JP2023551279A - 顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(fshd)を治療するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)又は肉腫を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び/又は予防するための生成物、方法、及び使用が本明細書に開示される。より具体的には、二重ホメオボックス4(DUX4)の発現を阻害又は下方制御するためのRNA干渉ベースの生成物、方法、及び使用が本明細書に開示される。更により具体的には、本開示は、DUX4の発現を阻害又は下方制御するためのU7DUX4アンチセンス配列を含む核酸、並びに細胞における及び/又はFSHD若しくはがんを含むがこれらに限定されない筋ジストロフィー若しくはがんを有する対象の細胞におけるDUX4発現を阻害又は下方制御するために当該アンチセンス配列を使用する方法を提供する。【選択図】なし
Description
政府権益の声明
本発明は、米国国立衛生研究所からの付与番号AR070604の下で政府の支援とともに行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所からの付与番号AR070604の下で政府の支援とともに行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
配列表の参照による組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表(ファイル名:56061_Seqlisting.txt、サイズ:13,671バイト、作成日:2021年11月23日)を含み、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態の配列表(ファイル名:56061_Seqlisting.txt、サイズ:13,671バイト、作成日:2021年11月23日)を含み、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
本開示は、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)又は肉腫を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィー又はがんの治療の分野に関する。より具体的には、本開示は、FSHD又は肉腫を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィー又はがんを治療、改善、進行を遅延、及び/又は予防するためのRNA干渉ベースの生成物、方法、及び使用を提供する。具体的には、本開示は、二重ホメオボックス4(DUX4)遺伝子の発現を阻害又は下方制御するための生成物及び方法を提供する。より具体的には、本開示は、DUX4の発現を阻害又は下方制御するためのU7小核RNA(U7snRNA)、及び当該U7snRNAを使用して、細胞において、及び/又は筋ジストロフィー若しくはがんを有するか若しくは有するリスクにある対象において、DUX4の発現を阻害又は下方制御する方法を提供する。
筋ジストロフィー(MD)は、遺伝性疾患のグループである。このグループは、動作を制御する骨格筋の進行性の衰弱及び変性を特徴とする。MDのいくつかの形態は乳児期又は小児期に発症するが、他は中年以降まで出現し得ない。障害は、筋力低下の分布及び程度(MDのいくつかの形態は心筋にも影響を及ぼす)、発病年齢、進行速度、並びに遺伝形式の点で異なる。
顔面肩甲上腕ジストロフィー(FSHD)は、なかでも最も一般的に遺伝する筋ジストロフィーであり、87万人にも影響を及ぼすと推定されている。FSHDの症状の古典的な説明には、顔、肩帯、及び腕における進行性の筋力低下が含まれるが、疾患は、胴体及び下肢の筋肉を含む、より広範囲に現れ得る。可変性はまた個人内に一般的に認められ、非対称的な衰弱が一般的である。発症年齢は幼児期から成人期までの範囲であり得、通常は疾患の重症度に関連しており、より早い発症は、多くの場合より重度の筋力低下に関連する。FSHDを有するほとんどの患者は、通常の寿命を有するが、呼吸不全が発生する可能性があり、疾患が衰弱させ得、罹患した個人の約25%がその50歳代までに車椅子に依存することになり得、より重症な疾患形態では更に早いが、一方、他は生涯歩行を維持する。
FSHDは、二重ホメオボックス4遺伝子(DUX4)の異常な発現によって引き起こされ、骨格筋にとって有毒な転写因子を産生する。DUX4は、通常、ヒトの発達の4細胞期の期間中に機能するが、その後、おそらく精巣及び多分胸腺を除いて、基本的に他の全ての組織で抑制される。FSHDを有する人々の骨格筋では、特定の遺伝的及びエピジェネティック因子が同時にDUX4脱抑制を可能にし、次いでそれが、分化異常、酸化ストレス、炎症性浸潤、細胞死、及び筋萎縮に関与するものを含む、いくつかの異常な遺伝子発現カスケードを開始する。
FSHD分野における進歩にもかかわらず、FSHDのために承認された治療法はまだなく、治療開発はこの分野で依然として重大な要求であり続けている。前臨床試験においてAAVベクターによって送達されたRNAiベースの遺伝子療法を使用するDUX4サイレンシングの安全性及び有効性が、既に示されている(非特許文献1)。非常に少量のDUX4タンパク質でさえ筋細胞に有毒であり得るため、患者の筋肉におけるDUX4サイレンシングを最大化するのに役立つ代替メカニズムを、単独で又は組み合わせ療法で使用することができる追加のDUX4サイレンシング戦略を開発することが重要である。
FSHDはDUX4脱抑制から生じるため、療法への最も直接的な経路には、筋肉におけるDUX4を阻害することが含まれる。U7小核RNA(U7snRNA)による遺伝子制御は、DUX4を阻害する1つの強力なアプローチである。U7snRNAは、RNA分子であり、小核リボ核タンパク質複合体(U7snRNP)の構成要素であり、ヒストンプレmRNAプロセシングに必要とされる。
アデノ随伴ウイルス(AAV)などのウイルスベクターが、U7snRNAを筋肉に送達するために使用されてきている。AAVは、例えば遺伝子療法において、外来DNAを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養における細胞のAAV感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、AAVは、多くの哺乳動物細胞を感染させて、インビボで多くの異なる組織を標的化する可能性を与える。更に、AAVは、ゆっくり分裂する細胞及び非分裂性細胞に形質導入し、転写的に活性な核エピソーム(染色体外要素)として本質的にそれらの細胞の存続期間にわたって持続することができる。AAVプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にするプラスミド中のクローン化DNAとして感染性である。更に、AAV複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを指示するシグナルがAAVゲノムのITR内に含有されるため、内部の約4.3kbのゲノム(複製及び構造カプシドタンパク質rep-capをコードする)の一部又は全てが、外来DNAで置き換えられ得る。rep及びcapタンパク質は、トランスで提供され得る。AAVの別の重要な特徴は、それが極めて安定した耐久性のあるウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件(56℃~65℃で数時間)に容易に耐え、AAVの低温保存の重要性を低くする。AAVは、凍結乾燥さえされ得る。最後に、AAV感染細胞は、重複感染に耐性ではない。
FSHDを含むが、これに限定されない筋ジストロフィーを治療するための生成物及び方法に対する当該技術分野での必要性が依然として存在する。本開示は、筋細胞におけるDUX4発現を阻害するためのU7小核RNA(U7snRNA)アプローチを提供する。
Wallace et al.,Mol Ther Methods Clin Dev8,121-130(2018)
本開示は、DUX4発現を阻害するための、並びに筋ジストロフィーを治療、改善、進行を遅延、及び/又は予防するための、生成物、方法、及び使用を提供する。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕ジストロフィー(FSHD)である。
本開示は、DUX4発現を阻害するように設計される核酸、核酸を含むウイルスベクター、核酸及びベクターを含む組成物及びキット、細胞におけるDUX4遺伝子の発現を阻害及び/又は発現に干渉するためにこれらの生成物を使用するための方法、並びに筋ジストロフィーに罹患している対象を治療するための方法を提供する。
本開示は、U7二重ホメオボックス4(DUX4)アンチセンスリボ核酸(asRNA)をコードする核酸を提供し、核酸は、(a)配列番号1~18のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも90%の同一性を含むヌクレオチド配列、(b)配列番号1~18のうちのいずれか1つに示されるヌクレオチド配列、又は(c)(a)及び/若しくは(b)のヌクレオチド配列の組み合わせを含む。
本開示は、配列番号19~36のいずれか1つに示されるDUX4標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするU7二重ホメオボックス4(DUX4)アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列、又は配列番号19~36のいずれか1つに示されるDUX4標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするU7二重ホメオボックス4(DUX4)アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列の組み合わせを含む、核酸を提供する。
いくつかの態様において、本開示の核酸は、プロモーターの制御下にあり、したがって、プロモーターヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、U6プロモーター、U7プロモーター、tRNAプロモーター、H1プロモーター、最小CMVプロモーター、T7プロモーター、EF1-アルファプロモーター、最小EF1-アルファプロモーター、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである。いくつかの更なる態様において、筋肉特異的プロモーターは、unc45bプロモーター、tMCKプロモーター、最小MCKプロモーター、CK6プロモーター、CK7プロモーター、MHCK7プロモーター、又はCK1プロモーターである。
いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか又はそれらのいずれか1つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターを含む。いくつかの態様において、1つ以上の核酸は、単一ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターと組み合わされる。いくつかの態様において、ナノ粒子は、リポソーム又はミセルである。
いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸又は本開示の核酸の組み合わせを含む、ベクターを含む。本開示の実施形態は、ベクター(例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び/又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなどのウイルスベクター)を利用して、本明細書に開示の核酸を送達する。そのため、いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか1つ又はそれらの組み合わせを含む、ベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)又はウイルスベクターである。いくつかの態様において、AAVは、rep及びcap遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、AAVは、組換えAAV(rAAV)又は自己相補的組換えAAV(scAAV)である。いくつかの態様において、rAAVは、rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rAAV13、rAAV-anc80、rAAVrh.74、rAAVrh.8、rAAVrh.10、又はrAAV-B1である。いくつかの態様において、AAVは、rAAV-9である。
本開示は、(a)本明細書に記載される核酸、若しくはかかる核酸の組み合わせ、(b)本明細書に記載されるナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本明細書に記載されるウイルスベクター、又は(d)本明細書に記載される組成物、を含む、組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容される担体を含む。
本開示は、細胞を、(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、と接触させることを含む、細胞における二重ホメオボックス4(DUX4)遺伝子の発現を阻害及び/又は発現に干渉する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は、対象中にある。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。
本開示は、対象に、有効量の(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、を投与することを含む、筋ジストロフィーを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)である。
本開示は、対象に、有効量の(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、を投与することを含む、がんを有する対象を治療する方法を提供する。いくつかの態様において、がんは、肉腫である。
本開示は、細胞における二重ホメオボックス4(DUX4)遺伝子の発現を阻害するための医薬品の調製のための、(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、細胞は、対象中にある。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。
本開示は、細胞における二重ホメオボックス4(DUX4)遺伝子の発現を阻害するための、(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、細胞は、対象中にある。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。
本開示は、筋ジストロフィーを治療又は改善するための医薬品の調製のための、(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、の使用を提供する。
本開示は、筋ジストロフィーを治療又は改善するための、(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、FSHDである。
本開示は、がんを治療又は改善するための医薬品の調製のための、(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、がんは、肉腫である。
本開示は、がんを治療又は改善するための、(a)本開示の核酸若しくはそれらの組み合わせ、(b)本開示のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、(c)本開示のウイルスベクター、又は(d)本開示の組成物、の使用を提供する。いくつかの態様において、がんは、肉腫である。
本開示はまた、本開示の核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、ベクター、ウイルスベクター、組成物、又は医薬品が、筋肉内注射、経皮輸送、又は血流への注入のために製剤化される、方法及び使用を提供する。
本開示の更なる態様及び利点は、図面と併せて得られる、以下の詳細な説明のレビューから、当業者には明らかであろう。しかしながら、詳細な説明(図面及び特定の実施例を含む)は、開示される主題の実施形態を示すが、例示としてのみ与えられ、それは本開示の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるためである。
本開示は、筋肉中の二重ホメオボックスタンパク質4(DUX4)の発現が、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)を含むが、これらに限定されない筋ジストロフィーを引き起こすことが知られているため、DUX4タンパク質産生を抑制又は阻害することによって転写後のDUX4遺伝子発現を果たす新規戦略を提供する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の生成物及び方法は、FSHDを治療、改善、進行の遅延、及び/又は予防する際に使用される。
DUX4遺伝子は、約45kDAのタンパク質をコードする(UniProtKB-Q9UBX2(DUX4_HUMAN)を参照)。DUX4遺伝子の脱抑制は、FSHDの疾患発症に関与する。脱抑圧は、2つの既知の機構:D4Z4反復収縮、又はクロマチン変更遺伝子であるSMCHD1若しくはDNMT3Bにおける変異、を通して発生し得る。前者では、非罹患対象では、D4Z4配列は11~100反復で構成されるが、FSHD1患者では、配列は1~10反復に減少する(PubMed:19320656)。いずれの状態も、染色体4q35でDNA低メチル化を引き起こし得、それによって、DUX4発現を許す染色体環境を生じる。
DUX4は、体細胞組織においてエピジェネティックに抑制されるD4Z4マクロサテライト反復に位置する。FSHD1におけるD4Z4クロマチン弛緩は、DUX4の非効率的なエピジェネティック抑制及び骨格筋核のサブセットにおけるDUX4タンパク質発現の多様化パターンをもたらす。骨格筋におけるDUX4の異所性発現は、幹細胞及び生殖細胞遺伝子の発現を活性化し、体細胞で過剰発現すると、DUX4は最終的に細胞死をもたらし得る。
各D4Z4反復単位は、2つのホメオボックスをコードするオープンリーディングフレーム(DUX4と名付けられた)を有し、反復配列及びORFは他の哺乳動物で保存されている。コードされたタンパク質は、ZSCAN4、PRAMEF12、TRIM43、及びMBD3L2を含むFSHD疾患バイオマーカーであると考えられるいくつかを含む、多くの遺伝子の転写活性化因子として機能することが報告されている(PMID:24861551)。マクロサテライト反復の収縮は、常染色体優性FSHDを引き起こす。代替的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。
本開示のいくつかの実施形態において、DUX4核酸及びタンパク質が提供される。いくつかの態様において、ヒトDUX4をコードする核酸は、配列番号37に示されるヌクレオチド配列で示される。いくつかの態様において、ヒトDUX4のアミノ酸配列は、配列番号38に示されるアミノ酸配列で示される。様々な態様において、本開示の方法はまた、配列番号37に示されるヌクレオチド配列のアイソフォーム及びバリアントも標的とする。いくつかの態様において、バリアントは、配列番号37に示されるヌクレオチド配列と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、及び70%の同一性を含む。いくつかの態様において、本開示の方法は、配列番号38に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸のアイソフォーム及びバリアントを標的とする。いくつかの態様において、バリアントは、配列番号38に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、及び70%の同一性を含む。
