JP2010213696A - 組換えaavベクターの高力価ヘルパーなし調製物を生成するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ベクター産生の開始において、該AAVプロデューサー細胞は、1つ以上のAAVパッケージング遺伝子、目的の異種(すなわち、非AAV)トランスジーンを含むAAVベクター、およびアデノウイルスのようなヘルパーウイルスを含む。産生されたAAVベクター調製物は、目的のトランスジーン(例えば、治療遺伝子)の任意の広範な組織および細胞への送達を媒介し得る。該AAVベクター調製物はまた、ヘルパーウイルス、ならびにヘルパーウイルスタンパク質および細胞タンパク質および他の夾雑物を実質的に含まない。ウイルス感染性および/もしくは複製に影響を及ぼす薬剤のスクリーニングの評価において有用である定量的な、高処理能アッセイ。
【選択図】なし
Description
本発明は、一般的に、遺伝子移入に使用され得る、組換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターおよびその調製物の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)および細胞性タンパク質を実質的に含まない、組換えAAVベクターの高力価の調製物の生成方法に関する。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、遺伝子治療のためのベクターとして魅力的な独特の特徴を有する。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の細胞型に感染する。しかし、アデノ随伴ウイルスは、形質転換性でなく、そして、いずれのヒト疾患の病因とも関係していない。DNAのレシピエント宿主細胞への導入は、一般的に、その細胞の正常の代謝を妨げることなく、そのDNAの長時間の残留および発現をもたらす。
本発明は、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、および細胞性タンパク質および他の成分を実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス(AAV)の高力価調製物を生成する、方法および物質を提供する。
本発明の目的は、ヘルパーウイルス、ヘルパーウイルスタンパク質、ならびに細胞性タンパク質および他の成分を実質的に含まない、アデノ随伴ウイルス(AAV)の高力価調製物を生成するための方法および物質を提供することである。
本明細書において使用する場合、「ベクター」とは、ポリヌクレオチドを含むか、またはポリヌクレオチドと会合して、そして細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用され得る、高分子または高分子の会合物をいう。例示的なベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ビヒクルが挙げられる。
本発明の実施は、他に示さない限り、当業者にとって公知である、従来の分子生物学、ウイルス学、動物細胞培養および生化学の技術を使用する。そのような技術は、文献において十分に例示される。例えば、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、第2版(Sambrook、FritschおよびManiatis、1989);「Animal Cell Culture」(R.I.Freshney、編、1987);「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.MillerおよびM.P.Calos、編、1987);「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausbelら、編、1987);「Current Protocols in Protein Science」(John E Coliganら、編、Wiley and Sons、1995);ならびに「Protein Purification: Principles and Practice」(Robert K.Scopes、Springer−Verlag、1994)を参照のこと。
本発明の組換えAAVベクターは、通常AAVゲノムの大部分を構成するAAVのrepおよび/またはcap遺伝子の代わりに、目的の異種(すなわち、非AAV)ポリヌクレオチドを含む。しかし、野生型AAVゲノムにおける場合のように、rAAVプロベクターは、好ましくは、上記の2つのAAVの逆方向末端反復(ITR)に隣接する。rAAV構築物が単一の(代表的には改変された)ITRに隣接するバリエーションもまた、当該分野において記載され、そして本発明との関連において使用され得る。
当該分野で記載され、そして本明細書および上記で引用された参考文献中に説明されるように、(AAVの産生のための哺乳動物「プロデューサー」細胞のような)細胞を形質転換または形質導入するための任意の種々の手段を用いて、このような細胞に遺伝物質を導入し得る。例として、このような技術は、例えば、細菌プラスミドを用いたトランスフェクション、ウイルスベクターを用いた感染、エレクトロポーレーション、リン酸カルシウム沈殿、および脂質を基礎にした種々の任意の組成物を用いる導入(しばしば「リポフェクション」と呼ばれるプロセス)を含む。これらの技術を実施するための方法および組成物は、当該分野で記載され、そして広く利用可能である。
上記のように、AAVは、自己複製欠損であるパルボウイルスであり、そして一般に、特定の複製機能を供給するヘルパーウイルスに依存しなければならない。多くのこのようなヘルパーウイルスが同定され、これらは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(HSV1、サイトメガロウイルスおよびHHV−6を含むがこれらに限定されない)、およびポックスウイルス(特にワクシニア)を含む。これらウイルスの任意を本発明とともに用い得る。
