CN101735975A - 一种利用单层培养技术制备和分离定型内胚层细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用单层培养技术制备和分离定型内胚层细胞的方法。本发明还公开了适用于制备定型内胚层细胞的培养基，所述培养基含有Neurobasal培养基、DMEM/F12培养基、N-2添加物、B-27添加物、牛血清白蛋白、单-二羟丙硫醇、活化素A。本发明的方法简单高效，可将哺乳动物(优选非人哺乳动物)胚胎干细胞向定型内胚层分化的效率大大提高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种利用单层培养技术制备和分离定型内胚层细胞的方法。
背景技术
自1981年第一次建系以来，小鼠胚胎干细胞(Mouse Embryonic Stem Cell，mESC)已经成为细胞生物学和实验医学领域的主要进步。它使小鼠基因组的常规操作成为可能并且为细胞替代治疗带来了巨大前景。作为哺乳动物早期发育的体外模型，它有潜力提供各种在成体中数量有限的分化细胞类型。
胚胎干细胞是从哺乳动物囊胚内细胞团中分离得到的具有全能性的干细胞，在体外分离培养后可以无限增殖并具备分化为全身各种细胞类型的潜力。从胚胎干细胞得到有功能且可用于移植的特异组织类型的细胞是致力于治疗各种损伤及退行性疾病的再生医学的一个长期目标。最近的许多文献报道了由胚胎干细胞分化得到各种特异组织类型的细胞，如神经细胞、肌肉细胞、血细胞以及肝细胞等。
为了产生特定需要的细胞类型并最终将它们应用到移植，必须致力于达到高效的分化并且获得相对均一的细胞群体。此外，还须确认细胞的真实“身份”并进一步对其进行定向分化。
以肝脏细胞为例，肝实质细胞是成体肝脏中主要的细胞类型并且履行肝脏的主要功能。它们由胚胎中腹部前肠段的定型内胚层(Definitive Endoderm，DE)细胞分化生成。定型内胚层产生所有内胚层的器官，包括肝、胰、肺和肠等。但是，在体外用ES细胞重复这个胚胎发育过程遇到的一个关键问题是区分定型内胚层和其它胚层的细胞，尤其是胚外来源的细胞。胚外内胚层细胞的衍生物内脏内胚层(Visceral Endoderm，VE)和脏壁内胚层这两类内胚层和定型内胚层及肝实质细胞共享许多重要的功能和分子水平上的相同性。这两类组织都有上皮样形态，分泌血清蛋白，参与糖脂代谢，还是临时的造血场所。直到最近，仍然没有找到定型内胚层表达而胚外内胚层不表达的特异标记。这使得在胚胎干细胞的不均一分化培养体系中很难确切的鉴定这些细胞。
大多数原先的关于胚胎干细胞自发或定向分化成肝细胞的报道没有很好的解决这个问题。确定这些细胞的真实“身份”是存在问题的，因为它们用作代表肝细胞的许多基因也表达在胚外内胚层(如Alb，Foxas，Tcfs，Cebps，Gatas和Hnf4等等)，因此在分化过程中最好能避免胚外内胚层细胞的产生。
因此，建立一种高效的由胚胎干细胞定向分化成定型内胚层细胞的诱导方法对于后续的分化得到肝、胰等可用于细胞治疗的特异组织类型细胞至关重要。需要引起重视的是，如上讨论，这一诱导分化方法必须能有效的避免胚外内胚层细胞的分化产生。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备定型内胚层细胞的培养基。
本发明的另一目的在于提供一种利用单层培养技术制备和分离定型内胚层细胞的方法。
在本发明的第一方面，提供一种制备含定型内胚层细胞的细胞群方法，所述方法包括：
(1)培养容器中加入诱导分化培养基，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
活化素A 10-50mg/L；
(2)将胚胎干细胞接种到(1)的培养基中，培养所述的胚胎干细胞3-10天，诱导胚胎干细胞分化，从而获得含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞数量占细胞总数的40％以上。
在另一优选例中，所述的培养容器是经明胶包被的培养容器。
在另一优选例中，所述的胚胎干细胞是经消化的胚胎干细胞。
在另一优选例中，所述的“含定型内胚层细胞的细胞群”是指定型内胚层细胞占优势的细胞群。较佳地，所述细胞群中定型内胚层细胞数量占细胞整体数量的45％以上；更佳地占细胞整体数量的50％或以上。
在另一优选例中，所述的定型内胚层细胞高表达内胚层基因Foxa2(Forkhead Box A2)、Goosecoid(Goosecoid Homeobox)或Sox17(SRY-boxcontaining gene 17)。
在另一优选例中，所述的含定型内胚层细胞的细胞群中，基本不存在胚外内胚层细胞。
在另一优选例中，所述的胚胎干细胞是非人哺乳动物胚胎干细胞，如兔、鼠、羊、猪、猴。较佳的，所述的胚胎干细胞是鼠胚胎干细胞。
在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括传代培养胚胎干细胞的步骤：
(a)培养容器(优选经明胶包被的培养容器)中加入传代培养基，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
BMP4 5-15mg/L；
白血病抑制因子(LIF) 0.05-0.15ml/L；