現在、FSHDのための治療はなく、筋ジストロフィーの中でのその相対的多数にもかかわらず、FSHD標的化翻訳の試験はほとんど公表されてきていない。いくつかのFSHD候補遺伝子が特定されているが、最近の多くの試験は、FSHD発症の主な寄与因子が、転写因子をコードするアポトーシス促進性DUX4遺伝子であることを裏付けている。したがって、ごく簡単にいうと、DUX4過剰発現が、FSHDの根底にある主要な病原性損傷である(Chen et al.,(2016)Mol Ther24,1405-1411、Ansseau et al.(2017)Genes(Basel)8、Lek et al.(2020)Sci Transl Med12、Himeda et al.(2016)Mol Ther24,527-535、DeSimone et al.(2019)Sci Adv5,12、Lim et al.(2020)Proc Natl Acad Sci USA 117,16509-16515、Wallace et al.(2018)、上記、Rojas et al.(2020)J Pharmacol Exp Ther.Sep;374(3):489-498)。
いくつかの実施形態において、本開示は、アンチセンス転写物とも称されるアンチセンスRNA(asRNA)、天然アンチセンス転写物、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスRNAは、それがハイブリダイゼーションするタンパク質コードメッセンジャーRNA(mRNA)に相補的であり、それによってタンパク質へのその翻訳を遮断する、一本鎖RNAである。asRNAの主な機能は、遺伝子発現を制御することである。アンチセンスRNAはまた、本明細書に記載されるように合成的に産生され得、DUX4発現を下方制御する際に使用される。
本開示は、U7アンチセンス(as)DUX4snRNAを使用することによってDUX4ノックダウン又はサイレンシングを達成するための新規構築物及び方法を提供する。U7-as snRNAは、核で転写され、次に細胞質に輸出され、そこでSm及びLsmタンパク質とともに組み立てられる。組み立てられたU7-snRNPは、細胞質に残るか、又は核に輸入されて戻され得る。核では、それらはスプライシング機構に関連しているが、細胞質では、それらはP bodyに関連し、通常、mRNA転換において機能する(Liu et al.(2007).PNAS104(28),11655-11659)。同様に、mRNAは核及び細胞質の両方で検出することができ、それらは核内で転写及び成熟され、その後、翻訳のために細胞質に輸送される。
いくつかの実施形態において、本開示は、筋肉における毒性DUX4遺伝子の発現を下方制御又は阻害することによってFSHDを治療する遺伝子療法アプローチを提供する。全長DUX4遺伝子産物は、細胞死及び筋肉毒性を引き起こし、したがって、本明細書に記載のFSHD療法は、全長DUX4発現を阻害するように設計される。本明細書に記載されるいくつかの態様において、DUX4阻害は、U7-snRNAアンチセンス発現カセット(U7-asDUX4と呼ばれる)を使用して達成される。これらの非コードRNAは、DUX4開始コドン、スプライス部位、又はポリアデニル化シグナルをマスキングすることによって、全長DUX4プレmRNAの産生又は成熟を阻害するように設計された。U7-asDUX4構築物は、3つの主な特徴:1つの末端における安定したヘアピン構造と、Smタンパク質に対する結合部位と、目的の任意の遺伝子、例えば、DUX4を標的とするように改変することができるアンチセンス領域と、を有する。
本明細書において特定されるいくつかの構築物は、エクソン1/イントロン1接合部(すなわち、U7-asDUX4-4及び-7)、又はDUX4ポリAシグナル(PAS)(すなわち、U7-asDUX4-8)を標的にする。DUX4PASに結合するアンチセンス配列の使用は、化学的に合成されたASOを使用して既に実証されており、インビトロ及びインビボでDUX4及びDUX4活性化バイオマーカーを低下させることが示されている(Vanderplanck et al.(2011)PLoS One6,e26820、Marsollier et al.(2016)Hum Mol Genet25,1468-1478、Chen,et al.(2016)Mol Ther24,1405-1411、Ansseau et al.(2017)Genes(Basel)8)が、スプライス接合部を標的にすることは、新規アプローチである。本明細書に記載されるU7-asDUX4配列は、独自で新規であり、Smタンパク質及びLsmタンパク質を動員する追加の配列を組み込み、プロモーターからインビボで発現されるため、ASOとは異なる。ポリアデニル化は、新生mRNAを安定化させ、翻訳のために核孔を通る細胞質までのmRNA通過を調整するために必要とされる重要なプロセスである。化学的に合成されたDNAベースのASOは、DNA:RNAハイブリッドを形成し、標的転写産物に対してRNAse Hを活性化することによって作用し得るが、それはまた、DUX4PASと塩基対形成するように設計された公開されたASO配列が、シグナルをマスキングし、ポリアデニル化を防止することによって作用することができ、それによってDUX4mRNA不安定化をもたらす可能性がある。
いくつかの実施形態において、本開示は、DUX4を標的として、DUX4の発現を阻害するU7snRNAをコードするヌクレオチド配列を含む核酸(U7-asDUX4)を提供する。本開示は、本明細書に記載の様々なヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれらからなる様々な核酸を含む。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸は、本質的にヌクレオチド配列からなる。いくつかの態様において、核酸は、ヌクレオチド配列からなる。
そのため、いくつかの態様において、本開示は、DUX4遺伝子の発現を防止及び阻害するために阻害性RNAをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。阻害性RNAは、DUX4の発現を阻害する、アンチセンス配列を含む。配列番号1~18に示される配列は、DUX4遺伝子の発現を防止及び阻害するU7snRNAをコードするDNA配列である。
いくつかの態様において、「U7-asDUX4」という用語は、配列番号1~18のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列を意味するように、本明細書で互換的に使用される。いくつかの他の態様において、本開示は、配列番号19~36のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列を含むDUX4配列を標的とする、DUX4アンチセンス、例えば、U7-asDUX4をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む。
いくつかの態様において、「U7-asDUX4」という用語は、配列番号19~36のいずれか1つに示される二重ホメオボックス4(DUX4)標的ヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするU7DUX4アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列を意味するように本明細書で互換的に使用される。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、(1)配列番号1~18に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか1つを含む核酸、又は配列番号1~18に示される配列のうちのいずれか1つと少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を含むそのバリアントを含む核酸、及び(2)配列番号19~36に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか1つを標的とするsnRNAをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、を含む。
いくつかの態様において、本開示は、U7プロモーターの制御下で、配列番号1~18に示される配列のうちのいずれか1つを含むヌクレオチド配列、又は配列番号1~18に示される配列のいずれか1つと少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を含むそのバリアントを含む核酸を含む。いくつかの態様において、本開示は、筋肉特異的プロモーターを含むが、これに限定されない別のプロモーターの制御下で、配列番号1~18に示されるヌクレオチド配列のうちのいずれか1つを含む核酸を含む。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、U7プロモーターの制御下で、配列番号19~36に示される標的配列のうちのいずれか1つに結合するsnRNAをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、本開示は、筋肉特異的プロモーターを含むがこれに限定されない別のプロモーターの制御下で、配列番号19~36に示される標的配列のうちのいずれか1つに結合するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。
本明細書に記載のDUX4のsnRNA標的化に使用される例示的なヌクレオチド配列には、以下の表1に特定されるものが含まれるが、これらに限定されない。これらのヌクレオチド配列の様々な特性が、以下の表2に示される。
上記で表1及び2に記載のDNAヌクレオチド配列は、(1)DUX4を標的とするためのRNAアンチセンス配列をコードするか、又は(2)DUX4snRNAにおける標的配列部位である。
いくつかの態様において、本開示は、DUX4遺伝子の発現を阻害又は発現に干渉するsnRNA又はU-RNAを提供する。いくつかの態様において、snRNAは、ヒト又はネズミU7プロモーター、すなわち、U7snRNAによって、又はその制御下で駆動される。いくつかの態様において、snRNAは、例えば、組織特異的プロモーター又は筋肉特異的プロモーターを含むが、これらに限定されない、任意の他のプロモーターの制御下にある。
いくつかの実施形態において、本開示の生成物及び方法は、DUX4発現を下方制御又は阻害するために、通常U-RNAとも称される小核リボ核酸(snRNA)をコードする核酸を含む。snRNAは、真核生物細胞内の細胞核のスプライシングスペックル及びカハール体内に見出される小RNA分子のクラスである。小核RNAは、特定のタンパク質のセットに関連付けられ、複合体は、小核リボ核タンパク質(しばしば「スナープ」と発音されるsnRNP)と称される。各snRNP粒子は、snRNA成分及びいくつかのsnRNP特異的タンパク質(核タンパク質のファミリーであるSmタンパク質を含む)からなる。snRNAは、それらの関連するタンパク質と一緒に、プレmRNA基質上の特定の配列に結合するリボ核タンパク質複合体(snRNP)を形成する。これらは、RNAポリメラーゼII又はRNAポリメラーゼIIIのいずれかによって転写される。snRNAは、多くの場合、共通の配列特徴及びRNA結合LSmタンパク質などの関連するタンパク質因子の両方に基づいて、2つのクラスに分類される。SmクラスのsnRNAとして知られる第1のクラスは、U1、U2、U4、U4atac、U5、U7、U11、及びU12で構成される。SmクラスのsnRNAは、RNAポリメラーゼIIによって転写される。第2のクラスは、LsmクラスのsnRNAとして知られ、U6及びU6atacで構成される。LsmクラスのsnRNAは、RNAポリメラーゼIIIによって転写され、SmクラスのsnRNAとは対照的に、核から決して離れない。いくつかの態様において、本開示は、DUX4アンチセンス配列の送達のためのU7snRNAを含むAAVベクターの産生及び投与を含む。
いくつかの態様において、本開示は、U7snRNA分子を使用して、遺伝子発現を阻害、ノックダウン、又はそれに干渉する。U7snRNAは、通常、ヒストンプレmRNA3’末端プロセシングに関与するが、いくつかの態様において、スプライシング調節のための汎用ツールに、又は細胞内で連続的に発現されるアンチセンスRNAとして、変換される(Goyenvalle et al.,Science306(5702):1796-9(2004))。野生型U7Sm結合部位を、スプライセオソームsnRNAに由来するコンセンサス配列で置き換えることによって、得られるRNAは、スプライセオソームsnRNAに見出される7つのSmタンパク質と組み立てられる(図7)。その結果、このU7Sm OPT RNAは、より効率的に核質内に蓄積し、ヒストンプレmRNA切断をもはや媒介しないが、依然としてヒストンプレmRNAに結合し、野生型U7snRNPの競合阻害物質として作用することができる。ヒストン下流エレメントに結合する配列を、スプライシング基質における特定の標的に相補的なもので更に置き換えることによって、特定のスプライシング事象を調節することができるU7snRNAを作製することが可能である。U7誘導体を使用する利点は、アンチセンス配列が、小核リボ核タンパク質(snRNP)複合体に埋め込まれることである。更に、遺伝子療法ベクターに埋め込まれると、これらの小RNAは、単回注入後に標的細胞内で永久的に発現することができる[Gorman et al.,Proc Natl Acad Sci.28;95(9):4929-34(1998)、Goyenvalle et al.,Science.3;306(5702):1796-9(2004)、Levy et al.,Eur.J.Hum.Genet.18(9):969-70(2010)、Wein et al.,Hum.Mutat.31(2):136-42,(2010)、Wein et al.,Nat.Med.20(9):992-1000(2014)]。CUG反復の発現を変化させるためのU7の使用は、DM1患者細胞株においてインビトロで試験されており[Francois et al.,Nat.Struct.Mol.Biol.18(1):85-7(2011)]、CUG反復を標的とするU7RNAは、DUX4関連病巣の減少した量及び異常なスプライシングパターンの修正をもたらすことが示されているが、しかしながら、このアプローチは、レンチウイルスに基づいており、インビボでそれ以上決して追及されなかった。AAVアプローチを使用した神経筋障害におけるU7snRNAシステムの可能性は、インビボで調査されてきている(AAV.U7)[Gorman et al.,Proc Natl Acad Sci.28;95(9):4929-34(1998)、Goyenvalle et al.,Science.3;306(5702):1796-9(2004)、Levy et al.,Eur.J.Hum.Genet.18(9):969-70(2010)、Wein et al.,Hum.Mutat.31(2):136-42(2010)、Wein et al.,Nat.Med.20(9):992-1000(2014)]。
U7 snRNAは、通常、ヒストンプレmRNA3’末端プロセシングに関与するが、スプライシング調節のための汎用ツールとして、又は細胞内で連続的に発現されるアンチセンスRNAとしても使用される。U7誘導体を使用する1つの利点は、アンチセンス配列が、小核リボ核タンパク質(snRNP)複合体に埋め込まれることである。更に、遺伝子療法ベクターに埋め込まれると、これらの小RNAは、単回注入後に標的細胞内で恒久的に発現することができる。
いくつかの態様において、本開示は、本開示の核酸のうちのいずれか、又はそれらのいずれか1つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターを含む。いくつかの態様において、1つ以上の核酸は、単一ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクターに組み合わされる。いくつかの態様において、ナノ粒子は、リポソーム又はミセルである。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載される核酸のうちのいずれか、又は核酸のうちのいずれかの組み合わせを含むベクターを含む。本開示の実施形態は、ベクター(例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び/又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなどのウイルスベクター)を利用して、本明細書に開示の核酸を送達する。
いくつかの実施形態において、本開示は、ベクター(例えば、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ウマ関連ウイルス、アルファウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルス、例えば、キメラウイルス、モザイクウイルス、若しくは偽型ウイルス、及び/又は外来タンパク質、合成ポリマー、ナノ粒子、若しくは小分子を含有するウイルスなどのウイルスベクター)を利用して、本明細書に開示の核酸又は核酸の組み合わせを送達する。
いくつかの実施形態において、ベクターは、AAVベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、一本鎖AAVベクターである。いくつかの態様において、AAVは、組換えAAV(rAAV)である。いくつかの態様において、rAAVは、rep及びcap遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、rAAVは、自己相補的(sc)AAVである。
したがって、いくつかの態様において、ウイルスベクターは、AAV1(すなわち、AAV1逆末端反復(ITR)及びAAV1カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV2(すなわち、AAV2ITR及びAAV2カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV3(すなわち、AAV3ITR及びAAV3カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV4(すなわち、AAV4ITR及びAAV4カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV5(すなわち、AAV5ITR及びAAV5カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV6(すなわち、AAV6ITR及びAAV6カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV7(すなわち、AAV7ITR及びAAV7カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV8(すなわち、AAV8ITR及びAAV8カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV9(すなわち、AAV9ITR及びAAV9カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAVrh74(すなわち、AAVrh74ITR及びAAVrh74カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAVrh.8(すなわち、AAVrh.8ITR及びAAVrh.8カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAVrh.10(すなわち、AAVrh.10ITR及びAAVrh.10カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV11(すなわち、AAV11ITR及びAAV11カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV12(すなわち、AAV12ITR及びAAV12カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV13(すなわち、AAV13ITR及びAAV13カプシドタンパク質を含有するAAV)、AAV-anc80、AAVrh.74、AAVrh.8、AAVrh.10、又はAAV-B1などのアデノ随伴ウイルス(AAV)である。
したがって、本開示のいくつかの実施形態は、配列番号1~18のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列、又は本明細書の詳細な説明で開示される配列番号1~18のうちのいずれかに示される配列と少なくとも約90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むそのバリアントを含む、核酸を含むrAAVゲノムを含む。加えて、本開示のいくつかの実施形態は、本明細書の詳細な説明で開示される、配列番号19~36のうちのいずれかに示される標的配列に結合するヌクレオチド配列を含む、核酸を含むrAAVゲノムを含む。