本明細書で記載される「条件的感受性」ヘルパーウイルスもまた、ヘルパーウイルス活性を提供するために採用され得る。このようなヘルパーウイルス株は、AAVがそれ自身効果的なゲノム複製を行わない少なくとも1セットの条件下で、宿主細胞中でのAAV複製を支持し得る性質を最小限有さなければならない。ヘルパーウイルス活性が、インタクトなウイルス粒子として提供される場合、それはまた、一般に、このウイルスが、第2のセットの条件下で、宿主細胞中で複製し得ることが必要である。第1のセットの条件は、第2のセットの条件と、容易に制御可能な特徴((カチオンのような)必要なコファクターの存在または非存在、阻害薬物の存在または非存在、または温度のような環境条件におけるシフトなど)が異なる。最も簡便には、2つの条件の差異は、温度であり、そしてこのような条件的感受性ウイルスは、それゆえ、温度感受性ヘルパーウイルス(tsHV)と呼ばれる。
・TCID50アッセイで測定したとき、少なくとも106、好ましくは少なくとも約108、より好ましくは少なくとも約1010IU/mlの密度。
・総タンパク質またはアデノウイルスヘキソンに対するアデノウイルスDNAの比は、ウイルス粒子の、少なくとも10%、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは、少なくとも約80%が、アデノウイルスDNAを含むことを示す。
・タンパク質について染色されたSDSゲル、またはエチジウムブロマイドで染色された制限ヌクレアーゼ消化物のアガロースゲルにより検出されるとき、タンパク質またはDNAレベルの非アデノウイルス物質による、20%より少ない、好ましくは約10%より少ない、より好ましくは約1%より少ない混入物。
・生産バッチあたり、合計少なくとも109、好ましくは少なくとも約1011、より好ましくは少なくとも約1013IU。
いくつかの基準が、本明細書に記載されるようなrAAV粒子を産生するのに使用するための細胞の選択に影響を与える。最初の事項として、その細胞は、選択されたヘルパーウイルスを用いる場合、rAAVベクターの複製およびパッケージングに許容性でなければならない。しかし、ほとんどの哺乳動物細胞は、AAVによって生産的に感染され得、そして多くの細胞もまたアデノウイルスのようなヘルパーウイルスによって感染され得るので、多くの種々の哺乳動物細胞および細胞株がこれらの基準を有効に満足することは明白である。これらのうち、より好ましい細胞および細胞株は、組換えAAVベクター調製物の大規模生産を容易にするために培養物中で容易に増殖され得るものである。しかし、このような細胞の多くもまた、この基準を有効に満たす。大規模生産が所望される場合、産生方法の選択はまた、宿主細胞の選択にも影響を与える。例えば、以下および当該分野においてより詳細に記載されるように、いくつかの生産技術および培養容器もしくはチャンバーが付着または接着細胞の増殖のために設計されており、他方、他のものが懸濁細胞増殖のために設計されている。後者の場合、従って、宿主細胞は、好ましくは、懸濁増殖に適合されたかまたは適合可能である。しかし、接着またはアンカー依存性とみなされる細胞および細胞株の場合でさえ、(以下に記載されるように)懸濁増殖しうる細胞について連続的に選択することによってアンカー依存性親株の懸濁適合性改変体を誘導させることが可能である。
○公知の標準を用いて複製アッセイまたは定量ハイブリダイゼーション比較において決定される場合、少なくとも107、好ましくは少なくとも約108、より好ましくは少なくとも約109RU/mlの濃度
○108RUのrAAV粒子あたり、103以下、好ましくは約102以下、より好ましくは101以下のヘルパーウイルスの感染性粒子
○SDSゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク質(例えば、アデノウイルスのヘキソンまたはペントンファイバー)についてのイムノアッセイのいずれかによって検出される、タンパク質ベース(重量/重量)で、5%未満、好ましくは約1%未満、より好ましくは約0.01%未満、さらにより好ましくは約0.001%未満のヘルパーウイルスによる混入物
○SDSゲルの密度分析によるか、またはヘルパーウイルス特異的タンパク質または細胞特異的タンパク質についてのイムノアッセイのいずれかによって検出される、5%未満、好ましくは約1%未満、より好ましくは約0.01%未満、さらにより好ましくは約0.001%未満のヘルパーウイルスまたは細胞タンパク質(重量/重量)による混入物
○好ましくは、その調製物はまた、細胞の脂質、炭水化物、および/または核酸のような他の潜在的な細胞成分を実質的に含まない。
○この調製物において、合計少なくとも1010、好ましくは1012、そしてより好ましくは1014RUのAAVベクター粒子。
本発明の種々の好ましい局面において、本明細書において記載されるようなrAAVベクターの産生における使用に適したヘルパーウイルスの生成のための産生および精製の方法が使用される。AAVの産生のために一般的に使用されるヘルパーウイルスは、アデノウイルス、代表的には、Ad5であるが、他のヘルパーウイルスもまた、本明細書においておよび当該分野で記載されるように使用され得る。
ヘルパーウイルス(例えば、Ad5)は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)に感染することによって容易に産生され得る。以下に記載される例示的な例において、細胞は、培地およびその宿主細胞の増殖に適した培養容器中で増殖され、感染前に濃縮され、次いで穏やかに攪拌しながらヘルパーウイルスに感染される(例えば、1〜5のMOIで)。感染後、細胞を、新鮮な培地に再懸濁し得、そしてヘルパーウイルスの複製およびパッケージングを可能にするために、さらなる期間(代表的には、約2日間)インキュベートし得る。インキュベーション後、細胞を採取し、そしてこれを溶解してヘルパーウイルスを放出させ得る。溶解後、その細胞溶解物は、好ましくは、ウイルス粒子にキャプシド化された核酸を分解させずに、遊離の核酸(例えば、細胞核酸)を分解するためにヌクレアーゼで処置される。この溶解物を、明澄化(例えば、濾過および/または遠心分離による)し得、そしてまた以下に記載されそして例示されるように、その調製物におけるそのヘルパーウイルスを精製および濃縮するために、さらに精製技術に供され得る。
ヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)の下流処理のために好ましい技術は、そのヘルパーウイルスの精製のためにイオン交換クロマトグラフィー手順を使用する。
ヘルパーウイルスについて、「上流」および「下流」のプロセスの相へとAAV産生および精製の議論を分割することが例示の目的のために簡便である。「上流」プロセスとは、一般的に、適切な宿主細胞におけるAAV産生、および「粗」AAV調製物を産生するためにその細胞からそのウイルスを放出または取り出すことをいう。「下流」処理は、その粗AAV調製物を精製するために使用され得る(例えば、細胞タンパク質および/または他の混入物からそのAAVを単離するために)。
AAVベクターは、必要なAAVパッケージング遺伝子(例えば、AAV repおよびcap遺伝子);少なくとも1つのAAV逆方向末端反復(ITR)に隣接する異種非AAVポリヌクレオチドを含む組換えAAV(rAAV)プロベクター;およびAAVのためのヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス)を含む、哺乳動物細胞株から産生され得る。これらの成分は、上記に記載および以下に例示されるように、種々の構成で細胞中に導入され得る。AAVは、任意の種々の哺乳動物細胞において複製され得そしてパッケージングされ得るので、AAVの産生のために改変され得そして使用され得る多数の細胞株が存在する。
上記に記載されるように、ヘルパーウイルス粒子(例えば、Ad粒子)を実質的に含まないAAVの調製物を得ることは特に有利である。さらに、AAVベクター調製物はまた、好ましくは、ヘルパーウイルスおよび細胞タンパク質(これはまた、免疫原性であり得る)を実質的に含まない。しかし、AAV産生のための技術の適性に影響を与えるさらなるセットの限定が存在する。すなわち、遺伝子治療のためのAAVの産生に特に有用であるために、その技術は、「大規模化可能」である(すなわち、大規模製造用デバイスおよび手順に関して適用可能である)ことが最も所望される。この後者のセットの限定は、塩化セシウム分離(これは、大規模調製手順にはあまり適していない)のような利用可能な標準的な技術の有用性を有効に減少または除去する。
種々の培地および培養容器における本発明者らのAAVを用いる産生試験の経過の間に、本発明者らは、代表的に、種々の増殖および/または代謝パラメーター(例えば、細胞密度、グルコースおよびアミノ酸の利用可能性、およびアンモニアおよび乳酸のような代謝副産物の産生)に関して培養物をモニターした。このような成分は、標準的な技術(例えば、当該分野で記載されるような、HPLCおよび酵素アッセイ)を用いて容易にモニターされ得る。
本発明において具現化されるのは、治療的に関連する遺伝子配列を用いたポリヌクレオチドを含むベクター組成物である。本発明のAAVウイルスベクターは、遺伝子治療の目的のために、個体に投与するために使用され得る。遺伝子治療に適した疾患は、ウイルス感染、細菌感染または寄生生物感染によって誘導される疾患、種々の悪性状態および過剰増殖性状態、自己免疫状態および感染性欠損を含むがこれらに限定されない。
(実施例1 野生型ヘルパーウイルス(AD5)および温度感受性ヘルパーウイルス(AD Ts149)を用いた組換えAAVベクターの例示的産生)
本実施例は、モデル治療遺伝子を含む組換えAAVベクター粒子の複製のためのヘルパー機能を提供する、野生型ヘルパーウイルス(Ad5)および温度感受性ヘルパーウイルス(Ad ts149)の使用を例示する。
先の実施例からの細胞溶解物を、C37複製アッセイによりrAAVCFベクターの産生についてアッセイし、そしてスロット−ブロットハイブリダイゼーションによりアデノウイルス産生について分析した。
この実施例は、温度感受性ヘルパーウイルスを用いる場合、得られるrAAVのレベルを改善するための種々の試みを例示する。ヘルパーウイルスの感染レベルを増加することは役にたたなかったが、動力学を調節することは驚くほど有効であった。
先行する実施例において用いた温度感受性および野生型アデノウイルスストックを、組織培養フラスコ中の293−1細胞で産生した。この実施例では、293−1細胞により産生されるアデノウイルスのレベルを、TCID50終点アッセイまたは感染度アッセイにより定量した。
ヘルパーウイルスを産生するための懸濁培養の開発
先の実施例は、従来の培養技術により産生された温度感受性アデノウイルスのレベルが低いことを示す。これは、AAVベクターの産生にヘルパーとして温度感受性アデノウイルスを用いる能力を制限する。本実施例は、感度感受性アデノウイルスをより多くの量で産生することを可能にする改良された方法を提供する。この改良の中心は、懸濁培養で増殖する宿主細胞の使用にある。
温度感受性ヘルパーウイルス(AD ts149)の産生のための改良された精製方法
CsCl勾配を用いる生成は大スケール産生にはわずらわしい。この実施例は、イオン交換クロマトグラフィーによるts149の精製を説明する。
・懸濁バイオリアクター中の細胞培養
・濃縮/培地交換・ヘルパーウイルスでの感染
・ウイルス産生
・回収:濃縮/ダイアフィルトレーション
・微小流動による溶解
・PIイオン交換クロマトグラフィー
・濃縮/ダイアフィルトレーション
・滅菌濾過
このタイプのアプローチは、本質的に、スケールアップ可能であり、かつ現在の商品製造慣行に従順である。
(A.例示の第1世代ヘルパーウイルス産生およびプロセシング)
ヘルパーウイルス産生についての例示的な「第1世代」プロセスにおいて、哺乳動物細胞を40のT225フラスコ中で増殖させ、次いでこの細胞に約1のMOIでAd5を感染させた。インキュベーション後、この細胞を遠心分離で収集し、凍結融解およびニードルの通過により溶解した。この溶解物をDNaseIでの処理に供し、次に段階CsCl勾配および等密度勾配にかけた。精製された物質を透析し、そして滅菌濾過した。
ヘルパーウイルス産生についての例示的な「第2世代」プロセスにおいて、哺乳動物細胞(HeLaS3)を10Lバイオリアクター中で増殖させ、次いでこの細胞に約1のMOIでAd5(ATCCから、続いて293細胞でプラーク精製し、HeLaS3細胞について連続的に広げ、そしてCsCl勾配遠心分離により二重精製した)を感染させた。インキュベーション後、この細胞をダイアフィルトレーションにより濃縮および収集し、そしてミクロフルイダイゼーションにより溶解した。この溶解物をベンゾナーゼ(Benzonase)(ヌクレア−ゼ)での処理に供し、次いで濾過した。次いでこの濾過物を濃縮およびダイアフィルトレートされた陰イオン交換カラム(PI)に流し、最終的に滅菌濾過した。
