JP2018148921A - 赤血球の産生 - Google Patents

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Abstract

【課題】幹細胞の赤血球系細胞への分化（differentiation）を誘導し、サポートするのに適した方法及び培地を提供する。【解決手段】幹細胞から胚様体を形成する工程、胚様体を、骨形成タンパク質４；管内皮（細胞）増殖因子１６５；Ｗｎｔ３Ａ；アクチビンＡ；及びインヒビターVIIIまたはＣＨＩＲ９９０２１からなる群から選択されるＧＳＫ３阻害剤を含むステムラインIIと接触させて分化を誘導する工程、前記分化する細胞を更に：ＢＭＰ４；ＶＥＧＦ；ＦＧＦα；ＳＣＦ；インスリン様成長因子２；トロンボポエチン；ヘパリン；イソブチルメチルキサシン；及びβ−エストラジオールを含むステムラインII（幹細胞系II）に再懸濁する工程、等を含む幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法。【選択図】なし

Description

本発明は、幹細胞の赤血球系細胞への分化（differentiation）を誘導し、サポートするのに適した方法及び培地を提供する。
幹細胞からの赤血球細胞（特にヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ））の産生は、ここ最近の科学コミュニティにおける関心事である。この要因の一部に、世界的な輸血の需要を満たすために必要な臨床的に安全な血液をドナーから確保しにくくなっていることがある。
幹細胞由来の赤血球細胞の生成について関心が高いにもかかわらず、殆ど研究が行われず、ＲＢＣの分化に重大な問題が残ったままとなっている。特に問題なのは、i）幹細胞の分化効率、ii）原始赤血球細胞とは対照的である産生の確実性、iii）分化プロセス全体の持続的な増幅、及びiv）分化した細胞の除核と最終成熟である。
本発明は、幹細胞を赤血球系細胞に分化するフィーダーフリー培養システムと培地を提供する。
第１の態様では、本発明は幹細胞を赤血球系細胞へ分化誘導する方法を提供する。この方法は、幹細胞をＧＳＫ３阻害剤とホスホジエステラーゼに接触させる工程からなる。
ＧＳＫ３阻害剤は、ＧＳＫ３−beta（ＧＳＫ３−β）阻害剤を含む。ＧＳＫ３阻害剤は、特定のＧＳＫ３阻害剤を含む。例えば、ＧＳＫ３阻害剤は特定のＧＳＫ３−β阻害剤を含む。特定のＧＳＫ３阻害剤がＧＳＫ３に結合し、かつ／またはＧＳＫ３を抑制するが、検出可能な程には結合せず、かつ／または他のキナーゼを抑制しないことが分かるだろう。ＧＳＫ３阻害剤は、例えば、inhibitorVIII、またはＡＲ−Ａ０１４４１８として知られるＮ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル） 尿素を含む。ＧＳＫ３阻害剤は、Ｎ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾール−２−イル）の誘導体または類似体でもよい。追加のまたは代替の、ＧＳＫ３阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１、その誘導体または類似体が挙げられる。
本明細書においては、ＧＳＫ３阻害剤は（i）特定のＧＳＫ３阻害剤類、（ii）ＧＳＫ３−β阻害剤類、（iii）inhibitorVIII、及び／または（iv）ＣＨＩＲ９９０２１を意味する。
ホスホジエステラーゼ阻害剤は、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ））でもよい。このタイプの化合物は以下の式で示される。
Figure 2018148921
 式中、Ｒ1は水素、アルキルまたはメチルを表し；Ｒ2は水素、アルキル、メチルまたはイソブチルを表し；Ｒ3は水素、アルキルまたはメチルを表し；Ｒ4は水素、アルキル（低級または高級アルキル、例えば、直鎖状または分岐鎖状のＣ1〜Ｃ6またはＣ7〜Ｃ10）、フェニル、置換フェニル、水酸基、メチル、または（ＣＨ2）n−Ｏ−Ｒ5；を表し；Ｒ5は水素、アルキル、またはメチルを表す。
本発明は、例えば８−ＭｅＯ−ＩＢＭＸなどのＭＭＰＸとして知られるＩＢＭＳ誘導体を利用している。
ＭＭＰＸは以下の式で示される。
Figure 2018148921
本発明の方法は、inhibitorVIII及び／またはＣＨＩＲ９９０２１及びＩＢＭＸを利用する。
本発明者らは、本明細書に記載の方法により、幹細胞から赤血球系細胞を改善された効率で得る方法を発見した。具体的には、細胞をＧＳＫ３阻害剤やホスホジエステラーゼ阻害剤にさらすか接触させて、臨床グレードに近い程度に程品質が改善された赤血球系細胞を生成する方法を発見した。さらに、本方法により作られた赤血球系細胞は、従来技術で作られたものよりも強いことが分かっている。さらに、本方法は懸濁液ベースの液体培養系を利用するのでスケールアップか可能である。また、本方法は精製の工程が不要な程、十分に高い効率に達していると本発明者らは考えている（ｄ１０でＨＰＣが８０％を超え、ｄ２４までに赤血球シリーズが９０％を超える）。また、本方法はＲＢＣに分化する際におこる細胞の著しい増幅をサポートする（ｄ０〜２４で約３５００００フォールド以下）。これは、ＨｏｘＢ４を増幅物質として利用した場合などに従来技術に比べて著しい改善が見られることを示している。本方法は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）や完全にＧＭＰに準拠したライセンス条件下で誘導される幹細胞株などの胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）に適用することができる。このタイプの細胞を本明細書ではまとめて“幹細胞”と呼ぶ（下記の定義参照）。発明者らは、さらに本明細書に記載の方法による幹細胞は赤血球生成の整染性正常赤芽球（orthochromatic normoblast）の段階に到達し、決定的な造血の特性（胚性グロビンのシャットオフとＡγグロビンの発現など）を示していると確信している。
“幹細胞”の用語は、自己複製と無限分裂をするあらゆる細胞を意味し、このタイプの細胞は“不死”として記述される。また、適切な条件下で培養し、及び／または特定の化合物に接触し、及び／または条件にさらされると、幹細胞は、胚及び／または成体組織を形成する１以上の特殊な細胞型に分化することができる。
幹細胞は本来、分化全能性があり、この全能細胞はあらゆる特殊な細胞型だけでなく、完全な生菌を生成することが分かるだろう。多能な幹細胞においては、このタイプの細胞は完全な生菌を産生することはできないが、あらゆる特殊な細胞型に分化できる。このように、本発明はあらゆるタイプの全能性及び／または多能性幹細胞に適用することができる。
本明細書において、“幹細胞”という用語は、胚、胎児、成体及び／または人工多能性幹細胞を含む。さらに、“幹細胞”という用語は、あらゆるタイプの前駆細胞も含む。ある実施形態においては、そこに記載されている幹細胞は哺乳動物の細胞である；例えば、“幹細胞”という用語はヒト及び／またはヒト以外の幹細胞の全てのタイプに適用することができる。例として、本発明は、霊長類、有蹄、反芻動物及び／または齧歯類（特に、ヒツジ、ブタ、畜牛、ヤギ、ウマ、ラットやマウス）に由来し、それから得られ、または提供される幹細胞に関するものである。
幹細胞は、次の群から選ばれる１以上のマーカーの存在で特徴づけられる：ＡＢＣＧ２、ＡＣＥ、ＡＬＣＡＭ、アルカリホスファターゼ、β−IIIチューブリン、ＢＭＰ−２、ＢＭＰＲ−ＩＡ／ＡＬＫ−３、ＢＭＰＲ−ＩＢ／ＡＬＫ−６、ＢＭＰＲ−２、Ｅ−カドヘリン、ＣＣＲ４、ＣＤ９、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＸＣＲ４、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、エンドグリン／ＣＤ１０５、ＦＡＢＰ１、ＦＡＢＰ２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ Ｒ４、ＦｏｘＤ３、ＦｏｘＰ３、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９、ＧＡＤ１ ／ＧＡＤ６７、ＧＡＴＡ−４、ＧＡＴＡ−６、ＧＤＦ−３、Ｇｌｕｔ１、ＨＮＦ−３ β、インテグリンα６／ＣＤ４９ｆ、インテグリンｂｅ−ｔａ１／ＣＤ２９、Ｌｅｆｔｙ、ＭＡＰ２、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、Ｎａｎｏｇ、ＮＣＡＭ−Ｌ１、ネクチン−２ＣＤ１１２、ネスチン、ニューロＤ１、Ｎｏｄａｌ、Ｎｏｇｇｉｎ、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、ヌクレオステミン、Ｏｔｘ２、Ｏｃｔ ３／４、ＰＡＸ６、ポドカリキシン、プロミニン２、ＲＯＢ０３、Ｓｃａ−１、ＳＣＦ Ｒ／ｃ−ｋｉｔ、ＳＨＨ、ＳＯＸ２、ＳＯＸ７、ＳＯＸ１７、ＳＰＡＲＣ、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＳＴＡＴ３、ＳＴＲＯ−１、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、チロシンヒドロキシラーゼ、γセクレターゼ、αセクレターゼ、βセクレターゼ、β−IIIチューブリン、αフェトプロテイン、βカテニン、ビメンチン及びＶＣＡＭ−１。これらのマーカーは、集合的に幹細胞マーカーと呼ばれ、したがって、本明細書で述べる“幹細胞マーカー”は上記マーカーを１以上含む。当業者には、幹細胞を同定しまたは検出するために、上記マーカーが１以上存在するか否かを（例えば、上記幹細胞マーカーの１以上と結合できる抗体や他の物質を使用して）検査することが理解できるであろう。
本発明の方法は、上述の任意の細胞に適用することができる。特定のタイプの幹細胞について、以下により詳細に説明する。
本発明は、胚幹細胞（ＥＳＣ）（例えば、哺乳類及び／またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ））から赤血球系細胞を産生するのに利用できる。ＥＳＣは、初期の胚、特に発育中の桑実胚または胚盤胞の内細胞塊から誘導される。例えば、この段階の胚及びその直後の短期間の胚から誘導される胚幹細胞は分化全能性（totipotent）（完全な生菌及び任意の細胞型を産生できる細胞）である。その後の段階の胚から誘導される胚幹細胞（すなわち、成長中の胚盤胞の内細胞塊から誘導されるもの）は分化多能性（pluripotent）である（完全な生菌は産生できないが、特定の細胞型に分化することができる）。従って、本発明は胚幹細胞（すなわち、全能性及び／または多能性の胚幹細胞）に適用することができる。
当業者は、本明細書に記載の方法で使用するｈＥＳＣや他の細胞株が、例えば、チャンら（Chung et al）の方法で胚からその胚を壊すことなく得られることを理解できるだろう（Cell Stem Cell,vol 2,issue 2, 113-117, 2008）。幹細胞は、またチャンら（Chung et al（2006））の方法で、胚盤胞（おおよそ８細胞期の胚盤胞）を形成する前の初期段階の胚から割球細胞を採取し、この細胞を確立された幹細胞系と共に培養して、十分に能力のある幹細胞株を産生することができる。チャンら（Chung et al（2006, 2008））に記載の方法で得られる幹細胞は幹細胞系を確立するのに用いられ、それらは本方法で使用する幹細胞の供給源として有用である。
胚幹細胞のマーカーとしては、例えば、ＡＢＣＧ２、アルカリホスファターゼ、Ｅ−カドヘリン、ＣＣＲ４、ＣＤ９、Ｃｒｉｐｔｏ、ＤＰＰＡ５／ＥＳＧ１、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ Ｒ４、ＦｏｘＤ３、ＦｏｘＰ３、ＧＤＦ−３、インテグリンα６／ＣＤ４９ｆ、インテグリンβ１／ＣＤ２９、Ｌｅｆｔｙ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ ３／４、ポドカリキシン、ＳＯＸ２、ＳＰＡＲＣ、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４及びＳＴＡＴ３が挙げられる。
