CN114127083A - 使用人工微rna修饰哺乳动物细胞以改变其特性及其产品的组成 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于培养哺乳动物细胞的稳定遗传修饰的方法和组合物。遗传修饰可用于产生用于治疗或诊断目的的培养的哺乳动物细胞。

Description

使用人工微RNA修饰哺乳动物细胞以改变其特性及其产品的 组成
对相关申请的交叉引用
本申请要求2019年5月13日提交的62/846847、2019年7月3日提交的62/870321、2020年2月25日提交的62/981417和2020年5月4日提交的63/019733的益处，通过引用将其全部合并用于所有目的。
对序列表的引用
本申请涉及在名为SEQ_DN20200502_ST25的txt文件中公开的序列，该文件为1,070,000字节，创建于2020年5月2日，通过引用并入。
2.背景技术
将异源核酸引入哺乳动物细胞可用于改变它们的特性，以及它们产生的分子的特性。培养的哺乳动物细胞的可遗传修饰特性包括培养的哺乳动物细胞分泌的蛋白质的糖基化、培养的哺乳动物细胞产生的蛋白质的蛋白水解加工、细胞产生的蛋白质的细胞内运输、包括哪些营养素必须从外部提供给细胞的细胞生长特性，以及细胞在包括高水平异源蛋白表达在内的各种压力下对细胞凋亡的存活率和敏感性。免疫细胞的可遗传修饰特性包括免疫细胞识别的分子、免疫细胞内的细胞反应、免疫细胞在某些环境条件(包括通常导致细胞死亡、无反应性、或衰竭的条件)下存活和执行免疫功能的能力，以及免疫细胞产生的蛋白质。
哺乳动物细胞的稳定遗传修饰可以通过将异源多核苷酸整合到培养的哺乳动物细胞的基因组中来进行。异源DNA可以通过不同方式导入细胞：通过用裸露的质粒DNA转染，通过将DNA包装成用于感染培养的哺乳动物细胞的病毒颗粒，或通过用转座子及其相应的转座酶转染细胞。
非病毒载体系统，包括质粒DNA，由于缺乏基因组插入和导致转染细胞群中载体的降解和/或稀释，经常遭受细胞传递效率低下、细胞毒性和转基因表达持续时间有限的问题。通过非病毒方法传递的转基因通常形成长的、重复的阵列(串联体)，这些阵列是异染色质形成转录沉默的目标。
病毒包装通常对可以插入的DNA的大小施加限制。还有关于病毒整合位点的安全问题，以及病毒制造的成本和复杂性。
在整合到细胞基因组中的多核苷酸上编码的基因的表达水平取决于多核苷酸内序列元件的构型。整合效率、整合到每个基因组中的多核苷酸拷贝数以及发生整合的基因组基因座也影响多核苷酸上编码基因的表达水平。通过将多核苷酸置于转座子中，通常可以提高多核苷酸整合到靶细胞基因组中的效率。转座子包含被转座酶识别的两个末端。转座酶作用于转座子，将其从一个DNA分子中切除并将其整合到另一个分子中。两个转座子末端之间的DNA与转座子末端一起被转座酶转座。侧翼为一对转座子末端以使其被转座酶识别和转座的异源DNA在本文中称为合成转座子。将合成转座子和相应的转座酶引入真核细胞的细胞核可能会导致转座子转座到细胞的基因组中。转座子/转座酶基因传递平台有可能克服裸露DNA和病毒传递的局限性。PiggyBac-like转座子因其无限的基因载货容量而具有吸引力，但Mariner转座子(如Sleeping Beauty，睡美人)或hAT转座子(如TcBuster)也提供了将异源DNA整合到哺乳动物细胞基因组中的有效方法。
通过抑制哺乳动物细胞的内源基因，可以有利地改变哺乳动物细胞的特性。RNA干扰方法可用于抑制内源性哺乳动物细胞基因，以有利地改变哺乳动物细胞的特性。RNA干扰是抑制哺乳动物细胞内源基因的一项有前途的技术。目前使用的技术受到限制，无法可靠地长期抑制基因表达。一种广泛使用的技术是用siRNA处理免疫细胞，通过siRNA转染或通过化学修饰的siRNA处理。这可用作确定基因抑制或基因敲除的表型效应的实验技术。然而，RNA是不稳定的，因此作为RNA给药的siRNA的任何影响都是暂时的。第二种技术是转染编码shRNA的基因，该基因与RNA聚合酶III转录的启动子可操作地连接。这种技术经常受到单个shRNA分子的可变效力以及随机整合的高度可变速率的限制。使用慢病毒载体可以解决随机整合的可变速率，但shRNA功效的可变性仍然存在很大问题(Anastasov et.al.,2009.J.Hematop 2,9-19.“Efficient shRNA delivery into B and T lymphoma cellsusing lentiviral vector-mediated transfer”)。
microRNAs(miRNAs)是天然存在的RNA，其通过RNA聚合酶II从它们的基因转录。microRNAs包括分子内双链RNA发夹，由细胞酶加工产生与一个或多个mRNA靶标互补的“向导链”。向导链与RISC复合体物理上相关联，通过RISC复合体抑制靶mRNA的表达。人工miRNAs(amiRNAs)可以通过使用天然支架进行设计，并对其进行调整以产生抑制天然靶标以外的靶标的向导链。人工miRNAs也可以被RNA聚合酶III转录(Snyder et.al.,2009.Nucl.Acids Res.37 e127 doi:10.1093/nar/gkp657.“RNApolymerase III candrive polycistronic expression of functional interfering RNAs designed toresemble microRNAs”)。miRNA支架的使用可以改善干扰RNAs的处理，但有效性的可变性仍然是一个挑战。因此，本领域需要一种稳健的RNA干扰方法来抑制哺乳动物细胞的内源基因，以改变哺乳动物细胞或哺乳动物细胞产生的蛋白质或其它化合物的特性。
为了实现有利的表型变化，本文公开了用于将包括人工microRNAs的多核苷酸引入哺乳动物细胞以抑制哺乳动物细胞内源性基因的方法和组合物。
3.发明内容
描述了修饰哺乳动物细胞基因组以抑制内源基因表达的方法。哺乳动物细胞可以包括为生产表达的蛋白质而培养的哺乳动物细胞。它们还可包括免疫细胞，包括淋巴细胞，例如T细胞和B细胞以及自然杀伤细胞(NK细胞)、T辅助细胞、抗原呈递细胞、树突细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。
RNA干扰方法可用于抑制内源性哺乳动物细胞基因的表达以有利地改变哺乳动物细胞的特性。在这里，我们描述了提高RNA干扰效率的方法：(i)表达干扰RNA的基因(例如shRNA或amiRNA基因)可以整合到转座子中，其中所述转座子的一个或多个拷贝被整合到哺乳动物细胞基因组的转录活性区域中，以及(ii)所述干扰RNA包含与同一mRNA靶标内的两个或多个不同序列互补的两个或多个不同的向导链。在慢病毒载体或转座子载体中提供与同一mRNA靶标内的不同序列互补的两条或多条向导链，大大提高了RNA干扰的可靠性。
描述了设计用于抑制哺乳动物细胞中表达的基因的多核苷酸的方法。用于抑制靶基因(“抑制性基因转移多核苷酸”)的优选基因转移多核苷酸包括两个或多个不同的发夹序列，其可在靶哺乳动物细胞中表达以产生两个或多个不同的RNA向导链序列，每个序列与靶mRNA的不同区域互补。所述第一(向导)序列包含19至22个与靶mRNA互补的连续碱基，且所述第二(向导)序列包含19至22个与靶mRNA互补的连续碱基。所述第一和第二向导链序列彼此不同但与相同的靶mRNA互补。可选择地，所述基因转移多核苷酸包括可在靶哺乳动物细胞中表达的第三发夹序列以产生包含与靶mRNA互补的19至22个连续碱基的RNA向导链序列，并且所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。所述抑制性基因转移多核苷酸中的每个发夹序列包括向导链序列和互补的过客链序列。每个向导链序列与其相应的过客链序列通过在表达的RNA中形成5到35个碱基的未配对环的序列分开。每条过客链序列包括至少19个碱基，与其相应向导链序列的反向互补序列至少78％相同(即，相对于相应向导链序列的相同反向互补，在这19个碱基中，它包含不超过4个错配，包括突变、单碱基缺失或单碱基插入)。选择向导链和过客链序列之间的差异以有利于通过哺乳动物RNA干扰途径加工转录的发夹并将向导链加载到RISC复合物中，以减少靶mRNA的表达。优选地，所述基因转移多核苷酸中的本发明的发夹序列(即向导链、环和过客链序列的组合)是在哺乳动物细胞中不是天然表达的序列或来自可感染哺乳动物细胞的病毒的序列。优选地，本发明的发夹序列由一种或多种人工微RNA表达。
所述抑制性基因转移多核苷酸包括两个或多个发夹序列，每个发夹序列与在所述靶哺乳动物细胞中有活性的异源启动子可操作地连接。每个发夹序列可以与相同的启动子可操作地连接，或者它们可以与单独的启动子连接。优选地，所述启动子由RNA聚合酶II或RNA聚合酶III转录，更优选地，所述启动子由RNA聚合酶II转录。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型启动子。
在一些实施方案中，所述抑制性基因转移多核苷酸包括(a)编码多发夹amiRNA序列的片段，其中所述片段包括(i)包含与天然哺乳动物细胞mRNA的第一靶位点完全互补的连续19-22个核苷酸序列的第一向导链序列，和包含与所述第一向导链序列至少78％互补的连续19-22个核苷酸序列第一过客链序列，其中所述第一向导链和第一过客链序列相隔5至35个核苷酸；(ii)第二向导链序列和第二过客链序列，所述第二向导链序列包含连续的19个核苷酸序列，所述连续的19个核苷酸序列与不同于与所述第一向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA的所述第一靶位点的第二靶位点完全互补，所述第二过客链序列包含与第二向导链序列至少78％互补的连续19-22个核苷酸序列，其中所述第二向导链和第二过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同；以及(b)在哺乳动物细胞中有活性并由RNA聚合酶II或RNA聚合酶III转录，并与编码amiRNA序列的片段可操作地连接的真核启动子，其中，所述amiRNA序列可被表达并折叠成多个发夹。所述第一过客链序列可以与所述第一向导链序列长度相同，或者可以短1-3个核苷酸。所述哺乳动物细胞mRNA中的所述第一和第二靶位点可能有一些重叠而不是重叠。
有利的抑制性基因转移多核苷酸在哺乳动物细胞中稳定保持，从而使所述靶基因被永久抑制。优选地，所述抑制性基因转移多核苷酸被整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。为了促进所述抑制性基因转移多核苷酸稳定整合到哺乳动物细胞的基因组中，将其表达所需的发夹序列和调控元件整合到转座子例如piggyBac-like转座子、或Mariner转座子(例如睡美人转座子)、或haT转座子(例如TcBuster转座子)、或病毒载体例如慢病毒载体中，是有利的。有利的抑制性基因转移多核苷酸包含可在哺乳动物细胞中表达的两个或更多个不同的发夹序列，每个发夹序列包含与靶mRNA互补的至少19、20、21或22个连续碱基的不同序列，其中每个发夹与在哺乳动物细胞中有活性的启动子可操作地连接，以及其中发夹和它们可操作地连接的启动子的侧翼是piggyBac-like转座子的反向末端重复，或Mariner转座子如Sleeping Beauty(睡美人)转座子的反向末端重复，或hAT转座子如TcBuster转座子的反向末端重复，使得发夹及其可操作地连接的启动子可被相应的转座酶转座。或者，所述发夹和它们可操作地连接的启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列，以便它们可以被包装成病毒颗粒。
本发明的方法包括将包括两个或多个可在哺乳动物细胞中表达的不同发夹序列的抑制性基因转移多核苷酸引入哺乳动物细胞，以产生两个或多个不同的向导RNA序列，每个序列与同一靶mRNA的不同区域互补。对于其中发夹序列携带在转座子载体上的抑制性基因转移多核苷酸，该方法可以进一步包括将相应的转座酶作为蛋白质或作为编码转座酶的核酸引入哺乳动物细胞。对于其中发夹序列携带在病毒载体上的抑制性基因转移多核苷酸，该方法可进一步包括将所述多核苷酸包装到病毒颗粒中并使哺乳动物细胞与病毒颗粒接触。
可选择地,所述抑制性基因转移多核苷酸还包括编码可在哺乳动物靶细胞中表达的蛋白质的基因，其中所述蛋白质改变哺乳动物细胞的特性、行为或产物。例如，所述基因转移多核苷酸可包含编码嵌合抗原受体、T细胞受体、抗体、双特异性抗体、受体或任何种类的治疗性蛋白质的开放阅读框，可操作地连接至使蛋白质在靶标哺乳动物细胞中表达的调节元件。以这种方式，单个多核苷酸可以携带在哺乳动物细胞内产生一种或多种异源蛋白质的序列，连同转录以产生减少一种或多种内源基因表达的干扰RNA分子的序列，例如那些在某些环境或某些条件下通常会降低哺乳动物细胞功效或存活的基因。可选择地，编码修饰哺乳动物细胞特性的蛋白质的所述基因与一个或多个发夹序列相同的启动子可操作地连接。
人细胞系例如来自人胚胎肾(HEK)的细胞系和啮齿动物细胞系例如来自中国仓鼠卵巢(CHO)的细胞系通常用于产生治疗性蛋白质，包括抗体。这些细胞具有内在的岩藻糖基转移酶活性。附着在Fc上的低聚糖的核心岩藻糖大大降低了抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，这会降低抗肿瘤抗体在人体内的临床疗效和抗癌活性。因此，减少或消除哺乳动物培养细胞系中产生的蛋白质的岩藻糖基化是有利的，这样它们将产生具有更高ADCC活性的抗体。我们公开了用于设计包含amiRNA序列的多核苷酸的方法，以减少在哺乳动物细胞中产生的异源产生的蛋白质(包括抗体)的岩藻糖基化。还公开了可用于降低异源产生的蛋白质的岩藻糖基化水平的含有amiRNA的多核苷酸的序列。
对于用于生产通常靶向溶酶体的蛋白质的啮齿动物和人类细胞系，大量合成的蛋白质可被导向溶酶体并随后被降解。这会导致蛋白质产量降低，以及危及细胞存活率。因此，破坏通常将这些蛋白质运输到生产细胞的溶酶体的途径是有利的，例如甘露糖6-磷酸受体、溶酶体整合膜蛋白LIMP-2和sortilin。我们公开了用于设计包含amiRNA序列以减少哺乳动物细胞中溶酶体运输的多核苷酸的方法，以及可用于减少细胞溶酶体运输的包含amiRNA的多核苷酸序列。
用于制造蛋白质的人和啮齿动物细胞系的开发通常涉及引入编码待生产蛋白质的异源DNA。所述异源DNA通常包含编码可选择标记的基因，以允许识别/选择已摄取异源DNA的细胞。一类特别有用的选择标记是允许细胞在没有添加营养物的情况下存活和生长的标记。为了使这样的选择起作用，细胞必须缺少选择标记的功能性内源拷贝，因此它依赖于添加的拷贝。培养的哺乳动物细胞已经通过其涉及氨基酸和核苷酸合成的内源基因，特别是谷氨酰胺合成酶和二氢叶酸还原酶基因的定向或非定向缺失或突变而被修饰。染色体中基因的删除是复杂且耗时的。另一种方法是使用RNA干扰来永久减少内源性谷氨酰胺合成酶或二氢叶酸还原酶基因的表达。我们公开了用于设计包括用于减少哺乳动物细胞中谷氨酰胺合成酶和二氢叶酸还原酶的表达的amiRNA序列的多核苷酸的方法，以及可用于实现这种减少的包含amiRNA的多核苷酸的序列。
对于用于生产通常被蛋白水解切割的蛋白质的啮齿动物和人类细胞系，这种切割可导致蛋白质产量降低，或导致异质蛋白质产物。因此，瓦解蛋白酶可能是有利的。我们公开了设计包含用于减少哺乳动物细胞中蛋白水解的amiRNA序列的多核苷酸的方法，以及可用于减少蛋白水解的包含amiRNA的多核苷酸的序列。
对于用于生产蛋白质的啮齿动物和人类细胞系，高水平的蛋白质表达会降低细胞存活率。因此，破坏参与正常细胞凋亡途径的基因可能是有利的。我们公开了设计包括用于减少哺乳动物细胞凋亡的amiRNA序列的多核苷酸的方法，以及可用于减少细胞凋亡的包括amiRNA的多核苷酸的序列。
增强人类T细胞的功能、持久性和增殖的能力是癌症免疫疗法的当前瓶颈。对提高T细胞性能、扩增和基因操作的技术的需求量很大。控制和扩展T细胞的能力有许多应用，包括以下内容。(i)改善T细胞疗法的功能以提高疗效和/或安全性，例如与CAR-T联合使用。(ii)逆转肿瘤浸润T细胞的T细胞衰竭。(iii)提高小鼠体内人类T细胞的存活率，用于临床前研究(体内)。(iv)抗原特异性T细胞的鉴定和体外T细胞受体的克隆。(v)开发可以在体外维持的T细胞系，并且仍然执行T细胞的生物学功能(例如细胞杀伤)。可通过引入通过RNA干扰起作用的抑制性基因转移系统(例如包含amiRNA的抑制性基因转移系统)进行的修饰，包括增强免疫细胞在某些条件或某些环境中存活和/或增殖的能力，改变免疫细胞表面表达的蛋白质的数量或类型，防止免疫细胞被内部或外部刺激灭活，并改变免疫细胞对接触细胞的蛋白质或小分子的反应。我们公开了设计包含用于修饰免疫细胞功能的amiRNA序列的多核苷酸的方法，以及可用于改善免疫细胞功能的包含amiRNA的多核苷酸的序列。
其表达可能会因来自抑制性基因转移多核苷酸的RNA干扰而降低，以提高免疫细胞在恶劣环境(例如肿瘤内)中的增殖、存活或功能的免疫细胞基因，包括:胸腺细胞选择相关的高迁移率群盒蛋白TOX和TOX1、T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3、活化T细胞的核因子、程序性细胞死亡蛋白1、核受体4A1(Nur77)、核受体4A2(Nurr1)、核受体4A3(NOR1)、Fas细胞表面死亡受体(肿瘤坏死因子受体超家族成员6)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、caspase 3、caspase 7、caspase 8、caspase 9、caspase 10、死亡受体4(肿瘤坏死因子受体超家族成员10A)、死亡受体5(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B)、细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)、细胞凋亡调节剂BAX和BAD(Bcl2相关的细胞死亡激动剂)。
修饰的哺乳动物细胞，包括修饰的人类免疫细胞，其基因组包含抑制性基因转移多核苷酸，该多核苷酸包含可在哺乳动物细胞中表达的两个或多个不同的发夹序列，以产生两个或多个不同的向导RNA序列，每个序列与靶mRNA的不同区域互补是本发明的一个方面。此外，动物免疫细胞，其基因组包括抑制性基因转移多核苷酸，该多核苷酸包括可在哺乳动物细胞中表达的两个或多个不同的发夹序列，以产生两个或多个不同的向导RNA序列，每个向导RNA序列与靶mRNA的不同区域互补，作为实验模型和动物治疗剂也很有价值。修饰的哺乳动物细胞，包括修饰的人免疫细胞，所述细胞包含抑制性基因转移多核苷酸，该多核苷酸已通过piggyBac-like转座酶的作用整合，包含至少两个发夹，每个发夹包含与相同靶mRNA的不同区域互补的至少19、20、21或22个连续碱基的不同序列，并且每个发夹与在哺乳动物免疫细胞中有活性的启动子可操作地连接，其中发夹和启动子的侧翼是piggyBac-like转座子的反向末端重复。修饰的哺乳动物细胞，包括修饰的人免疫细胞，其包含通过Sleeping Beauty(睡美人)转座酶的作用整合的抑制性基因转移多核苷酸，所述多核苷酸包含至少两个发夹，每个发夹包含与相同靶mRNA的不同区域互补的至少19、20、21或22个连续碱基的不同序列，并且每个发夹与在哺乳动物免疫细胞中有活性的启动子可操作地连接，其中发夹和启动子的侧翼是睡美人转座子的反向末端重复。修饰的哺乳动物细胞，包括修饰的人免疫细胞，其包含通过TcBuster转座酶的作用整合的抑制性基因转移多核苷酸，所述多核苷酸包含至少两个发夹，每个发夹包含与相同靶mRNA的不同区域互补的至少19、20、21或22个连续碱基的不同序列，并且每个发夹与在哺乳动物免疫细胞中有活性的启动子可操作地连接，其中发夹和启动子的侧翼是TcBuster转座子的反向末端重复。修饰的哺乳动物细胞，包括修饰的人免疫细胞，其包含通过慢病毒系统的作用整合的抑制性基因转移多核苷酸，所述多核苷酸包含至少两个发夹，每个发夹包含与相同靶mRNA的不同区域互补的至少19、20、21或22个连续碱基的不同序列，并且每个发夹与在哺乳动物免疫细胞中有活性的启动子可操作地连接，其中发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。优选地，相对于基因组不包含抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞，基因组包含抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞具有改善的增殖、存活或功能特性。
提供了用于实现哺乳动物细胞基因组修饰的基因转移多核苷酸序列。
4.附图说明
图1A、B：向导链和过客链序列结构的示意图。显示了单个miRNA发夹的编码链的核苷酸。向导链序列表示为22个连续的核苷酸N1到N22。向导链的序列优选为靶mRNA的完全反向互补，靶mRNA的表达将被降低。过客链序列表示为22个连续的核苷酸N’1到N’22。过客链序列优选是向导链序列的不完全反向互补。向导链序列和过客链序列中的相应碱基用水平线表示。对于由实线连接的碱基，过客链中的碱基优选是向导链中碱基的互补碱基。优选的是，对于由虚线连接的一个或多个碱基，过客链中的碱基优选不是向导链中碱基的互补碱基。如果向导链中的碱基是A或T，则过客链序列中的碱基优选是C。如果向导链序列中的碱基是C或G，则过客链序列中的碱基优选是A。最优选地，位置N'1处的过客链序列碱基与向导链序列碱基N1不互补。最优选地，位置N'12处的过客链序列碱基与向导链序列碱基N12不互补。如果删除过客链中的一个或多个碱基，也可能会出现错配。向导链序列和过客链序列由5-35个核苷酸的非结构化环序列连接，表示为L1-LZ。向导链序列可以位于图1A所示的环序列的5’，也可以位于图1B所示的环序列的3’。
图2A-B：部分多发夹amiRNA基因的示意图。如果amiRNA基因包含附加特征，则包含向导链序列、非结构化环和过客链序列的发夹序列的加工过程会得到改进，以产生加载到RISC复合物中的向导链序列以抑制靶基因表达。这些包括连着发夹序列5'和3'的附加茎结构。元件A是一个与元件E互补的序列，它稳定了发夹1，尽管元件A和E之间的互补性不需要完全来执行此功能。类似地，元件G是一个与元件K互补的序列，它稳定了发夹2，尽管元件A和E之间的互补性不需要完全来执行此功能。可选择地，发夹被非结构化的间隔元件F隔开。两个或多个发夹与相同的启动子可操作地连接，并且第一发夹通过间隔序列与启动子隔开。发夹1显示为具有向导后接环然后接过客的构造，发夹2在图2A中显示为相同构造，但在图2B中显示为过客-环-向导构造。任何其它构造组合都是可以接受的。可以在第二发夹之后放置额外的发夹。可选择地，多发夹amiRNA基因中的最后一个发夹后跟多聚腺苷酸化信号序列。
图3A-G：包含由稳定转染的CHO细胞系产生的聚糖的抗体质谱图，该CHO细胞系表达靶向FUT8的多发夹amiRNA基因。如第6.1.1.1节所述，从产生抗体的细胞中纯化蛋白质，并通过质谱法进行分析。箭头表示(i)50,424Da的预测分子量，G0修饰的重链：保守的七糖核心由2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，这些残基β-1,2连接到α-6甘露糖和α-3甘露糖，形成两个臂；(ii)50,571Da，G0F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个岩藻糖残基；(iii)50,586Da，被G1修饰的重链：保守的七糖核心加上一个半乳糖残基和(iv)50,733Da，被G1修饰的重链：保守的七糖核心加上一个半乳糖残基加上一个岩藻糖残基。在所有情况下，重链也失去了其C端赖氨酸残基。3A：无amiRNA转座子；3B-G：如图1A-B所示配置的多发夹amiRNA转座子。
图4A-D：包含由稳定转染的CHO细胞系产生的聚糖的抗体的质谱，该CHO细胞系表达与不同启动子连接的多amiRNA序列。如第6.1.1.2节所述，从产生抗体的细胞中纯化蛋白质，并通过质谱法进行分析。箭头表示(i)50,424Da的预测分子量，G0修饰的重链：保守的七糖核心由2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，这些残基β-1,2连接到α-6甘露糖和α-3甘露糖，形成两个臂；(ii)50,570Da，G0F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个岩藻糖残基；(iii)23,443Da，轻链。在所有情况下，重链也失去了其C端赖氨酸残基。图4A：无amiRNA转座子；图4B：与EEF2启动子可操作地连接的多发夹amiRNASEQ ID NO：726；图4C：与PGK启动子可操作地连接的多发夹amiRNA SEQ ID NO：726；图4D：与Ubb启动子可操作地连接的多发夹amiRNASEQ ID NO：726。
图5A-B：包含由表达多amiRNA基因的CHO细胞系产生的聚糖并随后用抗体基因瞬时转染的抗体的质谱图。如第6.1.1.3节所述，从产生抗体的细胞中纯化蛋白质，并通过质谱法进行分析。箭头表示(i)50,521Da的预测分子量，G0修饰的重链：保守的七糖核心2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，这些残基β-1,2连接到α-6甘露糖和α-3甘露糖，形成两个臂；(ii)50,668Da，G0F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个岩藻糖残基；(iii)23,444Da，轻链。在所有情况下，重链也失去了其C端赖氨酸残基。图5A：无amiRNA转座子；图5B：与EF1启动子可操作地连接的多发夹amiRNA SEQ ID NO：726。
5.说明
5.1定义
除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一”、“一个”和“这”的使用包括复数引用。因此，例如，提及“多核苷酸”包括多个多核苷酸，提及“底物”包括多个这样的底物，提及“变体”包括多个变体，等等。
术语例如“相连的”、“附着的”、“连接的”和“缀合的”在本文中可互换使用并且包括直接和间接的相连、附着、连接或缀合，除非上下文另有明确规定。在列举数值范围的情况下，应当理解，还具体公开了所述范围的所述上限和下限之间的每个中间整数值及其每个分数，以及这些值之间的每个子范围。任何范围的上限和下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围之外，并且其中一个、一个也不包括或两个限制都包括的每个范围也包括在本发明之内。在所讨论的值具有内在限制的情况下，例如当组分可以以0％到100％的浓度存在时，或者当水溶液的pH值可以在1到14之间时，这些内在限制被明确地公开。在明确列举数值的情况下，应当理解，与所述数值大致相同的数量或数额的数值也在本发明的范围内。在公开组合的情况下，该组合的要素的每个子组合也被具体公开并且在本发明的范围内。相反，在单独公开不同元素或元素组的情况下，也公开了它们的组合。在本发明的任何要素被公开为具有多个替代方案的情况下，在此还公开了该发明的示例，其中每个替代方案被单独排除或与其它替代方案的任何组合被排除；一项发明的不止一个要素可以具有这样的排除，并且特此公开具有这样排除的要素的所有组合。
除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。Singleton,et.al.,Dictionary of Microbiology andMolecular Biology,2nd Ed.,John Wiley and Sons,New York(1994),和Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology,Harper Perennial,NY,1991为技术人员提供本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料，但是描述了优选的方法和材料。除非另有说明，核酸按5'到3'方向从左到右书写；氨基酸序列分别以氨基到羧基的方向从左到右书写。紧接下面定义的术语通过参考整个说明书来更完整地定义。
“人工微RNA”或“amiRNA”是包含天然微RNA支架的序列，其中向导链和/或过客链序列已被修饰，使得向导链指向非天然靶标的mRNA靶标。也可以修饰天然微RNA支架的其它部分，例如以改善RNA干扰途径中酶的加工。包含与同一启动子可操作地连接的两条或更多向导链和过客链的amiRNA序列被称为“多发夹amiRNA基因”。
术语“密码子使用”或“密码子偏向性”是指使用不同的同义密码子在开放阅读框中编码氨基酸的相对频率。对特定靶细胞具有密码子偏好的核酸序列具有在该细胞类型中导致有效翻译的同义密码子选择的平衡。这种平衡通常无法从观察到的基因组密码子频率计算，但必须凭经验确定，例如美国专利7,561,972、7,561,973和8,401,798，以及Welchet.al.(2009)，“Design Parameters to Control Synthetic Gene Expression inEscherichia coli”.PLoS ONE 4(9):e7002.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0007002中所述。最初从一种细胞类型中分离的核酸被引入另一种类型的靶细胞，可以选择靶位点细胞的密码子偏好，使得在引入靶细胞的核酸与原始核酸之间，同义密码子中的至少1个，有时5个、20个、15个、20个、50个、100个或更多个选择不同。
如果一个氢的碱基与另一个的碱基键合，则两个多核苷酸是“互补的”。为了完全互补，第一个多核苷酸中的腺嘌呤(A)必须与第二个中的胸腺嘧啶(T)对应(反之亦然)，第一个多核苷酸中的胞嘧啶(C)必须与第二个中的鸟嘌呤(G)对应(反之亦然)。这两个多核苷酸也必须是反平行的。如果两个多核苷酸是互补的，一个可以被描述为另一个的“反向互补”，以表明当一个在5'到3'方向，另一个在3'到5'方向时，它们的碱基是互补的。如本文所用，当一个多核苷酸序列被描述为与另一个互补时，意在表明该序列是反平行的并且能够彼此碱基配对。
多核苷酸的“构造”是指多核苷酸内的功能序列元件，以及这些元件的顺序和方向。
术语“相应转座子”和“相应转座酶”用于表示转座酶和转座子之间的活性关系。转座酶转座其相应的转座子。许多转座酶可能对应一个转座子，许多转座子可能对应一个转座酶。
术语“反选择标记”是指赋予宿主细胞选择性劣势的多核苷酸序列。选择标记的例子包括sacB、rpsL、tetAR、pheS、thyA、gata-1、ccdB、kid和barnase(Bernard,1995,Journal/Gene,162:159-160；Bernard et.al.,1994.Journal/Gene,148:71-74；Gabantet.al.,1997,Journal/Biotechniques,23:938-941；Gababt et.al.,1998,Journal/Gene,207:87-92；Gababt et.al.,2000,Journal/Biotechniques,28:784-788；Galvao and deLorenzo,2005,Journal/Appl Environ Microbiol,71:883-892；Hartzog et.al.,2005,Journal/Yeat,22:789-798；Knipfer et.al.,1997,Journal/Plasmid,37:129-140；Reyratet.al.,1998,Journal/Infect Immun,66:4011-4017；Soderholm et.al.,2001,Journal/Biotechniques,31:306-310,312；Tamura et.al.,2005,Journal/Appl EnvironMicrobiol,71:587-590；Yazynin et.al.,1999,Journal/FEBS Lett,452:351-354)。反选择标记通常在特定情况下赋予其选择性劣势。例如，它们可以赋予可以添加到宿主细胞环境中的化合物的敏感性，或者它们可以杀死具有一种基因型的宿主但不会杀死具有不同基因型的宿主。不会对携带反选择标记的细胞造成选择性劣势的条件被描述为“允许的”。确实赋予携带反选择标记的细胞以选择劣势的条件被描述为“限制性的”。
术语“偶联元件”或“翻译偶联元件”是指允许第一多肽的表达与第二多肽的表达相关联的DNA序列。内部核糖体进入位点元件(IRES元件)和顺式作用水解酶元件(CHYSEL元件)是偶联元件的例子。
术语“DNA序列”、“RNA序列”或“多核苷酸序列”是指连续的核酸序列。该序列可以是长度为2至20个核苷酸的寡核苷酸至数千或数十万碱基对的全长基因组序列。
术语“表达构建体”是指设计用于转录RNA的任何多核苷酸。例如，包括至少一个启动子的构建体，该启动子与下游基因、编码区或多核苷酸序列[例如，编码多肽或蛋白质的cDNA或基因组DNA片段，或RNA效应分子，例如，反义RNA、三股螺旋形成RNA、核酶、人工选择的高亲和力RNA配体(适配子)、双链RNA，例如，包含茎-环或发夹dsRNA的RNA分子，或双指或多指dsRNA或microRNA，或任何RNA]可操作地连接或可以可操作地连接。“表达载体”是包含启动子的多核苷酸，该启动子可以与第二个多核苷酸可操作地连接。表达构建体转染或转化到受体细胞中允许细胞表达由表达构建体编码的RNA效应分子、多肽或蛋白质。表达构建体可以是基因工程质粒、病毒、重组病毒或源自例如噬菌体、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、痘病毒或疱疹病毒的人工染色体。这种表达载体可以包括来自细菌、病毒或噬菌体的序列。此类载体包括染色体、附加体和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体元件和病毒的载体，衍生自其组合的载体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件、粘粒和噬菌粒的那些载体。表达构建体可以在活细胞中复制，也可以人工合成。出于本申请的目的，术语“表达构建体”、“表达载体”、“载体”和“质粒”可互换使用以在一般的、说明性的意义上展示本发明的应用，并且不旨在将本发明限制为特定类型的表达构建体。
术语“表达多肽”是指由表达构建体上的基因编码的多肽。
术语“表达系统”意指任何体内或体外生物系统，其用于产生由多核苷酸编码的一种或多种基因产物。
“基因”是指转录单位，包括启动子和从其表达为RNA或蛋白质的序列。要表达的序列可以是基因组、cDNA、一种或多种非编码RNA，包括siRNA或microRNA，以及其它可能性。其它元件，例如内含子和其它调节序列可能存在也可能不存在。
“基因转移系统”包括载体或基因转移载体，或包含被克隆到载体(“基因转移多核苷酸”或“基因转移构建体”)中的待转移基因的多核苷酸。基因转移系统还可以包括促进基因转移过程的其它特征。例如，基因转移系统可包含载体和脂质或病毒包装混合物，以使第一多核苷酸进入细胞，或者它可包含多核苷酸，该多核苷酸包括转座子和编码相应转座酶的第二多核苷酸序列，以提高转座子的有效益的基因组整合。基因转移系统的转座酶和转座子可以在相同的核酸分子上或在不同的核酸分子上。基因转移系统的转座酶可以作为多核苷酸或作为多肽提供。
抑制性双链RNA(例如shRNA或miRNA)的“向导”链是与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合并参与基因沉默。向导链序列是靶mRNA序列的反向互补序列，它抑制其表达。
术语“发夹”用于描述多核苷酸序列，其中同一链的两个区域在核苷酸序列上互为反向互补，导致分子内碱基配对形成双链区域和未配对环。该术语在本文中用于描述编码这种结构的DNA序列，尽管通常DNA是通过分子间碱基配对形成双链的。该术语也用于指采用发夹结构的RNA序列。本发明的DNA发夹旨在表达为RNA。本发明的RNA发夹用作RNA干扰途径酶的底物，将其加工成加载到RISC复合物上的向导链。发夹的“向导链”是经过转录和加工后加载到RISC复合物中的序列。所述向导链与所述靶mRNA互补。
两个元件如果不是自然关联的，则彼此“异源”。例如，编码与异源启动子连接的蛋白质的核酸序列是指天然驱动蛋白质表达的启动子以外的启动子。侧翼为转座子末端或ITR的异源核酸是指非天然侧翼为那些转座子末端或ITR的异源核酸，例如编码除转座酶以外的多肽的核酸，包括抗体重链或轻链。如果核酸不是天然存在于细胞中，或者如果天然存在于细胞中但位于与所述位置不同的位置(例如，游离基因或不同的基因组位置)，则核酸对于细胞是异源的。
“过度活跃”的转座酶是一种比衍生它的天然存在的转座酶更活跃的转座酶。因此，“过度活跃”的转座酶不是天然存在的序列。
术语“宿主”是指可以是核酸受体的任何原核或真核生物。“宿主”，如本文所用的术语，包括可以进行基因工程改造的原核或真核生物。有关此类宿主的示例，请参见Maniatis et.al.,Molecular Cloning.A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1982).如本文所用，术语“宿主”、“宿主细胞”、“宿主系统”和“表达宿主”可以互换使用。
“IRES”或“内部核糖体进入位点”是指直接促进核糖体结合的专门序列，独立于帽子结构。
“分离的”多肽或多核苷酸是指已从其天然环境中移除、使用重组技术产生、或化学或酶促合成的多肽或多核苷酸。本发明的多肽或多核苷酸可以被纯化，即基本上不含任何其它多肽或多核苷酸和相关的细胞产物或其它杂质。
术语“核苷”和“核苷酸”包括那些不仅包含已知的嘌呤和嘧啶碱基，而且还包含被修饰的其它杂环碱基的部分。此类修饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶、或其它杂环。修饰的核苷或核苷酸还可以包括对糖部分的修饰，例如，其中一个或多个羟基被卤素、脂肪族基团取代，或被官能化为醚、胺等。术语“核苷酸单位”旨在包括核苷和核苷酸。
“开放阅读框”或“ORF”是指多核苷酸的一部分，当翻译成氨基酸时，不包含终止密码子。遗传密码以三个碱基对为一组读取DNA序列，这意味着双链DNA分子可以在六个可能的阅读框架中的任何一个中读取——三个在正向，三个在反向。ORF通常还包括一个起始密码子，翻译可以在该起始密码子处开始。
术语“可操作地连接”是指两个序列之间的功能连接，使得一个序列改变另一个序列的行为。例如，如果第一多核苷酸影响第二多核苷酸的转录和/或翻译，则包含核酸表达控制序列(例如启动子、IRES序列、增强子或转录因子结合位点阵列)的第一多核苷酸和第二多核苷酸可操作地连接。同样地，如果第一氨基酸序列导致第二氨基酸序列分泌或定位到亚细胞位置，则包含分泌信号或亚细胞定位信号的第一氨基酸序列和第二氨基酸序列可操作地连接。
术语“正交”是指两个系统之间缺乏相互作用。如果第一转座酶不切除或转座第二转座子并且第二转座酶不切除或转座第一转座子，则第一转座子及其相应的第一转座酶和第二转座子及其相应的第二转座酶是正交的。
术语“突出端”或“DNA突出端”是指双链DNA分子末端的单链部分。互补突出端是那些将彼此碱基配对的突出端。
抑制性双链RNA(例如shRNA或miRNA)的“过客”链是在转运至细胞质后降解且不直接参与基因沉默的链。
“PiggyBac-like转座酶”是指使用TBLASTN算法鉴定的与来自Trichoplusia ni(粉纹夜蛾)的piggyBac转座酶(SEQ ID NO:1047)具有至少20％序列同一性的转座酶，并在Sakar,A.et.al.,2003.Mol.Gen.Genomics 270:173-180中进行了更全面的描述。“广泛的piggyBac转座子家族和相关‘驯化’物种的分子进化分析”，并进一步表征为DDE-like(DDE样)的DDD基序，具有在与粉纹夜蛾piggyBac转座酶的D268、D346和D447的最大限度对齐位置对应的天冬氨酸残基。PiggyBac-like转座酶的特征还在于它们能够以高频率精确切除转座子。“piggyBac-like转座子”是指转座子末端与天然存在的转座子末端相同或至少80％相同，优选与编码piggyBac-like(piggyBac样)转座酶的天然存在转座子的转座子末端至少90、95、96、97、98、99％或100％相同。piggyBac-like转座子包括反向末端重复(ITR)序列，由位于每个末端的大约12-16个碱基组成。这些重复在两端可能是相同的，或者在两个ITR中，两端的重复可能在1、2、3或4个位置不同。转座子的两侧是与整合目标序列相对应的4碱基序列，该序列在转座子整合(靶位点重复、靶序列重复或TSD)时复制。PiggyBac-like转座子和转座酶天然存在于多种生物体中，包括Argyrogramma agnate(GU477713),Anopheles gambiae(XP_312615；XP_320414；XP_310729),Aphis gossypii(GU329918),Acyrthosiphon pisum(XP_001948139),Agrotis ypsilon(GU477714),Bombyx mori(BAD11135),Ciona intestinalis(XP_002123602),Chilo suppressalis(JX294476),Drosophila melanogaster(AAL39784),Daphnia pulicaria(AAM76342),Helicoverpaarmigera(ABS18391),Homo sapiens(NP_689808),Heliothis virescens(ABD76335),Macdunnoughia crassisigna(EU287451),Macaca fascicularis(AB179012),Musmusculus(NP_741958),Pectinophora gossypiella(GU270322),Rattus norvegicus(XP_220453),Tribolium castaneum(XP_001814566)and Trichoplusia ni(AAA87375)andXenopus tropicalis(BAF82026)，尽管几乎没有描述过这些生物体的转座活性。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，并可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物或它们的混合物。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。它还包括修饰的，例如通过烷基化和/或通过加帽，以及未修饰形式的多核苷酸。更具体地，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、hRNA、siRNA和mRNA，无论是剪接的还是未剪接的，任何其它类型的多核苷酸，该多核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷，以及其它含有非核苷酸骨架的聚合物，例如聚酰胺[例如，肽核酸(“PNA”)]和多吗啉(可从Anti-Virals,Inc.,Corvallis,Oreg.商购获得，作为Neugene)聚合物，以及其它合成的序列特异性核酸聚合物，前提是该聚合物含有以如下构型的核碱基：允许碱基配对和碱基堆积，例如在DNA和RNA中发现的。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在长度上没有有意的区别，并且这些术语在本文中可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括，例如，3'-脱氧-2'、5'-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3'P5'氨基磷酸酯、2'-O-烷基取代的RNA、双链和单链DNA，以及双链和单链RNA及其杂交体，包括例如DNA和RNA之间或PNA和DNA或RNA之间的杂交体，还包括已知类型的修饰，例如标记、烷基化、“帽子”、用类似物替换一个或多个核苷酸、核苷酸间修饰，例如具有不带电荷的键(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和带负电荷的键(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或类似物)，以及带有带正电荷的键(例如氨基烷基磷酸酯、氨基烷基磷酸三酯)的那些，含有侧链部分的那些，例如蛋白质[包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚-L-赖氨酸等]、带有嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)的那些、含有螯合物(由例如金属、放射性金属、硼、氧化金属或类似物组成)的那些、含有烷基化剂的那些、具有修饰键的那些(例如，α异头核酸等)，以及未修饰形式的多核苷酸或寡核苷酸。
“启动子”是指足以指导可操作地连接的核酸分子转录的核酸序列。启动子可以与或不与其它转录控制元件(例如，增强子)一起使用，这些元件足以使启动子依赖性基因表达以细胞类型特异性、组织特异性或时间特异性方式可控，或可通过外部信号或代理诱导；此类元件可能位于基因的3'区域内或内含子内。理想地，启动子可操作地连接至核酸序列，例如，cDNA或基因序列，或效应RNA编码序列，以使得能够表达核酸序列，或启动子提供于一种表达盒，其中可以方便地插入选定的待转录核酸序列。在哺乳动物细胞中具有活性的调节元件(例如启动子)是指可配置为在已引入调节元件的哺乳动物细胞中导致每个细胞至少1个转录物的表达水平的调节元件。
“RNA干扰”是一种生物学过程，其中RNA分子通过中和靶向mRNA分子来抑制基因表达或翻译。历史上，RNAi有其它名称，包括共抑制、转录后基因沉默(PTGS)和抑制。微RNAs，包括人工microRNAs，通过RNA干扰抑制基因表达。
通常在特定条件下，术语“选择标记”是指一种多核苷酸片段或其表达产物，它允许人们选择或反对包含它的分子或细胞。这些标记可以编码活性，例如但不限于产生RNA、肽或蛋白质，或可以为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物提供结合位点。可选择标记的例子包括但不限于：(1)编码产物的DNA片段，这些产物提供对其它有毒化合物(例如抗生素)的抗性；(2)编码受体细胞中其它缺乏的产物的DNA片段(例如，tRNA基因、营养缺陷型标记物)；(3)编码抑制基因产物活性的产物的DNA片段；(4)编码易于识别的产物的DNA片段[例如，表型标记，如β-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)和细胞表面蛋白)]；(5)结合对细胞存活和/或功能在其它方面有害的产物的DNA片段；(6)在其它方面会抑制上述第1-5条中描述的任何DNA片段的活性的DNA片段(例如，反义寡核苷酸)；(7)结合修饰底物的产物的DNA片段(例如限制性核酸内切酶)；(8)可用于分离所需分子的DNA片段(例如特定的蛋白质结合位点)；(9)编码特定核苷酸序列的DNA片段，其在其它方面可能无功能(例如，用于分子亚群的PCR扩增)；和/或(10)DNA片段，当不存在时，直接或间接赋予对特定化合物的敏感性。
序列同一性可以通过使用算法比对序列来确定，例如BESTFIT、FASTA和TFASTA(在Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中)，使用默认间隙参数，或通过检查和最佳比对(即，在比较窗口中产生最高百分比的序列相似性)。序列同一性的百分比是通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中出现相同残基的位置数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以匹配和不匹配位置的总数，不计算比较窗口中的间隙(即窗口大小)，然后将结果乘以100得出序列同一性的百分比从而计算出来。除非另有说明，两个序列之间的比较窗口由两个序列中较短的整个长度定义。
“靶核酸”是将要插入转座子的核酸。这种靶可以是染色体、附加体或载体的一部分。
转座酶的“整合靶序列”或“靶序列”或“靶位点”是靶DNA分子中转座子可被转座酶插入的位点或序列。来自粉纹夜蛾的piggyBac转座酶主要将其转座子插入靶序列5'-TTAA-3'。PiggyBac转座子的其它可用靶序列是5'-CTAA-3',5'-TTAG-3',5'-ATAA-3',5'-TCAA-3',5'-AGTT-3',5'-ATTA-3',5'-GTTA-3',5'-TTGA-3',5'-TTTA-3',5'-TTAC-3',5'-ACTA-3',5'-AGGG-3',5'-CTAG-3',5'-GTAA-3',5'-AGGT-3',5'-ATCA-3',5'-CTCC-3',5'-TAAA-3',5'-TCTC-3',5'-TGAA-3',5'-AAAT-3',5'-AATC-3',5'-ACAA-3',5'-ACAT-3',5'-ACTC-3',5'-AGTG-3',5'-ATAG-3',5'-CAAA-3',5'-CACA-3',5'-CATA-3',5'-CCAG-3',5'-CCCA-3',5'-CGTA-3',5'-CTGA-3',5'-GTCC-3',5'-TAAG-3',5'-TCTA-3',5'-TGAG-3',5'-TGTT-3',5'-TTCA-3',5'-TTCT-3'和5'-TTTT-3'(Li et al.,2013.Proc.Natl.Acad.Scivol.110,no.6,E478-487)以及5’-TTAT。PiggyBac-like转座酶使用剪切和粘贴机制转座其转座子，这会导致其4碱基对靶序列在插入DNA分子时重复。因此，在整合的piggyBac-like转座子的每一侧都发现了靶序列。
术语“翻译”是指通过核糖体“读取”多核苷酸序列合成多肽的过程。
“转座酶”是一种多肽，其催化从供体多核苷酸(例如载体)中切除相应的转座子，并且(假设转座酶不是整合缺陷的)随后将转座子整合到靶核酸中。
术语“转座”在本文中用于表示转座酶在从一个多核苷酸中切下转座子，然后将其整合到同一多核苷酸的不同位点、或整合到第二个多核苷酸中的作用。
术语“转座子”是指可以从第一多核苷酸(例如载体)中切除并整合到同一多核苷酸的第二个位置或整合到第二多核苷酸中的多核苷酸，例如，细胞的基因组或染色体外DNA，通过相应的反式转座酶的作用。转座子包括第一转座子末端和第二转座子末端，它们是被转座酶识别并被转座的多核苷酸序列。转座子通常进一步包括位于两个转座子末端之间的第一多核苷酸序列，使得第一多核苷酸序列通过转座酶的作用与两个转座子末端一起转座。天然转座子中的第一多核苷酸通常包含编码相应转座酶的开放阅读框，该转座酶识别并转座转座子。本发明的转座子是包含异源多核苷酸序列的“合成转座子”，该序列由于其在两个转座子末端之间的并置而可转座。合成转座子可以或可以不进一步包含在转座子末端之外的侧翼多核苷酸序列，例如编码转座酶的序列、编码选择标记的载体序列或序列。
术语“转座子末端”是指足以被相应转座酶识别和转座的顺式作用核苷酸序列。piggyBac-like转座子的转座子末端包括完全或不完全的重复，使得两个转座子末端中的相应重复是彼此的反向互补。这些被称为反向末端重复(ITR)或末端反向重复(TIR)。转座子末端可能包括或不包括靠近ITR的促进或增强转座的附加序列。
术语“载体”或“DNA载体”或“基因转移载体”是指用于对另一多核苷酸执行“携带”功能的多核苷酸。例如，载体通常用于允许多核苷酸在活细胞内繁殖，或允许将多核苷酸包装以输送到细胞中，或允许将多核苷酸整合到细胞的基因组DNA中。载体可以进一步包括附加的功能元件，例如它可以包括转座子。
5.2可用于在培养的哺乳动物细胞中表达的遗传元件
5.2.1基因转移系统
基因转移系统包括要转移到宿主细胞的多核苷酸。所述基因转移系统可包括本文所述的任何转座子及其相应的转座酶。尽管转座子是首选的基因转移系统，因为它们的货物尺寸大，并且可以在不影响基因转移系统的包装和递送的情况下合并多个不同的开放阅读框及其所有相关的调控元件，但是用于递送抑制性基因转移多核苷酸的基因转移系统可包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸具有促进有效基因转移而不需要转座酶或转座子的其它特征，例如病毒系统，如慢病毒系统、腺病毒系统或腺相关病毒系统。
通过粒子轰击、电穿孔、显微注射等技术，将组分与含脂质囊泡[如阳离子脂质囊泡、DNA缩合试剂(如磷酸钙、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺)]结合，并将组分(即它的核酸)插入病毒载体并使病毒载体与细胞接触，基因转移系统的组分可以转染到一个或多个细胞中。在使用病毒载体情况下，病毒载体可包括本领域已知的多种病毒载体中的任一种，包括选自逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体的病毒载体。逆转录病毒载体可以是包括两个LTR的慢病毒载体，每个LTR与选自SEQ ID NOs:115-116的序列至少90％相同。腺相关病毒载体可包含两个ITR，每个ITR与选自SEQ ID NOs:1117-1123的序列至少90％相同。基因转移系统可以以本领域已知的合适方式制定，或制定为药物组合物或试剂盒。