(A.例示の第1世代rAAV産生およびプロセシング)
rAAVベクター産生についての例示的な「第1世代」プロセスにおいて、哺乳動物細胞を40のT225フラスコ内で増殖させ、次いでこの細胞に約5のMOIでAd5を感染させた。インキュベーション後、この細胞を遠心分離により収集し、そして超音波処理により溶解した。この溶解物を、DNaseIでの処理に供し、次いで一連の2つのCsCl勾配にかけた。精製された物質を透析し、そして滅菌濾過した。この第1世代プロセスを使用して、本発明者らは4x103細胞から約5×106複製単位RUを得た。
rAAVベクター産生についての例示的な「第2世代」プロセスにおいて、哺乳動物細胞を10Lバイオリアクター中で増殖させ、次いでこの細胞に約5のMOIでAd5を感染させた。インキュベーション後、この細胞をダイアフィルトレーションにより濃縮および収集し、そしてミクロフルイダイゼーションにより溶解した。この溶解物をベンゾナーゼ(ヌクレアーゼ)での処理に供し、次いで濾過した。次いでこの濾過物を陰イオン交換カラムに流した後、陽イオン交換カラムに流した。AAVを含む溶出物画分をプール、濃縮、およびダイアフィルトレートし、最終的に滅菌濾過した。この第2世代プロセスは1x1010細胞から1x1011複製単位より多いRUを得ると期待される。
上述のように、クロマトグラフィー技術を、本発明に従ってAAV調製物をさらに精製および濃縮するために使用し得る。例として、粗製形態(例えば、溶解物)である、または陰イオン交換または陽イオン交換カラムから溶出され、および/または接線流濾過により濃縮されたAAVの調製物は、ヘパリン硫酸を含むカラムに結合させることにより精製され得る。次にAAVを、塩を含有する緩衝液(例えば、NaClの直線勾配)を使用して、このようなカラムから溶出し得る。
産生作業の別のセットにおいて、本発明者らはDMEM+10%FBSを増殖培地として使用して、セルファクトリー(Cell Factory)において増殖した3〜4x109細胞を使用した。細胞に約20のMOIでAdを感染させ、そしてこれを感染後72時間で収集した。収集した細胞を約5x106細胞/mlの濃度でTMEG+NaCl中に懸濁した。機械的な溶解(ミクロフルイダイゼーション、8000psiで2回通過)後、溶解物をベンゾナーゼで処理し(25ユニット/ml、37℃、1時間)、次いで5ミクロンフィルター(Pall Profile II)を通して濾過した。
上述のとおり、AAV産生は、AAVプロデューサー細胞の増殖または代謝に効果的なストレスを与える(または脱至適化する(de−optimize))任意の多様な薬剤および/または条件を使用して増強され得ると考えられる。この実施例において、培養中に生じるような特定のアミノ酸の枯渇は、AAV産生における相対的な増強と関連すること、および逆に、栄養ストレスを除去するための培地補充物は実際にベクター収量に劇的な減少をもたらすことが示される。
JL14細胞を、2Lバイオリアクター中に約4x105細胞/mlで接種し、バッチ様式または灌流(接線流濾過を使用して、1日目は0.4容量/日で、2〜3日は1.2容量/日で、4日目は2容量/日で、および5日目は4容量/日で)のいずれかにより、表2中に示されるrAAV培地中で増殖させた。培養物を、標準の技術を使用して、細胞密度、グルコース、乳酸、およびアミノ酸についてモニターした。
追跡研究を、培養培地中のグルタミン酸およびアスパラギン酸の相対的な欠乏の重要性を確認するために行った。JL14細胞をスピナーフラスコから得、および2つのセットに分割した。各セットに3x109感染単位の170−37Ad5を接種した。細胞の一方のセットを10%FBSおよび1%L−グルタミン(300ml)を含むrAAV培地(表2)中に106細胞/mLで再懸濁した。他方を、10%FBS、1%L−グルタミン、10mg/Lアスパラギン酸、および110mg/Lグルタミン酸を含むrAAV培地中に再懸濁した。
ストレス条件下でのrAAV産生の例として、本発明者らは、上述のとおりの技術と共に、減少血清ストレスを使用した。簡単には、JL14細胞を、継続的な連続培養様式で改変DMEM+10%FBSのスピナーフラスコで増殖させ、そして3〜4日毎に分割した。懸濁培養物からの細胞を、16のNuncセルファクトリー、10スタック(stack)に、3x108細胞/ファクトリーで、3〜4日のローテーションで配置した。増殖に使用した培地は、血清の10倍減少(すなわち、DMEM+1%FBS)を有し、これによりこの細胞を血清ストレス下に置いた。
ストレス条件下でのrAAV産生のさらなる例として、本発明者らは、上述のとおりの技術と共にpHストレスを使用した。簡単には、AAVプロデューサー細胞を上述のとおりバイオリアクター中で増殖させた。次いで細胞にMOI=10でAd5を感染させ、そしてこれを1.5Lバイオリアクター中の懸濁液中の低血清培地(実施例11に記載のとおり)に接種した。培養物を多様な高いpHレベル(7.2から8.0)で維持した。次いで培養物を、細胞数、生存度、グルコース消費、乳酸産生、pH、浸透圧、およびAAV産生について毎日モニターした。以下に示されるように、pHが7.4まで上昇した場合、AAV産生に増加が見られた;上清中に放出されたAAV粒子の数のさらにより劇的な増加を伴った(これはpHが上昇するにつれ増加した):
Claims (87)
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子の集団を生成する方法であって、以下の工程:
a)以下を含むAAVプロデューサー細胞を提供する工程:
(i)1つ以上のAAVパッケージング遺伝子であって、ここで該AAVパッケージング遺伝子の各々が、AAV複製またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子;
(ii)少なくとも1つのAAV逆方向末端反復配列(ITR)に隣接する異種非AAVポリヌクレオチドを含む組換えAAV(rAAV)プロベクター;および
