JP2021097689A - 組換えＧｌｕｔ１アデノ随伴ウイルスベクターコンストラクトおよびＧｌｕｔ１発現を回復させる方法 - Google Patents

Abstract

【課題】Ｇｌｕｔ１欠損症症候群の遺伝子療法のために、患者においてＧｌｕｔ１発現を回復させる方法を提供する。【解決手段】特定の実施形態において、本発明は、Ｇｌｕｔ１をコードする導入遺伝子を構成する核酸配列を含む組換え型アデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）に関する。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ニワトリβ−アクチンプロモーターをさらに含み、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。特定の実施形態において、特定の組換え型ＡＡＶのいずれかを含む組成物に関する。特定の実施形態において、特定の組成物を含む容器ケースを備えるキットに関する。特定の実施形態において、対象のＢＢＢにおいてＧｌｕｔ１輸送を回復させる方法に関し、特定の組換え型ＡＡＶベクターのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、それを必要とする対象においてＧｌｕｔ１欠損症症候群を処置する方法に関する。【選択図】図１Ａ−Ｄ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年３月１０日出願の米国仮特許出願第６２／１３０，８９９号に対する優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。

連邦政府支援の記載
本発明は、米国国立衛生研究所により授与される助成金番号第Ｒ０１ＮＳ０５７４８２号の下で政府支援により行われた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。

配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的にファイルされた配列表を含み、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。２０１６年３月４日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、０１００１−００３８８７−ＷＯ０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは１８９，９５３バイトである。

本発明は、組換え型Ｇｌｕｔ１アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）コンストラクトに関し、またＧｌｕｔ１欠損哺乳動物においてＧｌｕｔ１発現を回復させる方法に関する。

グルコースは、哺乳動物脳にとって主要エネルギー源である。溶質キャリアファミリー２としても知られているグルコーストランスポーター１（Ｇｌｕｔ１）は、血液脳関門（ＢＢＢ）で発現する主要なグルコーストランスポーターであり、脳へのグルコースの移行に関与し、最初に特定された促進性グルコーストランスポータファミリー（ＳＬＣ２Ａ）である。Ｇｌｕｔ１タンパク質をコードするヒト遺伝子ＳＬＣ２Ａｌは第１染色体短腕（１ｐ３４．２）に局在し、３５ｋｂの長さで、４９２個のアミノ酸のタンパク質をコードするエキソンを１０個含む（配列番号７９）。このタンパク質は、ヒト、ラット、マウス、ブタなどの異なる種の間で高度に保存されている。ｍＧｌｕｔ１タンパク質をコードするマウスＳｌｃ２ａ１遺伝子は第４染色体に局在し、その遺伝子構造はヒトＳＬＣ２Ａ１に極めて類似している（マウスゲノムインフォマティクス）（４９２個のアミノ酸ｍＧｌｕｔ１配列は配列番号７８である）。マウスＳ１ｃ２ａ１ｃＤＮＡ（ＮＭ０１１４００）は、ヒトＳＬＣ２Ａ１ｃＤＮＡのそれと９７％超同一である。（Ｍｕｅｃｋｌｅｒ Ｍら，１９８５；Ｖｅｇｇｉｏｔｔｉ，Ｐら，２０１３；Ｓｅｉｄｎｅｒら，１９９８を参照されたい）。

Ｇｌｕｔ１欠損症症候群（Ｇｌｕｔ１ ＤＳ、ＯＭＩＭ６０６７７７）は、まれな障害ではあるが、ＳＬＣ２Ａ１遺伝子のハプロ不全に起因する衰弱性の小児期神経障害である。Ｇｌｕｉｔ１欠損症症候群は常染色体優性遺伝疾患である。患者の最も顕著な表現型としては、乳児性痙攣、後天性小頭症、発育遅延および髄液糖減少症が挙げられる（Ｄｅ Ｖｉｖｏ Ｄ．Ｃ．ら，１９９１）。

疾患の現在の処置は、ケトン体が脳内でニューロンの代替エネルギー源を形成するので、ケトン誘発食の利用が挙げられる。しかし、ケトン食は油を大量に摂取する必要があり、また神経行動症状への効果はわずかであると報告されている。より良い処置、特に遺伝子療法のために、患者においてＧｌｕｔ１発現を回復させる処置の必要性が継続的に求められている。

特定の実施形態において、本発明は、Ｇｌｕｔ１をコードする導入遺伝子を構成する核酸配列を含む組換え型アデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）に関する。特定の実施形態において、Ｇｕｔ１は配列番号７８または７９を含む。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ニワトリβ−アクチンプロモーターをさらに含み、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。特定の実施形態において、導入遺伝子は、脳微小血管の内側を覆う内皮細胞内で発現することができる。特定の実施形態において、ニワトリβ−アクチンプロモーターは、配列番号３１、３８、４５、５４，６２および７０からなる群から選択される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶはＡＡＶ８またはＡＡＶ９である。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは配列番号４８、５６、５９、６４および７３からなる群から選択されるｍｉＲＮＡエレメントをさらに含む。特定の実施形態において、ｒＡＡＶはｍｉＲＮＡエレメントに隣接する末端逆位配列（ＩＴＲ）をさらに含む。

特定の実施形態において、本発明は本明細書に記載の組換え型ＡＡＶのいずれかを含む組成物に関する。特定の実施形態において、この組成物は医薬担体をさらに含む。

特定の実施形態において、本発明は本明細書に記載の組成物を含む容器ケースを備えるキットに関する。特定の実施形態において、容器はシリンジである。

特定の実施形態において、本発明は、対象の血液脳関門（ＢＢＢ）においてＧｌｕｔ１輸送を回復させる方法に関し、該方法はＢＢＢを通過することができ、また脳微小血管の内側を覆う内皮細胞内で発現することもできる本明細書に記載の組換え型ＡＡＶベクターのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。

特定の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象においてＧｌｕｔ１欠損症症候群を処置する方法に関し、該方法はＢＢＢを通過することができ、また脳微小血管の内側を覆う内皮細胞内で発現することもできる本明細書に記載の組換え型ＡＡＶベクターのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。

特定の実施形態において、本発明は、髄液糖減少症、後天性小頭症、運動失調およびジストニア運動障害からなる群から選択されるＧｌｕｔ１欠損症症候群に関連する症状のうちの少なくとも１つを緩和する方法に関し、該方法はＢＢＢを通過することができ、また脳微小血管の内側を覆う内皮細胞内で発現することもできる本明細書に記載の組換え型ＡＡＶベクターのいずれかの有効量を対象に投与することを含む。

本発明の特定の態様において、本発明の実施形態は、ＳＬＣ２Ａ１遺伝子の欠損またはハプロ不全によって特徴づけられる対象においてＧｌｕｔ１ ＤＳを処置する方法に関する。該方法は、所望の細胞内でＧｌｕｔ１産物を発現させるプロモーター配列の制御下で、正常型／野生型Ｇｌｕｔ１タンパク質をコードする核酸配列（すなわち導入遺伝子）を担持する組換え型アデノ随伴ウイルスの有効量を対象に投与することを含んでもよい。特定の実施形態において、プロモーター配列はＢＢＢ細胞内でＧｌｕｔ１産物の発現を提供する。特定の実施形態において、発現は脳微小血管の内側を覆う内皮細胞内に生じる。特定の実施形態において、導入遺伝子の発現は、対象において所望のＧｌｕｔ１レベルを回復させるまたは維持するのに必要な産物を細胞にもたらす。さらに別の実施形態において、本発明はＧｌｕｔ１ ＤＳの処置のための組成物を提供する。そのような組成物は注射に適した担体および追加の成分とともに製剤化されてもよい。

本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な説明において、その好ましい実施形態についてさらに述べる。

コンストラクトをコードする（１０個の）Ｇｌｕｔ１のプラスミドマップである。図１Ａは２Ａコード配列とともに、Ｇｌｕｔ１およびＥＧＦＰレポーター遺伝子を担持する２つのＥＧＦＰ−２Ａ−Ｇｌｕｔ１コンストラクトを示す。図１Ｂは２つのＧｌｕｔ１−２Ａ−ＥＧＦＰコンストラクトを示す。図１Ｃは２つの天然Ｇｌｕｔ１コンストラクトを示す。図１Ｄは肝組織内でＧｌｕｔ１の発現を選択的に遮断するのに役立つｍｉＲＮＡ−１２２結合部位（Ｍｉｒ−１２２ＢＳ）を担持する４つのコンストラクトを示す。 ＡＡＶ９−ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰ（配列番号８０）コンストラクトの発現と、ｉｎ ｖｉｔｒｏＣＨＯ細胞アッセイでのＧｌｕｔ１機能とを示すブロットおよびグラフである。図２ＡはＡＡＶ９−ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰコンストラクトの発現を立証するウエスタンブロットを示す。図２ＢはＡＡＶ９−ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰコンストラクトでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞へのグルコースの取り込みの改善を示すグラフである。機能アッセイにおけるこのコンストラクトの性能を示す。図２ＣはＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後のコンストラクトのＧＦＰ蛍光を示す。 マウスｓｌｃ２ａ１遺伝子をＧｌｕｔ１ ＤＳマウスに再導入した後の運動能力の改善を示すグラフである。図３ＡはＡＡＶ９−ｍＧｌｕｔ１（配列番号３５）で処置した変異マウスにおけるロータロッドパフォーマンスの改善を示すグラフである。図３Ｂは処置した変異マウスにおいてｍＧｌｕｔ１の回復後、垂直ポールクライミングの改善を示すグラフである。 ＡＡＶ９−ｍＧｌｕｔ１（配列番号３５）で処置したマウスにおけるＧｌｕｔ１の組織特異的発現の改善を示すグラフである。図４Ａは処置変異群および関連する対照群における相対的なｓｌｃ２ａ１遺伝子発現を示すグラフである。図４Ｂは野生型Ｇｌｕｔ１＋／＋マウスにおける発現パーセントとしてＧｌｕｔ１発現を示すグラフである。 ＡＡＶ９−ｍＧｌｕｔ１で処置した変異マウスにおいてＧｌｕｔ１タンパク質濃度とＣＳＦグルコース濃度の上昇を示すブロットおよびグラフである。Ｇｌｕｔ１ ＤＳモデルマウスにおいてＧｌｕｔ１の回復により髄液糖減少が軽減したことを示している。図５Ａは処置したＧｌｕｔ１ ＤＳ変異マウスおよび関連する対照群の脳組織内のＧｌｕｔ１タンパク質をウエスタンブロットで示す。図５Ｂは処置したＧｌｕｔ１ ＤＳ変異マウスおよび対照群におけるタンパク質濃度の定量化を示すグラフである。図５ＣはＡＡＶ９−ｍＧｌｕｔ１（配列番号３５）で処置したマウスおよび対照群における血糖値とＣＳＦグルコース濃度を示すグラフである。図５Ｄは種々のマウスにおけるＣＳＦグルコース濃度対血糖値の比率を示す箱ひげ図である。注：Ｎ．Ｓ．−有意差なし、＊Ｐ＜０．０５、 ＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、Ｎ≧８。

ＳＬＣ２Ａ１（Ｇｌｕｔ１とも呼ばれる）遺伝子における突然変異体は、Ｇｌｕｔ１欠損症症候群（Ｇｌｕｔ１ ＤＳ）をもたらし、まれであるが、破壊的な神経発達障害をもたらす（Ｄｅ Ｖｉｖｏ Ｄ．Ｃ．ら，１９９１）。野生型Ｇｌｕｔ１タンパク質は広範囲に発現する。しかし、その主要な細胞作用部位は、血液脳関門を横切るグルコースの促進輸送においてＧｌｕｔ１タンパク質が機能する脳微小血管の内皮細胞であると思われる。タンパク質の濃度の低下または欠損は、そのシグネチャー特徴が髄液糖減少、発育遅延および後天性小頭症を含む複合表現型をもたらす。患者は、運動失調ならびにジストニアの両方である運動表現型も示す。ｓｌｃ２ａ１遺伝子のハプロ不全マウスはヒト疾患の特徴の多くを示す。マウスｓｌｃ２ａ１遺伝子のホモ接合ノックアウトは、胚性致死である。ハプロ不全動物モデルは、ヒト疾患の多くの様相を示す。本発明は、脳内でＧｌｕｔ１タンパク質発現を回復させるためにＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１コンストラクトを用いることに関する。そのような方法およびＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１コンストラクトがヒト疾患の効果的な処置になり得ることが予想される。容易に参照できるように、本明細書に記載のベクターコンストラクトは種々のＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１と呼ばれ、他のエレメントの中でも、マウスＧｌｕｔ１またはヒトＧｌｕｔ１をコードする核酸配列を含むＡＡＶ９コンストラクトを示す。本明細書で用いる場合、ＳＬＣ２Ａ１はヒト遺伝子を指すが、ｓｌｃ２ａ１はそれぞれのＧｌｕｔ１タンパク質をコードするマウス遺伝子を指す。

定義
本発明がより容易に理解されることができるように、特定の技術用語および科学用語を以下に具体的に定義する。本文書中の他の個所で具体的に定義されてない限り、本明細書で用いるすべての他の技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野での当業者によって一般に理解される意味を有する。

添付の特許請求の範囲を含む本明細書で用いる場合、単数形の言葉、例えば「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに指示しない限り、それらが対応する複数の参照物を包含する。