如果异源多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中，则可以改善来自异源多核苷酸的基因在培养的哺乳动物细胞中表达的一致性。将多核苷酸整合到宿主细胞的基因组中通常也使其具有稳定的遗传性，方法是将其置于确保基因组DNA复制和分裂的相同机制中。这种稳定的可遗传性是在长生长期实现良好和一致表达所需要的。对于培养的哺乳动物细胞的稳定修饰，包括抑制性RNA(如miRNAs和amiRNAs)的一致表达，修饰的稳定性和表达水平的一致性很重要，特别是对于治疗应用。
5.2.2转座子元件
如果异源多核苷酸是转座子的一部分，则它们可以更有效地整合到靶基因组中，例如以便它们可以被转座酶整合。转座子的一个特殊好处是整合了转座子ITR之间的整个多核苷酸。这与随机整合形成对比，其中引入真核细胞的多核苷酸通常在细胞中随机断裂，并且只有部分多核苷酸整合到靶基因组中，通常以低频率。有几种不同类别的转座子。piggyBac-like转座子包括来自looper moth Trichoplusia ni的转座子,XenopuspiggyBac-like转座子,Bombyx piggyBac-like转座子,Heliothis piggyBac-like转座子,Helicoverpa piggyBac-like转座子,Agrotis piggyBac-like转座子,AmyeloispiggyBac-like转座子,piggyBat piggyBac-like转座子以及Oryzias piggyBac-like转座子。hAT转座子包括TcBuster。Mariner(水手)转座子包括Sleeping Beauty(睡美人)。这些转座子中的每一个都可以通过相应的转座酶整合到哺乳动物细胞的基因组中。掺入转座子的异源多核苷酸可以整合到培养的哺乳动物细胞以及肝细胞、神经细胞、肌肉细胞、血细胞、胚胎干细胞、体干细胞、造血细胞、胚胎、受精卵和精子细胞(其中一些可以在体外环境中进行操作)中。优选的细胞还可以是多能细胞(其后代可以分化为几种限制性细胞类型，例如造血干细胞或其它干细胞)或全能细胞(即，其后代可以成为生物体中任何细胞类型的细胞，例如，胚胎干细胞)。
包括含有抑制性RNA表达序列的抑制性多核苷酸的优选的基因转移系统，包含转座子与相应的转座酶蛋白组合，该转座酶蛋白转座所述转座子，或编码相应转座酶蛋白并可在靶细胞中表达的核酸。
当基因转移系统有多个组分时，例如一种或多种包含转座子末端的多核苷酸侧面有用于在靶细胞中表达的基因，和转座酶(其可以作为蛋白质提供或由核酸编码)，这些组分可以同时或顺序转染到细胞中。例如，转座酶蛋白或其编码核酸可以在相应转座子转染之前、同时或之后转染到细胞中。此外，所述基因转移系统的任一组分的施用可以重复发生，例如，通过施用至少两剂该组分。
转座酶蛋白可由包括RNA或DNA的多核苷酸编码。优选的RNA分子包括具有适当取代以减少对细胞的毒性作用的那些，例如用假尿苷取代尿苷，用5-甲基胞嘧啶取代胞嘧啶。可以制备编码转座酶的mRNA使其具有5'-帽子结构以提高在靶细胞中的表达。示例性帽子结构是帽子类似物[G(5')ppp(5')G]、抗反向帽子类似物[3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G、清洁帽子[m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG]，一个mCap[m7G(5')ppp(5')G]。可以制备编码转座酶的mRNA，使得一些碱基被部分或完全取代，例如尿苷可以被假尿苷取代，胞嘧啶可以被5-甲基-胞嘧啶取代。可以进行这些帽子和代替的任何组合。类似地，编码本发明转座酶蛋白或转座子的核酸可以以线性片段或环化片段、质粒或重组病毒DNA的形式转染到细胞中。如果转座酶作为编码转座酶的DNA序列引入，则编码转座酶的开放阅读框优选与在靶哺乳动物细胞中有活性的启动子可操作地连接。
用于修饰哺乳动物细胞基因组的有利的piggyBac-like转座子是Xenopus(非洲爪蟾)转座子，其包括具有SEQ ID NO：1004给出的序列的ITR、待转座的异源多核苷酸和具有由SEQ ID NO:1005给出的序列的第二个ITR。转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITR，远离异源多核苷酸。转座子可进一步包括与ITR紧邻且靠近异源多核苷酸的序列，该异源多核苷酸与异源多核苷酸一侧(优选左侧)上的SEQ ID NO:1000或1001具有至少95％同一性，以及与异源多核苷酸的另一侧(优选右侧)上的SEQ ID NO：1002或1003具有至少95％同一性的紧邻ITR并接近异源多核苷酸的序列。该转座子可以由相应的爪蟾(Xenopus)转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO:1049或1050给出的序列至少90％相同的序列，例如SEQ ID NOs:1049-1081中的任一个。优选地，转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。优选地，相对于SEQ ID NO:1049的序列，过度活跃变体转座酶包括一个或多个以下氨基酸变化：Y6L,Y6H,Y6V,Y6I,Y6C,Y6G,Y6A,Y6S,Y6F,Y6R,Y6P,Y6D,Y6N,S7G,S7V,S7D,E9W,E9D,E9E,M16E,M16N,M16D,M16S,M16Q,M16T,M16A,M16L,M16H,M16F,M16I,S18C,S18Y,S18M,S18L,S18Q,S18G,S18P,S18A,S18W,S18H,S18K,S18I,S18V,S19C,S19V,S19L,S19F,S19K,S19E,S19D,S19G,S19N,S19A,S19M,S19P,S19Y,S19R,S19T,S19Q,S20G,S20M,S20L,S20V,S20H,S20W,S20A,S20C,S20Q,S20D,S20F,S20N,S20R,E21N,E21W,E21G,E21Q,E21L,E21D,E21A,E21P,E21T,E21S,E21Y,E21V,E21F,E21M,E22C,E22H,E22R,E22L,E22K,E22S,E22G,E22M,E22V,E22Q,E22A,E22Y,E22W,E22D,E22T,F23Q,F23A,F23D,F23W,F23K,F23T,F23V,F23M,F23N,F23P,F23H,F23E,F23C,F23R,F23Y,S24L,S24W,S24H,S24V,S24P,S24I,S24F,S24K,S24Y,S24D,S24C,S24N,S24G,S24A,S26F,S26H,S26V,S26Q,S26Y,S26W,S28K,S28Y,S28C,S28M,S28L,S28H,S28T,S28Q,V31L,V31T,V31I,V31Q,V31K,A34L,A34E,L67A,L67T,L67M,L67V,L67C,L67H,L67E,L67Y,G73H,G73N,G73K,G73F,G73V,G73D,G73S,G73W,G73L,A76L,A76R,A76E,A76I,A76V,D77N,D77Q,D77Y,D77L,D77T,P88A,P88E,P88N,P88H,P88D,P88L,N91D,N91R,N91A,N91L,N91H,N91V,Y141I,Y141M,Y141Q,Y141S,Y141E,Y141W,Y141V,Y141F,Y141A,Y141C,Y141K,Y141L,Y141H,Y141R,N145C,N145M,N145A,N145Q,N145I,N145F,N145G,N145D,N145E,N145V,N145H,N145W,N145Y,N145L,N145R,N145S,P146V,P146T,P146W,P146C,P146Q,P146L,P146Y,P146K,P146N,P146F,P146E,P148M,P148R,P148V,P148F,P148T,P148C,P148Q,P148H,Y150W,Y150A,Y150F,Y150H,Y150S,Y150V,Y150C,Y150M,Y150N,Y150D,Y150E,Y150Q,Y150K,H157Y,H157F,H157T,H157S,H157W,A162L,A162V,A162C,A162K,A162T,A162G,A162M,A162S,A162I,A162Y,A162Q,A179T,A179K,A179S,A179V,A179R,L182V,L182I,L182Q,L182T,L182W,L182R,L182S,T189C,T189N,T189L,T189K,T189Q,T189V,T189A,T189W,T189Y,T189G,T189F,T189S,T189H,L192V,L192C,L192H,L192M,L192I,S193P,S193T,S193R,S193K,S193G,S193D,S193N,S193F,S193H,S193Q,S193Y,V196L,V196S,V196W,V196A,V196F,V196M,V196I,S198G,S198R,S198A,S198K,T200C,T200I,T200M,T200L,T200N,T200W,T200V,T200Q,T200Y,T200H,T200R,S202A,S202P,L210H,L210A,F212Y,F212N,F212M,F212C,F212A,N218V,N218R,N218T,N218C,N218G,N218I,N218P,N218D,N218E,A248S,A248L,A248H,A248C,A248N,A248I,A248Q,A248Y,A248M,A248D,L263V,L263A,L263M,L263R,L263D,Q270V,Q270K,Q270A,Q270C,Q270P,Q270L,Q270I,Q270E,Q270G,Q270Y,Q270N,Q270T,Q270W,Q270H,S294R,S294N,S294G,S294T,S294C,T297C,T297P,T297V,T297M,T297L,T297D,E304D,E304H,E304S,E304Q,E304C,S308R,S308G,L310R,L310I,L310V,L333M,L333W,L333F,Q336Y,Q336N,Q336M,Q336A,Q336T,Q336L,Q336I,Q336G,Q336F,Q336E,Q336V,Q336C,Q336H,A354V,A354W,A354D,A354C,A354R,A354E,A354K,A354H,A354G,C357Q,C357H,C357W,C357N,C357I,C357V,C357M,C357R,C357F,C357D,L358A,L358F,L358E,L358R,L358Q,L358V,L358H,L358C,L358M,L358Y,L358K,L358N,L358I,D359N,D359A,D359L,D359H,D359R,D359S,D359Q,D359E,D359M,L377V,L377I,V423N,V423P,V423T,V423F,V423H,V423C,V423S,V423G,V423A,V423R,V423L,P426L,P426K,P426Y,P426F,P426T,P426W,P426V,P426C,P426S,P426Q,P426H,P426N,K428R,K428Q,K428N,K428T,K428F,S434A,S434T,S438Q,S438A,S438M,T447S,T447A,T447C,T447Q,T447N,T447G,L450M,L450V,L450A,L450I,L450E,A462M,A462T,A462Y,A462F,A462K,A462R,A462Q,A462H,A462E,A462N,A462C,V467T,V467C,V467A,V467K,I469V,I469N,I472V,I472L,I472W,I472M,I472F,L476I,L476V,L476N,L476F,L476M,L476C,L476Q,P488E,P488H,P488K,P488Q,P488F,P488M,P488L,P488N,P488D,Q498V,Q498L,Q498G,Q498H,Q498T,Q498C,Q498E,Q498M,L502I,L502M,L502V,L502G,L502F,E517M,E517V,E517A,E517K,E517L,E517G,E517S,E517I,P520W,P520R,P520M,P520F,P520Q,P520V,P520G,P520D,P520K,P520Y,P520E,P520L,P520T,S521A,S521H,S521C,S521V,S521W,S521T,S521K,S521F,S521G,N523W,N523A,N523G,N523S,N523P,N523M,N523Q,N523L,N523K,N523D,N523H,N523F,N523C,I533M,I533V,I533T,I533S,I533F,I533G,I533E,D534E,D534Q,D534L,D534R,D534V,D534C,D534M,D534N,D534A,D534G,D534F,D534T,D534H,D534K,D534S,F576L,F576K,F576V,F576D,F576W,F576M,F576C,F576R,F576Q,F576A,F576Y,F576N,F576G,F576I,F576E,K577L,K577G,K577D,K577R,K577H,K577Y,K577I,K577E,K577V,K577N,I582V,I582K,I582R,I582M,I582G,I582N,I582E,I582A,I582Q,Y583L,Y583C,Y583F,Y583D,Y583Q,L587F,L587D,L587R,L587I,L587P,L587N,L587E,L587S,L587Y,L587M,L587Q,L587G,L587W,L587K或L587T。
用于修饰哺乳动物细胞基因组的有利的piggyBac-like转座子是Bombyx转座子，其包括具有SEQ ID NO：1010序列的ITR、待转座的异源多核苷酸和具有SEQ ID NO:1011序列的第二个ITR。转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITR，远离异源多核苷酸。转座子进一步可以包括与ITR紧邻并靠近异源多核苷酸的序列，该序列与异源多核苷酸一侧(优选左侧)的SEQ ID NO:1008具有至少95％的同一性，以及与ITR紧邻并靠近异源多核苷酸的序列，该序列与异源多核苷酸另一侧(优选右侧)的SEQ ID NO:1009至少95％相同。该转座子可以被相应的Bombyx转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO：1082至少90％相同的序列，例如SEQ ID NOs：1082-1104中的任一个。优选地，转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。优选地，相对于SEQ ID NO:1082的序列，过度活跃变体转座酶包含一个或多个以下氨基酸变化：Q85E,Q85M,Q85K,Q85H,Q85N,Q85T,Q85F,Q85L,Q92E,Q92A,Q92P,Q92N,Q92I,Q92Y,Q92H,Q92F,Q92R,Q92D,Q92M,Q92W,Q92C,Q92G,Q92L,Q92V,Q92T,V93P,V93K,V93M,V93F,V93W,V93L,V93A,V93I,V93Q,P96A,P96T,P96M,P96R,P96G,P96V,P96E,P96Q,P96C,F97Q,F97K,F97H,F97T,F97C,F97W,F97V,F97E,F97P,F97D,F97A,F97R,F97G,F97N,F97Y,H165E,H165G,H165Q,H165T,H165M,H165V,H165L,H165C,H165N,H165D,H165K,H165W,H165A,E178S,E178H,E178Y,E178F,E178C,E178A,E178Q,E178G,E178V,E178D,E178L,E178P,E178W,C189D,C189Y,C189I,C189W,C189T,C189K,C189M,C189F,C189P,C189Q,C189V,A196G,L200I,L200F,L200C,L200M,L200Y,A201Q,A201L,A201M,L203V,L203D,L203G,L203E,L203C,L203T,L203M,L203A,L203Y,N207G,N207A,L211G,L211M,L211C,L211T,L211V,L211A,W215Y,T217V,T217A,T217I,T217P,T217C,T217Q,T217M,T217F,T217D,T217K,G219S,G219A,G219C,G219H,G219Q,Q235C,Q235N,Q235H,Q235G,Q235W,Q235Y,Q235A,Q235T,Q235E,Q235M,Q235F,Q238C,Q238M,Q238H,Q238V,Q238L,Q238T,Q238I,R242Q,K246I,K253V,M258V,F261L,S263K,C271S,N303C,N303R,N303G,N303A,N303D,N303S,N303H,N303E,N303R,N303K,N303L,N303Q,I312F,I312C,I312A,I312L,I312T,I312V,I312G,I312M,F321H,F321R,F321N,F321Y,F321W,F321D,F321G,F321E,F321M,F321K,F321A,F321Q,V323I,V323L,V323T,V323M,V323A,V324N,V324A,V324C,V324I,V324L,V324T,V324K,V324Y,V324H,V324F,V324S,V324Q,V324M,V324G,A330K,A330V,A330P,A330S,A330C,A330T,A330L,Q333P,Q333T,Q333M,Q333H,Q333S,P337W,P337E,P337H,P337I,P337A,P337M,P337N,P337D,P337K,P337Q,P337G,P337S,P337C,P337L,P337V,F368Y,L373C,L373V,L373I,L373S,L373T,V389I,V389M,V389T,V389L,V389A,R394H,R394K,R394T,R394P,R394M,R394A,Q395P,Q395F,Q395E,Q395C,Q395V,Q395A,Q395H,Q395S,Q395Y,S399N,S399E,S399K,S399H,S399D,S399Y,S399G,S399Q,S399R,S399T,S399A,S399V,S399M,R402Y,R402K,R402D,R402F,R402G,R402N,R402E,R402M,R402S,R402Q,R402T,R402C,R402L,R402V,T403W,T403A,T403V,T403F,T403L,T403Y,T403N,T403G,T403C,T403I,T403S,T403M,T403Q,T403K,T403E,D404I,D404S,D404E,D404N,D404H,D404C,D404M,D404G,D404A,D404Q,D404L,D404P,D404V,D404W,D404F,N408F,N408I,N408A,N408E,N408M,N408S,N408D,N408Y,N408H,N408C,N408Q,N408V,N408W,N408L,N408P,N408K,S409H,S409Y,S409N,S409I,S409D,S409F,S409T,S409C,S409Q,N441F,N441R,N441M,N441G,N441C,N441D,N441L,N441A,N441V,N441W,G448W,G448Y,G448H,G448C,G448T,G448V,G448N,G448Q,E449A,E449P,E449T,E449L,E449H,E449G,E449C,E449I,V469T,V469A,V469H,V469C,V469L,L472K,L472Q,L472M,C473G,C473Q,C473T,C473I,C473M,R484H,R484K,T507R,T507D,T507S,T507G,T507K,T507I,T507M,T507E,T507C,T507L,T507V,G523Q,G523T,G523A,G523M,G523S,G523C,G523I,G523L,I527M,I527V,Y528N,Y528W,Y528M,Y528Q,Y528K,Y528V,Y528I,Y528G,Y528D,Y528A,Y528E,Y528R,Y543C,Y543W,Y543I,Y543M,Y543Q,Y543A,Y543R,Y543H,E549K,E549C,E549I,E549Q,E549A,E549H,E549C,E549M,E549S,E549F,E549L,K550R,K550M,K550Q,S556G,S556V,S556I,P557W,P557T,P557S,P557A,P557Q,P557K,P557D,P557G,P557N,P557L,P557V,H559K,H559S,H559C,H559I,H559W,V560F,V560P,V560I,V560H,V560Y,V560K,N561P,N561Q,N561G,N561A,V562Y,V562I,V562S,V562M,V567I,V567H,V567N,S583M,E601V,E601F,E601Q,E601W,E605R,E605W,E605K,E605M,E605P,E605Y,E605C,E605H,E605A,E605Q,E605S,E605V,E605I,E605G,D607V,D607Y,D607C,D607N,D607W,D607T,D607A,D607H,D607Q,D607E,D607L,D607K,D607G,S609R,S609W,S609H,S609V,S609Q,S609G,S609T,S609K,S609N,S609Y,L610T,L610I,L610K,L610G,L610A,L610W,L610D,L610Q,L610S,L610F或L610N。
用于修饰哺乳动物细胞基因组的有利的piggyBac-like转座子是piggyBat转座子，其包括具有SEQ ID NO：1016序列的ITR、待转座的异源多核苷酸和具有SEQ ID NO:1017序列的第二ITR。转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITR，远离异源多核苷酸。转座子进一步可以包括与ITR紧邻并靠近异源多核苷酸的序列，该序列与异源多核苷酸一侧(优选左侧)的SEQ ID NO:1018具有至少95％的同一性，以及与ITR紧邻并靠近异源多核苷酸的序列，该序列与异源多核苷酸另一侧(优选右侧)的SEQ ID NO:1019至少95％相同。该转座子可以被相应的piggyBat转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO:1046至少90％相同的序列。优选地，转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。优选地，相对于SEQ ID NO:1046的序列，过度活跃变体转座酶包括一个或多个以下氨基酸变化：A14V、D475G、P491Q、A561T、T546T、T300A、T294A、A520T、G239S、S5P、S8F、S54N、D9N、D9G、1345V、M481V、EI lG、K130T、G9G、R427H、S8P、S36G、DlOG、S36G。
用于修饰哺乳动物细胞基因组的有利的piggyBac-like转座子是piggyBac转座子，其包括具有SEQ ID NO：1014的序列的ITR、待转座的异源多核苷酸和具有SEQ ID NO:1015序列的第二ITR。转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITR，远离异源多核苷酸。转座子进一步可以包含与ITR紧邻并靠近异源多核苷酸的序列，该序列与异源多核苷酸一侧(优选左侧)的SEQ ID NO:1012具有至少95％的同一性，以及与ITR紧邻并靠近异源多核苷酸的序列，该序列与异源多核苷酸另一侧(优选右侧)的SEQ ID NO:1013至少95％相同。该转座子可以由包括与SEQ ID NO:1047至少90％相同的序列的相应piggyBac转座酶转座。优选地，转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。优选地，相对于SEQ ID NO:1047的序列，过度活跃变体转座酶包括一个或多个以下氨基酸变化：G2C,Q40R,I30V,G165S,T43A,S61R,S103P,S103T,M194V,R281G,M282V,G316E,I426V,Q497L,N505D,Q573L,S509G,N570S,N538K,Q591P,Q591R,F594L,M194V,I30V,S103P,G165S,M282V,S509G,N538K,N571S,C41T,A1424G,C1472A,G1681A,T150C,A351G,A279G,T1638C,A898G,A880G,G1558A,A687G,G715A,T13C,C23T,G161A,G25A,T1050C,A1356G,A26G,A1033G,A1441G,A32G,A389C,A32G,A389C,A32G,T1572A,G456A,T1641C,Tl 155C,G1280A,T22C,A106G,A29G,C137T,A14V,D475G,P491Q,A561T,T546T,T300A,T294A,A520T,G239S,S5P,S8F,S54N,D9N,D9G,1345V,M481V,E1lG,K130T,G9G,R427H,S8P,S36G,Dl0G,S36G,A51T,C153A,C277T,G201A,G202A,T236A,A103T,A104C,T140C,G138T,T118A,C74T,A179C,S3N,I30V,A46S,A46T,I82W,S103P,R119P,C125A,C125L,G165S,Y177K,Y177H,F180L,F180I,F180V,M185L,A187G,F200W,V207P,V209F,M226F,L235R,V240K,F241L,P243K,N258S,M282Q,L296W,L296Y,L296F,M298V,M298A,M298L,P311V,P311I,R315K,T319G,Y327R,Y328V,C340G,C340L,D421H,V436I,M456Y,L470F,S486K,M503I,M503L,V552K,A570T,Q591P,Q591R,R65A,R65E,R95A,R95E,R97A,R97E,R135A,R135E,R161A,R161E,R192A,R192E,R208A,R208E,K176A,K176E,K195A,K195E,S171E,M14V,D270N,I30V,G165S,M282L,M282I,M282V或M282A。
用于修饰培养的哺乳动物细胞的基因组的有利的piggyBac-like转座子是Amyelois转座子，其包括具有SEQ ID NO:1022序列的ITR、异源多核苷酸和具有SEQ ID NO:1023序列的第二ITR。转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITRs，远离异源多核苷酸。转座子进一步可包括与异源多核苷酸一侧的SEQ ID NO:1020至少95％相同的序列，和在异源多核苷酸的另一侧与SEQ ID NO:1021至少95％相同的序列。该转座子可以由相应的Amyelois转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO:1105至少90％相同的序列。优选地，转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。优选地，相对于SEQ ID NO:1105的序列，过度活跃变体转座酶包括一个或多个以下氨基酸变化：P65E,P65D,R95S,R95T,V100I,V100L,V100M,L115D,L115E,E116P,H121Q,H121N,K139E,K139D,T159N,T159Q,V166F,V166Y,V166W,G179N,G179Q,W187F,W187Y,P198R,P198K,L203R,L203K,I209L,I209V,I209M,N211R,N211K,E238D,L273I,L273V,L273M,D304K,D304R,I323L,I323M,I323V,Q329G,Q329R,Q329K,T345L,T345I,T345V,T345M,K362R,T366R,T366K,T380S,L408M,L408I,L408V,E413S,E413T,S416E,S416D,I426M,I426L,I426V,S435G,L458M,L458I,L458V,A472S,A472T,V475I,V475L,V475M,N483K,N483R,I491M,I491V,I491L,A529P,K540R,S560K,S560R,T562K,T562R,S563K,S563R。
用于修饰培养的哺乳动物细胞基因组的有利的piggyBac-like转座子是Heliothis转座子，其包括具有SEQ ID NO：1026序列的ITR、异源多核苷酸和具有SEQ IDNO：1027序列的第二ITR。转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITR，远离异源多核苷酸。转座子进一步可包括与异源多核苷酸一侧的SEQ ID NO:1024至少95％相同的序列，以及与异源多核苷酸另一侧的SEQ ID NO:1025至少95％相同的序列。该转座子可以通过相应的Heliothis转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO:1106至少90％相同的序列。优选地，转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。优选地，相对于SEQ IDNO:1106的序列，过度活跃变体转座酶包括一个或多个以下氨基酸变化：S41V,S41I,S41L,L43S,L43T,V81E,V81D,D83S,D83T,V85L,V85I,V85M,P125S,P125T,Q126S,Q126T,Q131R,Q131K,Q131T,Q131S,S136V,S136I,S136L,S136M,E140C,E140A,N151Q,K169E,K169D,N212S,I239L,I239V,I239M,H241N,H241Q,T268D,T268E,T297C,M300R,M300K,M305N,M305Q,L312I,C316A,C316M,L321V,L321M,N322T,N322S,P351G,H357R,H357K,H357D,H357E,K360Q,K360N,E379P,K397S,K397T,Y421F,Y421W,V450I,V450L,V450M,Y495F,Y495W,A447N,A447D,A449S,A449V,K476L,V492A,I500M,L585K和T595K。
用于修饰培养的哺乳动物细胞的基因组的有利的piggyBac-like转座子是Oryzias转座子，其包括具有SEQ ID NO:1030的序列的ITR、异源多核苷酸和具有SEQ IDNO:1031序列的第二ITR.转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITR，远离异源多核苷酸。转座子进一步可包括与异源多核苷酸一侧的SEQ ID NO:1028至少95％相同的序列，以及与异源多核苷酸另一侧的SEQ ID NO:1029至少95％相同的序列。该转座子可以通过相应的Oryzias转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO:1107至少90％相同的序列。优选地，所述转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。优选地，相对于SEQID NO:1107的序列，过度活跃变体转座酶包括一个或多个以下氨基酸变化：E22D,A124C,Q131D,Q131E,L138V,L138I,L138M,D160E,Y164F,Y164W,I167L,I167V,I167M,T202R,T202K,I206L,I206V,I206M,I210L,I210V,I210M,N214D,N214E,V253I,V253L,V253M,V258L,V258I,V258M,A284L,A284I,A284M,A284V,V386I,V386M,V386L,M400L,M400I,M400V,S408E,S408D,L409I,L409V,L409M,V458L,V458M,V458I,V467I,V467M,V467L,L468I,L468V,L468M,A514R,A514K,V515I,V515M,V515L,R548K,D549K,D549R,D550R,D550K,S551K和S551R。
用于修饰培养的哺乳动物细胞的基因组的有利的piggyBac-like转座子是Agrotis转座子，其包括具有SEQ ID NO:1036序列的ITR、异源多核苷酸和具有SEQ ID NO:1037序列的第二ITR.转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITR，远离异源多核苷酸。转座子进一步可包括与异源多核苷酸一侧的SEQ ID NO:1034至少95％相同的序列，以及与异源多核苷酸另一侧的SEQ ID NO:1035至少95％相同的序列。该转座子可以由相应的Agrotis转座酶转座，该Agrotis转座酶包括与SEQ ID NO:1108至少90％相同的序列。优选地，所述转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。
用于修饰培养的哺乳动物细胞的基因组的有利的piggyBac-like转座子是Helicoverpa转座子，其包括具有SEQ ID NO:1040序列的ITR、异源多核苷酸和具有SEQ IDNO:1041序列的第二ITR。转座子的两侧进一步可以是四核苷酸5'-TTAA-3'的拷贝，紧邻ITR，远离异源多核苷酸。转座子进一步可包括与异源多核苷酸一侧的SEQ ID NO:1038至少95％相同的序列，和在异源多核苷酸的另一侧与SEQ ID NO:1039至少95％相同的序列。该转座子可以由相应的Helicoverpa转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO:1109至少90％相同的序列。优选地，所述转座酶是天然存在的转座酶的过度活跃变体。
用于修饰哺乳动物细胞基因组的有利的Mariner转座子是Sleeping Beauty转座子，例如包括具有SEQ ID NO:1044序列的ITR、异源多核苷酸和以及具有SEQ ID NO:1045序列的第二ITR。用于修饰哺乳动物细胞基因组的有利的Mariner转座子包括与SEQ ID NO:1042具有至少90％序列同一性的第一转座子末端和与SEQ ID NO:1043具有至少90％序列同一性的第二转座子末端。该转座子可以由相应的Sleeping Beauty转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO：1048至少90％相同的序列，包括其过度活跃变体。
用于修饰哺乳动物细胞基因组的有利的hAT转座子是TcBuster转座子，例如包括具有SEQ ID NO：1112序列的ITR、异源多核苷酸和具有SEQ ID NO：1113序列的第二ITR的转座子。用于修饰哺乳动物细胞基因组的有利的hAT转座子包括与SEQ ID NO:1110具有至少90％序列同一性的第一转座子末端和与SEQ ID NO:1111具有至少90％序列同一性的第二转座子末端。该转座子可以由相应的TcBuster转座酶转座，该转座酶包括与SEQ ID NO:1114至少90％相同的序列，包括其过度活跃变体。
转座酶蛋白可以作为蛋白质或编码转座酶的核酸引入细胞，例如作为核糖核酸，包括mRNA或被细胞翻译机制识别的任何多核苷酸；作为DNA，例如作为染色体外DNA，包括游离DNA；作为质粒DNA，或作为病毒核酸。此外，编码转座酶蛋白的核酸可以作为核酸载体如质粒，或作为基因表达载体(包括病毒载体)转染到细胞中。核酸可以是环状或线性的。编码转座酶蛋白的DNA可以稳定插入细胞的基因组或用于组成型或诱导型表达的载体。在转座酶蛋白被转染到细胞中或作为DNA插入到载体中的情况下，转座酶编码序列优选与异源启动子可操作地连接。可以使用多种启动子，包括组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、物种特异性启动子、细胞类型特异性启动子等。特别考虑编码转座酶蛋白的所有DNA或RNA序列。或者，所述转座酶可以作为蛋白质直接引入细胞，例如使用细胞穿透肽(如Ramsey and Flynn,2015.Pharmacol.Ther.154:78-86"Cell-penetrating peptidestransport therapeutics into cells"中所描述的)；使用小分子，包括盐加propanebetaine(如Astolfo et.al.,2015.Cell 161:674-690中所描述的)；或电穿孔(如Morgan and Day,1995.Methods in Molecular Biology 48:63-71"The introduction ofproteins into mammalian cells by electroporation"中所描述的)。
5.2.3启动子元件
用于在培养的哺乳动物细胞中表达多肽的基因转移系统包括要转移至宿主细胞的多核苷酸。多核苷酸包括在培养的哺乳动物细胞中有活性的启动子，可操作地连接至待表达的异源序列。用于在哺乳动物细胞中表达amiRNA的有利的基因转移多核苷酸包括PolII启动子，例如来自任何哺乳动物或鸟类物种(包括人、大鼠、小鼠、鸡和中国仓鼠)的EF1a启动子，(例如选自SEQ ID NOS:894-915的序列)；来自人类、灵长类动物或啮齿动物细胞巨细胞病毒(CMV)的即时早期基因1、2或3的启动子(例如选自SEQ ID NOS:916-927的序列)；来自任何哺乳动物或鸟类物种的真核延伸因子2(EEF2)的启动子，包括人、大鼠、小鼠、鸡和中国仓鼠，(例如选自SEQ ID NOS:928-938的序列)；来自任何哺乳动物或酵母物种的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子(例如选自SEQ ID NOS:949-965的序列)，来自任何哺乳动物或鸟类物种的肌动蛋白启动子，包括人、大鼠、小鼠、鸡和中国仓鼠(例如选自SEQ IDNOS：939-948的序列)；来自任何哺乳动物或鸟类物种的PGK启动子，包括人、大鼠、小鼠、鸡和中国仓鼠(例如选自SEQ ID NOS：966-974或1188的序列)，或泛素启动子(例如SEQ IDNO:975)，或病毒启动子，例如HSV-TK启动子或与多发夹amiRNA序列可操作地连接的SV40启动子(例如选自SEQ ID NOS：976-982的序列)。或者，多发夹amiRNA序列可以与Pol III启动子如U6启动子(例如选自SEQ ID NOS:987-991的序列)或H1启动子(例如SEQ ID NO:992)可操作地连接。
5.2.4微RNA元件
小抑制性RNA(siRNA)已被用于通过RNA干扰降低哺乳动物培养细胞内某些基因的活性。siRNA可以在细胞中由编码短发夹RNA(shRNA)的核酸表达，该核酸与由RNA聚合酶III自然转录的启动子(“Pol III启动子”)可操作地连接。天然存在的shRNA也可以从与RNA聚合酶II天然转录的启动子(“Pol II启动子”)可操作地连接的核酸表达。Pol II启动子通常负责大多数蛋白质编码基因的转录。天然Pol II可表达的shRNA基因的产物称为microRNA(miRNA)。
靶向shRNA在哺乳动物细胞内的表达可以通过工程化天然miRNA来实现，用与要降低表达的靶mRNA互补的序列替换天然向导链序列，从而创建如miR-30 microRNA(Zenget.al.,2002.Both Natural and Designed Micro RNAs Technique Can Inhibit theExpression of Cognate mRNAs When Expressed in Human Cells.Molecular Cell:9,1327–1333)所述的人工miRNA(amiRNA)。
哺乳动物细胞中基因表达的减少可以通过使用amiRNA的RNA干扰来实现。由于任何单一抑制性RNA的功效有限，成功通常是有限的。已描述的提高RNA干扰功效的策略包括在分子内RNA双链体中掺入错配(Wu et.al.,2011.Improved siRNA/shRNA Functionalityby Mismatched Duplex.PLoS ONE 6(12):e28580.doi:10.1371/journal.pone.0028580；Myburgh et.al.,2014.Optimization of Critical Hairpin Features Allows miRNA-based Gene Knockdown Upon Single-copy Transduction.Molecular Therapy-NucleicAcids 3,e207；doi:10.1038/mtna.2014.58)，在amiRNA基因内插入间隔区，介于Pol II启动子和amiRNA发夹序列之间(Rousset et.al.,2019.Optimizing Synthetic miRNAMinigene Architecture for Efficient miRNA Hairpin Concatenation and Multi-target Gene Knockdown.Molecular Therapy-Nucleic Acids 14,351-363.)，和amiRNA发夹在amiRNA基因内的串联(Sun et al.,2006.Multi-miRNA hairpin method thatimproves gene knockdown efficiency and provides linked multi-geneknockdown.BioTechniques 41:59-63doi 10.2144/000112203)。
尽管包括多个拷贝的相同发夹的amiRNA基因已被证明比仅具有单个发夹拷贝的amiRNA基因更有效，即使在单个慢病毒载体中具有三个相同的发夹，也很难将靶基因的表达降低到低于正常水平的10％(Sun et al.,2006 ibid,Rousset et.al.,2019ibid)。包括多个amiRNA发夹的基因的另一个应用是同时抑制多个基因(Hu et.al.,2009.Construction of an Artificial MicroRNA Expression Vector forSimultaneous Inhibition of Multiple Genes in MammalianCells.Int.J.Mol.Sci.10,2158-2168；Choi et al,2015.Mol.Ther.23,310-320.“Multiplexing Seven miRNA-Based shRNAs to Suppress HIV Replication”)。
我们设计了包括多个不同发夹的amiRNA基因，而不是使用源自多个相同发夹的多个相同抑制性RNA靶向靶mRNA中的一个序列，每个发夹用于表达与同一靶mRNA内不同区域互补的不同抑制性RNA向导链。由于源自每个发夹的向导链序列针对基因的不同区域，因此它们本质上是独立的。此外，如果同一RNA转录本中包括多个发夹，则可改进发夹加工以产生RISC相关的向导链。此外，使用多个独立的向导链降低了不需要的脱靶效应的风险，因为没有必要以极高的水平表达任何单独的向导链。因此使用包括两个、三个、四个、五个或更多发夹的多核苷酸是有利的，这些发夹将在哺乳动物细胞内表达以产生两个、三个、四个、五个或更多不同的抑制性RNA向导链，每个向导链都与同一靶mRNA中的不同序列互补。当用于表达抑制性RNA向导链的多个发夹与同一启动子可操作地连接时，我们将它们称为多发夹amiRNA基因。优选地，当整合到哺乳动物细胞的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因的表达降低至低于哺乳动物细胞中靶基因的表达水平，该哺乳动物细胞基因组包含amiRNA基因，该基因包括用于表达单个抑制性RNA向导链的发夹。优选地，当整合到哺乳动物细胞群的基因组中时，多发夹amiRNA基因将群体内靶基因的平均表达水平降低至低于哺乳动物细胞群体中靶基因表达水平，该群体的基因组包括amiRNA基因，该基因包含用于表达单个发夹抑制性RNA向导链。优选地，当整合到哺乳动物细胞群体的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因的表达降低至自然水平的50％以下，其在所述群体中的比例大于在哺乳动物细胞群体中表达降低至50％以下的群体中的比例，该哺乳动物细胞群体的基因组包括amiRNA基因,该amiRNA基因包含用于表达单个抑制性RNA向导链的发夹。优选地，当整合到哺乳动物细胞群体的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因的表达降低至自然水平的40％以下，其在所述群体中的比例大于在哺乳动物细胞群体中表达降低至40％以下的群体中的比例，该哺乳动物细胞群体的基因组包括amiRNA基因,该amiRNA基因包含用于表达单个抑制性RNA向导链的发夹。优选地，当整合到哺乳动物细胞群体的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因的表达降低至自然水平的30％以下，其在所述群体中的比例大于在哺乳动物细胞群体中表达降低至30％以下的群体中的比例，该哺乳动物细胞群体的基因组包括amiRNA基因,该amiRNA基因包含用于表达单个抑制性RNA向导链的发夹。优选地，当整合到哺乳动物细胞群体的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因的表达降低至自然水平的20％以下，其在所述群体中的比例大于在哺乳动物细胞群体中表达降低至20％以下的群体中的比例，该哺乳动物细胞群体的基因组包括amiRNA基因,该amiRNA基因包含用于表达单个抑制性RNA向导链的发夹。优选地，当整合到哺乳动物细胞群体的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因的表达降低至自然水平的10％以下，其在所述群体中的比例大于在哺乳动物细胞群体中表达降低至10％以下的群体中的比例，该哺乳动物细胞群体的基因组包括amiRNA基因,该amiRNA基因包含用于表达单个抑制性RNA向导链的发夹。优选地，当整合到哺乳动物细胞群体的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因的表达降低至自然水平的5％以下，其在所述群体中的比例大于在哺乳动物细胞群体中表达降低至5％以下的群体中的比例，该哺乳动物细胞群体的基因组包括amiRNA基因,该amiRNA基因包含用于表达单个抑制性RNA向导链的发夹。
优选地,当整合到哺乳动物细胞的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因的表达降低至小于靶基因的自然表达水平的50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％。这种表达的降低可以直接检测为mRNA水平或蛋白质水平的降低，但也可以检测为靶基因负责的功能或活性的相应降低。例如，如果靶基因的产物是胞内蛋白，优选地，当整合到哺乳动物细胞的基因组中时，多发夹amiRNA基因将细胞内靶基因产物的活性降低至小于细胞内靶基因产物的天然活性的50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％。如果靶基因的产物是胞外蛋白，优选地，当整合到哺乳动物细胞的基因组中时，多发夹amiRNA基因使细胞分泌的靶基因产物的活性降低至小于从细胞分泌的靶基因产物的天然活性的50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％。如果靶基因的产物是跨膜蛋白，例如具有信号功能的受体蛋白，优选地，当整合到哺乳动物细胞的基因组中时，多发夹amiRNA基因将靶基因产物的信号转导降低到小于靶基因产物自然信号传导的50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％。如果靶基因的正常表达导致哺乳动物细胞产生的产物发生修饰，当多发夹amiRNA基因整合到哺乳动物细胞的基因组中时，靶基因的表达优选地被降低，使得由哺乳动物细胞制成的产物中，少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％被靶基因产物的作用修饰。如果靶基因的正常表达导致哺乳动物细胞产生的产物发生改变，当多发夹amiRNA基因被整合到哺乳动物细胞的基因组中时，优选地降低靶基因的表达，使得由靶基因表达导致的产品修饰程度，在不存在多发夹amiRNA基因的情况下，降低到小于产物将被修饰的程度的50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％。产品修饰包括哺乳动物细胞产生的蛋白质的蛋白水解切割、糖基化、或其它翻译后修饰。
amiRNA的向导链序列包含与靶基因的mRNA互补的19、20、21或22个碱基。向导链序列可以与mRNA的任何部分互补，优选与mRNA的3'UTR、mRNA的5'UTR、或mRNA的编码区互补。优选地，所述向导链序列的5'碱基是胸腺嘧啶(T)。amiRNA的过客链序列与向导链序列互补。如果过客链序列与向导链序列不完全互补，则对amiRNA的适当加工通常是有利的。如果过客链序列在与向导链序列的5'碱基互补的碱基处错配，通常会改进加工。图1A-B显示了示例性amiRNA发夹的一般示意图。优选地，所述过客链序列在对应于向导链序列的5'碱基(图1A-B中的碱基N1)的碱基处包含与向导链序列互补的错配。如果向导链序列的5'碱基是腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)，则过客链序列优选在相应的互补位置包含胞嘧啶(C)(图1A-B中的碱基N'1)。如果向导链序列的5'碱基是胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，则过客链序列优选在相应的互补位置包含腺嘌呤(A)。一个、两个或三个额外的错配可以作为错配碱基、插入或缺失并入过客链序列中。最有利的错配发生在过客链序列中，其在与向导链序列中的位置9、10、11、12或13(图1A-B中的碱基N9、N10、N11、N12和N13)互补的一个或多个相应位置处产生错配。最优选地，所述过客链序列在对应于向导链序列中位置12的碱基(图1A-B中的碱基N’12)处包含错配。amiRNA的向导链和过客链序列通常由5到35个核苷酸(图1A-B中的碱基L1-LZ)的非结构化环隔开。优选地，所述环包括源自天然存在的miRNA的序列，例如选自SEQ IDNO：683-692的序列。
用于抑制靶基因的优选基因转移多核苷酸(“抑制性多核苷酸”)包括多发夹amiRNA基因，该基因包含至少两个不同的amiRNA发夹序列，其向导链序列不同且各自与同一靶mRNA中的不同序列互补。所述多发夹amiRNA基因包括与靶mRNA互补的至少19、20、21或22个连续碱基的第一(向导链)序列和与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的至少19、20、21或22个碱基的第一(过客链)序列(即在19个碱基内，相对于第一向导链序列的相同反向互补，它包含不超过4个错配，包括突变、单碱基缺失或单碱基插入)。所述第一向导链序列和第一过客链序列相隔5至35个碱基。所述第一向导链序列、第一过客链序列和将它们分开的序列统称为第一发夹。所述多发夹amiRNA基因进一步包括与靶mRNA互补的至少19、20、21或22个连续碱基的第二(向导链)序列和与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的至少19、20、21或22个碱基的第二(过客链)序列(即在19个碱基内，相对于第二向导链序列的相同反向互补，它包含不超过4个错配，包括突变、单碱基缺失或单碱基插入)。所述第二向导链序列和第二过客链序列相隔5到35个碱基。所述第二向导链序列、第二过客链序列和将它们分开的序列统称为第二发夹。所述第一和第二向导链序列彼此不同但与相同的靶mRNA互补。
所述多发夹amiRNA基因进一步包括与靶mRNA互补的至少19、20、21或22个连续碱基的第三向导链序列和与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的至少19、20、21或22个碱基的第三过客链序列(即在19个碱基内，相对于第三向导链序列的相同反向互补，它包含不超过4个错配，包括突变、单碱基缺失或单碱基插入)。所述第三向导链序列和第三过客链序列相隔5到35个碱基。所述第三向导链序列、第三过客链序列和将它们分开的序列统称为第三发夹。所述第一、第二和第三向导链序列各自与相同靶mRNA的不同区域互补。