(iii)AAVのヘルパーウイルス;
b)工程a)で提供されるプロデューサー細胞を、AAVの複製を可能にする条件下でインキュベートする工程;
c)工程b)のインキュベーションの後に該プロデューサー細胞を溶解して、AAVプロデューサー細胞溶解物を生成する工程;
d)工程c)のAAVプロデューサー細胞溶解物を少なくとも1つの正に荷電した陰イオン交換樹脂上でクロマトグラフィーにかける工程;ならびに e)工程d)のrAAV粒子を含むクロマトグラフィー画分を、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは接線流濾過によって精製して、rAAVベクター粒子の精製された集団を生成する工程、
を包含する、方法。 - 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記精製する工程e)が、前記画分を陽イオン交換クロマトグラフィーにかける工程を包含する、方法。
- 前記請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記精製する工程e)が、前記画分を接線流濾過にかける工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記rAAVプロベクターが、2つのAVV逆方向末端反復配列(ITR)に隣接する異種非AAVポリヌクレオチドを含む、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVプロデューサー細胞が、該AAVプロデューサー細胞のゲノムに安定に組み込まれた少なくとも1つのAAVパッケージング遺伝子を含む、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)において前記プロデューサー細胞を提供する工程が、前記ヘルパーウイルスを、前記AAVパッケージング遺伝子および前記rAAVプロベクターをすでに導入されたプロデューサー細胞中に導入する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)におけるプロデューサー細胞を提供する工程が、前記rAAVプロベクターおよび前記ヘルパーウイルスを、前記AAVパッケージング遺伝子をすでに導入した該プロデューサー細胞中に同時に、または連続して導入する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)における前記プロデューサー細胞を提供する工程が、前記AAVパッケージング遺伝子および前記rAAVプロベクターを、前記ヘルパーウイルスをすでに導入した宿主細胞中へ、同時に、または連続して導入する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVプロデューサー細胞が、AAVrep遺伝子およびAAVcap遺伝子を含む、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVrep遺伝子およびAAVcap遺伝子が、前記AAVプロデューサー細胞のゲノム中に安定に組み込まれている、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)における前記プロデューサー細胞を提供する工程が、該プロデューサー細胞中に少なくとも1つのAAVスプリットパッケージング遺伝子を導入する工程を包含する、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記ヘルパーウイルスがアデノウイルスである、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記ヘルパーウイルスが、温度感受性ヘルパーウイルスであり、そして前記プロデューサー細胞をインキュベートする工程が、AAVの複製を可能にするが、該温度感受性ヘルパーウイルスの複製を可能にしない温度で行われる、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記ヘルパーウイルスが温度感受性アデノウイルスである、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記ヘルパーウイルスがアデノウイルスAd−ts149である、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVプロデューサー細胞溶解物がまた、AAV上に存在する1つ以上の表面分子について特異的なリガンドを有する樹脂上でアフィニティー精製される、方法。
- 請求項16に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記アフィニティー精製が、イオン交換クロマトグラフィー後に行われる、方法。
- 請求項16に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記リガンドがAAV上に存在する表面分子について特異的な抗体である、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程b)のAAVプロデューサー細胞が、溶解される前に濃縮される、方法。
- 請求項19に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程b)のAAVプロデューサー細胞が、溶解される前に、遠心分離または接線流濾過によって濃縮される、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVプロデューサー細胞を溶解する工程が、該細胞を、ミクロフルイダイゼーション、超音波処理、および凍結融解からなる群から選択される溶解技術に供することによって行われる、方法。
- 請求項21に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVプロデューサー細胞を溶解する工程が、該細胞を、ミクロフルイダイゼーションに供することによって行われる、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程c)のAAVプロデューサー細胞の溶解物が、クロマトグラフィーの前にヌクレアーゼで処理される、方法。
