关细胞。说明本发明得到的内胚层细胞在体内能进一步向内胚层来源的功能细胞分化(图7)。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种人内胚层诱导分化培养基，其特征在于，所述培养基由以下培养基A和培养基B组成：培养基A由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和ChIR99021；培养基B由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和LDN-193189。

2.如权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述维生素C的浓度为50～100mg/ml。

3.如权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述ChIR99021的浓度为1～6μM。更优选地，所述ChIR99021的浓度为3μM。

4.如权利要求1所述的诱导培养基，其特征在于，所述LDN-193189的浓度为0.05～2μM。

5.一种体外诱导干细胞向内胚层细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1预处理阶段：以Vitronectin作为细胞培养的基质胶，将干细胞在含有Y-27632的E8培养基中培养，待细胞汇合度为80～90％时开始内胚层诱导；

S2内胚层诱导阶段包括以下步骤：

(a)将步骤S1得到的干细胞在如权利要求1所述的A培养基中诱导培养24h，每天换液；

(b)在如权利要求1所述的B培养基中诱导培养48h，每天换液；得到由干细胞分化的内胚层细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述干细胞为人胚胎干细胞或人诱导性多能干细胞。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述培养基A由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和ChIR99021；培养基B由以下组分组成：DMEM/F12培养基、维生素C和LDN-193189。

8.一种体外诱导干细胞向肝细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1将权利要求5所述的步骤(b)得到的内胚层细胞在含有20ng/ml BMP2、30ng/ml FGF4和B27^TM Supplement的RPMI-1640培养基中培养96h，每天换液；

S2接着在含有20ng/ml HGF、20ng/ml KGF和B27^TM Supplement的RPMI-1640培养基培养144h，每天换液；

S3继续在含有20ng/ml Oncostatin M的HCM^TM Hepatocyte Culture MediumBulletKit^TM培养液中该培养；每天换液，培养192h，每天换液；得到由干细胞分化的肝细胞。

9.一种体外诱导干细胞向胰腺前体细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求5所述的步骤(b)得到的内胚层细胞在含有2μM Retinoic acid、1μMDorsomorphin、10μM SB431542和B27^TM Supplement的DMEM/F12培养基，培养192h，隔天换液，得到由干细胞分化的胰腺前体细胞。

10.一种体外诱导干细胞向肺前体细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1将权利要求5所述的步骤(b)在如权利要求1所述的B培养基中诱导培养24h的内胚层细胞制备成单细胞悬液，加入含10μM SB431542和2μM Dorsomorphin的肺前体分化基础培养基，传代后，加入浓度为10μM的Y-27632，培养24h；

S2在含有10μM SB431542和2μM Dorsomorphin的肺前体分化基础培养基，培养144h；

S3在含有3μM CHIR99021、10ng/ml BMP4和100nM Retinoic acid的肺前体细胞基础培养基中培养216h，隔天换液，得到由干细胞分化的肺前体细胞。

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