「活性化」、「刺激」および「処置」とは、細胞または受容体に適用される場合、文脈によって、または明示的に示されていない限り、同じ意味を有することもあり、例えば、リガントによる細胞もしくは受容体の活性化、刺激または処置を意味することがある。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えば、サイトカイン、サイトカイン変異体、サイトカイン類似体、変異タンパク質および抗体由来の結合化合物を包含する。また「リガンド」は、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣体および抗体のペプチド模倣体を包含する。「活性化」は、内部機構によって、ならびに外部要因または環境要因によって調節される細胞活性化を指すことができる。「応答」、例えば、細胞、組織、器官または生物の「応答」は、生化学的挙動または生理的挙動の変化、例えば、濃度、密度、接着または生物学的区画内の遊走、遺伝子発現の割合または分化状態の変化を包含し、該変化は活性化、刺激もしくは処置と、または遺伝的プログラミングなどの内部機構と相関性がある。

分子の「活性」とは、リガンドもしくは受容体への分子の結合、触媒活性；遺伝子発現もしくは細胞シグナリング、分化または成熟を刺激する能力；抗原活性、他の分子の活性の調節などを述べる、または指すことがある。分子の「活性」は、細胞間相互作用、例えば接着の調節もしくは維持における活性、または細胞の構造、例えば細胞膜もしくは細胞骨格の維持における活性を指すこともある。「活性」は、比活性度、例えば、［触媒活性］／［ｍｇタンパク質］または［免疫活性］／［ｍｇタンパク質］、生物学的区画内の濃度などを意味することもありうる。「活性」は、自然免疫系または適応免疫系の成分の調節を指すこともある。

動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に適用される場合、「投与」および「処置」は、外因性の医薬、治療薬、診断薬もしくは組成物を該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官もしくは生物学的流体と接触させることを指す。「投与」および「処置」は、例えば、治療方法、薬物動態学的方法、診断方法、研究方法および実験方法を指すこともありうる。細胞の処置は、試薬を細胞と接触させること、ならびに細胞と接触している流体に試薬を接触させることを包含する。「投与」および「処置」は、例えば、試薬、診断化合物、結合化合物による、または別の細胞による、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の処置も意味する。「対象」という用語は、任意の生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒト、例えばヒト患者を含む。

「処置する」または「処置」とは、本発明のｒＡＡＶコンストラクトのいずれかを含有する組成物などの治療薬を、該治療薬が治療活性を有する１つまたは複数の疾患症状を有する、もしくは疾患が疑われる、もしくは疾患に罹患するリスクが上昇している対象もしくは患者に内的もしくは外的に投与することを意味する。一般に、薬剤は、処置されている対象もしくは母集団において、１つまたは複数の疾患症状の軽減を臨床的に測定できる程度で誘発すること、またはそのような症状（複数可）の進行を臨床的に測定できる程度で阻止することのいずれかにより１つまたは複数の疾患症状を軽減する効果的な量で投与される。特定の疾患症状を軽減するのに効果的な治療薬の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、例えば、患者の疾患の状態、年齢と体重などの要因、および対象において所望の反応を誘発する薬物の能力のよって変化しうる。疾患の症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度または進行状態を評価するために、医師または他の熟練した医療サービス提供者によって一般に用いられているどのような臨床的測定によっても評価されることができる。本発明の一実施形態（例えば、処置方法または製造物品）は、すべての対象において標的疾患の症状（複数可）を軽減するのに効果的でない場合もあるが、スチューデントｔ検定、カイ二乗検定、マン・ホィットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール・タプストラ検定およびウィルコクソン−検定などの当技術分野で知られていかなる統計検定によって判定される場合、統計的に有意な数の対象において標的疾患症状を軽減しなければならない。

ヒト対象、動物対象または研究の対象に適用される場合、「処置」は、治療処置措置、予防措置または防止措置を指し、研究応用および診断応用を指す。ヒト対象、動物対象もしくは研究の対象、または細胞、組織もしくは器官に適用される場合、「処置」は、ヒト対象もしくは動物対象、細胞、組織、生理学的区画もしくは生理学的流体に適用される場合、本発明のｒＡＡＶコンストラクトのいずれかのトランスフェクションまたは関連する方法を包含する。

「単離された核酸分子」とは、ゲノムのＤＮＡもしくはＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成起源もしくはいくつかのこれらの組み合わせを意味し、単離されたポリヌクレオチドが自然界に見られるポリヌクレオチドの全部または一部と結合されない、または自然界では結合されないポリヌクレオチドに結合される。本開示のために、特定のヌクレオチド配列を「含む核酸分子」は無処置の染色体を包含しないことを理解すべきである。特定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、特定された配列に加えて、１０まで、もしくはさらに２０以上までもの他のタンパク質もしくはそれらの部分もしくはフラグメントのコード配列を含むことがあり、または列挙された核酸配列のコード領域の発現を制御する作用可能に結合している調節配列を含むことがあり、かつ／またはベクター配列を含むこともある。

「制御配列」という語句は、特定の宿主生物内で作用可能に結合されているコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に適した制御配列は、プロモーター、任意選択でオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使用することが知られている。

核酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係にあるとき、「作用可能に結合され」ている。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーのＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与する前駆体タンパク質として発現する場合、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されており、プロモーターまたはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に結合されており、またはリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするように配置されている場合、コード配列に作用可能に結合されている。一般に、「作用可能に結合されている」とは、結合されるＤＮＡ配列は近接しており、分泌リーダーの場合、近接しており、かつ読みフェーズ（ｒｅａｄｉｎｇ ｐｈａｓｅ）にあることを意味する。しかし、エンハンサーは近接している必要はない。結合は、簡便な制限酵素認識部位でライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の実務に従って使用される。

本明細書で用いる場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」という表現は、互換的に用いられ、そのような呼称のすべては後代子孫を含む。このように、「形質転換体」および「形質転換細胞」という用語は、トランスファーの回数に関係なく、それに由来する初代対象細胞および培養物を含む。すべての後代子孫が、意図的変異または偶発変異のため、正確に同じＤＮＡ量を有するわけではないことも理解されている。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有する変異子孫は包含される。異なる名称が意図される場合、それは文脈から明白になろう。

組換え型ＡＡＶ
一部の態様において、本発明は単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＡＶに関して本明細書で用いる場合、「単離された」という用語は、その自然環境（例えば、宿主細胞、組織または対象）から単離されているＡＡＶを指す。単離されるＡＡＶは組換え方法を用いて生成されてもよい。そのようなＡＡＶは、本明細書では「組換え型ＡＡＶ」と称する。組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ｒＡＡＶの導入遺伝子が１つまたは複数の所定の組織に特異的に送達されるように、組織特異的ターゲティング能力を有することが好ましい。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的ターゲティング能力を判定するうえで重要なエレメントである。このように、標的にされる組織に適しているカプシドを有するｒＡＡＶが選択されることが可能である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは、配列番号９７に記載のアミノ酸配列を有するＡＡＶ９カプシドをコードする配列（例えば配列番号９６）またはそれとの実質的な相同性を有するタンパク質を含む。

Ｇｌｕｔ１ ＤＳの処置と関連して、所望の組織を標的にするために、好ましいｒＡＡＶはＡＡＶ９カプシドとＡＡＶ２骨格の組み合わせであり、本明細書に記載の種々のｒＡＡＶをもたらす（表１および配列リストを参照されたい）。

所望のカプシドタンパク質を有する組換え型ＡＡＶを取得するための方法は記述されている（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２号を参照されたい。その内容は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの異なるＡＡＶカプシドタンパク質は記述されており、例えば、以下に開示されている：Ｇ．Ｇａｏ，ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７８（１２）：６３８１−６３８８（Ｊｕｎｅ ２００４）；Ｇ．Ｇａｏら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１００（１０）：６０８１−６０８６（Ｍａｙ １３，２００３）；米国特許出願公開第２００３−０１３８７７２号、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８号。ＡＡＶカプシドタンパク質および関連するヌクレオチドとアミノ酸配列に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ここで記述するコンストラクトおよび方法の望ましいパッケージングについては、ＡＡＶ９ベクターおよびカプシドが好ましい。しかし、他の適切なＡＡＶ、例えばｒＡＡＶｒｈ．８およびｒＡＡＶｒｈ．１０、または他の同様のベクターは本発明での使用に適応できることが注目されている。一般的に、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質またはそのフラグメントをコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）と導入遺伝子から構成される組換え型ＡＡＶベクター；およびＡＡＶカプシドタンパク質への組換え型ＡＡＶベクターのパッケージングを可能にする十分なヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。

ＡＡＶカプシドにｒＡＡＶベクターをパッケージングするために、宿主細胞中で培養される成分は、宿主細胞にトランスで提供されてもよい。あるいは、必要な成分（例えば、組換え型ＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列および／またはヘルパー機能）のいずれか１つまたは複数は、当業者に既知の方法を用いて必要な成分の１つまたは複数を含有するように設計されている安定な宿主細胞によって提供されてもよい。そのような安定な宿主細胞は、誘導性プロモーターの制御下で必要な成分（複数可）を含有することが最も適切である。しかし、必要な成分（複数可）は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。さらに別の選択肢において、選択される安定な宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下の選択された成分（複数可）と、１つまたは複数の誘導性プロモーター制御下の他の選択された成分とを含有してもよい。例えば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下でＥ１ヘルパー機能を含有する）由来であるが、しかし誘導性プロモーターの制御下でｒｅｐタンパク質および／またはｃａｐタンパク質を含有する安定の宿主細胞が生成されてもよい。

ｒＡＡＶを生成するための組換え型ＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列，ｃａｐ配列およびヘルパー機能は、いずれの適切な遺伝因子（ベクター）を用いてパッケージング宿主細胞に送達されることができる。選択された遺伝因子は、本明細書に記載のものを含むいずれの適切な方法によって送達されてもよい。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．， ７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。

一部の実施形態において、組換え型ＡＡＶは、トリプルトランスフェクション法（例えば、米国特許第６，００１，６５０号に詳細に記載されている方法。トリプルトランスフェクション法に関する内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を用いて生成することができる。一般的に、組換え型ＡＡＶは、ＡＡＶ粒子、ＡＡＶヘルパー機能ベクターおよび補助機能ベクターにパッケージングされる組換え型ＡＡＶベクター（導入遺伝子を含む）で宿主細胞をトランスフェクトすることによって生成される。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、生産的なＡＡＶ複製とカプシド形成のためにトランスで機能する「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、どのような検出可能な野生型ＡＡＶビリオンも（すなわち、機能的ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）生成することなく、効果的なＡＡＶベクター生成を補助する。本発明での使用に適したベクターの非限定な例としては、米国特許第６，００１，６５０号に記載のｐＨＬＰ１９および米国特許第６，１５６，３０３号に記載のｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターが挙げられる。両特許全体は参照により本明細書に組み込まれる。補助機能ベクターは、ＡＡＶが複製のために依存している非ＡＡＶ由来ウイルス機能および／または細胞機能（すなわち「補助機能」）をコードする。補助機能はＡＡＶ複製で必要な機能を含み、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化に関与する部分、段階特異的なＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、およびＡＡＶカプシド集合が挙げられるがこれらに限定されない。ウイルスベースの補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）およびワクシニアウィルスなどの既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来することが可能である。

トランスフェクトされた宿主細胞に関して、「トランスフェクション」という用語を用いて、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指し、細胞は、外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入されているとき、「トランスフェククトされる」。いくつかのトランスフェクション手法は、当技術分野で一般に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｄａｖｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照されたい。そのような手法を用いて、ヌクレオチド組込み型ベクターおよび他の核酸部分などの１つまたは複数の外因性核酸を適切な宿主細胞に導入することができる。

「宿主細胞」は、目的の物質を内部に持っている、または内部に持つことができるいずれの細胞も指す。宿主細胞は哺乳動物細胞であることが多い。宿主細胞は、ＡＡＶヘルパーコンストラクトのレシピエント、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクターまたは組換え型ＡＡＶの生成に関連する他のトランスファーＤＮＡとして用いることができる。この用語は、トランスフェクトされた原細胞の後代子孫を含む。このように、本明細書で用いる場合、「宿主細胞」とは、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指すこともある。当然のことながら、単一親細胞の子孫は、自然変異、偶然的変異、または意図的な変異に起因し、形態もしくはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において元の親と必ずしも完全に同一でないこともある。

細胞に関して、「単離された」という用語は、その自然環境（例えば、組織または対象）から分離された細胞を指す。「細胞株」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで連続してまたは長期間にわたり増殖と分裂が行える細胞の集団を指す。細胞株は、単一前駆細胞に由来するクローン集団であることが多い。自発変化または誘起変化がそのようなクローン集団の保管中にまたはトランスファー中に核型内で起こりうることは、当技術分野でさらに知られている。したがって、言及した細胞株に由来する細胞はその母細胞または培養物と正確に同一でないこともあり、言及した細胞株はそのような変種体を含む。本明細書で用いられる場合、「組換え型細胞」という用語は、生物活性ポリペプチドの転写またはＲＮＡなどの生物活性核酸の生産を引き起こすＤＮＡ断片などの外来性ＤＮＡ断片が導入された細胞を指す。