所述多发夹amiRNA基因进一步包括在哺乳动物细胞中有活性的启动子，优选地可由RNA聚合酶II或RNA聚合酶III转录。每个发夹都与启动子可操作地连接。优选地，所述启动子与发夹是异源的。它启动子由RNA聚合酶II转录，则抑制性多核苷酸进一步包含与启动子可操作地连接的间隔区多核苷酸是有利的：amiRNA发夹可以放置在间隔区多核苷酸的3'UTR，或者它们可以放置在由Pol II启动子转录的内含子中。所述间隔区多核苷酸可以包括编码可表达多肽的开放阅读框，或者它可以包括不编码可表达多肽的序列。优选地，所述间隔区多核苷酸包括50至3,000个核苷酸，更优选间隔区包括100至1,500个核苷酸。可选择地，所述间隔区包括要在哺乳动物细胞中表达的开放阅读框，例如嵌合抗原受体或选择标记。示例间隔区多核苷酸序列以SEQ ID NO：723-724给出。
每个发夹可以包括除向导链和过客链序列之外的序列以增强转录的RNA的茎环结构，以增加加工向导链并将其加载到RISC复合物中的机会。图2A-B显示了示例性多发夹amiRNA基因的示意图。可以将短序列(5到20个碱基之间)添加到向导-环-过客发夹的5'和3'以稳定它并改善RNA加载到RISC复合物的加工。这些在图2A-B中显示为元件A和E稳定发夹1和元件G和K稳定发夹2。例如，可以将具有SEQ ID NO:697的短序列添加到向导-环-过客发夹序列的5'侧，并且可以将具有SEQ ID NO:698的短序列添加到向导-环-过客发夹序列的3'侧以增强RNA发夹形成。可分别添加到向导-环-过客链序列的5'和3'以增强RNA发夹形成的替代示例性茎稳定序列对是SEQ ID NO:699和700，SEQ ID NO:701和702，SEQ ID NO：703和704，SEQ ID NO：705和706，SEQ ID NO：709和710，SEQ ID NO：711和712，SEQ ID NO：713和714，或5'具有序列5'-GTAGCAC-3'的附加茎和具有序列5'-TACTGC-3'的3'附加茎。这些茎序列源自侧翼有天然存在的miRNA中miRNA序列的向导-环-过客发夹部分的序列。也可以使用来自其它miRNA的相应序列。如图1A-B所示，尽管本文给出的大多数示例性序列在过客链序列之前具有向导链序列，但顺序可以是5'-向导-环-过客-3'，或者它可以是5'-过客-环-向导-3'。加载到RISC复合体中的序列不是由它们出现的顺序决定的。“向导-环-过客”旨在表示包括5'-向导-环-过客-3'或5'-过客-环-向导-3'结构中的这三个元件的序列。
在包括多个发夹的多核苷酸中在发夹之间提供一些分隔是有利的，以改进RNA的加工(参见例如图2A-B中的元件F)。分离发夹的顺序应该是相对非结构化的。可以掺入抑制性多核苷酸中发夹之间的示例性非结构化序列包括以SEQ ID NOs：715-722给出的序列。
向抑制性多核苷酸中的第一发夹的5'提供一些非结构化序列是有利的。可以掺入抑制性多核苷酸的第一发夹的5'的示例性非结构化序列包括以SEQ ID NOs:693-694给出的序列。在抑制性多核苷酸的最后一个发夹的3'提供一些非结构化序列是有利的。可以掺入抑制性多核苷酸最后一个发夹的3'的示例性非结构化序列包括以SEQ ID NOs:695-696给出的序列。
尽管人工miRNAs的一些序列元件源自天然存在的miRNAs，但本发明的每个人工miRNA中的向导、环和过客链序列的组合，或本发明的每个人工miRNA中的向导、环和过客链序列与5'和3'发夹稳定序列的组合，不是天然存在的miRNA序列。
图2A-B显示了多发夹amiRNA基因的示例性通用结构。它包括(i)启动子，可操作地连接到(ii)间隔区序列，优选为50至3,000个核苷酸；(iii)非结构化序列，可选地来自天然存在的miRNA的5'区域；(iv)第一发夹包含(a)第一5'茎序列(图2A-B，元件A)，其可以可选择地源自天然发生的miRNA的5'茎(但优选不是向导链或过客链序列)；(b)第一向导(或过客)链序列(图2A-B，元件B)；(c)第一环序列(图2A-B，元件C)；(d)第一过客(如果(b)中的序列是向导链序列)或向导(如果(b)中的序列是过客链序列)链序列(图2A-B，元件D)；(e)第一3'茎序列(图2A-B，元件E)，其可以可选择地源自天然存在的miRNA的3'茎(但优选不是向导链或过客链序列)，并且其中第一5'茎序列和第一3'茎序列增加了第一向导链序列和第一过客链序列形成的发夹的稳定性；(v)可选的非结构化序列将第一发夹与第二发夹分开(图2A-B，元件F)；(vi)包含(f)第二5'茎序列(图2A-B，元件G)的第二发夹，其可以可选择地源自天然发生的miRNA的5'茎(但优选不是向导链或过客链序列)；(g)第二向导(或过客)链序列(图2A-B，元件H)；(h)第二环序列(图2A-B，元件I)；(j)第二过客(如果(g)中的序列是向导链序列)或向导(如果(g)中的序列是过客链序列)链序列(图2A-B，元件J)；(k)第二3'茎序列(图2A-B，元件K)，其可以可选择地源自天然存在的miRNA的3'茎(但优选不是向导链或过客链序列)，并且其中第二5'茎序列和第二3'茎序列增加了由第二向导链序列和第二过客链序列形成的发夹的稳定性；并且其中所述第一向导链序列和第二向导链序列与哺乳动物内源细胞基因表达的相同靶mRNA互补，并且所述第一和第二向导链序列彼此不同。
所述抑制性多核苷酸可以掺入培养的哺乳动物细胞中，或者在瞬时载体上，在病毒载体上，例如腺病毒相关病毒载体(AAV载体)上，在慢病毒载体上，或在通过随机整合过程整合到细胞基因组中的载体上。包括多发夹amiRNA基因的抑制基因转移多核苷酸的拷贝数可以通过将其掺入转座子，然后使用相应的转座酶将转座子的多个拷贝插入哺乳动物细胞基因组中而增加，所述多发夹amiRNA基因整合到培养的哺乳动物细胞的基因组中。如第5.2.2节所述，有利的抑制基因转移多核苷酸包括两个转座子末端。
通过将转座子和相应的转座酶(如第5.2.2节所述)引入真核细胞，可将包括多发夹amiRNA基因(其两侧为转座子末端)的抑制基因转移多核苷酸稳定地整合到真核细胞的基因组中，作为转座酶蛋白质或作为编码转座酶的多核苷酸。可选择地，所述抑制基因转移多核苷酸还可包括选择标记，其可用于鉴定基因组包括抑制基因转移多核苷酸和多发夹amiRNA基因的细胞。还可以对这些细胞进行表型测试以确定靶mRNA表达降低的程度。在某些情况下，所述靶mRNA的抑制可能会导致可选择的表型。
尽管最好将两个或多个amiRNA发夹结合起来，以将与同一靶mRNA互补的向导表达到单个多核苷酸中，可以通过使用两个单独的抑制基因转移多核苷酸替代表达与同一靶mRNA的不同目标位点互补的两个或多个amiRNA向导，前提是这两个多核苷酸都整合到培养的哺乳动物细胞的基因组中。优选地，所述抑制基因转移多核苷酸包括转座子末端或慢病毒重复序列。基因组包含第一和第二amiRNA发夹的培养的哺乳动物细胞，其中所述第一和第二向导链序列与相同mRNA的第一和第二靶位点互补，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同也是本发明的一个方面。优选地，编码mRNA的靶基因的表达水平降低至低于靶基因在其基因组仅包括第一或第二amiRNA发夹的培养的哺乳动物对照细胞中的表达水平。
基因组包括抑制性多核苷酸的细胞，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该细胞由靶mRNA编码的基因的活性可能永久降低或消除。然后这样的细胞对于产生分子是有用的和有价值的，另外这些分子会由于靶mRNA的直接或间接作用而被修饰。此类产生的分子可能包括蛋白质、糖、代谢物和其它细胞产物。可以被抑制性多核苷酸修饰的哺乳动物细胞表型包括蛋白质的糖基化、蛋白质的细胞内运输、蛋白质的蛋白水解切割、为细胞生长提供特定营养的需求以及细胞在各种条件下生存的能力。可以通过抑制基因转移多核苷酸修饰的免疫细胞表型包括免疫细胞的增殖、存活、寿命、无反应性和衰竭。
5.2.5绝缘子元件
当异源多核苷酸整合到哺乳动物细胞的基因组中时，通常需要防止异源多核苷酸内的遗传元件影响内源免疫细胞基因的表达。类似地，通常需要防止异源多核苷酸中的基因受到免疫细胞基因组中元件的影响，例如通过掺入异染色质而沉默。已知绝缘子元件具有增强子阻断活性(有助于防止异源多核苷酸中的基因影响内源免疫细胞基因的表达)和屏障活性(有助于防止异源多核苷酸中的基因因掺入异染色质而被沉默)。增强子阻断活性可由转录阻遏物CTCF蛋白的结合产生。屏障活性可由脊椎动物屏障蛋白如USF1和VEZF1的结合引起。有用的绝缘子序列包括CTCF、USF1或VEZF1的结合位点。有利的基因转移系统包括多核苷酸，该多核苷酸包括含有CTCF、USF1或VEZF1的结合位点的绝缘子序列。更优选地，基因转移系统包括含有两个绝缘子序列的多核苷酸，每个绝缘子序列包含CTCF、USF1或VEZF1的结合位点，其中所述两个绝缘子序列侧接异源多核苷酸内的任何启动子或增强子。绝缘子序列的有利实例以SEQ ID NOs：993-999给出。
如果包括启动子或增强子的异源多核苷酸被整合到没有绝缘子序列的哺乳动物细胞的基因组中，存在异源多核苷酸内的启动子或增强子元件会影响内源性免疫细胞基因(例如癌基因)的表达的风险，或者异源多核苷酸内的启动子或增强子元件将通过掺入异染色质而沉默。当异源多核苷酸在随机片段化后整合到目标基因组中时，一些遗传元件通常会丢失，而另一些可能会重新排列。因此，如果异源多核苷酸包含侧接增强子和启动子元件的绝缘子元件，绝缘子元件可能会重新排列或丢失，并且增强子和启动子元件可能能够影响它们整合的基因组环境并受其影响。因此使用转座子基因转移系统是有利的，其中两个转座子ITR之间的整个序列被整合到免疫细胞基因组中，而没有重排。因此，用于整合到免疫细胞基因组中的有利基因转移系统包括转座子，其中元件按以下顺序排列：左转座子末端；第一绝缘子序列；用于在免疫细胞内表达的序列；第二绝缘子序列；右转座子末端。用于在免疫细胞内表达的序列可以包括与任意数量的开放阅读框可操作地连接的任意数量的调节序列。
5.2.6嵌合抗原受体元件
嵌合抗原受体(CAR)包括(细胞外)抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个(细胞内)共刺激/信号传递区域。
抗原结合域可源自特异性识别抗原的单链可变片段(scFv)。scFv通常源自抗体或T细胞受体的重链和轻链的可变域。
跨膜结构域可以源自跨膜蛋白。例子包括CD8、CD28、诱导性T细胞共刺激剂(ICOS)、DNAX辅助分子1(DNAM-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、信号淋巴细胞活化分子1(SLAM)-1，T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域1(TIM-1)，干扰素受体，如干扰素受体A1或A2，肿瘤坏死因子受体超家族的成员，如TNFRSF4(OX40)、TNFRSF5(CD40)、TNFRSF5(CD27)、TNFRSF11A(RANK)、TNFRSF13B(CD267)、TNFRSF9(4-1BB)、TNFRSF13C(CD268)、TNFRSF14(CD270)、TNFRSF17(CD269)、TNFRSF18(GITR)、TNFRSF3(CD18)、TNFRSF6(Fas)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF10A(死亡受体4)、TNFRSF10B(死亡受体5)、TNFRSF19(TROY)、TNFRSF21(DR6)、和TNFRSF25(DR3)。示例性跨膜结构域序列以SEQ ID NOs：1124-1150给出。
细胞内结构域可以包括来自对T细胞具有刺激作用的蛋白质的细胞内结构域的序列。例子包括CD28、诱导性T细胞共刺激剂(ICOS)、肿瘤坏死因子受体超家族的成员，例如TNFRSF4(OX40)、TNFRSF5(CD40)、TNFRSF11A(RANK)、TNFRSF13B(CD267)、TNFRSF9(4-1BB)、TNFRSF13C(CD268)、TNFRSF14(CD270)、TNFRSF17(CD269)、TNFRSF18(GITR)、DNAX辅助分子1(DNAM-1)、信号淋巴细胞活化分子1(SLAM-1)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白结构域1(TIM-1)和CD3 zeta结构域。示例性刺激结构域序列以SEQ ID NOs：1151-1172给出。
5.2.7包括基因转移多核苷酸的靶细胞的选择
如果基因转移多核苷酸包括编码选择标记的基因，则可以通过将靶细胞暴露于有利于表达选择标记的细胞的条件(“选择条件”)来鉴定其基因组包括稳定整合的基因转移多核苷酸的靶细胞。因此，基因转移多核苷酸包括编码选择标记的基因可能是有利的。
可以有利地掺入基因转移多核苷酸中的一类选择标记是通过允许细胞在有害物质如抗生素、酶抑制剂或细胞毒物[例如新霉素(由氨基糖苷类3'-磷酸转移酶赋予的耐药性，例如具有选自SEQ ID NOs:878-881的序列的多肽)、嘌呤霉素(嘌呤霉素乙酰转移酶赋予的耐药性，例如具有选自SEQ ID NOs:884-886的序列的多肽)、杀稻瘟菌素(由杀稻瘟素乙酰转移酶和杀稻瘟素脱氨酶赋予的抗性，例如具有由SEQ ID NO:887给出的序列的多肽)、潮霉素B(由潮霉素B磷酸转移酶赋予的抗性，例如具有选自SEQ ID NO:882-883的序列的多肽)和zeocin(由ble基因编码的结合蛋白赋予的抗性，例如具有由SEQ ID NO：875给出的序列的多肽)]存在下存活而为细胞提供生长优势的那些。
可以有利地掺入基因转移多核苷酸中的另一类选择标记是通过允许细胞合成代谢有用物质而为细胞提供生长优势的那些选择标记。这种选择标记的一个例子是谷氨酰胺合成酶(GS，例如具有选自SEQ ID NOs：888-892的序列的多肽)，其允许通过谷氨酰胺代谢进行选择。谷氨酰胺合酶是负责从谷氨酸盐和氨生物合成谷氨酰胺的酶，它是哺乳动物细胞中谷氨酰胺形成唯一途径的重要组成部分。在生长培养基中不存在谷氨酰胺的情况下，GS酶对于培养的哺乳动物细胞的存活至关重要。某些细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞，在不添加谷氨酰胺的情况下无法表达足够的GS酶来存活。在这些细胞中，转染的GS基因可以通过允许在不含谷氨酰胺的培养基中生长而起到选择标记的作用。在其它细胞系中，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达足够的GS酶，在没有外源性添加谷氨酰胺的情况下存活。这些细胞系可以通过包括CRISPR/Cas9在内的基因组编辑技术进行操作，以降低或消除GS酶的活性。在所有这些情况下，GS抑制剂如甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)可用于抑制细胞的内源性GS活性。选择方案包括引入包含编码第一多肽和谷氨酰胺合酶选择标记的序列的基因转移多核苷酸，然后用谷氨酰胺合酶抑制剂例如甲硫氨酸亚砜亚胺(methionine sulphoximine)处理细胞。使用的甲硫氨酸亚砜亚胺的水平越高，则需要越高的谷氨酰胺合成酶表达水平，以使细胞合成足够的谷氨酰胺以存活。这些细胞中的一些还将显示出第一多肽的表达增加。
优选地，所述GS基因可操作地连接至弱启动子或其它如本文所述的减弱表达的序列元件，使得只有当存在多个基因转移多核苷酸拷贝，或者它们被整合到基因组中发生高水平表达的位置时，才会发生高水平表达。在这种情况下，可能没有必要使用抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺：如果谷氨酰胺合成酶的表达减弱，那么简单地合成足够的谷氨酰胺用于细胞存活就可以提供足够严格的选择。
可以有利地掺入基因转移多核苷酸以通过允许细胞合成代谢有用物质为细胞提供生长优势的选择标记基因的另一个例子是编码二氢叶酸还原酶的基因(DHFR，例如具有选自SEQ ID NO:876-877的序列的多肽)，其是催化5,6-二氢叶酸(DHF)还原为5,6,7,8-四氢叶酸(THF)所必需的。如果不添加次黄嘌呤和胸苷(HT)，一些细胞系不会表达足够的DHFR来存活。在这些细胞中，转染的DHFR基因可以通过允许在不含次黄嘌呤和胸苷的培养基中生长而起到选择标记的作用。DHFR缺陷细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可以通过包括CRISPR/Cas9在内的基因组编辑技术产生，以降低或消除内源性DHRF酶的活性。DHFR赋予对甲氨蝶呤(MTX)的抗性。DHFR可被更高水平的甲氨蝶呤抑制。选择方案包括将包含编码第一多肽和DHFR选择标记的序列的构建体引入具有或不具有内源性DHFR基因的细胞中，然后用DHFR抑制剂例如甲氨蝶呤处理细胞。使用的甲氨蝶呤水平越高，细胞合成足够的DHFR以存活所需的DHFR表达水平就越高。这些细胞中的一些还将显示第一多肽的表达增加。优选地，所述DHFR基因与弱启动子或如上所述减弱表达的其它序列元件可操作地连接，使得只有当基因转移多核苷酸的多个拷贝存在，或者它们被整合到基因组中发生高水平表达的位置时，才会发生高水平表达。
另一类可选择标记包括那些可以通过视觉检测然后选择的标记，但它们不为细胞提供任何固有的生长优势。示例包括荧光或显色蛋白(例如编码GFP、RFP等的基因)，例如可以使用流式细胞术进行选择。其它不为细胞提供任何内在生长优势的选择标记包括编码跨膜蛋白的基因，这些基因可以结合第二个分子(蛋白质或小分子)，该分子可以被荧光标记，从而可以使用流式细胞术选择跨膜蛋白的存在。其它不为细胞提供任何内在生长优势的选择标记包括编码荧光素酶的基因。
可以从基因转移多核苷酸上编码的基因获得高水平的表达，这些基因整合在具有高度转录活性的基因组区域，或以多拷贝整合到基因组中，或以多拷贝存在于染色体外。将编码选择标记的基因可操作地连到导致来自基因转移多核苷酸的选择多肽的低水平表达的表达控制元件和/或提供更严格选择的使用条件通常是有利的。在这些条件下，为了使表达细胞产生足够水平的编码在基因转移多核苷酸上的可选择多肽以在选择条件下存活，基因转移多核苷酸必须存在于细胞基因组中有利于高水平表达的有利位置，或者必须存在足够高数量的基因转移多核苷酸，使得这些因素补偿了由于表达控制元件而可实现的低表达水平。
转座子的基因组整合，其中选择标记与仅弱表达标记的调控元件可操作地连接，通常需要通过转座酶将转座子插入到靶因组中。通过将选择标记与导致弱表达的元件可操作地连接，选择包含多个转座子拷贝或其中转座子整合在有利基因组位置以实现高表达的细胞。使用包含转座子和相应转座酶的基因转移系统增加了产生具有多个转座子拷贝的细胞的可能性，或者其中转座子整合在有利的基因组位置以进行高表达的可能性。当转座子包含与弱启动子可操作地连接的选择标记时，包含转座子和相应转座酶的基因转移系统因此特别有利。
要从基因转移多核苷酸表达的基因可作为选择标记包括在相同基因转移多核苷酸上，两个基因可操作地连接到不同的启动子。在这种情况下，可选择标记的低表达水平可以通过使用弱活性组成型启动子例如磷酸甘油激酶(PGK)启动子(例如选自SEQ ID NOS:966-974或1188的启动子)、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子(例如SEQ ID NO：977)、MC1启动子(例如SEQ ID NO：978)、泛素启动子(例如SEQ ID NO：975)来实现。可以有意构建其它弱活性启动子，例如通过截短减弱的启动子，例如来自猿猴病毒40(SV40)的截短启动子(例如SEQ ID NO:979-980)，或截短的HSV-TK启动子(例如SEQ ID NO:976或982)。
也可以通过使mRNA不稳定来降低选择标记的表达，例如通过将amiRNA发夹掺入选择标记的3'UTR。将多个miRNA发夹插入GFP基因的3'UTR可能会降低GFP的表达，即使miRNA不靶向GFP(Sun et al.,2006.Multi-miRNA hairpin method that improves geneknockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown.BioTechniques41:59-63doi10.2144/000112203)。这可能是因为miRNA加工去除了稳定的3'UTR结构，例如基因的polyA尾。因此，通过将miRNA发夹序列插入编码选择标记的基因的3'UTR中，可以有利地降低选择标记的表达水平，从而提高基因转移多核苷酸上编码的其它基因的生产力。在第6.1.2.1和6.1.2.2节中显示了一个例子，其中在编码代谢酶的基因的3'UTR中包含amiRNA发夹增加了在同一基因转移多核苷酸上编码的另一个基因的产量。与包括单个amiRNA发夹相比，包括2或3个amiRNA发夹导致在基因转移多核苷酸上编码的其它基因的表达水平显著更高。两个和三个发夹在抑制它们的靶基因方面也更有效。有利的基因转移多核苷酸包括编码与Pol II启动子可操作地连接的选择标记的基因，并且进一步包含在选择标记的3'UTR中的第一和第二amiRNA发夹。优选地，所述第一amiRNA发夹包括与mRNA靶标互补的至少19、20、21或22个连续碱基的第一向导链序列，并且所述第二amiRNA发夹包括与所述第一向导链序列相同的mRNA靶标内的不同序列互补的至少19、20、21或22个连续碱基的第二向导链序列。优选地，所述第一向导链序列不同于所述第二向导链序列。可选择地，所述基因转移多核苷酸在选择标记的3'UTR中包含第三个amiRNA发夹，其中第三个amiRNA发夹包含与同一mRNA靶标内的不同序列互补的至少19、20、21或22个连续碱基的第三向导链序列，并且其中所述第三向导链序列不同于所述第一和第二向导链序列。优选地，所述选择标记为细胞提供生长优势，例如通过允许细胞合成代谢有用的物质，或在有害物质如抗生素、酶抑制剂或细胞毒物的存在下存活。优选地，所述选择标记不同于荧光蛋白、显色蛋白、或催化荧光或显色反应且不直接有益于细胞的蛋白质。
有利的选择标记基因包括编码多肽的开放阅读框，该多肽的序列与选自SEQ IDNOs:875-892的序列至少90％相同，该开放阅读框可操作地连接至弱启动子，例如选自SEQID NOs:966-982的序列。可选择地，在启动子和谷氨酰胺合成酶开放阅读框之间存在衰减的5'UTR，例如选自SEQ ID NOs:983-986的序列。选择标记基因的3'UTR包括位于开放阅读框和多聚腺苷酸化序列之间的多发夹amiRNA序列。优选地，所述选择标记基因是转座子的一部分，可被相应的转座酶转座。
与非转座子结构相比，将转座子和转座酶与弱表达的选择标记结合使用具有若干优点。一个是选择标记的表达与转座子上的其它基因之间的联系非常高，因为转座酶会将位于两个转座子末端之间的整个序列整合到基因组中。相反，当异源DNA被引入真核细胞(例如哺乳动物细胞)的细胞核时，它会逐渐分解成随机片段，这些片段可能整合到细胞的基因组中或被降解。因此，如果将包括待表达序列和选择标记的基因转移多核苷酸引入细胞群，一些细胞将整合编码选择标记的序列，但不整合编码其它待表达序列的序列，反之亦然。在这些情况下，选择表达高水平选择标记的细胞因此仅与也表达高水平其它待表达基因的细胞有一定的相关性。相反，由于转座酶整合了转座子末端之间的所有序列，表达高水平选择标记的细胞也极有可能表达高水平的其它待表达基因。
转座子和转座酶的第二个优势是它们在将DNA序列整合到基因组中的效率更高。因此，细胞群体的更高部分可能将基因转移多核苷酸的一个或多个拷贝整合到它们的基因组中，所以选择标记和第一多肽两者良好表达的可能性相应更高。
piggyBac-like转座子和转座酶的第三个优点是piggyBac-like转座酶倾向于将其相应的转座子插入具有转录活性的染色质中。因此，每个细胞都可能将基因转移多核苷酸整合到基因组中基因良好表达的区域中，所以选择标记和第一多肽两者良好表达的可能性相应更高。
5.3用于抑制分泌蛋白岩藻糖基化的微RNA
抗体的岩藻糖基化抑制抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。因此，已经尝试使用RNA干扰来减少培养的哺乳动物细胞中的核心岩藻糖基化，包括通过靶向岩藻糖基转移酶8(FUT8)，该酶催化α1,6-连接的岩藻糖转移到N-连接聚糖中的第一个N-乙酰氨基葡萄糖。与在没有siRNA的情况下只有10％被去岩藻糖基化(afucosylated)相比较，Mori等鉴定了两种针对FUT8的siRNA，它们导致60％的分泌抗体被去岩藻糖基化(Mori et.al.,2004.Engineering Chinese hamster ovary cells to maximize effector function ofproduced antibodies using FUT8 siRNA.Biotechnol Bioeng.88:901-8.)。Beuger等鉴定出一种靶向FUT8的shRNA，可产生高达88％的去岩藻糖基化抗体(Beuger et.al.,2009.Short-hairpin-RNA-mediated silencing of fucosyltransferase 8in Chinese-hamster ovary cells for the production of antibodies with enhanced antibodyimmune effector function.Biotechnol Appl Biochem.53:31-7)。美国专利6946292、7737325、7749753、7846725和8003781描述了抑制岩藻糖基化途径中一种或多种基因的策略，包括GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)、α-(1,6)-岩藻糖基转移酶和使用RNA干扰的GDP-岩藻糖转运蛋白1(GFT)。Imai-Nishiya等设计了一对靶向FUT8和GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)的siRNA分子，如果培养基中不存在岩藻糖，则这对siRNA分子能够完全消除岩藻糖基化(Imai-Nishiya et.al.,2007.Double knockdown ofα1,6-fucosyltransferase(FUT8)and GDP-mannose 4,6-dehydratase(GMD)in antibody-producing cells:a newstrategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies withenhanced ADCC.BMC Biotechnology 2007,7:84)。然而，岩藻糖的存在损害了敲除这两个基因的协同效应。还鉴定了靶向FUT8的天然microRNA，包括miR-122和miR-34a(BernardiC.et.al.,2013.Effects of MicroRNAs on Fucosyltransferase 8(FUT8)Expression inHepatocarcinoma Cells.PLoS ONE 8(10):e76540.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0076540)，尽管这些microRNA的影响不大。
在上面给出的许多RNA干扰示例中，通过用岩藻糖特异性凝集素(例如Lensculinaris凝集素)处理细胞来选择具有高水平去岩藻糖基化的细胞，该凝集素会杀死具有岩藻糖基化表面分子的细胞。这是因为任何单个siRNA序列的有效性都低于100％，并且当将表达siRNA的基因引入细胞时，表达水平的变化会导致细胞间的显著差异。为了克服这些限制，我们设计了包括一个、两个或三个向导链序列的多发夹amiRNA基因，这些序列与同一mRNA靶标(FUT8的mRNA)内的不同序列互补。我们还使用了piggyBac-like的转座子载体来确保amiRNA基因被整合到基因组的转录活性区域。
第6.1.1节(包括第6.1.1.1、6.1.1.2和6.1.1.3节)中描述的例子表明，将包括多发夹amiRNAs的转座子整合到CHO基因组中，该多发夹amiRNAs具有与CHO FUT8的3'UTR互补的向导链序列，导致细胞产生的抗体完全缺乏岩藻糖(通过高灵敏度质谱检测)。与之前报道的方法相比，不需要随后的基于凝集素的选择来杀死仍在产生岩藻糖基化蛋白的细胞。选择细胞仅用于将包括多发夹amiRNA基因的转座子整合到基因组中。通过结合多条向导链序列针对同一靶标mRNA内的多个不同序列的有效性，以高效的转座酶催化转座子整合到哺乳动物基因组中，结果是消除了整个细胞群中可检测的靶酶表达，无需进一步的选择步骤。这些实施例中使用的每个多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:1互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，和含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。每个多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:1互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。每个多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:1互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，和含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此均不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相距5到35个碱基。对于多发夹amiRNASEQ ID NOs 724和726，每个向导链序列与其各自的过客链序列通过包含SEQ ID NO:683的序列分开。对于多发夹amiRNASEQ ID NO 727，每个向导链序列与其各自的过客链序列通过包含SEQ ID NO：684的序列分开。
用于抑制仓鼠细胞岩藻糖基化的有利基因转移多核苷酸包括抑制FUT8的多发夹amiRNA序列。FUT8抑制性多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:1互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，和含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。FUT8抑制性多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:1互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。FUT8抑制性多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:1互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，和含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO:683-692的序列。用于抑制仓鼠FUT8的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：75和379、SEQ ID NOs：76和380、SEQ ID NOs：77和381、SEQ ID NOs：78和382、SEQ ID NOs：79和SEQ ID NOs：383，以及80和384。
用于抑制仓鼠细胞岩藻糖基化的有利基因转移多核苷酸包括抑制GMD的多发夹amiRNA序列。GMD抑制性多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:3互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，和含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。GMD抑制性多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:3互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。GMD抑制性多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:3互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，和含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO:683-692的序列。用于抑制仓鼠GMD的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs:87和391、SEQ ID NOs:88和392、SEQ ID NOs:89和393、SEQ ID NOs:90和394、SEQ ID NOs：91和395，以及SEQ ID NO：92和396。
用于抑制仓鼠细胞中岩藻糖基化的有利基因转移多核苷酸包括抑制GFT的多发夹amiRNA序列。GFT抑制性多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:5互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，和含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。GFT抑制性多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:5互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。GFT抑制性多发夹amiRNA序列可选择地包括含有与SEQ ID NO:5互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，和含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包含选自序列SEQ ID NO:683-692的序列。用于抑制仓鼠GFT的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs:93和397、SEQ ID NOs:94和398、SEQID NOs:95和399、SEQ ID NOs:96和400、SEQ ID NOs：97和401，以及SEQ ID NO：98和402。
用于抑制仓鼠细胞岩藻糖基化的有利抑制性多核苷酸包括含有与天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列至少78％互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列，其中所述第一向导链和第一过客链序列相隔5至35个核苷酸，以及含有与第一向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列和含有与第二向导链序列至少78％互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，其中所述第二向导链和第二过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中第一和第二向导链序列彼此不同，并且其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ ID NO:1-6的序列至少98％相同、或至少99％相同、或完全相同的序列。用于抑制仓鼠细胞中岩藻糖基化的示例性多发夹amiRNA包括SEQ ID NOs：725-733。
用于抑制人细胞中岩藻糖基化的有利基因转移多核苷酸包括抑制FUT8的多发夹amiRNA序列。FUT8抑制性多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:7互补的连续19或20或21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，和含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19或20或21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。FUT8抑制性多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:7互补的连续19或20或21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19或20或21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。FUT8抑制性多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:7互补的连续19或20或21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，和含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19或20或21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO:683-692的序列。用于抑制人FUT8的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：81和385、SEQ ID NOs：82和386、SEQ ID NOs：83和387、SEQ ID NOs：84和388、SEQ ID NOs：85和389，以及SEQ ID NOs：86和390。
用于抑制人细胞中岩藻糖基化的有利的基因转移多核苷酸包括抑制GMD的多发夹amiRNA序列。GMD抑制性多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:8互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，和含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。GMD抑制性多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:8互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。GMD抑制性多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:8互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，和含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO:683-692的序列。用于抑制仓鼠GMD的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：99和403、SEQ ID NOs：100和404，以及SEQ ID NOs：101和405。
用于抑制仓鼠细胞中岩藻糖基化的有利基因转移多核苷酸包括抑制GFT的多发夹amiRNA序列。GFT抑制性多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:9互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，和含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。GFT抑制性多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:9互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。GFT抑制性多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:9互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，和含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO:683-692的序列。用于抑制仓鼠GFT的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：102和406、SEQ ID NOs：103和407，以及SEQ ID NOs：104和408。
用于抑制人细胞岩藻糖基化的有利抑制性多核苷酸包括含有与天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列至少78％互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列，其中所述第一向导链和第一过客链序列相隔5至35个核苷酸，以及含有与第一向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列至少78％互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，其中所述第二向导链和第二过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同，并且其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ ID NO:7-9的序列至少98％相同、或至少99％相同、或完全相同的序列。用于抑制人细胞中岩藻糖基化的示例性多发夹amiRNA包括SEQ ID NOs：734-736。
5.4用于调节分泌蛋白的细胞内运输的微RNA
有几种途径将蛋白质运输到溶酶体。当培养的哺乳动物细胞被用来异源地产生一种通常被输送到溶酶体的蛋白质时，将异源蛋白质运输到溶酶体会与其分泌物竞争，并且还有堵塞溶酶体和损害培养的哺乳动物细胞的健康(和生产力)的风险。两种已被证明参与将蛋白质运输到溶酶体的蛋白质是sortilin和prosaposin。通过多发夹amiRNA抑制这两种蛋白质的表达可以调节蛋白质向溶酶体的运输。
用于调节仓鼠细胞中细胞内蛋白质运输的有利的基因转移多核苷酸包括抑制prosaposin的多发夹amiRNA序列。抑制prosaposin的多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ IDNO:10互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。抑制prosaposin的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:10互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，以及含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。抑制prosaposin的多发夹amiRNA序列包括可以可选择地含有与SEQID NO:10互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，以及含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO：683-692的序列。用于抑制仓鼠prosaposin的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：105和409、SEQ ID NOs：106和410，以及SEQ ID NOs：107和411。
用于调节仓鼠细胞中细胞内蛋白质运输的有利基因转移多核苷酸包括抑制sortilin的多发夹amiRNA序列。抑制sortilin的多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:11互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。抑制sortilin的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:11互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，以及含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。抑制sortilin的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:11互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，以及含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQID NO：683-692的序列。用于抑制仓鼠sortilin的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：108和412、SEQ ID NOs：109和413，以及SEQ ID NOs：110和414。
用于调节仓鼠细胞内蛋白质运输的有利抑制性多核苷酸包括含有与天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列至少78％互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列，其中所述第一向导链和第一过客链序列相隔5至35个核苷酸，以及含有与第一向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，和含有与第二向导链序列至少78％互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，其中所述第二向导链和第二过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同，并且其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ ID NOs:10和11的序列至少98％相同、或至少99％相同、或完全相同的序列。用于调节仓鼠细胞中细胞内蛋白质运输的示例性多发夹amiRNA包括选自SEQ ID NOs：737-739的序列。
5.5用于调节分泌蛋白的蛋白水解切割的微RNA
哺乳动物培养细胞产生多种蛋白酶。其中一些可能会对细胞产生的异源蛋白质产生不利影响。中国仓鼠细胞产生的蛋白酶的实例包括羧肽酶，例如具有与SEQ ID NOs：12-20给出的序列至少98％相同、或至少99％相同、或相同的mRNA序列的那些。
用于减少仓鼠细胞中异源产生的蛋白质的蛋白水解加工的有利基因转移多核苷酸包含抑制羧肽酶的多发夹amiRNA序列。抑制羧肽酶的多发夹amiRNA序列包括包含与选自SEQ ID NO:12-20的序列互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及包含与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。抑制羧肽酶的多发夹amiRNA序列进一步包括第二向导链序列，该第二向导链序列包含与第一向导链序列相同的mRNA互补的连续的19、20、21或22个核苷酸序列，以及包含与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。抑制羧肽酶的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括第三向导链序列，该第三向导链序列包含与第一和第二向导链序列相同的mRNA互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列，以及包含与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。
已鉴定羧肽酶D负责从抗体重链中去除C端赖氨酸(Hu et al,2016.Biotechnol.Bioeng.113,2100-6“Carboxypeptidase D is the Only EnzymeResponsible for Antibody C-Terminal Lysine Cleavage in Chinese Hamster Ovary(CHO)Cells”)。用于抑制仓鼠细胞中羧肽酶D的有利基因转移多核苷酸包括抑制羧肽酶D的多发夹amiRNA序列。抑制羧肽酶D的多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:17互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。抑制羧肽酶D的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:17互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，以及含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。抑制羧肽酶D的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:17互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，以及含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO：683-692的序列。用于抑制仓鼠羧肽酶D的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQID NOs：111和415、SEQ ID NOs：112和416、SEQ ID NOs：113和417、SEQ ID NOs：1173和1174、SEQ ID NOs：1175和1176，SEQ ID NOs：1177和1178。用于抑制仓鼠细胞中羧肽酶D的示例性多发夹amiRNA包括SEQ ID NOs:740和1179。
5.6谷氨酰氨合成酶
破坏通常为细胞提供生长、分裂或存活所必需的蛋白质的天然哺乳动物基因，例如编码必需代谢酶的基因，可以提供开发代谢选择系统的机会。一些示例性代谢选择系统在第5.2.7节中描述。通常，这是通过永久性不可逆破坏编码必需代谢酶的基因来实现的，其可以使用靶向破坏方法(例如锌指核酸酶、TALE效应核酸酶、CRISPR Cas9定向核酸酶和AAV定向核酸酶)或随机方法，例如辐射或其它随机诱变细胞，随后鉴定其中编码必需代谢酶的基因被破坏的细胞。如果外源地提供一种酶、生长因子、营养素或其它分子以补偿缺失的必需代谢酶产物的缺乏，则必需代谢基因表达被破坏的细胞可以在缺少该必需基因的情况下存活、生长和分裂。然后，基本代谢基因的表达已被破坏的细胞可被用作随后引入表达多核苷酸的宿主，所述表达多核苷酸包括可选择标记，其功能是补充或补偿基本代谢基因功能的缺失，以及要在细胞中表达的一个或多个其它基因。然后将这些细胞置于去除酶、生长因子、营养物或其它允许细胞生长的分子的条件下。只有吸收了包含编码互补选择标记的基因的表达多核苷酸的细胞才能存活。先前描述的例子包括CRISPR破坏人类培养细胞中谷氨酰胺合成酶基因(Yu et al,2018.Biotechnol Bioeng.115:1367-1372.“Glutaminesynthetase gene knockout-human embryonic kidney 293E cells for stableproduction of monoclonal antibodies.”)，CHO细胞中谷氨酰胺合成酶的锌指破坏(Fanet al 2012.Biotechnol Bioeng.109:1007-15.“Improving the efficiency of CHOcell line generation using glutamine synthetase gene knockout cells.”)，哺乳动物细胞中DHFR基因的锌指破坏(Santiago et al 2008.Proc Natl Acad Sci U S A.105:5809–5814.“Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineeredzinc-finger nucleases”)，以及通过照射删除CHO细胞中的DHFR(Urlaub et al,1983.Cell.33:405-12.“Deletion of the diploid dihydrofolate reductase locusfrom cultured mammalian cells.”)。