(b)将原代胚胎干细胞(优选经消化的原代胚胎干细胞)接种到(a)的培养基中，传代培养所述的胚胎干细胞，每2-5天(优选2-3天)传代一次，获得未分化的胚胎干细胞。
在另一优选例中，在步骤(b)中，将原代胚胎干细胞传代3-5代。
在另一优选例中，所述方法还包括：(3)从(2)获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群。
在另一优选例中，分选细胞表面CXCR4分子阳性且ECD分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群(即其中定型内胚层细胞占细胞总数的80％以上；较佳的90％以上)。
在另一优选例中，采用流式细胞分选方法分离出定型内胚层细胞群。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(3’)培养容器(优选经I型胶原(Collagen Type I)包被的培养容器)中加入诱导培养基，该培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
活化素A 10-50mg/L；
bFGF 10-30mg/L；
BMP4 20-50mg/L；
(4’)将步骤(2)获得含定型内胚层细胞的细胞群(优选经消化的细胞群)接种到(3’)的培养基中，培养1-5天(较佳的2-3天)，诱导所述含定型内胚层细胞的细胞群分化为含胎肝细胞(优选的是表达甲胎蛋白(Afp)的胎肝细胞)的细胞群。
较佳地，所述方法还包括：(5’)从(4’)获得的细胞群中分离出胎肝细胞的细胞群；
或者，所述的方法还包括步骤：
(3”)培养容器(优选经I型胶原包被的培养容器)中加入诱导培养基，该培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
活化素A 10-50mg/L；
bFGF 5-20mg/L；
Noggin(R&D) 30-70mg/L；
(4”)将步骤(2)获得含定型内胚层细胞的细胞群(优选经消化的细胞群)接种到(3”)的培养基中，培养1-5天(较佳的2-3天)，诱导所述含定型内胚层细胞的细胞群分化为含胰腺前体细胞(优选的是表达Pdxl(pancreatic andduodenal homeobox 1)的胰腺前体细胞)的细胞群。
较佳地，所述方法还包括：(5”)从(4”)获得的细胞群中分离出胰腺前体细胞的细胞群。
在本发明的第二方面，提供一种含定型内胚层细胞的细胞群，所述的细胞群中定型内胚层细胞数量占细胞总数的40％以上；所述的细胞群通过以下方法获得：
(1)培养容器中加入诱导分化培养基，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
Activin A 10-50mg/L。
(2)将胚胎干细胞接种到(1)的培养基中，培养所述的胚胎干细胞3-10天，诱导胚胎干细胞分化，从而获得含定型内胚层细胞的细胞群。
在另一优选例中，在步骤(2)之后，还包括步骤：分选细胞表面CXCR4分子阳性且ECD分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群。
在本发明的第三方面，提供一种用于制备定型内胚层细胞的培养基，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
活化素A 10-50mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 450-530ml/L；
DMEM/F12培养基 450-530ml/L；
N-2添加物 4-6ml/L；
B-27添加物 8-12ml/L；
牛血清白蛋白 0.45-0.56mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.11-0.18mM；
活化素A 20-40mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基还包括：
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 10-30mg/L；
骨成型蛋白4(BMP4) 20-50mg/L。
在另一优选例中，包括：
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 15-25mg/L；
骨成型蛋白4(BMP4) 25-35mg/L。
在另一优选例中，所述的培养基还包括：
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 5-20mg/L；
Noggin 30-70mg/L。
在另一优选例中，包括：
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 7-15mg/L；
Noggin 40-60mg/L。
在本发明的第四方面，提供所述的培养基的用途，用于制备含定型内胚层细胞的细胞群，所述的细胞群中，定型内胚层细胞占细胞总数的40％以上。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1A.诱导分化定型内胚层细胞后获得的细胞群的明场细胞形态。