AAVは、複製欠損パルボウイルスであり、その一本鎖DNAゲノムは、逆位末端反復(ITR)に145ヌクレオチドを含む長さが約4.7kbである。AAVの複数の血清型がある。AAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、既知である。例えば、AAV1の完全ゲノムは、GenBank受託番号NC_002077で提供され、AAV2の完全ゲノムは、GenBank受託番号NC_001401及びSrivastava et al.,J.Virol.,45:555-564{1983)で提供され、AAV3の完全ゲノムは、GenBank受託番号NC_1829で提供され、AAV4の完全ゲノムは、GenBank受託番号NC_001829で提供され、AAV5ゲノムは、GenBank受託番号AF085716で提供され、AAV6の完全ゲノムは、GenBank受託番号NC_001862で提供されて、AAV7及びAAV8ゲノムの少なくとも一部は、それぞれGenBank受託番号AX753246及びAX753249で提供され(AAV8に関連する米国特許第7,282,199号及び同第7,790,449号も参照)、AAV9ゲノムは、Gao et al.,J.Virol.,78:6381-6388(2004)で提供され、AAV10ゲノムは、Mol.Ther.,13(1):67-76(2006)で提供され、AAV11ゲノムは、Virology,330(2):375-383(2004)で提供され、AAV12ゲノムは、J Virol.2008 Feb;82(3):1399-406で提供され、AAV13ゲノムは、J Virol2008;82:8911で提供される。ウイルスDNA複製(rep)、カプシド形成/パッケージング、及び宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用配列は、AAV ITR内に含有される。3つのAAVプロモーター(それらの相対的マップ位置でp5、p19、及びp40と名付けられる)は、rep及びcap遺伝子をコードする2つのAAV内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。単一のAAVイントロンの差次的スプライシング(ヌクレオチド2107位及び2227位)と結合した、2つのrepプロモーター(p5及びp19)は、rep遺伝子から4つのrepタンパク質(rep78、rep68、rep52、及びrep40)の産生をもたらす。repタンパク質は、ウイルスゲノムを複製するために最終的に関与する複数の酵素特性を有する。cap遺伝子は、p40プロモーターから発現され、3つのカプシドタンパク質であるVP1、VP2、及びVP3をコードする。代替的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、3つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与する。単一コンセンサスポリアデニル化部位は、AAVゲノムのマップ位置95位に配置される。AAVのライフサイクル及び遺伝学は、Muzyczka,Current Topics in Microbiology and Immunology,158:97-129(1992)にレビューされている。
AAVは、例えば遺伝子療法において、外来DNAを細胞に送達するためのベクターとしてそれを魅力的にする固有の特徴を有する。培養での細胞のAAV感染は、非細胞変性であり、ヒト及び他の動物の自然感染は、無症状及び無症候性である。更に、AAVは、多くの哺乳動物細胞を感染させて、インビボで多くの異なる組織を標的とする可能性を与える。更に、AAVは、ゆっくり分裂する細胞及び非分裂性細胞で形質導入し、転写的に活性な核エピソーム(染色体外要素)として本質的にそれらの細胞の存続期間にわたって持続し得る。AAVプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実現可能にする、プラスミド中のクローン化DNAとして感染性である。更に、AAV複製、ゲノムカプシド形成、及び組み込みを指示するシグナルがAAVゲノムのITR内に含有されるため、内部の約4.7kbのゲノム(複製及び構造カプシドタンパク質をコードする、rep-cap)のいくつか又は全てが、外来DNAで置き換えられ得る。rep及びcapタンパク質は、トランスで提供され得る。AAVの別の重要な特徴は、それが極めて安定した頑強なウイルスであることである。これは、アデノウイルスを不活性化するために使用される条件(56℃~65℃で数時間)に容易に耐え、AAVの低温保存の重要性を低くする。AAVは、凍結乾燥され得、AAV感染細胞は、重複感染に耐性ではない。
いくつかの実施形態において、本開示のrAAVゲノムを含む、本開示のDNAプラスミドが提供される。DNAプラスミドは、感染性ウイルス粒子へのrAAVゲノムの組み立てのために、AAVのヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス、E1欠失アデノウイルス、又はヘルペスウイルス)による感染を許容できる細胞に移される。パッケージングされるべきAAVゲノムと、rep及びcap遺伝子と、ヘルパーウイルス機能とを細胞に提供するrAAV粒子を産生する技術は、当該技術分野において標準的である。rAAVの産生は、単一細胞(本明細書においてパッケージング細胞として示される)内に存在する以下の構成要素:rAAVゲノムと、rAAVゲノムから離れた(すなわち、その中に存在しない)AAV rep及びcap遺伝子と、ヘルパーウイルス機能と、を必要とする。AAV rep遺伝子は、組換えウイルスが由来することができる任意のAAV血清型からであり得、AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-anc80、AAVrh.74、AAVrh.8、AAVrh.10、及びAAV-B1を含むが、これらに限定されない、rAAVゲノムITRとは異なるAAV血清型からであり得る。いくつかの態様において、rAAVゲノムにおけるAAV DNAは、組換えウイルスが由来することができる、AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-anc80、AAVrh.74、AAVrh.8、AAVrh.10、及びAAV-B1を含むが、これらに限定されない任意のAAV血清型からである。他のタイプのrAAVバリアント、例えば、カプシドバリアントを有するrAAVも、本開示に含まれる。例えば、Marsic et al.,Molecular Therapy22(11):1900-1909(2014)を参照されたい。上記のように、様々なAAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。同族構成要素の使用が具体的に企図される。偽型rAAVの産生は、例えば、WO01/83692に開示され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態において、本開示の組換えAAVゲノムは、ポリヌクレオチド配列に隣接する1つ以上のAAV ITR、例えば、プレmRNA内の主要なエクソン定義要素に結合する1つ以上のアンチセンス配列を含む。そのため、いくつかの実施形態において、本開示のrAAVゲノムは、例えば、1つ以上のDUX4アンチセンス配列をコードするポリヌクレオチドに隣接する1つ以上のAAV ITRを含む。Ambion Inc.(Austin,TX)、Darmacon Inc.(Lafayette,CO)、InvivoGen(San Diego,CA)、及びMolecular Research Laboratories,LLC(Herndon,VA)などの商業的プロバイダーが、カスタム阻害性RNA分子を作製する。加えて、市販のキットが、SILENCER(商標)siRNA構築キット(Ambion Inc.、Austin,TX)又はpsiRNAシステム(InvivoGen、San Diego,CA)などのカスタムsiRNA分子を生成するために利用可能である。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の組換えAAVゲノムは、少なくとも1つのDUX4標的化ポリヌクレオチド構築物に隣接する1つ以上のAAV ITRを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、snRNA、snRNAをコードするポリヌクレオチド、又は標的配列に結合するように設計されたsnRNAをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、snRNAをコードするポリヌクレオチドは、DUX4を標的とする他のポリヌクレオチド構築物とともに投与される。
様々な態様において、プロモーターを使用して、組織特異的発現を可能にする。いくつかの態様において、snRNAは、U6プロモーター、U7プロモーター、T7プロモーター、tRNAプロモーター、H1プロモーター、EF1-アルファプロモーター、最小EF1-アルファプロモーター、unc45bプロモーター、CK1プロモーター、CK6プロモーター、CK7プロモーター、ミニCMVプロモーター、CMVプロモーター、筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、アルファ-ミオシン重鎖エンハンサー-/MCKエンハンサー-プロモーター(MHCK7)、tMCKプロモーター、最小MCKプロモーター、又はデスミンなどのプロモーターを含むが、これらに限定されない様々なプロモーター下で発現される。rAAVゲノムにおけるAAV DNAは、組換えウイルスが由来することができる、AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV-anc80、AAVrh.74、AAVrh.8、AAVrh.10、及びAAV-B1を含むが、これらに限定されない任意のAAV血清型からであり得る。上記に示されるように、様々なAAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。
いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、偽型AAVであり、1つのAAV血清型からのITR及び異なるAAV血清型からのカプシドタンパク質を含有する。いくつかの実施形態において、偽型AAVは、AAV2/9(すなわち、AAV2ITR及びAAV9カプシドタンパク質を含有するAAV)である。いくつかの実施形態において、偽型AAVは、AAV2/8(すなわち、AAV2ITR及びAAV8カプシドタンパク質を含有するAAV)である。いくつかの実施形態において、偽型AAVは、AAV2/1(すなわち、AAV2ITR及びAAV1カプシドタンパク質を含有するAAV)である。
いくつかの実施形態において、AAVは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV-anc80、AAVrh74、AAVrh.8、又はAAVrh.10、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、又はAAV-B1からの1つ以上のカプシドタンパク質のキメラを含有するカプシドタンパク質などの組換えカプシドタンパク質を含有する。他のタイプのrAAVバリアント、例えば、カプシドバリアントを有するrAAVも企図される。例えば、Marsic et al.,Molecular Therapy,22(11):1900-1909(2014)を参照されたい。上記に示されるように、様々なAAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列が、当該技術分野において既知である。
いくつかの実施形態において、パッケージング細胞が提供される。パッケージング細胞は、AAV粒子産生に必要な全ての構成要素を安定して発現する細胞株を有するために作製される。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスのgag、pol、及びenv遺伝子を除去することによって作製される。これらは、治療用遺伝子によって置き換えられる。ベクター粒子を産生するためには、パッケージング細胞が不可欠である。パッケージング細胞株は、カプシド産生及びベクターのビリオン成熟に必要な全てのウイルスタンパク質を提供する。そのため、パッケージング細胞株は、それらがgag、pol、及びenv遺伝子を含有するように作製される。レトロウイルスDNAベクターに所望の遺伝子を挿入し、適切なパッケージング細胞株を維持した後、レトロウイルスベクターを調製することは、今や簡単なことである。
例えば、AAV rep及びcap遺伝子を欠くrAAVゲノムと、rAAVゲノムから離れたAAV rep及びcap遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーと、を含むプラスミド(又は複数のプラスミド)が、細胞のゲノムに組み込まれる。AAVゲノムは、GCテーリング(Samulski et al.,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79:2077-2081)、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加(Laughlin et al.,1983,Gene,23:65-73)、又は直接的な平滑末端ライゲーション(Senapathy&Carter,1984,J.Biol.Chem.,259:4661-4666)などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、rAAVの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、rAAVゲノム並びに/又はrep及びcap遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の核酸のうちのいずれか又はベクターのうちのいずれかを、希釈剤、賦形剤、又は緩衝剤と組み合わせて含む、組成物を含む。
したがって、いくつかの実施形態において、AAV粒子産生に必要な全ての構成要素を安定して発現する細胞株を生じるパッケージング細胞を作製する方法が提供される。例えば、AAV rep及びcap遺伝子を欠くrAAVゲノムと、rAAVゲノムから離れたAAV rep及びcap遺伝子と、ネオマイシン耐性遺伝子などの選択可能なマーカーと、を含むプラスミド(又は複数のプラスミド)が、細胞のゲノムに組み込まれる。AAVゲノムは、GCテーリング(Samulski et al.,1982,Proc.Natl.Acad.S6.USA,79:2077-2081)、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含有する合成リンカーの付加(Laughlin et al.,1983,Gene,23:65-73)、又は直接的な平滑末端ライゲーション(Senapathy et al.,1984,J.Biol.Chem.,259:4661-4666)などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次いで、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスで感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、rAAVの大規模産生に好適であることである。好適な方法の他の例は、rAAVゲノム並びに/又はrep及びcap遺伝子をパッケージング細胞に導入するためにプラスミドではなく、アデノウイルス又はバキュロウイルスを用いる。
rAAV産生の一般的原理は、例えば、Carter,1992,Current Opinions in Biotechnology,1533-539、及びMuzyczka,1992,Curr.Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-129)にレビューされている。様々なアプローチが、Ratschin et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072(1984)、Hermonat et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6466(1984)、Tratschin et al.,Mo1.Cell.Biol.5:3251(1985)、McLaughlin et al.,J.Virol.,62:1963(1988)、及びLebkowski et al.,1988 Mol.Cell.Biol.,7:349(1988)、Samulski et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989)、米国特許第No.5,173,414号、WO95/13365及び対応する米国特許第5,658.776号、WO95/13392、WO96/17947、PCT/US98/18600、WO97/09441(PCT/US96/14423)、WO97/08298(PCT/US96/13872)、WO97/21825(PCT/US96/20777)、WO97/06243(PCT/FR96/01064)、WO99/11764、Perrin et al.,Vaccine,13:1244-1250(1995)、Paul et al.,Human Gene Therapy,4:609-615(1993)、Clark et al.,Gene Therapy,3:1124-1132(1996)、米国特許第5,786,211号、米国特許第5,871,982号、米国特許第6,258,595号、及びMcCarty,Mol.Ther.,16(10):1648-1656(2008)に記載されている。前述の文書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれ、rAAV産生に関する文書のこれらの部分を特に強調している。様々なタイプのrAAVの産生及び使用が具体的に企図され、例示される。そのため、組換えAAV(すなわち、感染性カプシド化rAAV粒子)が本明細書に提供される。いくつかの態様において、rAAVのゲノムは、AAV rep及びcap遺伝子を欠いており、すなわち、rAAVのゲノムのITR間にAAV rep又はcap DNAが存在しない。いくつかの実施形態において、AAVは、組換え直鎖AAV(rAAV)、一本鎖AAV(ssAAV)、又は組換え自己相補的AAV(scAAV)である。
そのため、本開示は、いくつかの実施形態において、感染性rAAVを産生するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、HeLa細胞、293細胞、及びPerC.6細胞(同族293株)などの、安定して形質転換されたがん細胞である。別の実施形態において、パッケージング細胞は、低継代293細胞(アデノウイルスのE1で形質転換されたヒト胎児腎細胞)、MRC-5細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、WI-38細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、Vero細胞(サル腎細胞)、及びFRhL-2細胞(アカゲザル胎児肺細胞)などの形質転換されたがん細胞ではない細胞である。
いくつかの態様において、rAAVは、当該技術分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー又は塩化セシウム勾配によって精製される。ヘルパーウイルスからrAAVベクターを精製するための方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Clark et al.,Hum.Gene Ther.,10(6):1031-1039(1999)、Schenpp and Clark,Methods Mol.Med.,69 427-443(2002)、米国特許第6,566,118号及びWO98/09657に開示されている。
