JP2024043538A - B型肝炎ワクチンおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】操作B型肝炎ウイルス(HBV)による分子ワクチン構築物を提供する。【解決手段】1または複数の免疫応答誘導性B型肝炎ウイルス(HBV)ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しないポリヌクレオチドを提供する。ワクチン構築物はまた、宿主細胞内のサイトカインなど、異種遺伝子の発現をモジュレートするための、リガンド誘導性操作遺伝子スイッチ系も含みうる。【選択図】なし
Description
配列表への参照
電子的に提出され、本出願により出願された配列表(名称:2584_161PC01
_SeqListing_ST25;サイズ:372,514バイト;作成日:2019
年3月5日)の内容は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
電子的に提出され、本出願により出願された配列表(名称:2584_161PC01
_SeqListing_ST25;サイズ:372,514バイト;作成日:2019
年3月5日)の内容は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。
本開示の分野
本開示は、バイオインフォマティクスおよびタンパク質操作における、発展的原理の使
用を介してデザインされた、改善型広域スペクトルHBV分子ワクチンに関する。
本開示は、バイオインフォマティクスおよびタンパク質操作における、発展的原理の使
用を介してデザインされた、改善型広域スペクトルHBV分子ワクチンに関する。
慢性B型肝炎は、複数のウイルス(HepBまたはHBV)遺伝子型を伴う疾患である
。HBVの遺伝子型/遺伝子亜型は、肝疾患の重症度および抗ウイルス治療に対する応答
など、臨床的特徴およびウイルス学的特徴の差違との関連が、ますます大きくなっている
。HBVの感染は、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌(HCC)を結果としてもたらしう
る肝炎を引き起こす。HBVの診断は、血清学的所見に基づく。慢性HBV感染には、治
癒が存在しない。現在利用可能な処置選択肢は、肝硬変の進行およびウイルスの複製を緩
徐化し、HCCおよび肝不全の発生率を低減することを目的とする。
。HBVの遺伝子型/遺伝子亜型は、肝疾患の重症度および抗ウイルス治療に対する応答
など、臨床的特徴およびウイルス学的特徴の差違との関連が、ますます大きくなっている
。HBVの感染は、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌(HCC)を結果としてもたらしう
る肝炎を引き起こす。HBVの診断は、血清学的所見に基づく。慢性HBV感染には、治
癒が存在しない。現在利用可能な処置選択肢は、肝硬変の進行およびウイルスの複製を緩
徐化し、HCCおよび肝不全の発生率を低減することを目的とする。
本開示は、バイオインフォマティクスおよびタンパク質操作における発展的原理の使用
を介してデザインされた改善型広域スペクトルHBV分子ワクチンに関する。これらの新
規のHBVワクチンは、HBV関連疾患に対する治療用ワクチンとして使用することがで
きる。
を介してデザインされた改善型広域スペクトルHBV分子ワクチンに関する。これらの新
規のHBVワクチンは、HBV関連疾患に対する治療用ワクチンとして使用することがで
きる。
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特
許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場
合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特
許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場
合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書では、少なくとも1または複数の免疫応答誘導性B型肝炎ウイルス(HBV)
ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しない(non-naturally occu
rring)ポリヌクレオチドが提示される。
ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しない(non-naturally occu
rring)ポリヌクレオチドが提示される。
一部の実施形態では、前記天然に存在しないポリヌクレオチドは、前記1または複数の
HBVポリペプチドを含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、前記1また
は複数のHBVポリペプチドは、HBVコアペプチドを含む。一部の実施形態では、前記
HBVコアペプチドは、表3に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか1つを有する
。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、HBV表面ペプチドを含
む。一部の実施形態では、前記HBV表面ペプチドは、表3に示される表面ペプチド配列
のうちのいずれか1つを有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチ
ドは、HBV Polペプチドを含む。一部の実施形態では、前記HBV Polペプチ
ドは、表3に示されるPolペプチド配列のうちのいずれか1つを有する。一部の実施形
態では、前記1または複数のHBVペプチドは、HBV HBSP/HBxペプチドを含
む。一部の実施形態では、前記HBV HBSP/HBxペプチドは、表3に示されるH
BSP/HBxペプチド配列のうちのいずれか1つを有する。一部の実施形態では、前記
1または複数のHBVペプチドは、KKリンカーを含む。一部の実施形態では、前記KK
リンカーは、表3に示されるペプチド配列のうちのいずれか1つを、表3に示される他の
任意(any other)のペプチド配列へと接続する。
HBVポリペプチドを含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、前記1また
は複数のHBVポリペプチドは、HBVコアペプチドを含む。一部の実施形態では、前記
HBVコアペプチドは、表3に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか1つを有する
。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、HBV表面ペプチドを含
む。一部の実施形態では、前記HBV表面ペプチドは、表3に示される表面ペプチド配列
のうちのいずれか1つを有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチ
ドは、HBV Polペプチドを含む。一部の実施形態では、前記HBV Polペプチ
ドは、表3に示されるPolペプチド配列のうちのいずれか1つを有する。一部の実施形
態では、前記1または複数のHBVペプチドは、HBV HBSP/HBxペプチドを含