图1B.诱导分化定型内胚层细胞后获得的细胞群的FACS分析结果，方框中为CXCR4+ECD+的细胞。
图2.定型内胚层分化过程中的基因动态表达情况。
A.中内胚层细胞分化有关的基因Brachyury、Eomesodermin(Eomes)、Mixl1基因动态表达情况；
B.内胚层细胞分化有关的基因Foxa1、Foxa2、Foxa3、Goosecoid、Sox17基因动态表达情况；
C.其它胚层细胞的分子标记基因动态表达情况，以Rex1、Gata1、Sox7、Cdx2、Sox1分别作为ESC、造血中胚层、胚外内胚层(VE)、滋养外胚层、神经外胚层的分子标记。
图3.FACS分选的不同群体中基因表达情况。
A.流式细胞术分选CXCR4+ECD-和CXCR4+ECD+两个群体。
B.CXCR4+ECD+群体和CXCR4+ECD-群体中Foxa2、Goosecoid和Sox17基因的表达情况；
C.CXCR4-ECD+群体、CXCR4+ECD-群体和CXCR4+ECD+群体中Sox7、Nanog、Brachyury、Meoxl基因的表达情况。
图4.由胚胎干细胞诱导5天后，将细胞消化后在不同条件下继续诱导2天得到表达Afp的胎肝细胞或表达Pdx1的胰腺前体细胞。其中，
A.继续诱导培养后0-7天细胞群中Afp的表达情况；
B.继续诱导培养后0-7天细胞群中Pdx1的表达情况。
具体实施方式
本发明人经过长期的研究，首次优化出了一种特别适合于诱导胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化的培养基，并且开发出了诱导产生定型内胚层细胞占优势的细胞群的方法。本发明的方法简单高效，可将哺乳动物(优选非人哺乳动物)胚胎干细胞向定型内胚层分化的效率大大提高。
胚胎干细胞的定向分化的难点在于：①定向分化效率低；②分化的目的细胞纯度低，难于富集；③分化的细胞的真实性。本发明人针对这三个难题，对哺乳动物胚胎干细胞向定型内胚层细胞的分化进行了深入探索和优化，使分化效率大大提高，通过分选技术富集目的细胞群，并通过基因表达分析验证了富集到的细胞群的真实性。
培养基
为了高效地得到定型内胚层细胞占优势的细胞群，本发明人致力于培养基的优化，提供了一种用于制备定型内胚层细胞的分化培养基，所述的分化培养基含有：Neurobasal培养基、DMEM/F12培养基、N-2添加物、B-27添加物、牛血清白蛋白、单-二羟丙硫醇、活化素A(Activin A)。采用所述的培养基，结合本发明的方法，可高效地获得定型内胚层细胞占优势的细胞群。定型内胚层细胞群(即其中定型内胚层细胞占细胞总数的80％以上；较佳的90％以上)。
如本文作用，所述的“含定型内胚层细胞的细胞群”中，定型内胚层细胞数量占细胞整体数量的40％以上，较佳地占细胞整体数量的45％以上；更佳地占细胞整体数量的50％或以上。所述的“定型内胚层细胞的细胞群”中，定型内胚层细胞数量占细胞整体数量的80％以上，较佳地占细胞整体数量的85％以上；更佳地占细胞整体数量的90％或以上。
作为本发明的优选方式，所述的分化培养基中，各组分的较佳含量如表1所示。
表1
| 较佳含量 | 更佳含量 | |
| Neurobasal培养基 | 400-570ml/L | 450-530ml/L |
| DMEM/F12培养基 | 400-570ml/L | 450-530ml/L |
| N-2添加物 | 3-7ml/L | 4-6ml/L |
| B-27添加物 | 5-15ml/L | 8-12ml/L |
| 牛血清白蛋白 | 0.34-0.64mg/L | 0.45-0.56mg/L |
| 单-二羟丙硫醇 | 0.09-0.225mM | 0.11-0.18mM |
| Activin A | 10-50mg/L | 20-40mg/L |
作为本发明的优选方式，所述的分化培养基中还含有碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor 2，bFGF)和骨成型蛋白4(Bone MorphogeneticProtein 4，BMP4)，从而在采用表1的分化培养基获得定型内胚层细胞占优势的细胞群后，通过在该分化培养基中加入bFGF和BMP4而使得所述定型内胚层细胞占优势的细胞群进一步分化为胎肝细胞占优势(通常胎肝细胞数量占细胞整体数量的40％以上，较佳地占细胞整体数量的50％以上)的细胞群。
所述的分化培养基中，Activin A是TGFβ超家族的成员，其蛋白序列可与GeneID：16323所示的序列基本相同。
所述的分化培养基中，bFGF和BMP4的较佳含量如表2所示。
表2
| 较佳含量 | 更佳含量 | |
| bFGF | 10-30mg/L | 15-25mg/L |
| BMP4 | 20-50mg/L | 25-35mg/L |
作为本发明的优选方式，所述的分化培养基中还含有bFGF和Noggin，从而在采用表1的分化培养基获得定型内胚层细胞占优势的细胞群后，通过在该分化培养基中加入bFGF和和Noggin而使得所述定型内胚层细胞占优势的细胞群进一步分化为胰腺前体细胞占优势(通常胰腺前体细胞数量占细胞整体数量的40％以上，较佳地占细胞整体数量的50％以上)的细胞群。