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載されるような、核酸又はベクター、例えばウイルスベクターなどを含む組成物又は複数の組成物を提供する。そのため、本明細書に記載の送達ビヒクル(rAAVなど)を含む組成物が提供される。様々な態様において、かかる組成物はまた、薬学的に許容される担体を含む。様々な態様において、かかる組成物はまた、希釈剤、賦形剤、及び/又はアジュバントなどの他の成分を含む。許容される担体、希釈剤、賦形剤、及びアジュバントは、レシピエントに非毒性であり、好ましくは、用いられる投与量及び濃度で不活性であり、リン酸、クエン酸、若しくは他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギニン、アルギニン、若しくはリシンなどのアミノ酸、グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物、EDTAなどのキレート剤、マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成対イオン、並びに/又はツイーン、プルロニック、若しくはポリエチルグリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。
いくつかの態様において、核酸は、送達のためにベクターに導入される。いくつかの態様において、送達のためのベクターは、AAV又はrAAVである。そのため、本開示の実施形態は、(i)配列番号1~18のうちのいずれかに示されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号1~18のうちのいずれかに示される配列と少なくとも約90%の配列同一性を含むそのバリアント、又は(ii)配列番号19~36のうちのいずれかに示されるDUX4標的配列に結合するDUX4asRNAをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む、rAAVゲノムを含む。
いくつかの他の態様において、核酸は、非ベクター化送達を介して細胞に導入される。そのため、実施形態において、本開示は、DUX4asRNAをコードする核酸の非ベクター化送達を含む。いくつかの態様において、この文脈では、核酸と複合体を形成し、細胞外及び細胞内ヌクレアーゼからそれらを保護することができる合成担体は、ウイルスベクターの代替物である。本開示は、かかる非ベクター化送達を含む。本開示はまた、本明細書に記載の構築物のうちのいずれかを単独又は組み合わせで含む組成物を含む。
滅菌注射可能溶液は、rAAVを必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分とともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
本開示の方法で投与されるrAAVの力価は、例えば、特定のrAAV、投与方式、治療目標、個体、及び標的にされる細胞型に応じて異なり、当該技術分野で標準的な方法によって決定され得る。rAAVの力価は、ml当たり約1×106個、約1×107個、約1×108個、約1×109個、約1×1010個、約1×1011個、約1×1012個、約1×1013~約1×1014個、又はそれを超えるDNase耐性粒子(DRP)の範囲であり得る。投与量はまた、ウイルスゲノム(vg)の単位で表され得る(例えば、それぞれ、1×107vg、1×108vg、1×109vg、1×1010vg、1×1011vg、1×1012vg、1×1013vg、及び1×1014vg)。
したがって、いくつかの態様において、本開示は、細胞又は対象に、(i)配列番号1~18のうちのいずれか1つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号1~18に示される配列のうちのいずれか1つと少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を含むそのバリアントを含む、U7-asDUX4アンチセンスをコードするポリヌクレオチド、及び/あるいは(ii)配列番号19~36のうちのいずれか1つに示されるヌクレオチド配列を含むDUX4配列を標的とするU7-asDUX4アンチセンスをコードするポリヌクレオチドを含む、任意の1つ以上の核酸を送達する方法を提供する。
いくつかの態様において、方法は、細胞又は対象に、(i)配列番号1~18のうちのいずれか1つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号1~18に示される配列のうちのいずれか1つと少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を含むそのバリアントを含む、U7-asDUX4アンチセンスをコードするポリヌクレオチド、及び/あるいは(ii)配列番号19~36のうちのいずれか1つに示されるヌクレオチド配列を含むDUX4配列を標的とするU7-asDUX4アンチセンスをコードするポリヌクレオチドを含む、任意の1つ以上の核酸を含むAAVを投与することを含む。
更に別の態様において、本開示は、細胞又は対象におけるDUX4遺伝子の発現を減少させるか、又は機能的DUX4の発現を減少させる方法を提供し、方法は、細胞又は対象を、(i)配列番号1~18のうちのいずれか1つに示されるヌクレオチド配列、又は配列番号1~18に示される配列のうちのいずれか1つと少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%の同一性を含むそのバリアントを含む、U7-asDUX4アンチセンスをコードするポリヌクレオチド、及び/あるいは(ii)配列番号19~36のうちのいずれか1つに示されるヌクレオチド配列を含むDUX4配列を標的とするU7-asDUX4アンチセンスをコードするポリヌクレオチドを含む、任意の1つ以上の核酸と接触させることを含む。
いくつかの態様において、方法は、1つ以上のAAVベクターで核酸を送達することを含む。いくつかの態様において、方法は、核酸を非ベクター化送達で細胞に送達することを含む。
いくつかの態様において、DUX4の発現又は機能的DUX4の発現は、本明細書に提供される方法によって、細胞又は対象において、少なくとも又は約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、又は100%減少する。
いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載されるU7-asDUX4アンチセンス構築物をコードする核酸の送達のためのAAV形質導入細胞を提供する。インビボ又はインビトロで、標的細胞をrAAVで形質導入する方法が、本開示に含まれる。方法は、有効用量又は有効複数用量の本開示のrAAVを含む組成物を、それを必要とする動物(ヒトなど)を含む対象に投与するステップを含む。用量が筋ジストロフィーの発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量が筋ジストロフィーの発症後に投与される場合、投与は治療的である。本開示の実施形態において、有効用量は、治療される筋ジストロフィーに関連する少なくとも1つの症状を緩和(排除又は低減)し、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防し、筋ジストロフィーの進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、筋ジストロフィーの寛解(部分若しくは完全)をもたらし、かつ/又は生存を延長する用量である。いくつかの態様において、筋ジストロフィーは、FSHDである。
併用療法も本開示によって企図される。本明細書に使用される併用は、同時治療又は連続治療を含む。本開示の方法と、標準的な医学的治療(例えば、コルチコステロイド及び/又は免疫抑制剤)、又は他の阻害性RNA構築物との組み合わせは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、国際公開第2013/016352号に開示されるものなどの他の療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。
有効用量の組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、鼻孔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。本開示のrAAVのAAV成分(特に、AAV ITR及びカプシドタンパク質)の投与経路及び血清型は、治療される疾患状態、及びDUX4を発現する細胞などの標的細胞/組織を考慮して、当業者によって選択及び/又は適合され得る。いくつかの実施形態において、投与経路は、筋肉内である。いくつかの実施形態において、投与経路は、静脈内である。
いくつかの態様において、本開示のrAAVの実際の投与は、rAAV組換えベクターを動物の標的組織に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。本開示による投与には、筋肉、血流、中枢神経系への注入、及び/又は脳若しくは他の器官への直接注入が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝化生理食塩水中にrAAVを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、rAAVと同時投与することができる担体又は他の成分について既知の制限はない(だが、DNAを分解する組成物は、rAAVを用いる通常の手段では避けるべきである)。rAAVのカプシドタンパク質は、rAAVが筋肉などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるWO02/053703を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を実施に使用することができる。rAAVは、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
筋肉内注射を目的のために、セサミ油若しくはピーナッツ油などのアジュバント溶液、又は水性プロピレングリコール溶液、並びに滅菌水溶液を用いることができる。かかる水溶液は、必要に応じて緩衝化することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水又はグルコースで等張にすることができる。遊離酸(DNAが酸性リン酸基を含む)又は薬理学的に許容される塩としてのrAAVの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と好適に混合した水で調製することができる。rAAVの分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に周知の標準的な技術によって容易に得ることができる。
注射可能な使用に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器での使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保存の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。いくつかの態様において、適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
いくつかの態様において、製剤は、安定剤を含む。「安定剤」という用語は、加熱又は凍結中に生じるものなどの有害な条件から製剤を保護し、かつ/又は安定状態で製剤の安定性若しくは有効期間を延長させる物質又は賦形剤を指す。安定剤の例としては、スクロース、ラクトース、及びマンノースなどの糖、マンニトールなどの糖アルコール、グリシン又はグルタミン酸などのアミノ酸、並びにヒト血清アルブミン又はゼラチンなどのタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、製剤は、抗微生物保存剤を含む。「抗微生物保存剤」という用語は、使用されるバイアル又は容器の反復穿刺時に導入され得る微生物の増殖を阻害する組成物に添加される任意の物質を指す。抗微生物保存剤の例としては、チメロサール、2-フェノキシエタノール、塩化ベンゼトニウム、及びフェノールなどの物質が挙げられるが、これらに限定されない。
「形質導入」という用語は、レシピエント細胞によるDUX4miRNAの発現をもたらす、本開示の複製欠損rAAVを介する、インビボ又はインビトロのいずれかでのレシピエント細胞への本明細書に記載の核酸のうちの1つ以上の投与/送達を指すために使用される。
一態様において、rAAVによる形質導入は、インビトロで実行される。一実施形態において、所望の標的細胞は、対象から取り出され、rAAVで形質導入され、対象に再導入される。代替的に、同系又は異種の細胞が、それらの細胞が対象において不適切な免疫応答を生じない場合に使用することができる。
対象への形質導入及び形質導入した細胞の再導入のために好適な方法は、当該技術分野で既知である。一実施形態において、細胞は、例えば適切な培地中で、rAAVを細胞と組み合わせることによってインビトロで形質導入され、サザンブロット及び/若しくはPCRなどの従来の技術を使用して、又は選択可能なマーカーを使用して、目的のDNAを有するこれらの細胞についてスクリーニングする。次いで、形質導入された細胞を医薬組成物に製剤化し、組成物を、筋肉内、静脈内、皮下、及び腹腔内注入による、又は例えばカテーテルを使用した平滑筋及び心筋への注入によるなど、様々な技術によって対象に導入することができる。
本開示は、DUX4の発現を下方制御又は阻害するように設計されたマイクロRNAをコードするDNAを含む、有効用量(又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔をおいて投与される用量)のrAAVを、細胞又はそれを必要とする対象に投与する方法を提供する。いくつかの態様において、有効用量は、したがって、治療的に有効な用量である。
いくつかの実施形態において、投与されるrAAVの用量又は有効用量は、約1.0×1010vg/kg~約1.0×1016vg/kgである。いくつかの態様において、1.0×1010vg/kgはまた、1.0E10vg/kgで示され、これは単に科学的表記を示す代替的な方法である。同様に、1011は、E11と同等である、などである。いくつかの態様において、投与されるrAAVの用量は、約1.0×1011vg/kg~約1.0×1015vg/kgである。いくつかの態様において、rAAVの用量は、約1.0×1010vg/kg、約2.0×1010vg/kg、約3.0×1010vg/kg、約4.0×1010vg/kg、約5.0×1010vg/kg、約6.0×1010vg/kg、約7.0×1010vg/kg、約8.0×1010vg/kg、約9.0×1010 約1.0×1011vg/kg、約2.0×1011vg/kg、約3.0×1011vg/kg、約4.0×1011vg/kg、約5.0×1011vg/kg、約6.0×1011vg/kg、約7.0×1011vg/kg、約8.0×1011vg/kg、約9.0×1011vg/kg、約1.0×1012vg/kg、約2.0×1012vg/kg、約3.0×1012vg/kg、約4.0×1012vg/kg、約5.0×1012vg/kg、約6.0×1012vg/kg、約7.0×1012vg/kg、約8.0×1012vg/kg、約9.0×1012vg/kg、約1.0×1013vg/kg、約2.0×1013vg/kg、約3.0×1013vg/kg、約4.0×1013vg/kg、約5.0×1013vg/kg、約6.0×1013vg/kg、約7.0×1013vg/kg、約8.0×1013vg/kg、約9.0×1013vg/kg、約1.0×1014vg/kg、約2.0×1014vg/kg、約3.0×1014vg/kg、約4.0×1014vg/kg、約5.0×1014vg/kg、約6.0×1014vg/kg、約7.0×1014vg/kg、約8.0×1014vg/kg、約9.0×1014vg/kg、約1.0×1015vg/kg、約2.0×1015vg/kg、約3.0×1015vg/kg、約4.0×1015vg/kg、約5.0×1015vg/kg、約6.0×1015vg/kg、約7.0×1015vg/kg、約8.0×1015vg/kg、約9.0×1015vg/kg、又は約1.0×1016vg/kgである。
いくつかの態様において、用量は、約1.0×1011vg/kg~約1.0×1015vg/kgである。いくつかの態様において、用量は、約1.0×1013vg/kg~約5.0×1013vg/kgである。いくつかの態様において、用量は、約2.0×1013vg/kg~約4.0×1013vg/kgである。いくつかの態様において、用量は、約3.0×1013vg/kgである。
いくつかの態様において、初回用量の後に、第2のより多い用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、第2の同じ用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、1つ以上のより少ない用量が続く。いくつかの態様において、初回用量の後に、同じ用量又はより多い用量である複数の用量が続く。
インビボ又はインビトロで、標的細胞を送達ビヒクル(例えば、rAAV)で形質導入する方法が企図される。本開示のrAAVによる細胞の形質導入は、DUX4アンチセンス配列の持続した発現をもたらす。そのため、いくつかの態様において、本開示は、プレmRNAにおける主要なエクソン定義要素に結合するアンチセンス配列を発現するrAAV及びrAAVを投与/送達する方法を提供し、スプライセオソームによる特定のエクソンの認識を阻害し、対象に成熟RNAからの標的エクソンの排除をもたらす。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。これらの方法は、細胞及び組織(筋肉などの組織を含むが、これらに限定されない)を本明細書に記載の1つ以上のrAAVで形質導入することを含む。形質導入は、細胞特異的制御要素を含む遺伝子カセットを用いて実行され得る。「形質導入」という用語は、例として、標的細胞によるDUX4の減少した発現又は発現の阻害をもたらす本明細書に記載の複製欠損rAAVを介した、インビボ又はインビトロのいずれかでの標的細胞へのアンチセンス配列、例えばU7-asDUX4を含むu7snRNAの投与/送達を指す。
インビボ方法は、送達ビヒクル(rAAVなど)を含む組成物の有効用量又は有効複数用量を、それを必要とする対象(ヒト対象を含む)に投与するステップを含む。そのため、有効用量(又は本質的に同時に投与される用量若しくは間隔をおいて投与される用量)の本明細書に記載のrAAVを、それを必要とする患者に投与する方法が提供される。用量又は複数用量が、障害/疾患の発症前に投与される場合、投与は予防的である。用量又は複数用量が、障害/疾患の発症後に投与される場合、投与は治療的である。有効用量は、治療される障害/疾患状態に関連する少なくとも1つの症状を緩和(排除又は低減)し、障害/疾患状態への進行を遅延若しくは防止し、障害/疾患状態の進行を遅延若しくは予防し、疾患の程度を軽減し、障害/疾患状態の寛解(部分若しくは完全)をもたらし、かつ/又は生存を延長する用量である。
いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、筋ジストロフィー(MD)などの疾患を治療、改善、又は予防する際に使用される。様々な態様において、かかるMDは、FSHDである。FSHDは、なかでも最も一般的に遺伝する筋ジストロフィーであり、87万人にも影響を及ぼすと推定されている。FSHDの症状の古典的な説明には、顔、肩帯、及び腕における進行性の筋力低下が含まれるが、疾患は、胴体及び下肢の筋肉を含む、より広範囲に現れ得る。可変性はまた個人内に一般的に認められ、非対称的な衰弱が一般的である。発症年齢は幼児期から成人期までの範囲であり得、通常は疾患の重症度に関連しており、より早い発症は、多くの場合より重度の筋力低下に関連する。FSHDを有するほとんどの患者は、通常の寿命を有するが、呼吸不全が発生する可能性があり、疾患が衰弱させ得、罹患した個人の約25%がその50歳代までに車椅子に依存することになり得、より重症な疾患形態では更に早いが、一方、他は生涯歩行を維持する。
FSHDは、二重ホメオボックス4遺伝子(DUX4)の異常な発現によって引き起こされ、骨格筋にとって有毒な転写因子を産生する。DUX4は、通常、ヒトの発達の2細胞期の期間中に機能するが、その後、おそらく精巣を除いて、基本的に他の全ての組織で抑制される。FSHDを有する人々の骨格筋では、特定の遺伝的及びエピジェネティック因子が同時にDUX4脱抑制を可能にし、次いでそれが、分化異常、酸化ストレス、炎症性浸潤、細胞死、及び筋萎縮に関与するものを含む、いくつかの異常な遺伝子発現カスケードを開始する。
病理学的FSHDを有することが知られている家族では、本開示の方法は、様々な態様において、疾患を予防する方法であり、それらは疾患の発症前に実行される。他の様々な態様において、本開示の方法は、診断後に実行され、したがって、疾患を治療又は改善する方法である。