“幹細胞”という用語は、また、原腸形成期の過程で発達する３つの一次胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のいずれかより誘導される多能性細胞の意味に用いられる。これらの胚葉から誘導される細胞は、識別手段となる１以上のマーカーを発現する。例としは、外胚葉の胚葉は、例えば、Ｏｔｘ２、ネスチン、ＴＰ６３／ＴＰ７３Ｌ、β−IIIチューブリン、ＳＨＨ、ＰＡＸ６などのマーカーを発現する。外胚葉はニューロンなどの細胞型を形成する能力を有し、初期のニューロン系統マーカーとしては、ＡＣＥ、ＡＬＣＡＭ、ＣＤ９０／Ｔｈｙｌ、ＧＡＤ１／ＧＡＤ６７、Ｇｌｕｔｌ、ＭＡＰ２、ＮＣＡＭ−Ｌ１、ネクチン−２ＣＤ１１２、ＮｅｕｒｏＤｌ、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、ＲＯＢ０３、γセクレターゼ、αセクレターゼ、βセクレターゼ、β−IIIチューブリン、チロシンヒドロキシラーゼが挙げられる。神経幹細胞マーカーとしては、ＡＢＣＧ２ｃＸＣＲ４、ＦＧＦ Ｒ４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ−９、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、ネスチン、Ｎｏｇｇｉｎ、ヌクレオステミン、プロミニン２、ＳＯＸ２、ビメンチンが挙げられる。初期の内胚葉細胞のマーカーとしては、例えばＦＡＢＰ１、ＦＡＢＰ２、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３β（集合的には、完全に発育した内胚葉（definitive endodermal）幹細胞マーカーと言う。）が挙げられ、同様に原始内胚葉のためのマーカーとしてはα−フェトプロテイン、βカテニン、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ１７及びＳＯＸ７などが挙げられる。
本発明は、また“成熟した”幹細胞に適用することができる。このタイプの細胞は、動物の成体及び／または成体組織（あるいは成長／分化した組織）（ヒト成体及び／またはヒト成体組織を含む）から得られる幹細胞である。ここで、“成体”には、新生児、乳児、若年及び／または青年期の動物から誘導される幹細胞も含まれる。この成体幹細胞は任意の適切な組織を供給源とするものであればよく、例えば毛包、皮膚、歯などの骨髄及び／または特殊な構造も含まれる。
本発明が適用できる幹細胞は、例えば胚性動物（ヒトの胚を含む）、不妊治療プログラムの一部として中絶され、または作成された胚などの様々な供給源から得られる。他の場合として、確立された幹細胞株から幹細胞を得ることも可能であり、これによりヒトの胚を含む哺乳動物の胚の使用を回避することができる。本発明で使用する幹細胞の例として、Ｈ１及び／またはＲＣ９／１１／１２／１３細胞株から得られるものが挙げられる。
また、本発明が適用できる幹細胞は、マイスナー及びジェニッシュ（Meissner & Jaenisch（2006））の方法により得ることができる。これらの方法では、胚幹細胞株が誘導される再構築胚を調製するために、核移植プロセス中にｃｄｘ２遺伝子がドナー核の中でサイレンシングされる。ｃｄｘ２遺伝子は、細胞株の調製に使用された胚から単離された状態の胚盤胞の細胞内で再度オン状態になる。これは、いわゆる“代替核移植”と呼ばれる例であり、胚は着床できないが、そこから誘導される幹細胞株には十分な能力がある。
“幹細胞”は、また人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）として知られている細胞を含む。これらは特定の因子（転写調節因子など）を発現するように再プログラムされた成体の体細胞であり、再プログラムの結果、個々の特殊な細胞型に分化できる。このようにして、特に齧歯類などの哺乳類のｉＰＳ細胞を、本明細書に記載の方法及び／または組成物で培養しかつ／または保持することができる。
上記の方法により誘導された赤血球細胞は、以下の群から選択される１以上の造血／赤血球系マーカーの発現によって特徴づけられる：ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ７１及びＣＤ２３５ａ。
本明細書に記載の方法で使用される幹細胞は、供給源から直接使用することができる。追加的または代替的に、本発明で使用する幹細胞は一定時間保持された幹細胞を含む。
“保持された”幹細胞は、一定期間またはより長い期間に亘り、かつ／または継代数を超えて、増殖性及び／または多能性の状態を維持する。保持された幹細胞は多能性または多能性表現型を保持し、本明細書に記載の１以上の幹細胞マーカーを発現する。
本明細書に記載の方法で使用する幹細胞は、幹細胞を幹細胞保全プロトコルに従って扱うことにより保持することができる。幹細胞保全プロトコルでは、幹細胞を保持するのに適した培地及び／または基質を使用する。例えば、幹細胞はStemPro（登録商標）のような幹細胞培地で保持することができる。さらに、幹細胞は例えばCELLstart（登録商標）などの基質で保持することができる。保持された幹細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日毎に継代培養することができる。
本明細書に記載の方法は、例えば一定期間保持されている幹細胞が、胚様体を形成するように誘導する追加の工程を含む。特定の条件下におかれるか、さらされると幹細胞は胚様体を形成することを当業者は理解するだろう。具体例として、本明細書に記載の保守プロトコルを使用し保持された幹細胞などの幹細胞は、付着性の低い基質を含む培養系に移してもよい。付着性の低い（例えば、極めて低い）基質上で、または基質の存在下で培養すると、幹細胞は胚様体を形成する方向に進む。胚様体の形成を誘導する培養系へ移送するに先立って、幹細胞の融合性単層を切断または区分し、単層の塊あるいは一部を培養系に移し、その培養系上で単層の一部及び／または塊を胚様体が形成するように誘導する。
上記に鑑みて、本発明は、（ａ）幹細胞が胚様体を形成するように誘導する工程、及び（ｂ）胚様体にＧＳＫ３阻害剤とホスホジエステラーゼ阻害剤を接触させる工程を
含む幹細胞（ｈＥＳＣ）の赤血球系細胞への分化誘導方法を提供する。
本発明の第１の態様による方法は、第１及び第２の段階（phase）からなる。第１の段階及び第２の段階は、幹細胞が中胚葉（mesodermal germ layer）、造血系の細胞、及び最終的に赤血球系細胞の特徴を示す方向に徐々に分化させる工程からなる。
この方法は、幹細胞または胚様体をＧＳＫ３阻害剤（InhibitorVIII及び／またはＣＨＩＲ９９０２１など）に接触させる第１段階（フェーズ１）、及びこの細胞をホスホジエステラーゼ阻害剤（ＩＢＭＸなど）と接触させる第２段階（フェーズ２）からなる。当業者は、一旦ＧＳＫ３阻害剤と接触させると、幹細胞はある程度分化する（最初は中胚葉仕様の細胞へ、次に造血系の細胞へ分化する）ことを理解するだろう。従って、本明細書に記載の方法の第２段階に委ねられる細胞は、部分的に分化した幹細胞、または分化した細胞ということになる。当業者は、本明細書記載の方法の第２段階の目的は、第１段階で産生された細胞を、造血系を経由して赤血球細胞に分化することにあることを理解するだろう。
本発明によって提供される方法のフェーズ１は、幹細胞（またはそれから形成される胚様体）をＧＳＫ３阻害剤及び１以上の補助的化合物と接触させる工程を含む。補助的化合物は、以下の（i）〜（vii）からなる群から選択される。
（i）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（ii）管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iii）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、
（iv）アクチビンＡ、
（v）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（vi）幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び
（vii）β‐エストラジオール。
フェーズ１は、幹細胞をＧＳＫ３阻害剤及び上記の補助的化合物を１以上添加した培地に接触させる工程を含む。
本発明により提供される方法のフェーズ２は、第１フェーズの方法で産生または発生した細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤及び１以上の補助的化合物と接触させる工程を含む。１以上の補助的化合物は、以下の（i）〜（xvi）からなる群から選択される。
（i）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（ii）管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iii）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（iv）幹細胞因子（ＳＣＦ）、
（v）β‐エストラジオール、
（vi）インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、
（vii）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
（viii）ヘパリン、
（ix）ヒドロコルチゾン、
（x）Ｆｌｔ３リガンド、
（xi）インターロイキン３（ＩＬ３）、
（xii）ＩＬ１１、
（xii）エリスロポエチン（ＥＰＯ）、
（xiv）インスリン成長因子１（ＩＧＦ１）、
（xv）StemRegenin１（ＳＲ１）、及び
（xvi）プルリポチン（ＳＣ１）。
フェーズ２は、ホスホジエステラーゼ阻害剤及び上記の補助的化合物を１以上添加した培地に幹細胞を接触させる工程を含む。
フェーズ２の後半では、幹細胞またはそれから分化した細胞をＥＰＯのみを添加した培地に接触させる方法を利用する。
本明細書記載の方法のフェーズ１は、第１サブフェーズ（以下、“サブフェーズ１ａ”という。）を含む。サブフェーズ１ａは、幹細胞（または胚様体）を以下の（i）〜（v）からなる群から選択される１以上の化合物と接触させる工程を含む。
（i）ＧＳＫ３阻害剤、
（ii）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（iii）管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iv）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、及び
（v）アクチビンＡ。
本明細書記載の方法のフェーズ１は、さらにサブフェーズ１ａの後に実行される第２のサブフェーズ（以下、“サブフェーズ１ｂ”という。）を含む。サブフェーズ１ｂは、幹細胞（または胚様体）を以下の（i）〜（viii）からなる群から選択される１以上の化合物と接触させる工程を含む。
（i）ＧＳＫ３阻害剤、
（ii）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（iii）内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iv）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、
（v）アクチビンＡ、
（vi）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（vii）幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び
（viii）β‐エストラジオール。