bFGF是碱性成纤维细胞生长因子，具有多种用途，在本发明中其对于诱导胎肝细胞的产生是有用的，其蛋白序列可以与GeneID：14173所示的基因基本上相似。
BMP4是一种已知的骨成型蛋白，具有多种用途，在本发明中其主对于诱导胎肝细胞的产生是有用的，其蛋白序列可以与GeneID：652所示的基因基本上相似。
所述的分化培养基中，bFGF和Noggin的较佳含量如表3所示。
表3
| 较佳含量 | 更佳含量 | |
| bFGF | 5-20mg/L | 7-15mg/L |
| Noggin | 30-70mg/L | 40-60mg/L |
其中，Noggin在本发明中对于诱导胎胰细胞的产生是有用的，其蛋白序列可以与GeneID：18121所示的基因基本上相似。
本发明所述的分化培养基中，各组分均可以通过商购的途径获得。因此，根据本发明人提供的配方，可以方便地配制出所述的分化培养基。
制备含定型内胚层细胞的细胞群的方法
本发明提供一种制备含定型内胚层细胞的细胞群的方法，所述方法包括：(1)用胶原包被培养容器，加入诱导分化培养基，所述的培养基是根据表1所述的配方配制的；(2)将经消化的胚胎干细胞接种到(1)的培养基中，培养所述的胚胎干细胞3-10天，诱导胚胎干细胞分化，从而获得含定型内胚层细胞的细胞群。
所述的“含定型内胚层细胞的细胞群”是指定型内胚层细胞占优势的细胞群，也即所述的细胞群中，定型内胚层细胞数量占细胞整体数量的40％以上，较佳地占细胞整体数量的45％以上；更佳地占细胞整体数量的50％或以上。
所述的定型内胚层细胞高表达内胚层基因Foxa2、Goosecoid或Sox17，这些基因均是已知的分子标记，细胞内这些分子标记的高表达代表所述细胞是定型内胚层细胞。所述的Foxa2基因可以与GeneID：15376所示的基因基本上相似。所述的Goosecoid基因可以与GeneID：14836所示的基因基本上相似。所述的Sox17基因可以与GeneID：20671所示的基因基本上相似。所述的“高表达”通常指所述基因在定型内胚层细胞的表达高于整体细胞群平均水平的5倍，较佳地高10倍；更佳地高100倍，如高500倍、1000倍或更高。
采用本发明的方法，获得的细胞群中基本不存在胚外内胚层细胞。传统的胚胎干细胞分化方法——拟胚体(Embryoid Body，EB)悬浮培养，已经被证明不可避免的会产生胚外内胚层细胞。而本发明采用单层培养，结合本发明的培养基，有效地避免了胚外内胚层细胞的分化产生，从而大大改善了定型内胚层细胞的诱导效率。所述的“基本不存在”是指所述的细胞群中，胚外内胚层细胞的含量低于胚胎干细胞正常培养情况下相同时期的水平，如低30％，较佳地低60％，更佳地低100％或更低，如低200％，低500％。
在进行诱导分化前，通常还包括传代培养胚胎干细胞。可以采用本领域人员已知的培养基进行传代培养。作为本发明的优选方式，所述的培养基包括：Neurobasal培养基、DMEM/F12培养基、N-2添加物、B-27添加物、牛血清白蛋白、单-二羟丙硫醇、BMP4、LIF。所述的传代培养的培养基中，各组分及其较佳含量如表4所示。
表4
| 较佳含量 | 更佳含量 | |
| Neurobasal培养基 | 400-570ml/L | 450-530ml/L |
| DMEM/F12培养基 | 400-570ml/L | 450-530ml/L |
| N-2添加物 | 3-7ml/L | 4-6ml/L |
| B-27添加物 | 5-15ml/L | 8-12ml/L |
| 牛血清白蛋白 | 0.34-0.64mg/L | 0.45-0.56mg/L |
| 单-二羟丙硫醇 | 0.09-0.225mM | 0.11-0.18mM |
| BMP4 | 5-15mg/L | 8-12mg/L |
| LIF | 0.05-0.15ml/L | 0.08-0.12ml/L |
传代培养胚胎干细胞的方法优选的是：(a)用明胶包被培养容器，加入传代培养基；(b)将经消化的原代胚胎干细胞接种到(a)的培养基中，传代培养所述的胚胎干细胞，每2-5天(优选2-3天)传代一次，获得未分化的胚胎干细胞。优选地，将原代胚胎干细胞传代3-5代。
作为本发明的优选方式，在获得定型内胚层细胞的细胞群后，还包括：从获得的含定型内胚层细胞的细胞群中分离出定型内胚层细胞群。可以采用本领域技术人员已知的方法来鉴定或分离定型内胚层细胞群。较为经典的方法如荧光激活的细胞分选技术(FACS)或磁性细胞分选法，也即利用抗定型内胚层细胞特定表面分子的抗体从总的细胞群中分离表达内胚层细胞特定表面分子的细胞群。优选的方法例如是FACS法。各种细胞都有相应的表面分子表达方式，通过免疫荧光标记技术将细胞表面分子同标记有特异染料或荧光的一种或以上特异性抗体结合后，在流式细胞仪同一激光光源激发下可产生一种或集中特异荧光色，由荧光检测器对每个细胞的体积、结构、荧光种类及性质等多种参数同时测定，从而可分析得到细胞群体的多种表面分子的表达情况，或分选出特定细胞。FACS法是一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的细胞分析或分选技术，利用合适的细胞表面分子，通过FACS法来分析或分选细胞是本领域人员熟知的技术。作为本发明的优选方式，利用FACS和表面标记技术，能够将定型内胚层细胞富集至CXCR4+ECD+细胞群中；利用RT-PCR以及其它基因表达分析技术，证明富集到的内胚层细胞纯度较高，很少有其它胚层细胞的污染，特别是基本上不存在胚外内胚层细胞。