いくつかの実施形態において、本開示の組成物及び方法は、がんなどの疾患を治療、改善、又は予防する際に使用される。DUX4は、いくつかのがんタイプで活性化されることが示されており、それは腫瘍細胞を免疫系からマスキングするように機能する(Chew et al.,Dev.Cell2019 Sep 9;50(5):658-71)。例えば、DUX4タンパク質融合は、横紋筋肉腫及びユーイング肉腫などのがんを引き起こすことが知られている。CIC-DUX4遺伝子融合は、肉腫を誘発し、肉腫転移を駆動する(Yoshimoto et al.,Cancer Res.2017 Jun 1;77(11):2927-2937、Okimoto et al.,J Clin Invest.2019;129(8):3401-3406)。そのため、本明細書に記載の核酸、rAAV、及び組成物は、がんの治療、改善、又は予防においてDUX4発現を阻害する際に使用される。
分子的、生化学的、組織学的、及び機能的な転帰尺度は、DUX4遺伝子及びタンパク質の発現を減少させ、FSHDなどの筋ジストロフィーを治療することにおける、本明細書に開示される生成物及び方法の治療有効性を実証する。転帰尺度は、例えば、Dyck and Thomas,Peripheral Neuropathy,Elsevier Saunders,Philadelphia,PA,4thEdition,Volume1(2005)のチャプター32、35、及び43、並びにBurgess et al.,Methods Mol.Biol.,602:347-393(2010)に記載されている。転帰尺度には、罹患した組織におけるDUX4mRNA又はタンパク質の低下又は除去が挙げられるが、これらに限定されない。細胞におけるDUX4の発現の欠如及び/又はDUX4の発現の下方制御は、改善を決定するためにrAAV投与の前及び後の筋生検において、RT-PCR、qRT-PCR、RNAscope、ウェスタンブロット、免疫蛍光、又は免疫組織化学を含むが、これらに限定されない当該技術分野において既知の方法によって、DUX4タンパク質のレベルを測定することによって検出される。
いくつかの実施形態において、対象の細胞におけるDUX4遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルは、アンチセンスsnRNA構築物又はベクター、例えば、rAAVの投与前のDUX4遺伝子発現又はタンパク質発現のレベルと比較して、アンチセンスsnRNA構築物又はアンチセンスsnRNA構築物を含むベクター、例えば、rAAVの投与後に減少する。いくつかの態様において、DUX4の発現は、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、少なくとも約100%、又は少なくとも約100%超減少する。様々な態様において、改善した筋力、改善した筋機能、及び/又は改善した可動性及びスタミナは、少なくとも約2%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、少なくとも約100%、又は少なくとも約100%超改善を示す。
他の転帰尺度には、治療の前及び後の対象における血清クレアチニンキナーゼ(CK)のレベルを測定することが含まれる。増加したCKレベルは、筋肉損傷の特徴である。筋ジストロフィー患者では、CKレベルは正常範囲(出生以来、正常レベルの10~100倍)を超えて有意に増加する。上昇したCKレベルが血液試料中に認められる場合、それは通常、筋肉が筋ジストロフィー又は炎症などのいくつかの異常なプロセスによって崩壊されていることを意味する。そのため、本開示の方法による治療における肯定的な治療転帰は、rAAVの投与前の血清クレアチニンキナーゼのレベルと比較して、rAAVの投与後の血清クレアチニンキナーゼのレベルの低下である。
他の転帰尺度には、治療後の対象において、筋力の改善、筋機能の改善、可動性の改善、スタミナの改善、又はそれらの2つ以上の組み合わせが存在するかを決定するために測定することが含まれる。かかる転帰尺度は、対象における筋ジストロフィーの進行を決定する上で重要であり、当該技術分野で既知の様々な検査によって測定される。これらの検査のいくつかには、6分間歩行検査、立ち上がり時間検査、昇り4ステップ検査、昇り降り4ステップ検査、ノーススター歩行評価(NSAA)検査、10メートル時限検査、100メートル時限検査、ハンドヘルド筋力測定(HHD)検査、時限アップアンドゴー検査、粗大運動サブ検査スケール(Bayley-III)スコア、最大随意等尺性収縮検査(MVICT)、又はそれらの2つ以上の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
併用療法も本開示に含まれる。本明細書に使用される併用は、同時治療及び連続治療の両方を含む。本明細書に記載の方法と標準的な医学的治療及び支持療法との組み合わせは、グルココルチコイドなどの療法との組み合わせと同様に、具体的に企図される。全てのタイプのグルココルチコイドが、本明細書に開示の併用療法における使用のために含まれる。かかるグルココルチコイドには、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、デフラザコート、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、及びトリアムシノロンが含まれるが、これらに限定されない。
本開示に含まれる他の併用療法は、本明細書に記載される、U7-snRNAと、他のU7-snRNAとの組み合わせ、又はmiRNAベースの遺伝子療法、DUX4発現の小分子阻害剤、RNAiを介してDUX4を阻害するオリゴヌクレオチド、又はRNAse H若しくはエクソンスキッピング機構との組み合わせ、U7-snRNAプラス理論的CRISPRベースの遺伝子療法アプローチである。
有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、鼻孔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。いくつかの態様において、有効用量は、全身投与経路、すなわち、全身投与によって送達される。全身投与は、体全体が影響を受けるような循環系への投与の経路である。かかる全身投与は、様々な態様において、経腸投与(胃腸管を通した薬物の吸収)又は非経口投与(一般に、注射、注入、又は移植を介して)を介して行われる。様々な態様において、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様において、有効用量は、静脈内及び/若しくは筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。いくつかの態様において、有効用量は、順番に、又は連続して送達される。いくつかの態様において、有効用量は、同時に送達される。本開示のrAAVのAAV成分(特に、AAV ITR及びカプシドタンパク質)の投与経路及び血清型は、様々な態様において、治療される疾患又は障害の状況又は状態、対象の状況、状態、又は年齢、並びに核酸又はタンパク質を発現すべき標的細胞/組織を考慮して、当業者によって選択及び/又は適合される。
特に、送達ビヒクル(rAAVなど)の実際の投与は、送達ビヒクル(rAAVなど)を動物の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与には、筋肉、血流、及び/又は直接的な神経系若しくは肝臓への注入が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝化生理食塩水中にrAAVを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、rAAVと同時投与することができる担体又は他の成分について既知の制限はない(だが、DNAを分解する組成物は、rAAVを用いる通常の手段では避けるべきである)。rAAVのカプシドタンパク質は、rAAVが神経細胞などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるWO02/053703を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示の実施に使用することができる。送達ビヒクル(rAAVなど)は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
送達ビヒクル(rAAVなど)の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に既知の標準的な技術に容易に得ることができる。
注射可能な使用に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保存の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど)、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
滅菌注射可能溶液は、rAAVを必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分とともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
「治療すること」は、筋肉消耗、筋力低下、筋緊張症、骨格筋の問題、網膜の異常、股関節の脱力、顔の脱力、腹部筋力低下、関節及び脊髄の異常、下肢の脱力、肩の脱力、聴力喪失、筋肉炎症、及び非対称的な衰弱を含むが、これらに限定されない、筋ジストロフィーの1つ以上の症状を改善又は阻害することを含む。
有効用量の本開示の核酸、ウイルスベクター、又は組成物の投与は、筋肉内、非経口、血管内、静脈内、経口、頬側、鼻孔、肺、頭蓋内、脳室内、髄腔内、骨内、眼内、直腸、又は膣を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で標準的な経路によるものであり得る。いくつかの態様において、有効用量は、全身投与経路、すなわち、全身投与によって送達される。全身投与は、体全体が影響を受けるような循環系への投与の経路である。かかる全身投与は、様々な態様において、経腸投与(胃腸管を通した薬物の吸収)又は非経口投与(一般に、注射、注入、又は移植を介して)を介して行われる。様々な態様において、有効用量は、経路の組み合わせによって送達される。例えば、様々な態様において、有効用量は、静脈内及び/若しくは筋肉内、又は静脈内及び脳室内などで送達される。いくつかの態様において、有効用量は、順番に、又は連続して送達される。いくつかの態様において、有効用量は、同時に送達される。本開示のrAAVのAAV構成要素(特に、AAV ITR及びカプシドタンパク質)の投与経路及び血清型は、様々な態様において、治療される疾患又は障害の状況又は状態、対象の状況、状態、又は年齢、並びに核酸又はタンパク質を発現すべき標的細胞/組織を考慮して、当業者によって選択及び/又は適合される。
特に、送達ビヒクル(rAAVなど)の実際の投与は、送達ビヒクル(rAAVなど)を動物の標的細胞に輸送する任意の物理的方法を使用することによって達成され得る。投与には、筋肉、血流、及び/又は直接的な神経系若しくは肝臓への注入が含まれるが、これらに限定されない。リン酸緩衝化生理食塩水中にrAAVを単に再懸濁させることが、筋肉組織発現に有用なビヒクルを提供するのに十分であることが実証されており、rAAVと同時投与することができる担体又は他の成分について既知の制限はない(だが、DNAを分解する組成物は、rAAVを用いる通常の手段では避けるべきである)。rAAVのカプシドタンパク質は、rAAVが神経細胞などの目的の特定の標的組織に標的化されるように改変され得る。例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるWO02/053703を参照されたい。医薬組成物は、注射可能な製剤として、又は経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の製剤が既に開発されており、本開示を実施に使用することができる。送達ビヒクル(rAAVなど)は、投与及び取り扱いを容易にするために、任意の薬学的に許容される担体とともに使用することができる。
送達ビヒクル(rAAVなど)の分散液はまた、グリセロール、ソルビトール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中で、並びに油中で調製することができる。通常の保存状態及び使用下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌水性媒体は全て、当業者に既知の標準的な技術に容易に得ることができる。
注射可能な使用に好適な薬学的形態には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射可能な溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易に注射器使用が可能性である程度に流動性でなければならない。製造及び保存の条件下で安定していなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、ソルビトールなど)、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散剤の場合に必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長時間の吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。
滅菌注射可能溶液は、rAAVを必要量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙される他の様々な成分とともに組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は滅菌した活性成分を、基礎的な分散媒及び上に列挙されるものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、それは、活性成分プラス予め滅菌濾過したそれらの溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす。
本開示はまた、本開示の核酸、ベクター、又は組成物を含むか、又は本開示のプロセスに従って製造された、キットを提供する。本開示の文脈において、「キット」という用語は、2つ以上の構成要素を意味し、そのうちの1つは、本開示の核酸、ベクター、又は組成物に対応し、他は、容器、レシピエント、説明書、又は他のものに対応する。したがって、キットは、様々な態様において、特定の目標を達成するのに十分な一連の製品であり、単一のユニットとして販売することができる。
キットは、本開示の核酸、ベクター、又は組成物を投与のための適切な投与量(上記参照)で含有する、任意の適切な形状、サイズ、及び材料の1つ以上のレシピエント(バイアル、アンプル、容器、注射器、ボトル、バッグなど)を含み得る。キットは追加的に、使用のための指示若しくは説明書(例えば、リーフレット又は取扱説明書の形態で)、核酸、ベクター、若しくは組成物を投与するための注射器、ポンプ、注入器など手段、核酸、ベクター、若しくは組成物を再構成するための手段、及び/又は核酸、ベクター、若しくは組成物を希釈するための手段を含み得る。
いくつかの態様において、キットは、キットに提供される試薬の使用を説明するラベル及び/又は説明書を含む。キットはまた、本明細書に記載の方法で使用される組成物のうちの1つ以上を送達するためのカテーテル、注射器、又は他の送達デバイスを任意選択的に含む。
本発明はまた、単回用量の投与単位のための、又は複数回用量のためのキットを提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、単一チャンバ型及び複数チャンバ型のプレフィルドシリンジを含むキットを提供する。
本文書全体は、統一された開示として関連することが意図されており、特徴の組み合わせが本文書の同じ文章、又は段落、又はセクションで一緒に認められない場合でも、本明細書に記載される特徴の全ての組み合わせが企図されることを理解されたい。本開示はまた、例えば、上記で具体的に言及される変形よりもいくらか範囲が狭い本開示の全ての実施形態を含む。属として記載される本開示の態様に関して、全ての個々の種は、本開示の別個の態様とみなされる。「a」又は「an」で記載又は特許請求される本開示の態様に関して、これらの用語は、文脈がより限定された意味を明確に必要としない限り、「1つ以上」を意味することを理解されたい。
特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連における全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載の本開示の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するか、又は定型的な実験を超えることなく使用して確認することができるであろう。かかる等価物は、本開示によって包含されることが意図される。
本明細書で使用される「及び/又は」という用語はいつでも、「及び」、「又は」、及び「当該用語によって接続された要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の20%以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内を意味する。しかしながら、それはまた、具体的な数字を含み、例えば、約10は10を含む。
本明細書で使用される「約」又は「およそ」という用語は、所与の値又は範囲の20%以内、好ましくは10%以内、より好ましくは5%以内を意味する。しかしながら、それはまた、具体的な数字を含み、例えば、約10は10を含む。
本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈で別段の要求がない限り、「comprise(含む)」という単語、並びに「comprises(含む)」及び「comprising(含む)」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含めることを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。本明細書で使用される場合、「comprising(含む)」という用語は、「containing(含有する)」若しくは「including(含む)」という用語で、又は本明細書でときどき使用される場合、「having(有する)」という用語で置き換えることができる。
本明細書で使用される場合、「からなる」は、特許請求の範囲の要素に指定されていないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を与えない材料又はステップを除外しない。
本明細書の各例では、「含む(comprising)」、「から本質的になる(consisting essentially of)」、及び「からなる(consisting of)」という用語のいずれかは、他の2つの用語のいずれで置き換えられ得る。
本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、材料、試薬、及び物質などに限定されず、そのため変化することができることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、特許請求の範囲によってのみ定義される、本開示の主題の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書の本文全体で引用されている全ての刊行物及び特許(全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様、説明書などを含む)は、上記又は下記にかかわらず、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた材料が本明細書と一致しないか、又は矛盾する範囲では、本明細書は、いかなるかかる材料にも優先する。
本開示及びその利点のより良い理解は、例示的な目的のためのみに提供される以下の実施例から得られるであろう。実施例は、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書に記載の実施例及び実施形態は、例示的な目的のみのためのものであり、それらの観点から様々な修正又は変更が当業者に示唆されるが、本出願の趣旨及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
本開示の追加の態様及び詳細は、限定するのではなく例示的であることが意図されている以下の実施例から明らかであろう。
実施例1
材料及び方法
DUX4標的化U7-snRNAの設計