む。一部の実施形態では、前記HBV HBSP/HBxペプチドは、表3に示されるH
BSP/HBxペプチド配列のうちのいずれか1つを有する。一部の実施形態では、前記
1または複数のHBVペプチドは、KKリンカーを含む。一部の実施形態では、前記KK
リンカーは、表3に示されるペプチド配列のうちのいずれか1つを、表3に示される他の
任意(any other)のペプチド配列へと接続する。
本明細書では、本明細書で提示されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含み、異種
遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、1または複数のポリヌ
クレオチドをさらに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイ
ッチ系により調節され;前記異種遺伝子が、本明細書で記載されるポリヌクレオチドのう
ちのいずれかを含む、ポリヌクレオチドが提示される。一部の実施形態では、前記遺伝子
スイッチ系は、エクジソン受容体ベースの(EcRベースの)遺伝子スイッチ系である。
一部の実施形態では、前記1または複数のHBVポリペプチドは、ワクチンにおける使用
のためのHBVポリペプチドである。
遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、1または複数のポリヌ
クレオチドをさらに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイ
ッチ系により調節され;前記異種遺伝子が、本明細書で記載されるポリヌクレオチドのう
ちのいずれかを含む、ポリヌクレオチドが提示される。一部の実施形態では、前記遺伝子
スイッチ系は、エクジソン受容体ベースの(EcRベースの)遺伝子スイッチ系である。
一部の実施形態では、前記1または複数のHBVポリペプチドは、ワクチンにおける使用
のためのHBVポリペプチドである。
本明細書では、本明細書で提示されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含むベクタ
ーが提示される。一部の実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターである
。一部の実施形態では、前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクター
である。
ーが提示される。一部の実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターである
。一部の実施形態では、前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクター
である。
本明細書では、細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞へと、(
i)抑制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および(ii)発現が、前記遺
伝子スイッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子であって、1または複数のHB
Vポリペプチドのうちの少なくとも1つをコードする異種免疫応答誘導性遺伝子を含む、
1または複数のポリヌクレオチドを導入するステップと;前記細胞を、前記異種免疫応答
誘導性遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十分な量の化合物へと曝露するステップと
を含む方法が提示される。
i)抑制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および(ii)発現が、前記遺
伝子スイッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子であって、1または複数のHB
Vポリペプチドのうちの少なくとも1つをコードする異種免疫応答誘導性遺伝子を含む、
1または複数のポリヌクレオチドを導入するステップと;前記細胞を、前記異種免疫応答
誘導性遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十分な量の化合物へと曝露するステップと
を含む方法が提示される。
一部の実施形態では、前記標的細胞は、本明細書で記載される、細胞内の異種遺伝子の
発現を調節する方法における哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記遺伝子スイ
ッチは、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体、オーファン受容体1、NER
-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体相互作用性タンパク質15
、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容
体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用性タンパク質14、およびファルネソー
ル(famesol)受容体のうちの少なくとも1つに由来する、リガンド結合性ドメインを含
む。
発現を調節する方法における哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記遺伝子スイ
ッチは、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体、オーファン受容体1、NER
-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体相互作用性タンパク質15
、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容
体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用性タンパク質14、およびファルネソー
ル(famesol)受容体のうちの少なくとも1つに由来する、リガンド結合性ドメインを含
む。
本明細書では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物のうちのいずれかをコードす
るポリヌクレオチドが提示される。本明細書ではまた、前記ポリヌクレオチドを含むベク
ターも提示される。一部の実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターであ
る。一部の実施形態では、前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクタ
ーである。
るポリヌクレオチドが提示される。本明細書ではまた、前記ポリヌクレオチドを含むベク
ターも提示される。一部の実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターであ
る。一部の実施形態では、前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクタ
ーである。
本明細書では、少なくとも1つのHBVペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