利用本发明的方法，可建立哺乳动物胚胎干细胞向定型内胚层分化的系统，从而为研究哺乳动物胚胎发育分子机制提供研究模型。胚胎干细胞向内胚层的分化为细胞进一步向肝脏细胞或胰脏细胞分化奠定基础，最终可实现胚胎干细胞向功能性肝脏细胞和/或胰脏细胞的高效分化，从而为细胞移植的临床研究和基础研究提供良好途径。
本发明还包括采用前述的制备方法获得的含定型内胚层细胞的细胞的细胞群。所述的细胞群中，定型内胚层细胞数量占细胞整体数量的40％以上，较佳地占细胞整体数量的45％以上；更佳地占细胞整体数量的50％或以上。
本发明还包括经过分选技术分离出来的定型内胚层细胞含量更高的细胞群。优选地，可分选细胞表面CXCR4分子阳性且ECD分子阳性的细胞群，所述的细胞群中定型内胚层细胞占细胞总数的80％以上；较佳的90％以上。
作为本发明的优选方式，在获得了所述的含定型内胚层细胞的细胞群后，还包括步骤：诱导定型内胚层细胞分化为含胎肝细胞的细胞群。较佳地，所述的方法包括：用胶原包被培养容器，加入诱导培养基，所述的诱导培养基在表1所示培养基的基础上，还包括了如表2所示配方的bFGF和BMP4；将所述的含定型内胚层细胞的细胞群消化后接种到该诱导培养基中，培养1-5天(较佳的2-3天)，诱导所述含定型内胚层细胞的细胞群分化为含胎肝细胞的细胞群，所述的胎肝细胞表达(即Afp+)。经验证，采用所述的方法，可获得胎肝细胞占优势的细胞群。较佳地，所述方法还包括：从获得的含胎肝细胞的细胞群中分离出胎肝细胞的细胞群。
本发明还包括采用本发明所述的方法获得的含胎肝细胞的细胞群。
作为本发明的优选方式，在获得了所述的含定型内胚层细胞的细胞群后，还包括步骤：诱导定型内胚层细胞分化为含胰腺前体细胞的细胞群。较佳地，所述的方法包括：用胶原包被培养容器，加入诱导培养基，所述的诱导培养基在表1所示培养基的基础上，还包括了如表2所示配方的bFGF和Noggin；将所述的含定型内胚层细胞的细胞群消化后接种到该诱导培养基中，培养1-5天(较佳的2-3天)，诱导所述含定型内胚层细胞的细胞群分化为含胰腺前体细胞的细胞群，所述的胰腺前体细胞表达Pdx1(即Pdx1+)。经验证，采用所述的方法，可获得胰腺前体细胞数量占优势的细胞群。较佳地，所述方法还包括：从获得的含胰腺前体细胞的细胞群中分离出胰腺前体细胞的细胞群。
本发明还包括采用本发明所述的方法获得的含胰腺前体细胞的细胞群。
本发明涉及的胚胎干细胞是非人哺乳动物的胚胎干细胞，或是通过商业途径购买的，而并非通过破坏胚胎的方式获得的胚胎干细胞。所述的胚胎干细胞优选的是非人哺乳动物胚胎干细胞，如兔、鼠、羊、猪、猴。较佳的，所述的胚胎干细胞是鼠胚胎干细胞。
早在1998年人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞就已经建系成功，例如1998年Thomson领导的小组从14个囊胚中最终建立起5个人类ES细胞系：H1、H13、H14、H7和H19；Gearhart领导的小组从5-9周龄的流产胎儿的性腺嵴及肠系膜中分离原始的干细胞，以期避免因直接利用胚胎所造成的伦理学上的麻烦。见晁岚等，“人胚胎干细胞的研究进展”，《现代妇产科进展》，2003年7月第12卷第4期。基于上述工作，在2000年的2月份，Wisconsin Alumni ResearchFoundation(WARF)建立了WiCell，WiCell是一家非官方的、非盈利性的附属机构，它以低费用向合格的科学家分配人胚胎干细胞。此外，提供这种现成的人胚胎干细胞的机构还包括NSCB(National Stem Cell Bank)、ES CELLINTERNATIONAL、nov cell、TECHNION-HOME TO ISRAEL’S NOBELSCIENTISTS、UCSF(University of California San Fransisco)等机构。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明首次揭示一种利用单层培养技术诱导胚胎干细胞高效分化为定型内胚层细胞以及通过流式细胞术富集的新方法，该方法具有诱导条件简单明确，重复性高；诱导效率高的优点。
(2)本发明的方法富集到的内胚层细胞纯度较高，显微镜下可见该细胞为典型上皮样细胞；很少有其它胚层细胞的污染，特别是有效减少了胚外内胚层细胞的产生。
(3)本发明的方法得到的小鼠定型内胚层细胞可用于后续分化为各种内胚层来源器官的前体细胞类型，如胎肝细胞(Afp+)、胰腺前体细胞(Pdx1+)等。
本发明的主要优点在于：
(1)找到了一种非常适合于诱导胚胎干细胞分化为定型内胚层细胞的培养基；并且，提供了基于所述培养基添加Noggin或bFGF而诱导定型内胚层细胞分化为胎肝细胞或胰腺前体细胞的培养基。
(2)提供了一种采用单层培养技术制备定型内胚层细胞占优势的细胞群方法，所述方法诱导定型内胚层细胞的效率高，产生的细胞群中基本不存在胚外内胚层细胞；并且，产生的细胞群中造血中胚层、胚外内胚层(VE)、滋养外胚层、神经外胚层细胞基本维持在胚胎干细胞本底的表达水平，没有大量产生。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1.定型内胚层细胞的诱导分化