Marseille UniversityのHuman Splicing Finder version 3.1プログラム(http-colon-slash-slash-www.umd.be-slash-HSF-slash)を使用して、DUX4エクソン1(コード配列)の末端及び非翻訳エクソン1及び2内の潜在的なスプライスアクセプター(SA)、スプライスドナー(SD)、及びスプライスエンハンサー部位を予測した。DUX4に対するU7-snRNA(U7-asDUX4と呼ばれる)を設計するために、CpGの数が最も少ない18のハイスコア標的部位及び1つの非標的領域を選択した(表1)。予測された標的外適合を、ヒトゲノムデータベース(https colon-slash-slash-blast.ncbi.nlm.nih.gov)に対する各配列を使用して、BLASTによって決定した。マウスU7プロモーターを含有する全てのU7-asDUX4の発現カセットを合成し、pUCIDTプラスミド(Integrated DNA Technologies、Coralville,Iowa)にクローニングした。配列はまた、逆相補性塩基対形成を介してDUX4開始コドン及びポリAシグナルに結合するように設計された(表1)。非標的化対照snRNAアンチセンス配列は、5’-GTCATGTCGCGTGCCCCGGTGGTCGACACGTCGG-3’(配列番号43)である。
実施例1
材料及び方法
DUX4標的化U7-snRNAの設計
Marseille UniversityのHuman Splicing Finder version 3.1プログラム(http-colon-slash-slash-www.umd.be-slash-HSF-slash)を使用して、DUX4エクソン1(コード配列)の末端及び非翻訳エクソン1及び2内の潜在的なスプライスアクセプター(SA)、スプライスドナー(SD)、及びスプライスエンハンサー部位を予測した。DUX4に対するU7-snRNA(U7-asDUX4と呼ばれる)を設計するために、CpGの数が最も少ない18のハイスコア標的部位及び1つの非標的領域を選択した(表1)。予測された標的外適合を、ヒトゲノムデータベース(https colon-slash-slash-blast.ncbi.nlm.nih.gov)に対する各配列を使用して、BLASTによって決定した。マウスU7プロモーターを含有する全てのU7-asDUX4の発現カセットを合成し、pUCIDTプラスミド(Integrated DNA Technologies、Coralville,Iowa)にクローニングした。配列はまた、逆相補性塩基対形成を介してDUX4開始コドン及びポリAシグナルに結合するように設計された(表1)。非標的化対照snRNAアンチセンス配列は、5’-GTCATGTCGCGTGCCCCGGTGGTCGACACGTCGG-3’(配列番号43)である。
細胞培養
ヒト胎児腎臓(HEK293)細胞を、10%ウシ胎児血清、1%L-グルタミン、及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中で、5%CO2中37℃で培養した。ヒトFSHD患者に由来する影響化及び無影響化不死化ヒト筋芽細胞、及び無影響化の比較の15Abic及び15Vbic(40,60)を、16%Medium199、20%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、30ng/ml硫酸亜鉛、1.4mg/mlビタミンB12、55ng/mlデキサメタゾン、2.5ng/mlヒト成長因子、10ng/ml線維芽細胞成長因子、及び20mM HEPESを補充したDMEM培地中で拡張させた。細胞を筋芽細胞として維持し、qRT-PCR及びRNAscopeによるDUX4及びDUX4活性バイオマーカースクリーニングのために分化させた。筋芽細胞を筋管に分化させるために、トランスフェクトした筋芽細胞を、収集前に最大7日間、15%KnockOut Serum(ThermoFisher Scientific)、2mM L-グルタミン、及び1%抗生物質/アンチマイコバイオティックスを補充した、4:1のDMEM:Medium199からなる分化培地に切り替えた。
ヒト胎児腎臓(HEK293)細胞を、10%ウシ胎児血清、1%L-グルタミン、及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充したDMEM中で、5%CO2中37℃で培養した。ヒトFSHD患者に由来する影響化及び無影響化不死化ヒト筋芽細胞、及び無影響化の比較の15Abic及び15Vbic(40,60)を、16%Medium199、20%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、30ng/ml硫酸亜鉛、1.4mg/mlビタミンB12、55ng/mlデキサメタゾン、2.5ng/mlヒト成長因子、10ng/ml線維芽細胞成長因子、及び20mM HEPESを補充したDMEM培地中で拡張させた。細胞を筋芽細胞として維持し、qRT-PCR及びRNAscopeによるDUX4及びDUX4活性バイオマーカースクリーニングのために分化させた。筋芽細胞を筋管に分化させるために、トランスフェクトした筋芽細胞を、収集前に最大7日間、15%KnockOut Serum(ThermoFisher Scientific)、2mM L-グルタミン、及び1%抗生物質/アンチマイコバイオティックスを補充した、4:1のDMEM:Medium199からなる分化培地に切り替えた。
生存率アッセイ
HEK293細胞(細胞250,000個/ウェル)を、全長DUX4プレmRNA(DUX4-fl)がサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(CMV.DUX4-fl)から転写された発現プラスミドで、U7-asDUX4 snRNA又は非標的化U7-snRNAのいずれかを発現するプラスミドと一緒に、プロトコルを使用して1:6の比率で共トランスフェクトした(Lipofectamine-2000、Invitrogen)。細胞を、トランスフェクションの48時間後にトリプシン処理し、1mlの増殖培地に収集した。自動細胞計数を、Countess(登録商標)細胞計数チャンバースライド(Thermo Fisher)を使用して行った。結果を、血球計数器及びトリパンブルー染色を使用した従来の細胞計数で確認した。3つの独立した実験を行い、データは、群当たりの全細胞数の平均±SEMとして報告した。
HEK293細胞(細胞250,000個/ウェル)を、全長DUX4プレmRNA(DUX4-fl)がサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター(CMV.DUX4-fl)から転写された発現プラスミドで、U7-asDUX4 snRNA又は非標的化U7-snRNAのいずれかを発現するプラスミドと一緒に、プロトコルを使用して1:6の比率で共トランスフェクトした(Lipofectamine-2000、Invitrogen)。細胞を、トランスフェクションの48時間後にトリプシン処理し、1mlの増殖培地に収集した。自動細胞計数を、Countess(登録商標)細胞計数チャンバースライド(Thermo Fisher)を使用して行った。結果を、血球計数器及びトリパンブルー染色を使用した従来の細胞計数で確認した。3つの独立した実験を行い、データは、群当たりの全細胞数の平均±SEMとして報告した。
細胞死アッセイ
HEK293細胞(細胞42,000個/ウェル)を、トランスフェクションの16時間前に、96ウェルプレートに播種した。翌朝、細胞を、CMV.DUX4-fl及びU7-asDUX4snRNA又は非標的化U7-snRNA発現プラスミドと、1:6のモル比で共トランスフェクトした(Lipofectamine-2000、Invitrogen)。細胞死を、トランスフェクションの48時間後にApo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay(Promega、Madison,WI)を使用し、蛍光プレートリーダ(Spectra Max M2,Molecular Devices、Sunnyvale,CA)を使用して測定した。3回の個々のアッセイを三重測定(n=3)で行い、実験ごとにデータを平均化し、CMV.DUX4-flのみでトランスフェクトした対照アッセイと比較して、平均カスパーゼ活性±SEMとして報告した。
HEK293細胞(細胞42,000個/ウェル)を、トランスフェクションの16時間前に、96ウェルプレートに播種した。翌朝、細胞を、CMV.DUX4-fl及びU7-asDUX4snRNA又は非標的化U7-snRNA発現プラスミドと、1:6のモル比で共トランスフェクトした(Lipofectamine-2000、Invitrogen)。細胞死を、トランスフェクションの48時間後にApo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay(Promega、Madison,WI)を使用し、蛍光プレートリーダ(Spectra Max M2,Molecular Devices、Sunnyvale,CA)を使用して測定した。3回の個々のアッセイを三重測定(n=3)で行い、実験ごとにデータを平均化し、CMV.DUX4-flのみでトランスフェクトした対照アッセイと比較して、平均カスパーゼ活性±SEMとして報告した。
ウェスタンブロットアッセイ
この実験では、DUX4発現プラスミドを、エピトープタグ(DUX4N末端に融合されたmycエピトープタグを含有するCMV.Myc-DUX4-fl、又はCMV-DUX4-fl)の有り及び無しで使用した。HEK293細胞を、1:6の比率のDUX4:U7asDUX4発現プラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクションの20時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有するカクテルを補充したRIPA緩衝液(50mMのTris、150mMのNaCl、0.1%のSDS、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、1%のTritonX100)に溶解した。タンパク質濃度をローリータンパク質アッセイキット(Bio-Rad Laboratories)によって決定した。各総タンパク質試料の25μgを、12%SDS-ポリアクリルアミドゲルで展開させた。タンパク質を、半乾燥移動法を介してPVDF膜に移し、次いで、5%の脱脂乳でブロッキングし、一次モノクローナルマウス抗DUX4(1:500、P4H2、Novus Biologicals)、マウス抗Myc(R95125、Invitrogen)、又はウサギポリクローナル抗αチューブリン抗体(1:1,000、ab15246、Abcam、Cambridge,MA)とともに4℃で一晩インキュベートした。翌日、複数回の洗浄後、ブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート化ヤギ抗マウス又はヤギ抗ウサギ二次抗体(1:100,000、Jackson ImmunoResearch、West Grove,PA)を用いて室温で1時間探査した。Immobilon Chemiluminescent HRP基質(Millipore、Billerica,MA)中で短時間インキュベーションした後、相対的なタンパク質バンドをX線フィルムで現像した。タンパク質定量は、ImageJソフトウェア(National Institutes of Health、Bethesda,Maryland,USA、imagej.nih.gov/ij/)によって評価した。
この実験では、DUX4発現プラスミドを、エピトープタグ(DUX4N末端に融合されたmycエピトープタグを含有するCMV.Myc-DUX4-fl、又はCMV-DUX4-fl)の有り及び無しで使用した。HEK293細胞を、1:6の比率のDUX4:U7asDUX4発現プラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクションの20時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含有するカクテルを補充したRIPA緩衝液(50mMのTris、150mMのNaCl、0.1%のSDS、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、1%のTritonX100)に溶解した。タンパク質濃度をローリータンパク質アッセイキット(Bio-Rad Laboratories)によって決定した。各総タンパク質試料の25μgを、12%SDS-ポリアクリルアミドゲルで展開させた。タンパク質を、半乾燥移動法を介してPVDF膜に移し、次いで、5%の脱脂乳でブロッキングし、一次モノクローナルマウス抗DUX4(1:500、P4H2、Novus Biologicals)、マウス抗Myc(R95125、Invitrogen)、又はウサギポリクローナル抗αチューブリン抗体(1:1,000、ab15246、Abcam、Cambridge,MA)とともに4℃で一晩インキュベートした。翌日、複数回の洗浄後、ブロットを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート化ヤギ抗マウス又はヤギ抗ウサギ二次抗体(1:100,000、Jackson ImmunoResearch、West Grove,PA)を用いて室温で1時間探査した。Immobilon Chemiluminescent HRP基質(Millipore、Billerica,MA)中で短時間インキュベーションした後、相対的なタンパク質バンドをX線フィルムで現像した。タンパク質定量は、ImageJソフトウェア(National Institutes of Health、Bethesda,Maryland,USA、imagej.nih.gov/ij/)によって評価した。
免疫蛍光染色
処理した細胞及び未処理細胞におけるV5エピトープタグDUX4タンパク質の細胞内局在を、V5免疫蛍光染色を用いて視覚化した(Wallace et al.(2011)Ann Neurol69,540-552。このプラスミドは、コード配列及び3’UTR配列からなる全長DUX4配列を担持したが、フレーム内のカルボキシ末端V5エピトープ融合とともにDUX4タンパク質を発現するように操作された。トランスフェクションの20時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で20分間固定し、非特異的抗原を、0.2%TritonX-100を補充したPBS中の5%BSAでブロッキングした。細胞を、ウサギポリクローナル抗V5一次抗体(1:2,500、Abcam、ab9116)中、4℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をPBSで洗浄し、ヤギ抗ウサギAlexa-594二次抗体(1:2,500、Invitrogen)とともにインキュベートし、DAPI含有Vectashield封入メディウム(Vector Laboratories、Burlingame,CA)で封入した。
処理した細胞及び未処理細胞におけるV5エピトープタグDUX4タンパク質の細胞内局在を、V5免疫蛍光染色を用いて視覚化した(Wallace et al.(2011)Ann Neurol69,540-552。このプラスミドは、コード配列及び3’UTR配列からなる全長DUX4配列を担持したが、フレーム内のカルボキシ末端V5エピトープ融合とともにDUX4タンパク質を発現するように操作された。トランスフェクションの20時間後、細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で20分間固定し、非特異的抗原を、0.2%TritonX-100を補充したPBS中の5%BSAでブロッキングした。細胞を、ウサギポリクローナル抗V5一次抗体(1:2,500、Abcam、ab9116)中、4℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をPBSで洗浄し、ヤギ抗ウサギAlexa-594二次抗体(1:2,500、Invitrogen)とともにインキュベートし、DAPI含有Vectashield封入メディウム(Vector Laboratories、Burlingame,CA)で封入した。
RNAscopeアッセイ及び定量化
HEK293で過剰発現したDUX4を検出する。RNAscope in situハイブリダイゼーションアッセイを使用して、HEK293細胞におけるCMV.DUX4-fl及びU7.asDUX4発現プラスミド(1:6比)の共トランスフェクション後のDUX4mRNAレベルを測定した。具体的には、HEK293細胞を、トランスフェクションの16時間前にウェル当たり細胞120,000個の密度で24ウェルプレートにおけるガラスカバースリップに三重測定で播種した。翌朝、70%密集に達したとき、細胞を250ngのCMV.DUX4-fl発現プラスミド(Lipofectamine-2000、Thermo Fisher Scientific)で、製造業者の説明書に従って共トランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、細胞を4%PFAで固定し、RNAscope染色を製造業者の説明書に従って行った(以下に詳述する)。
HEK293で過剰発現したDUX4を検出する。RNAscope in situハイブリダイゼーションアッセイを使用して、HEK293細胞におけるCMV.DUX4-fl及びU7.asDUX4発現プラスミド(1:6比)の共トランスフェクション後のDUX4mRNAレベルを測定した。具体的には、HEK293細胞を、トランスフェクションの16時間前にウェル当たり細胞120,000個の密度で24ウェルプレートにおけるガラスカバースリップに三重測定で播種した。翌朝、70%密集に達したとき、細胞を250ngのCMV.DUX4-fl発現プラスミド(Lipofectamine-2000、Thermo Fisher Scientific)で、製造業者の説明書に従って共トランスフェクトした。トランスフェクションの16時間後、細胞を4%PFAで固定し、RNAscope染色を製造業者の説明書に従って行った(以下に詳述する)。
ヒトFSHD筋管における内因性DUX4を検出する。標的化内因性DUX4mRNAに対するU7-asDUX4snRNAの特異性を決定するために、15Abic FSHD筋芽細胞(15A、細胞500,000個/反応)を、エレクトロポレーション(Lonza,VVPD-1001)を介してU7-asDUX4発現プラスミドでトランスフェクトし、次いで、最大7日間、筋管に分化させた。RNAscope染色を、既に報告されているように行った(Amini Chermahini,et al.(2019)RNA25,1211-1217)。細胞を4%PFAに固定し、エタノール勾配で脱水化/再水和化した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、過酸化水素処理によって遮断した。プロテアーゼIIIを添加して、RNAscopeプローブのために固定した細胞の透過性を増加させた。細胞を、DUX4特異的RNAscopeプローブ(ACDBio、カタログNo.498541)又は陽性対照ハウスキーピングペプチジルプロリルイソメラーゼB(PPIB)及び陰性対照細菌遺伝子であるジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)を検出するプローブで処理した。プローブインキュベーション後、細胞を、RNAscope2.5HD Assay Brownを製造業者のプロトコル(ACDBio)に従って使用して、いくつかのシグナル増幅ステップで処理した。50%GillのヘマトキシリンI(カタログNo.HXGHE1LT、American Master Tech Scientific)を用いて、細胞を室温で2分間対比染色し、続いて数回洗浄した。封入後、オリンパスDP71顕微鏡を使用して画像をキャプチャした。DUX4RNAscopeシグナルを、既に報告されているようにImageJ-Fijiソフトウェアを使用して定量化した(30)。
DUX4バイオマーカーの定量的リアルタイムPCR分析
15A FSHD筋芽細胞を、本明細書でRNAscopeセクションに記載されるようにトランスフェクトし、筋管に分化させた。TRIzol試薬(ThermoFisher)を製造業者のプロトコルに従って使用して、総RNA含有量を抽出し、収率をNanodropによって測定した。次いで、単離したRNAをDnase処理し(DNA-Free、Ambion、TX)、ランダムヘキサマープライマーを使用した大容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を用いてcDNAを作製した。次いで、その後のcDNA試料を、事前に設計したTRIM43、MBD3L2、PRAMEF12、ZSCAN4(DUX4活性のバイオマーカー)、及びヒトRPL13A対照プライマー/プローブセット(Applied Biosystems)を使用したTaqmanアッセイの鋳型として使用した。全てのデータは、非標的化U7-snRNAトランスフェクトした細胞に対して正規化した。データは、各バイオマーカーについて、三重測定で行った2つの独立した実験から得た。