必要に応じて、本明細書記載の方法のフェーズ２を実行する前に、フェーズ１（特にサブフェーズ１ａと１ｂ）により提供または産生された細胞または胚様体に、解離プロトコルを行う。例えば、フェーズ１により提供または産生された細胞または胚様体を機械的または化学的に解離し、例えば遠心分離などで採取する。採取した細胞（再懸濁後）にフェーズ２を行う。採取した細胞は、例えばStemline IIなどの適切な培地に再懸濁させる。さらに、フェーズ２の実行前に１ウェル当たり約２００×１０個の細胞をプレートアウト（plate out）する。
本明細書記載の方法のフェーズ２は、第１サブフェーズを含む（以下、“サブフェーズ２ａ”という。）。サブフェーズ２ａは、フェーズ１（特にサブフェーズ１ａと１ｂ）により提供または産生された細胞または胚様体を解離し採取のプロトコルを行ったものを、以下の（i）〜（ix）からなる群から選択される１以上の化合物と接触させる工程を含む。
（i）ＢＭＰ４、
（ii）ＶＥＧＦ、
（iii）ＦＧＦα、
（iv）ＳＣＦ、
（v）インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、
（vi）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
（vii）ヘパリン、
（viii）ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ＩＢＭＸ）、及び
（ix）β‐エストラジオール。
フェーズ２は、さらに第２のサブフェーズ（以下、“サブフェーズ２ｂ”という。）を含む。サブフェーズ２ｂはサブフェーズ２ａの方法の繰り返しであり、換言すると、サブフェーズ２ｂは上記（i）〜（ix）に挙げた１以上の化合物と、サブフェーズ２ａの細胞を接触させる工程を含む。必要に応じて、サブフェーズ２ｂで使用するサイトカイン類（化合物は上記（i）〜（ix）に挙げた。）は、StemRegenin１（ＳＲＩ）とともに添加できる。本発明者らは、特にプロトコルの後半の段階で、サブフェーズ２ｂの期間（５日目）に、ＳＲ１を任意に添加すると細胞の増幅率が高まることを発見した。さらに、本発明者らはStemRegenin１（ＳＲＩ）を利用する方法で培養した細胞は、より“頑丈”で溶解しにくいことを認めた。
本明細書記載の方法のフェーズ２は、さらに第３のサブフェーズ（以下、“サブフェーズ２ｃ”という。）を含む。サブフェーズ２ｃは、サブフェーズ２ａ及び／または２ｂの方法を繰り返す。必要に応じて、サブフェーズ２ｃを実行する前に、まずサブフェーズ２ｂで産生された細胞を遠心分離などにより採取する。さらに、サブフェーズ２ｂ後の細胞の合計数が５００×１０3を超える場合には、サブフェーズ２ｃを実行する前に細胞を分割する。さらに、サブフェーズ２ｃにおいては総細胞数を１×１０6／ｍｌ以下に保持する。
本明細書記載の方法のフェーズ２は、さらに第４のサブフェーズ（以下、“サブフェーズ２ｄ”という。）を含む。サブフェーズ２ｄは、サブフェーズ２ａの方法を繰り返す。サブフェーズ２ｄは、サブフェーズ２ｃで提供または産生された細胞を以下の（i）〜（ix）からなる群から選択される１以上の化合物と接触させる工程からなる。
（i）ＢＭＰ４、
（ii）ＶＥＧＦ、
（iii）ＦＧＦα、
（iv）ＳＣＦ、
（v）インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、
（vi）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
（vii）ヘパリン、
（viii）ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ＩＢＭＸ）、及び
（ix）β−エストラジオール
サブフェーズ２ｄで使用される１以上の化合物の濃度は、サブフェーズ２ａで使用した濃度の半分である。
本明細書記載の方法のフェーズ２は、第５のサブフェーズ（以下、“サブフェーズ２ｅ”という。）を含む。サブフェーズ２ｅは、サブフェーズ２ｄで産生または提供された細胞を以下の（i）〜（viii）からなる群から選択される１以上の化合物と接触させる工程を含む。
（i）ヒドロコルチゾン、
（ii）ＳＣＦ、
（iii）Ｆｌｔ３リガンド、
（iv）ＢＭＰ４、
（v）インターロイキン３（ＩＬ３）、
（vi）ＩＬ１１、
（vii）ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えば、ＩＢＭＸ）、及び
（viii）エリスロポエチン（ＥＰＯ）。
必要に応じて、サブフェーズ２ｅは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０回繰り返す。サブフェーズ２ｅの繰り返し間隔は１、２または３日間である。好ましくは、サブフェーズ２ｅは略２日間隔で３乃至５回繰り返す。
サブフェーズ２ｅの期間に、さらに付加的に、細胞をプルリポチン（ＳＣ１）と接触させる。例えば、略１４日目と略１６日目に、細胞をプルリポチン（ＳＣ１）と接触させる。この場合も、本発明者らはサブフェーズ２ｅの期間に（例えば、ほぼ１４日目乃至１６日目に）、本発明のプロトコルの後半段階でプルリポチン（ＳＣ１）を任意に添加することにより細胞の増幅率が高まることを発見した。さらに、本発明者らはプルリポチン（ＳＣ１）を利用して培養した細胞は、より“頑丈”で溶解しにくいことを認めた。
本明細書記載の方法のフェーズ２は、第６のサブフェーズ（以下、“サブフェーズ２ｆ”という。）を含む。サブフェーズ２ｆは、サブフェーズ２ｅで産生または提供された細胞を以下の（i）〜（vi）からなる群から選択される１以上の化合物と接触させる工程を含む。
（i）ヒドロコルチゾン、
（ii）ＳＣＦ、
（iii）インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、
（iv）ＩＬ３、
（v）ＩＬ１１、及び
（vi）ＥＰＯ。
サブフェーズ２ｆを実行する前に、サブフェーズ２ｅで提供または産生された細胞をＩＢＩＴ培地に移す。当業者には、ＩＢＩＴ培地は、例えば、安定グルタミン、アルブミン（ヒト及び／またはウシ（胎児）血清アルブミンなど）、インスリン、トランスフェリン及び異種由来成分を含まない（xeno−free）の脂質混合溶液を添加した不完全イスコフ培地からなることが明らかであろう。サブフェーズ２ｆは、上記（i）〜（vi）に挙げたサイトカイン類を添加したＩＢＩＴ培地を用いるステム（stem）を含む。必要に応じて、サブフェーズ２ｆを実行する前にサブフェーズ２ｅで提供または産生された細胞を（できれば遠心分離で）採取し、ＩＢＩＴ培地３ｍｌ当たり約５００×１０3〜１×１０6の密度にプレートアウトする。
サブフェーズ２ｆは１、２、３または４回繰り返す。また、サブフェーズ２ｆが繰り返される毎に、新鮮なＩＢＩＴ培地と化合物を使用する。
本明細書記載の方法のフェーズ２は、第７のサブフェーズ（以下、“サブフェーズ２ｇ”という。）を含む。サブフェーズ２ｇは、サブフェーズ２ｆで産生または発生した細胞を（おそらく、遠心分離で）採取する工程を含む。サブフェーズ２ｇはＥＰＯを添加したＩＢＩＴ培地で、サブフェーズ２ｆで生成または産生された（所望により採取した）細胞をさらに保持する工程を含む。サブフェーズ２ｆで産生または生成され、所望により採取した細胞はＥＰＯを添加したＩＢＩＴで略１、１．５、２、２．５または３日間保持する。サブフェーズ２ｇは、ＥＰＯを添加しＩＢＩＴで細胞を保持した後、さらにＩＢＩＴのみで細胞を保持する。細胞は、略３、４、４．５、５、５．５、６、７、８、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３または１４日間、ＩＢＩＴ培地で保持される。
本発明は、本明細書に記載したフェーズ１を実行し、次に本明細書に記載したフェーズ２を実行することを含み、前記フェーズ１はサブフェーズ１ａと１ｂからなり、フェーズ２はサブフェーズ２ａ〜２ｇからなる、幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法を提供する。
本発明は、以下の（ａ）〜（ｉ）の工程からなり、２ｇの生成物が赤血球系細胞である（ことを特徴とする）、幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法を提供する。
（ａ）幹細胞を保持し胚様体の形成を誘導する
（ｂ）胚様体にサブフェーズ１ａを行う；
（ｃ）サブフェーズ１ａの生成物にサブフェーズ１ｂを行う；
（ｄ）サブフェーズ１ｂの生成物にサブフェーズ２ａを行う；
（ｅ）サブフェーズ２ａの生成物にサブフェーズ２ｂを行う；
（ｆ）サブフェーズ２ｂの生成物にサブフェーズ２ｃを行う；
（ｇ）サブフェーズ２ｃの生成物にサブフェーズ２ｄを行う；
（ｈ）サブフェーズ２ｅの生成物にサブフェーズ２ｆを行う；及び
（ｉ）サブフェーズ２ｆの生成物にサブフェーズ２ｇを行う；
本発明により提供される方法は、数日間かけて実行される。サブフェーズ１ａは、本明細書に記載する方法の最初の工程であり、従って、サブフェーズ１ａは０日目に実行される。サブフェーズ１ａは略１、２または３日間続けられる。サブフェーズ１ａは略２日間続けられる。
サブフェーズ１ｂは略０．５、１または２日間続けられる。サブフェーズ１ｂは略１日間続けられる。
サブフェーズ２ａは略１、２または３日間続けられる。サブフェーズ２ａは略２日間続けられる。
サブフェーズ２ｂは略１、２または３日間続けられる。サブフェーズ２ｂは略２日間続けられる。
サブフェーズ２ｃは略１、２または３日間続けられる。サブフェーズ２ｃは略２日間続けられる。
サブフェーズ２ｄは略０．５、１、１．５または２日間続けられる。サブフェーズ２ｄは略１日間続けられる。
サブフェーズ２ｅは略４、５、６、６．５、７、７．５、 ８、９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１３または１４日間続けられる。サブフェーズ２ｅは略７日間または略１１日間続けられる。
サブフェーズ２ｆは略５、６、６．５、７、７．５または８日間続けられる。サブフェーズ２ｆは略７日間続けられる。
サブフェーズ２ｇは略３、４、５、６、６．５、７、７．５、８、９、１０、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日間または２１日間続けられる。サブフェーズ２ｇは略７日間乃至略１２日間続けられる。
先に述べたように、サブフェーズ１ａは、本明細書に記載する方法の最初の工程を表し、サブフェーズ１ａは０日目に実行され、サブフェーズ１ｂは略２日目に実行される。サブフェーズ２ａは略３日目に実行され、サブフェーズ２ｂは略５日目に実行される。サブフェーズ２ｃは７日目に実行され、サブフェーズ２ｄは略９日目に実行される。サブフェーズ２ｅは略１０日目に実行され、サブフェーズ２ｆは略１７日目乃至略２１日目に実行される。サブフェーズ２ｇは略２４日目乃至略２８日目に実行される。
本発明で用いるＧＳＫ３阻害剤は、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、１、１．５、２、２．５、３、４または５μΜの最終濃度で使用する。例えばInhibitorVIIIは、本明細書記載の方法のサブフェーズ１ａ及び１ｂの両方で、約２μΜの最終濃度で使用する。ＣＨＩＲ９９０２１は、上述の方法のサブフェーズ１ａ及び１ｂで約０．２μΜの最終濃度で使用する。
骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）は、約１、５、１０、１５、２０または２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。例えば、サブフェーズ１ａにおいて、ＢＭＰ４は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ１ａにおいて、ＢＭＰ４は約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ１ｂ及び２ａ、２ｂ及び２ｃにおいて、ＢＭＰ４は約１５、１７．５、２０、２２．５または２５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ１ｂ、２ａ、２ｂ及び２ｃにおいて、ＢＭＰ４は約２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ＢＭＰ４は約５、７、１０、１２または１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ＢＭＰ４は約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｅにおいて、ＢＭＰ４は約６、６．２、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、７または７．５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｅにおいて、ＢＭＰ４は約６．７ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＶＥＧＦは、約５、１０、１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０または３５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ１ａ及び１ｂにおいて、ＶＥＧＦは約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用し、サブフェーズ２ａにおいて、ＶＥＧＦは約３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ＶＥＧＦは約１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａは、約５、７．５、１０、１２．５または１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ１ａ及び１ｂにおいて、Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａは約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
アクチビンＡは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ１ａ及び１ｂにおいて、アクチビンＡは約５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＦＧＦαは約５、７．５、１０、１２．５または１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ１ｂ、２ａ、２ｂ及び２ｃにおいて、ＦＧＦαは約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ＦＧＦαは約５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＳＣＦは約１０、１４．５、１５、１５．５、１９．５、２０、２０．５、２５、２９．５、３０及び３０．５ｎｇ／ｍｌでの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ａ、２ｂ及び２ｃにおいて、ＳＣＦは約３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ＳＣＦは約１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｆにおいて、ＳＣＦは約２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＩＧＦ２は約１、２、３、４、４．５、５、５．５、７．５、１０、１２．５または１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ａ、２ｂ及び２ｃにおいて、ＩＧＦ２は約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ＩＧＦ２は約５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＴＰＯは約１、２、３、４、４．５、５、５．５、７．５、１０、１２．５または１５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ａ、２ｂ及び２ｃにおいて、ＴＰＯは約１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ＴＰＯは約５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ヘパリンは約１、１．５、２、２．５、３、３．５ 、４、４．５または５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ａ、２ｂ及び２ｃにおいて、ヘパリンは約５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ヘパリンは約２．５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばＩＢＭＸ）は、約１０、２０、２３、２４、２５、２６、２７、３０、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０または１００μΜの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ａ、２ｂ、２ｃ及び２ｅにおいて、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばＩＢＭＸ）は約５０μΜの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばＩＢＭＸ）は約２５μΜの最終濃度で使用する。
β−エストラジオールは、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ１ｂ、２ａ、２ｂ及び２ｃにおいて、β−エストラジオールは約０．４ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｄにおいて、β−エストラジオールは約０．２ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ヒドロコルチゾンは、０．１×１０-6Ｍ、０．２×１０-6Ｍ、０．５×１０-6Ｍ、１×１０-6Ｍ、２×１０-6Ｍ、３×１０-6Ｍ、４×１０-6Ｍ、５×１０-6Ｍ、６×１０-6Ｍ、７×１０-6Ｍ、８×１０-6Ｍ、９×１０-6Ｍあるいは１０×１０-6Ｍの最終濃度で使用する。ヒドロコルチゾンは１×１０-6Ｍの濃度で使用する。
Ｆｌｔ３リガンドは約３０、４０、４５、５０、５５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｅにおいて、Ｆｌｔ３リガンドは約５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＩＬ３は、約６、６．２、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、７または７．５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｅ及び２ｆにおいて、ＩＬ３は約６．７ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＩＬ１１は、約６、６．２、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、７または７．５ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｅ及び２ｆにおいて、ＩＬ１１は約６．７ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＩＧＦ１は、約５、１０、１５、２０、２５または３０／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｆにおいて、ＩＧＦ１は約２０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。
ＥＰＯは、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５または５Ｕ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｆにおいて、ＥＰＯは約２Ｕ／ｍｌの最終濃度で使用する。サブフェーズ２ｇにおいて、ＥＰＯは約４Ｕ／ｍｌの最終濃度で使用する。
StemRegenin１（ＳＲＩ）は、約０．１〜１０μΜの最終濃度で使用する。例えば、サブフェーズ２ｂでは最終濃度０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０μΜを使用する。典型的には、最終濃度約１μΜのStemRegenin（ＳＲＩ）が使用される。
プルリポチン（ＳＣＩ）は、約１００〜１０００ｎＭの最終濃度で使用する。例えば、サブフェーズ２ｅでは最終濃度１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１０００ｎＭを使用する。典型的には、最終濃度約２５０ｎＭまたは約５００ｎＭのプルリポチン（ＳＣＩ）が使用される。例えば、サブフェーズ２ｅの略１４日目で、約５００ｎＭのプルリポチン（ＳＣＩ）を添加し。略１６日目で約２５０ｎＭのプルリポチンを添加する。
上記の多様な補助的化合物の濃度と量は、培地中の各化合物の最終濃度／量である。本明細書記載の方法で使用する培地の適切な形態について以下により詳しく説明するが、上記で述べたサブフェーズ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ、及び２ｅのうちいずれも、幹細胞の保持及び／または増殖／分化に適したあらゆる基本培地を利用できる。例えば、これらのサブフェーズは、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）またはダルベッコ改変イーグル培地をベースにした培地量を利用できる。このタイプの培地は、例えば、以下の（i）〜（vii）からなる群から選択される１以上を含む：
（i）Stemline（登録商標）I＆II（シグマ・アドリッチ社製）、
（ii）Stemspan（登録商標）（ステムセル・テクノロジーズ社製）、
（iii）Ｘ−ｖｉｖｏ １０、１５または２０（バイオウィッタカー／ロンザ社製）、
（iv）StemPro（登録商標）３４（ライフ・テクノロジーズ社製）、
（v）Poietics ＨＰＧＭ （ロンザ社製）、
（vi）ＡＰＥＬ（ステムセル・テクノロジーズ社製）、
（vii）ＩＭＤＭまたはＤＭＥＭ＋因子（ＢＩＴと同類の因子）をベースにした他のオーダーメードまたはホームメードの培地。
本明細書に記載した補助的化合物の最終濃度及び量は、基本培地に添加した補助的化合物の最終濃度及び量である。
本発明は、さらに本明細書記載の方法と第２の態様において使用する培地を提供し、本発明は幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導する培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地であって、ＧＳＫ３阻害剤及び／またはホスホジエステラーゼ阻害剤、及び以下の（i）〜（xvi）からなる群から選択される１以上の補助的化合物を含む培地を提供する。
（i）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（ii）管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iii）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、
（iv）アクチビンＡ、
（v）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（vi）幹細胞因子（ＳＣＦ）、
（vii）β−エストラジオール、
（vi）インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、