1.小鼠胚胎干细胞的培养
a)明胶的包被
吸取适量ESGRO Complete Gelatin Solution(Millipore)入培养瓶/皿中，室温静置30-60分钟，吸去明胶溶液，待用。
b)小鼠胚胎干细胞的传代
每2-3天，将小鼠胚胎干细胞(购自ATCC，CRL-1821)以ESGRO CompleteEnzyme-Free Dissociation Solution(Millipore)于37℃消化5-10分钟后，以1∶3到1∶5传代，每2-3天传代。每100ml培养液的成分如表5配方1或配方2。
在配制液体培养基时，体积不足的情况下余量为水。
表5
| 配方1 | 配方2 | |
| Neurobasal培养基(Invitrogen；目录号21103-049) | 48.9ml | 43ml |
| DMEM/F12培养基(Invitrogen；目录号10565-018) | 48.9ml | 54.8ml |
| N-2添加物(Invitrogen；目录号17502-048) | 0.5ml | 0.6ml |
| B-27添加物(Invitrogen；目录号12587-010) | 1ml | 0.9ml |
| 7.5％(w/v)牛血清白蛋白(Invitrogen；目录号15260-037) | 0.667ml | 0.6ml |
| 0.45M单-二羟丙硫醇(mono-thioglycerol)(Sigma) | 0.033ml | 0.05ml |
| BMP4(R&D；目录号314-BP) | 10ng/ml | 8ng/ml |
| LIF | 0.01ml | 0.012ml |
| (Millipore；目录号ESG1107) |
上表中，0.45M单-二羟丙硫醇0.033ml相当于单-二羟丙硫醇终浓度为0.15mM。
2.定型内胚层细胞的诱导分化
a)小鼠IV型胶原的包被
将Mouse Collagen IV(BD Biosciences)溶解于0.05N HCl溶液中，以1-2μgMouse Collagen IV/cm2加入培养瓶/皿中，室温静置30-60分钟。吸去HCl，待用。
b)用于诱导分化的小鼠胚胎干细胞的消化与接种
将小鼠胚胎干细胞用ESGRO Complete Enzyme-Free Dissociation Solution(Millipore)于37℃消化5-10分钟后，以5×103-5×104/ml的密度接种到包被有小鼠四型胶原的培养瓶中，每2天换一次液。每100ml培养液的成分如表6配方。
表6
| 配方1 | 配方2 | 配方3 | |
| Neurobasal培养基 | 48.9ml | 43ml | 54.8ml |
| DMEM/F12培养基 | 48.9ml | 54.8ml | 43ml |
| N-2添加物 | 0.5ml | 0.6ml | 0.4ml |
| B-27添加物 | 1ml | 0.9ml | 1.2ml |
| 7.5％(w/v)牛血清白蛋白 | 0.667ml | 0.6ml | 0.7ml |
| 0.45M单-二羟丙硫醇 | 0.033ml | 0.05ml | 0.028ml |
| Activin A(R&D；目录号338-AC) | 30ng/ml | 40ng/ml | 20ng/ml |
5天以后，消化细胞进行流式细胞术检测。
实施例2.流式细胞术检测表面标记CXCR4与E-Cadherin(ECD)
将消化后的细胞用含0.5％BSA的PBS悬浮，按每105个细胞加入10μl抗体的比例，分别加入抗小鼠CXCR4-APC与抗小鼠ECD-PE的抗体(R&D)，4℃孵育30分钟。用含0.5％BSA的PBS洗两遍。最后用500μl含0.5％BSA的PBS悬浮，FACS上机检测。
本发明人通过FACS分析了分化得到的细胞中CXCR4+ECD+群体的比例，分析结果见图1B。正常情况下，定型内胚层细胞的诱导效率维持在50％的水平。培养条件下的细胞呈现定型内胚层细胞典型的上皮样形态，细胞与细胞之间具紧密连接，明场细胞形态见图1A。图1各结果诱导培养时具体采用的是表6配方1培养基，采用配方2和3作为培养基获得的结果类似。
实施例3.定量PCR检测定型内胚层细胞生成过程中的基因表达变化情况
在诱导培养的第5天，采用常规的定量PCR技术，利用Qiagen公司的Quantitect SYBR Green PCR master mix试剂盒，本发明人观察了分化过程中整个细胞群体的基因表达动态情况。典型的定型内胚层基因如Foxa2、Goosecoid、Sox17等都呈现高达数千倍的上调，见图2A。已知与中内胚层(mesendoderm)分化有关的几个基因，包括Brachyury、Eomesodermin、Mixl1等呈现上调又下调的动态表达特征，见图2B。这些都与定型内胚层细胞在胚胎发生过程中的基因动态表达情况非常吻合。图2各结果诱导培养时具体采用的是表6配方1培养基，采用配方2和3作为培养基获得类似的结果。
本发明人也观察了在这一分化体系中，其它胚层细胞的产生情况，选取了Rex1、Gata1、Sox7、Cdx2、Sox1分别作为ESC、造血中胚层、胚外内 胚层(VE)、滋养外胚层、神经外胚层的分子标记，发现它们的表达大都没有显著的上调，基本维持在胚胎干细胞本底的表达水平，见图2C。