基因序列的永久破坏是以前用来抑制必需代谢酶表达的方法，因为为了提供适当的选择压力，必需代谢酶的表达必须降低到低于允许细胞生长的水平。也必须没有“泄漏”：如果一些细胞能够恢复表达必需的代谢酶，那么它们将在不存在包含互补选择标记的表达多核苷酸的情况下生长，这将创建一个细胞背景，该细胞不表达在表达多核苷酸上编码的待表达基因。RNA干扰在抑制必需代谢基因的表达方面通常不够有效，也不够稳定以确保持续抑制必需代谢基因的表达。然而，RNA干扰方法的好处是它可以非常快速地实施，并且它可以同时抑制二倍体或多倍体细胞中基因的所有拷贝，而不必独立确定每个基因组拷贝已被突变灭活。此外，如第6.1.3节中的示例所示，一种方法包括引入多发夹amiRNA基因以抑制必需代谢基因进入细胞池的基因组，以及选择其基因组包含多发夹amiRNA基因的细胞，可导致一个细胞池，其中基本代谢酶的表达被抑制到阻止池中70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％以上细胞生长的水平。这与诸如锌指核酸酶、TAL效应核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas9核酸酶或AAV等定向切割方法形成对比。如果这些方法可以使1％到10％的转染细胞中的靶基因发生突变和失活，则这些方法被认为是有效的。因此，多发夹amiRNA方法的效率至少比这些基于核酸酶的基因破坏技术高10倍。
多发夹amiRNA基因可以整合到哺乳动物细胞的基因组中，以抑制天然哺乳动物基因，该基因通常为细胞提供生长必需的蛋白质(包括生存和分裂)。所述多发夹amiRNA可以放置在第二个基因的3'UTR中，以便在细胞内表达。优选地，该基因编码必需代谢酶，使得细胞在没有该必需基因的情况下不能生长，除非外源性地提供酶、生长因子、营养物或其它分子(我们将此称为外源性地提供的补体因子)。细胞通常会在细胞内储存各种营养物质，因此如果细胞在去除外源性提供的补体因子后只能分裂1、2、3或4次，则认为细胞不会生长。因此，在去除外源性提供的补充因子后，必需代谢酶的表达已被成功抑制的细胞群将其活细胞密度增加不超过2倍、4倍、8倍或16倍。优选地，必需代谢酶的表达被抑制，使得低于50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％或1％的天然酶活性保留在细胞中。这种蛋白质的实例包括参与氨基酸合成的必需代谢酶、参与氨基酸前体合成的必需代谢酶、参与核苷酸合成的必需代谢酶、参与核苷酸前体合成的必需代谢酶、参与脂肪酸合成的必需代谢酶和参与维生素合成的必需代谢酶。如果多发夹amiRNA基因稳定整合到哺乳动物细胞基因组中，并稳定表达，则必需代谢酶被稳定抑制(不存在第二补偿基因)。然后可以将补充或补偿被抑制的必需代谢酶的第二个基因用作哺乳动物细胞中的选择标记。所述第二基因可能编码另一种版本的被抑制的必需代谢酶，该酶对多发夹amiRNA的抑制具有抗性，例如，通过在必需代谢酶的mRNA和由多发夹amiRNA基因编码的向导链序列之间的互补位置包括其mRNA序列的差异。所述第二基因可替代地编码一种或多种酶，这些酶提供替代代谢途径以提供缺失的必需营养素。然后可以将包括第二互补基因的第二多核苷酸引入哺乳动物细胞，并且可以通过撤回、立即或通过逐渐减少外源提供的酶、生长因子、营养物或其它分子来施加选择压力。只有那些吸收了第二多核苷酸并表达第二基因的细胞才能在这种选择中存活下来。所述第二多核苷酸可以包括也将被表达的其它基因。优选地，所述第二多核苷酸是转座子或病毒载体。这种策略的一个优点是，与添加药物相比，撤回营养素通常是一种非常温和的选择。通常用作选择标记的药物常常具有多效作用，可能对哺乳动物细胞产生不良影响(Lanza et al,2013；Yallop et al,2003；Yallop et al,2001；Flintoff et al,1982)。例如，使用甲硫氨酸亚砜胺抑制谷氨酰胺合成酶基因会降低细胞生长速度并增加CHO细胞中有毒代谢废物乳酸和氨的产生(Noh et al(2018).Comprehensive characterization ofglutamine synthetase-mediated selection for the establishment of recombinantCHO cells producing monoclonal antibodies.Scientific Reports,8,[5361].https://doi.org/10.1038/s41598-018-23720-9)。
将用于表达的多核苷酸稳定地引入哺乳动物细胞的方法包括(a)将抑制基因转移多核苷酸引入哺乳动物细胞，该多核苷酸包含可在哺乳动物细胞中表达的基因，该基因编码具有与必需代谢酶的mRNA互补的向导链序列的干扰RNA；(b)在酶、生长因子、营养物或其它外源性分子的存在下使细胞生长，使细胞能够存活、生长和分裂，同时抑制必需代谢酶的表达；(c)将包含(i)编码可在哺乳动物细胞中表达的选择标记的基因,其中选择标记在功能上补充了必需代谢酶的缺乏，并消除了对酶、生长因子、营养物或其它分子的外源性提供的需要，这些酶、生长因子、营养物或其它分子使细胞能够存活、生长和分裂，同时抑制必需代谢酶的表达，和(ii)可在哺乳动物细胞中表达的第二基因的第二多核苷酸引入细胞；以及(d)在没有(b)中外源提供的酶、生长因子、营养物或其它分子的情况下使细胞生长，以使细胞能够存活、生长和分裂，同时抑制必需代谢酶的表达，从而使细胞的存活、生长和分裂依赖于来自第二多核苷酸的选择标记的表达。优选地，所述第一和第二多核苷酸被整合到哺乳动物细胞基因组中。该方法可选择地还包括(e)在表达第二多核苷酸中的第二基因的条件下培养细胞。可选择地，所述第二基因编码蛋白质产物，并且该方法进一步包括(f)收集或纯化由第二基因编码的蛋白质产物。
可以有利地掺入基因转移多核苷酸中的一类选择标记是通过允许细胞合成代谢有用物质而为细胞提供生长优势的那些选择标记。这种选择标记的一个例子是谷氨酰胺合成酶(GS，例如选自SEQ ID NOs：888-892的多肽序列)，它允许通过谷氨酰胺代谢进行选择。谷氨酰胺合酶是负责从谷氨酸盐和氨生物合成谷氨酰胺的酶，它是哺乳动物细胞中谷氨酰胺形成的唯一途径的重要组成部分。在生长培养基中不存在谷氨酰胺的情况下，谷氨酰胺合成酶对于培养的哺乳动物细胞的存活是必不可少的。一些细胞系，例如小鼠骨髓瘤细胞，在不添加谷氨酰胺的情况下不表达足够的谷氨酰胺合成酶以存活。
在一些细胞系中，例如HEK细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，表达了足够的谷氨酰胺合成酶以使细胞能够在没有外源性添加谷氨酰胺的情况下存活。这些细胞可以通过包括CRISPR/Cas9在内的基因组编辑技术进行操作，以降低或消除内源性谷氨酰胺合成酶的活性。然而，即使使用CRISPR，这也是一个费力的过程，可能会在其它基因中引入脱靶突变。另一种方法是将包括靶向内源性谷氨酰胺合成酶基因的多发夹amiRNA的多核苷酸稳定整合到细胞基因组中。然后，外源性提供的谷氨酰胺合成酶基因可以用作选择标记，条件是外源性提供的基因不包括向导链序列靶向的序列。这可以通过改变用于编码谷氨酰胺合成酶的密码子来实现，如果向导靶向开放阅读框中的序列。如果向导靶向5'UTR内的序列，则可以通过改变5'UTR来实现。如果向导靶向多聚腺苷酸化信号序列/3'UTR中的序列，则可以通过改变3'UTR的多聚腺苷酸化信号来实现。
5.6.1减少内源性谷氨酰胺合成酶的微RNA
用于通过RNA干扰抑制仓鼠细胞中谷氨酰胺合成酶的有利基因转移多核苷酸包括抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA序列。抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:21互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:21互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，以及含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:21互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，以及含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO:683-692的序列。用于抑制仓鼠谷氨酰胺合成酶的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：114和418、SEQ ID NOs：115和419、SEQ ID NOs：117和421、SEQ ID NOs：118和422、SEQ ID NOs:119和423,SEQ ID NOs:120和424,SEQ ID NOs:121和425,SEQ ID NOs:122和426,SEQ ID NOs:123和427,SEQ IDNOs:124和428,SEQ ID NOs：125和429、SEQ ID NOs：126和430、SEQ ID NOs：127和431、SEQID NOs：128和432、SEQ ID NOs：129和433，以及SEQ ID NOs：116和420。
多发夹amiRNA SEQ ID NO:741包括与CHO谷氨酰胺合成酶mRNA靶标(SEQ ID NO:21)内的三个不同序列互补的向导链序列。多发夹amiRNASEQ ID NO:741包括具有SEQ IDNO:114的第一向导链序列和具有SEQ ID NO:418的第一过客链序列；SEQ ID NO:741进一步包括具有SEQ ID NO:115的第二向导链序列和具有SEQ ID NO:419的第二过客链序列；SEQID NO:741进一步包括具有SEQ ID NO:116的第三向导链序列和具有SEQ ID NO:420的第三过客链序列。向导链序列SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:115和SEQ ID NO:116彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列通过包括SEQ ID NO:683的序列分开。将多发夹amiRNA并入转座子载体可提高amiRNA基因整合到基因组转录活性区域的可能性。如第6.1.3节所述，将具有SEQ ID NO:741的多发夹amiRNA整合到仓鼠细胞的基因组中会降低谷氨酰胺合成酶的表达，从而使细胞完全依赖于外源提供的谷氨酰胺生存。
类似的策略可用于创建缺乏谷氨酰胺合成酶的人类细胞系，例如HEK细胞系。用于通过RNA干扰抑制人细胞中谷氨酰胺合成酶的有利基因转移多核苷酸包含抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA序列。抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA序列包括含有与人谷氨酰胺合成酶的mRNA互补的连续的19、20、21或22个核苷酸序列(例如SEQ ID NO：23)的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与人谷氨酰胺合成酶的mRNA互补的连续的19、20、21或22个核苷酸序列(例如SEQ ID NO：23)的第二向导链序列，含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与人谷氨酰胺合成酶的mRNA互补的连续的19、20、21或22个核苷酸序列(例如SEQ ID NO：23)的第三向导链序列，和含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NO：683-692的序列。用于抑制人谷氨酰胺合成酶的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：130和434、SEQ ID NOs：131和435、SEQID NOs：132和436、SEQ ID NOs：133和437、SEQ ID NOs:134和438,SEQ ID NOs:135和439,SEQ ID NOs:136和440,SEQ ID NOs:137和441,SEQ ID NOs:138和442,SEQ ID NOs:139和443,SEQ ID NOs：140和444、SEQ ID NOs：141和445，以及SEQ ID NOs：142和446。
5.6.2谷氨酰胺合成酶营养缺陷型的互补作用
在缺乏功能性谷氨酰胺合成酶基因的细胞中，包括因RNA干扰而降低内源性谷氨酰胺合成酶表达的细胞(例如通过将包含SEQ ID NO:741的多发夹amiRNA基因整合到细胞的基因组中)，外源性添加的谷氨酰胺合成酶基因可以通过允许在不含谷氨酰胺的培养基中生长而起到选择标记的作用。优选地，将包括外源性谷氨酰胺合成酶基因的基因转移多核苷酸引入细胞中。优选地，所述外源性谷氨酰胺合成酶基因包括的序列特征可防止其表达被用于使宿主细胞对谷氨酰胺合成酶产生营养缺陷的任何RNA干扰抑制。如果RNA干扰分子(包括amiRNA向导链)与内源性谷氨酰胺合成酶的编码部分互补，则编码谷氨酰胺合成酶的外源基因可以在编码序列改变时避免抑制，例如通过靶向区域中的沉默突变。如果RNA干扰分子(包括amiRNA向导链)与内源性谷氨酰胺合成酶的3'UTR或5'UTR部分互补，则编码谷氨酰胺合成酶的外源基因可通过用替代序列替换天然UTR序列来避免抑制，例如，从其它天然基因获得或改编的合成序列或UTR序列。
选择方案包括引入包括编码谷氨酰胺合酶选择标记的序列的基因转移多核苷酸，然后在不含有足够的谷氨酰胺的培养基中培养细胞以使细胞在没有编码谷氨酰胺合成酶的外源基因的情况下存活。
优选地，编码谷氨酰胺合成酶基因的外源基因与弱启动子或其它减弱表达的序列元件可操作地连接，使得只有当基因转移多核苷酸的多个拷贝存在时，或者如果它们被整合到基因组中发生高水平表达的位置时，才会发生高水平表达。在这种情况下，可能没有必要使用谷氨酰胺合成酶抑制剂，例如甲硫氨酸亚砜亚胺：如果谷氨酰胺合成酶的表达减弱，那么简单地合成足够的谷氨酰胺用于细胞存活就可以提供足够严格的选择。示例性谷氨酰胺合成酶多肽序列作为SEQ ID NOs：888-892给出。
5.7二氢叶酸还原酶
可以有利地掺入基因转移多核苷酸以通过允许细胞合成代谢有用物质为细胞提供生长优势的可选择标记基因的另一个例子是编码二氢叶酸还原酶的基因(DHFR，例如选自SEQ ID NO:876-877的多肽序列)，该二氢叶酸还原酶是催化5,6-二氢叶酸(DHF)还原为5,6,7,8-四氢叶酸(THF)所必需的。如果不添加次黄嘌呤和胸苷(HT)，一些细胞系不会表达足够的DHFR来存活。在这些细胞中，转染的DHFR基因可以通过允许在不含次黄嘌呤和胸苷的培养基中生长而起到选择标记的作用。DHFR赋予对甲氨蝶呤(MTX)的抗性。DHFR可被更高水平的甲氨蝶呤抑制。选择方案包括将包含编码DHFR选择标记的序列的构建体引入具有或不具有内源性DHFR基因的细胞中，然后用DHFR抑制剂例如甲氨蝶呤处理细胞。使用的甲氨蝶呤水平越高，细胞合成足够的DHFR以存活所需的DHFR表达水平就越高。优选地，所述DHFR基因与如上所述减弱表达的弱启动子或其它序列元件可操作地连接，使得只有当基因转移多核苷酸的多个拷贝存在时，或者如果它们被整合到基因组中发生高水平表达的位置时，才会发生高水平表达。
优选地，所述DHFR基因与如本文所述减弱表达的弱启动子或其它序列元件可操作地连接，使得只有当基因转移多核苷酸的多个拷贝存在时，或者如果它们被整合到基因组中发生高水平表达的位置时，才会发生高水平表达。在这种情况下，可能没有必要使用DHFR抑制剂，例如甲氨蝶呤：如果DHFR的表达减弱，只需合成足够的四氢叶酸用于细胞存活就可以提供足够严格的选择。
在一些细胞系中，例如HEK细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，表达了足够的DHFR酶，使细胞能够在没有外源性添加HT的情况下存活。这些细胞可以通过包括CRISPR/Cas9在内的基因组编辑技术进行操作，以降低或消除DHFR酶的活性。然而，即使使用CRISPR，这也是一个费力的过程，可能会在其它基因中引入脱靶突变。另一种方法是将包括靶向内源性DHFR mRNA的多发夹amiRNA的多核苷酸稳定整合到细胞基因组中。
5.7.1减少内源性二氢叶酸还原酶的微RNA
用于抑制仓鼠细胞中二氢叶酸还原酶的有利基因转移多核苷酸包括抑制二氢叶酸还原酶的多发夹amiRNA序列。抑制二氢叶酸还原酶的多发夹amiRNA序列包括含有与仓鼠DHFR mRNA互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列(其序列由SEQ ID NO：22给出)的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。抑制二氢叶酸还原酶的多发夹amiRNA序列进一步包括第二向导链序列，该第二向导链序列包含与SEQ ID NO:22互补的连续的19、20、21或22个核苷酸序列，以及包含与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。抑制二氢叶酸还原酶的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括第三向导链序列，该第三向导链序列包含与SEQ ID NO:22互补的连续的19、20、21或22个核苷酸序列，以及包含与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列都彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。用于将向导链序列与其过客链序列分离的示例性序列是包括选自序列SEQ ID NOs：683-692的序列。用于抑制仓鼠二氢叶酸还原酶的示例性向导链序列及其各自的过客链序列是SEQ ID NOs：143和447、SEQ ID NOs：144和448，以及SEQ ID NOs：145和449。
多发夹amiRNA SEQ ID NO:742包括与CHO二氢叶酸还原酶mRNA靶标(SEQ ID NO:22)内的不同序列互补的向导链序列。多发夹amiRNA序列包括含有与SEQ ID NO:22互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一向导链序列，以及含有与第一向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第一过客链序列。多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:22互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二向导链序列，以及含有与第二向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第二过客链序列，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同。多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:22互补的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三向导链序列，以及含有与第三向导链序列的反向互补序列至少78％相同的连续19、20、21或22个核苷酸序列的第三过客链序列，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。每个向导链序列与其各自的过客链序列相隔5到35个碱基。对于多发夹amiRNA SEQ IDNO 742，每个向导链序列与其各自的过客链序列通过包含SEQ ID NO：683的序列分开。多发夹amiRNA SEQ ID NO:742包括具有SEQ ID NO:143的第一向导链序列和具有SEQ ID NO:447的第一过客链序列；SEQ ID NO:742进一步包括具有SEQ ID NO:144的第二向导链序列和具有SEQ ID NO:448的第二过客链序列；SEQ ID NO:742进一步包括具有SEQ ID NO:145的第三向导链序列和具有SEQ ID NO:449的第三过客链序列。向导链序列SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:145都彼此不同。
5.7.2 DHFR营养缺陷型的补充
在缺乏功能性DHFR基因的细胞中，包括内源性DHFR表达因RNA干扰而降低的细胞，外源性添加的DHFR基因可通过允许在无HT培养基中生长而起到选择标记的作用。优选地，将包括外源性DHFR基因的基因转移多核苷酸引入细胞中。优选地，所述外源性DHFR基因包括防止其表达被用于使宿主细胞成为DHFR营养缺陷型的任何RNA干扰抑制的序列特征。如果包括amiRNA向导链在内的RNA干扰分子针对内源性DHFR的编码部分，则编码DHFR的外源基因可以避免在编码序列发生改变(例如通过靶向区域的沉默突变)时受到抑制。如果包括amiRNA向导链在内的RNA干扰分子针对内源性DHFR的3'UTR或5'UTR部分，编码DHFR的外源基因可以通过用替代序列(例如从其它天然基因中提取或改编的UTR序列)替换天然UTR序列来避免抑制。
选择方案包括引入包含编码DHFR选择标记的序列的基因转移多核苷酸，然后在不含足够HT的培养基中培养细胞，使细胞在没有编码DHFR的外源基因的情况下能够存活。
优选地，所述编码DHFR基因的外源基因与弱启动子或减弱表达的其它序列元件可操作地连接，使得只有当基因转移多核苷酸的多个拷贝存在时，或者它们被整合到基因组中发生高水平表达的位置时，才会发生高水平表达。在这种情况下，可能没有必要使用DHFR抑制剂，例如甲硫氨酸亚砜亚胺：如果DHFR的表达减弱，那么简单地合成足够的谷氨酰胺用于细胞存活就可以提供足够严格的选择。示例性DHFR多肽序列作为SEQ ID NOs：876-877给出。
5.8用于改变免疫细胞功能的内源基因靶标
为了让免疫细胞对身体受到的威胁做出充分反应，它们必须能够存活足够长的时间来攻击它们的目标。对于需要对免疫细胞进行离体操作的治疗和研究，免疫细胞的增殖是有利的。然而，无论是离体培养条件还是某些体内环境(例如实体瘤内的环境)都不是免疫细胞生长的最佳条件。例如，与来自未经治疗的患者的T细胞相比，使用抗CD19嵌合抗原受体进行工程改造后，来自大量预处理的淋巴瘤患者的T细胞显示出较低的体外扩增率和临床反应率。进一步地，长时间暴露于靶抗原的T细胞会变得无反应或衰竭，这种无反应或衰竭通常是通过T细胞表达并存在于T细胞表面的受体介导的。因此，需要增强人免疫细胞的功能、持久性和增殖的方法，特别是在对免疫细胞天然敌意的条件下。
RNA干扰是抑制内源性细胞基因的一种有利机制。增强人类免疫细胞持久性和增殖的一种方法是将抑制某些内源性免疫细胞靶基因表达的免疫细胞抑制的多核苷酸整合到基因组中。候选靶基因包括那些正常功能是减少增殖、参与细胞凋亡或参与失能或耗竭途径的基因。人工microRNAs可以编码在多核苷酸上，该多核苷酸还携带能够改变免疫细胞功能的第二基因，例如嵌合抗原受体。优选地，所述多核苷酸是转座子或病毒载体以确保amiRNA和嵌合抗原受体一起整合到免疫细胞基因组中。
正常功能是减少增殖或参与细胞凋亡的候选RNA干扰靶基因包括caspase 3、caspase 7、caspase 8、caspase 9、caspase 10、死亡受体4(肿瘤坏死因子受体超家族成员10A)、死亡受体5(肿瘤坏死因子受体超家族成员10B)、FAS(肿瘤坏死因子受体超家族成员6)、细胞毒性T淋巴细胞蛋白4、细胞凋亡调节剂BAX和BAD(Bcl2相关的细胞死亡激动剂)。正常功能是参与衰竭途径的候选RNA干扰靶基因包括转录因子胸腺细胞选择相关的高迁移率群盒蛋白TOX和TOX2，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3(TIM-3)和核受体亚家族4A组成员1、2和3(NR4A1、NR4A2和NR4A3)。
5.8.1 TOX
胸腺细胞选择相关的高迁移率群盒蛋白TOX与诱导和/或维持由慢性抗原刺激引发的低反应、疲惫或功能障碍状态有关，其特征是几种抑制性受体的上调和效应物功能的丧失(Seo et.al.2019.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.116,12410-12415.“TOX and TOX2transcription factors cooperate with NR4A transcription factors to impose CD8+T cell exhaustion”)。小鼠中TOX基因的抑制改善了表达嵌合抗原受体的T细胞的性能。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中TOX的有利基因转移多核苷酸包括抑制TOX的多发夹amiRNA序列。抑制TOX的多发夹amiRNA序列包括含有与人TOX mRNA(SEQ ID NO:24)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与TOX mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框的3'端(SEQ ID NO:25)。抑制TOX的多发夹amiRNA序列还包括含有与SEQ ID NO:24互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制TOX的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:24互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中TOX的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:146和450、SEQ ID NOs:147和451、SEQ ID NOs:148和452、SEQ ID NOs:149和453、SEQ ID NOs:150和454,SEQ ID NOs:151和455,SEQ ID NOs:152和456,SEQ ID NOs:153和457,SEQ ID NOs:154和458,SEQ ID NOs:155和459,SEQ ID NOs：156和460，SEQ IDNO：157和461。用于抑制人TOX的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO：743-746。
优选的实施方案包括包括靶向TOX的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。优选地，所述免疫细胞是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向TOX的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与TOX mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，以及每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向TOX的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向TOX的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向TOX的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包括与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。免疫细胞优选地是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能具有永久降低或消除的TOX基因活性，所述多发夹amiRNA包括与TOX mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与TOX mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。降低TOX表达可减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可以具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含与TOX mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.2 TOX2
胸腺细胞选择相关的高迁移率群盒蛋白TOX2与诱导和/或维持由慢性抗原刺激引发的低反应、疲惫或功能障碍状态有关，其特征是几种抑制性受体的上调和效应物功能的丧失(Seo et.al.2019.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.116,12410-12415.“TOX and TOX2transcription factors cooperate with NR4Atranscription factors to impose CD8+T cell exhaustion”)。小鼠中TOX2基因的抑制改善了表达嵌合抗原受体的T细胞的性能。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的TOX2的有利的基因转移多核苷酸包括抑制TOX2的多发夹amiRNA序列。抑制TOX2的多发夹amiRNA序列包括第一向导序列，该序列含有与人TOX2mRNA的序列(SEQ ID NO：26)互补的连续19个核苷酸序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与TOX2 mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框的3'端(SEQ ID NO:27)。抑制TOX2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:26互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制TOX2的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:26互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于在免疫细胞中抑制人TOX2的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs：158和462、SEQ ID NOs：463和392、SEQ IDNOs：160和464、SEQ ID NOs：161和465、SEQ ID NOs:162和466,SEQ ID NOs:163和467,SEQID NOs:164和468,SEQ ID NOs:165和469,SEQ ID NOs:166和470,SEQ ID NOs:167和471,SEQ ID NOs：168和472，SEQ ID NOs：169和473，SEQ ID NOs：170和474。用于抑制人TOX2的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO：747-750。
优选的实施方案包括包含靶向TOX2的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选为T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向TOX2的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包括与TOX2 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在人免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向TOX2的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向TOX2的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向TOX2的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包括与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了TOX2基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹状amiRNA，该多发夹amiRNA包括两个与TOX2 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。可选择地，包括与TOX2 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。TOX2表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可能具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包括两个与TOX2 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。
5.8.3 TOX1和TOX2
胸腺细胞选择相关的高迁移率群盒蛋白TOX1和TOX2共同参与诱导和/或维持由慢性抗原刺激引发的低反应、疲惫或功能障碍状态，其特征是几种抑制性受体的上调和效应物功能的丧失(Seo et.al.2019.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.116,12410-12415.“TOX andTOX2 transcription factors cooperate with NR4A transcription factors toimpose CD8+T cell exhaustion”)。在小鼠中同时抑制TOX1和TOX2可改善表达嵌合抗原受体的T细胞的性能。因此，使用多发夹amiRNA同时抑制这两种基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中TOX1和TOX2的有利基因转移多核苷酸包括多发夹amiRNA序列，其向导与两者的mRNAs互补。抑制TOX/TOX2的多发夹amiRNA序列包括含有与人TOXmRNA(SEQ ID NO：24)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。抑制TOX/TOX2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与人TOX mRNA(SEQ ID NO：24)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制TOX/TOX2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与人TOX2mRNA(SEQ ID NO:26)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列。抑制TOX/TOX2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:26互补的连续19个核苷酸序列的第四向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第四过客序列，并且其中所述第三和第四向导序列彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。发夹可以以任何顺序出现在抑制性基因转移多核苷酸中。例如，包括与TOX互补的向导的两个发夹可以彼此相邻，或者它们可以通过一个或多个包括与TOX2互补的向导的发夹彼此分开。相反，包括与TOX2互补的向导的两个发夹可以彼此相邻，或者它们可以通过一个或多个包括与TOX互补的向导的发夹彼此隔开。用于抑制人TOX和TOX2的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO：751-754。其它用于抑制TOX和TOX2的示例性多发夹amiRNA序列可以通过选择来自SEQ ID NOs：743-746的序列和来自SEQ ID NOs：747-750的序列并将这两个序列连接在一起来获得。两个序列的顺序无关紧要。
优选的实施方案包括包含靶向TOX和TOX2的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包含多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向TOX和TOX2的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包含四个发夹，每个发夹包括至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与TOX mRNA互补，其中两个与TOX2 mRNA互补，每个发夹可操作地连接到在人免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向TOX和TOX2的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向TOX和TOX2的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向TOX和TOX2的转座子携带多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括四个发夹，每个发夹包含至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与TOX mRNA互补，其中两个与TOX2mRNA互补，每个发夹可操作地连接到在人免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性地降低或消除了TOX和TOX2基因的活性，该抑制性多核苷酸包含多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含与TOX mRNA内的两个不同序列和TOX2 mRNA内的两个不同序列互补的四个向导序列。可选择地，包括与TOXmRNA内的两个不同序列和TOX2 mRNA内的两个不同序列互补的四个向导序列的多发夹amiRNA可操作地连接到与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子。TOX和TOX2表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭的表型。基因组包含抑制性多核苷酸的T细胞可以具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与TOX mRNA内的两个不同序列和TOX2 mRNA内的两个不同序列互补的四个向导序列。
5.8.4 PD-1
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种免疫检查点，在通过抑制T细胞活性和促进细胞凋亡来下调免疫系统中起作用。耗尽的T细胞表达高水平的PD-1(Jiang et.al.,2015.Cell Death&Disease 6,e1972 https://doi.org/10.1038/cddis.2015.162.“T-cell exhaustion in the tumor microenvironment”)。用针对PD-1的siRNA处理T细胞改善了体外CAR-T细胞的功能(Simon et al,2018.Exp Dermatol.27:769-778.“The siRNA-mediated downregulation of PD-1alone or simultaneously with CTLA-4showsenhanced in vitro CAR-T-cell functionality for further clinical developmenttowards the potential use in immunotherapy of melanoma”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的PD-1的有利的基因转移多核苷酸包括抑制PD-1的多发夹amiRNA序列。抑制PD-1的多发夹amiRNA序列包括含有与人PD-1 mRNA(SEQ ID NO：28)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列,以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与开放阅读框(SEQ ID NO:29)的3’的PD-1 mRNA的序列互补的连续的19个核苷酸序列。抑制PD-1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:28互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制PD-1的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:28互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列彼此不同。每个向导序列与其各自的乘客序列相隔5到35个碱基。用于抑制免疫细胞中人PD-1的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:171和475、SEQ ID NOs:172和476、SEQ ID NOs:173和477、SEQID NOs:174和478，SEQ ID NOs:175和479、SEQ ID NOs:176和480、SEQ ID NOs:177和481、SEQ ID NOs:178和482、SEQ ID NOs:179和483、SEQ ID NOs:180和484。用于抑制人PD-1的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO：755-758。
优选的实施方案包括包括靶向PD-1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向PD-1的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与PD-1 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在人类免疫细胞中具有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向PD-1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向PD-1的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向PD-1的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包含抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除PD-1基因的活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含与PD-1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与PD-1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。PD-1表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可能具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含与PD-1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.5 CTLA-4
细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)是一种蛋白质受体，其功能是作为免疫检查点下调免疫系统。耗尽的T细胞表达高水平的CTLA-4(Jiang et.al.,2015.Cell Death&Disease 6,e1972 https://doi.org/10.1038/cddis.2015.162.“T-cell exhaustion inthe tumor microenvironment”)。用针对CTLA-4的siRNA处理T细胞改善了体外CAR-T细胞功能(Simon et al,2018.Exp Dermatol.27:769-778.“The siRNA-mediateddownregulation of PD-1 alone or simultaneously with CTLA-4shows enhanced invitro CAR-T-cell functionality for further clinical development towards thepotential use in immunotherapy of melanoma”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的CTLA-4的有利的基因转移多核苷酸包括抑制CTLA-4的多发夹amiRNA序列。抑制CTLA-4的多发夹amiRNA序列包括含有与人CTLA-4mRNA(SEQ IDNO：30)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包含与位于开放阅读框(SEQ ID NO:31)的3'端的CTLA-4mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列。抑制CTLA-4的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:30互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制CTLA-4的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:30互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列彼此不同。每个向导序列与其各自的乘客序列相隔5到35个碱基。用于在免疫细胞中抑制人CTLA-4的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:181和485、SEQ ID NOs:182和486、SEQ IDNOs:183和487、SEQ ID NOs:184和488，SEQ ID NOs：185和489、SEQ ID NOs：186和490、SEQID NOs：187和491、SEQ ID NOs：188和492、SEQ ID NOs：189和493。用于抑制人CTLA-4的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO:759-762。
优选的实施方案包括包含靶向CTLA-4的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向CTLA-4的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与CTLA-4 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，和每个发夹可操作地连接到在人免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向CTLA-4的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向CTLA-4的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向CTLA-4的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包含两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包含抑制性多核苷酸的免疫细胞可能具有永久降低或消除的CTLA-4基因活性，该多发夹amiRNA包括与CTLA-4 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与CTLA-4 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。CTLA-4表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可以具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含与CTLA-4 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.6 PD-1和CTLA-4
程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种免疫检查点，具有下调免疫系统的作用，而细胞毒性T淋巴细胞蛋白4(CTLA-4)是一种蛋白质受体，可作为免疫检查点下调免疫系统。用针对PD-1和CTLA-4的siRNA处理T细胞改善了体外CAR-T细胞的功能(Simon et al,2018.Exp Dermatol.27:769-778.“The siRNA-mediated downregulation of PD-1 aloneor simultaneously with CTLA-4shows enhanced in vitro CAR-T-cell functionalityfor further clinical development towards the potential use in immunotherapyof melanoma”)。因此，使用多发夹amiRNA同时抑制这两种基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的PD-1和CTLA-4的有利基因转移多核苷酸包括多发夹amiRNA序列，其具有与两者的mRNAs互补的向导。抑制PD-1/CTLA-4的多发夹amiRNA序列包括含有与人PD-1 mRNA(SEQ ID NO:28)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。抑制PD-1/CTLA-4的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:28互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制PD-1/CTLA-4的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与人CTLA-4 mRNA(SEQ ID NO:30)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列。抑制PD-1/CTLA-4的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:30互补的连续19个核苷酸序列的第四向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第四过客序列，并且其中所述第三和第四向导序列彼此不同。每个向导序列与其各自的乘客序列相隔5到35个碱基。发夹可以以任何顺序出现在抑制性基因转移多核苷酸中。例如，包括与PD-1互补的向导的两个发夹可以彼此相邻，或者它们可以通过一个或多个包含与CTLA-4互补的向导的发夹彼此隔开。相反，包括与CTLA-4互补的向导的两个发夹可以彼此相邻，或者它们可以通过一个或多个包括与PD-1互补的向导的发夹相互隔开。用于抑制人PD-1和CTLA-4的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：763-766。用于抑制PD-1和CTLA-4的其它示例性多发夹amiRNA序列可以通过从SEQ ID NOs：755-758中选择一个序列，以及从SEQ IDNOs：759-762中选择一个序列并将这两个序列连接在一起来获得。两个序列的顺序无关紧要。