ベクターであって、アデノウイルスベクターであるベクターが提示される。
ベクターであって、アデノウイルスベクターであるベクターが提示される。
本明細書では、少なくとも1つのHBVペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む
ベクターであって、前記ベクターが、アデノウイルスベクターであり、前記アデノウイル
スベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、ベクターが提示される。
ベクターであって、前記ベクターが、アデノウイルスベクターであり、前記アデノウイル
スベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、ベクターが提示される。
本明細書では、HBV HBxドメイン、およびHBV Polドメイン、HBVコア
ドメイン、HBVプレコアドメイン、またはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つ
を含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書ではまた、プレコアドメイン、および
HBV Polドメイン、HBV HBxドメイン、またはHBV表面ドメインのうちの
少なくとも1つを含むポリペプチド構築物も提示される。一部の実施形態では、前記HB
V HBxドメインは、配列番号98に示される配列を有する。一部の実施形態では、前
記HBV Polドメインは、野生型HBV Polドメインと比較した、少なくとも1
つのアミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態では、前記欠失は、前記野生型HBV Po
lドメインの欠失部分を含み、前記欠失部分は、アミノ酸538~544またはアミノ酸
710~742のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記欠失部分は、
アミノ酸538~544およびアミノ酸710~742の両方を含む。一部の実施形態で
は、前記HBV Polドメインは、配列番号99に示される配列を有する。一部の実施
形態では、前記HBV表面ドメインは、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、およびS
ドメインのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記HBV表面ドメイン
は、HBV Sドメインを含む。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、配列番号1
00に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、HBV
コアドメインをさらに含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、コア部分
を含み、前記コア部分は、前記HBVコアドメインと、前記HBVプレコアドメインとを
含む。一部の実施形態では、前記コア部分は、配列番号101に示される配列を有する。
一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、SHB(Env)ドメイン、HBeA
gドメイン、HBxドメイン、およびPolドメインの各々を含む。一部の実施形態では
、前記ポリペプチド構築物は、N末端から、C末端へと、前記SHB(Env)ドメイン
、HBeAgドメイン、HBxドメイン、およびPolドメインの構造を含む。一部の実
施形態では、前記SHB(Env)ドメインは、配列番号102に示される配列を有する
。一部の実施形態では、前記HBeAgドメインは、配列番号103に示される配列を有
する。一部の実施形態では、前記HBxドメインは、配列番号104に示される配列を有
する。一部の実施形態では、前記Polドメインは、配列番号105に示される配列を有
する。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号106に示される配列
を有する。
ドメイン、HBVプレコアドメイン、またはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つ
を含むポリペプチド構築物が提示される。本明細書ではまた、プレコアドメイン、および
HBV Polドメイン、HBV HBxドメイン、またはHBV表面ドメインのうちの
少なくとも1つを含むポリペプチド構築物も提示される。一部の実施形態では、前記HB
V HBxドメインは、配列番号98に示される配列を有する。一部の実施形態では、前
記HBV Polドメインは、野生型HBV Polドメインと比較した、少なくとも1
つのアミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態では、前記欠失は、前記野生型HBV Po
lドメインの欠失部分を含み、前記欠失部分は、アミノ酸538~544またはアミノ酸
710~742のうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記欠失部分は、
アミノ酸538~544およびアミノ酸710~742の両方を含む。一部の実施形態で
は、前記HBV Polドメインは、配列番号99に示される配列を有する。一部の実施
形態では、前記HBV表面ドメインは、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、およびS
ドメインのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記HBV表面ドメイン
は、HBV Sドメインを含む。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、配列番号1
00に示される配列を有する。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、HBV
コアドメインをさらに含む。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、コア部分
を含み、前記コア部分は、前記HBVコアドメインと、前記HBVプレコアドメインとを
含む。一部の実施形態では、前記コア部分は、配列番号101に示される配列を有する。
一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、SHB(Env)ドメイン、HBeA
gドメイン、HBxドメイン、およびPolドメインの各々を含む。一部の実施形態では
、前記ポリペプチド構築物は、N末端から、C末端へと、前記SHB(Env)ドメイン
、HBeAgドメイン、HBxドメイン、およびPolドメインの構造を含む。一部の実
施形態では、前記SHB(Env)ドメインは、配列番号102に示される配列を有する
。一部の実施形態では、前記HBeAgドメインは、配列番号103に示される配列を有
する。一部の実施形態では、前記HBxドメインは、配列番号104に示される配列を有
する。一部の実施形態では、前記Polドメインは、配列番号105に示される配列を有
する。一部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号106に示される配列
を有する。