（vii）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
（viii）ヘパリン、
（ix）ヒドロコルチゾン、
（x）Ｆｌｔ３リガンド、
（xi）インターロイキン３（ＩＬ３）、
（xii）ＩＬ１１、
（xii）エリスロポエチン（ＥＰＯ）、
（xiv）インスリン成長因子１（ＩＧＦ１）、
（xv）StemRegenin１（ＳＲ１）、及び
（xvi）プルリポチン（ＳＣ１）。
本発明により提供される培地は、幹細胞の保持及び／または増殖に適した基本培地を含む。この基本培地は、幹細胞の保持及び／または増殖に適した培地を含む。このタイプの培地は、例えば幹細胞の維持及び／または増殖を容易にする化合物及び分子を含む。基本培地は、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）またはダルベッコ改変イーグル培地をベースにした培地を含む。例として、基本培地は以下の（i）〜（vii）からなる群から選択される１以上を含む。
（i）Stemline（登録商標）I＆II（シグマ・アドリッチ社製）、
（ii）Stemspan（登録商標）（ステムセル・テクノロジーズ社製）、
（iii）Ｘ−ｖｉｖｏ １０、１５または２０（バイオウィッタカー／ロンザ社製）、
（iv）StemPro（登録商標）３４（ライフ・テクノロジーズ社製）、
（v）Poietics ＨＰＧＭ （ロンザ社製）、
（vi）ＡＰＥＬ（ステムセル・テクノロジーズ社製）、
（vii）ＩＭＤＭまたはＤＭＥＭ＋因子）（ＢＩＴと同類の因子）をベースにした他のオーダーメードまたはホームメード培地。
適切な基本培地は血清を含まないものである。
基本培地は、例えばStemline（登録商標）II培地（シグマ・アドリッチ社製）を含む。
本明細書に記載される方法では、ＩＭＤＭまたはＤＭＥＭをベースとしたあらゆる培地が利用できるが、具体例の方法ではStemline（登録商標）IIを含む培地を利用する。このタイプの培地はサブフェーズ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ 及び／または２ｅで使用するのに適している。
サブフェーズ２ｆ及び／または２ｇのように、赤血球前駆細胞の保持または増殖を必要とする方法の場合には、基本培地はＩＢＩＴ培地を含み、ＩＢＩＴ培地自体が安定グルタミン、ウシ血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン及び異種由来成分を含まない（xeno−free）の脂質混合溶液を添加した不完全イスコフ培地を含む。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導するための培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地は、ＧＳＫ３阻害剤及び以下の（i）〜（xiv）からなる群から選択される１以上の化合物を含む。
（i）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（ii）管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iii）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、
（iv）アクチビンＡ、
（v）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（vi）幹細胞因子（ＳＣＦ）、
（vii）β‐エストラジオール、
（vi）インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、
（vii）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
（viii）ヘパリン、
（ix）ヒドロコルチゾン、
（x）Ｆｌｔ３リガンド、
（xi）インターロイキン３（ＩＬ３）、
（xii）ＩＬ１１、
（xii）エリスロポエチン（ＥＰＯ）、及び
（xiv）インスリン成長因子１（ＩＧＦ１）。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導するための培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地は、以下の（i）〜（viii）を含む。
（i）ＧＳＫ３阻害剤、
（ii）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（iii）内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iv）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、
（v）アクチビンＡ、
（vi）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（vii）幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び
（viii）β−エストラジオール。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導する培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地は、以下の（i）〜（v）を含む。
（i）ＧＳＫ３阻害剤、
（ii）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（iii）内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iv）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、及び
（v）アクチビンＡ。
直上に記載の培地は、本明細書記載の方法のサブフェーズ１ａで使用される。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導する培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地は、以下の（i）〜（viii）を含む。
（i）ＧＳＫ３阻害剤、
（ii）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（iii）内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iv）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、
（v）アクチビンＡ、
（vi）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（vii）幹細胞因子（ＳＣＦ）、及び
（viii）β−エストラジオール。
直上に記載の培地は、本明細書記載の方法のサブフェーズ１ｂで使用される。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導する培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地は、以下の（i）〜（xvi）からなる群から選択される１以上の化合物を含む。
（i）ホスホジエステラーゼ阻害剤、
（ii）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（iii）内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iv）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（v）幹細胞因子（ＳＣＦ）、
（vi）インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、
（vii）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
（viii）ヘパリン、
（ix）β−エストラジオール、
（x）ヒドロコルチゾン、
（xi）Ｆｌｔ３リガンド、
（xii）インターロイキン３（ＩＬ３）、
（xiii）ＩＬ１１、
（xiv）エリスロポエチン（ＥＰＯ）、
（xv）StemRegenin１（ＳＲ１）、及び
（xvi）プルリポチン（ＳＣ１）。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導する培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地は、以下の（i）〜（vix）を含む。
（i）ホスホジエステラーゼ阻害剤、
（ii）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（iii）内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iv）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（v）幹細胞因子（ＳＣＦ）、
（vi）インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、
（vii）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
（viii）ヘパリン、及び
（ix）β‐エストラジオール。
直上に記載の培地は、本明細書記載の方法のサブフェーズ２ａ、２ｂ、２ｃ及び２ｄで使用される。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導するための培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用するための培地は、以下の（i）〜（ix）を含む。
（i）ホスホジエステラーゼ阻害剤、
（ii）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（iii）ヒドロコルチゾン、
（iv）Ｆｌｔ３リガンド、
（v）インターロイキン３（ＩＬ３）、
（vi）ＩＬ１１、
（vii）エリスロポエチン（ＥＰＯ）、
（viii）β−エストラジオール、
（ix）StemRegenin１（ＳＲ１）、及び
（ix）プルリポチン（ＳＣ１）。
直上に記載の培地は、本明細書記載の方法のサブフェーズ２ｅで使用される。
上記の培地で、本明細書記載の方法のサブフェーズ１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、２ｃ、２ｄ及び２ｅに適する培地は、さらにStemlineIIを含む。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導する培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地は、以下の（i）〜（vii）を含む。
（i）幹細胞因子（ＳＣＦ）、
（ii）ヒドロコルチゾン、
（iii）インターロイキン３（ＩＬ３）、
（iv）ＩＬ１１、
（v）エリスロポエチン（ＥＰＯ）、及び
（vi）インスリン成長因子１（ＩＧＦ１）。
直上に記載の培地は、本明細書記載の方法のサブフェーズ２ｆで使用される。
幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導する培地、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する培地は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を含む。
直上に記載の培地は、本明細書記載の方法のサブフェーズ２ｇで使用される。
サブフェーズ２ｆ、２ｇに適した培地（上記の培地など）は、さらに上記で明確にしたＩＢＩＴ培地を含む。
上記の多様な補助的化合物の正確な濃度及び量は用途により変化するが、一般に本発明により提供される培地は、補助的化合物を本明細書に記載の方法で必要な濃度及び量と実質的に同じか同程度の濃度及び量で含む。種々の補助的化合物の適切な濃度及び量については、上記で詳細に説明した（方法及びサブフェーズを説明したセクション参照）。