- 請求項23に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記ヌクレアーゼがBensonaseである、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程c)の前記AAVプロデューサー細胞の溶解物が、クロマトグラフィーの前に明澄化される、方法。
- 請求項25に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程c)のAAVプロデューサー細胞の溶解物が、クロマトグラフィーの前に濾過または遠心分離によって明澄化される、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVプロデューサー細胞が、溶解の前に濃縮され、少なくとも50mM NaCl溶液のイオン強度と同じイオン強度の生理食塩水を含む緩衝液中に再懸濁され、溶解され、次いでクロマトグラフィーの前に濾過によって明澄化される、方法。
- 請求項2に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記rAAV粒子を含むクロマトグラフィー画分が、前記クロマトグラフィー樹脂から溶出された後に濾過または遠心分離によって濃縮される、方法。
- 請求項2に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記rAAV粒子を含むクロマトグラフィー画分が、接線流濾過によって濃縮される、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記陰イオン交換樹脂が、N−荷電アミノ樹脂またはイミノ樹脂である、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記陰イオン交換樹脂が、POROS 50 PI樹脂、ジエチルアミノエチル(DEAE)樹脂、トリメチルアミノエチル(TMAE)樹脂、4級アミン樹脂、およびポリエチレンイミン(PEI)樹脂からなる群から選択される、方法。
- 請求項2に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記陽イオン樹脂が、スルホ基ベース、ホスホ基ベース、またはカルボキシル基ベースの陽イオン樹脂である、方法。
- 請求項2に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記陽イオン交換樹脂が、HS樹脂、SP樹脂、およびカルボキシルメチル(CM)樹脂からなる群から選択される、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)のプロデューサー細胞が、結合依存性の哺乳動物細胞株である、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)で提供された前記プロデューサー細胞をインキュベートする前記工程b)が、組織培養フラスコ、ローラーボトル、スピナーフラスコ、タンクリアクター、発酵槽、およびバイオリアクターからなる群から選択される容器中で行われる、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)で提供されるプロデューサー細胞をインキュベートする前記工程b)が、マイクロキャリアを使用して行われる、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記容器が、中空繊維バイオリアクター、充填床バイオリアクター、または流動床バイオリアクターである、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)のプロデューサー細胞が、懸濁液適合化哺乳動物細胞株である、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)で提供されるプロデューサー細胞をインキュベートする前記工程b)が、スピナーフラスコ、タンクリアクター、およびエアリフト発酵槽からなる群から選択される容器中で行われる、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程a)で提供されるプロデューサー細胞をインキュベートする前記工程b)が、表2に本質的に示されるrAAV培地中で行われる、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記プロデューサー細胞が、293 N3細胞またはHeLa S3細胞である、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、工程b)が少なくとも5日間行われる、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記プロデューサー細胞をインキュベートする工程b)が、多リットルバイオリアクターにおいて行われ、そしてバイオリアクター容量1リットルあたりrAAVの少なくとも約109個の複製可能なユニットが工程e)の後に単離される、方法。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子の集団を生成する方法であって、以下の工程:
a)以下を含むAAVプロデューサー細胞を提供する工程:
(i)1つ以上のAAVパッケージング遺伝子であって、ここで該AAVパッケージング遺伝子の各々は、AAV複製またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子;
(ii)少なくとも1つのAAV逆方向末端反復配列(ITR)に隣接する異種非AAVポリヌクレオチドを含む組換えAAV(rAAV)プロベクター;および
(iii)AAVのヘルパーウイルスまたは少なくとも1つのヘルパーウイルス機能をコードする該ヘルパーウイルスのポリヌクレオチド配列;
b)工程a)で提供されるプロデューサー細胞を致死量未満のストレスに供する工程;ならびに
c)工程b)の該ストレスを受けたプロデューサー細胞を、AAVの複製を可能にする条件下でインキュベートする工程、