优选的实施方案包括包含靶向PD-1和CTLA-4的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向PD-1和CTLA-4的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包含四个发夹，每个发夹包含至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与PD-1 mRNA互补，其中两个与CTLA-4 mRNA互补，每个发夹可操作地连接到在人免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向PD-1和CTLA-4的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向PD-1和CTLA-4的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向PD-1和CTLA-4的转座子携带多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括四个发夹，每个发夹包含至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与PD-1mRNA互补，其中两个与CTLA-4 mRNA互补，每个发夹可操作地连接到在人免疫细胞中具有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复序列。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性地降低或消除PD-1和CTLA-4基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包括与PD-1mRNA内的两个不同序列和CTLA-4 mRNA内的两个不同序列互补的四个向导序列。可选择地，包括与PD-1 mRNA内的两个不同序列和CTLA-4 mRNA内的两个不同序列互补的四个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。降低PD-1和CTLA-4的表达可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭表型。
5.8.7 TIM-3
T细胞免疫球蛋白粘蛋白受体3(Tim-3，甲型肝炎病毒细胞受体2)是T细胞上的共抑制受体。耗尽的T细胞表达高水平的Tim-3(Jiang et.al.,2015.Cell Death&Disease 6,e1972 https://doi.org/10.1038/cddis.2015.162.“T-cell exhaustion in the tumormicroenvironment”)。Tim-3抑制可以增强T细胞抗肿瘤活性(Das et.al.,2017.ImmunolRev.276,97–111.“Tim-3and its role in regulating anti-tumor immunity”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的TIM-3的有利的基因转移多核苷酸包括抑制TIM-3的多发夹amiRNA序列。抑制TIM-3的多发夹amiRNA序列包括第一向导序列，该序列包含与人TIM-3 mRNA的序列(SEQ ID NO:32)互补的连续19个核苷酸序列，以及包含与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与TIM-3 mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框的3'(SEQ ID NO:33)。抑制TIM-3的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:32互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制TIM-3的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:32互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的乘客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的TIM-3的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:190和494、SEQ ID NOs:191和495、SEQ ID NOs:192和496、SEQ ID NOs:193和497，SEQ ID NOs：194和498、SEQ ID NOs：195和499、SEQ ID NOs：196和500、SEQ ID NOs：197和501、SEQ ID NOs：198和502，以及SEQ IDNOs：199和503。用于抑制人TIM-3的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO：767-770。
优选的实施方案包括包含靶向TIM-3的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选为T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向TIM-3的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包括与TIM-3 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹与哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子可操作地连接，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向TIM-3的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向TIM-3的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向TIM-3的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包含两个发夹，每个发夹包括与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除TIM-3基因的活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与TIM-3 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与TIM-3 mRNA内两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。TIM-3表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含互补于TIM-3 mRNA内的两个不同序列的两个向导序列。
5.8.8 NR4A1(Nur77)
核受体4A1(Nur77)与抑制实体瘤中的T细胞功能有关(Rao et al 2019.Nature567,530-534“NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solidtumours.”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的NUR77的有利的基因转移多核苷酸包括抑制NUR77的多发夹amiRNA序列。抑制NUR77的多发夹amiRNA序列包括含有与人NUR77 mRNA的序列(SEQ IDNO:34)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与NUR77 mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框的3'(SEQ IDNO:35)。抑制NUR77的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:34互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制NUR77的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:34互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中NUR77的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:200和504、SEQ ID NOs:201和505、SEQ ID NOs:202和506、SEQ ID NOs:203和507、SEQ ID NOs:204和508、SEQ ID NOs:205和509、SEQ IDNOs:206和510、SEQ ID NOs:207和511、SEQ ID NOs:208和512。用于抑制人NUR77的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO：771-774。
优选的实施方案包括包含靶向NUR77的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向NUR77的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包含两个发夹，每个发夹包含与NUR77 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向NUR77的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向NUR77的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向NUR77的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包括与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包含抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除NUR77基因的活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与NUR77 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与NUR77 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。NUR77表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可以具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与Nur77 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.9 NR4A2(Nurr1)
核受体4A2(Nurrl)与抑制实体瘤中的T细胞功能有关(Rao et al 2019.Nature567,530-534“NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solidtumours.”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的NURR1的有利的基因转移多核苷酸包括抑制NURR1的多发夹amiRNA序列。抑制NURR1的多发夹amiRNA序列包括含有与人NURR1 mRNA(SEQ ID NO:36)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与NURR1 mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ IDNO:37)的3'。抑制NURR1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:36互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制NURR1的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:36互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的乘客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的NURR1的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:209和513、SEQ ID NOs:210和514、SEQ IDNOs:211和515、SEQ ID NOs:212和516、SEQ ID NOs:213和517、SEQ ID NOs:214和518、SEQID NOs:215和519、SEQ ID NOs:216和520。用于抑制人NURR1的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO：775-778。
优选的实施方案包括包含靶向NURR1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向NURR1的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与NURR1 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向NURR1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向NURR1的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向NURR1的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包含抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除NURR1基因的活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含与NURR1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与NURR1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。减少NURR1表达可能减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可能具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包括与NUUR1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.10 NR4A3(NOR1)
核受体4A3(NOR1)与抑制实体瘤中的T细胞功能有关(Rao et al 2019.Nature567,530-534“NR4A transcription factors limit CAR T cell function in solidtumours.”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的NOR1的有利的基因转移多核苷酸包括抑制NOR1的多发夹amiRNA序列。抑制NOR1的多发夹amiRNA序列包括含有与人NOR1 mRNA(SEQ ID NO:38)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与位于开放阅读框(SEQ ID NO:39)的3'端的NOR1 mRNA的序列互补的连续19个核苷酸序列。抑制NOR1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:38互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制NOR1的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:38互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的乘客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的NOR1的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:217和521、SEQ ID NOs:218和522、SEQ ID NOs:219和523、SEQID NOs:220和524、SEQ ID NOs:221和525、SEQ ID NOs:222和526、SEQ ID NOs:223和527、SEQ ID NOs:224和528，以及SEQ ID NOs:225和529。用于抑制人NOR1的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：779-782。
优选的实施方案包括包含靶向NOR1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向NOR1的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与NOR1 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向NOR1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向NOR1的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向NOR1的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如SleepingBeauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能具有永久性降低或消除的NOR1基因活性，该多发夹amiRNA包括与NOR1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与NOR1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。NOR1表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可能具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包括与NOR1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.11 NR4A1(Nur77)和NR4A2(Nurr1)和NR4A3(NOR1)
核受体4A1、2和3(Nur77、Nurr1和NOR1)可能共同参与抑制实体瘤中的T细胞功能(Rao et al 2019.Nature 567,530-534“NR4A transcription factors limit CAR Tcell function in solid tumours.”)。因此，使用多发夹amiRNA同时抑制这两种基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的Nur77、NOR1和Nuur1的有利基因转移多核苷酸包括多发夹amiRNA序列，其具有与所有三个基因的mRNAs互补的向导。抑制Nur77/NOR1/Nuur1的多发夹amiRNA序列包括含有与人Nur77 mRNA的序列(SEQ ID NO:34)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。抑制Nur77/NOR1/Nuur1的多发夹amiRNA序列进一步包括包含与SEQ ID NO:34互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及包含与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制Nur77/NOR1/Nuur1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与人Nuur1 mRNA的序列(SEQ ID NO：36)互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列。抑制Nur77/Nuur1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:36互补的连续19个核苷酸序列的第四向导序列，以及含有与第四向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第四过客序列，并且其中所述第三和第四向导序列彼此不同。抑制Nur77/NOR1/Nuur1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与人NOR1 mRNA的序列(SEQ ID NO:38)互补的连续19个核苷酸序列的第五向导序列，以及含有与第五向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第五过客序列。抑制Nur77/NOR1/Nuur1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:38互补的连续19个核苷酸序列的第六向导序列，以及含有与第六向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第六过客序列，并且其中所述第五和第六向导序列彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。发夹可以以任何顺序出现在抑制性基因转移多核苷酸中。例如，包括与Nur77互补的向导的两个发夹可以彼此相邻，或者它们可以通过一个或多个包括与Nuur1或NOR1互补的向导的发夹相互隔开。用于抑制人Nur77、Nuur1和NOR1的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：783-788。用于抑制Nur77和Nuur1和NOR1的其它示例性多发夹amiRNA序列可以通过选择选自SEQ ID NOs：771-774的序列、和选自SEQ ID NOs：775-778的序列、和选自SEQID NOs：779-782的序列并将三个序列连接在一起获得。三个序列的顺序无关紧要。
优选的实施方案包括包含靶向Nur77、NOR1和Nuur1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向Nur77、NOR1和Nuur1的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括六个发夹，每个发夹包含至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与Nur77 mRNA互补，其中两个与NOR1 mRNA互补，其中两个与Nuur1 mRNA互补，并且每个发夹可操作地连接到在人免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括多核苷酸，该多核苷酸包含靶向Nur77和Nuurl的多发夹amiRNA，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向Nur77、NOR1和Nuur1的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向Nur77、NOR1和Nuur1的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括六个发夹，每个发夹包含至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与Nur77 mRNA互补，其中两个与NOR1 mRNA互补，其中两个与Nuur1 mRNA互补，每个发夹均与在人免疫细胞中有活性的异源启动子可操作地连接，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
免疫细胞，其基因组包括抑制性多核苷酸，所述抑制性多核苷酸包括含有六个向导序列六个向导序列的多发夹amiRNA，其中两个向导序列与Nur77 mRNA内的两个不同序列互补，两个向导序列与Nuur1 mRNA内的两个不同序列互补，两个向导序列与NOR1mRNA内的两个不同序列互补，可能永久降低或消除了Nur77、NOR1和Nuur1基因的活性。可选择地，所述多发夹amiRNA包含六个向导序列六个向导序列，其中两个向导序列与Nur77 mRNA内的两个不同序列互补，两个向导序列与Nuur1 mRNA内的两个不同序列互补，并且两个向导序列与NOR1 mRNA内的两个不同序列互补，所述NOR1 mRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。Nur77和Nuur1表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。
5.8.9 NFAT
活化T细胞的转录因子核因子(NFAT)与促进CD8 T细胞衰竭有关(Martinez etal.,2015.Immunity 42,265-278.“The transcription factor NFAT promotesexhaustion of activated CD8+T cells”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制该基因在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的NFAT的有利的基因转移多核苷酸包括抑制NFAT的多发夹amiRNA序列。抑制NFAT的多发夹amiRNA序列包括含有与人NFAT mRNA的序列(SEQ ID NO:40)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列,以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与NFAT mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO:41)的3'端。抑制NFAT的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:40互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制NFAT的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:40互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中NFAT的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:226和530、SEQ ID NOs:227和531、SEQ ID NOs:228和532、SEQ ID NOs:229和533、SEQ ID NOs:230和534,SEQ ID NOs:231和535,SEQ ID NOs:232和536,SEQ ID NOs:233和537,SEQ ID NOs:234和538,SEQ ID NOs:235和539,以及SEQID NOs:236和540。用于抑制人NFAT的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：789-792。
优选的实施方案包括包含靶向NFAT的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向NFAT的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与NFAT mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，和每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向NFAT的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向NFAT的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向NFAT的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能具有永久性降低或消除的NFAT基因活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包括与NFAT mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与NFAT mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。NFAT表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含与NFAT mRNA内两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.12 FAS(CD95)
嵌合抗原受体(CAR)的不依赖抗原的进补信号可以增加T细胞的分化和衰竭，从而限制其效力。在CARs中加入4-1BB共刺激可能使T细胞能够抵抗这种功能衰竭。这种进补CAR衍生的4-1BB信号可以通过增强FAS依赖性细胞死亡在T细胞中产生毒性(Gomes-Silvaet.al.,2017.Cell Rep.21,17-26.“Tonic 4-1BB Costimulation in Chimeric AntigenReceptors Impedes T Cell Survival and Is Vector Dependent”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制T细胞中FAS的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的FAS的有利的基因转移多核苷酸包括抑制FAS的多发夹amiRNA序列。抑制FAS的多发夹amiRNA序列包括含有与人FAS mRNA的序列(SEQ ID NO：42)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与FAS mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO:43)的3'。抑制FAS的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:42互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制FAS的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:42互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的乘客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中FAS的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:237和541、SEQ ID NOs:238和542、SEQ ID NOs:239和543、SEQ IDNOs:240和544、SEQ ID NOs:241和545、SEQ ID NOs:242和546、SEQ ID NOs:243和547、SEQID NOs:244和548。用于抑制人FAS的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NO：793-796。
优选的实施方案包括包含靶向FAS的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向FAS的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与FAS mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列,并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向FAS的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向FAS的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向FAS的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能具有永久降低或消除的FAS基因活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与FAS mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与FAS mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。FAS表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可以具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与FAS mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.13 Caspase 3
Caspase 3表达在T细胞无反应性诱导期间被激活。使用siRNA阻断Caspase3表达会削弱无反应性的诱导。因此，使用多发夹amiRNA抑制Caspase 3在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的caspase 3的有利的基因转移多核苷酸包括抑制caspase 3的多发夹amiRNA序列。抑制caspase 3的多发夹amiRNA序列包括含有与人caspase3 mRNA(SEQ ID NO：44)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与caspase 3 mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO:45)的3'端。抑制caspase 3的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:44互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制caspase 3的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:44互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的caspase 3的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ IDNOs：245和549、SEQ ID NOs：246和550、SEQ ID NOs：247和551、SEQ ID NOs：248和552、SEQID NOs：249和553、SEQ ID NOs：250和554、SEQ ID NOs：251和555、SEQ ID NOs：252和556。用于抑制人caspase 3的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：797-800。
优选的实施方案包括包含靶向caspas 3的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向caspase 3的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与caspase 3 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 3的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向caspase 3的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向caspase 3的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含至少19个与靶mRNA互补的连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如SleepingBeauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能具有永久降低或消除的caspase 3基因活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与caspase 3mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与caspase 3 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。caspase 3表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含与caspase 3 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.14 Caspase 7
缺乏caspase 7基因的小鼠可免受内毒素诱导的淋巴细胞凋亡(Lamkanfiet.at.2009.Blood 113,2742-2745.“Caspase-7deficiency protects from endotoxin-induced lymphocyte apoptosis and improves survival”)。减少淋巴细胞凋亡在许多免疫细胞疗法中可能是有利的。因此，使用多发夹amiRNA抑制caspase 7在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的caspase 7的有利的基因转移多核苷酸包括抑制caspase 7的多发夹amiRNA序列。抑制caspase 7的多发夹amiRNA序列包括第一向导序列，其包含与人caspase 7 mRNA的序列(SEQ ID NO:46)互补的连续19个核苷酸序列，以及包含与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与caspase 7 mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该19个核苷酸序列位于开放阅读框(SEQ ID NO:47)的3'。抑制caspase 7的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:46互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制caspase 7的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:46互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中caspase 7的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQID NOs:253和557、SEQ ID NOs:254和558、SEQ ID NOs:255和559、SEQ ID NOs:256和560、SEQ ID NOs：257和561、SEQ ID NOs：258和562、SEQ ID NOs：259和563、SEQ ID NOs：260和564。用于抑制人caspase 7的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：801-804。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 7的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向caspase 7的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与caspase 7 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列,并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 7的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向caspase 7的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向caspase 7的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含至少19个与靶标mRNA互补的连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如SleepingBeauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能具有永久降低或消除的caspase 7基因的活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与caspase 7mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与caspase 7 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。caspase 7表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可能具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含两个与caspase 7 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。
5.8.15 Caspase 8
Fas和其它T细胞抑制性受体通过caspase 8基因起作用(Murali et.al.,2011.J.Clin.Cell Immunol.Suppl 3:2.doi:10.4172/2155-9899.S3-002.“Apoptosis–anUbiquitous T cell Immunomodulator”)。在许多免疫细胞疗法中，减少淋巴细胞凋亡可能是有利的。因此，使用多发夹amiRNA抑制T细胞中caspase 8的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的caspase 8的有利的基因转移多核苷酸包括抑制caspase 8的多发夹amiRNA序列。抑制caspase 8的多发夹amiRNA序列包括含有与人caspase 8 mRNA(SEQ ID NO：48)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与caspase 8 mRNA的序列互补的连续的19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO:49)的3'。抑制caspase 8的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:48互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制caspase 8的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:48互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中caspase 8的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ IDNOs:261和565、SEQ ID NOs:262和566、SEQ ID NOs:263和567、SEQ ID NOs:264和568、SEQID NOs:265和569、SEQ ID NOs：266和570、SEQ ID NOs：267和571、SEQ ID NOs：268和572、SEQ ID NOs：269和573。用于抑制人caspase 8的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：805-808。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 8的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向caspase 8的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与caspase 8 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 8的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向caspase 8的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由转座子携带的多发夹amiRNA靶向caspase 8修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含至少19个与靶标mRNA互补的连续碱基的不同序列，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包含抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久降低或消除了caspase 8基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包括两个与caspase 8 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。可选择地，包括与caspase 8 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。caspase 8表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可能具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含两个与caspase 8 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。
5.8.16 Caspase 9
通过阻断caspase激活，通常会引发致耐受性反应的信号可以转化为免疫原性信号(Murali et.al.,2011.J.Clin.Cell Immunol.Suppl 3:2.doi:10.4172/2155-9899.S3-002.“Apoptosis–an Ubiquitous T cell Immunomodulator”)。在许多免疫细胞疗法中，减少淋巴细胞凋亡可能是有利的。因此，使用多发夹amiRNA抑制Caspase 9在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的caspase 9的有利的基因转移多核苷酸包括抑制caspase 9的多发夹amiRNA序列。抑制caspase 9的多发夹amiRNA序列包括含有与人caspase 9 mRNA(SEQ ID NO：50)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与caspase 9 mRNA的序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO：51)的3’。抑制caspase 9的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:50互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制caspase 9的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:50互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的caspase 9的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ IDNOs:270和574、SEQ ID NOs:271和575、SEQ ID NOs:272和576、SEQ ID NOs:273和577、SEQID NOs：274和578、SEQ ID NOs：275和579、SEQ ID NOs：276和580、SEQ ID NOs：277和581、SEQ ID NOs：278和582。用于抑制人caspase 9的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：809-812。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 9的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向caspase 9的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与caspase 9 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 9的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向caspase 9的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向caspase 9的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含至少19个与靶标mRNA互补的连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久降低或消除了caspase 9基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含两个与caspase 9 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。可选择地，包括与caspase 9 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。caspase 9表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可能具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含两个与caspase 9 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。
5.8.17 Caspase 10