第３の態様において、本発明は幹細胞の赤血球系細胞への分化を誘導するため使用する、及び／または幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法で使用する、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群から選択される１以上の要素（component）を含むキットを提供する。
（ａ）本明細書に記載の１以上の培地；
（ｂ）以下の（i）〜（xviii）からなる群から選択される１以上の化合物：
（i）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、
（ii）管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、
（iii）Ｗｎｔ３Ａ及び／またはＷｎｔ５ａ、
（iv）アクチビンＡ、
（v）線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、
（vi）幹細胞因子（ＳＣＦ）、
（vii）β−エストラジオール、
（viii）インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、
（ix）トロンボポエチン（ＴＰＯ）、
（x）ヘパリン、
（xi）ヒドロコルチゾン、
（xii）Ｆｌｔ３リガンド、
（xiii）インターロイキン３（ＩＬ３）、
（xiv）ＩＬ１１、
（xv）エリスロポエチン（ＥＰＯ）、
（xvi）インスリン成長因子１（ＩＧＦ１）、
（xvii）StemRegenin１（ＳＲ１）、及び
（xviii）プルリポチン（ＳＣ１）；
（ｃ） 幹細胞、胚様体及び／または胚細胞の培養及び／または保持のための、オプションで用いる無菌容器；
（ｄ）培地にサプリメントを添加するツール及び／または道具（ピペット及び／またはシリンジなど）；及び
（ｅ）使用説明書。
第４の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法により製造され、また得られる赤血球細胞を提供する。
第５の態様において、本発明は上記で説明し、また以下に詳細な説明と図面を示す方法と培地を提供する。
［詳細な説明］
以下に図面を参照しながら本発明を詳細に説明する。
図１は接着培養（ｄ３〜１０）が、増殖と分化に必要でないことを示す。.柱状グラフ（histgram）は、正常組織培養処理された表面上または超低密着面上で、inhibitorVIIIの存在下、ｈＥＳＣ株Ｈ１において培養された赤血球分化培地の３〜１０日目の総増幅数（total fold）を示す。 図２は、ｄ１０でのＧＳＫ阻害剤の表現型における効果を示す、赤血球培地の１０日目におけるｈＰＳＣ分化のフローサイトメトリー分析図である。検査した全細胞は、全血球増殖性（panhematopoietic）ＣＤ４３抗原に対して高い陽性を示している。ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４１及びＣＤ２３５ａの存在は、分析した細胞が血管芽腫（hemangioblastic）の段階か、血管芽腫（hemangioblastic）後間もない段階のどちらかであることを示している。Ｈ１とｉＰＳＣの間に観察される差異は、これら細胞株への分化固有（differentiation intrinsic）の分化反応速度（differential kinetics）を反映している。
ｄ２４で９０％を超えるＣＤ２３５ａ（ＧｌｙＡ＋）赤血球系細胞に関し、赤血球培養条件下、２８日目で分化したｈＰＳＣのフローサイトメトリー分析を示す。分析した細胞の８０％を超えるものにトランスフェリン受容体が存在（ＣＤ７１）するがこれは細胞がまだ増殖段階にあることを示し、ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＣＤ４１の消滅中（データは表示していない）、細胞の９５％以上にグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）が存在するという分析結果は、細胞の赤血球特性の良好な指標である。 ｄ２４で９０％を超えるＣＤ２３５ａ（ＧｌｙＡ＋）赤血球系細胞に関し、２８日目における、赤血球細胞に分化したｈｉＰＳＣのサイトスピン調合液（preparation）を短時間でロマノフスキー染色した写真であり、細胞は主として整染性正赤芽球である。 ＧＦとＧＳＫ阻害剤を添加剤として用いた系で、アクチビンＡの非存在下または存在下での、ｉＰＳ株の赤血球分化培養中のフォールドの累積増幅数を示すグラフである。
図５（図５Ａ及び図５Ｂ）は、inhibitorVIIIが複数の株で細胞数を増加させることを示す。図５Ａの柱状グラフは、inhibitorVIIIの非存在下または存在下で、ｈＥＳＣ株のＲＣ９及びＨ１の赤血球分化培養物における総増幅数（total fold amplification）を示す。 図５Ｂの柱状グラフは、inhibitorVIIIの非存在下または存在下（共にＩＢＭＸを含む条件で）、ｉＰＳ株の赤血球分化培養物における総増幅数（total fold amplification）を示す。 ＩＢＭＸはさらに増殖を増進させる。図６Ａの柱状グラフは、小分子が存在しない状態か、またはサトカインミックスＡ中で７日間の標準的オプションを使用し、ＧＳＫ３阻害剤とＩＢＭＸの組み合せが存在する状態での、Ｈ１（ｈＥＳＣ）またはｈｉＰＳＣの赤血球分化培養における経時的な累積増幅数を示す。 図６Ｂの柱状グラフは、小分子が存在しない状態か、またはサトカインミックスＡ中で１１日間の長期間のオプションを使用し、ＧＳＫ３阻害剤とＩＢＭＸの組み合せが存在する状態での、Ｈ１（ｈＥＳＣ）またはｈｉＰＳＣの赤血球分化培養における経時的な累積増幅数を示す。
inhibitorVIII＋ＩＢＭＸはｉＰＳＣのキー（key）分子マーカーを増やす。図７の柱状グラフは、赤血球生成に関わる一連の遺伝子のｍＲＮＡ発現を示す。赤血球培養の０、１０、１７及び２４日目に、ＲＴｑＰＣＲ（リアルタイム定量ＰＣＲ）によるｈＰＳＣ ＋／− inhibitorVIIIのみの分化、またはinhibitorVIII＋ＩＢＭＸの分化の発現が測定された。 図８（図８Ａ〜図８Ｄ）は、分化したｈＰＳＣにより発生したグロビンのＨＰＬＣ分析を示すパネルである。グロビンは、ほぼ例外なく胎児性（fetal）であり胚性（embryonic）ではない。 図８Ａは胚性及び胎児性グロビンの混合発現を示すパネル１であり、本パネルでは、ヘモグロビンＧｏｗｅｒ１（ζ２ε２鎖）の消滅は顕著ではない。 ｉＰＳＣから誘導された赤血球系細胞のグロビンの発現を示すパネル２であり、ヘモグロビンＧｏｗｅｒ１（ζ２ε２鎖）の消滅はパネル１（図８Ａ）に比較して顕著である。 Ｈ１ ｈＥＳＣから誘導された赤血球系細胞のグロビンの発現を示すパネル３であり、ヘモグロビンＧｏｗｅｒ１（ζ２ε２鎖）の消滅はパネル１（図８Ａ）に比較して顕著である。 胎児肝臓（成体）幹細胞（対照細胞）から誘導された赤血球系細胞のグロビンの発現を示すパネル３であり、ｈＰＳＣから誘導された細胞から得られたもの（図８Ａ〜８Ｃ）と同様のＨＰＬＣプロフィ−ルを示す。 図８Ａ〜８Ｄのグロビンζ鎖で観察された差異は、いくつかの残留ヘモグロビンPortland（ζ２γ２鎖）によるものである可能性がある。
Ｗｎｔ３ＡとＷｎｔ５ａの細胞数の経日変化を示すグラフである。 分化中のｉＰＳＣの増幅に対するＳＣＩ＋ ＳＲＩの影響を示すグラフである。 分化中のｈＥＳＣの増幅に対するＳＣＩ＋ ＳＲＩの影響を示すグラフである。 ＳＲ１＋ＳＣ１の有無による、培養後３０日目の細胞を比較した顕微鏡写真である。
［方法］
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、Cellstart（ライフ・テクノロジーズ社製）のStempro培地（ライフ・テクノロジーズ社製）中で未分化の状態で保持され、ＥＺパッセージ（EZpassage）ツール（ライフ・テクノロジーズ社製）を用い、それら細胞の状態に応じて略７日毎に継代する。
分化のため、密集した（confluent）ｈＰＳＣをEZpassageツール（ライフ・テクノロジーズ社製）で正方形に切断し、胚様体（ＥＢ）を形成できるようにStemlineII（シグマ・アドリッチ社製）３ｍｌ／ウェルの超低接着６ウェルプレート（コーニング社製）上に５００×１０3／ウェルでプレートする。
０日目で、分化を誘導するために、以下のサイトカインを添加する：骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）（１０ｎｇ／ｍｌ）、管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３Ａ（及び／またはＷｎｔ５ａ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（５ｎｇ／ｍｌ）、及びinhibitorVIII（２μＭ）。ＧＳＫ３ inhibitorVIIIは、メルク製品（３６１５４９）の名称であり、これはＡＲ−Ａ０１４４１８ またはＮ−（４−メトキシベンジル）−Ｎ’−（５−ニトロ−１，３−チアゾ−ル−２−イル）尿素とも呼ばれる。
分化の２日目（４８時間後のＥＢ）で、新たな１セットのサイトカインをStemlineII［ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３Ａ（及び／またはＷｎｔ５ａ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、アクチビンＡ（５ｎｇ／ｍｌ）、inhibitorVIII（２μΜ）、線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）（１０ｎｇ／ｍｌ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）（２０ｎｇ／ｍｌ）及びβ−エストラジオール（０．４ｎｇ／ｍｌ）］の０．５ｍｌ／ウェル中に添加する；
注：サイトカイン濃度が、常に新たに添加されたサイトカインの最終濃度であるとして、例えば細胞を培養するときには完全に培地を交換するよりは、サイトカイン（６×cytokines）を０．５ｍｌ添加して、すでにウェルにある２．５ｍｌと合わせて総容量が３ｍｌ（１×cytokines）となるようする。
分化の３日目で、ＥＢをＰＢＳ中で洗浄し、３７℃で１０分間、１ｍｌ／ウェルのTrypleSelect（１０×）を用いて解離する。１０ｍｌのＰＢＳを添加した後、細胞を１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄みを傾斜で除去し、細胞を３ｍｌの新鮮なStemlineIIで再懸濁し、以下のサイトカイン［ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＣＦ（３０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）（１０ｎｇ／ｍｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヘパリン（５ｕｇ／ｍｌ）、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）５０μΜ、及びβ−エストラジオール（０．４ｎｇ／ｍｌ）］と共に通常の６ウェル組織培養プレートにて、２００×１０3／ウェルで再プレートする。
分化の５日目で、３日目と同じ新鮮な１セットのサイトカインを、StemlineII０．５ｍｌ／ウェルに添加し、新鮮なサイトカインの最終濃度を３日目と同じ濃度にする。
分化の７日目で、細胞を採取し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、３日目と同じ1セットのサイトカインを添加した新鮮なStemlineII培地で再懸濁する。細胞数が５００×１０3を超える場合は、培地の急激な枯渇やｐＨの大幅な上昇などで分化効率に悪影響を及ぼすため、培養液を分割することが望ましい。