「ベクター」という用語は、任意の遺伝因子、例えばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオンを含み、適切な制御エレメントと結合しているとき、複製することができ、および細胞間で遺伝子配列をトランスファーすることができる。このように、この用語はクローニングビヒクルおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。一部の実施形態において、有用なベクターは、転写される核酸断片がプロモーターの転写制御下に配置されているベクターであると考えられる。「プロモーター」は、遺伝子の特定の転写を開始させるのに必要な、細胞の合成機構によって認識されたＤＮＡ配列、または導入された合成機構を指す。「作用可能に配置された」、「作用可能に結合された」、「制御下」または「転写制御下」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子発現を制御するために核酸に関してプロモーターが正しい位置および方向にあることを意味する。「発現ベクターまたはコンストラクト」という用語は、核酸コード配列の一部または全体が転写されることができる核酸を含んでいるどのような種類の遺伝子コンストラクトも意味する。一部の実施形態において、発現は、例えば、転写された遺伝子から生物活性ポリペプチド産物または阻害ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を生成するための核酸の転写を含む。

組換え型ＡＡＶベクター
本明細書に記載の「組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」とは、一般的に、最低でも、導入遺伝子（例えばＧｌｕｔ１をコードする）とその調節配列、および５’と３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）から構成される。カプシドタンパク質にパッケージングされて、選択された標的細胞に送達されるのは、この組換え型ＡＡＶベクターである。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター）または他の目的の遺伝子産物（例えばＧｌｕｔ１）をコードするベクター配列と非相同的な核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞において導入遺伝子転写、翻訳および／または発現を可能にする様式で調節成分に作用可能に結合される。

ベクターのＡＡＶ配列は、シス作用性５’と３’末端逆位配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ． Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ “Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，編，Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、一般的に長さが約１４５ｂｐである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全配列は分子で使用されるが、これらの配列のある程度の微修正はさしつかえない（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；およびＫ． Ｆｉｓｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）のテキストを参照されたい）。そのような分子の一例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドがあり、同プラスミド内では選択された導入遺伝子および結合した調節エレメントが５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列と隣接している。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在特定されている哺乳動物のＡＡＶ種類を含み、いずれの既知のＡＡＶからも得ることができる。

組換え型ＡＡＶベクターについて上で特定されたエレメントに加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、または本発明によって産生されたウイルスに感染した細胞内でその転写、翻訳および／または発現が可能となるように導入遺伝子に作用可能に結合される従来の制御エレメントも含むことができる。本明細書で用いる場合、「作用可能に結合された」配列とは、目的の遺伝子と近接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスで、または少し離れて作用する発現制御配列との両方を含む。発現制御配列としては、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；スプライシングシグナルおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；転写効率を高める配列（すなわち、コンセンサスＫｏｚａｋ配列）；タンパク質安定性を高める配列：および必要に応じて、コードされた産物の分泌を高める配列が挙げられる。天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターを含む多数の発現制御配列は、当技術分野で既知であり、利用することができる。

本明細書で用いる場合、核酸配列（例えば、コード配列）および調節配列とは、これらの配列が核酸配列の発現または転写を調節配列の影響下または制御下に置くような方法で共有結合されると、作用可能に結合されていると言われる。核酸配列が機能タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、５’調節配列においてプロモーターの誘導がコード配列の転写をもたらすならば、および２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が（１）フレームシフト変異を導入しない、（２）コード配列の転写を指示するプロモーター領域の能力に干渉しない、または（３）タンパク質に翻訳されるための対応するＲＮＡ転写の能力に干渉しないならば、これら２つのＤＮＡ配列は作用可能に結合されていると言われる。このように、得られた転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるようにプロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる場合、プロモーター領域は核酸配列に作用可能に結合されるであろう。同様に、２つ以上のコード領域は、共通のプロモーターからのそれらが転写されフレーム内で翻訳された２つ以上のタンパク質の発現が生じるようにそれらが結合されているとき、作用可能に結合されている。一部の実施形態において、作用可能に結合されたコード配列は、融合タンパク質をもたらす。一部の実施形態において、作用可能に結合されたコード配列は、機能性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）をもたらす。

タンパク質をコードする核酸の場合、ポリアデニル化配列は、一般に導入遺伝子配列の後、３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本発明で有用なｒＡＡＶコンストラクトは、イントロンも含んでもよく、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子の間に位置するのが望ましい。１つの可能なイントロン配列はＳＶ−４０に由来し、ＳＶ−４０Ｔイントロン配列と呼ばれる。用いることができる別のベクターエレメントは、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列は、複数のポリペプチドを単一遺伝子転写物から産生するのに用いられる。ＩＲＥＳ配列は、複数のポリペプチド鎖を含むタンパク質を産生するのに用いられる。これらおよび他の一般的なベクターエレメントの選択は、従来通りであり、多くのそのような配列が入手可能である（例えば、以下を参照されたい。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、およびそれに引用されている参照文献、例えばページ ３．１８ ３．２６ と１６．１７ １６．２７、およびＡｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）。いくつかの状況では、口蹄疫ウイルス２Ａ配列がポリタンパク質に含まれることもある。これは低分子ペプチド（長さが約１８アミノ酸）であり、ポリタンパク質の切断を媒介することが示されている（Ｒｙａｎ， Ｍ Ｄら，ＥＭＢＯ，１９９４；４：９２８−９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ，Ｎ Ｍら，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６； ｐ． ８１２４−８１２７； Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８６４−８７３；およびＨａｌｐｉｎ，Ｃら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３−４５９）。
２Ａ配列の切断活性は、これまでにプラスミドおよび遺伝子治療ベクター（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を含む人工系で立証されてきた（Ｒｙａｎ，Ｍ Ｄら，ＥＭＢＯ，１９９４；４：９２８−９３３；Ｍａｔｔｉｏｎ，Ｎ Ｍら，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９６；ｐ．８１２４−８１２７；Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８６４−８７３；および Ｈａｌｐｉｎ，Ｃら，Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９；４：４５３−４５９；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ，Ｐら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：１９８−２０８；ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， Ｐら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０００；１１：１９２１−１９３１； および Ｋｌｕｍｐ，Ｈら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１；８：８１１−８１７）。

宿主細胞内での遺伝子発現にとって必要とされる調節配列の正確な性質は、種、組織または細胞型間で変化しうるが、一般的に、必要に応じて、それぞれ転写開始および翻訳に関与する５’非転写配列および５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサーエレメントなどを含む。特に、そのような５’非転写調節配列は、作用可能に連結された遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含有するプロモーター領域を含む。調節配列は、要望に応じてエンハンサー配列または上流アクチベーター配列も含むことができる。ベクターは、任意選択で５’リーダー配列またはシグナル配列を含んでもよい。

構成的プロモーターの例としては、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択でＣＭＶエンハンサーを含む）［例えばＢｏｓｈａｒｔら，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターおよびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が挙げられるが、これらに限定されない。

誘導性プロモーターは遺伝子発現の調節を可能にし、外因的に供給される化合物、温度などの環境因子、または特定の生理的状態の存在、例えば急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製中の細胞のみにおいて調節されることができる。誘導性プロモーターおよび誘導性の系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄを含がこれらに限定されない様々な商業的供給源から入手することができる。外因的に供給されるプロモーターにより調節される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号）；エクジソン昆虫プロモーター（Ｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６））、テトラサイクリン−抑制系（Ｇｏｓｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７？５５５１（１９９２））、テトラサイクリン−誘導系（Ｇｏｓｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）、またＨａｒｖｅｙら，Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：５１２−５１８（１９９８）を参照されたい）、ＲＵ４８６−誘導系（Ｗａｎｇら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）およびＷａｎｇら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７））およびラパマイシン−誘導系（Ｍａｇａｒｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７））が挙げられる。さらに、この文脈において、有用でありうる他の種類の誘導性プロモーターは、特定の生理的状態、例えば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製中の細胞のみにおいて調節されるベクターである。

別の実施形態において、導入遺伝子のための天然プロモーターまたはそのフラグメントが使用される。導入遺伝子の発現が天然の発現を模倣する必要があることが望ましいとき、天然プロモーターが好ましいこともある。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的に、もしくは発生的に、もしくは組織特異的に、もしくは特定の転写刺激に応答して調節されなければならないときに、使用できる。さらなる実施形態において、他の天然の発現制御エレメント、例えばエンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位またはコザックコンセンサス配列を用いて、天然の発現を模倣することもできる。

一部の実施形態において、調節配列は組織特異遺伝子発現機能をもたらす。場合によっては、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘発する組織特異的転写因子を結合する。そのような組織特異的調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）は、当技術分野では周知である。代表的な組織特異的調節配列としては、以下の組織特異的プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターなどのニューロンプロモーター（Ａｎｄｅｒｓｅｎら，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３−１５ １９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＤＳＡ，８８：５６１１−５（１９９１））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Ｐｉｃｃｉｏｌｉら， Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３−８４（１９９５））。一部の実施形態において、組織特異的プロモーターは、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ）およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）から選択される遺伝子プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはニワトリβ−アクチンプロモーターである。

一部の実施形態において、導入遺伝子を内部に持つ対象の１つまたは複数の組織、例えば非ＣＮＳ組織において導入遺伝子の発現を阻害するために、１つまたは複数のｍｉＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位がｒＡＡＶベクターの導入遺伝子内に組み入れられる。当業者は、結合部位が組織特異的に導入遺伝子の発現を制御するように選択されうることを認識する。例えば、肝臓において導入遺伝子の発現は、肝臓内で導入遺伝子から発現されるｍＲＮＡがｍｉＲ−１２２に結合し、かつｍｉＲ−１２２によって阻害されるように、ｍｉＲ−１２２の結合部位を組み入れることによって阻害することができる。心臓において導入遺伝子の発現は、心臓内で導入遺伝子から発現されたｍＲＮＡがｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１に結合し、かつｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１によって阻害されるように、ｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１の結合部位を組み入れることによって阻害することができる。ｍＲＮＡにおいてｍｉＲＮＡ標的部位は、コード領域の５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ内にありうる。一般的に、標的部位はｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内にある。さらに、導入遺伝子は、複数のｍｉＲＮＡが同じ部位または複数の部位を認識することによってｍＲＮＡを調節するように、デザインすることができる。複数のｍｉＲＮＡ結合部位が存在することで、複数のＲＩＳＣが強調的に作用し、発現の阻害が高効率でもたらされる。標的部位配列は、総計５〜１００、１０〜６０またはそれ以上のヌクレオチドを含むことができる。標的部位配列は、標的遺伝子結合部位の配列の少なくとも５ヌクロチドを含むことができる。

導入遺伝子コード配列
ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子配列の組成は、結果として得られるベクターの用途に依存する。例えば、１種類の導入遺伝子配列は、発現すると検出可能なシグナルを生成するレポーター配列を含む。別の例において、導入遺伝子は治療用Ｇｌｕｔ１タンパク質または治療用機能性ＲＮＡをコードする。別の例において、導入遺伝子は、研究目的、例えば導入遺伝子を内部に持つ体細胞遺伝子導入動物モデルを作製する、例えば導入遺伝子産物の機能を調査する目的での使用が意図されるタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。別の例において、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作製するための使用が意図されるタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。適切な導入遺伝子コード配列は、当業者にとって明らかである。

一部の態様において、本発明は、哺乳動物においてＳＬＣ２Ａ１遺伝子欠損（例えば遺伝性遺伝子欠損、体細胞遺伝子変化）、例えば、対象においてＧｌｕｔ１ポリペプチド欠乏をもたらす遺伝子欠損を予防または処置する方法で、特に、Ｇｌｕｔ１欠乏を呈する対象において欠乏の重症度または程度を処置または低下させる方法で用いるｒＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態において、方法は、１つまたは複数の治療用ペプチド、ポリペプチド、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチドなどをコードするｒＡＡＶベクターを薬学的に許容される担体中で、Ｇｌｕｔ１障害を有する、または障害を有すると疑われる対象においてＧｌｕｔ１障害を処置するのに十分な量および期間で投与することを含む。

組換え型ＡＡＶの投与
ｒＡＡＶは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用を起こすことなく十分なレベルの遺伝子トランスファーと発現をもたらすように十分な量で投与される。従来の投与経路および薬学的に許容される投与経路としては、選択された組織への直接送達（例えば脳内投与、くも膜下腔内投与）、静脈内、経口、吸入（鼻腔内送達および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内および他の非経口投与経路が挙げられるがこれらに限定されない。投与経路は、必要に応じて組み合わせてもよい。

対象への特定のｒＡＡＶの送達は、例えば、対象の血流中への投与によって行われてもよい。血流への投与は、静脈、動脈または他のいかなる血管導管への注射による投与であってもよい。さらに、特定の例において、脳組織、髄膜、神経細胞、グリア細胞、アストロサイト、希突起神経膠細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間隙腔などにｒＡＡＶを送達することが望ましいこともある。一部の実施形態において、組換え型ＡＡＶは、定位的注射によるなどの当技術分野で既知の脳神経外科技術を用いて、針、カテーテルまたは関連するデバイスによる、脳室領域への注射によって脊髄または脳に、ならびに線条体（例えば、線状体の尾状核または被殻）、および神経筋接合部または小脳小葉に直接送達されることもできる（例えば、Ｓｔｅｉｎ ら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：３４２４−３４２９，１９９９； Ｄａｖｉｄｓｏｎら，ＰＮＡＳ ９７：３４２８−３４３２，２０００；Ｄａｖｉｄｓｏｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１９−２２３，１９９３；およびＡｌｉｓｋｙ とＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：２３１５−２３２９，２０００を参照されたい）。特定の状況において、本明細書に開示する適切に製剤化された医薬組成物中のｒＡＡＶベース治療用コンストラクトを、皮下に、脾内に、鼻腔内に、非経口的に、静脈内に、筋内に、脳内に、くも膜下腔内に、脳内に、経口で、腹腔内にまたは吸入のいずれかによって送達することが望ましい。一部の実施形態において、米国特許第５，５４３，１５８号、第５，６４１，５１５号および第５，３９９，３６３号（それぞれの全体を参照によって本明細書に明確に組み込まれる）に記載の投与モダリティを用いてｒＡＡＶを送達することができる。