通过阻断caspase激活，通常会引发致耐受反应的信号可以转化为免疫原性信号(Murali et.al.,2011.J.Clin.Cell Immunol.Suppl 3:2.doi:10.4172/2155-9899.S3-002.“Apoptosis–an Ubiquitous T cell Immunomodulator”)。在许多免疫细胞疗法中，减少淋巴细胞凋亡可能是有利的。因此，使用多发夹amiRNA抑制caspase 10在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的caspase 10的有利的基因转移多核苷酸包括抑制caspase 10的多发夹amiRNA序列。抑制caspase 10的多发夹amiRNA序列包括含有与人caspase 10 mRNA(SEQ ID NO：52)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与caspase 10 mRNA的序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO：53)的3’。抑制caspase 10的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:52互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制caspase 10的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:52互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的caspase 10的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs：279和583、SEQ ID NOs：280和584、SEQ ID NOs：281和585、SEQ ID NOs：282和586、SEQ ID NOs：283和587、SEQ ID NOs：284和588、SEQ ID NOs：285和589，以及SEQ IDNOs：286和590。用于抑制人caspase 10的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：813-816。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 10的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向caspase 10的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与caspase 10 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向caspase 10的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向caspase 10的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由转座子携带的多发夹amiRNA靶向caspase 10修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如SleepingBeauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了caspase 10基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含两个与caspase 10mRNA内两个不同序列互补的向导序列。可选择地，包括与caspase 10 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。caspase 10表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可以具有改良的杀死肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与caspase 10 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.18死亡受体4(TNFRSF10A)
不同的肿瘤可能使用不同的方法来逃避免疫系统。例如，结直肠癌可能通过表达TRAIL配体来诱导死亡受体信号，该配体刺激TRAIL受体1[死亡受体4，肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(TNFRSF10A)]导致T细胞凋亡(Murali et.al.,2011.J.Clin.CellImmunol.Suppl 3:2.doi:10.4172/2155-9899.S3-002.“Apoptosis–an Ubiquitous Tcell Immunomodulator”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制T细胞中死亡受体4的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中死亡受体4的有利的基因转移多核苷酸包括抑制死亡受体4的多发夹amiRNA序列。抑制死亡受体4的多发夹amiRNA序列包括含有与人死亡受体4 mRNA(SEQ ID NO:54)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与死亡受体4 mRNA的序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO：55)的3’。抑制死亡受体4的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQID NO:54互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制死亡受体4的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ IDNO:54互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中死亡受体4的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:287和591、SEQ ID NOs:288和592、SEQ ID NOs:289和593、SEQ ID NOs:290和594，SEQ ID NOs：291和595、SEQ ID NOs：292和596、SEQ ID NOs：293和597、SEQ ID NOs：294和598。用于抑制人死亡受体4的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：817-820。
优选的实施方案包括包含靶向死亡受体4的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向死亡受体4的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与死亡受体4 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向死亡受体4的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向死亡受体4的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向死亡受体4的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如SleepingBeauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了死亡受体4基因的活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含与死亡受体4mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与死亡受体4 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。死亡受体4表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含与死亡受体4 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.19死亡受体5(TNFRSF10B)
不同的肿瘤可能使用不同的方法来逃避免疫系统。例如，结直肠癌可能通过表达TRAIL配体诱导死亡受体信号传导，该配体刺激TRAIL受体2[死亡受体5，肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(TNFRSF10B)]导致T细胞凋亡(Murali et.al.,2011.J.Clin.CellImmunol.Suppl 3:2.doi:10.4172/2155-9899.S3-002.“Apoptosis–an Ubiquitous Tcell Immunomodulator”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制T细胞中死亡受体5的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中死亡受体5的有利的基因转移多核苷酸包括抑制死亡受体5的多发夹amiRNA序列。抑制死亡受体5的多发夹amiRNA序列包括含有与人死亡受体5 mRNA(SEQ ID NO：56)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与死亡受体5 mRNA的序列互补的连续的19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO：57)的3’。抑制死亡受体5的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:56互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制死亡受体5的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQID NO:56互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中死亡受体5的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:295和599、SEQ ID NOs:296和600、SEQ ID NOs:297和601、SEQ ID NOs:298和602，SEQ ID NOs：299和603、SEQ ID NOs：300和604、SEQ ID NOs：301和605、SEQ ID NOs：302和606、SEQ ID NOs：303和607。用于抑制人死亡受体5的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：821-824。
优选的实施方案包括包含靶向死亡受体5的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向死亡受体5的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与死亡受体5 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向死亡受体5的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向死亡受体5的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向死亡受体5的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如SleepingBeauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了死亡受体5基因的活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包含与死亡受体5mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与死亡受体5 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。死亡受体5表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含与死亡受体5 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.20死亡受体4和5
不同的肿瘤可能使用不同的方法来逃避免疫系统。例如，结直肠癌可能通过表达TRAIL配体来诱导死亡受体信号，从而刺激死亡受体4和5，导致T细胞凋亡(Murali et.al.,2011.J.Clin.Cell Immunol.Suppl 3:2.doi:10.4172/2155-9899.S3-002.“Apoptosis–anUbiquitous T cell Immunomodulator”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制T细胞中死亡受体4和5的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中死亡受体4和死亡受体5的有利的基因转移多核苷酸包括多发夹amiRNA序列，其具有与两者的mRNA互补的向导。抑制死亡受体4/死亡受体5的多发夹amiRNA序列包括含有与人死亡受体4 mRNA的序列(SEQ ID NO:54)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。抑制死亡受体4/死亡受体5的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:54互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制死亡受体4/死亡受体5的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与人死亡受体5mRNA的序列(SEQ ID NO:56)互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列。抑制死亡受体4/死亡受体5的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:56互补的连续19个核苷酸序列的第四向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第四过客序列，并且其中所述第三和第四向导序列彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。发夹可以在抑制性基因转移多核苷酸中以任何顺序出现。例如，包括与死亡受体4互补的向导的两个发夹可以彼此相邻，或者它们可以通过一个或多个包括与死亡受体5互补的向导的发夹彼此分开。相反，包括与死亡受体5互补的向导的两个发夹可以彼此相邻，或者它们可以通过一个或多个包括与死亡受体4互补的向导的发夹彼此分开。用于抑制人死亡受体4和死亡受体5的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：825-826。其它用于抑制人死亡受体4和死亡受体5的示例性多发夹amiRNA序列可以通过从SEQ ID NOs：817-820中选择一个序列，从SEQ ID NOs：821-824中选择一个序列并将这两个序列连接在一起来获得。两个序列的顺序无关紧要。
优选的实施方案包括多核苷酸，该多核苷酸包括靶向死亡受体4和死亡受体5的多发夹amiRNA，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向死亡受体4和死亡受体5的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括四个发夹，每个发夹包含至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与死亡受体4 mRNA互补，其中两个与死亡受体5 mRNA互补，每个发夹可操作地连接到在人类免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向死亡受体4和死亡受体5的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向死亡受体4和死亡受体5的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向死亡受体4和死亡受体5的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括四个发夹，每个发夹包括至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与死亡受体4 mRNA互补，其中两个与死亡受体5 mRNA互补，每个发夹可操作地连接到在人免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包含抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了死亡受体4和5的活性，所述抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，所述多发夹amiRNA包括与死亡受体4mRNA内的两个不同序列和死亡受体5 mRNA内的两个不同序列互补的四个向导序列。可选择地，包括与死亡受体4 mRNA内的两个不同序列和死亡受体5 mRNA内的两个不同序列互补的四个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。死亡受体4和死亡受体5表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。
5.8.21 Apaf1
来自缺乏凋亡肽酶激活因子1(Apaf1)的小鼠的T细胞增殖更有效，并显示出更高百分比的具有激活表型的细胞(Tong et.al.2018PLOS ONE,https://doi.org/10.1371/journal.pone.0195119.“Apaf1 plays a negative regulatory role in T cellresponses by suppressing activation of antigen-stimulated T cells”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制Apaf1在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的Apaf1的有利的基因转移多核苷酸包括抑制Apaf1的多发夹amiRNA序列。抑制Apaf1的多发夹amiRNA序列包括含有与人Apaf1 mRNA(SEQ ID NO：58)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与开放阅读框(SEQ ID NO:59)的3’的Apaf1 mRNA的序列互补的连续的19个核苷酸序列。抑制Apaf1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:58互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制Apaf1的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:58互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中Apaf1的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:304和608、SEQ ID NOs:305和609、SEQ ID NOs:306和610、SEQ ID NOs:307和611、SEQ ID NOs:308和612、SEQ ID NOs:309和613、SEQ IDNOs:310和614、SEQ ID NOs:311和615、SEQ ID NOs:312和616，以及SEQ ID NOs:313和617。用于抑制人Apaf1的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：827-832。
优选的实施方案包括包含靶向Apaf1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向Apaf1的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与Apaf1 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向Apaf1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包含转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向Apaf1的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向Apaf1的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除Apaf1基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含与Apaf1 mRNA内两个不同序列互补的两个向导序列。可选择地，包括与Apaf1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。Apaf1表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含与Apaf1mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.22 Blimp1
B淋巴细胞诱导的成熟蛋白-1(Blimp-1)表达与慢性病毒感染(Fu et.al.,2017.J.Biomedical Science 24,49https://doi.org/10.1186/s12929-017-0354-8.“Newinsights into Blimp-1 in T lymphocytes:a divergent regulator of cell destinyand effector function”)和癌症(Zhu et.al.,2017.J.Hematology and Oncology 10:124https://doi.org/10.1186/s13045-017-0486-z.“Blimp-1 impairs T cell functionvia upregulation of TIGIT and PD-1in patients with acute myeloid leukemia”)期间的T细胞衰竭相关。因此，使用多发夹amiRNA抑制Blimp1在T细胞中的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的Blimp1的有利的基因转移多核苷酸包括抑制Blimp1的多发夹amiRNA序列。抑制Blimp1的多发夹amiRNA序列包括含有与人Blimp1 mRNA的序列(SEQ ID NO:60)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与Blimp1 mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(SEQ ID NO:61)的3'。抑制Blimp1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:60互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列,以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制Blimp1的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:60互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列,以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的Blimp1的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:314和618、SEQ ID NOs:315和619、SEQ ID NOs:316和620、SEQ ID NOs:317和621、SEQ ID NOs:318和622、SEQ ID NOs:319和623、SEQ ID NOs:320和624、SEQ ID NOs:321和625，以及SEQ ID NOs:322和626。用于抑制人Blimp1的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：833-838。
优选的实施方案包括包含靶向Blimp1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向Blimp1的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与Blimp1 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向Blimp1的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向Blimp1的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向Blimp1的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了Blimp1基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含两个与Blimp1 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。可选择地，包括与Blimp1 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。Blimp1表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含互补于Blimp1 mRNA内两个不同序列的两个向导序列。
5.8.23 BTLA
耗尽的T细胞表达高水平的T淋巴细胞衰减因子(BTLA)(Jiang et.al.,2015.CellDeath&Disease 6,e1972 https://doi.org/10.1038/cddis.2015.162.“T-cellexhaustion in the tumor microenvironment”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制T细胞中BTLA的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的BTLA的有利的基因转移多核苷酸包括抑制BTLA的多发夹amiRNA序列。抑制BTLA的多发夹amiRNA序列包括含有与人BTLA mRNA的序列(例如SEQ IDNO:62)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与BTLA mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(例如SEQ IDNO:63)的3'。抑制BTLA的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:62互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中第一和第二向导序列彼此不同。抑制BTLA的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:62互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中BTLA的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:323和627、SEQ ID NOs:324和628、SEQ ID NOs:325和629、SEQ ID NOs:326和630、SEQ ID NOs:327和631、SEQ ID NOs:328和632、SEQ ID NOs:329和633，以及SEQ ID NOs:330和634。用于抑制人BTLA的示例性多发夹amiRNA序列是SEQID Nos：839-844。
优选的实施方案包括包含靶向BTLA的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向BTLA的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与BTLA mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向BTLA的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向BTLA的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向BTLA的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复序列。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了BTLA基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含两个与BTLA mRNA内两个不同序列互补的向导序列。可选择地，包括与BTLA mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。BTLA表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含与BTLAmRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.21 LAG-3
耗尽的T细胞表达高水平的淋巴细胞活化基因3蛋白(Lag-3)(Jiang et.al.,2015.Cell Death&Disease 6,e1972 https://doi.org/10.1038/cddis.2015.162.“T-cell exhaustion in the tumor microenvironment”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制T细胞中Lag-3的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的LAG-3的有利的基因转移多核苷酸包括抑制LAG-3的多发夹amiRNA序列。抑制LAG-3的多发夹amiRNA序列包括含有与人LAG-3 mRNA的序列(例如SEQ ID NO：64)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。抑制LAG-3的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:64互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制LAG-3的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:64互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的LAG-3的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs：331和635、SEQ ID NOs：332和636、SEQ ID NOs：333和637、SEQ ID NOs：334和638，SEQ ID NOs：335和639、SEQ ID NOs：336和640、SEQ ID NOs：337和641，以及SEQ IDNOs：338和642。用于抑制人LAG-3的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：845-850。
优选的实施方案包括包含靶向LAG-3的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向LAG-3的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与LAG-3 mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向LAG-3的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向LAG-3的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向LAG-3的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复序列。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了LAG-3基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含两个与LAG-3 mRNA内两个不同序列互补的向导序列。可选择地，包括与LAG-3 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。LAG-3表达的减少可以减轻肿瘤浸润淋巴细胞耗竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含与LAG-3 mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.22 TIGIT
耗尽的T细胞表达高水平的具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)(Jianget.al.,2015.Cell Death&Disease 6,e1972 https://doi.org/10.1038/cddis.2015.162.“T-cell exhaustion in the tumor microenvironment”)。因此，使用多发夹amiRNA抑制T细胞中TIGIT的表达是有利的。
用于抑制人免疫细胞中的TIGIT的有利的基因转移多核苷酸包括抑制TIGIT的多发夹amiRNA序列。抑制TIGIT的多发夹amiRNA序列包括含有与人TIGIT mRNA的序列(例如SEQ ID NO：65)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与TIGIT mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该序列位于开放阅读框(例如SEQ ID NO:66)的3'。抑制TIGIT的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:65互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制TIGIT的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:65互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的TIGIT的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:340和644、SEQ ID NOs:341和645、SEQ ID NOs:342和646、SEQ ID NOs:343和647、SEQ ID NOs:344和648、SEQ ID NOs：345和649，以及SEQ ID NOs：346和650。用于抑制人TIGIT的示例性多发夹amiRNA序列是SEQID NOs：851-856。
优选的实施方案包括包含靶向TIGIT的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向TIGIT的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与TIGIT mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向TIGIT的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向TIGIT的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向TIGIT的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了TIGIT基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含两个与TIGIT mRNA内两个不同序列互补的向导序列。可选择地，包括与TIGIT mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。TIGIT表达的减少可能会减轻肿瘤浸润淋巴细胞衰竭的表型。基因组包括抑制性多核苷酸的T细胞可具有改良的杀伤肿瘤细胞的能力，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该amiRNA包含与TIGIRmRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列。
5.8.26β-2-微球蛋白
过继的T细胞转移的一个限制是，患者自身T细胞的功能可能已受到先前治疗的影响，从而难以在体外增殖细胞。此外，提取患者自身的T细胞、修改它们并将其返回给患者的物流工作可能是一个重大的物流障碍。另一种方法是消除来自未匹配供体的T细胞的主要组织相容性复合体表达，例如通过敲除β-2-微球蛋白。这将防止过继转移的T细胞被患者自身的免疫反应清除。可以使用CRISPR/Cas9实现这种删除(Ren et.al.,2017.Clin.CancerRes.23:2255-2266.“Multiplex genome editing to generate universal CAR T cellsresistant to PD1 inhibition”)。或者，可以使用多发夹amiRNA来抑制β-2-微球蛋白的表达。
用于抑制人免疫细胞中的β-2-微球蛋白的有利的基因转移多核苷酸包括抑制β-2-微球蛋白的多发夹amiRNA序列。抑制β-2-微球蛋白的多发夹amiRNA序列包括第一向导序列，该第一向导序列包含与人β-2-微球蛋白mRNA的序列(例如SEQ ID NO:67)互补的连续19个核苷酸序列，以及包含与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与β-2-微球蛋白mRNA序列互补的连续的19个核苷酸序列，该核苷酸序列位于开放阅读框(例如SEQ ID NO：68)的3’。抑制β-2-微球蛋白的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:67互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制β-2-微球蛋白的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:67互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的β-2-微球蛋白的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs：347和651、SEQ ID NOs：348和652、SEQID NOs：349和653、SEQ ID NOs：350和654、SEQ ID NOs：351和655、SEQ ID NOs：352和656、SEQ ID NOs：353和657，以及SEQ ID NOs：354和658。用于抑制人β-2-微球蛋白的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：857-862。
优选的实施方案包括包含靶向β-2-微球蛋白的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。由靶向β-2-微球蛋白的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包括与β-2-微球蛋白mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复。
优选的实施方案包括包含靶向β-2-微球蛋白的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向β-2-微球蛋白的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向β-2-微球蛋白的转座子携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括两个发夹，每个发夹包含与靶mRNA互补的至少19个连续碱基的不同序列，并且每个发夹可操作地连接到在哺乳动物免疫细胞中有活性的异源启动子，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞，或B细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可能永久性降低或消除了β-2-微球蛋白基因的活性，该抑制性多核苷酸包括多发夹amiRNA，该多发夹amiRNA包含两个与β-2-微球蛋白mRNA内两个不同序列互补的向导序列。这样的免疫细胞会降低或消除免疫原性，因此会降低接受免疫细胞的患者排斥的风险。可选择地，包括与β-2-微球蛋白mRNA内的两个不同序列互补的两个向导序列的多发夹amiRNA与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子可操作地连接。
5.8.27 T细胞受体
从不匹配的供体过继转移T细胞有两个主要的潜在缺陷。首先是移植的T细胞将成为宿主免疫系统的目标。这个问题可以通过删除β-2-微球蛋白来解决。第二个问题是移植的T细胞可能会识别并摧毁不匹配的宿主。这种事件可以通过阻止T细胞受体的表达来避免。这可以使用CRISPR/Cas9实现(Ren et.al.,2017.Clin.Cancer Res.23:2255-2266.“Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1inhibition”)。或者，可以使用多发夹amiRNA靶向α(alpha)、β(beta)1和β(beta)2恒定区(分别为TCRα、TCRβ1和TCRβ2)来抑制T细胞受体的表达。
用于抑制人免疫细胞中的TCRα的有利的基因转移多核苷酸包括抑制TCRα的多发夹amiRNA序列。抑制TCRα的多发夹amiRNA序列包括含有与人TCRαmRNA的恒定区序列(SEQID NO:69)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与位于开放阅读框(SEQ ID NO:70)3’的TCRαmRNA序列互补的连续19个核苷酸序列。抑制TCRα的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:69互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制TCRα的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:69互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的TCRα的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs：355和659、SEQ ID NOs：356和660、SEQ ID NOs：357和661、SEQ ID NOs：358和662、SEQ ID NOs：359和663、SEQ ID NOs：360和664、SEQ ID NOs：361和665，以及SEQ ID NOs：362和666。
用于抑制人免疫细胞中的TCRβ1的有利的基因转移多核苷酸包括抑制TCRβ1的多发夹amiRNA序列。抑制TCRβ1的多发夹amiRNA序列包括含有与人TCRβ1 mRNA的恒定区序列(SEQ ID NO：71)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与开放阅读框(SEQ ID NO:72)的3’的TCRβ1 mRNA的序列互补的连续的19个核苷酸序列。抑制TCRβ1的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:71互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制TCRβ1的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:71互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的TCRβ1的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:363和667、SEQ ID NOs:364和668、SEQ IDNOs:365和669、SEQ ID NOs:366和670、SEQ ID NOs:367和671、SEQ ID NOs：368和672、SEQID NOs：369和673，以及SEQ ID NOs：370和674。
用于抑制人免疫细胞中的TCRβ2的有利的基因转移多核苷酸包括抑制TCRβ2的多发夹amiRNA序列。抑制TCRβ2的多发夹amiRNA序列包括含有与人TCRβ2 mRNA的恒定区序列(SEQ ID NO：73)互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。更优选地，所述第一向导序列包括与TCRβ2 mRNA序列互补的连续19个核苷酸序列，该核苷酸序列位于开放阅读框(SEQ ID NO:74)的3'。抑制TCRβ2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:73互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中所述第一和第二向导序列彼此不同。抑制TCRβ2的多发夹amiRNA序列可以可选择地包括含有与SEQ ID NO:73互补的连续19个核苷酸序列的第三向导序列，并且其中所述第一、第二和第三向导序列都彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。用于抑制人免疫细胞中的TCRβ2的示例性向导序列及其各自的过客序列是SEQ ID NOs:371和675、SEQ ID NOs:372和676、SEQID NOs:373和677、SEQ ID NOs:374和678、SEQ ID NOs:375和679、SEQ ID NOs：376和680、SEQ ID NOs：377和681，以及SEQ ID NOs：378和682。
用于抑制人类免疫细胞中的TCRα、TCRβ1和TCRβ2的有利基因转移多核苷酸包括多发夹amiRNA序列，该amiRNA序列具有与所有三个基因的mRNA互补的向导。抑制TCRα/TCRβ1/TCRβ2的多发夹amiRNA序列包括含有与人TCRαmRNA(SEQ ID NO：69)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第一向导序列，以及含有与第一向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第一过客序列。抑制TCRα/TCRβ1/TCRβ2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:69互补的连续19个核苷酸序列的第二向导序列，以及含有与第二向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第二过客序列，并且其中第一和第二向导序列彼此不同。抑制TCRα/TCRβ1/TCRβ2的多发夹amiRNA序列进一步包括第三向导序列，其含有与人TCRβ2 mRNA(SEQ ID NO：73)的序列互补的连续19个核苷酸序列，以及含有与第三向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第三过客序列。抑制TCRα/TCRβ2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:73互补的连续19个核苷酸序列的第四向导序列，以及含有与第四向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第四过客序列，并且其中第三和第四向导序列彼此不同。抑制TCRα/TCRβ1/TCRβ2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与人TCRβ1 mRNA(SEQ ID NO：71)的序列互补的连续19个核苷酸序列的第五向导序列，以及含有与第五向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第五过客序列。抑制TCRα/TCRβ1/TCRβ2的多发夹amiRNA序列进一步包括含有与SEQ ID NO:71互补的连续19个核苷酸序列的第六向导序列，以及含有与第六向导序列的反向互补序列至少78％相同的连续19个核苷酸序列的第六过客序列，并且其中第五和第六向导序列彼此不同。每个向导序列与其各自的过客序列相隔5到35个碱基。所述发夹可以以任何顺序出现在抑制性基因转移多核苷酸中。例如，包括与TCRα互补的向导的两个发夹可以彼此相邻，或者它们可以通过一个或多个包括与TCRβ2或TCRβ1互补的向导的发夹彼此分开。用于抑制人TCRα、TCRβ2和TCRβ1的示例性多发夹amiRNA序列是SEQ ID NOs：863-868。
优选的实施方案包括包含靶向TCRα、TCRβ1和TCRβ2的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是慢病毒载体的一部分。包括多发夹amiRNA的慢病毒载体可被包装并用于感染免疫细胞。所述免疫细胞优选地是T细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞。由靶向TCRα、TCRβ1和TCRβ2的慢病毒携带的多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括六个发夹，每个发夹包含至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与TCRαmRNA互补，其中两个与TCRβ1 mRNA互补，其中两个与TCRβ2 mRNA互补，每个发夹与在人免疫细胞中有活性的异源启动子可操作地连接，其中所述发夹和启动子的侧翼是慢病毒的反向末端重复序列。
优选的实施方案包括包含靶向TCRα和TCRβ2的多发夹amiRNA的多核苷酸，其中所述多核苷酸是转座子的一部分。所述转座子包括转座子末端，使得当转座子被引入免疫细胞并且免疫细胞表达相应的转座酶时，靶向TCRα、TCRβ1和TCRβ2的多发夹amiRNA被整合到免疫细胞的基因组中。由靶向TCRα、TCRβ1和TCRβ2的转座子携带多发夹amiRNA修饰的免疫细胞包括六个发夹，每个发夹包含至少19个连续碱基的不同序列，其中两个与TCRαmRNA互补，其中两个与TCRβ1 mRNA互补，其中两个与TCRβ2 mRNA互补，并且每个发夹与在人免疫细胞中有活性的异源启动子可操作地连接，其中所述发夹和启动子的侧翼是转座子的反向末端重复。所述转座子可以是piggyBac-like转座子或Mariner转座子，例如Sleeping Beauty转座子。所述免疫细胞优选地是T细胞(例如CD4T细胞、CD8 T细胞或自然杀伤(NK)T细胞。
基因组包括抑制性多核苷酸的免疫细胞可永久降低或消除TCRα和TCRβ2基因的活性，该抑制性多核苷酸包括含有六个向导序列的多发夹amiRNA，其中两个向导序列与TCRαmRNA中的两个不同序列互补，两个向导序列与TCRβ1 mRNA中的两个不同序列互补，并且两个向导序列与TCRβ2 mRNA中的两个不同序列互补。可选择地，包括六个向导序列的多发夹amiRNA可操作地连接到与编码嵌合抗原受体的基因相同的启动子,其中两个向导序列与TCRαmRNA中的两个不同序列互补，两个向导序列与TCRβ1 mRNA中的两个不同序列互补，并且两个向导序列与TCRβ2 mRNA中的两个不同序列互补。
5.8.28提高生存和增殖