本明細書では、1または複数のHBV HBxリンカー、ならびにコアドメイン、表面
ドメイン、およびPolドメインのうちの少なくとも1つを含み、前記コアドメイン、前
記表面ドメイン、および前記Polドメインのうちの1つのドメインが、前記1または複
数のHBxリンカーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Polド
メインのうちの別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物が提示される。一部の
実施形態では、前記表面ドメインは、HBVプレS1ドメイン、HBVプレS2ドメイン
、およびHBV Sドメインのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記
1または複数のHBV HBxリンカーは、複数のHBV HBxリンカーを含む。一部
の実施形態では、前記複数のHBV HBxリンカーのうちの、少なくとも2つは、アミ
ノ酸配列が異なる。一部の実施形態では、前記HBV HBxリンカーは、表3のHBx
-1、HBx-2、HBx-3、HBx-4、HBx-5、またはHBx-6のうちのい
ずれか1つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記コアドメインは、前記表
面ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、プレS1ドメインを
含む。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記1または複数のHBxリンカーの
うちの1つにより、前記コアドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記Pol
ドメインは、表面ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、プレ
S1ドメイン、プレS2ドメイン、およびSドメインのうちの少なくとも1つを含む。一
部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記プレS1ドメインを含み、前記Polドメ
インのN末端部分は、前記プレS1ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記Po
lドメインの、前記N末端部分は、前記1または複数のHBxリンカーのうちの1つによ
り、前記プレS1ドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、
前記プレS2ドメインを含み、前記PolドメインのN末端部分は、前記プレS2ドメイ
ンと隣接する。一部の実施形態では、前記Polドメインの、前記N末端部分は、前記1
または複数のHBxリンカーのうちの1つにより、前記プレS2ドメインへと接続される
。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記プレS2ドメインを含み、前記Pol
ドメインのC末端部分は、前記プレS2ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記
Polドメインの、前記C末端部分は、前記1または複数のHBxリンカーのうちの1つ
により、前記プレS2ドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記表面ドメイン
は、前記Sドメインを含み、前記PolドメインのC末端部分は、前記Sドメインと隣接
する。一部の実施形態では、前記Polドメインの、前記C末端部分は、前記1または複
数のHBxリンカーのうちの1つにより、前記Sドメインへと接続される。一部の実施形
態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号107に示される配列を有する。
ドメイン、およびPolドメインのうちの少なくとも1つを含み、前記コアドメイン、前
記表面ドメイン、および前記Polドメインのうちの1つのドメインが、前記1または複
数のHBxリンカーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Polド
メインのうちの別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物が提示される。一部の
実施形態では、前記表面ドメインは、HBVプレS1ドメイン、HBVプレS2ドメイン
、およびHBV Sドメインのうちの少なくとも1つを含む。一部の実施形態では、前記
1または複数のHBV HBxリンカーは、複数のHBV HBxリンカーを含む。一部
の実施形態では、前記複数のHBV HBxリンカーのうちの、少なくとも2つは、アミ
ノ酸配列が異なる。一部の実施形態では、前記HBV HBxリンカーは、表3のHBx
-1、HBx-2、HBx-3、HBx-4、HBx-5、またはHBx-6のうちのい
ずれか1つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記コアドメインは、前記表
面ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、プレS1ドメインを
含む。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記1または複数のHBxリンカーの
うちの1つにより、前記コアドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記Pol
ドメインは、表面ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、プレ
S1ドメイン、プレS2ドメイン、およびSドメインのうちの少なくとも1つを含む。一
部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記プレS1ドメインを含み、前記Polドメ
インのN末端部分は、前記プレS1ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記Po
lドメインの、前記N末端部分は、前記1または複数のHBxリンカーのうちの1つによ
り、前記プレS1ドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、
前記プレS2ドメインを含み、前記PolドメインのN末端部分は、前記プレS2ドメイ
ンと隣接する。一部の実施形態では、前記Polドメインの、前記N末端部分は、前記1
または複数のHBxリンカーのうちの1つにより、前記プレS2ドメインへと接続される
。一部の実施形態では、前記表面ドメインは、前記プレS2ドメインを含み、前記Pol
ドメインのC末端部分は、前記プレS2ドメインと隣接する。一部の実施形態では、前記
Polドメインの、前記C末端部分は、前記1または複数のHBxリンカーのうちの1つ
により、前記プレS2ドメインへと接続される。一部の実施形態では、前記表面ドメイン
は、前記Sドメインを含み、前記PolドメインのC末端部分は、前記Sドメインと隣接
する。一部の実施形態では、前記Polドメインの、前記C末端部分は、前記1または複
数のHBxリンカーのうちの1つにより、前記Sドメインへと接続される。一部の実施形