由上述结果可以判断，本发明人建立的分化方法是针对定型内胚层细胞特异的，可以获得内胚层占优势的细胞群。
实施例4.流式细胞术分选CXCR4+ECD-和CXCR4+ECD+两个群体，实时定量PCR检测基因表达情况
在诱导培养的第5天，采用常规的定量PCR技术，利用Qiagen公司的Q，采用常规的流式细胞术(染色方法同上)分选CXCR4+ECD-和CXCR4+ECD+两个群体，见图3A。离心收集细胞后分别进行RNA抽提，逆转录生成单链cDNA作为下步定量PCR的模板。定量PCR采用Qiagen公司的Quantitect SYBR GreenPCR master mix试剂盒。
基于CXCR4和ECD的表达，在诱导培养的第5天，本发明人进一步分选了不同的细胞群体。根据传统的理解，认为CXCR4+ECD+群体代表定型内胚层细胞，而CXCR4+ECD-群体代表早期中胚层细胞。通过定量PCR分析，本发明人观察到几个典型的内胚层基因如Foxa2、Goosecoid和Sox17的表达显著富集在CXCR4+ECD+群体中。这进一步证实，本发明人分化得到的CXCR4+ECD+群体代表着定型内胚层细胞，见图3B。
相反的，泛中胚层表达的基因Meox1显著富集在CXCR4+ECD-群体中，见图3C。
此外，本发明人还对CXCR4-ECD+这个群体进行了分析。传统认为这是一个代表胚外内胚层的群体。本发明人发现在本发明得到的CXCR4-ECD+群体中，代表胚外内胚层的标记Sox7表达量甚至低于胚胎干细胞本底的水平，见图3C，这意味着它不可能是胚外内胚层细胞。本发明人还观察到这个群体呈现出Nanog和Brachyury的高表达。它们分别是从胚胎干细胞到定型内胚层细胞的中间态细胞epiblast和mesendoderm的标记。上述结果提示这是一个未同步化的前体细胞群体。这一点的重要意义在于，本发明人建立的定型内胚层细胞诱导分化方法完全摆脱了胚外内胚层细胞的干扰，这在传统的拟胚体悬浮诱导方法中是无法避免的。而这种自发生成的胚外内胚层细胞正是当前胚胎干细胞向定型内胚层细胞分化中的最大阻碍之一。
实施例4.用分化得到的定型内胚层细胞继续诱导得到胎肝细胞(Afp+)或胰腺前体细胞(Pdx1+)
由胚胎干细胞诱导5天后，将细胞消化后接种在铺有I型胶原(BDBiosciences)的培养瓶中，在不同条件下继续诱导2天得到表达Afp的胎肝细胞或表达Pdx1的胰腺前体细胞。消化后离心收集细胞进行RNA抽提，逆转录生成单链cDNA作为下步定量PCR的模板。定量PCR采用Qiagen公司的Quantitect SYBR Green PCR master mix试剂盒。
培养基如下：
胎肝细胞：每100ml培养液的成分如表7配方1或配方2。
表7
| 配方1 | 配方2 | |
| Neurobasal培养基 | 48.9ml | 54.8ml |
| DMEM/F12培养基 | 48.9ml | 43ml |
| N-2添加物 | 0.5ml | 0.4ml |
| B-27添加物 | 1ml | 1.2ml |
| 7.5％(w/v)牛血清白蛋白 | 0.667ml | 0.7ml |
| 0.45M单-二羟丙硫醇 | 0.033ml | 0.028ml |
| Activin A | 30ng/ml | 25ng/ml |
| bFGF(R&D；目录号3139-FB) | 20ng/ml | 25ng/ml |
| BMP4 | 30ng/ml | 35ng/ml |
胰腺前体细胞：每100ml培养液的成分如表8配方1或配方2。
表8
| 配方1 | 配方2 | |
| Neurobasal培养基 | 48.9ml | 43ml |
| DMEM/F12培养基 | 48.9ml | 54.8ml |
| N-2添加物 | 0.5ml | 0.6ml |
| B-27添加物 | 1ml | 0.9ml |
| 7.5％(w/v)牛血清白蛋白 | 0.667ml | 0.6ml |
| 0.45M单-二羟丙硫醇 | 0.033ml | 0.05ml |
| Activin A | 30ng/ml | 40ng/ml |
| bFGF | 10ng/ml | 15ng/ml |
| Noggin(R&D；目录号1967-NG) | 50ng/ml | 55ng/ml |
根据已有的关于胚胎发育中不同信号通路调控肝、胰等器官发生的报道，本发明人设计了不同的诱导分化条件，将得到的定型内胚层细胞分别继续分化成为早期的胎肝细胞或胰腺前体细胞。通过定量PCR的分析可以知道继续诱导2天后的细胞较之定型内胚层细胞，显著上调了Afp或Pdx1的表达，分别见图4A(诱导培养时具体采用表7配方1培养基)和图4B(诱导培养时具体采用表8配方1培养基)。
Afp和Pdx1分别是早期胎肝细胞或胰腺前体细胞特异的标记。上述结果充分说明，本发明所得到的胚胎干细胞来源的定型内胚层细胞，在发育的潜能上，和早期胚胎内的定型内胚层细胞非常相似。在合理的后续分化条件下，本发明所得到的定型内胚层细胞有很大的潜力用于将来的细胞治疗。
综上所述，本发明人已建立的定型内胚层诱导分化方法具备如下优势：
(1)没有检测到胚外内胚层细胞的产生。