を包含する、方法。 - 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが、栄養性ストレス、浸透圧性ストレス、pHストレス、温度ストレス、有酸素性ストレス、機械的ストレス、放射能性ストレス、および毒性ストレスからなる群から選択される、方法。
- 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが、栄養性のストレスである、方法。
- 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが、浸透圧性ストレスである、方法。
- 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが、pHストレスである、方法。
- 請求項48に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記pHストレスが、pH7.2より上までpHを上げることを包含する、方法。
- 請求項48に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記pHストレスが、pHを少なくとも7.4まで上昇させることを包含し、そしてここで前記生成された大部分のAAV粒子が、前記上清中へ放出される、方法。
- 請求項48に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記pHストレスが、pHを約8.0まで上げることを包含する、方法。
- 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが、温度ストレスである、方法。
- 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが有酸素性ストレスである、方法。
- 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが機械的ストレスである、方法。
- 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが放射能性ストレスである、方法。
- 請求項44に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記致死量未満のストレスが毒性ストレスである、方法。
- 請求項46に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記栄養性ストレスが、前記プロデューサー細胞を1つ以上のアミノ酸が欠乏している培地中で培養することを包含する、方法。
- 請求項46に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記栄養性ストレスが、前記プロデューサー細胞をアスパラギン酸が欠乏している培地中で培養することを包含する、方法。
- 請求項46に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記栄養性ストレスが、前記プロデューサー細胞をグルタミン酸が欠乏している培地中で培養することを包含する、方法。
- 請求項58に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記欠乏培地が、10μmol/L未満のアスパラギン酸を含有する、方法。
- 請求項59に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記欠乏培地が、2μmol/L未満のグルタミン酸を含有する、方法。
- 請求項46に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記栄養性ストレスが、前記プロデューサー細胞を血清が欠乏している培地中で培養することを包含する、方法。
- 請求項46に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記細胞が、該細胞を栄養的に欠乏している培地中に導入することによって前記栄養性ストレスに供される、方法。
- 請求項46に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記細胞が、該細胞を培地が栄養的に欠乏するまで該培地中で培養することによって前記栄養性ストレスに供される、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、rAAVベクター粒子の前記精製された集団が、複製コンピテントなAAVおよびヘルパーウイルスおよび細胞タンパク質を実質的に含まない、方法。
- 請求項1に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、ここで前記クロマトグラフィー樹脂からの溶出が、塩濃度を増大させることによって行われ、そしてrAAV粒子を含むクロマトグラフィー溶出物が、希釈、透析、ダイアフィルトレーション、または濃縮によって有効塩濃度を低減させるために引き続いて処理される、方法。
- 請求項1〜66のいずれか1項に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、AAV粒子を含む画分をヘパリン硫酸クロマトグラフィーに供する工程を包含する、方法。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子の集団を生成する方法であって、以下の工程:
a)以下を含むAAVプロデューサー細胞を提供する工程:
(i)1つ以上のAAVパッケージング遺伝子であって、ここで該AAVパッケージング遺伝子の各々が、AAV複製またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子;
(ii)少なくとも1つのAAV逆方向末端反復(ITR)に隣接する異種非AAVポリヌクレオチドを含む組換えAAV(rAAV)プロベクター;および
(iii)AAVのヘルパーウイルス;
b)工程a)で提供されるプロデューサー細胞を、AAVの複製が可能な条件下でインキュベートする工程であって、該AAVプロデューサー細胞において致死量未満のストレスを誘導することを含む、工程;