態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号107に示される配列を有する。
本明細書では、アンキリン様リピートドメイン、および1または複数のHBVペプチド
を含むポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、前記アンキリン様リピー
トタンパク質は、ヒトアンキリン様リピートタンパク質である。一部の実施形態では、前
記1または複数のHBVペプチドは、表3のアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示され
る配列を有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、コアペプ
チド、表面ペプチド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの1また
は複数を含む。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、コアペプチ
ドを含み、前記コアペプチドは、表3のコアアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示され
る配列を有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、表面ペプ
チドを含み、前記表面ペプチドは、表3の表面アミノ酸配列のうちのいずれか1つに示さ
れる配列を有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、Pol
ペプチドを含み、前記Polペプチドは、表3のPolアミノ酸配列のうちのいずれか1
つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは
、HBSP/HBxペプチドを含み、前記HBSP/HBxペプチドは、表3のHBSP
/HBxアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する。一部の実施形態で
は、前記ポリペプチド構築物は、配列番号108に示される配列を有する。
を含むポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では、前記アンキリン様リピー
トタンパク質は、ヒトアンキリン様リピートタンパク質である。一部の実施形態では、前
記1または複数のHBVペプチドは、表3のアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示され
る配列を有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、コアペプ
チド、表面ペプチド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの1また
は複数を含む。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、コアペプチ
ドを含み、前記コアペプチドは、表3のコアアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示され
る配列を有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、表面ペプ
チドを含み、前記表面ペプチドは、表3の表面アミノ酸配列のうちのいずれか1つに示さ
れる配列を有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは、Pol
ペプチドを含み、前記Polペプチドは、表3のPolアミノ酸配列のうちのいずれか1
つに示される配列を有する。一部の実施形態では、前記1または複数のHBVペプチドは
、HBSP/HBxペプチドを含み、前記HBSP/HBxペプチドは、表3のHBSP
/HBxアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する。一部の実施形態で
は、前記ポリペプチド構築物は、配列番号108に示される配列を有する。
本明細書では、表3に示される少なくとも2つのHBVアミノ酸配列を含み、前記少な
くとも2つのHBVアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリ
ンカーが、KKリンカーである、ポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では
、前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列は、表3に示されるコアペプチド、表面ペプ
チド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの少なくとも1つを含む
。一部の実施形態では、前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列は、表3に示されるア
ミノ酸配列の各々を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列の前記各々は、前記KKリ
ンカーにより、アミノ酸配列の前記各々のうちの、別のアミノ酸配列へと接続される。一
部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号109に示される配列を有する
。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物のうちのいずれかは、
ワクチンにおける使用のためのポリペプチド構築物である。本明細書ではまた、本明細書
で記載されるポリペプチド構築物のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提示
される。本明細書ではまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクターも提示される。一部の
実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、
前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクターである。
くとも2つのHBVアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリ
ンカーが、KKリンカーである、ポリペプチド構築物が提示される。一部の実施形態では
、前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列は、表3に示されるコアペプチド、表面ペプ
チド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの少なくとも1つを含む
。一部の実施形態では、前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列は、表3に示されるア
ミノ酸配列の各々を含む。一部の実施形態では、アミノ酸配列の前記各々は、前記KKリ
ンカーにより、アミノ酸配列の前記各々のうちの、別のアミノ酸配列へと接続される。一
部の実施形態では、前記ポリペプチド構築物は、配列番号109に示される配列を有する
。一部の実施形態では、本明細書で記載されるポリペプチド構築物のうちのいずれかは、
ワクチンにおける使用のためのポリペプチド構築物である。本明細書ではまた、本明細書