(2)较低水平的造血中胚层基因的表达。
(3)较之前发表的同类结果具更高的诱导效率(50％)。
(4)更显著的内胚层基因的表达。
(5)更高的细胞汇集度(80-90％)。
(6)可扩展到大规模的化合物文库筛选。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (12)
1.一种制备含定型内胚层细胞的细胞群方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)培养容器中加入诱导分化培养基，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
活化素A 10-50mg/L；
(2)将胚胎干细胞接种到(1)的培养基中，培养所述的胚胎干细胞3-10天，诱导胚胎干细胞分化，从而获得含定型内胚层细胞的细胞群，所述细胞群中定型内胚层细胞数量占细胞总数的40％以上。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前，还包括传代培养胚胎干细胞的步骤：
(a)培养容器中加入传代培养基，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM：
BMP4 5-15mg/L；
白血病抑制因子 0.05-0.15ml/L；
(b)将原代胚胎干细胞接种到(a)的培养基中，传代培养所述的胚胎干细胞，每2-5天传代一次，获得未分化的胚胎干细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述方法还包括：(3)从(2)获得的细胞群中分离出定型内胚层细胞群。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，分选细胞表面CXCR4分子阳性且ECD分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：
(3’)培养容器中加入诱导培养基，该培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
活化素A 10-50mg/L；
bFGF 10-30mg/L；
BMP4 20-50mg/L；
(4’)将步骤(2)获得含定型内胚层细胞的细胞群接种到(3’)的培养基中，培养1-5天，诱导所述含定型内胚层细胞的细胞群分化为含胎肝细胞的细胞群；
或者，所述的方法还包括步骤：
(3”)培养容器中加入诱导培养基，该培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
活化素A 10-50mg/L；
bFGF 5-20mg/L；
Noggin 30-70mg/L
(4”)将步骤(2)获得含定型内胚层细胞的细胞群接种到(3”)的培养基中，培养1-5天，诱导所述含定型内胚层细胞的细胞群分化为含胰腺前体细胞的细胞群。
6.一种含定型内胚层细胞的细胞群，所述的细胞群中定型内胚层细胞数量占细胞总数的40％以上；所述的细胞群通过以下方法获得：
(1)培养容器中加入诱导分化培养基，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
Activin A 10-50mg/L；
(2)将胚胎干细胞接种到(1)的培养基中，培养所述的胚胎干细胞3-10天，诱导胚胎干细胞分化，从而获得含定型内胚层细胞的细胞群。
7.如权利要求6所述的细胞群，其特征在于，在步骤(2)之后，还包括步骤：分选细胞表面CXCR4分子阳性且ECD分子阳性的细胞群，所述的细胞群是定型内胚层细胞群。
8.一种用于制备定型内胚层细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 400-570ml/L；
DMEM/F12培养基 400-570ml/L；
N-2添加物 3-7ml/L；
B-27添加物 5-15ml/L；
牛血清白蛋白 0.34-0.64mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.09-0.225mM；
活化素A 10-50mg/L。
9.如权利要求8所述的培养基，其特征在于，所述的培养基包括：
Neurobasal培养基 450-530ml/L；
DMEM/F12培养基 450-530ml/L；
N-2添加物 4-6ml/L；
B-27添加物 8-12ml/L；
牛血清白蛋白 0.45-0.56mg/L；
单-二羟丙硫醇 0.11-0.18mM；
活化素A 20-40mg/L。
10.如权利要求8-9任一所述的培养基，其特征在于，所述的培养基还包括：
碱性成纤维细胞生长因子 10-30mg/L；
骨成型蛋白4 20-50mg/L。
11.如权利要求8-9任一所述的培养基，其特征在于，所述的培养基还包括：
碱性成纤维细胞生长因子 5-20mg/L；
Noggin 30-70mg/L。
12.权利要求8-9任一所述的培养基的用途，用于制备含定型内胚层细胞的细胞群，所述的细胞群中，定型内胚层细胞占细胞总数的40％以上。
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