組換え型ＡＡＶ組成物
ｒＡＡＶは、当技術分野で既知の任意の適切な方法によって、組成物中で対象に送達されることができる。ｒＡＶＶは、好ましくは、生理学的に適合する担体（例えば、組成物中で）に懸濁され、対象、例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウまたは非ヒト霊長類（例えばマカク）に投与されてもよい。特定の実施形態において、組成物はｒＡＡＶを単独で、または、１種または複数種のウイルス（例えば、１種または複数種の異なる導入遺伝子をコードする第２のｒＡＡＶ）との組み合わせで含むことができる。

適切な担体は、ｒＡＡＶが向けられる兆候の観点から当業者により容易に選択されることができる。例えば、１つの適切な担体としては、種々の緩衝液を用いて製剤化されることができる生理食塩水（例えばリン酸緩衝生理食塩水）が挙げられる。他の代表的な担体としては、無菌食塩水、ラクトース、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油および水が挙げられる。担体を選択することでは、本発明は限定されない。

任意選択で、ｒＡＡＶと担体（複数可）に加えて、本発明の組成物は、他の従来の医薬成分、例えば保存剤または化学安定剤を含んでもよい。適切な代表的な保存剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノールおよびパラクロロフェノールが挙げられる。適切な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。

所望の効果または「治療効果」を達成するために必要とされるｒＡＡＶビリオンの投与量、例えば体重Ｋｇ当たりのベクターゲノム中の投与量の単位（ｖｇ／ｋｇ）は、いくつかの要因、これらに限定されないが、例えばｒＡＡＶ投与経路、治療効果を達成するために必要とされる遺伝子もしくはＲＮＡの発現レベル、処置される特定の疾患もしくは障害、および遺伝子もしくはＲＮＡの産物の安定性に基づいて変化する。当業者は、前述の要因、ならびに当技術分野で周知の他の要因に基づいて特定の疾患または障害を有する対象を処置するためにｒＡＡＶビリオンの投与量範囲を容易に決定することができる。ｒＡＡＶの有効量は一般に、対象当たり約１０^９〜１０^１６ゲノムコピーを含有する溶液約１０μＬ〜約１００ｍＬの範囲である。この溶液を他の量で用いてもよい。使用される量は、一般的に対象の大きさ、ｒＡＡＶの投与量および投与経路に依存する。例えば、くも膜下腔内投与または脳内投与の場合、１μＬ〜１０μＬまたは１０μＬ〜１００μＬの範囲の量を用いることができる。静脈内投与の場合、１０μＬ〜１００μＬ、１００μＬ〜１ｍＬ、１ｍＬ〜１０ｍＬまたはそれ以上の範囲の量を用いることができる。場合によっては、対象当たり約１０^１０〜１０^１２の間のｒＡＡＶゲノムコピーの用量が適当である。特定の実施形態において、対象当たり１０^１２ｒＡＡＶゲノムコピーがＣＮＳ組織を標的とするのに効果的である。一部の実施形態において、ｒＡＡＶは対象当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、１０^１４または１０^１５ゲノムコピーの投与量で投与される。一部の実施形態において、ｒＡＡＶはＫｇ当たり１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３または１０^１４ゲノムコピーの投与量で投与される。

一部の実施形態において、ｒＡＡＶ組成物は、特に、高濃度のｒＡＡＶが存在する場合（例えば、約１０^１３ＧＣ／ｍＬまたはそれ以上）、組成物中のＡＡＶ粒子の凝集を減少させるように製剤化される。ｒＡＡＶの凝集を減少させる方法は、当技術分野で周知であり、例えば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整などがある（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ Ｆ Ｒ，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００５）１２，１７１−１７８を参照されたい。この内容は参照により本明細書に組み込まれる）。

薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の製剤は、当業者には周知であり、種々の処置計画において本明細書に記載の特定の組成物を用いる適切な投薬および処置が開発されている。一般的に、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の活性成分を含んでもよいが、活性成分（複数可）のパーセンテージはもちろん、変えることができ、都合のいいことには、製剤全体の重量または体積の約１％もしくは２％と約７０％もしくは８０％以上の間である。当然、治療に有用な各組成物中の活性成分の量は、適切な投与量が化合物の任意の所与の単位用量で得られるように調製されてもよい。溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品有効期間などの要因、ならびに他の薬理学考慮はそのような医薬製剤を調製する当業者によって熟考され、このように、種々の投与量および治療計画が望ましいことがある。

注射用途に適した剤型としては、無菌の水性液剤もしくは分散剤、および無菌の注射剤もしくは分散剤の即時調製用の無菌粉末剤が挙げられる。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールとそれらの混合物、および油で調製されることもできる。通常の保管および使用の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防止するための保存剤を含む。多くの場合、剤型は、容易に注射針を通過できる程度の無菌の流体である。剤型は、製造および保管の条件下で安定でなければならず、ならびにバクテリアおよび真菌などの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールと液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物および／または植物油を含有する溶媒または分散媒であってよい。適当な流動率は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散剤の場合、所要の粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールによってもたらすことが可能である。多くの場合、等張化剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で用いることによってもたらすことが可能である。

水性注射液の投与の場合、例えば、必要に応じて、注射液は適切に緩衝され、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張化されてもよい。これらの特定の水性液剤は、特に静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の投与に適している。この点について、使用することができる無菌の水性溶媒は、当業者には知られている。例えば、一投与量は、１ｍＬの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍＬの持続皮下輸液に添加するか、または提案された注入部位に注射することができる（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”第１５版，ｐａｇｅｓ １０３５−１０３８および１５７０−１５８０を参照されたい）。投与量の一部の変化は、宿主の状態によって、必然的に起こる。投与責任者は、いずれにしても、個々の宿主のために適切な投与量を判定する。

無菌注射剤は、ろ過滅菌に続いて、必要に応じて、本明細書に列挙される他の種々の成分とともに適切な溶媒に活性ｒＡＡＶを必要量で組み入れることによって調製される。一般に、分散剤は、基本的な分散媒と上記列挙からの所要の他の成分とを含有する無菌ビヒクル中に種々の無菌活性成分を組み入れることによって調製される。無菌注射剤の調製のための無菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて、以前に無菌ろ過したその溶液からの任意のさらなる所望の成分を産生する真空乾燥手法および凍結乾燥手法がある。

本明細書に開示されるｒＡＡＶ組成物は、中性形態または塩形態で製剤化されることもできる。薬学的に許容される塩としては、例えば塩酸もしくはリン酸といった無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸といった有機酸で形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩も、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第二鉄といった無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基由来でありうる。製剤化後すぐに、液剤は投与製剤と適合する様式で、および治療効果のある量で投与される。製剤は、注射剤、薬物放出カプセルなどの種々の剤形で、容易に投与される。

本明細書で用いる場合、「担体」にはありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤と抗真菌剤、等張化剤と吸収遅延剤、緩衝剤、担体液剤、懸濁剤、コロイド剤などが含まれる。そのような溶媒および薬剤を薬学的活性物質のために用いることは、当技術分野で周知である。補助活性成分も組成物に組み込まれることができる。
「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されると、アレルギー有害反応または類似の有害反応をもたらさない分子実体と組成物を指す。

送達ビヒクル、例えばリポソーム、ナノカプセル、微粒子、小球体、脂質粒子、小胞は、本発明の組成物を適切な宿主細胞に導入するために用いることができる。特に、導入遺伝子に送達されるｒＡＡＶベクターは、送達のために、製剤化されるか、または脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノ球体またはナノ粒子などにカプセル化されてもよい。

そのような製剤は、本明細書に開示する核酸またはｒＡＡＶコンストラクトの薬学的に許容される製剤の導入のために好まれることがある。リポソームの製剤および使用は、一般的に当業者に知られている。最近では、血清安定性および循環半減期が改善したリポソームが開発されている（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、可能性がある薬物担体としてリポソームおよびリポソーム様調製の種々の方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、第５，５５２，１５７号、第５，５６５，２１３号、第５，７３８，８６８号および第５，７９５，５８７号）。

リポソームは、通常は他の手法によるトランスフェクションに対して抵抗するいくつかの細胞型とともに、成功裏に用いられている。加えて、リポソームには、ウイルスベースの送達系で一般的なＤＡＮ長の制約がない。リポソーを効率的に用いて、種々の培養細胞株と動物に遺伝子、薬物、放射線療法剤、ウイルス、転写調節因子とアロステリックエフェクターを導入している。加えて、リポソーム媒介の薬物送達の有効性を調べるいくつかの臨床試験が好結果で終了している。

リポソームは、水性媒体中に分散し、自然に多層同心二重層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶの径は、一般的に２５ｎｍ〜４μｍである。ＭＬＶの音波処理により、コアに水溶液を含有する、粒径が２００〜５００Å範囲内の小さい単層ベシクルＳＵＶ）が形成される。

あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤が使用されてもよい。ナノカプセル剤は、一般的に、安定した再生可能な方法で、物質を封入することができる。細胞内のポリマーの過負担に起因する副作用を避けるために、そのような超微粒子（約０．１μｍの大きさ）はｉｎ ｖｉｖｏで分解されることが可能なポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要求を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子は、使用が可能とみなされる。

上記の送達方法に加えて、以下の手法が、宿主にｒＡＡＶ組成物を送達する代替方法としても可能とみなされる。循環系への、および同系を通る薬物透過の速度と有効性を高める装置として、ソノフォレーシス（すなわち、超音波）が米国特許第５，６５６，０１６号に用いられ記載されている。予想される他の薬物送達の選択肢は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号）、マイクロチップデバイス（米国特許第５，７９７，８９８号）、眼科用製剤（Ｂｏｕｒｌａｉｓら，１９９８）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号と第５，７８３，２０８号）、およびフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号）がある。

ｒＡＡＶ組成物の送達に関連する一般方法
本発明はｒＡＡＶビリオンを含む安定な医薬組成物を提供する。本組成物は、凍結／解凍サイクルにかけても、ガラスを含む種々の材料製の容器に保管されても、安定性および活性を維持し続ける。

目的の異種ヌクレオチド配列を含有する組換え型ＡＡＶビリオンは、遺伝子送達のために、例えば遺伝子治療応用において、遺伝子導入動物の生産のために、核酸ワクチン、リボザイムとアンチセンス療法において、ならびに種々の細胞型へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの遺伝子送達のために用いることが可能である。

一般に、ｒＡＡＶビリオンは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかの形質導入手法を使用して、対象の細胞に導入される。ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入される場合、望ましいレシピエント細胞は対象から取り出され、ｒＡＡＶビリオンで形質導入され、次いで対象に再導入される。あるいは、同系細胞または異種細胞が対象内で不適切な免疫応答を起こさない場合、これらの細胞を用いることができる。

形質導入した細胞の送達および導入のための適切な方法は、記述されている。例えば、組換え型ＡＡＶビリオンと細胞を、例えば適切な媒体中で組み合わせ、目的のＤＮＡを内部に有するこれらの細胞をサザンブロットおよび／またはＰＣＲなどの従来の手法を用いて、スクリーニングを行うことによって、または選択可能なマーカーを用いることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を形質導入することができる。次いで、形質導入された細胞は、以下にさらに十分に記載の医薬組成物に製剤化されることが可能であり、この組成物は種々の経路によって、例えば筋内、静脈内、動脈内、皮下および腹腔内の注射によって、または例えばカテーテルを用いて平滑筋への注射によって、もしくは器官への直接注入によって対象に導入されることができる。

ｉｎ ｖｉｖｏでの送達の場合、ｒＡＡＶビリオンは、医薬組成物に製剤化され、一般に非経口的に、例えば骨格筋への筋内注射によって直接的に、動脈内に、静脈内に、または器官に直接的に投与される。

適切な用量は、他の要因の中でも、処置される対象（例えばヒトもしくは非ヒト霊長類または他の哺乳動物）、処置される対象の年齢および全身状態、処置を受けている病態の重症度、ｒＡＡＶビリオンの投与方法によって決まる。適切な有効量は、当業者によって容易に決定されることができる。

このように、「治療有効量」は、臨床試験を経て決定されることができる比較的広い範囲に入る。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの注射、すなわち対象への直接注射の場合、治療有効用量はｒＡＡＶビリオン約１０^５〜１０^１６個、より好ましくはｒＡＡＶビリオン１０^８〜１０^１４個のオーダーである。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの形質導入の場合、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、１０^５〜１０^１３、好ましくはｒＡＡＶビリオン１０^８〜１０^１３個のオーダーである。医薬組成物が対象に戻される形質導入細胞を含む場合、医薬組成物中の形質導入細胞の量は、約１０^４〜１０^１０個、より好ましくは１０^５〜１０^８個である。もちろん、用量は、形質導入の効率、プロモーター強度、メッセージの安定性、およびそれによってコードされるタンパク質などに依存する。有効投与量は、用量反応曲線を確定する通常の試行によって当業者が容易に確立することができる。