分化の７日目から１０日目で、細胞密度を綿密に監視し、必要に応じて補助剤を添加した媒体を添加し、また分割して複数のウェルとして、細胞数を１０6／ｍｌ未満に維持する。
分化の９日目で、３日目のサイトカインの半分の量を、StemlineIIを０．５ｍｌ／ウェル添加し、新鮮なサイトカインの最終濃度が３日目の半分の濃度となるようにする。
分化の１０日目で、細胞を１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、その後、赤血球液体培養条件で再プレートする。すなわち、サイトカイン［ヒドロコルチゾン１０-6Ｍ、ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３−リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）（１６．７ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ４（６．７ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン３（ＩＬ３）（６．７ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１１（６．７ｎｇ／ｍｌ）、ＩＢＭＸ（５０μΜ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）１．３Ｕ／ｍｌ］を添加したStemlineII３ｍｌ／ウェルに、細胞を１００×１０3の密度でプレートする。
１０日目から１７日目（短いプロトコル）または２１日目（延長されたＡフェーズプロトコル）では、上記のサイトカインは２日毎に更新され、０．５ｍｌ のStemlineIIに添加し、新鮮なサイトカインの最終濃度を１０日目で定めたようにする。
分化の１７日目（短いプロトコル）または２１日目（延長されたＡフェーズプロトコル）で、細胞を１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、その後、ＩＢＩＴ培地３ｍｌ／ウェルに５００×１０3〜１×１０6細胞／ウェルの密度で再プレートする。前記のＩＢＩＴ培地は、安定グルタミンを含む不完全イスコフ培地（バイオクロムＡＧ）、１％ウシ血清アルブミン（ライフ・Lechnologies社製またはシグマ社製）、１０ｕｇ／ｍｌのインスリン、２００ｕｇ／ｍｌのトランスフェリン（共にシグマ社製）と異種由来成分を含まない（xeno−free）脂質混合溶液２００×（ペプロテック社製）で構成され、以下のサイトカイン：ヒドロコルチゾン１０-6Ｍ、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン成長因子１（ＩＧＦ１）（２０ｎｇ／ｍｌ）、インターロイキン３（ＩＬ３）（６．７ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１１（６．７ｎｇ／ｍｌ）、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）２Ｕ／ｍｌが添加されている。
１７乃至２１日目から２４乃至２８日目では、上記のサイトカイン類の全投与量は２日毎に更新し、０．５ｍｌのStemlineIIに新鮮なサイトカインの最終濃度が１７乃至２１日目と同濃度になるように添加する。
分化の２４日目または２８日目では、細胞を１２００ｒｐｍで３分間遠心分離し、その後、ＥＰＯを４Ｕ／ｍｌ添加した新鮮なＩＢＩＴ培地に５００〜１０００×１０3の密度で２日間、次にＩＢＩＴ培地のみに５〜１０日間再プレートとする。培養培地は２日毎に新鮮なＩＢＩＴ培地を加えてリフレッシュされる。
［分析と評価］
１０日目、１７乃至２１日目、及び２４乃至２８日目では、細胞の造血及び赤血球特性を評価するため、細胞をフローサイトメトリーで分析した。ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ７１及びＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡとして知られる）（ＢＤバイオサイエンス社製及びｅバイオサイエンス社製）に対する抗体を使用し、細胞をＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ｅバイオサイエンス社製）で分析した。
１７日目以降、細胞の赤血球段階を、サイトスピン調合液（preparation）のラピッドロマノフスキー（Rapid Romanovski）染色後の形態評価で決定した。
０、１０、１７及び２４日目で、分化する細胞における目的遺伝子の発現をｑＲＴ−ＰＣＲ （タクマン（Taqman））でモニターした。
ｈＰＳＣの分化の程度を評価するために、遺伝子パネルは赤血球形成の種々の段階で発現することが知られている遺伝子を含むよう選択される。
２４、２８日目またはそれ以降は、初期段階から造血段階への切り替わる段階を評価するため、グロビンタンパク質の発現プロファイルを高圧液体クロマトグラフィーによって分析した。
［結果］
本明細書に記載したｈＰＳＣからのＲＢＣ（Red Blood Cell）の産生は、生体内赤血球の発育の模倣を目的とする連続的分化プロセスであり、生体内で誘導されるＲＢＣの生物学的機能に類似し、また一致する最終製品を得るためのものである。
最初に、ｈＰＳＣはＥＢの形成を促進し、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｗｎｔ３Ａ（Ｗｎｔ５ａ）及びアクチビンＡのバランスよい混合を通して、中胚葉（mesodermal germ layer）仕様へと向かう。変換効率を最適化するサイトカインの最良の組み合せを決定するために用量試験を行った。第２に、ＥＢ段階の２日目に、ＢＭＰ４及びＶＥＧＦの増加とＳＣＦ、ＦＧＦα及びβ−エストラジオールの添加により、造血系細胞が分化の刺激を受ける。
ＥＢを解離した後、中胚葉系統でなく造血幹細胞（ＨＳＣ）の発生と増殖のために設計されたサイトカイン混合物の３日目の添加を通して、細胞はさらに造血分化へと向かう。この段階で、解離したＥＢが培養表面に付着するが、この付着性は超低密着面培養プラスチック（細胞接着をサポートしない）を使用することで抑制される場合は細胞数に悪影響を与えず（図１）、従ってこの方法は懸濁培養によって完全に実行することができる。
ＨＳＣはＣＤ３４抗原の発現によって部分的に特徴づけられ、図２に示すようにＣＤ３４＋細胞の最大値は通常７〜１０日目の間に到達し、ＣＤ３４がｉＰＳＣまたはｈＥＳＣから誘導された細胞の３０〜８０％で検出できる。
さらに、造血性の同定は、ＣＤ４３抗体の分析によって確認でき（Vodyanik MA, Thomson JA, Slukvin II, Blood, 2006 15;108(6):2095-105）、図２に示すように１０日目のフローサイトメトリー分析で、細胞の５０〜１００％がこの重要なマーカーを発現することを示している。ｄ１０の細胞で検出された抗原のパネル及び特にＣＤ３１、ＣＤ４１ａ、ＣＤ４３及びＣＤ２３５ａが同時に存在することから、細胞の大部分は血管芽腫の（hemangioｂlastic）段階または血管芽腫後（post hemangioｂlastic）の段階であると思われる（図２）（Salvagiotto G et al, Exp Hematol．2008 36(10):1377-89）。これらの細胞は、ｄ１０でのＣＦＵ分析において、全ての骨髄性系統を含むコロニーをも形成することができる。
１７日目または２１日目の抗原発現プロファイル、及び短時間でのロマノフスキー染色では、ほとんどの細胞は前または好塩基性正(常)赤芽球であり、大多数の細胞が明らかに赤血球であることを示す。この段階で、StemlineIIは赤芽球の成熟をサポートしていないため、基礎培地をＩＢＩＴに切り替える。対応するサイトカイン混合物は、赤血球マーカーの最も高いレベルを示す細胞を産生するように精製した。
２４日目または２８日目では、ＣＤ２３５ａの発現のフローサイトメトリー分析が示すように（図３）、細胞の９５〜１００％が赤血球である。ｄ２４またはｄ２８の細胞のサイトスピンは、赤芽球の好塩基性、多染性及び正染性（orthochromic）サブクラス間で可変分布を示すが、これはテストした分化条件及び使用したｈＰＳＣの複製起点（origin）によるものである（図３Ａ及びＢ）。この点から、本方法に記載した培養条件下に置くと、自然発生的な除核を受けた細胞がわずかにあるものの、分化する細胞はほぼ均一な正染性正赤芽球の個体群へと進化する。
高価な組み換えタンパク質成長因子の使用を減らすために、本発明者らは、組み換えＷｎｔ３Ａを小分子のグリコーゲン合成酵素３β（ＧＳＫ３）阻害剤に置換できるか否かを調べた。これら薬剤は、ＧＳＫ３によってβカテニンのリン酸化を防止して活性βカテニンの放出と蓄積が可能であり、Ｗｎｔ情報伝達を持続的に模倣する能力があるので組み換えＷｎｔ３Ａの代替となり得るものと考えた。
分化プロトコルの０〜３日目の間、inhibitorVIII（Ａ−Ａ０１４４１８）またはＣＨＩＲ９９０２１（特異性がより低い阻害剤のＢｉＯではない）などのＧＳＫ３阻害剤の添加で、Ｗｎｔ３Ａを置換することはできなかった。しかし、Ｗｎｔ３Ａと共に使用すると、これらの阻害剤は、図３Ｂ及び図４に示すように、本発明者らの分化プロトコルにより産生される赤血球細胞の質と量において予想外に顕著な改善が認められた。予備段階の結果で、これらＧＳＫ３阻害剤が種々の多能性細胞株とは異なる反応を刺激することが示された。そこで、本発明者らは、各株についての最適条件、及びさらに重要な一般的に適用できる最適の条件を確立するために、培養プロトコルの異なるフェーズで投与するサイトカインと阻害剤の多様な組み合わせについて試験を行った。図３に示すように、上記の組み合わせは、液体培養の終了時に増幅と細胞の頑強性（robustness）とに著しい改善を示しており、これはｉＰＳＣとｈＥＳＣの両者に適用できる。
Ｈ１ＥＳＣの分化において、inhibitorVIIIはアクチビンＡに置換できるが、アクチビンＡが存在しないと著しく分化効率を妨げるＲＣ９とｉＰＳＣのＧ細胞株では、この効果は観察されなかった（図４）。最も一般的に適用できる方法を定めるために、本発明者らは分化の初期段階においてＧＳＫ３阻害剤、Ｗｎｔ３Ａ及びアクチビンＡの組み合せを使用し、検査したすべてのｈＰＳＣ株で矛盾のない結果が得られた（図５Ａ及びＢ）。検査した第２のＧＳＫ３阻害剤のＣＨＩＲ９９０２１はより強力であり（inhibitorVIII ２μΜに代えて０．２μΜ使用）、inhibitorVIIIに比較してｈｉＰＳＣ株よりｈＥＳＣに強い効果を有している（表１）。さらに、inhibitorVIII（ｄ０〜ｄ５）の処理期間を増やすと、細胞数の増殖が認められる。
ｃＡＭＰ及びその主要な標的であるｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）は、多種多様な細胞型における増殖及び分化を含む多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たし、Ｂ−ＲａｆまたはＲａｆ−１のＲａｓが介在する活性化を通して分裂細胞でＥＲＫを活性化することにより細胞増殖を刺激することができる。ここで、３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、ｃＡＭＰに特異性のない阻害剤、及び細胞内ｃＡＭＰの分解を制御するｃＧＭＰホスホジエステラーゼが培地の細胞数を増やし、またＧＳＫ３β阻害剤で試験したときＩＢＭＸが細胞増幅に相乗効果を示している（図６Ａ及びＢ、表１）。分化のプロトコルの様々な段階でＩＢＭＸを試験したが、３日目及び１７日目に培地に添加した時最大の増幅誘導に最も有効であることが判明した（表１）。
ＧＳＫ３阻害剤とＩＢＭＸとの組み合わせで処理した細胞が形態的により完全で強いことから、本発明者らはサイトカインＡミックスの分化期間を延長することによって増幅容量を上げようと試みた。図６Ｂに示すように、通常のｄ１０〜１７間の７ｄを１１ｄまでとすると、この期間延長によってさらなる増幅が認められ、このフェーズが細胞数の増加となるように延長できることを示唆している。