优选地，相对于基因组不包括抑制性基因转移多核苷酸并且以正常水平表达内源性免疫细胞基因的免疫细胞的半衰期，基因组包括靶向内源性免疫细胞基因的抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞的半衰期增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。优选地，相对于基因组不包括抑制性基因转移多核苷酸并且以正常水平表达内源性免疫细胞基因的免疫细胞的最大寿命，基因组包括靶向内源性免疫细胞基因的抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞的最大寿命增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。优选地，相对于基因组包括靶向内源性免疫细胞基因的抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞的倍增时间，基因组不包括抑制性基因转移多核苷酸并且以正常水平表达内源性免疫细胞基因的免疫细胞的倍增时间长至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。优选地，相对于基因组不包括抑制性基因转移多核苷酸并且以正常水平表达内源性免疫细胞基因的免疫细胞的增殖率，基因组包括靶向内源性免疫细胞基因的抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞的增殖率增加至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少100％。
在某些环境条件下，例如在肿瘤微环境中，基因组包括抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞的增殖率可以增加。在某些环境条件下，例如在肿瘤微环境中，基因组包括抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞的半衰期可能会增加。在某些环境条件下，例如在肿瘤微环境中，基因组包括抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞的寿命可以增加。在某些环境条件下，例如在肿瘤微环境中，基因组包括抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞的倍增时间可能会减少。
细胞生存可以测量为一个群体中只有一半细胞存活所需的时间(半衰期)，或一个群体中所有细胞死亡所需的时间(最大寿命)。表达靶向免疫细胞抑制基因的抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞比不表达抑制基因转移多核苷酸的免疫细胞存活时间更长。测量这种效应的一种方法是将抑制基因转移多核苷酸整合到免疫细胞的基因组中,其中所述多核苷酸包括靶向内源性免疫细胞抑制基因的多发夹amiRNA，其与导致多发夹amiRNA在免疫细胞内表达的调控序列可操作地连接。基因组包括抑制基因转移多核苷酸的细胞表达amiRNA，其向导链RNA被加载到RISC复合物中并抑制靶mRNA的表达。存活的增强可以通过表达多发夹amiRNA的免疫细胞相对于不表达amiRNA的免疫细胞在体外或体内的半衰期增加来衡量。
细胞增殖可通过一个群体中的细胞数量翻倍所需的时间长度(倍增时间)或细胞群体在单位时间内增加的分数(增殖率)来测量。表达靶向内源性免疫细胞抑制基因的多发夹amiRNA的免疫细胞可能分裂更长时间，或者它们可能比不表达多发夹amiRNA的免疫细胞分裂得更快。增殖的增强可以通过表达多发夹amiRNA的免疫细胞相对于正常表达内源性免疫细胞抑制基因的免疫细胞的倍增时间的减少来测量。可以在免疫细胞开始表达多发夹amiRNA后的不同时间测量增殖率或倍增时间。在抑制性基因转移多核苷酸被整合到免疫细胞基因组5天后、10天后、15天后、20天后、25天后、30天后、35天后、40天后、45天后、50天后、55天后、或60天后，表达多发夹amiRNA的免疫细胞的增殖率可相对于不表达多发夹amiRNA的相同免疫细胞的增殖率增加。
T细胞杀死靶肿瘤细胞的能力可以测量为在某些确定的条件下杀死固定数量的靶细胞所需的T细胞数量。具有更高杀伤效率的T细胞可以杀死更多的肿瘤细胞。肿瘤杀伤可以通过在体外混合T细胞与靶细胞来测量，例如在细胞培养物中。肿瘤杀伤还可以在体内测量，例如在动物模型中，其中已知数量的肿瘤细胞被引入动物中，或者当动物中的肿瘤已经生长到一定大小时。表达靶向免疫细胞抑制基因的抑制性基因转移多核苷酸的T细胞比不表达抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞存活时间更长。它们还将保留杀死肿瘤细胞的能力。与正常表达免疫细胞抑制基因的T细胞数量相比，肿瘤杀伤的增强可以通过基因组包含多发夹amiRNA的T细胞数量来测量，该amiRNA靶向杀死已知数量的肿瘤细胞所需的免疫细胞抑制基因。基因组包括靶向免疫细胞抑制基因的多发夹amiRNA的T细胞对肿瘤的杀伤可能增加2倍(也就是说，杀死相同数量的肿瘤细胞需要两倍于正常情况下表达免疫细胞抑制基因的T细胞)，或肿瘤杀伤可能增加3倍，或肿瘤杀伤可能增加4倍，或肿瘤杀伤可能增加5倍，或肿瘤杀伤可能增加6倍，或肿瘤杀伤可能增加7倍，或者肿瘤杀伤可能增加8倍，或者肿瘤杀伤可能增加9倍，或者肿瘤杀伤可能增加10倍或更多。
在本发明的一些实施方案中，抑制性基因转移多核苷酸包括可由RNA加工酶Drosha和Dicer加工的两个发夹，从而将第一和第二向导RNA加载到RISC复合物中，并且第一和第二向导RNA互补并抑制相同内源性免疫细胞mRNA的表达。所述免疫细胞mRNA可以是任何天然免疫细胞基因。所述免疫细胞基因可以选自以下之一：TOX、TOX2、PD-1、CTLA-4、TIM-3、Nur77、Nuur1、NOR1、NFAT、FAS受体、caspase 3、caspase 7、caspase 8、caspase 9、caspase 10、死亡受体4、死亡受体5、Apaf1、Blimp1、BTLA、LAG-3、TIGIT、β-2-微球蛋白，T细胞受体的恒定区。优选地，在基因组不包括抑制性基因转移多核苷酸的免疫细胞中，靶基因的表达降低至小于靶基因正常表达水平的50％、40％、30％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％。
5.9靶标组合
同时抑制培养的哺乳动物细胞内源的多个基因的表达可能是有利的。这可以通过将靶向不同mRNA的向导链序列与适当的环和过客链序列组合以形成发夹来完成，优选地用发夹稳定序列稳定到向导-环-过客链序列的5'和3'，如第5.2.4节中所述。抑制性基因转移多核苷酸可以靶向任意数量的基因，并且多个抑制性基因转移多核苷酸可以整合到培养的哺乳动物细胞的基因组中。
5.10试剂盒
本发明的特征还在于包括转座酶作为蛋白质、或由核酸编码的转座酶、和/或转座子的试剂盒；或如本文所述的基因转移系统，其包括作为蛋白质或由如本文所述的核酸编码的转座酶，与转座子组合；可选择地与药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂一起，并可选择地与使用说明一起。本发明的试剂盒的任何组分可以以随后的顺序或并行的方式施用和/或转染到细胞中，例如，转座酶蛋白或其编码核酸可以在转座子的施用和/或转染之前、同时或之后施用和/或转染到如上定义的细胞中。或者，可以在转座酶蛋白或其编码核酸转染之前、同时或之后将转座子转染到如上定义的细胞中。如果平行转染，优选地两种组分在单独的制剂中提供和/或在施用前直接彼此混合以避免转染前的转座。此外，试剂盒的至少一种组分的施用和/或转染可以以时间交错的模式发生，例如通过给予该成分的多倍剂量。
实施例
以下实施例说明了本文公开的方法、组合物和试剂盒，并且不应以任何方式解释为限制。从下面的例子中可以清楚地看出各种等同物；这种等同物也被认为是本文公开的发明的一部分。
6.1减少分泌蛋白的岩藻糖基化
6.1.1抗体岩藻糖基化的微RNA减少
6.1.1.1消除稳定表达的抗体的岩藻糖基化
我们使用多发夹amiRNA基因来抑制抗体的岩藻糖基化。该抗体具有SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和SEQ ID NO:869给出的成熟重链序列，编码抗体的基因通过转座子整合到CHO细胞系的基因组中，该转座子进一步包括含有5'-TTAA-3'靶序列的左端，紧接着是具有SEQ ID NO：1006的ITR(其是SEQ ID NO：1004的一个实施方案)和具有SEQ ID NO：1000的附加序列和包括SEQ ID NO:1002的右端，紧接着是具有SEQ ID NO:1007(其是SEQID NO:1005的一个实施方案)的ITR，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。所述转座子进一步包括编码谷氨酰胺合成酶选择标记的基因。
构建了三种不同的多发夹amiRNA基因，其靶向Criteculus griseusα-(1,6)-岩藻糖基转移酶(FUT8)mRNA(其具有SEQ ID NO：1)。两个多发夹amiRNA，序列由SEQ ID NO:725和726给出，每个包括三个发夹；第一发夹包括向导链序列SEQ ID NO:75，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:379，第二发夹包括向导链序列SEQ ID NO:76，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:380，第三发夹包括向导链序列SEQID NO:77，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:381。这三个引向导链序列中的每一个都是22个碱基序列，它是Criteculus griseusα-(1,6)-岩藻糖基转移酶(FUT8)mRNA内不同区域的精确反向互补序列。每条过客链序列与其对应的向导链序列互补，只是过客链序列中对应于向导链5’碱基和向导链第12个碱基的碱基改为非互补。SEQID NO：75的向导链的第一个和第十二个碱基分别为G和C，相应的过客链序列SEQ ID NO：379中的相应碱基分别为A和A。SEQ ID NO：76的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和A，相应过客链序列SEQ ID NO：380中的相应碱基分别为C和C。SEQ ID NO：77的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQ ID NO：381中的相应碱基分别为C和A。多发夹amiRNA序列SEQ ID NOs:725和726中的每个发夹还包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:698紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ ID NOs：725和726进一步包括SEQ ID NO：693至第一发夹的5'的非结构化序列，以及SEQ ID NO：695至第三发夹的3'的非结构化序列。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:726进一步包括在第一和第二发夹之间具有SEQ ID NO:716的非结构化序列，以及在第二和第三发夹之间具有SEQ ID NO:717的非结构化序列。每个向导链序列都是不同的，并且每个都与Criteculus griseus FUT8(SEQ ID NO:1)的mRNA互补。
具有由SEQ ID NO:727给出的序列的第三个多发夹amiRNA也包括三个发夹；第一发夹包含向导链序列SEQ ID NO:78，紧接着是环序列SEQ ID NO:685和过客链序列SEQ IDNO:382，第二发夹包含向导链序列SEQ ID NO:79，紧接着是环序列SEQ ID NO:685和过客链序列SEQ ID NO:383，第三发夹包含向导链序列SEQ ID NO:80，紧接着是环序列SEQ ID NO:685和过客链序列SEQ ID NO:384。这三个向导链序列中的每一个都是21个碱基的序列，它是Criteculus griseusα-(1,6)-岩藻糖基转移酶(FUT8)mRNA内不同区域的精确反向互补序列。每条过客链序列与其对应的向导链序列互补，只是过客链序列中对应于向导链第十二和第十三碱基的碱基被删除。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:727中的每个发夹还包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:699紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:700紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:727进一步包括在第一发夹的5'具有SEQ ID NO:694的非结构化序列，以及在第三发夹的3'具有SEQ ID NO:696的非结构化序列。每个向导链序列都是不同的，并且每个都与Criteculus griseus FUT8(SEQ ID NO:1)的mRNA互补。
将三个多发夹amiRNA序列中的每一个置于编码红色荧光蛋白(由SEQ ID NO:723给出)的开放阅读框的3'，然后是兔珠蛋白聚腺苷酸化序列。将每个多发夹amiRNA序列克隆到转座子载体中，其中它与Pol II启动子[CMV启动子(具有SEQ ID NO：927)或EF1启动子(具有SEQ ID NO：898)，如表1所示]可操作地连接。所述转座子包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，该靶序列紧邻具有SEQ ID NO:1010的ITR,紧随其后的是具有SEQ ID NO:1008的附加序列，和包括SEQ ID NO:1009的右端，紧随其后的是具有SEQ ID NO:1011的ITR，紧随其后的是5'-TTAA-3'靶序列。它进一步包括编码嘌呤霉素选择标记的基因(具有多肽序列SEQ ID NO:886)。所述转座子的配置使得多发夹amiRNA、荧光蛋白基因以及所有必要的可操作地连接的控制元件都可以通过相应的转座酶进行转座。
转座子与编码转座酶SEQ ID NO:1086的mRNA共转染到表达具有由SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和由SEQ ID NO:869给出的成熟重链序列的抗体的克隆CHO细胞系中。转染细胞池在10μg/ml嘌呤霉素的存在下生长，直到它们的存活率达到95％。然后使用Sigma Advanced Fed Batch培养基以14天的补料分批方式培养它们。使用蛋白质A亲和层析从培养物上清液中纯化蛋白质，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上进行分析。质谱图如图3A-G所示。表1显示了用于图3A-G中所示每个迹线的不同转座子组件。
四个质谱峰由图3A-G中的箭头标识：(i)在50,424Da处是G0修饰的重链：保守的七糖核心由2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，这些残基β-1,2与α-6甘露糖和α-3甘露糖相连，形成两个臂；(ii)在50,571Da处是G0F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个岩藻糖残基；(iii)在50,586Da处是被G1修饰的重链：保守的七糖核心加上一个半乳糖残基，以及(iv)在50,733Da处是被G1F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个半乳糖残基和一个岩藻糖残基。图3A显示在起始克隆CHO细胞系中，在50,424Da处有一个小的G0峰，在50,571处有一个更大的G0F峰，表明大部分抗体被岩藻糖基化(大约80％使用相对峰高或曲线下的积分)。同样地，对于起始克隆CHO细胞系，在50,733处有一个显著的G1F峰。图3B-G均显示在50,424Da处有一个更大的G0峰，在50,571处没有可检测到的G0F峰，在50,733处也没有任何可检测到的G1F峰。我们得出结论：所有三种多发夹amiRNA结构，其发夹与哺乳动物细胞中活跃的PolII启动子(CMV启动子或EF1启动子)可操作地连接，充分抑制FUT8表达以完全抑制抗体岩藻糖基化。
6.1.1.2与不同Pol II启动子可操作地连接的多发夹amiRNAs
我们使用多发夹amiRNA基因来抑制具有SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和SEQ ID NO:869给出的成熟重链序列的抗体的岩藻糖基化，其中抗体从克隆CHO细胞系中稳定表达，如第6.1.1.1节所述。
如第6.1.1.1节所述，具有由SEQ ID NO:726给出的序列的多发夹amiRNA包括三个发夹，所述三个发夹具有与Criteculus griseusα-(1,6)-岩藻糖基转移酶(FUT8)的mRNA互补的向导。将多发夹amiRNA序列置于编码红色荧光蛋白(由SEQ ID NO:723给出)的开放阅读框的3'端，然后是兔珠蛋白聚腺苷酸化序列。多发夹amiRNA基因被克隆到三个不同的Bombyx转座子载体中，在每个载体中它与不同的Pol II启动子可操作地连接，该启动子比第6.1.1.1节中使用的强EF1和CMV启动子：大鼠EEF2启动子(序列由SEQ ID NO：934给出)、PGK启动子(序列由SEQ ID NO：969给出)和Ubb启动子(序列由SEQ ID NO：975给出)更弱。转座子包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，该靶序列紧邻具有SEQ ID NO:1010的ITR，紧接着是具有SEQ ID NO:1008的附加序列；以及包括SEQ ID NO:1009的右端，SEQ ID NO:1009紧接着是具有SEQ ID NO:1011的ITR，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。它进一步包括编码嘌呤霉素选择标记的开放阅读框，其多肽序列由SEQ ID NO:886给出。转座子被配置成使得多发夹amiRNA、荧光蛋白基因和选择标记基因以及所有必要的可操作地连接的控制元件可被相应的转座酶转座。
将转座子与编码转座酶SEQ ID NO:1086的mRNA共转染到表达抗体的克隆CHO细胞系中，该抗体具有SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和SEQ ID NO:869给出的成熟重链序列。转染细胞池在10μg/ml嘌呤霉素的存在下生长，直到它们的存活率达到95％。然后使用Sigma Advanced Fed Batch培养基以14天的补料分批方式培养它们。使用蛋白质A亲和层析从培养物上清液中纯化蛋白质，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上进行分析。质谱图如图4A-D所示。
三个质谱峰由图4A-D中的箭头标识：(i)在50,424Da处是G0修饰的重链：保守的七糖核心由2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，β-1,2与α-6甘露糖和α-3甘露糖相连，形成两臂；(ii)在50,570Da处是G0F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个岩藻糖残基；(iii)在23,443Da是轻链。图4A显示，在起始克隆CHO细胞系中，重链主要作为50,570处的单个G0F峰存在，表明大部分抗体被岩藻糖基化(使用相对峰高或曲线下积分，大约为85％)。图4B-D都显示了50,424Da处的单个G0峰，并且在50,570处没有可检测到的G0F峰。我们得出结论，所有这三个Pol II启动子、EEF2启动子、PGK启动子或泛素启动子都能够从多发夹amiRNA驱动足够的amiRNA表达，从而充分抑制FUT8表达以完全抑制抗体岩藻糖基化。
6.1.1.3修饰CHO细胞系以充当去岩藻糖基化(afucosylated)抗体瞬时产生的宿主
我们使用多发夹amiRNA基因来抑制CHO细胞池中的FUT 8表达。随后将细胞用于表达抗体，并对其进行岩藻糖基化测试。
如第6.1.1.1节所述，具有由SEQ ID NO:726给出的序列的多发夹amiRNA包括三个发夹，其具有与Criteculus griseusα-(1,6)-岩藻糖基转移酶(FUT8)的mRNA互补的向导。将多发夹amiRNA序列置于编码红色荧光蛋白(由SEQ ID NO:723给出)的开放阅读框的3'端，然后是兔珠蛋白聚腺苷酸化序列。将多发夹amiRNA基因克隆到Bombyx转座子载体中，其中它与EF1启动子(序列由SEQ ID NO：898给出)可操作地连接。转座子包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，该靶序列紧邻具有SEQ ID NO:1010的ITR，紧接着是具有SEQ ID NO:1008的附加序列；以及包括SEQ ID NO:1009的右端，SEQ ID NO:1009紧接着是具有SEQ IDNO:1011的ITR，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。它进一步包括编码嘌呤霉素选择标记的开放阅读框，其多肽序列由SEQ ID NO:886给出。转座子被配置成使得多发夹amiRNA、荧光蛋白基因和选择标记基因以及所有必要的可操作地连接的控制元件可被相应的转座酶转座。
转座子与编码转座酶SEQ ID NO:1086的mRNA共转染到不表达异源抗体序列的CHO细胞系中。转染细胞池在10μg/ml嘌呤霉素的存在下生长，直到它们的存活率达到95％。然后用编码抗体的基因转染细胞池，该抗体具有SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和SEQID NO:871给出的成熟重链序列。不含amiRNA的亲本CHO细胞系也用这些编码抗体的质粒作为对照转染。使用ThermoFisher ExpiCHO培养基在7天的瞬时培养中培养转染的细胞池。使用蛋白质A亲和层析从培养物上清液中纯化蛋白质，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上进行分析。质谱图如图5A-B所示。
三个质谱峰由图5A-B中的箭头标识：(i)50521Da处是经G0修饰的重链：保守的七糖核心由2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，这些残基β-1,2与α-6甘露糖和α-3甘露糖连接，形成两个臂；(ii)在50,668Da处是G0F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个岩藻糖残基；(iii)在23,444Da是轻链。图5A显示在由亲本CHO细胞系产生的抗体中，重链主要以50,668处的单个G0F峰存在，没有可检测的去岩藻糖基化重链。图5B显示了当从基因组包括多发夹amiRNA基因的细胞池中产生相同抗体时，在50,521Da处有一个重链G0峰，而在50,668处没有可检测的G0F峰。我们得出结论，将包括可操作地连接到PolII启动子的SEQ ID NO:726的多发夹amiRNA基因稳定整合到CHO基因组中，导致细胞池中FUT8表达降低到仅产生去糖基化抗体的水平。
6.1.1.4使用针对多个不同基因的多发夹amiRNA基因消除稳定表达抗体的岩藻糖基化
岩藻糖基化发生在高尔基体中。作为抑制岩藻糖基转移酶的替代方法，原则上可以通过阻断岩藻糖的细胞合成来防止分泌抗体的岩藻糖基化。GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)是岩藻糖合成中的关键酶，因此是RNA干扰的潜在目标。然而，还有一条岩藻糖补救途径可以绕过GMD步骤的阻断。这反过来又可以通过抑制GDP-岩藻糖转运蛋白1(GFT)阻止岩藻糖进入高尔基体来抑制。
多发夹amiRNA基因被设计成靶向Criteculus griseus GDP-甘露糖4，6-脱水酶(GMD)和GDP-岩藻糖转运蛋白1(GFT)。具有由SEQ ID NO:732给出的序列的多发夹amiRNA包括四个发夹；第一发夹包含向导链序列SEQ ID NO：87(与GMD的mRNA互补，具有由SEQ IDNO：3给出的序列)，紧接着是环序列SEQ ID NO：683和过客链序列SEQ ID NO：391；第二发夹包含向导链序列SEQ ID NO：93(与GFT的mRNA互补，具有由SEQ ID NO：5给出的序列)，紧接着是环序列SEQ ID NO：683和过客链序列SEQ ID NO：397；第三发夹包含向导链序列SEQ IDNO:88(与GMD的mRNA互补，具有由SEQ ID NO:3给出的序列)，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:392；并且第四个发夹包含向导链序列SEQ ID NO:94(与GFT的mRNA互补，具有由SEQ ID NO:5给出的序列)，紧随其后的是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:398。每条过客链序列与其对应的向导链序列互补，只是过客链序列中对应于向导链5’碱基和向导链第12个碱基的碱基改为非互补。SEQ ID NO：87的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应过客链序列SEQ ID NO：391中的相应碱基分别为C和A。SEQ ID NO：93的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和C，相应的过客链序列SEQ IDNO：397中的相应碱基分别为C和A。SEQ ID NO：88的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和T，相应的过客链序列SEQ ID NO：392中的相应碱基分别为C和C。SEQ ID NO：94的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQ ID NO：398中的相应碱基分别为C和A。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:732中的每个发夹还包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:698紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:732进一步包括在第一发夹的5'具有SEQ ID NO:693的非结构化序列，以及在第四个发夹的3'具有SEQ ID NO:695的非结构化序列。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:732进一步包括在第一和第二发夹之间具有SEQ ID NO:716的非结构化序列，和在第二和第三发夹之间具有SEQ ID NO：717的非结构化序列，以及在第三和第四发夹之间具有SEQ ID NO：718的非结构化序列。因此，多发夹amiRNASEQ ID NO：732包括与Criteculus griseus GMD mRNA互补的两条向导链序列和与灰仓鼠GFT mRNA互补的两条向导链序列，其中每个向导链序列不同。
将具有SEQ ID NO:732的多发夹amiRNA序列置于编码红色荧光蛋白(由SEQ IDNO:723给出)的开放阅读框的3'，然后是兔珠蛋白聚腺苷酸化序列。然后将多发夹amiRNA克隆到转座子载体中，其中它与Pol II启动子(人CMV启动子)可操作地连接。转座子包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，该靶序列紧邻具有SEQ ID NO:1010的ITR，紧接着是具有SEQ ID NO:1008的附加序列；以及包括SEQ ID NO:1009的右端，SEQ ID NO:1009紧接着是具有SEQ ID NO:1011的ITR，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。其进一步包括编码嘌呤霉素选择标记的基因(具有多肽序列SEQ ID NO：886)。转座子的配置使得多发夹amiRNA、荧光蛋白基因以及所有必要的可操作地连接的控制元件都可以通过相应的转座酶进行转座。
将转座子与编码转座酶SEQ ID NO:1086的mRNA共转染到克隆CHO细胞系中，该细胞系表达具有由SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和由SEQ ID NO:869给出的成熟重链序列的抗体。转染细胞池在10μg/ml嘌呤霉素的存在下生长，直到它们的存活率达到95％。然后使用Sigma Advanced Fed Batch培养基以14天的补料分批方式培养它们。使用蛋白A亲和层析从培养物上清液中纯化蛋白质，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上进行分析。与经G0F或G1F:G0和G1(添加岩藻糖残基)修饰的抗体重链的百分比相比，表2显示了经G0(保守的七糖核心由2个N-乙酰葡糖胺、3个甘露糖和2个其它N-乙酰葡糖胺残基组成，这些残基β-1,2与α-6甘露糖和α-3甘露糖相连，形成两个臂)或G1(保守七糖核心加半乳糖残基)修饰的抗体重链的百分比。
如表2所示，从未用多发夹amiRNA转染的对照细胞系表达的抗体具有约75％的岩藻糖基化水平。相比之下，在基因组包括具有SEQ ID NO:732的多发夹amiRNA的细胞池中，质谱法检测不到岩藻糖。我们得出结论，这两种多发夹amiRNA都完全抑制了抗体岩藻糖基化。我们得出结论，将包括可操作地连接到PolII启动子的SEQ ID NO:732的多发夹amiRNA基因稳定整合到CHO基因组中，导致细胞池中GMD和GFT表达降低到仅产生去糖基化抗体的水平。
6.1.1.5修饰人类细胞系以作为去岩藻糖基化抗体瞬时产生的宿主
设计了两种不同的多发夹amiRNA序列来靶向参与人类细胞岩藻糖基化途径的基因：α-(1,6)-岩藻糖基转移酶(FUT8)、GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)，和GDP-岩藻糖转运蛋白1(GFT)。一个多发夹amiRNA，其序列由SEQ ID NO:734给出，包括三个发夹；第一发夹包含向导链序列SEQ ID NO:81，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:385，第二发夹包含向导链序列SEQ ID NO:82，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQID NO:386，第三发夹包含向导链序列SEQ ID NO:83，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:387。这三个向导链序列中的每一个都是22个碱基序列，它是智人(Homo sapiens)α-(1,6)-岩藻糖基转移酶(FUT8)mRNA内不同区域的精确反向互补序列。每条过客链序列与其对应的向导链序列互补，只是过客链序列中对应于向导链5’碱基和向导链第12个碱基的碱基改为非互补。SEQ ID NO：81的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和T，相应的过客链序列SEQ ID NO：385中的相应碱基分别为C和C。具有SEQ ID NO：82的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和T，相应的过客链序列SEQ ID NO：386中的相应碱基分别为C和C。具有SEQ ID NO：83的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和A，相应的过客链序列SEQ ID NO：387中的相应碱基分别为C和C。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:734中的每个发夹进一步包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:698紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:734进一步包括在第一发夹的5'具有SEQ ID NO:693的非结构化序列，以及在第三发夹的3'具有SEQ IDNO:695的非结构化序列。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO：734进一步包括在第一和第二发夹之间具有SEQ ID NO：716的非结构化序列，以及在第二和第三发夹之间具有SEQ ID NO：717的非结构化序列。每个向导链序列都是不同的，并且每个都与智人FUT8(SEQ ID NO:7)的mRNA互补。
第二个多发夹amiRNA基因被设计为靶向智人GDP-甘露糖4,6-脱水酶(GMD)，其mRNA序列由SEQ ID NO:8给出，以及GDP-岩藻糖转运蛋白1(GFT)，其mRNA序列由SEQ ID NO:9给出。序列由SEQ ID NO:736给出的多发夹amiRNA包括四个发夹；第一发夹包含向导链序列SEQ ID NO：99(与人GMD的mRNA互补，具有序列SEQ ID NO：8)，紧接着是环序列SEQ IDNO：683和过客链序列SEQ ID NO：403；第二发夹包含向导链序列SEQ ID NO:104(与人GFT的mRNA互补，序列由SEQ ID NO:9给出)，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ IDNO:408；第三发夹包含向导链序列SEQ ID NO:102(与人GFT的mRNA互补，具有序列SEQ IDNO:9)，紧随其后的是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:406，以及第四个发夹包含向导链序列SEQ ID NO：101(与人GMD的mRNA互补，序列由SEQ ID NO：8给出)，紧接着是环序列SEQ ID NO：683和过客链序列SEQ ID NO：405。每条过客链序列与其对应的向导链序列互补，只是过客链序列中对应于向导链5’碱基和向导链第12个碱基的碱基改为非互补。SEQ ID NO：99的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQ IDNO：403中的相应碱基分别为C和A。SEQ ID NO：104的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和A，相应的过客链序列SEQ ID NO：408中的相应碱基分别为C和C。SEQ ID NO：102的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQ ID NO：406中的相应碱基分别为C和A。SEQ ID NO：101的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和C，相应的过客链序列SEQ ID NO：405中的相应碱基分别为C和A。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:736中的每个发夹还包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:698紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:736进一步包括在第一发夹的5'具有SEQ ID NO:693的非结构化序列和在第四个发夹的3'具有SEQ ID NO:695的非结构化序列。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:732进一步包括在第一和第二发夹之间具有SEQ ID NO:716的非结构化序列，和在第二和第三发夹之间具有SEQ ID NO：717的非结构化序列，以及在第三和第四发夹之间具有SEQ ID NO：718的非结构化序列。因此，多发夹amiRNA SEQ ID NO：736包括与智人GMD mRNA互补的两条向导链序列和与智人GFT mRNA互补的两条向导链序列，其中每条向导链序列是不同的。
将多发夹amiRNA序列置于编码红色荧光蛋白(由SEQ ID NO:723给出)的开放阅读框的3'，然后是兔珠蛋白聚腺苷酸化序列。将每个多发夹amiRNA序列克隆到转座子载体中，其中它与Pol II启动子(具有SEQ ID NO：927的CMV启动子)可操作地连接。转座子包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，该靶序列紧邻具有SEQ ID NO：1010的ITR，紧接着是具有SEQ ID NO：1008的附加序列，和包括SEQ ID NO：1009的右端，紧接着是具有SEQ ID NO：1011的ITR，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。其进一步包括编码嘌呤霉素选择标记的基因(具有多肽序列SEQ ID NO：886)。转座子的配置使得多发夹amiRNA、荧光蛋白基因以及所有必要的可操作地连接的控制元件都可以通过相应的转座酶进行转座。
转座子与编码转座酶SEQ ID NO：1086的mRNA共转染到不表达异源抗体序列的人胚胎肾(HEK)细胞系中。转染细胞池在10μg/ml嘌呤霉素的存在下生长，直到它们的存活率达到95％。然后在两个独立的反应中用编码抗体的基因转染每个细胞池，该抗体具有由SEQID NO:870给出的成熟轻链序列和由SEQ ID NO:871给出的成熟重链序列。抗体基因与人CMV启动子和兔珠蛋白聚腺苷酸化信号序列可操作地连接。使用ThermoFisher Expi293培养基在7天的瞬时培养中培养转染的细胞池。使用蛋白质A亲和层析从培养物上清液中纯化蛋白质，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上进行分析。峰被鉴定并量化，对应于(i)经G0修饰的重链：保守的七糖核心由2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，这些残基β-1,2与α-6甘露糖和α-3甘露糖相连，形成两个臂，(ii)经G0加岩藻糖(G0F)修饰的重链，(iii)经G0加额外半乳糖残基(G1)修饰的重链，以及(iv)经G0加额外半乳糖残基加岩藻糖(G1F)修饰的重链。表3显示了由转染的HEK细胞池产生的抗体效价，以及在每种情况下观察到的岩藻糖基化。
在不存在多发夹amiRNA的情况下，HEK细胞产生的抗体的岩藻糖基化率在93％到100％之间(表3第1行和第2行)。基因组包括SEQ ID NO:736(表3第5行和第6行)的抗GMD/GFT多发夹amiRNA基因的两个细胞池复制都显示完全消除了抗体岩藻糖基化。基因组包括SEQ ID NO:734的抗FUT8多发夹型amiRNA(表3第3行和第4行)的两个细胞池复制都显示抗体岩藻糖基化减少约90％。我们得出结论，包括SEQ ID NO:734或736的多发夹amiRNA基因稳定整合到HEK基因组中抑制了岩藻糖基化途径中基因的表达，使得所得细胞池产生大部分或完全去岩藻糖基化的抗体。
对基因组包括具有SEQ ID NO:734的抗FUT8多发夹amiRNA的HEK细胞池之一进行单细胞克隆。产生了四种单克隆细胞系。这些细胞系中的每一个在两个独立的反应中用编码抗体的基因转染，该抗体具有由SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和由SEQ ID NO:871给出的成熟重链序列。抗体基因与人CMV启动子和兔珠蛋白聚腺苷酸化信号序列可操作地连接。转染的细胞使用ThermoFisher Expi293培养基在7天的瞬时培养中生长。如上所述，使用蛋白质A亲和层析从培养上清液中纯化蛋白质，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上分析是否存在岩藻糖基化抗体。表4显示了从克隆制备的抗体的岩藻糖基化水平。
基因组不包括多发夹amiRNA基因的细胞产生的抗体岩藻糖基化率在90％到94％之间(表4第1行和第2行)。四个不同的克隆产生的抗体具有显著不同的岩藻糖基化水平，尽管在同一克隆细胞系中进行的复制之间的水平非常相似。克隆细胞系1产生约40％岩藻糖基化的抗体，来自克隆系2的抗体约20％岩藻糖基化，克隆系3产生约13％岩藻糖基化的抗体，克隆系4产生具有6％至10％岩藻糖基化的抗体。在四个克隆系中的至少一个系中稳定地保持对岩藻糖基化的抑制。
包括多发夹amiRNA基因的转座子可整合到HEK293细胞的基因组中，以减少HEK细胞产生的抗体的岩藻糖基化，该amiRNA基因包括多个向导链序列，每个向导链序列与人类FUT8 mRNA(序列由SEQ ID NO:7给出)内的不同序列互补。优选地，由细胞系产生的小于40％的抗体被岩藻糖基化，更优选地，由细胞系产生的小于20％的抗体被岩藻糖基化，更优选地，由细胞系产生的小于10％的抗体被岩藻糖基化。
6.1.2双功能微RNAs：基因敲除和可选择的标记衰减
6.1.2.1岩藻糖基化靶向microRNAs并入选择标记基因的3'UTR
如第5.2.7节所述，将多发夹amiRNA序列并入选择标记基因的3’UTR中可能是有利的，尤其是当选择标记是转座子的一部分时。转录后，amiRNA序列的处理使选择标记mRNA不稳定，因为它会导致去除稳定的polyA序列。这意味着为了提供足够的选择标记基因编码的选择标记蛋白，转座子的表达需要高于在选择标记3'UTR中没有amiRNA序列的转座子的表达。在选择标记的3'UTR中包括amiRNA序列，因此要么选择基因组包括更多转座子拷贝的细胞，要么选择转座子整合到基因组转录活性更强区域的细胞。另一个优点是，转座子大小仅增加很小的一部分(小于额外的1,000bp)就可以通过抑制一个或多个宿主基因的表达来影响表型变化。例如，这可以与引入编码待表达蛋白质的基因同时进行。为了证明这一点，amiRNA序列被放置在一个基因的3'UTR中，用于在哺乳动物细胞中表达谷氨酰胺合成酶。
一、二、或三发夹amiRNA被并入转座子上谷氨酰胺合成酶选择标记的3'UTR中。如第6.1.1.1节所述，序列由SEQ ID NO:726给出的多发夹amiRNA包括三个发夹。
具有由SEQ ID NO:728给出的序列的多发夹amiRNA包括两个发夹，第一发夹包含向导链序列SEQ ID NO:75，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:379，第二发夹包含向导链序列SEQ ID NO:76，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQID NO:380。这两个向导链序列中的每一个都是22碱基序列，它是Criteculus griseusα-(1,6)-岩藻糖基转移酶(FUT8)mRNA内不同区域的精确反向互补序列。向导链和过客链序列之间的错配如第6.1.1.1节所述。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:728中的每个发夹进一步包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:698紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ ID NOs:728进一步包括在第一发夹的5'具有SEQ ID NO:693的非结构化序列，以及在第三发夹的3'具有SEQ ID NO:695的非结构化序列。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO：728还包括在第一和第二发夹之间具有SEQ ID NO：716的非结构化序列。每个向导链序列都是不同的，并且每个都与Criteculus griseusFUT8(SEQ ID NO:1)的mRNA互补。
我们还设计并合成了具有由SEQ ID NO:729给出的序列的单发夹amiRNA，其包括一个发夹，该发夹包含向导链序列SEQ ID NO:75，紧随其后的是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:379。向导链和过客链序列之间的错配如第6.1.1.1节所述。amiRNA序列SEQ ID NO：729中的发夹进一步包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO：697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO：698紧接在过客链序列之后。amiRNA序列SEQ ID NO:729进一步包括在发夹的5'具有SEQ ID NO:693的非结构化序列，以及在发夹的3'具有SEQ IDNO:695的非结构化序列。
这些amiRNA序列被置于编码谷氨酰胺合成酶蛋白(多肽序列由SEQ ID NO:891给出)的开放阅读框的3’，然后是人珠蛋白聚腺苷酸化序列。amiRNA基因被克隆到转座子载体中，其中它们与Pol II启动子可操作地连接。转座子进一步包括编码具有由SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和由SEQ ID NO:872给出的成熟重链序列的抗体的基因。转座子进一步包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，紧随其后的是具有SEQ ID NO:1006(其是SEQID NO:1004的一个实施方案)的ITR和具有SEQ ID NO:1000的附加序列，以及包括SEQ IDNO:1002的右端，SEQ ID NO:1002紧接着是具有SEQ ID NO:1007的ITR(其是SEQ ID NO:1005的一个实施方案)，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。转座子的配置使得多发夹amiRNA、谷氨酰胺合成酶基因和两条抗体链的基因，以及所有必要的可操作地连接的控制元件都可以被相应的转座酶转座。
转座子与编码转座酶SEQ ID NO:1056的mRNA共转染到没有功能性谷氨酰胺合成酶基因的CHO细胞系中。转染细胞池在培养基中不添加谷氨酰胺的情况下生长，直到它们的存活率达到95％。然后使用Sigma Advanced Fed Batch培养基以14天的补料分批方式培养它们。使用蛋白质A亲和层析从培养物上清液中纯化蛋白质，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上进行分析。我们对50,456Da(对应G0修饰的重链：保守的七糖核心由2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，这些残基β-1,2与α-6甘露糖和α-3甘露糖相连，形成两个臂)和50,602(对应于G0F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个岩藻糖残基)处峰下的面积进行积分，以计算岩藻糖基化和去岩藻糖基化抗体的相对比例。结果如表5所示。
表5显示，当强CMV或EEF2启动子与谷氨酰胺合成酶基因和其3'UTR中的多发夹amiRNA可操作地连接时，抗体完全去岩藻糖基化(表5第1行和第2行)。这与在谷氨酰胺合成酶基因的3'UTR中没有amiRNA序列的等效转座子时看到的大约80-85％岩藻糖基化形成对比(如第6.1.1.1和6.1.1.2节所述)。因为这些启动子很强，它们表达高水平的谷氨酰胺合成酶，这意味着细胞不需要许多整合转座子的拷贝来合成足够的谷氨酰胺来存活。因此培养上清液中的抗体效价较低：在最强(CMV)启动子的情况下最低(163mg/L)(表5第E列)，而在较弱的EEF2启动子的情况下更高(443mg/L)。与多发夹amiRNASEQ ID NO：726(通过在编码选择标记的开放阅读框之后，但在polyA信号序列之前加入amiRNA发夹)可操作地连接的CMV和EEF2启动子完全消除了抗体的岩藻糖基化(表5，第F和G列)。
当较弱的启动子与谷氨酰胺合成酶可操作地连接时，并且3’UTR仅包括单个amiRNA发夹(具有SEQ ID NO:729的amiRNA，表5第3行)，抗体效价为514mg/L：与第6.1.1.1节和6.1.1.2节中描述的约80-85％的天然水平相比，比使用CMV启动子时高约3倍，但抗体仍有约50％岩藻糖基化。如表5第4行所示，将第二个amiRNA发夹添加到谷氨酰胺合成酶(amiRNA SEQ ID NO:728)的3'UTR具有增加抗体效价(至770mg/L)和减少抗体岩藻糖基化(至10％)的双重效果。这些效应源于对选择标记3'UTR的更多加工，这会在RISC复合物中产生更多的FUT8靶向RNA，并且还会增加谷氨酰胺合成酶选择标记mRNA的不稳定。如表5第5行所示，当PGK启动子与谷氨酰胺合成酶基因可操作地连接时，这种趋势会继续，在其3'UTR(SEQ ID NO:726)中具有三发夹amiRNA。抗体效价进一步提高到835mg/L，完全阻止了抗体的岩藻糖基化。
该实施例还证明了使用多发夹amiRNA序列的益处，其中两个或多个不同的向导链序列与同一靶mRNA中的两个或多个不同的序列互补。使用具有与FUT8 mRNA互补的一条向导链序列的单个发夹amiRNA降低了FUT8表达，这导致抗体岩藻糖基化从大约80％减少到50％。使用具有与FUT8 mRNA内不同序列互补的两条不同向导链序列的多发夹可更多地降低FUT8表达，并导致抗体岩藻糖基化降低至10％。使用具有与FUT8 mRNA内的不同序列互补的三个不同向导链序列的多发夹进一步降低FUT8表达，并导致抗体岩藻糖基化降低至检测限以下。
6.1.2.2岩藻糖基化靶向microRNAs并入选择标记基因的3'UTR并由不同启动子驱动
如6.1.2.1节所述，具有SEQ ID NO:726的多发夹amiRNA能够完全抑制抗体的岩藻糖基化。然而，我们也希望增加抗体的效价。如第5.2.7节所述，减弱谷氨酰胺合成酶选择标记的表达可以提高转座子编码基因的表达。如第6.1.2.1节所述，从PGK启动子转录多发夹amiRNA序列提供了足够的与RISC复合物相关的向导链，以将通过FUT8的岩藻糖基化降低到可检测水平以下。因此，我们希望以不会减少多发夹amiRNA转录的方式减弱谷氨酰胺合成酶的表达。为此，我们在谷氨酰胺合成酶基因之前测试了抑制性5'UTRs的掺入。这些应该减少谷氨酰胺合成酶的表达而不影响多发夹amiRNA的转录。我们还测试了在存在抑制性5’UTRs的情况下，通过将谷氨酰胺合成酶和多发夹amiRNA与较弱的HSV-TK启动子进行可操作地连接，以表达谷氨酰胺合成酶和具有SEQ ID NO:726的多发夹amiRNA。
将具有SEQ ID NO:726的三发夹amiRNA并入转座子上谷氨酰胺合成酶选择标记的3'UTR。将该amiRNA序列置于编码谷氨酰胺合成酶蛋白的开放阅读框的3′端，该谷氨酰胺合成酶蛋白具有由SEQ ID NO:891给出的多肽序列，随后是人珠蛋白多聚腺苷酸化序列。amiRNA基因被克隆到不同的转座子载体中，其中它与不同的Pol II启动子可操作地连接。每个转座子进一步包括编码抗体的基因，该抗体具有SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和SEQ ID NO:872给出的成熟重链序列。转座子进一步包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，紧随其后的是具有SEQ ID NO:1006(其是SEQ ID NO:1004的一个实施方案)的ITR和具有SEQ ID NO:1000的附加序列，以及包括SEQ ID NO:1002的右端，SEQ ID NO:1002紧接着是具有SEQ ID NO:1007(其是SEQ ID NO:1005的一个实施方案)的ITR，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。转座子的配置使得多发夹amiRNA、谷氨酰胺合成酶基因和两条抗体链的基因，以及所有必要的可操作地连接的控制元件都可以被相应的转座酶转座。
转座子与编码转座酶SEQ ID NO:1056的mRNA共转染到没有功能的谷氨酰胺合成酶基因的CHO细胞系中。转染细胞池在培养基中不添加谷氨酰胺的情况下生长，直到它们的存活率达到95％。然后使用Sigma Advanced Fed Batch培养基以14天的补料分批方式培养它们。使用蛋白质A亲和层析从培养物上清液中纯化蛋白质，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上进行分析。我们整合了50,456Da(对应于G0修饰的重链：保守的七糖核心由2个N-乙酰氨基葡萄糖、3个甘露糖和2个其它N-乙酰氨基葡萄糖残基组成，这些残基β-1,2连接到α-6甘露糖和α-3甘露糖，形成两个臂)和50,602(对应于G0F修饰的重链：保守的七糖核心加上一个岩藻糖残基)峰下的面积来计算岩藻糖化和去岩藻糖化抗体的相对比例。结果如表6所示。
表6显示当具有SEQ ID NOs 985或986的抑制性5'UTR序列置于PGK启动子和谷氨酰胺合成酶基因之间时，抗体效价约为2g/L(表6第2行和第3行)。这与使用更高水平减毒的谷氨酰胺合成酶所见的效价非常相似，但在基因的3'UTR中没有amiRNA发夹(表6第1行)，并且是第6.1.2.1节和表5第5行中没有这种衰减5'UTR元件时所见效价的两倍多。然而，在不存在amiRNA的情况下，82％的抗体被岩藻糖基化(表6，第G列)，这与I部分6.1.1.1和6.1.1.2中看到的80-85％岩藻糖基化一致。当转座子在谷氨酰胺合成酶基因的3'UTR中包括amiRNA时，抗体被完全去岩藻糖基化(表6，第F列)。使用较弱的HSV-TK启动子也产生被完全去岩藻糖基化的抗体(表6第4行和第5行)，尽管效价不如使用PGK启动子高。