15A FSHD筋芽細胞を、本明細書でRNAscopeセクションに記載されるようにトランスフェクトし、筋管に分化させた。TRIzol試薬(ThermoFisher)を製造業者のプロトコルに従って使用して、総RNA含有量を抽出し、収率をNanodropによって測定した。次いで、単離したRNAをDnase処理し(DNA-Free、Ambion、TX)、ランダムヘキサマープライマーを使用した大容量cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を用いてcDNAを作製した。次いで、その後のcDNA試料を、事前に設計したTRIM43、MBD3L2、PRAMEF12、ZSCAN4(DUX4活性のバイオマーカー)、及びヒトRPL13A対照プライマー/プローブセット(Applied Biosystems)を使用したTaqmanアッセイの鋳型として使用した。全てのデータは、非標的化U7-snRNAトランスフェクトした細胞に対して正規化した。データは、各バイオマーカーについて、三重測定で行った2つの独立した実験から得た。
統計解析
全ての統計分析(カスパーゼ3/7アッセイ、細胞生存率アッセイ、RNAscope定量化、ウェスタンブロット、qRT-PCR)は、GraphPad Prism 5(GraphPad Software、La Jolla,CA)で、示された統計検定を使用して行われた。
全ての統計分析(カスパーゼ3/7アッセイ、細胞生存率アッセイ、RNAscope定量化、ウェスタンブロット、qRT-PCR)は、GraphPad Prism 5(GraphPad Software、La Jolla,CA)で、示された統計検定を使用して行われた。
実施例2
DUX4標的化U7-snRNAは、アポトーシスを低下させ、同時トランスフェクトしたHEK293の生存率を増加させる。
DUX4標的化U7-snRNAは、アポトーシスを低下させ、同時トランスフェクトしたHEK293の生存率を増加させる。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(Goyenvalle et al.(2012)Mol Ther20,1212-1221)及びβ-サラセミア(Nualkaew et al.(2019)Sci Rep9,7672)に対する可能性のある治療として、変異したエクソンのスキッピングを誘導するために、組換えU7-snRNAが以前に開発された。これらの試験では、U7-snRNAを使用して、エクソン全体をスキッピングすることによってフレームシフトした遺伝子の発現を回復させた。対照的に、この試験の目的は、U7-snRNAを使用して、DUX4プレmRNAの成熟に干渉するか、又は翻訳開始を阻害することによって、新規遺伝子サイレンシング戦略を開発することだった(Biferi et al.(2017)Mol Ther25,2038-2052、Wein et al.(2014)Nat Med20,992-1000)。
これを行うために、スプライスドナー(SD)、スプライスアクセプター(SA)、及びスプライスエンハンサー(SE)配列、又はDUX4エクソン3におけるポリアデニル化シグナル(PAS)を標的とする組換えU7-snRNAを開発した(図1A~B)。加えて、全長DUX4開始コドンの上に配置され、翻訳に干渉する可能性がある2つの構築物(9及び10)を作製した。これらのDUX4標的化U7-snRNA(U7-asDUX4と称される)の構造が図1Aにされ、特異性の重要な特徴は、DUX4プレmRNAの様々な領域と塩基対形成するように改変されたアンチセンス配列である。正しいスプライシングに干渉するための有効な配列を選択するために、Human Splicing Finderツール(図5A~C)を使用して、3つのDUX4エクソン全てで、並びにイントロン1及び2内で、潜在的なSD、SA、及びSE部位を予測した。次いで、U7-asDUX4は、最高スコア部位を標的にするように設計された(図1B)。ポリAシグナル又は開始コドンを標的とするこれらのU7-asDUX4では、アンチセンス配列が、DUX4mRNA上の同族部位の完全な網羅を提供することを確実にした。全てのU7-asDUX4配列及びそれらの重要な特徴が、本明細書に表1及び2にまとめて示される。
HEK293細胞は、通常、検出可能なDUX4を発現しないが、CMV.DUX4発現プラスミドによるトランスフェクション後、DUX4誘導性細胞死に感受性である。したがって、U7-asDUX4発現プラスミドの有効性は、最初に、カスパーゼ-3/7を使用してアポトーシス細胞死を測定すること、及び同時トランスフェクトしたHEK293細胞における転帰尺度としての細胞生存率アッセイによって評価した。18個のU7-asDUX4配列を設計し、構築物を作製して試験した。これら18個の構築物のうち、13個は、共トランスフェクトしたHEK293細胞の細胞死を有意に減少させ(50%)、生存率を増加させた(50%)(図1C~D)。最も効果的なU7-asDUX4は、エクソン1-イントロン1接合部又はポリAシグナル(PAS)を標的とする構築物4、7、及び8だった。これらの構築物は、カスパーゼ-3/7活性をそれぞれ75±7%、60±9%、及び50±8%減少させ、DUX4のみ(19.1±1.6%)又は非標的U7-snRNAを用いたDUX4(23.3±0.5%)と比較して、他のU7-asDUX4よりも生存率をそれぞれ78.5±8.4%、94.8±4.9%、及び84.8±3.8%有意に増加させた(図1C~D)。それらの優れた保護特性のために、U7-asDUX4構築物4、7及び8は、リード候補配列であるように思われた。
実施例3
U7-asDUX4は、トランスフェクトされたHEK293細胞におけるDUX4発現を有意に減少させる。
U7-asDUX4は、トランスフェクトされたHEK293細胞におけるDUX4発現を有意に減少させる。
U7-asDUX4プラスミドで処理した試料におけるDUX4関連細胞死結果の低下は、これらの配列が、全長DUX4遺伝子発現を阻害するように操作されたことを示唆した。HEK293細胞で過剰発現したDUX4mRNAを標的とし、それを減少させると思われるリードU7-asDUX4配列の特異性を調査するために、RNAscope in situハイブリダイゼーションアッセイを最初に使用して、同時トランスフェクトした細胞におけるDUX4mRNAを検出した。固定した細胞を、DUX4を標的とするプローブ、対照転写産物、又は陰性対照試薬とともにインキュベートし、次いで、ハイブリダイゼーションした標的mRNAを褐色に染色するジアミノベンジジン(DAB)試薬で処理した。以前に報告されたように(Amini Chermahini et al.(2019)RNA25,1211-1217)、DUX4発現プラスミドのみでトランスフェクトされた細胞は、DUX4プローブとともにインキュベートされたとき、豊富な、クモ様の褐色シグナル、並びに死と一致する比較的低い細胞密度を示した(図2A)。対照的に、DUX4プローブシグナルは、DUX4及び本発明者らの3つのリードU7-asDUX4と同時トランスフェクトされた細胞では、有意に減少した(図2B~D)。具体的には、U7-asDUX4処理したウェルでは、依然としてDUX4シグナルを示した細胞において、有意に少ないDUX4陽性細胞、及び/又は強度の低下したDUX4染色だった(図2B~D)。トランスフェクトされていないHEK293細胞ではDUX4シグナルが認められず(図2E)、一方、豊富なシグナルが、RNAscopeアッセイにおける陽性対照であるペプチジルイソメラーゼB(PPIB)遺伝子に対するプローブで染色された細胞で明らかであり(図2F)、陽性対照及び陰性対照は予想されたように機能した。細胞死からのある程度の保護を提供したDUX4ノックダウン(図1D)と一致して、U7-asDUX4プラスミドでトランスフェクトされたウェルは、「DUX4のみ」でトランスフェクトされた試料と比較して、より高い細胞密度を有した。
実施例4
U7-asDUX4snRNAは、トランスフェクトされたHEK293細胞における全長DUX4タンパク質を減少させる
全長DUX4mRNAノックダウンを確認するために、U7-asDUX4がDUX4タンパク質発現を抑制する効率を決定した。これを行うために、細胞は、3つのリードU7-asDUX4構築物、又は非標的化対照で、CMV.DUX4発現プラスミドとともに同時トランスフェクトされた細胞だった。タンパク質の検出を容易にするために、V5エピトープタグ(CMV.DUX4.V5-fl)のフレーム内COOH末端融合物を含有する全長DUX4構築物を使用した(図3A)。DUX4タンパク質を検出するために、細胞を、V5タグに対する蛍光標識抗体で染色した。非標的化対照U7-snRNAを受けた細胞と比較して、低下したDUX4.V5シグナルが、U7-asDUX4配列7又は8で同時トランスフェクトした細胞で観察された(図3B)。興味深いことに、U7-asDUX4-4は、その結合部位がV5エピトープタグによって破壊されたとき、DUX4.V5タンパク質レベルに影響を与えず、それによって特異性の偶発的な対照として機能した。
U7-asDUX4snRNAは、トランスフェクトされたHEK293細胞における全長DUX4タンパク質を減少させる
全長DUX4mRNAノックダウンを確認するために、U7-asDUX4がDUX4タンパク質発現を抑制する効率を決定した。これを行うために、細胞は、3つのリードU7-asDUX4構築物、又は非標的化対照で、CMV.DUX4発現プラスミドとともに同時トランスフェクトされた細胞だった。タンパク質の検出を容易にするために、V5エピトープタグ(CMV.DUX4.V5-fl)のフレーム内COOH末端融合物を含有する全長DUX4構築物を使用した(図3A)。DUX4タンパク質を検出するために、細胞を、V5タグに対する蛍光標識抗体で染色した。非標的化対照U7-snRNAを受けた細胞と比較して、低下したDUX4.V5シグナルが、U7-asDUX4配列7又は8で同時トランスフェクトした細胞で観察された(図3B)。興味深いことに、U7-asDUX4-4は、その結合部位がV5エピトープタグによって破壊されたとき、DUX4.V5タンパク質レベルに影響を与えず、それによって特異性の偶発的な対照として機能した。
リードU7-snRNAによるDUX4タンパク質ノックダウンを更に確認するために、同様の同時トランスフェクション実験をHEK293細胞で実行したが、ウェスタンブロットを使用して結果を測定した。加えて、C末端V5タグがU7-asDUX4-4結合部位を破壊したため、異なるDUX4発現構築物をこの一連の実験に利用した。具体的には、アミノ末端のフレーム内mycエピトープタグを含有するCMV.DUX4発現プラスミドを作製した(図3C)。この構築物は、エクソン1の3’末端付近で全長DUX4mRNA SD/SAをマスキングするように設計されたU7-asDUX4配列が、スプライシングを偏らせて切断された無毒性のDUX4-sタンパク質アイソフォームを産生するか決定することを可能にすると推論された(図3C)(Snider et al.(2010)PLoS Genet6,e1001181)。Myc.DUX4を発現するプラスミドと、エクソン1/イントロン1接合部付近で塩基対形成するように設計された、3つのリード構築物並びに配列5及び6を含む、5つの異なるU7-asDUX4構築物と、で同時トランスフェクトされたHEK293細胞からのタンパク質抽出物を使用してウェスタンブロッティングを実行した。myc-エピトープ抗体を使用して、全長Myc-DUX4タンパク質バンド(52kDa)が、全てのトランスフェクトされた細胞で検出された。更に、全ての試料は、内因性c-mycタンパク質のサイズ(約60kDa)で移動した、より大きな非DUX4タンパク質を含有した。前の実験と一致して、リード構築物であるU7-asDUX4配列4、7、及び8は、DUX4タンパク質を87.4%±9.8%SEM、65.9%±15%SEM、及び84.7%±13.5%SEMで有意に減少させた(n=3の独立した実験、図3D~E及び6A~B)。DUX4-s産生の証拠はウェスタンブロットによって検出されず(予測サイズ22kDa)、DUX4スプライス部位をマスキングするように設計されたU7-asDUX4配列(4、5、6、及び7)による全長DUX4遺伝子発現の減少は、DUX4-sアイソフォームに有利なようにスプライシングパターンをシフトさせることによって機能しなかったことを示唆した。同様に、より短いDUX4-s転写産物の証拠は、3’RACE RT-PCRを使用して認められなかった(図7)。これらのウェスタンブロットにおける非特異的な上部バンドは、可変的な発現を示した。DUX4は、Mycを活性化することが示されているため、それがMycである場合、DUX4レベルを変化させることは、その上部バンドの存在量に影響を与える可能性がある(Shadle et al.(2017)PLoS Genet13,e1006658)。しかしながら、これらの実験における残留DUX4とMyc存在量との間に強い相関は観察されなかった。
実施例5
U7-asDUX4は、FSHD患者からの筋管における内因性DUX4発現を有意に減少させる
HEK293における試験からの結果は、いくつかのU7-asDUX4snRNAが全長DUX4発現を減少させ、過剰発現モデルにおいて細胞死から保護することができることを示唆した。そのため、FSHD患者の筋管中の内因性DUX4mRNAを減少させるリードU7-asDUX4snRNA構築物(4、7、及び8)の能力を、RNAscope in situハイブリダイゼーションを使用して評価した。RNAscopeは、FSHD筋管中のDUX4を検出するために既に使用されてきている(Amini Chermahini et al.(2019)RNA25,1211-1217)。以前の報告と一致して、DUX4染色は、任意の所与の時点で、わずかな割合の細胞にのみ存在したことが認められた。重要なことに、人工DUX4標的化マイクロRNA(mi405)の送達後のDUX4ノックダウンを定量することができた(Amini Chermahini et al.(2019)上記、Jones et al.(2012)Hum Mol Genet21,4419-4430)。したがって、RNAscopeを使用して、U7-asDUX4snRNAが、ヒトFSHD患者に由来する筋管中の内因性DUX4シグナルを低下させることができるか決定し、それによってこのアプローチの潜在的な転写可能性を裏付けた。これを行うために、典型的には約50~70%のトランスフェクション効率をもたらすエレクトロポレーションを使用してFSHD筋細胞をトランスフェクトした(図8)。前の結果と一致して、トランスフェクトされていない15A FSHD筋管は、褐色のDUX4シグナルを示したが、U7-asDUX4配列4、7、及び8でトランスフェクトされたものは、RNAscopeシグナルを有意に低下させた(図4A~H)。これらの結果は、これら3つのU7-asDUX4構築物(すなわち、U7-asDUX4配列4、7、及び8)が、FSHD筋細胞における内因性DUX4mRNAの不安定化及び分解に影響を及ぼすことができることを確証する。
U7-asDUX4は、FSHD患者からの筋管における内因性DUX4発現を有意に減少させる
HEK293における試験からの結果は、いくつかのU7-asDUX4snRNAが全長DUX4発現を減少させ、過剰発現モデルにおいて細胞死から保護することができることを示唆した。そのため、FSHD患者の筋管中の内因性DUX4mRNAを減少させるリードU7-asDUX4snRNA構築物(4、7、及び8)の能力を、RNAscope in situハイブリダイゼーションを使用して評価した。RNAscopeは、FSHD筋管中のDUX4を検出するために既に使用されてきている(Amini Chermahini et al.(2019)RNA25,1211-1217)。以前の報告と一致して、DUX4染色は、任意の所与の時点で、わずかな割合の細胞にのみ存在したことが認められた。重要なことに、人工DUX4標的化マイクロRNA(mi405)の送達後のDUX4ノックダウンを定量することができた(Amini Chermahini et al.(2019)上記、Jones et al.(2012)Hum Mol Genet21,4419-4430)。したがって、RNAscopeを使用して、U7-asDUX4snRNAが、ヒトFSHD患者に由来する筋管中の内因性DUX4シグナルを低下させることができるか決定し、それによってこのアプローチの潜在的な転写可能性を裏付けた。これを行うために、典型的には約50~70%のトランスフェクション効率をもたらすエレクトロポレーションを使用してFSHD筋細胞をトランスフェクトした(図8)。前の結果と一致して、トランスフェクトされていない15A FSHD筋管は、褐色のDUX4シグナルを示したが、U7-asDUX4配列4、7、及び8でトランスフェクトされたものは、RNAscopeシグナルを有意に低下させた(図4A~H)。これらの結果は、これら3つのU7-asDUX4構築物(すなわち、U7-asDUX4配列4、7、及び8)が、FSHD筋細胞における内因性DUX4mRNAの不安定化及び分解に影響を及ぼすことができることを確証する。
実施例6
U7-asDUX4snRNAは、FSHD筋管におけるDUX4活性化バイオマーカー発現を減少させる
前向きなFSHD療法の出現に伴い、FSHD分野では、治療有効性を確立するために使用することができる臨床転帰尺度及びバイオマーカーを開発する必要性が生じた(LoRusso et al.(2019)BMC Neurol19,224、Mul et al.(2017).Neurology89,2057-2065、Wang et al.(2019)Hum Mol Genet28,476-486、Wong et al.(2020)Hum Mol Genet29,1030-1043)。DUX4発現は、前向き薬物又は遺伝子療法による標的関与の最も直接的な尺度であるが、FSHD筋生検において検出することは困難であり、比較的少ない。そのため、ヒト筋生検におけるDUX4発現は現在、FSHD臨床試験の信頼できる転帰尺度ではなく、いくつかのグループは現在、DUX4発現の間接尺度としてDUX4活性化バイオマーカーを検査することに変えている。少なくとも67個の異なる遺伝子が、DUX4結合部位を有する調節領域を含有し、DUX4発現時に一貫して活性化される。しかしながら、最近の試験は、一連の全体を表すために少数のバイオマーカーのみが必要であることを示唆している(Rickard et al.(2015)Hum Mol Genet24,5901-5914、Yao et al.(2014)Hum Mol Genet23,5342-5352、Eidahl(2016)Hum Mol Genet25,4577-4589、Geng et al.(2012)Dev Cell22,38-51、Jagannathan(2016)Hum Mol Genet25,4419-4431、van den Heuvel et al.(2019)Hum Mol Genet28,1064-1075)。そのため、4つのバイオマーカー、すなわち、ZSCAN4、PRAMEF12、TRIM43、及びMBD3L2が、DUX4標的遺伝子及びFSHD疾患バイオマーカーとして確立されており、FSHD細胞と健常対照細胞との間で一貫して示差的な発現を示しているため、この試験ではそれらが選択された(Yao et al.(2014)Hum Mol Genet23,5342-5352、Eidahl(2016)Hum Mol Genet25,4577-4589、Chen et al.(2016)Mol Ther24,1405-1411、Lek et al.(2020)Sci Transl Med12.、Amini Chermahini(2019)RNA25,1211-1217.)。したがって、FSHD患者細胞におけるこれらのDUX4活性化バイオマーカーを抑制するいくつかのU7-asDUX4snRNAの能力を試験した。
U7-asDUX4snRNAは、FSHD筋管におけるDUX4活性化バイオマーカー発現を減少させる