投薬処置は、上記の量が最終的に送達されるように、単回投与計画または複数回投与計画であってよい。さらに、対象は必要に応じて多くの用量として投与されてもよい。このように、対象は、例えば、単回投与で１０^５〜１０^１６個のｒＡＡＶビリオン、または例えば合計で１０^５〜１０^１６個のｒＡＡＶビリオンを送達する２回、４回．５回、６回以上の投与を施されてもよい。当業者は、投与する用量の適切な回数を容易に決定することができる。

このように、医薬組成物は、目的のタンパク質の治療有効量、すなわち問題の病状の症状を軽減する、もしくは寛解させるのに十分な量、または所望の利益を与えるのに十分な量を生産するのに十分な遺伝物質を含む。このように、ｒＡＡＶビリオンは、１つまたは複数の用量で投与されると、治療効果をもたらすのに十分な量で医療組成物中に存在する。ｒＡＡＶビリオンは、凍結乾燥製剤として提供され、即時使用の場合または今後使用の場合ビリオン安定化組成物に希釈されることができる。あるいは、ｒＡＡＶビリオンは、生産直後に提供され、今後使用用に保管されることができる。

医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含む。そのような賦形剤は、その組成物が投与される個体に有害な抗体の産生をそれ自体は誘発せず、過度の毒性なして投与されることができる、任意の医薬品を含む。薬学的に許容される賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体が挙げられるが、これらに限定されない。それに含まれる薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩；および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩が挙げられる。さらに、湿潤剤または乳化剤などの補助物質、ｐＨ緩衝物質などはそのようなビヒクル中に存在することもある。薬学的に許容される賦形剤に関する完全な考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）から入手することが可能である。

本明細書で用いる場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、特定の核酸配列、すなわちＲＮＡおよび／またはＤＮＡが例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載のように増幅される方法または手法を指す。一般に、関心領域またはそれを越えた末端からの配列情報を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。これらのプライマーは、増幅される鋳型の反対鎖に対して配列が同一または類似する。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅された物質の末端と一致することができる。ＰＣＲを用いて、特定のＲＮＡ配列、完全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージ配列またはプラスミド配列を増幅することができる。全般的に、Ｍｕｌｌｉｓら（１９８７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３；Ｅｒｌｉｃｈ，編，（１９８９）ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。本明細書で用いる場合、ＰＣＲは、核酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応方法の１例であるが唯一の例ではないと考えられ、該方法は、核酸の特定の断片を増幅または生成するために、プライマーとして既知の核酸および核酸ポリメラーゼの使用を含む。

核酸
また、本発明は、特定のコンストラクトと、本明細書に記載のＧｌｕｔ１タンパク質をコードする核酸とを含む。配列番号２８〜７５と８０〜９７を含む表１に収載の選択された配列を含み、ならびに特定の態様において配列番号２〜５、７〜９、１１〜１４、１６〜１８、２０〜２３、２５〜２７および８０〜９５のうちの１または複数を含む特定のコンストラクトおよび配列は、本発明の実施形態において有用でありうる。予想外に、本明細書に記載するように、例えば２Ａペプチドをコードする核酸配列が所望のレベルのＧｌｕｔ１を発現しないことが判明した。このように、好ましいｒＡＡＶコンストラクトは、核酸配列番号６、１５および／または２４が欠如し、これらすべては２Ａコード配列に対応する。

好ましくは、核酸は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件または高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的機能を維持するＧｌｕｔ１タンパク質をコードする。第１の核酸分子の一本鎖形態が温度および溶液イオン強度の適切な条件下で第２の核酸分子にアニールすることができるとき、第１の核酸分子は、第２の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲を参照されたい）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。一般的な低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、５５℃、５ＸＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳおよびホルムアミドなし、または４２℃で３０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳを含む。一般的な中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、４２℃で、５ＸＳＳＣまたは６ＸＳＳＣおよび０．１％ ＳＤＳで、４０％ホルムアミドである。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、４２℃で、または任意選択でより高い温度（例えば、５７℃、５９℃、６０℃、６２℃、６３℃、６５℃もしくは６８℃）で、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣもしくは６ＸＳＳＣである。一般に、ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含むことが必要であるが、しかしハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって、塩基間のミスマッチがあり得る。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さと相補性の程度、すなわち当技術分野で周知の変数に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きくなればなるほど、その下で核酸がハイブリダイズすることができるストリンジェンシーは高くなる。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドの場合の融解温度の計算式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，前掲、９．５０−９．５１を参照されたい）。短い核酸、例えばオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置はより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さはその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，前掲、１１．７−１１．８を参照されたい）。

アルゴリズムのパラメータがそれぞれの参照配列の全長にわたりそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較が行われるとき、本明細書に示すｍＧｌｕｔ１またはｈＧｌｕｔ１アミノ酸配列（例えば、配列番号７８および配列番号７９）と少なくとも約７０％同一である、好ましくは少なくとも約８０％同一である、より好ましくは少なくとも約９０％同一である、および最も好ましくは少なくとも約９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）であるアミノ酸配列を含むＧｌｕｔ１ポリペプチドは、Ｇｌｕｔ１機能を回復させることに関して可能とみなされる。アルゴリズムのパラメータがそれぞれの参照配列の全長にわたりそれぞれの配列間で最大のマッチを与えるように選択されるＢＬＡＳＴアルゴリズムによって比較が行われるとき、参照Ｇｌｕｔ１アミノ酸配列のいずれかと少なくとも約７０％類似する、好ましくは少なくとも約８０％類似する、より好ましくは少なくとも約９０％類似する、および最も好ましくは少なくとも約９５％類似（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明のコンストラクトおよび方法にも含まれている。

配列相同性とは、２つの配列が至適に整列しているとき、２つのポリペプチドのアミノ酸が同等の位置で同じである程度を指す。配列類似性とは、同一の残基および同一でない生化学的に関連したアミノ酸を含む。類似の特性を共有し、相互に交換できる生化学的に関連したアミノ酸は上述している。

「相同性」とは、至適に整列しているときの、２つのポリヌクレオチド配列間、または２つのポリペプチド配列間の配列類似性を指す。２つの比較される配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されとき、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンによって占有される場合、これらの分子はその位置で相同である。相同性のパーセントは、２つの配列によって共有される相同位置の数を比較される位置の総数で割り、１００を掛ける。例えば、配列を至適に整列させるとき、２つの配列内の１０位置のうち６がマッチする、または相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般に、２つの配列が最大パーセント相同性を与えるように整列されて、比較が行われる。

以下の参考文献は、配列分析でしばしば用いられるＢＬＡＳＴルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．，ら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．，ら，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ， Ｊ．，ら，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９−６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．，ら，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９−１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ， Ｊ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７−７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ら， “Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．” ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編）， ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．”ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．”Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３−３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，ら，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６−７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ．，ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ら，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ． ３６：２９０−３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ， Ｓ．，ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．，ら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．，ら，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２−２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ．”ｉｎ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ． Ｓｕｈａｉ，編），（１９９７）ｐｐ．１−１４，Ｐｌｅｎｕｍ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。

本発明は、種々の核酸を含む発現ベクターも提供する。該核酸は、宿主細胞がこのベクターでトランスフェクトされると、宿主細胞によって認識される制御配列に作用可能に結合される。また、組換え型ＡＡＶ９配列および特定のＡＡＶ２配列、ならびにニワトリ−β−アクチンプロモーターとＣＭＶエンハンサーの指示の下でＧｌｕｔ−１を発現させるための核酸配列を含むビリオンが提供される。これらのコンストラクト内で、ｒＡＡＶ２配列は、５’および３’ＩＴＲ配列、例えば、表１に記載の配列番号２、９、２９、３４、３６、４１およびその他に対応する。これらの配列は、本発明においてＧｌｕｔ−１欠損症に対して治療効果のあるビリオンを形成するためにＡＡＶ９カプシドでパッケージングした。

医薬組成物および投与
本発明の組成物の医薬組成物または無菌組成物を調製するために、ＡＡＶ９ベクターまたは関連する組成物は薬学的に許容される担体または賦形剤と混合されることができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。

治療薬および診断薬の製剤は、例えば凍結乾燥粉末剤、スラリー剤、水性液剤または懸濁剤の形態での許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって調製されることができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓ，ら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｗｅｉｎｅｒ ａｎｄ Ｋｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００） Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。

単独でまたは別の薬剤と組み合わせて投与される治療用組成物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ_５０（集団の５０％に治療効果のある用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準薬学的手順によって決定することができる。有毒作用と治療効果間の用量比は、治療係数（ＬＤ_５０／ＥＤ_５０）である。特定の態様において、高治療係数を示す治療用組成物が望ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための投与量の範囲を定める際に用いることができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどもしくはまったくないＥＤ_５０を含む血中濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形および投与経路によってこの範囲内で変化し得る。

本発明の一実施形態において、本発明の組成物は、米医薬品便覧Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ； 第５７版（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １， ２００２）に従って、対象に投与される。

投与の方法は、変化し得る。適切な投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸管内、非経口、筋肉内、皮下、皮内、骨髄内、くも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、ガス注入、局所的、皮膚に、経皮的、または動脈内の投与が挙げられる。

特定の実施形態において、組成物または治療薬は、注射によるなどの侵襲経路によって投与されることができる（上記を参照されたい）。本発明のさらなる実施形態において、組成物、治療薬またはその医薬組成物は、静脈内に、皮下に、筋内に、動脈内に、関節内に（例えば関節炎の関節に）、腫瘍内に、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。
非侵襲性経路による投与（例えば経口で；例えば丸薬、カプセル剤もしくは錠剤で）も、本発明の範囲内である。

組成物は、当技術分野で既知の医用デバイスによって投与されることができる。例えば、本発明の医薬組成物は、予備充填されたシリンジまたはオートインジュエクターを含む皮下注射針を用いる注射によって投与されることができる。

本発明の医薬組成物は、米国特許第６，６２０，１３５号、第６，０９６，００２号、第５，３９９，１６３号、第５，３８３，８５１号、第５，３１２，３３５号、第５，０６４，４１３号、第４，９４１，８８０号、第４，７９０，８２４号または第４，５９６，５５６号に開示されているデバイスなどの無針皮下注射デバイスによって投与されることもできる。

あるいは、ＡＡＶ９ベクターまたは関連する化合物は全身的よりむしろ局所的に、例えば、デポー製剤または徐放性製剤であることが多いが、所望の標的部位に直接注射によって投与されてもよい。さらに、組成物は、標的化薬物送達システムで、例えば組織特異的抗体でコートされたリポソームで、例えば脳を標的にして投与されてもよい。リポソームは、所望の組織を標的にし、選択的にそれに取り込まれる。

投与計画は、いくつかの要因、例えば、治療用組成物の血清または組織代謝回転速度、症状のレベル、および生体マトリックス中の標的細胞の接近可能性に依存する。好ましくは、投与計画は、標的疾患において改善をもたらすように十分な治療用組成物を送達しながら、同時に望ましくない副作用を最小限に抑える。したがって、送達される生物製剤の量は、特定の治療用組成物と処置される状態の重症度に一部依存する。

適切な用量の決定は、臨床医によって、例えば、当技術分野で処置に影響を及ぼすことが知られている、または疑われるパラメータまたは因子を用いて、行われる。一般に、用量は適量よりいくらか少ない量から開始され、その後、好ましくない副作用と比較して所望の効果または最適な効果が達成されるまで、すこしずつ増加される。重要な診断評価基準としては、例えば炎症の症状または産生される炎症性サイトカインのレベルが挙げられる。一般に、使用される生物製剤は、処置のために標的化される動物と同じ種に由来し、それによって試薬に対する免疫応答を最小限に抑えることが望ましい。

本明細書で用いる場合、「阻害する」もしくは「処置する」もしくは「処置」とは、障害に関連する症状の発症の先送りおよび／またはそのような障害の症状の重症度の低下を含む。これらの用語は、既存の抑えられない症状または好ましくない症状を改善すること、さらなる症状を防止すること、およびそのような症状の根本的な原因を改善または防止することをさらに含む。このように、これらの用語は、障害、疾患もしくは症状を有する、またはそのような障害、疾患もしくは症状を発症する可能性を有する脊椎動物の対象に有益な結果がもたらされたことを意味する。

本明細書で用いる場合、「治療有効量」、「治療有効用量」および「有効量」という用語は、本発明のｒＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１ベースの化合物の一定量が単独で、またはさらなる治療薬と組み合わせて細胞、組織または対象に投与されるとき、疾患もしくは状態の１つまたは複数の症状において、またはそのような疾患もしくは状態の進行において測定可能な改善をもたらすのに効果的であることを指す。治療有効用量は、さらに、症状、例えば、関連する病状の処置、治癒、予防もしくは改善の少なくとも部分的寛解、またはそのような病状の処置、治癒、予防もしくは改善の割合の増加をもたらすのに十分な化合物のその量を指す。単独で投与される個々の活性成分に適用されるとき、治療有効量用はその成分だけを指す。組み合わせに適用されるとき、治療有効用量は、組み合わせで連続的にまたは同時に投与されるかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の合計量を指す。治療的有効量は、診断基準またはパラメータの少なくとも１０％、通常少なくとも２０％。好ましくは少なくとも約３０％。より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは少なくとも５０％の改善をもたらす。有効量は、主観的評価基準を用いて、疾患の重症度を評価する場合には、主観的評価基準における改善をもたらすこともできる。