造血、具体的には赤血球の生成に関与する遺伝子の発現レベルの差異を評価するために、リアルタイム定量ＰＣＲを使用して、経時的に分子レベルで細胞を調べた（図７）。ｈｉＰＳＣまたはｈＥＳＣの結果は、小分子inhibitorVIIIとＩＢＭＸがグロビン遺伝子の発現及び他のマーカーに特有の造血特性の発現（ＨＢＡ、ＨＢＧ、ＨＢＢ、Ｒｕｎｘ１、Ｇａｔａ２、ＨｏｘＢ４）、並びに赤血球生成の種々の段階に特異的遺伝子（ＨＯＸＡ９、ＣＤ３６及びＮＦＥ２）の発現を増加させることを示し、多能性を示すマーカーに必要な減少には影響を及ぼさないことを示している。
ＩＢＭＸ及びＧＳＫ３β阻害剤の添加は、コントロールの培養条件に比べて、また小さな分子はインビトロで作られるｃＧＭＰに準拠する赤血球細胞の産生と極めて相性が良好であるため、細胞の形態と成熟に対して何等のネガティブな影響を及ぼさなかった。ＧＳＫ３β阻害剤及びＩＢＭＸの存在下で分化プロセスが完了したｈＰＳＣは、胎児起源の細胞とほぼ同様のＨＰＬＣグロビンプロフィールを示し胚性グロビンは極くわずかしか残らない（図８）。このことは、産生された細胞の主要部が典型的な最終的な造血の典型例であることの良い指標となるものである。しかし、培養の最終段階でわずかな％の細胞が自然発生的に除核される。
小分子を２つ含むことにより、細胞の質と増幅が向上する。分化の５日目に、３日目と同様に新鮮なサイトカインを、StemlineII０．５ｍｌ／ウェル添加する。最終濃度１μΜの小分子StemRegenin１（ＳＲＩ）（セラジェン・テクノロジー社製）をサイトカインと共に添加する。１４日目に、最終濃度５００ｎＭの小分子プルリポチン（ＳＣＩ）（ステムジェント社製）をサイトカインと共に添加する。１６日目に、最終濃度２５０ｎＭの小分子プルリポチン（ＳＣＩ）（ステムジェント社製）をサイトカインと共に添加する。５日目のＳＲＩの添加、１４、１６日目のＳＣＩの添加は、本方法の後半における細胞増幅の割合を大きくする（図２）。また、細胞はより頑丈で溶解しにくくなる。ＣＤ３４＋の増幅（ＳＲＩ）または多能性（ＳＣＩ）の維持管理に関して公表されている特性（published property）であり（以下参照）、これまでは赤血球の発育に関与していなかった小分子について試験した。その効果は投与のタイミングに強く依存している。
［総括］
本発明者らは、混濁液ベースの液体培地を使用し、スケールアップが可能であり、精製工程を必要としないほど効率の高い（ｄ１０でＨＰＣが８０％を超え、ｄ２４で赤血球系が９０％超える）分化プロトコルを提供する。本方法は赤血球に分化する細胞数のかなりの量の増幅をサポートする（ｄ０〜２４で最大３５万フォールド）。これは以前に報告された量を超え、ＨｏｘＢ４を増幅剤として使用した場合も超えている［ＲＥＦＳ］。本方法は、ヒト多能性幹細胞（ｈＥＳＣ）と呼ばれるヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、またはヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）（これは完全にＧＭＰに準拠したライセンス条件下で誘導されるＥＳＣ株をも含む。）に適している。さらに、細胞は正染性正赤芽球の段階に達しており、最終的な造血特性を示す（胚性グロビンのシャットオフとΑγグロビンの発現を含む）。プロセスのスケールアップに向けた新たな一歩として、本発明者らはこのプロトコルがｈＰＳＣからスタートすることを保証する。このｈＰＳＣは、ＧＭＰ準拠の試薬を用いた大規模な装置での生産に適している無フィーダー培養により、多くの継代に渡り保持されてきたものである。
・この分化方法は、ｈｉＰＳＣとｈＥＳＣを含むヒト多能性ＳＣの効率的な分化に使用できる。
・アクチビンＡはｉＰＳＣの効率的な分化に必要である。
・アクチビンＡの投与を増やすことには有益な効果がない（データは示さない）。
・inhibitorVIIIのパルスの延長（ｄ０〜５）は分化した細胞（ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ）の収率を増加させる。
・inhibitorVIII、またはＣＨＩＲ９９０２１とＩＢＭＸの組み合わせは相乗効果を示すが、ＢｉＯ、特異性の少ないＧＳＫ３阻害剤は効果がない
・サイトカインミックスＡでの長期培養（ｄ１０〜２１）が、分化した細胞の収率を増加させる。
・検査パラメータの組み合わせにより、ｈＰＳＣあたり３５０×１０3赤血球系細胞を達成し、赤血球細胞の収率を最大化できた。この増殖は６ウェルプレートの２以下のウェルから採取できたｉＰＳＣ ６×１０6あたりＲＢＣの１単位濃度（２×１０12細胞）に相当する。
・このプロトコルは、ＧＭＰグレードの無血清培地（CellStart、ライフ・テクノロジーズ社製）中のＧＭＰグレードの無細胞基質で前もって保持したＰＳＣ（StemPro、ライフ・テクノロジーズ社製）を使用して最適化されており、ＰＳＣを保持するためにフィーダーを使用する他の多くのプロトコルとは異なり、ＧＭＰグレードの製造と完全な互換性がある。
Figure 2018148921

Claims (7)

  1. 下記の工程１〜１１を含む、幹細胞の赤血球系細胞への分化誘導方法：
    工程１．幹細胞から胚様体（ＥＢｓ）を形成する工程、
    工程２．前記胚様体（ＥＢｓ）を、以下の成分：骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）；管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）；Ｗｎｔ３Ａ；アクチビンＡ；及びインヒビターVIII（inhibitorVIII）またはＣＨＩＲ９９０２１からなる群から選択されるＧＳＫ３阻害剤を含むステムラインII（幹細胞系II）と接触させて分化を誘導する工程、
    工程３．前記分化する胚様体を以下の成分：骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）;管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）;Ｗｎｔ３Ａ;アクチビンＡ;インヒビターVIII（inhibitorVIII）;線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）;幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びβ−エストラジオールを含むステムラインII（幹細胞系II）と接触させる工程、
    工程４．前記胚様体（ＥＢｓ）を洗浄かつ解離し、以下の成分：骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）；管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）；線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）；インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ヘパリン；イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）；及びβ−エストラジオールを含む新鮮なステムラインII（幹細胞系II）に再懸濁する工程、
    工程５．前記分化する細胞を以下の成分：ＢＭＰ４；ＶＥＧＦ；ＦＧＦα；ＳＣＦ；インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ヘパリン；イソブチルメチルキサシン（ＩＢＭＸ）；及びβ−エストラジオールを含むステムラインII（幹細胞系II）に再懸濁する工程、
    工程６．前記分化する細胞を採取し、以下の成分：ＢＭＰ４；ＶＥＧＦ；ＦＧＦα；ＳＣＦ；インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ヘパリン；イソブチルメチルキサシン（ＩＢＭＸ）；及びβ−エストラジオールを含むステムラインII（幹細胞系II）に再懸濁する工程、
    工程７．分化する細胞数をｍＬ当たり１０6未満に維持する工程、
    工程８．前記分化する細胞を以下の成分：ＢＭＰ４；ＶＥＧＦ；ＦＧＦα；ＳＣＦ；インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ヘパリン；イソブチルメチルキサシン（ＩＢＭＸ）；及びβ−エストラジオールを含むステムラインII（幹細胞系II）に再懸濁する工程、
    工程９．前記分化する細胞を以下の成分：ヒドロコルチゾン；ＳＣＦ；Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）；ＢＭＰ４；インターロイキン３（ＩＬ３）；ＩＬ１１；ＩＢＭＸ；及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むステムラインII（幹細胞系II）と接触させる工程、
    工程１０．前記分化する細胞を、以下の成分：ヒドロコルチゾン；ＳＣＦ；インスリン生長因子１（ＩＧＦ１）；インターロイキン３（ＩＬ３）；ＩＬ１１；及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含むＩＢＩＴ培地に再懸濁する工程、
    工程１１．前記分化する細胞を、ＥＰＯを含有するＩＢＩＴ培地に２日間再懸濁し、引き続きＩＢＩＴ培地に５〜１０日間再懸濁する工程。
  2. 請求項１の方法で使用する、以下の成分：骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）；管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）：Ｗｎｔ３Ａ；アクチビンＡ;及びインヒビターVIII（inhibitorVIII）またはＣＨＩＲ９９０２１からなる群から選択されるＧＳＫ３阻害剤を含有するステムラインIIを含む細胞培養培地。
  3. 請求項１の方法で使用する、以下の成分：骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔ３Ａ、アクチビンＡ、インヒビターVIII（inhibitorVIII）、線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、及びβ−エストラジオール）を含有するステムラインII（幹細胞系II）を含む細胞培養培地。
  4. 請求項１の方法で使用する、以下の成分：骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、管内皮（細胞）増殖因子１６５（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子α（ＦＧＦα）、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヘパリン、イソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、及びβ−エストラジオールを含有するステムラインII（幹細胞系II）を含む細胞培養培地。
  5. 請求項１の方法で使用する、以下の成分：ヒドロコルチゾン、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＢＭＰ４、インターロイキン３（ＩＬ３）、ＩＬ１１、ＩＢＭＸ、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含有するステムラインII（幹細胞系II）を含む細胞培養培地。
  6. 請求項１の方法で使用する、以下の成分：ヒドロコルチゾン、ＳＣＦ、インスリン生長因子１（ＩＧＦ１）、インターロイキン３（ＩＬ３）、ＩＬ１１、及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）を含有するＩＢＩＴ培地。
  7. 請求項１の方法で使用する、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を含有するＩＢＩＴ培地。
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