前向きなFSHD療法の出現に伴い、FSHD分野では、治療有効性を確立するために使用することができる臨床転帰尺度及びバイオマーカーを開発する必要性が生じた(LoRusso et al.(2019)BMC Neurol19,224、Mul et al.(2017).Neurology89,2057-2065、Wang et al.(2019)Hum Mol Genet28,476-486、Wong et al.(2020)Hum Mol Genet29,1030-1043)。DUX4発現は、前向き薬物又は遺伝子療法による標的関与の最も直接的な尺度であるが、FSHD筋生検において検出することは困難であり、比較的少ない。そのため、ヒト筋生検におけるDUX4発現は現在、FSHD臨床試験の信頼できる転帰尺度ではなく、いくつかのグループは現在、DUX4発現の間接尺度としてDUX4活性化バイオマーカーを検査することに変えている。少なくとも67個の異なる遺伝子が、DUX4結合部位を有する調節領域を含有し、DUX4発現時に一貫して活性化される。しかしながら、最近の試験は、一連の全体を表すために少数のバイオマーカーのみが必要であることを示唆している(Rickard et al.(2015)Hum Mol Genet24,5901-5914、Yao et al.(2014)Hum Mol Genet23,5342-5352、Eidahl(2016)Hum Mol Genet25,4577-4589、Geng et al.(2012)Dev Cell22,38-51、Jagannathan(2016)Hum Mol Genet25,4419-4431、van den Heuvel et al.(2019)Hum Mol Genet28,1064-1075)。そのため、4つのバイオマーカー、すなわち、ZSCAN4、PRAMEF12、TRIM43、及びMBD3L2が、DUX4標的遺伝子及びFSHD疾患バイオマーカーとして確立されており、FSHD細胞と健常対照細胞との間で一貫して示差的な発現を示しているため、この試験ではそれらが選択された(Yao et al.(2014)Hum Mol Genet23,5342-5352、Eidahl(2016)Hum Mol Genet25,4577-4589、Chen et al.(2016)Mol Ther24,1405-1411、Lek et al.(2020)Sci Transl Med12.、Amini Chermahini(2019)RNA25,1211-1217.)。したがって、FSHD患者細胞におけるこれらのDUX4活性化バイオマーカーを抑制するいくつかのU7-asDUX4snRNAの能力を試験した。
これを行うために、15A FSHD患者筋芽細胞を、U7-asDUX4snRNA-4、-7、及び-8、並びに非標的化対照でトランスフェクトした。次いで、細胞を7日間、筋管に分化させ、定量的RT-PCRを実行して、DUX4活性化ヒトバイオマーカーであるTRIM43、MBD3L2、PRAMEF12、及びZSCAN4の発現を測定した。4つのバイオマーカー全ての発現が、未処理の15A筋管中に存在し、U7-asDUX4処理した15A細胞中で有意に減少した(図4I)。
同時トランスフェクトされた細胞及びFSHD患者由来の筋管の両方において、DUX4及びDUX4関連結果を有意に低下させたいくつかのU7-asDUX4構築物が特定された。これらの実験は、FSHDの治療のための新規アプローチとして新規組換えU7-asDUX4を使用した、DUX4サイレンシングの概念実証を提供する。このインビボでのアプローチをFSHDマウスモデルに移すことが実行されている。
実施例7
U7-asDUX4snRNAは、FSHDのマウスモデルにおけるDUX4活性化バイオマーカーの発現を減少させる
本開示のAAV.U7-asDUX4を、新しいFSHDマウスモデル、例えば、重度のFSHDのタモキシフェン誘導性DUX4(TIC-DUX4)マウスモデル(Giesige et al.,JCI Insight.2018;3(22))、又はFSHDマウスの任意の他のマウスモデルに、筋肉内(IM)又は静脈内(IV)注入した。動物は、尾静脈又は筋肉内を介して、mi405、mi405H、若しくはmiLacZ配列を担持するAAV6ベクターの3×10E14vg/kg、8×10E13vg/kg、若しくは3×10E13vg/kgの粒子、又は生理食塩水を受ける。
U7-asDUX4snRNAは、FSHDのマウスモデルにおけるDUX4活性化バイオマーカーの発現を減少させる
本開示のAAV.U7-asDUX4を、新しいFSHDマウスモデル、例えば、重度のFSHDのタモキシフェン誘導性DUX4(TIC-DUX4)マウスモデル(Giesige et al.,JCI Insight.2018;3(22))、又はFSHDマウスの任意の他のマウスモデルに、筋肉内(IM)又は静脈内(IV)注入した。動物は、尾静脈又は筋肉内を介して、mi405、mi405H、若しくはmiLacZ配列を担持するAAV6ベクターの3×10E14vg/kg、8×10E13vg/kg、若しくは3×10E13vg/kgの粒子、又は生理食塩水を受ける。
動物は無作為化し、盲検方式で注入し、それによって2人の操作者を必要とし、第1の者は盲検を設定して、送達のためのベクターを希釈し、第2の者は動物に注射して転帰尺度を行う。TIC-DUX4マウスの公表された特性評価で行われた検定力分析に基づき、群当たりN=20の動物が、転帰尺度を試験するのに十分な検定力を提供した。しかしながら、ヒトと同様に、TIC-DUX4マウスは可変表現型を示し得、そのため高い検定力試験を確実にし、減少を防ぐため、各用量及び時点について、Nは26(N=13の雄及び13の雌)に増加させる。
いくつかの試験では、動物は以下のように2群に無作為に分けられる。
急性FSHDモデル。経口胃管を介してタモキシフェン(週当たり1回5mg/kgを10週間)又はヒマワリ油ビヒクルで処理した、TIC-DUX4マウス又はWTマウス。
急性FSHDモデル。経口胃管を介してタモキシフェン(週当たり1回5mg/kgを10週間)又はヒマワリ油ビヒクルで処理した、TIC-DUX4マウス又はWTマウス。
慢性FSHDモデル。TIC-DUX4マウス又はWTマウスは未誘発のままであり、転帰尺度を行う前に9ヶ月間加齢させることができる。
4、8、12、16、20、及び24週後、Wfdc3又はTrim36などのDUX4バイオマーカーの発現レベルを、qRT-PCR、RNAscope、又はddPCRによって測定する。
4、8、12、16、20、及び24週後、Wfdc3又はTrim36などのDUX4バイオマーカーの発現レベルを、qRT-PCR、RNAscope、又はddPCRによって測定する。
DUX4バイオマーカー発現のレベルの低下が、未処理マウスの筋肉のレベルと比較して、U7-asDUX4で処理したマウスの筋肉で観察される。
実施例8
U7-asDUX4snRNAは、FSHDのマウスモデルにおける筋肉中の内因性DUX4発現を減少させる
本開示のAAV.U7-asDUX4を、新しいFSHDマウスモデル(TIC-DUX4)又はFSHDマウスの任意の他のマウスモデルに、筋肉内(IM)又は静脈内(IV)で注入する。4、8、12、16、20、及び24週後、DUX4mRNAの発現レベルを、qRT-PCR、RNAscope、又はddPCRによって測定する。組織病理学分析及び分子分析のために、前脛骨筋、腓腹筋、三頭筋、二頭筋、四頭筋、及び横隔膜を含むいくつかの筋肉を収集する。絶対筋力及び比筋力の測定は、腓腹筋で実行される。筋力測定は、筋肉組織病理学の完全性に負に影響を及ぼす可能性があるため(すなわち、イメージングについてそれらを非公表品質にする)、群ごとにいくつかの余分なマウスを任意選択的に注入して、組織病理学的分析のための質の高い画像を確実にする。
実施例8
U7-asDUX4snRNAは、FSHDのマウスモデルにおける筋肉中の内因性DUX4発現を減少させる
本開示のAAV.U7-asDUX4を、新しいFSHDマウスモデル(TIC-DUX4)又はFSHDマウスの任意の他のマウスモデルに、筋肉内(IM)又は静脈内(IV)で注入する。4、8、12、16、20、及び24週後、DUX4mRNAの発現レベルを、qRT-PCR、RNAscope、又はddPCRによって測定する。組織病理学分析及び分子分析のために、前脛骨筋、腓腹筋、三頭筋、二頭筋、四頭筋、及び横隔膜を含むいくつかの筋肉を収集する。絶対筋力及び比筋力の測定は、腓腹筋で実行される。筋力測定は、筋肉組織病理学の完全性に負に影響を及ぼす可能性があるため(すなわち、イメージングについてそれらを非公表品質にする)、群ごとにいくつかの余分なマウスを任意選択的に注入して、組織病理学的分析のための質の高い画像を確実にする。
DUX4mRNAのレベルの低下が、未処理マウスの筋肉のレベルと比較して、U7-asDUX4で処理したマウスの筋肉で観察される。
実施例9
U7-asDUX4snRNAは、筋肉における内因性DUX4発現を減少させる
本開示のAAV.U7-asDUX4を、FSHDに罹患している患者に、筋肉内(IM)又は静脈内(IV)で注入する。治療前、並びに治療の4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、及び52週後、患者の筋肉中のDUX4mRNAの発現レベルを、qRT-PCR、RNAscope、又はddPCRによって生検筋肉中で測定する。
実施例9
U7-asDUX4snRNAは、筋肉における内因性DUX4発現を減少させる
本開示のAAV.U7-asDUX4を、FSHDに罹患している患者に、筋肉内(IM)又は静脈内(IV)で注入する。治療前、並びに治療の4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、及び52週後、患者の筋肉中のDUX4mRNAの発現レベルを、qRT-PCR、RNAscope、又はddPCRによって生検筋肉中で測定する。
DUX4mRNAのレベルの低下が、治療前の同じ患者の筋肉中のDUX4mRNAのレベルと比較して、U7-asDUX4で治療した患者の筋肉中に観察される。FSHD疾患症状の改善も観察される。
前述の説明は、理解の明確さのためだけに与えられ、本発明の範囲内の修正は、当業者には明らかであり得るため、不必要な制限がそこから理解されるべきではない。
本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈で別段の要求がない限り、「comprise(含む)」という単語、並びに「comprises(含む)」及び「comprising(含む)」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含めることを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。
本明細書及びその後の特許請求の範囲全体を通して、文脈で別段の要求がない限り、「comprise(含む)」という単語、並びに「comprises(含む)」及び「comprising(含む)」などの変形は、記載された整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含めることを意味するが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外することを意味しないと理解されたい。
本明細書全体にわたって、組成物が成分又は材料を含むと記載される場合、別段の記載がない限り、組成物は、列挙された成分又は材料の任意の組み合わせから本質的になるか、又はそれらからなることもできることが企図される。同様に、方法が特定のステップを含むと記載される場合、別途記載されない限り、方法はまた、列挙されたステップの任意の組み合わせから本質的になるか、又はそれらからなることができることが企図される。本明細書に例示的に開示される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素又はステップが存在せずに適切に行われ得る。
本明細書に開示される方法の実施、及びその個々のステップは、マニュアルで、かつ/又は電子装置の支援若しくはそれによって提供される自動化を用いて、行うことができる。プロセスが特定の実施形態を参照して記載されているが、当業者であれば、方法に関連する行為を行う他の方法を使用し得ることを容易に理解するであろう。例えば、ステップの様々な順序は、別途記載されていない限り、本方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく変更され得る。加えて、個々のステップのうちのいくつかは、組み合わせるか、省略するか、又は更に追加のステップに細分化することができる。
本明細書に引用される全ての特許、刊行物、及び参考文献は、参照により完全に組み込まれる。本開示と組み込まれた特許、刊行物、及び参考文献との間に矛盾がある場合、本開示が優先されるべきである。付番を伴う本明細書に言及される参考文献は、本明細書に以下に示されるように、全引用文献とともに提供される。
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本開示は、本開示の実施のための特定の方式を含むように見出されるか、又は提案される特定の実施形態に関して記載されている。本開示の様々な修正及び変形は、本開示の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本開示は、特定の実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本開示の方法は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、関連分野の当業者には明らかである方法を実行するための記載された方式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
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本開示は、本開示の実施のための特定の方式を含むように見出されるか、又は提案される特定の実施形態に関して記載されている。本開示の様々な修正及び変形は、本開示の範囲及び趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本開示は、特定の実施形態に関連して記載されているが、特許請求される本開示の方法は、かかる特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、関連分野の当業者には明らかである方法を実行するための記載された方式の様々な修正は、以下の特許請求の範囲内であることが意図されている。
Claims (28)
- U7二重ホメオボックス4(DUX4)アンチセンスリボ核酸(asRNA)をコードする核酸であって、
(a)配列番号1~18のうちのいずれか1つに示される配列と少なくとも90%の同一性を含むヌクレオチド配列、
(b)配列番号1~18のうちのいずれか1つに示されるヌクレオチド配列、又は
(c)(a)及び/若しくは(b)の前記ヌクレオチド配列の組み合わせ、を含む、核酸。 - 核酸であって、配列番号19~36のうちのいずれか1つに示される二重ホメオボックス4(DUX4)標的ヌクレオチド配列又は前記ヌクレオチド配列の組み合わせに特異的にハイブリダイズするU7DUX4アンチセンス配列をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
- プロモーターヌクレオチド配列を更に含む、請求項1又は2に記載の核酸。
- 前記プロモーターが、U6プロモーター、U7プロモーター、tRNAプロモーター、H1プロモーター、最小CMVプロモーター、T7プロモーター、EF1-アルファプロモーター、最小EF1-アルファプロモーター、又は筋肉特異的プロモーターのうちのいずれかである、請求項3に記載の核酸。
- 前記筋肉特異的プロモーターが、unc45bプロモーター、tMCKプロモーター、最小MCKプロモーター、CK6プロモーター、CK7プロモーター、MHCK7プロモーター、又はCK1プロモーターである、請求項4に記載の核酸。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸又はそれらのいずれか1つ以上の組み合わせを含む、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、又はベクター。
- 前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項6に記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、バキュロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、又は合成ウイルスである、請求項7に記載のウイルスベクター。
- 前記ウイルスベクターが、AAVである、請求項7又は8に記載のウイルスベクター。
- 前記AAVが、rep及びcap遺伝子を欠いている、請求項9に記載のウイルスベクター。
- 前記AAVが、組換えAAV(rAAV)又は自己相補的組換えAAV(scAAV)である、請求項9又は10に記載のウイルスベクター。
- 前記AAVが、rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10、rAAV11、rAAV12、rAAV13、rAAV-anc80、rAAVrh.74、rAAVrh.8、rAAVrh.10、又はrAAV-B1である、請求項9~11のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
- 前記AAVが、rAAV-9である、請求項9~12のいずれか一項に記載のウイルスベクター。
- 組成物であって、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、又は
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクターと、
薬学的に許容される担体と、を含む、組成物。 - 細胞における二重ホメオボックス4(DUX4)遺伝子の発現を阻害及び/又はそれに干渉する方法であって、前記細胞を、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、と接触させることを含む、方法。 - 筋ジストロフィーを有する対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、を投与することを含む、方法。 - 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕筋ジストロフィー(FSHD)である、請求項16に記載の方法。
- がんを有する対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、を投与することを含む、方法。 - 前記がんが、肉腫である、請求項18に記載の方法。
- 使用であって、細胞における二重ホメオボックス4(DUX4)遺伝子の発現を阻害するための医薬品の調製のための、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、
の使用。 - 使用であって、細胞における二重ホメオボックス4(DUX4)遺伝子の発現を阻害するための、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、
の使用。 - 使用であって、筋ジストロフィーを治療又は改善するための医薬品の調製のための、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、
の使用。 - 使用であって、筋ジストロフィーを治療又は改善するための、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、
の使用。 - 前記筋ジストロフィーが、顔面肩甲上腕筋ジストロフィーである、請求項22又は23に記載の使用。
- 使用であって、がんを治療又は改善するための医薬品の調製のための、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、
の使用。 - 使用であって、がんを治療又は改善するための、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、又は
(d)請求項14に記載の組成物、
の使用。 - 前記がんが、肉腫である、請求項25又は26に記載の使用。
- 前記核酸、ナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、ベクター、組成物、又は医薬品が、筋肉内注射、経皮輸送、又は血流への注入のために製剤化される、
(a)請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、
(b)請求項6に記載のナノ粒子、細胞外小胞、エクソソーム、若しくはベクター、
(c)請求項7~13のいずれか一項に記載のウイルスベクター、
(d)請求項14に記載の組成物、
(e)請求項15~19のいずれか一項に記載の方法、又は
(e)請求項20~27のいずれか一項の記載の使用。
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