キット
本発明は、キット形態で本発明の成分の組み合わせを含むキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記述のｒＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１ベースの化合物を含むがこれに限定されない１種または複数種の成分と、関連して、本明細書に記述の薬学的に許容される担体および／または化学療法薬を含むがこれに限定されない、１種または複数種の追加の成分とを含む。ｒＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１ベースの化合物もしくは組成物および／または治療薬は純粋な組成物として、または医薬組成物中で薬学的に許容される担体との組み合わせで製剤化されことができる。

一実施形態において、キットは、１つの容器に（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル中に）本発明のｒＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１ベースの化合物／組成物またはその医薬組成物、ならびに別の容器に（例えば、無菌ガラスまたはプラスチックバイアル中に）にその医薬組成物および／または化学療法薬を含む。

本発明の別の実施形態において、キットは、例えばｒＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１ベースの化合物、それに加えて薬学的に許容される担体、任意選択で、一緒に製剤化された１種または複数種の化学療法薬成分の組み合わせを含む本発明の組み合わせを、任意選択で、単一の一般的な容器中の医薬組成物に含む。

キットが対象への非経口投与用の医薬組成物を含む場合、キットはそのような投与を行うためのデバイスを含むことができる。例えば、キットは上述の１種または複数種の皮下注射針または他の注射デバイスを含むことができる。

キットは、キットに含まれる医薬組成物および剤形に関する情報を包含する添付文書を含むことができる。一般に、そのような情報は、患者および医師が同封された医薬組成物および剤形を効果的かつ安全に使用する際の助けとなる。例えば、本発明の組み合わせに関する以下の情報は、添付文書で供給されてもよい：薬物動態、薬力学、臨床試験、有効性評価基準、適応症と用法、禁忌、警告、注意事項、有害反応、過量、適切な用法・用量、供給方法、適切な保管条件、参考文献、製造業者／ディストリビュータ情報および特許情報。

一般的方法
分子生物学での標準方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈとＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２ ＆ １９８９ 第２版，２００１ 第３版 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｗｕ（１９９３）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，Ｖｏｌ．２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に記載されている。また標準方法は、Ａｕｓｂｅｌ，ら，（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１−４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに、細菌細胞でのクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（第１巻）、哺乳動物細胞と酵母でのクローニング（第２巻）、複合糖質とタンパク質発現（第３巻）およびバイオインフォマティクス（第４巻）に記載されている。

免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離および結晶化を含むタンパク質精製のための方法は、（Ｃｏｌｉｇａｎ，ら，（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ． １，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化は、（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ら，（２０００）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ，ら，（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ，ｐｐ．１６．０．５−１６．２２．１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃｏ．（２００１）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；ｐｐ．４５−８９；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ｐｐ．３８４−３９１を参照されたい）に記載されている。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生成、精製および断片化は（Ｃｏｌｉｇａｎ，ら，（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，上記参照）に記載されている。リガンド／受容体の相互作用の特性を明らかにする標準手法は、（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ら，（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）を利用できる。

略語
ＡＡＶ：アデノ随伴ウイルス
ｒＡＡＶ：組換え型アデノ随伴ウイルスまたはウイルスベクター
ＢＢＢ：血液脳関門
ＦＭＤＶ：口蹄疫ウイルス
ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質
Ｇｌｕｔ１：促進性グルコーストランスポーターメンバー１（ＳＬＣ２Ａ１）の溶質キャリアファミリー２としても知られているグルコーストランスポーター１は、ヒトにおいてＳＬＣ２Ａ１遺伝子によってコードされるユニポータータンパク質である。Ｇｌｕｔ１は哺乳動物細胞の細胞膜を横切ってグルコースの輸送を促進する。Ｇｌｕｔ１は特性を明らかにされた最初のグルコーストランスポーターであった。Ｇｌｕｔ１は、ヒトＧｌｕｔ１タンパク質（ｈＧｌｕｔ１）（受入番号：ＮＰ＿００６５０７．２；配列番号７９）およびマウスＧｌｕｔ１タンパク質（ｍＧｌｕｔ１）（受入番号：ＮＰ＿０３５５３０．２；配列番号７８）で高度に保護されており、９８％の相同性を共有する。Ｇｌｕｔ１は他のＧｌｕｔと４０％の相同性を示す。
ＳＬＣ２Ａ１：ヒトグルコーストランスポーター（ｈＧｌｕｔ１）をコードする遺伝子。ヒトＳＬＣ２Ａ１（受入番号：ＮＧ＿００８２３２．１；遺伝子ＩＤ−６５１３）。
Ｓｌｃ２ａ１：マウスＧｌｕｔ１（ｍＧｌｕｔ１）をコードする遺伝子。（受入番号：ゲノム＃：ＮＣ＿００００７０．６；遺伝子ＩＤ−２０５２５）。
ＧＬＵＴ１ ＤＳ：Ｇｌｕｔ１欠損症症候群
ＰＮＤ：出生後日数
ＰＮＤ３：出生後３日目

実施例

組換え型ＡＡＶコンストラクトの開発
図１Ａ〜Ｂに示すように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターをコードするヌクレオチドカセットに結合したマウスまたはヒトＳＬＣ２Ａ１遺伝子のいずれかを担持する４つのＤＮＡコンストラクトを生成した。これらの４つのコンストラクトは、Ｇｌｕｔ１とＧＦＰのオープンリーディングフレームの間に組み込まれた口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の１６アミノ酸長の２Ａペプチドをコードする核酸配列も含む。２Ａペプチドは、Ｇｌｕｔ１−ＧＦＰ融合タンパク質がＧｌｕｔ１タンパク質の構造または活性を変えうる可能性を回避するためにコンストラクト内に含まれる。２Ａペプチドは、続いて起こるプロセシング現象においてＦＭＤＶポリタンパク質の一次シス「切断」を媒介し、最終的に成熟ＦＭＤＶタンパク質を生成する（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｍ．Ｌ．ら，（２００１））。この戦略ではＧｌｕｔ１タンパク質がその天然状態で生成されるコンストラクトを作製することが予想された。しかし、以下に記述するように、これらのコンストラクトのどれも満足のゆくレベルでＧｌｕｔ１を発現しなかった。

追加の６つのＤＮＡコンストラクトも２Ａペプチドをコードする核酸なしで開発し（図１Ｃ〜Ｄ）、そのうちのいくつかはＳＬＣ２Ａ１遺伝子の発現が肝臓内で選択的に遮断されることを定める配列を含む（図１Ｄ）。将来の遺伝子治療の実験においてＳＬＣ２Ａ１遺伝子を全身的に増やすことによって、肝臓で発現されるタンパク質の濃度を高め、それによりグリコーゲン生成のプロセスを高め、したがって低血糖状態を誘発することができる可能性に取り組むために、これらのコンストラクトを開発した。最終的に、天然マウスまたはヒトＳＬＣ２Ａ１遺伝子だけを含有するコンストラクトも対照目的で生成した（図１Ｃ）。検証実験では、ｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｈＧｌｕｔ１、ｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｈＧｌｕｔ１ ｏｕｔ３ｘｍｉＲ１２２ＢＳ、およびｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｈＧｌｕｔ１ ｉｎ３ｘｍｉＲ１２２ＢＳを利用することになる。これらのコンストラクトの配列と重要な特徴は表１と、配列番号１〜９７に示す対応する配列とに収載する。

ＣＨＯ細胞にトランスフェクトされたｒＡＡＶプラスミドの初期発現の解析
２つの細胞株を用いて、細胞培養中で種々の組換え型プラスミドを評価した。１つの細胞株は チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株であり、他の細胞系はＧｌｕｔ１患者由来の線維芽細胞株である（Ｙａｎｇら，２０１１）。細胞培養実験およびそれに続くウエスタンブロットは、２Ａペプチドを含有するプラスミドコンストラクトが満足のいく濃度のＧｌｕｔ１またはＧＦＰを発現しなかったことを示した。予想外ではあるが、ＳＬＣ２Ａ１／ｓｌｃ２Ａ１遺伝子と関連して、２Ａペプチドはタンパク質の発現に悪影響を及ぼす可能性がある。対照的に、マウスまたはヒトＳＬＣ２Ａ１遺伝子だけを含有する対照コンストラクトは確固たる濃度のタンパク質を発現することが判明した。Ｇｌｕｔ１コンストラクトを含有する２Ａ（図１Ａ〜Ｂ）のいずれも変異体モデル系においてＧｌｕｔ１発現を回復させることについてさらに追跡しなかった。

最初の４つのコンストラクト（図１Ａ〜Ｂ）中に２Ａペプチドが存在することによってもたらされる発現の難しさを回避するために、ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰ融合タンパク質（ｐｈＧｌｕｔ１：：ｅＧＦＰと呼ばれる）を試験した。細胞培養実験は、この融合タンパク質がグルコース取り込みアッセイにおいて発現されるばかりでなく、機能的でもあることを示した。マウスｓｌｃ２ａ１遺伝子またはヒトＳＬＣ２Ａ１遺伝子だけを含有するコンストラクトとともにこのコンストラクト（ｐｈＧｌｕｔ１：：ｅＧＦＰ）は、Ｇｌｕｔ１モデルマウスの遺伝子治療を含むｉｎ ｖｉｖｏ実験での使用が考えられる。

ＡＡＶ９プラスミドクローニングとその後のウイルスベクターパッケージング
ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰ融合タンパク質のコンストラクト（ｐｈＧｌｕｔ１：：ｅＧＦＰ）をＡＡＶ９プラスミドに再クローン化し、続いてウイルスベクターへのパッケージングを行った。再クローン化コンストラクトが継続したタンパク質を発現するかを確認するために、それをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に一時的にトランスフェクトし、タンパク質濃度をウエスタンブロット解析によって調べた（図２Ａ）。ＣＨＯ細胞でのタンパク質発現の分析は、ｃＤＮＡをコードするｈＧｌｕｔ１だけまたは異なるプロモーター配列によって駆動されるｈＧｌｕｔ−ｅＧＦＯ融合をコードするｈＧｌｕｔ１だけを発現するコンストラクトと比較して、ＡＡＶ９−ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰプラスミドが低濃度のＧｌｕｔ１を発現した（図２Ａ）ことを示した。しかし、改変（ＡＡＶ９−ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰ）融合コンストラクトは効果的かつ満足のいく量でＧｌｕｔ１タンパク質を発現し続けた。さらに融合タンパク質は、Ｇｌｕｔ１ ｃＤＮＡの３’末端でのＧＦＰタグのため予想通りに、天然ｇＧｌｕｔ１タンパク質よりもかなり大きいように見えた（図２Ａ）。これらの結果は、ｈＧｌｕｔ−ｅＧＦＰタンパク質がＣＨＯ細胞へのグルコースの取り込みを増加させることが判明したグルコース取り込みアッセイと一致する（図２Ｂ）。図２Ｃは、ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後のこのコンストラクトのＧＦＰ蛍光を示す。並行して、ヒトＳＬＣ２Ａ１遺伝子とマウスｓｌｃ２ａ１遺伝子もＡＡＶ９プラスミドにクローニングし、患者の線維芽細胞へのトランスフェクション時に、Ｇｌｕｔ１発現を引き起こし、グルコース取り込みを増加させることが判明した。したがって、各々をＡＡＶ９カプシドにパッケージングし、約１０^１３ゲノムコピーをＧｌｕｔ１ ＤＳモデルマウスへの投与のために調製した（米国特許第８，７３４，８０９号に記載の方法、およびＧｒｉｅｇｅｒとＳａｍｕｌｓｋｉ ２００５およびＧｒｉｅｇｅｒとＳａｍｕｌｓｋｉ ２０１２に従った）。

パッケージング条件／分布
ＡＡＶ９ベクターにパッケージングされたコンストラクトを発現するＧｌｕｔ１の投与の条件を最適化するために、野生型マウスにおけるＡＶ９−ＧＦＰ（Ｆｏｕｓｔ，Ｋ．Ｄ．ら，２００９）ベクターの分布を分析した（Ｇａｏ，Ｇ．Ｐ．，とＳｅｎａ−Ｅｓｔｅｖｅｓ，Ｍ．（２０１２），Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ ２：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｍ．Ｒ．ＧｒｅｅｎとＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ編）に記載の方法に従った）。

ＡＡＶ９−ＧＦＰコンストラクトの分布を野生型成体または新生児マウス内の種々の組織で評価した。ＡＡＶ９−ＧＦＰを注射されたマウスの試験組織中に明るい緑色蛍光が認められたが、ＰＢＳ対照を注射されたマウスには認められなかった。基本的に、ベクターの約４×１０^１２ゲノムコピーを約４０μＬの量でマウスの眼窩後洞と側頭静脈から全身投与した。これらの実験の結果は、ＡＡＶ９ウイルスが多様な神経組織と非神経組織内に分布することを示す。特に、骨格筋、心臓および肝臓を高濃度で標的にすることが判明した。しかし、かなりのＧＦＰ蛍光が脳細胞内、例えば脳微小血管系の内側を覆うＧｌｕｔ１陽性内皮細胞にも見られた。重要なことに、これらの細胞はＧｌｕｔ１ ＤＳの標的治療の推定部位である。