第1-5行中显示的转座子中的抗体开放阅读框与EF1启动子可操作地相似。在第6-7行，抗体开放阅读框与CMV启动子可操作地连接。在第6行中，谷氨酰胺合成酶基因在3'UTR中缺少多发夹amiRNA序列。与第1行中的EF1驱动的抗体一样，该抗体的岩藻糖基化率约为80％，效价为4.2g/L。在第7行中，谷氨酰胺合成酶基因包括多发夹amiRNA序列，在3'UTR中具有SEQ ID NO:726。与第2-5行中的EF1驱动的抗体一样，抗体岩藻糖基化被完全抑制，而效价超过3g/L。
我们得出结论，有可能将多发夹amiRNA掺入转座子上的选择标记的3'UTR，将转座子整合到培养的哺乳动物细胞的基因组中，并获得转座子表达的基因的良好效价，同时完全抑制培养的哺乳动物细胞的内源基因。包括靶向CHO FUT8 mRNA的多发夹amiRNA序列的谷氨酰胺合成酶基因的示例性序列作为SEQ ID NOs：1189-1198给出。
6.1.3用微RNAs抑制谷氨酰胺合成酶的工程
6.1.3.1靶向谷氨酰胺合成酶的microRNAs
如5.6节所述，具有SEQ ID NO 741的多发夹amiRNA包括与中国仓鼠谷氨酰胺合成酶mRNA中的3个不同序列互补的3个向导链序列。具有SEQ ID NO:741给出的序列的多发夹amiRNA包括三个发夹；第一发夹包含向导链序列SEQ ID NO：114，紧接着是环序列SEQ IDNO：683和过客链序列SEQ ID NO：418，第二发夹包含向导链序列SEQ ID NO:115，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:419，第三发夹包含向导链序列SEQ ID NO:116，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:420。这三个向导链序列中的每一个都是22碱基序列，它是Criteculus griseus谷氨酰胺合成酶mRNA内不同区域的精确反向互补。每条过客链序列与其对应的向导链序列互补，只是过客链序列中对应于向导链5’碱基和向导链第12个碱基的碱基改为非互补。具有SEQ ID NO：114的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和T，相应的过客链序列SEQ ID NO：418中的相应碱基分别为C和C。具有SEQ ID NO：115的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和A，相应的过客链序列SEQID NO：419中的相应碱基分别为C和C。具有SEQ ID NO:116的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQ ID NO:420中的相应碱基分别为C和A。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:741中的每个发夹还包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:698紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ IDNO:741进一步包括在第一发夹的5'具有SEQ ID NO:693的非结构化序列，以及在第三发夹的3'具有SEQ ID NO:695的非结构化序列。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO：741进一步包括在第一和第二发夹之间具有SEQ ID NO：716的非结构化序列，以及在第二和第三发夹之间具有SEQ ID NO：717的非结构化序列。每个向导链序列都是不同的，并且每个都与Criteculusgriseus谷氨酰胺合成酶的mRNA(SEQ ID NO:17)互补。
将多发夹amiRNA克隆到piggyBac-like的转座子中，该转座子位于间隔多核苷酸的3'，该间隔多核苷酸序列由SEQ ID NO:724给出，并且可操作地连接至具有由SEQ ID N0:969给出的序列的PGK启动子。多发夹amiRNA基因序列如SEQ ID NO：1180所示。piggyBac-like转座子进一步包括赋予对G418/新霉素抗性的选择标记，其氨基酸序列由SEQ ID NO:880给出。PiggyBac-like转座子还包括靶序列5'-TTAA-3'，紧接着是具有SEQ ID NO:1032序列的ITR，它是SEQ ID NO:1030的一个实施方案，紧随其后的是更远的具有序列SEQ IDNO:1028的转座子末端序列。piggyBac-like转座子进一步包括由SEQ ID NO:1029给出的序列，紧随其后的是具有SEQ ID NO:1033序列的第二个ITR，它是SEQ ID NO:1031的一个实施方案，紧随其后的是靶序列5'-TTAA-3'。转座子被配置成使得多发夹amiRNA、间隔多核苷酸和编码选择标记的基因以及所有必需的可操作地连接的控制元件可被相应的转座酶转座。包括多发夹amiRNA基因和选择标记的转座子的完整序列作为SEQ ID NO:1184给出。
转座子与编码转座酶SEQ ID NO:1107的mRNA共转染到具有完整谷氨酰胺合成酶基因的CHO细胞系中。转染细胞池在600或1,000μg/ml G418加5mM谷氨酰胺的存在下生长，直到它们的存活率达到95％。
对照转座子包括编码RFP的开放阅读框和赋予嘌呤霉素抗性的选择标记基因，但缺乏任何多发夹amiRNA序列。对照转座子与编码其相应转座酶的mRNA一起导入具有完整谷氨酰胺合成酶基因的相同CHO细胞系。转染细胞池在6或8μg/ml嘌呤霉素加5mM谷氨酰胺的存在下生长，直到它们的存活率达到95％。
在转染的细胞池恢复到>95％的存活率后，我们测试了它们在没有谷氨酰胺的情况下生长的能力。将细胞转移到缺乏谷氨酰胺的Sigma Advanced Fed Batch培养基中，使其初始密度为0.3×106个活细胞/ml。在去除谷氨酰胺后的不同时间测量活细胞密度。在第四天，在缺乏谷氨酰胺的培养基中将细胞稀释回0.3×106个活细胞/ml的密度，以确保生长的细胞具有足够的营养。表7显示，用缺乏多发夹amiRNA的对照转座子转染的细胞池在适应无谷氨酰胺培养基时经历了缓慢生长的初始阶段，但到第4天，活细胞密度增加了大约3倍(表7第D和E列，比较第3行和第5行)。在此之后，活细胞密度在第4天和第6天稀释之间大约增加了两倍，并且在第6天和第8天之间再次增加了一倍。相比之下，在第1天和第4天之间，用转座子(其包括具有SEQ ID NO:741的多发夹amiRNA)转染的细胞池，并用600μg/ml G418选择，增加了不到50％的活细胞密度(表7第C列，比较第3行和第5行)，而转染了转座子(其包括具有SEQ ID NO:741的多发夹amiRNA)的细胞池，并用1000μg/ml G418进行选择，但未能增加其活细胞密度(表7第B列，比较第3行和第5行)。然后，在第6天，用包括具有SEQ IDNO：741的多发夹amiRNA的转座子转染的两个池的活细胞密度开始下降(表7第B和C列，比较第6、7和8行)。到第8天，活细胞密度急剧下降至低于0.02×106个活细胞/ml。在谷氨酰胺存在下，用对照转座子或包括具有SEQ ID NO：741的多发夹amiRNA的转座子转染的细胞的生长没有差异：所有池都生长良好。我们得出结论，包括与CHO谷氨酰胺合成酶mRNA靶标(SEQID NO：21)内的三个不同序列互补的向导链序列的多发夹amiRNA可用于制备依赖于外源提供的谷氨酰胺的CHO细胞。该池中的细胞已用新霉素/G418选择，这允许其基因组包括含有多发夹amiRNA的转座子的细胞生长。到第8天，活细胞密度已从300,000个细胞/ml下降到低于20,000个细胞/ml，表明只有不到7％的细胞仍然存活。通过使用多发夹amiRNA基因，我们能够产生细胞池，其中必需代谢酶谷氨酰胺合成酶的表达被抑制到阻止细胞在池中超过93％的细胞中生长的水平。
具有序列为SEQ ID NO:741的多发夹amiRNA也被克隆到三个其它PiggyBac-like转座子中，也克隆到具有序列为SEQ ID NO:724的间隔多核苷酸的3'。在第一个转座子中，多发夹amiRNA与PGK启动子可操作性地接，PGK启动子序列由SEQ ID NO:1188给出。该多发夹amiRNA基因的序列为Seq ID NO：1182。在第二个转座子中，多发夹amiRNA与具有SEQ IDNO:898给出的序列的EF1启动子可操作地连接。该多发夹amiRNA基因的序列作为SEQ IDNO:1181给出。在第三个转座子中，多发夹amiRNA与EEF2启动子可操作地连接，EEF2启动子序列由SEQ ID NO:934给出。该多发夹amiRNA基因的序列作为SEQ ID NO:1183给出。这三个piggyBac-like转座子中的每一个进一步包括赋予对嘌呤霉素抗性的选择标记，其氨基酸序列由SEQ ID NO:886给出。piggyBac-like转座子进一步包括靶序列5'-TTAA-3'，紧接着是具有SEQ ID NO:1010序列的ITR，紧接着是较远的具有序列SEQ ID NO:1008的转座子末端序列。piggyBac-like转座子进一步包括由SEQ ID NO:1009给出的序列，紧随其后的是具有SEQ ID NO:1011序列的ITR，紧随其后的是靶序列5'-TTAA-3'。转座子被配置成使得多发夹amiRNA、间隔多核苷酸和编码选择标记的基因以及所有必需的可操作地连接的控制元件可被相应的转座酶转座。包括多发夹amiRNA基因和选择标记的第一、第二和第三转座子的完整序列分别作为SEQ ID NOs：1186、1185和1187给出。每个转座子分别与编码转座酶SEQID NO：1086的mRNA共转染到具有完整谷氨酰胺合成酶基因的CHO细胞系中。在存在10μg/ml嘌呤霉素和5mM谷氨酰胺的条件下培养转染细胞池，直至其存活率达到95％。在细胞池恢复到>95％的存活率后，我们测试了它们在没有谷氨酰胺的情况下生长的能力。将细胞转移到缺乏谷氨酰胺的Sigma Advanced Fed Batch培养基中，使其初始密度为0.3×106个活细胞/ml。对于用600或1,000ug/ml新霉素选择的池，源自每个转座子的细胞池的表现本质上如表7所示。我们得出结论，SEQ ID NO:741的多发夹amiRNA序列可以与多种不同的启动子可操作地连接，置于多种不同的piggyBac-like转座子中，并通过相应的转座酶整合到宿主基因组中,为了抑制CHO细胞中谷氨酰胺合成酶的表达，并使这些细胞依赖于外源性提供的谷氨酰胺。
6.1.3.2包括针对谷氨酰胺合成酶的基因组整合多发夹amiRNA的克隆细胞系
三个单克隆系(#23、#38和#129)源自用转座子转染的池并用6.1.3.1节中描述的1,000μg/ml G418选择，该转座子包括具有SEQ ID NO:741的多发夹amiRNA。将这些克隆细胞系在谷氨酰胺存在和不存在下的生长与其谷氨酰胺合成酶基因的两个基因组拷贝都包括失活突变的细胞系的生长进行比较。
将细胞转移至缺乏谷氨酰胺的Sigma Advanced Fed Batch培养基中至初始密度为0.3×106活细胞/ml。在去除谷氨酰胺后的不同时间测量活细胞密度。表8显示克隆细胞系的行为类似于表7中所示的细胞池。从第6天左右开始，所有三个克隆系都显示出活细胞密度降低(表8，第B、C和D列)。其谷氨酰胺合成酶基因的两个基因组拷贝都包括失活突变的细胞系在第4天左右开始显示出较早的活细胞密度下降(表8，第E列)。相比之下，在存在谷氨酰胺的情况下，所有细胞系中的活细胞密度在第7天和第10天之间保持高水平。我们观察到第10天活细胞密度有所下降。我们认为这是因为在这个实验中，细胞在第4天没有被稀释到新鲜培养基中。到第4天，在存在谷氨酰胺的情况下，所有细胞都达到了它们的最大活细胞密度(表8第5行)，因此到第10天，它们的营养已经耗尽。我们得出结论，所有三种单克隆细胞系都依赖于外源提供的谷氨酰胺，因此我们期望谷氨酰胺合成酶基因可用作选择标记，以选择将第二个转座子整合到细胞基因组中。
6.1.3.3在CHO细胞中使用谷氨酰胺合成酶选择表达抗体，其中谷氨酰胺合成酶已被使用多发夹amiRNA敲低。
谷氨酰胺合成酶选择被用于将用于抗体表达的转座子整合到单克隆系和细胞系中，其中谷氨酰胺合成酶基因的两个基因组拷贝都包括第6.1.3.2节中描述的失活突变。
一个转座子(333286)包括编码多肽的开放阅读框，该多肽包括具有SEQ ID NO:870给出的序列的成熟轻链，其可操作地连接至鼠EFl启动子和聚腺苷酸化序列，以及编码多肽的开放阅读框，所述多肽包括具有由SEQ ID NO：872给出的序列的成熟重链，其与人EF1启动子和聚腺苷酸化序列可操作地连接。转座子进一步包括具有SEQ ID NO:893的开放阅读框，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:892的谷氨酰胺合成酶基因，可操作地连接至异源启动子和异源3'UTR和聚腺苷酸化信号序列。第二转座子(346168)包括编码多肽的开放阅读框，该多肽包括具有由SEQ ID NO:870给出的序列的成熟轻链，其与人CMV启动子和聚腺苷酸化序列可操作地连接，以及编码包括成熟重链的多肽的开放阅读框，其序列由SEQID NO：872给出，可操作地连接至人CMV启动子和聚腺苷酸化序列。转座子进一步包括具有SEQ ID NO:893的开放阅读框，其编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:892的谷氨酰胺合成酶基因，可操作地连接至异源启动子、异源3'UTR和聚腺苷酸化信号序列。多发夹amiRNA序列SEQID NO:741中的三个向导链序列都是仓鼠谷氨酰胺合成酶基因的天然3'UTR内互补的不同序列。因此，来自包括抗体编码序列的转座子的谷氨酰胺合成酶基因的表达不应受到抗谷氨酰胺合成酶多发夹amiRNA基因的影响。
两个转座子进一步包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，紧随其后的是具有SEQ ID NO:1006(其是SEQ ID NO:1004的一个实施方案)的ITR和具有SEQ ID NO:1000的附加序列，以及包括SEQ ID NO:1002的右端，紧随其后的是具有SEQ ID NO:1007(其是SEQ IDNO:1005的一个实施方案)的ITR，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。转座子被配置为使得谷氨酰胺合成酶基因和两条抗体链的基因，以及所有必要的可操作地连接的控制元件可被相应的转座酶转座。
将转座子与编码具有多肽序列SEQ ID NO:1056的转座酶的mRNA共转染到四种不同的CHO细胞系中：一种细胞系的两个基因组拷贝都包括失活缺失，而其它三种是克隆细胞系#23、#38和#129，其中使用多发夹amiRNA抑制谷氨酰胺合成酶，如第6.1.3.1和6.1.3.2节所述。这些转座子的相应转座酶不同于用于转座第6.1.3.1节中描述的第一转座子的转座酶，其包括用于抑制CHO细胞中天然谷氨酰胺合成酶基因的amiRNA基因。这确保第一转座子不会被第二转座酶的作用切除或失活。转染细胞池在培养基中不添加谷氨酰胺的情况下生长，直至其存活率达到95％。然后使用Sigma Advanced Fed Batch培养基以14天的补料分批方式培养它们。使用Octet测量上清液中的蛋白质浓度。结果如表9所示。谷氨酰胺合成酶表达最初被基因基因组拷贝中工程突变抑制的细胞产生的抗体量(表9第4行和第8行)与amiRNA基因最初抑制谷氨酰胺合成酶表达的3个细胞系产生的抗体量相当(比较第1-3行和第4行，以及第5-7行和第8行)。因此，如同在谷氨酰胺合成酶基因直接基因突变抑制谷氨酰胺合成酶的细胞中，第二转座子中的衰减的谷氨酰胺合成酶基因能够在谷氨酰胺合成酶表达被干扰RNA抑制的细胞中为第二转座子上的其它基因选择相同高水平的表达。
我们得出结论，在哺乳动物细胞中，谷氨酰胺合成酶的表达通过整合到基因组中而降低，第一转座子包括多发夹amiRNA基因，该基因包括SEQ ID NO:741，可通过使用编码谷氨酰胺合成酶的基因作为第二转座子上的选择标记来选择基因组包括第二转座子的细胞。第二转座子包括可在哺乳动物细胞中表达以产生抗体的额外基因。这种谷氨酰胺合成酶敲低细胞系的生产力与其谷氨酰胺合成酶因基因组突变而失活的细胞系的生产力可比较。
6.1.3.4使用多发夹amiRNA敲低谷氨酰胺合成酶的CHO细胞中抗体表达的稳定性。
将通过用具有序列SEQ ID NO:874(如第6.1.3.3节所述和表9第7行所示)的表达抗体的转座子转染来自第6.1.3.2节的克隆129获得的细胞池传代30或60次群体倍增，以评估在存在或不存在G418的情况下表达的稳定性，该选择最初用于引入抑制谷氨酰胺合成酶的多发夹amiRNA。如果克隆细胞系在60次群体倍增后的生产力仍至少为原始生产力的70％，则该克隆细胞系被认为是“稳定的”。基因组中包括抗体编码基因的CHO细胞池通常会在传代时表现出一些额外的生产力下降，这是由于种群动态的结果：产量较低的细胞往往生长得更快，因为它们的代谢负担较低，并且它们接管了池。
传代后，细胞使用Sigma Advanced Fed Batch培养基以14天的补料分批方式培养。使用Octet测量上清液中的蛋白质浓度。结果如表10所示。F列显示第14天产生的抗体效价，G列显示效价占未传代池的百分比(第1行)。表10显示，在G418存在下传代30或60次群体倍增的细胞池分别产生了未传代池产生的第14天抗体效价的89％和85％。在没有G418的情况下，稳定性甚至更好：即使在没有G418的情况下进行60次群体倍增后，细胞池仍然产生接近95％的未传代池产生的第14天抗体效价度。所有这些效价都大大高于通常认为的“克隆稳定性”阈值。
我们得出结论,如果使用基因组整合的多发夹amiRNA基因抑制编码必需酶的基因，并且如果包括互补选择标记的第二多核苷酸的基因组整合为细胞提供了执行被抑制的必需功能的替代方式，那么第二多核苷酸上编码的其它基因的表达可以稳定维持。
6.1.4用微RNAs敲低羧肽酶D
6.1.4.1靶向羧肽酶D的microRNAs
羧肽酶D是负责从CHO细胞产生的抗体重链中去除C端赖氨酸的肽酶。我们比较了3发夹amiRNA基因和4发夹amiRNA基因降低羧肽酶D表达和防止从抗体重链中去除C端赖氨酸的能力。
具有SEQ ID NO 740的3-发夹多发夹amiRNA包括与中国仓鼠羧肽酶mRNA中的3个不同序列互补的3个向导链序列(其序列由SEQ ID NO:17给出)。第一发夹包括向导链序列SEQ ID NO:111，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:415，第二发夹包括向导链序列SEQ ID NO:112，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:416，第三发夹包括向导链序列SEQ ID NO:113，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:417。这三个向导链序列中的每一个都是22个碱基序列，它是Criteculusgriseus羧肽酶D mRNA内不同区域的精确反向互补序列。每条过客链序列与其对应的向导链序列互补，只是过客链序列中对应于向导链5'碱基和向导链第12个碱基的碱基改为非互补。SEQ ID NO：111的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQID NO：415中的相应碱基分别为C和A。SEQ ID NO：112的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和C，相应的过客链序列SEQ ID NO：416中的相应碱基分别为C和A。SEQ ID NO：113的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQ ID NO：417中的相应碱基分别为C和A。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:740中的每个发夹进一步包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:698紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:740进一步包括在第一发夹的5'具有SEQ IDNO:693的非结构化序列和在第三发夹的3'具有SEQ ID NO:695的非结构化序列。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO：740进一步包括在第一和第二发夹之间具有SEQ ID NO：716的非结构化序列，以及在第二和第三发夹之间具有SEQ ID NO：717的非结构化序列。每个向导链序列都是不同的，并且每个都与Criteculus griseus羧肽酶D(SEQ ID NO:17)的mRNA互补。
具有SEQ ID NO:1179的4-发夹多发夹amiRNA包括与中国仓鼠羧肽酶mRNA(其序列由SEQ ID NO:17给出)中的4个不同序列互补的4个向导链序列。第一发夹包括向导链序列SEQ ID NO:1173，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:1174，第二发夹包括向导链序列SEQ ID NO:1175，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ IDNO:1176，第三发夹包括向导链序列SEQ ID NO:1177，紧接着是环序列SEQ ID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:1178；第四发夹包括向导链序列SEQ ID NO:111，紧接着是环序列SEQID NO:683和过客链序列SEQ ID NO:415。这三个向导链序列中的每一个都是22个碱基的序列，它是Criteculus griseus羧肽酶D mRNA内不同区域的精确反向互补。每条过客链序列与其对应的向导链序列互补，只是过客链序列中对应于向导链5'碱基和向导链第12个碱基的碱基改为非互补。SEQ ID NO：1173的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和A，相应的过客链序列SEQ ID NO：1174中的相应碱基分别为C和C。SEQ ID NO:1175的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQ ID NO:1176中的相应碱基分别为C和A。SEQ ID NO：1177的向导链的第一个和第十二个碱基分别为A和T，对应的过客链序列SEQ ID NO：1178中的相应碱基分别为C和C。SEQ ID NO：111的向导链的第一个和第十二个碱基分别为T和G，相应的过客链序列SEQ ID NO：415中的相应碱基分别为C和A。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:1179中的每个发夹还包括额外的茎稳定序列，茎序列SEQ ID NO:697紧接在向导链序列之前，茎序列SEQ ID NO:698紧接在过客链序列之后。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:1179进一步包括在第一发夹的5'具有SEQ ID NO:693的非结构化序列，以及在第三发夹的3'具有SEQ ID NO:695的非结构化序列。多发夹amiRNA序列SEQ ID NO:740进一步包括在第一和第二发夹之间具有SEQ ID NO:716的非结构化序列，在第二和第三发夹之间具有SEQ ID NO:717的非结构化序列和在第三和第四发夹之间具有SEQ ID NO:718的非结构化序列。每个向导链序列都是不同的，并且每个都与Criteculus griseus羧肽酶D(SEQ ID NO:17)的mRNA互补。
将三个多发夹amiRNA序列中的每一个置于编码红色荧光蛋白(由SEQ ID NO:723给出)的开放阅读框的3'，然后是兔珠蛋白聚腺苷酸化序列。每个多发夹amiRNA序列被克隆到转座子载体中，其中它与Pol II启动子(序列由SEQ ID NO：927给出的CMV启动子)可操作地连接。转座子包括左端，该左端包括5'-TTAA-3'靶序列，该靶序列紧邻具有SEQ ID NO:1010的ITR，紧接着是SEQ ID NO:1008的附加序列，和包括SEQ ID NO:1009的右端，SEQ IDNO:1009紧接着是SEQ ID NO:1011的ITR，紧接着是5'-TTAA-3'靶序列。它还包括编码嘌呤霉素选择标记的基因(具有多肽序列SEQ ID NO：886)。转座子的配置使得多发夹amiRNA、荧光蛋白基因以及所有必要的可操作地连接的控制元件都可以通过相应的转座酶进行转座。
转座子与编码转座酶SEQ ID NO:1086的mRNA共转染到表达具有由SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和由SEQ ID NO:869给出的成熟重链序列的抗体的克隆CHO细胞系中。转染的细胞池在10μg/ml嘌呤霉素的存在下生长，直到它们的存活率达到95％。然后使用Sigma Advanced Fed Batch培养基以14天的补料分批方式培养它们。使用蛋白质A亲和层析从培养物上清液中纯化蛋白质，用PNGaseF处理去除N连接的聚糖结构，用二硫苏糖醇还原，并在安捷伦QTOF质谱仪上进行分析。未修饰的重链质量为49,252Da。去除C端赖氨酸将其减少到49,124Da。比较基因组包括多发夹amiRNA基因之一的细胞和不含多发夹amiRNA基因的细胞中含有和不含C端赖氨酸的抗体重链比例。结果如表11所示。
如表11所示，在正常条件下从CHO细胞产生抗体导致C-末端赖氨酸的完全丧失(第1行)。基因组包括转座子的细胞产生的抗体中50％的重链是全长的并保留了C端赖氨酸，该转座子包括具有SEQ ID NO:740的3-发夹多发夹amiRNA序列。基因组包括转座子的细胞产生的抗体中超过70％的重链是全长的并保留了C端赖氨酸，该转座子包括具有SEQ ID NO:1179的4-发夹多发夹amiRNA序列。这表明包括与靶mRNA互补的额外向导链序列提高了沉默靶mRNA的效率。
表格简述
表1.用于生成图3A-G所示数据的结构。如第6.1.1.1节所述构建转座子。SEQ IDNO显示在C列中的多发夹amiRNA与B列中显示的Pol II启动子可操作地连接。相应的质谱图显示在图3A-G的面板中，如D列所示。
表2.使用靶向GMD和GFT的amiRNA抑制抗体岩藻糖基化。如第6.1.1.4节所述构建转座子。amiRNA SEQ ID NO显示在A列中。在连续14天的补料分批抗体生产运行后，B列中显示了去岩藻糖基化的抗体百分比，C列中显示了岩藻糖基化的百分比。BDL＝低于检测限
表3.使用针对不同靶基因的多发夹amiRNA抑制HEK细胞中的抗体岩藻糖基化。如第6.1.1.5节所述，构建转座子、转染到HEK细胞中并进行选择。基因转移多核苷酸包括针对A列中所列基因的amiRNA。多发夹amiRNA具有B列中所示SEQ ID NO给出的序列；多发夹amiRNA中存在的发夹数量显示在C列中。用编码具有由SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和由SEQ ID NO:871给出的成熟重链序列的抗体的基因瞬时转染回收的池。培养7天后，培养上清液中含有F列中显示的抗体浓度。被去岩藻糖基化的抗体百分比显示在D列中，被岩藻糖基化的百分比显示在E列中。BDL＝低于检测限。
表4.具有针对FUT8的多发夹amiRNAs的克隆HEK细胞系中抗体岩藻糖基化的抑制。克隆细胞系是从表3第3行和第4行中显示的池中产生的。细胞系的名称显示在A列中。克隆细胞系用编码抗体的基因瞬时转染，该抗体具有由SEQ ID NO:870给出的成熟轻链序列和由SEQ ID NO:871给出的成熟重链序列。培养7天后，培养上清液中含有D列所示浓度的抗体。被去岩藻糖基化的抗体百分比显示在B列中，被岩藻糖基化的百分比显示在C列中。
表5.用不同数量的amiRNA发夹抑制抗体岩藻糖基化。如第6.1.2.1节所述构建转座子。包括谷氨酰胺合成酶ORF和珠蛋白polyA序列的amiRNA基因的SEQ ID NO在A列中给出。B列中显示的Pol II启动子与amiRNA可操作地连接，其SEQ ID NO显示在C列中。amiRNA包括D列中显示的发夹数量。在连续14天的补料分批抗体生产运行后，培养上清液含有列E中所示的抗体浓度。被去岩藻糖基化的抗体百分比显示在F列中，被岩藻糖基化的百分比显示在G列中。BDL＝低于检测限。
表6.由不同启动子驱动的多发夹amiRNA抑制抗体岩藻糖基化。如第6.1.2.2节所述构建转座子。选择标记谷氨酰胺合成酶基因的序列，包括3'UTR中的多发夹amiRNA序列，显示在A列中。B列中显示的Pol II启动子与C列中显示的抑制性5'UTR可操作地连接，该抑制性5'UTR与谷氨酰胺合成酶基因可操作地连接。在谷氨酰胺合成酶基因的3'UTR中放置了amiRNA，其SEQ ID NO显示在D列中。在连续14天的补料分批抗体生产运行后，培养上清液含有列E中所示的抗体浓度。被去岩藻糖基化的抗体百分比显示在F列中，被岩藻糖基化的百分比显示在G列中。BDL＝低于检测限。
表7.在缺乏谷氨酰胺的情况下，具有靶向谷氨酰胺合成酶的amiRNA的细胞生长。如第6.1.3.1节所述，用包括第1行所示SEQ ID NO的多发夹amiRNA的转座子转染细胞，并通过添加第2行所示浓度的G418或嘌呤霉素进行选择。在细胞恢复到>95％存活率后，将细胞以每毫升培养基0.3×106个活细胞转移到不含谷氨酰胺的培养基中。在实验开始后的不同时间测量活细胞密度：实验开始后的天数显示在A列中。在第4天，细胞被稀释回0.3×106个活细胞/毫升(第5行是稀释前，第6行是稀释后)。B-E列显示活细胞密度×106个活细胞/毫升。
表8.在缺乏谷氨酰胺的情况下，具有靶向谷氨酰胺合成酶的amiRNA的克隆细胞系的生长。用包括具有SEQ ID NO:741的多发夹amiRNA的转座子转染的池被克隆，并且在存在或不存在谷氨酰胺(谷氨酰胺浓度显示在第2行)的情况下生长三个克隆细胞系(第1行显示的克隆ID)。将生长与在谷氨酰胺合成酶基因的两个基因组拷贝中包括失活突变的细胞系的生长进行比较(第E和I列，在第1行中表示为GS KO)。以每毫升培养基0.3×106个活细胞接种细胞。在实验开始后的不同时间测量活细胞密度：实验开始后的天数显示在A列中。B-I列显示活细胞密度×106个活细胞/毫升。
表9.在谷氨酰胺合成酶敲低细胞中表达抗体。如第6.1.3.3节所述，用包括编码抗体重链和轻链的开放阅读框的两种不同转座子转染第6.1.3.2节中描述和表8中所示的四种细胞系。克隆IDs显示在第1列中：三个克隆源自具有谷氨酰胺合成酶基因的两个完整基因组拷贝的细胞池，这些拷贝已用多发夹amiRNA SEQ ID NO:741转染，在第四行中，谷氨酰胺合成酶基因的两个基因组拷贝都包括失活突变(在第1列中指示为GS KO)。转座子SEQ IDNOs显示在第2列中。如第6.1.3.3节所述选择细胞。回收后，它们接种了14天的分批补料，在7、10、12和14天后取样，用于通过Octet进行效价测量。在培养上清液中测量的抗体效价在C(第7天)、D(第10天)、E(第12天)和F(第14天)列中以μg/ml显示。
表10.来自谷氨酰胺合成酶敲低细胞的抗体表达的稳定性。如第6.1.3.3节所述和表9第7行所示，克隆细胞系#129转染序列为SEQ ID NO:874的转座子的细胞池，通过传代细胞0、30和60次群体倍增来测试稳定性，如B列所示。在存在或不存在G418的情况下传代细胞，其浓度显示在A列中。传代后，它们接种了14天的分批补料，在7、10、12和14天后取样，通过Octet进行效价测量。在培养上清液中测量的抗体效价在C(第7天)、D(第10天)、E(第12天)和F(第14天)列中以μg/ml显示。第14天的生产力表示为未经过传代的细胞池(第1行)生产力的百分比。
表11.抑制羧肽酶D。两个转座子包括多发夹amiRNA基因，如第6.1.4节所述。多发夹amiRNA的SEQ ID NOs显示在A列中，发夹的数量显示在B列中。如第6.1.4节所述，将转座子转染到表达抗体的克隆CHO细胞系中，选择并培养转染细胞池以产生抗体。纯化抗体，去除聚糖并通过质谱法分析蛋白质以确定具有C-末端赖氨酸的重链部分。
表格
Figure BDA0003432228890001251
表1
Figure BDA0003432228890001252
表2
Figure BDA0003432228890001261
表3
Figure BDA0003432228890001262
表4
Figure BDA0003432228890001263
表5
Figure BDA0003432228890001264
表6
Figure BDA0003432228890001271
表7
Figure BDA0003432228890001272
表8
Figure BDA0003432228890001273
表9
Figure BDA0003432228890001274
表10
Figure BDA0003432228890001281
表11
7.参考文献
本文引用的所有参考文献均以引用的方式全部并入本文，并用于所有目的，其程度与每个单独的出版物、专利或专利申请均明确且单独指示以引用的方式全部并入本文相同。如果序列的不同版本在不同时间与登录号相关联，则表示与本申请有效申请日的登录号相关联的版本。有效申请日是指实际申请日或优先权申请的申请日中较早者，参考登录号(如果适用)。同样地，如果出版物、网站等的不同版本在不同时间发布，除非另有说明，则表示在申请的有效申请日最近发布的版本。
除非另外特别指明，否则本发明的任何特征、步骤、元件、实施例或方面可以与任何其它组合使用。在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文描述的特定实施例仅作为示例提供，并且本发明仅受所附权利要求的条款以及这些权利要求所赋予的等效物的全部范围的限制。

Claims (67)

1.一种多核苷酸，包括
a)编码多发夹amiRNA序列的片段，其中所述片段包括：
ⅰ)包含与天然哺乳动物细胞mRNA的第一靶位点完全互补的连续19个核苷酸序列的第一向导链序列以及包含与所述第一向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列的第一过客链序列，其中所述第一向导链和第一过客链序列相隔5至35个核苷酸；
ⅱ)包含连续的19个核苷酸序列的第二向导链序列，所述连续的19个核苷酸序列与不同于与所述第一向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA的所述第一靶位点的第二靶位点完全互补，以及包含与所述第二向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列的第二过客链序列，其中所述第二向导链和第二过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同；和
b)在哺乳动物细胞中有活性并且由RNA聚合酶II或RNA聚合酶III转录的真核启动子，其可操作地连接到编码所述amiRNA序列的片段，其中所述amiRNA序列可被表达并折叠成多个发夹。
2.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一向导链序列是与所述天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的19-22个核苷酸序列，并且所述第一过客链序列与所述第一向导序列长度相同。
3.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一向导链序列是与所述天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的19-22个核苷酸序列，并且所述第一过客链序列比所述第一向导序列短。
4.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一和第二靶位点不重叠。
5.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述多发夹amiRNA序列的所述片段进一步包括第三向导链序列和第三过客链序列，所述第三向导链序列包含与所述第一和第二向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19个核苷酸序列，所述第三过客链序列包含与所述第三向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列，其中所述第三向导链和第三过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。
6.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，进一步包括两个位于所述片段和所述启动子侧翼的转座子末端，其中所述片段和所述启动子可被相应的转座酶转座。
7.权利要求6所述的多核苷酸，其中每个转座子末端包括选自SEQ ID NOs：1004和1005、或SEQ ID NOs：1010和1011、或SEQ ID NOs：1014和1015、或SEQ ID NOs：1016和1017、或SEQ ID NOs：1022和1023、或SEQ ID NOs：1026和1027、或SEQ ID NOs：1030和1031、或SEQID NOs：1036和1037、或SEQ ID NOs：1040和1041、或SEQ ID NOs：1044和1045、或SEQ IDNOs：1112和1113的序列。
8.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，进一步包括与所述启动子可操作地连接的开放阅读框，其中所述多发夹amiRNA序列从所述开放阅读框后的3'UTR中的启动子表达。
9.权利要求8所述的多核苷酸，其中所述开放阅读框编码选择标记。
10.权利要求9所述的多核苷酸，其中所述开放阅读框编码荧光蛋白。
11.权利要求8所述的多核苷酸，其中所述选择标记通过允许细胞合成代谢有用的物质或在有害物质如抗生素、酶抑制剂或细胞毒物存在下存活，为细胞提供生长优势。
12.权利要求8所述的多核苷酸，其中所述选择标记选自二氢叶酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、氨基糖苷3'-磷酸转移酶、嘌呤霉素乙酰转移酶、杀稻瘟素乙酰转移酶、杀稻瘟素脱氨酶、潮霉素B磷酸转移酶或zeocin结合蛋白。
13.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述启动子是EF1a启动子、来自巨细胞病毒的即刻早期基因1、2或3的启动子、真核延伸因子2的启动子、3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子、肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶启动子、泛素启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子或猿猴病毒40启动子。
14.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中每个过客链序列在对应于所述向导链序列的第一个碱基的位置与其对应的向导链序列不互补。
15.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中每个过客链序列在对应于所述向导链序列第十二个碱基的位置与其对应的向导链序列不互补。
16.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中向导链序列与其对应的过客链序列之间的每个5-35个核苷酸的非结构化环序列包含选自SEQ ID NOs：683-692的序列。
17.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中每个向导链-过客链发夹进一步包括紧邻所述发夹的5'和3'的附加序列，其中所述附加序列是SEQ ID NO:697到5'和SEQ IDNO:698到3'，或SEQ ID NO:699到5'和SEQ ID NO:700到3'，或SEQ ID NO:701到5'和SEQ IDNO:702到3'，或SEQ ID NO:703到5'和SEQ ID NO:704到3'，或SEQ ID NO:705到5'和SEQ IDNO:706到3'，或SEQ ID NO:709到5'和SEQ ID NO:710到3'，或SEQ ID NO:711到5'和SEQ IDNO:712到3'，或SEQ ID NO:713到5'和SEQ ID NO:714到3'。
18.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸被整合到哺乳动物细胞的基因组中。
19.前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，编码mRNA的靶基因的表达、或mRNA或由其表达的蛋白质的功能或活性被所述多核苷酸有效地降低至低于在基因组不包含所述多核苷酸的对照哺乳动物细胞中的20％。
20.权利要求18所述的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞是仓鼠细胞。
21.权利要求18所述的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞是初级免疫细胞。
22.一种哺乳动物细胞，包含前述权利要求中任一项的多核苷酸。
23.权利要求23中所述的哺乳动物细胞，其中与基因组不包含所述多核苷酸的等效哺乳动物细胞相比，所述靶基因的表达或所述靶基因产物的功能或活性降低至其正常水平的20％以下。
24.权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA编码催化直接或间接影响细胞产生的蛋白质糖基化的反应的酶。
25.权利要求24所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA编码岩藻糖基转移酶、GDP-甘露糖脱水酶或GDP-岩藻糖转运蛋白。
26.权利要求24所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ IDNOs：1-9的序列至少98％相同的序列。
27.权利要求26所述的多核苷酸，其中所述第一和第二向导链序列选自SEQ ID NOs：75-80，或SEQ ID NOs：81-86，或SEQ ID NOs：87-92，或SEQ ID NOs：93-98，或SEQ ID NOs：99-101，或SEQ ID NOs：102-104。
28.权利要求26所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括选自SEQ ID NO:725-736的序列。
29.权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞mRNA编码直接或间接影响细胞产生的蛋白质的细胞内分选的蛋白质。
30.权利要求29所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA编码prosaposin或sortilin。
31.权利要求30所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ IDNOs：10-11的序列至少98％相同的序列。
32.权利要求29所述的多核苷酸，其中所述第一和第二向导链序列选自SEQ ID NOs：105-107或SEQ ID NOs：108-110。
33.权利要求29所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括选自SEQ ID NOs：737-739的序列。
34.权利要求1-21中任一项所述的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞mRNA编码直接或间接影响细胞产生的蛋白质的蛋白水解切割的蛋白质。
35.权利要求34所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA编码羧肽酶。
36.权利要求35所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ IDNOs：12-20的序列至少98％相同的序列。
37.权利要求36所述的多核苷酸，其中所述第一和第二向导链序列选自SEQ ID NOs:111-113、1173、1175和1177。
38.权利要求36所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO:740或1179。
39.一种制备哺乳动物细胞的方法，包括向表达天然细胞mRNA的哺乳动物细胞引入
a)权利要求3所述的多核苷酸；和
b)相应的转座酶，其中所述转座酶将多核苷酸整合到所述细胞的基因组中。
40.权利要求39所述的方法，其中所述相应的转座酶作为编码所述转座酶的多核苷酸被引入。
41.权利要求39所述的方法，其中编码所述转座酶的所述多核苷酸是mRNA。
42.权利要求39所述的方法，其中所述编码转座酶的多核苷酸是DNA，并且包括编码所述转座酶的开放阅读框，所述开放阅读框与在所述哺乳动物细胞中具有活性的启动子可操作地连接。
43.权利要求39所述的方法，其中所述转座酶以转座酶蛋白的形式提供。
44.一种制备哺乳动物细胞的方法，包括
a)将权利要求9所述的多核苷酸引入多个哺乳动物细胞中；和
b)在表达选择标记的细胞具有选择优势的条件下生长所述多个细胞。
45.权利要求44所述的方法，进一步包括鉴定基因组包括权利要求9所述的多核苷酸的细胞。
46.权利要求44所述的方法，其中所述选择标记选自二氢叶酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、氨基糖苷3'-磷酸转移酶、嘌呤霉素乙酰转移酶、杀稻瘟素乙酰转移酶、杀稻瘟素脱氨酶、潮霉素B磷酸转移酶、或zeocin结合蛋白。
47.一种多核苷酸，包括
a)编码多发夹amiRNA序列的片段，其中所述片段包括
ⅰ)包含与编码必需代谢酶的天然哺乳动物细胞mRNA的第一靶位点完全互补的连续19个核苷酸序列的第一向导链序列，和包含与所述第一向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列的第一过客链序列，其中所述第一向导链和第一过客链序列相隔5至35个核苷酸；
ⅱ)包含连续的19个核苷酸序列的第二向导链序列，所述连续的19个核苷酸序列与不同于与所述第一向导链序列相同的天然哺乳动物细胞mRNA的所述第一靶位点的第二靶位点完全互补，以及包含与所述第二向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列的第二过客链序列，其中所述第二向导链和第二过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一和第二向导链序列彼此不同；和
b)在哺乳动物细胞中有活性并由RNA聚合酶II或RNA聚合酶III转录的真核启动子，所述真核启动子与编码所述amiRNA序列的片段可操作地连接，其中所述amiRNA序列可被表达并折叠成多个发夹。
48.权利要求47所述的多核苷酸，其中所述第一向导链序列是与所述天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的19-22个核苷酸序列，且所述第一过客链序列与第一向导序列长度相同。
49.权利要求47所述的多核苷酸，其中所述第一向导链序列是与所述天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的19-22个核苷酸序列，且所述第一过客链序列比所述第一向导序列短。
50.权利要求47-49中任一项所述的多核苷酸，其中所述第一和第二靶位点不重叠。
51.权利要求47-50中任一项所述的多核苷酸，其中编码所述多发夹amiRNA序列的片段进一步包括第三向导链序列和第三过客链序列，所述第三向导链序列包含与所述第一和第二向导链序列相同的所述天然哺乳动物细胞mRNA完全互补的连续19个核苷酸序列，所述第三过客链序列包含与所述第三向导链序列至少78％互补的连续19个核苷酸序列，其中所述第三向导链和第三过客链序列相隔5至35个核苷酸，并且其中所述第一、第二和第三向导链序列彼此不同。
52.权利要求47-51中任一项所述的多核苷酸，进一步包括位于所述片段和所述启动子侧翼的两个转座子末端，其中所述片段和所述启动子可被相应的转座酶转座。
53.权利要求52所述的多核苷酸，其中每个转座子末端包括选自SEQ ID NOs:1004和1005、或SEQ ID NOs:1010和1011、或SEQ ID NOs:1014和1015、或SEQ ID NOs:1016和1017、或SEQ ID NOs：1022和1023、或SEQ ID NOs：1026和1027、或SEQ ID NOs：1030和1031、或SEQID NOs：1036和1037、或SEQ ID NOs：1040和1041、或SEQ ID NOs：1044和1045、或SEQ IDNOs：1112和1113的序列。
54.权利要求47-53中任一项所述的多核苷酸，其中所述哺乳动物细胞mRNA编码所述细胞合成必需氨基酸所需的酶。
55.权利要求54所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA编码谷氨酰胺合成酶。
56.权利要求55所述的多核苷酸，其中所述天然哺乳动物细胞mRNA包括与选自SEQ IDNOs:21和23的序列至少98％相同的序列。
57.权利要求56所述的多核苷酸，其中所述第一和第二向导链序列选自SEQ ID NOs：114-142。
58.权利要求57所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括SEQ ID NO:741。
59.权利要求47-53中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸被整合到哺乳动物细胞的基因组中。
60.一种哺乳动物细胞，包括整合到其基因组中的权利要求47-59中任一项所述的多核苷酸。
61.权利要求60所述的哺乳动物细胞，其中所述多发夹amiRNA序列被表达并抑制所述天然细胞mRNA的表达，由此，在不将包含编码可选择标记的基因的第二多核苷酸整合到所述细胞基因组中且可在所述细胞中表达以补偿抑制的情况下，所述细胞需要外源性提供酶、生长因子、营养物或其它分子以生长。
62.权利要求61所述的哺乳动物细胞，其基因组进一步包括所述第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含编码可在所述哺乳动物细胞中表达的选择标记的基因，其中所述基因的表达补偿了对所述天然细胞mRNA表达的抑制，从而在没有外源性提供所述酶、生长因子、营养物或其它分子以使所述细胞生长的情况下恢复生长能力。
63.权利要求62所述的哺乳动物细胞，其中所述第二多核苷酸进一步包括可在哺乳动物细胞中表达的第二基因。
64.一种选择将编码靶蛋白的核酸整合到细胞基因组中的方法，包括：
a)在由于所述多发夹amiRNA序列抑制所述天然细胞mRNA的表达而使所述细胞生长所需的酶、生长因子、营养物或其它分子的存在下培养根据权利要求61的哺乳动物细胞群；
b)用第二多核苷酸转染所述细胞群，所述第二多核苷酸包含编码可在所述哺乳动物细胞中表达的选择标记的基因和编码所述靶蛋白的第二基因，其中所述选择标记基因的表达补偿对所述天然细胞mRNA表达的抑制，从而恢复在没有所述酶、生长因子、营养物或其它分子的情况下生长的能力；以及
c)在所述酶、生长因子、营养物或其它分子的浓度降低或不存在的情况下培养所述转染细胞，
其中在培养中存活的转染细胞已将所述第二多核苷酸整合到它们的基因组中，从而可以表达所述靶蛋白。
65.权利要求64所述的方法，其中所述转染细胞在所述酶、生长因子、营养物或其它分子的向下逐渐减少的情况下进行培养。
66.一种哺乳动物细胞，包括编码RNA分子的多核苷酸，其在细胞中表达并抑制天然细胞mRNA的表达，其中，不存在第二多核苷酸整合到包含编码选择标记的基因以补偿抑制的所述细胞的基因组中时，所述细胞需要外源酶、生长因子、营养物或其它分子来生长。
67.权利要求66所述的哺乳动物细胞，进一步包括整合到所述细胞基因组中的第二多核苷酸，其包含编码可在所述哺乳动物细胞中表达的选择标记的基因和编码靶蛋白的第二基因，其中所述基因的表达补偿对所述天然细胞mRNA表达的抑制，从而恢复在没有所述酶、生长因子、营养物或其它分子的情况下生长的能力。
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