c)工程b)のインキュベーションの後に該プロデューサー細胞を溶解して、AAVプロデューサー細胞溶解物を生成する工程;ならびに
d)該AAVプロデューサー細胞溶解物を精製して、組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子の集団を生成する工程、
を包含する、方法。 - 請求項68に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記精製工程d)が、工程c)のAAVプロデューサー細胞溶解物を、少なくとも1つの正に荷電した陰イオン交換樹脂上でクロマトグラフィーにかけ、続いて陽イオン交換樹脂かまたは接線流濾過によってのいずれかで精製して、rAAVベクター粒子の精製された集団を生成する工程を含む、方法。
- 請求項68に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記精製する工程d)が、工程c)のAAVプロデューサー細胞溶解物を、正に荷電した陰イオン交換樹脂上でクロマトグラフィーにかけ、続いて接線流濾過によりrAAVベクター粒子の精製された集団を生成する工程を含む、方法。
- 請求項68に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記rAAVプロベクターが、2つのAAV逆方向末端反復配列(ITR)に隣接している異種非AAVポリヌクレオチドを含む、方法。
- 請求項68に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVプロデューサー細胞が、該AAVプロデューサー細胞のゲノムに安定に組み込まれている少なくとも1つのAVVパッケージング遺伝子を含む、方法。
- 請求項68に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記AAVプロデューサー細胞が、AAVrep遺伝子およびAAVcap遺伝子を含む、方法。
- 請求項68に記載のrAAV粒子の集団を生成する方法であって、前記ヘルパーウイルスがアデノウイルスである、方法。
- 組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を高効率で生成するための宿主細胞であって、以下:
a)1つ以上のAAVパッケージング遺伝子であって、ここで該AAVパッケージング遺伝子の各々は、AAV複製またはキャプシド化タンパク質をコードする、遺伝子;
b)rAAVプロベクターを使用して該宿主細胞中に導入された異種ポリヌクレオチドであって、ここで該rAAVプロベクターは、少なくとも1つのAAV逆方向末端反復配列(ITR)に隣接し、そして該AAVパッケージング遺伝子が欠乏している該異種ポリヌクレオチドを含む、異種ポリヌクレオチド;
c)AAVの温度感受性ヘルパーウイルス(tsHV)であって、該tsHVが自己複製について温度感受性である、ウイルス、
を含む、宿主細胞。 - 請求項1〜74に記載の方法のいずれか1つによって生成される、rAAV粒子の集団。
- 100万個の感染性rAAV粒子あたり1個以下の感染性アデノウイルス粒子を含有する、請求項76に記載のrAAV粒子の集団。
- 108個の感染性rAAV粒子あたり1個以下の感染性アデノウイルスを含有する、請求項76に記載のrAAV粒子の集団。
- 哺乳動物細胞において複製し得るウイルスを含有する調製物の感染性力価を決定するための高処理能力アッセイであって、以下の工程:
a)それぞれ哺乳動物細胞のアリコートおよび力価測定されるべきウイルス調製物のアリコートを含む培養ウェルのアレイを提供する工程;
b)工程a)の細胞およびウイルスをインキュベートして該ウイルスの複製を可能にする工程;
c)該細胞を溶解して、ウイルスポリヌクレオチドを含有する多数の溶解物を生成する工程;
d)工程c)からの該多数の溶解物を、核酸の結合する膜に移して、核酸の膜結合アレイを生成する工程;
e)工程d)の核酸の膜結合アレイをウイルス特異的プローブとハイブリダイズさせ、次いで該培養ウェルの各々において複製されたウイルス核酸の相対量を決定する工程、
を包含する、アッセイ。 - 前記ウイルスがアデノウイルスまたはAAVである、請求項79に記載のウイルス調製物の感染性力価を決定するための高処理能力アッセイ。
- 前記ウイルスがAAVである、請求項79に記載のウイルス調製物の感染性力価を決定するための高処理能力アッセイ。
- 前記培養ウェルのアレイが、マイクロタイター容器の形態である、請求項79に記載のウイルス調製物の感染性力価を決定するための高処理能力アッセイ。
- 前記ウイルス調製物のアリコートが連続希釈されたアリコートである、請求項79に記載のウイルス調製物の感染性力価を決定するための高処理能力アッセイ。
- 哺乳動物細胞におけるウイルスの複製に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする高処理方法であって、以下の工程:
a)それぞれ哺乳動物細胞のアリコート、該ウイルスのアリコート、および必要に応じて該薬剤のアリコートを含む培養ウェルのアレイを提供する工程;
b)該細胞、ウイルス、および必要に応じて工程a)の薬剤をインキュベートして、該ウイルスの複製を可能にする工程;
c)該細胞を溶解して、ウイルスポリヌクレオチドを含有する多数の溶解物を産生する工程;
d)工程c)からの該多数の溶解物を、核酸の結合する膜に移して、核酸の膜結合アレイを生成する工程;
e)工程d)の核酸の該膜結合アレイをウイルス特異的プローブとハイブリダイズさせ、次いで該培養ウェルの各々において複製したウイルス核酸の相対量を決定する工程、
を包含する、方法。 - 前記ウイルスがアデノウイルスまたはAAVである、請求項84に記載のウイルスの複製に影響を及ぼす薬剤についてスクリーニングする高処理能力方法。
- 前記ウイルスがAAVである、請求項84に記載のウイルスの複製に影響を及ぼす薬剤についてスクリーニングする高処理能力方法。
- 前記培養ウェルのアレイがマイクロタイター容器の形態である、請求項84に記載のウイルスの複製に影響を及ぼす薬剤をスクリーニングする高処理能力方法。
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