対照ＡＡＶ９−ｍＧｌｕｔ１コンストラクト
表２−ｍＧｌｕｔ１＝ｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１（配列番号３５〜４１）

ｍＧｌｕｔ１タンパク質の所望量を発現したコンストラクトの１つをＡＡＶ９ウイルスベクターにパッケージングした。たとえこのコンストラクトには標識タグ（例えばＧＦＰ）がないとしても、モデルマウスにおいてこのコンストラクトからのＧｌｕｔ１発現は、ウエスタンブロット解析と免疫組織化学実験による総ｍＧｌｕｔ１タンパク質を評価することによって追跡することが可能である。

コンストラクトｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１（配列番号３５）を生後（ＰＮＤ）２日目の変異Ｇｌｕｔ１マウスの仔に眼窩後洞から導入した。このコンストラクトを注射したマウスは、ＡＡＶ９−ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰ注射変異体のための対照として用いた（配列番号８０。配列番号８１〜８７の特徴を参照されたい）。９匹の変異マウスにＡＡＶ９−ｍＧｌｕｔ１コンストラクトｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１を注射した（表２）。新たな対象として、７匹の変異マウスにビヒクル（ＰＢＳ）のみを注射した。これらのマウスは疾患表現型の機能改善について検査をする。これは、ＰＥＴ走査によって脳組織内のグルコース取り込みのレベルを判定し、標準手法によるロータロッドテストまたはポールテストでの運動パフォーマンスを測定することによって行われる（Ｋａｒｉｙａら，２０１２を参照されたい）。

Ｇｌｕｔ１ＤＳモデルマウスによる遺伝子置換実験で用いたコンストラクトの１つは、ＡＡＶ９−ｈＧｌｕｔ１−ｅＧＦＰコンストラクトである（配列番号８０）。このコンストラクトから産生したタグ標識Ｇｌｕｔ１タンパク質は、追跡される種々の器官系、例えば実験マウスの脳のＧｌｕｔ１発現内皮細胞において、タンパク質の分布を可能する。これにより、マウス脳内のｍＧｌｕｔ１を検出するための条件を最適化することが可能になる。脳内でのｍＧｌｕｔ１タンパク質の強力な発現は、特異的抗体を用いることで検出可能になる。

歩行機能障害をレスキューすることによって例証されるように、Ｇｌｕｔ１ ＤＳ変異マウスにＧｌｕｔ１を回復させることにより疾患表現型をレスキューする
複数の細胞型を感染させる組換え型アデノ随伴ウイルス９（ｒＡＡＶ９）の能力を機能として用いて、ヒト疾患のマウスモデルにマウスＳｌｃ２ａ１遺伝子を再導入した。一野生型Ｓｌｃ２ａ１対立遺伝子が存在しない場合、Ｇｌｕｔ１ ＤＳマウスはロータロッドアッセイにおいてパフォーマンスが不十分であり、評価項目はヒト患者で観察される運動行動障害、すなわち運動表現型をモデル化すると思われた。生後３日目の変異マウスに、コンストラクトｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１（配列番号３５）によってもたらされた約４×１０^１１ゲノムコピー、またはビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかを注射した。一元配置分散分析を用いてＰ値を算出した。生後３日目に変異マウスにｓＬＣ２Ａ１遺伝子を回復させることによって、早くも６週齢で、ロータロッド（標準条件下で行った。Ｗａｎｇら，２００６を参照されたい）でのパフォーマンスに著しい改善が見られた（図３Ａ）。パフォーマンスの改善は、実験を終了した２０週齢まで持続した。

ロータロッドアッセイでのパフォーマンスの改善（図３Ａ）に加えて、処置したマウスは、ビヒクルで処置したそのカウンターパート（図３Ｂ）よりも高い敏捷さでポールテストもやり遂げる。６週齢と１２週齢の間でコホートを検査したとき、処置した変異マウスは、他の同腹仔の野生型対照とは見分けがつかない動きであった。これらの結果は、Ｇｌｕｔ１ ＤＳマウスにＧｌｕｔ１を回復させることでヒト疾患の特徴的な運動表現型を緩和する強力なエビデンスを提供し、変異モデルマウスにＳｌｃ２ａｌ遺伝子を回復させることは治療的価値を意味することを示している。

Ｇｌｕｔ１ ＤＳ変異マウスにＧｌｕｔ１を回復させると複数の組織内の遺伝子発現が改善する
ＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１処置動物のパフォーマンス改善の分子基盤を調査するために、動物の脳組織と肝組織内でのマウスＳｌｃ２ａ１遺伝子の発現を評価した。ｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１（配列番号３５）で処置した変異動物では脳組織と肝組織内で高レベルのＳｌｃ２ａ１遺伝子がひしめいていた（図４Ａ〜Ｂ）。処置マウスおよび対照マウスから脳組織と肝組織を抽出した。ＲＮＡを調製し、次いで逆転写し、Ｑ−ＰＣＲアッセイでＳｌｃ２ａｌ転写物の増幅を行った。β−アクチンを用いてＳｌｃ２ａ１遺伝子発現を正規化した。図４Ａは、処置変異マウスおよび関連する対照マウスにおける相対的なＳｌｅ２ａ１遺伝子発現を示す。図４Ｂは野生型Ｇｌｕｔ１^＋／−マウスにおける発現のパーセントとしてＳｌｃ２ａ１発現を示す。イントロン１にわたるプライマーを用いて、処置変異マウス（Ｇｌｕｔ１^＋／−）と関連対照マウス（Ｇｌｕｔ１^＋／＋およびＰＢＳ処置Ｇｌｕｔ１^＋／−変異マウス）において定量的ＰＣＲによって、転写物をコードするＧｌｕｔ１を増幅させた。マウスを安楽死させて、ＰＢＳを用いる経心腔的潅流に続いて組織を抽出した。メーカーの説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓｙキットを用いてＲＮＡを調製した（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）。標準手順に従ってＲＮＡを逆転写し、以下のプライマーを用いて逆転写物をコードするＧｌｕｔ１を増幅した：Ｇｌｕｔ１ＱＰＣＲ Ｆ１：５’ＣＴＴ ＧＣＴ ＴＧＴ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＣＧ ＡＴＣ ３’（配列番号７６）およびＧｌｕｔ１ＱＰＣＲ Ｒ１：５’ＣＡＧ ＴＧＡ ＴＣＣ ＧＡＧ ＣＡＣ ＴＧＣ ＴＣ ３’（配列番号７７）。予想された２１２ｂｐバンドをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｒｅａｌｐｌｅｘ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内で定量化した。

予想外に、処置した変異マウス肝臓内での遺伝子発現はＧｌｕｔ１^＋／＋対照の同じ組織内でのレベルを超え、ＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１ウイルスが肝臓に対して特定の親和性があるという以前の報告と一致した（Ｆｏｕｓｔら，２０１０）。ウイルスを投与した野生型マウスの小コホートにおいて、これは、低血糖症状をもたらし、この組織内でＳｌｃ２ａ１の発現が上昇し、したがって血液からグルコースが除去された結果生じた可能性がある。したがって、Ｓｌｃ２ａ１発現の抑制は、ｍｉＲＮＡ−１２２結合部位を含むコンストラクトを用いて検討される（図１Ｄに示し、配列番号４２〜７５に包含される）。ｍｉＲＮＡ−１２２は肝臓で特異的に発現し、その転写物にｍｉＲＮＡ−１２２が結合する遺伝子の発現を抑制する（Ｘｉｅら，２０１１）。本知見の生理学的結果は、さらなる調査の主題となろう。

ＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１で処置した変異マウスにおけるＧｌｕｔ１脳タンパク質およびＣＳＦグルコースの改善；Ｇｌｕｔ１回復によるＧｌｕｔ１ ＤＳモデルマウスにおける髄液糖減少症の緩和
Ｇｌｕｔ１ ＤＳを決定付ける特徴は髄液糖減少症（脳脊髄液グルコースの低下）である。Ｇｌｕｔ１ ＤＳモデルマウスはこの表現型を示す。モデルマウスへのＧｌｕｔ１の回復により髄液糖減少症が改善したかまたは緩和したかを判定するために、動物から血液および脳脊髄液（ＣＳＦ）を抽出してグルコース濃度を測定した。すべてのマウスを一晩断食させて、測定を行った。基本的には前述（Ｗａｎｇら，２００６；Ｆｌｅｍｉｎｇら，１９８３）のようにＣＳＦを大槽から分離した。手短に言うと、頭蓋上部から背側胸郭まで切開を施し、頭蓋底部から第１頸椎までの筋組織を除去して大槽を覆う髄膜を露出させた。半透明の髄膜に穴をあけないように注意して大槽の上の組織を切除した。周辺部位の残留血液／間質液を洗浄してから、３０Ｇ針に取り付けたマイクロピペットを用いて、大槽を覆うクモ膜を穿刺して、ＣＳＦを５〜１５μＬ抽出した。この全手順は５分内に完了し、ＣＳＦグルコースをＡｓｃｅｎｓｉａ Ｅｌｉｔｅ ＸＬグルコースメーター（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐ．）で測定した。血糖値を同じように判定してから、尾を切開して約１０μＬの血液を抽出することによってＣＳＦの抽出を行った。各マウスの血糖濃度と脳脊髄液糖濃度のそれぞれの測定値を評価した。平均値を報告する。

ＣＳＦグルコース値と病期に関して、代表的な範囲は以下の通りである：９０％を超えるＧｌｕｔ１患者のＣＳＦグルコース値は、＜４０ｍｇ／ｄＬ（２．２ｍＭ）であり、残りの患者は４１〜５２ｍｇ／ｄＬの範囲に入る。このように、ＣＳＦグルコース濃度の正常な範囲は≧約５３ｍｇ／ｄＬである。Ｇｌｕｔ１ ＤＳモデルマウスの場合、一般的なＣＳＦグルコース濃度は約２３．３±７．１７ｍｇ／ｄＬ（＜２５．０±８．００ｍｇ／ｄＬの範囲内）であるが、野生型マウスの場合、その濃度は約７４．６±１４．１ｍｇ／ｄＬ（≧約７０．０±１５．０ｍｇ／ｄＬの範囲内）である。

さらに、ＲＢＣグルコース取り込み機能アッセイは、Ｇｌｕｔ１ハプロ不全の代替として用いられることが多い。このアッセイでは、Ｇｌｕｔ１ ＤＳを示す患者サンプルは、約５０％の取り込みに密集し、３６〜７３％の範囲である。≧７５％活性は正常範囲と一致すると推定される。＜２５％は重症であり、０％で胚性致死に近づいていることが注目される。

Ｇｌｕｔ１ ＤＳ変異マウスにコンストラクトｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１（配列番号３５）をトランスフェクトすることによってｓｌｃ２ａ１遺伝子を回復させると、Ｇｌｕｔ１の発現が上昇する（図５Ａ）。さらに、処置したＧｌｕｔ１ ＤＳ変異マウスは、脳組織内で高レベルのＧｌｕｔ１タンパク質を発現する（図５Ｂ）。図５Ｃでは、処置した変異マウスにおいてＣＳＦグルコース濃度は、無処置変異マウスのそれよりも有意に高かったが、野生型対照で観察された濃度には達しなかった。ｓｌｃ２ａ１が回復した変異マウスはＣＳＦ血糖濃度の上昇を示した（図５Ｄ）。サンプルサイズは、無処置変異マウスはｎ＝８、処置変異マウスはｎ＝９である。さらに野生型コホートはｎ＝１８である。これらのデータは、Ｇｌｕｔ１ ＤＳ変異マウスにＧｌｕｔ１を回復させることで、ＣＳＦグルコース濃度が上昇し、髄液糖減少症に冒された動物が緩和される。まとめると、これらの結果は、Ｇｌｕｔ１欠損対象においてＧｌｕｔ１を回復させることによる治療効果を明白に示している。これらの実験からの予備段階の結果は、これらの症状がある成体マウスにＧｌｕｔ１を回復させると、疾患表現型をレスキューできないことを示しており、マウスにおいて、おそらくヒトにおいても治療好機が限定されていることの根拠を示している。

症状があるマウスへのＧｌｕｔ１の回復−Ｇｌｕｔ１投与のタイミング
Ｇｌｕｔ１ ＤＳマウスにおいて疾患経過の初期にＧｌｕｔ１発現をモデルマウスに回復させる（生後３日でのＡＡＶ９−ｍＧｌｕｔ１コンストラクトの注射を例とした）ことは、明白に治療価値がある。症状があるマウスにおいてＧｌｕｔ１回復の時間枠を判定するために、８週齢の変異マウスにｐＡＡＶ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１コンストラクト（配列番号３５）を注射することを含む実験を開始した。Ｇｌｕｔ１ ＤＳマウスはこの時点で明らかに症状があり、ロータロッドで同腹仔の野生型対照よりは動きがよくなかった。したがって、Ｇｌｕｔ１ ＤＳのコホートにビヒクルまたはＡＡＶ９−ｍＧｌｕｔ１の１×１０^１２ゲノムコピーのいずれかを全身的に注射した。すべてのマウスはこの手法に耐え、成体齧歯動物においてウイルス注射が安全であることを示した。上述のものに類似する分子、細胞および行動のアッセイを評価して、Ｇｌｕｔ１欠損症の症状を処置／軽減することを可能にする時間枠ならびに疾患表現型の経過を逆転させるための何らかの期限を決定する。

Ｇｌｕｔ１ ＤＳモデルにおける治療好機の改善
新生（生後３日目）Ｇｌｕｔ１ ＤＳマウスにおいてＡＡＶ９媒介のＧｌｕｔ１（マウス）タンパク質の充足によりＧｌｕｔ１発現が上昇し、この疾患で特徴的に認められる髄液糖減少症を緩和し、脳の大きさを回復させ、および運動機能を著しく改善することを本データは示している。対照的に、８週齢でのＧｌｕｔ１の充足は疾患表現型をレスキューできなかった。Ｇｌｕｔ１ ＤＳモデルマウスにおいて治療好機は限定されており、ヒトの病態にも反映する可能性があることが判明したことをこれらの結果は示唆している。早くも２週齢で変異マウスにおいてＣＳＦグルコース濃度が有意に低下していることを予備段階データも示している（変異群：２３．２５±３．７７ｍｇ／ｄＬ、対照群：５３．３３±５．２０ｍｇ／ｄＬ、Ｐ＜０．０１、ｔ検定）。依然として、明白な表現型が識別できる前に、この時点でＧｌｕｔ１を回復させることで治療効果がもたらされるかどうかは不明瞭である。

疾患のこの初期段階でのＧｌｕｔ１回復の結果を判定するために（幼児期にＧｌｕｉｔ１欠損症に起因する疾患の影響を受けてきたにもかかわらず、小児期に診断された患者を処置することに似ている）、変異マウスにｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１ベクター（配列番号３５）を形質導入させる。手短にいうと、約５０μＬ量のビヒクルで治療用ベクター約１０^１２ゲノムコピーを２週齢マウスの側頭静脈に注射する。マウスにおいてこの「若年期」段階での機能タンパク質の回復の結果を判定するために、続いて、総括的な一連の分子アッセイ（ウエスタンブロット解析、Ｑ−ＰＣＲアッセイ、ＣＳＦ濃度と血糖値）、画像診断アッセイ（ＰＥＴ走査）、および行動アッセイ（ロータロッド分析、ポールテスト）を用いて動物を評価する。これらの実験は、Ｇｌｕｔ１ ＤＳに関して一方では新生仔（生後３日目）での処置、他方では成体モデル（８週齢）での処置の後、得られた結果を補足し、およびその治療好機を改善する。

Ｇｌｕｔ１ ＤＳモデルマウスにおいてケトン誘発食による早期処置と、Ｇｌｕｔ１タンパク質の充足による後期処置との複合効果の評価
成体マウス（８週齢）へのＧｌｕｔ１回復はＧｌｕｔ１ ＤＳ表現型を緩和しなかったことは明白であるが、これらのマウスを高脂肪食で前処置することで、良好な結果がもたらされうる可能性がある。そのような食事療法でのマウスは年長のＧｌｕｔ１ ＤＳ患者のコホートをより正確に表す。該患者は、理想的な治療好機を逃したかもしれないが、それでもケトン誘発食は保護効果が早いため、Ｇｌｕｔ１タンパク質の遅い回復からの恩恵を受けうる。そのような食事療法は、ケトン体、すなわちモノカルボン酸トランスポーターを介して血液脳関門を横切るエネルギー源の不完全ではあるが代替物を脳に供給する。したがって、２週齢のマウスでの実験に加えて、本発明者らは、７Ｃトリグリセリドトリヘプタノインを投与された（生後７日目に開始）成体（６〜８週齢）変異マウスへのＧｌｕｔ１回復の効果を試験する。現在、Ｇｌｕｔ１ ＤＳに関する臨床試験中であるトリヘプタノインは、ＴＣＡ回路のためにアセチル補酵素Ａに代謝されるだけでなく、栄養素は最終的に細胞のエネルギー必要量を供給するために分解されるので、同回路に不可欠なアナプレロティック基質を提供するとも考えられている。手短に言えば、この実験は、変異マウスにＡＡＶ９−Ｇｌｕｔ１（ｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１）コンストラクトが投与されるまで、トリヘプタノイン（８２ｍｇ／ｇ）を用いて、またはトリヘプタノインを用いずに同マウスを処置することを含む。次いで、現在、利用可能な（ケント誘発食）処置を受けている年長患者においてＧｌｕｔ１発現の回復の治療結果を予測する方法として異なるコホートのマウスを上述のように、評価する。

臨床試験のためのＧｌｕｔ１コンストラクトの最適化
Ｇｌｕｔ１ ＤＳマウスにおいてｓｌｃ２ａ１発現の有害作用は現在まで観察されてないが、コンストラクトｐＡＡＶ９ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１ベクター（配列番号３５）を投与された野生型の小サンプルについての予備検査はＣＳＦ濃度および血糖値の低下を示した。この予想外の結果は、ＡＡＶ９の好ましい標的器官の肝臓でのｓｌｃ２ａ１発現の上昇、したがって、この組織へのグルコーストランスポートの改善に起因する可能性がある。最終結果は、低血糖状態に反映される循環グルコースの低下である。そのような結果を予想して、ＡＡＶ９が特に高い親和性を有する器官の肝臓において高濃度でそれが発現することを妨げるようにｈＧｌｕｔ１コンストラクト（ｐＡＡＶ ＣＢ６ ＰＩ ｈＧｌｕｔ１）を改変する（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉら，２００８；Ｐａｃａｋら，２００６）。そのためには、ｍｉＲＮＡ−ｍｉＲ−１２２（特に肝細胞で発現する）の結合部位（ＢＳ）をコンストラクトに導入する。この戦略は以前には順調に実行されており（Ｘｉｅら，２０１１を参照されたい）、標的ｍＲＮＡのｍｉ−ＲＮＡ媒介エンドヌクレアーゼ的切断を活用し、このように転写物の発現を対象組織に制限する。図１Ｄおよび表１に示すそのようなコンストラクト（ｐＡＡＶ ＣＢ６ ＰＩ ｈＧｌｕｔ１−ｉｎ３ｘｍｉＲ−１２２ ＢＳ、ｐＡＡＶ ＣＢ６ ＰＩ ｈＧｌｕｔ１−ｏｕｔ３ｘｍｉＲ−１２２ ＢＳ、ｐＡＡＶ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１−ｉｎ３ｘｍｉＲ−１２２，ｐＡＡＶ ＣＢ６ ＰＩ ｍＧｌｕｔ１−ｏｕｔ３ｘｍｉＲ−１２２）を最初（無改変）のＧｌｕｔ１発現ベクターと平行してマウスのサブセットで試験し、Ｇｌｕｔ１発現レベルと治療効果を各々調べる。低血糖を引き起こす原型コンストラクトの高い傾向は、その後の実験および試験において新規のＧｌｕｔ１−ｍｉＲＮＡ−ＢＳを用いる利点を示す。

製造プロセスの間、ウイルス力価を減少させる方法としてだけでなく、高濃度ウイルスに関連する安全性への懸念に取り組むために、本明細書に記載の試験コンストラクトの発現を最適化するために、ＳＬＣ２Ａ１およびｓｌｃ２ａ１の遺伝子を、無料公開のソフトウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ＣｏｄｏｎＯｐｔ）を使用して、コドン最適化プロセスを用いて評価する。加えて、必要に応じてコンセンサスＫｏｚａｋ配列をコンストラクトに導入する。このように、表１に記載のいずれのコンストラクトまたは配列もこのような方法でコドン最適化することができる。修飾コンストラクトの各々をマウスにおいて親のコンストラクトと並行して試験する。手短に言うと、コンストラクトを生後３日目の仔マウスに側頭静脈から全身的に投与する。次いで、２週間または３週間後に、これらの動物を安楽死させ、各コンストラクトからのタンパク質濃度をＱ−ＰＣＲとウエスタンブロッティングによって判定する。最も迅速で最も高高度な発現を達成するコンストラクトは、非ヒト霊長類調査および最終的にヒト患者のための臨床試験での最終的使用が考慮される。

非ヒト霊長類調査
大型哺乳動物モデルにおいて本発明者らが選択したコンストラクトの生体内分布、発現および毒性を判定するために、ウイルスベクターをカニクイザルのコホートに投与する。手短に言うと、６匹の動物に各生後１日目、生後９０日目および２歳で、ＡＡＶ９ベクターを５×１０^１３ゲノムコピー／ｋｇの用量で全身的に投与する。コンストラクト（複数可）の急性毒性を判定するために、ベクター投与から１日目、３日目および７日目に動物から採血する。さらに、ベクター注射から２週後、３週後および４週後に採血する。すべての場合において、重要な臨床化学パラメータおよび血液学パラメータを評価する。血清試料中のＡＡＶ９への中和抗体の力価を形質導入ベースの定量的中和抗体アッセイ（Ｒａｐｔｉら，２０１２）によってモニターし、ＰＢＭＣ中の導入遺伝子またはカプシドに特異的なＴ細胞の存在を、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色法およびフローサイトメトリーを用いて、判定する（Ｗａｌｋｅｒら，２００１）。上記の免疫試験を補足するために、４週目に各コホートから動物３匹を安楽死させ、すべての主要な器官系において病理組織学、ベクター生体内分布調査および導入遺伝子発現分析を行う。これらの実験により、ウイルス投与後早い時期を遅い時期と対比して、血清、白血球およびＰＢＭＣにおけるカプシドまたは導入遺伝子に対するＢ細胞とＴ細胞の免疫応答の試験と比較もおこなうことが可能になる。長期安定性試験を行うために、各群の残り３匹の動物については、３ヵ月間にわたり経過観察を行い、上記のように臨床化学試験および血液学試験のために毎月採血する。急性毒性調査において、最終的にこれらの動物は注射から３ヵ月後に安楽死させ、上述のように分析を行う。ヒトＧｌｕｔ１タンパク質はカニクイザルと約９９％の相同性を共有するにもかかわらず、積極的な免疫応答を誘発することが可能である。これを防止するには、ｍｉＲ−１４２−３ｐとｍｉＲ−１５５の２つのｍｉＲＮＡ結合部位を試験コンストラクトに導入する。独立した調査からの予備結果は、これらのｍｉＲＮＡが抗原提示細胞中で発現し、その結果その転写物がｍｉＲＮＡのための結合部位を含むタンパク質の発現を抑制する。まとめると、これらの調査により、ヒト臨床試験において本明細書に記載の試験Ｇｌｕｔ１コンストラクトの最終的使用が容易になる。

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１７．Ｇｏｕｌｄｅｒ ＰＪ， Ａｄｄｏ ＭＭ， Ａｌｔｆｅｌｄ ＭＡ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＥＳ， Ｔａｎｇ Ｙ， Ｇｏｖｅｎｄｅｒ Ｕ， Ｍｎｇｑｕｎｄａｎｉｓｏ Ｎ， Ａｎｎａｍａｌａｉ Ｋ， Ｖｏｇｅｌ ＴＵ， Ｈａｍｍｏｎｄ Ｍ， Ｂｕｎｃｅ Ｍ， Ｃｏｏｖａｄｉａ ＨＭ， Ｗａｌｋｅｒ ＢＤ（２００１）Ｒａｐｉｄ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｉｖｅ ｎｏｖｅｌ ＨＬＡ−Ａ＊３００２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｅｌｉｓｐｏｔ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｓｓａｙｓ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７５，１３３９−１３４７．

当業者とって明らかなように、本発明の多くの修正および変更は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行われることができる。本発明は、添付の請求項が権利を付与される均等物の全範囲に沿って、かかる請求項の見地によって定義される。以下の実施例を含む本明細書に記載の具体的な実施形態は、ほんの一例として提示されており、それらの細目によって本発明の範囲は限定されないものとする。

本明細書に引用されているすべての参考文献は、それぞれ個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願または特許が参照により組み入れられることを具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。文献の引用の記述は、出願人によって、３７のＣ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従い、ありとあらゆる刊行物、データベースエントリー（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願もしくは特許に関し、それぞれは、たとえそのような引用が文献の引用のための記述に直接隣接してなくても、７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（２）に従って明確に確認されるように意図される。文献の引用のための記述の包含は、あるとしても、本明細書内であり、文献の引用のこの一般的記述を多少なりとも弱めるものではない。本明細書の参考文献の引用は、その参考文献が関連する先行技術であると認めることを意図するものではなく、またはこれらの刊行物もしくは文献の内容または日付に関して何らかの容認をなすものではない。

本発明は本明細書に記載の具体的な実施形態によって範囲が限定されないものとする。実際に、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の修正は、前述の発明の詳細な説明および添付の図面から当業者には明らかになる。そのような修正は添付の特許請求項の範囲内に入ることを意図している。

前述の明細書は当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であるとみなされる。本明細書に示し、記載したものに加えて、本明細書の種々の修正は、前述の発明の詳細な説明から当業者には明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入る。

Claims (1)

1. Ｇｌｕｔ１をコードする導入遺伝子を構成する核酸配列を含む組換え型アデノ随伴ベクター（ｒＡＡｖ）。

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