で記載されるポリペプチド構築物のうちのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提示
される。本明細書ではまた、前記ポリヌクレオチドを含むベクターも提示される。一部の
実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターである。一部の実施形態では、
前記アデノウイルスベクターは、ゴリラアデノウイルスベクターである。
図面の簡単な説明
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴
および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を
明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴
および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を
明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
発明の詳細な説明
以下の記載および例は、本開示の実施形態について、詳細に例示する。
以下の記載および例は、本開示の実施形態について、詳細に例示する。
本開示は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして
、変動しうることを理解されたい。当業者は、本開示には、変動および改変がなされ、こ
れらは、その範囲内に包含されることを認識するであろう。
、変動しうることを理解されたい。当業者は、本開示には、変動および改変がなされ、こ
れらは、その範囲内に包含されることを認識するであろう。
全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学
用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有
する。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学
用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有
する。
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主
題を限定するものとみなすべきではない。
題を限定するものとみなすべきではない。
本開示の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提
示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では
、明確さのために、本開示を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本開示はまた、単
一の実施形態でも、実施することができる。
示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では
、明確さのために、本開示を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本開示はまた、単
一の実施形態でも、実施することができる。
以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる
関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属し
ない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法およ
び材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料およ
び方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態
について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するもので
はない。
関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属し
ない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法およ
び材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料およ
び方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態
について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するもので
はない。
定義
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複
数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されな
い限りにおいて、単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」は、複数の
指示対象を含むことに注意しなければならない。
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複
数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されな
い限りにおいて、単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」は、複数の
指示対象を含むことに注意しなければならない。
本出願では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「お
よび/または」を意味する。本明細書で使用される、「および/または」および「これら
の任意の組合せ」という用語、ならびにそれらの文法的同等物は、互換的に使用すること
ができる。これらの用語は、任意の組合せが、具体的に想定されることを伝達しうる。例
示だけを目的として述べると、以下の、「A、B、および/またはC」または「A、B、
C、またはこれらの任意の組合せ」という語句は、「個別のA;個別のB;個別のC;A
およびB;BおよびC;AおよびC;ならびにA、B、およびC」を意味しうる。文脈に
より、選言的使用が言及されない限りにおいて、「または」という用語は、接続的に使用
することもでき、選言的に使用することもできる。
よび/または」を意味する。本明細書で使用される、「および/または」および「これら
の任意の組合せ」という用語、ならびにそれらの文法的同等物は、互換的に使用すること
ができる。これらの用語は、任意の組合せが、具体的に想定されることを伝達しうる。例
示だけを目的として述べると、以下の、「A、B、および/またはC」または「A、B、
C、またはこれらの任意の組合せ」という語句は、「個別のA;個別のB;個別のC;A
およびB;BおよびC;AおよびC;ならびにA、B、およびC」を意味しうる。文脈に
より、選言的使用が言及されない限りにおいて、「または」という用語は、接続的に使用
することもでき、選言的に使用することもできる。
さらに、「~を含むこと」という用語のほか、「~を含む」、「~を含む」、および「
含まれた」など、他の形態の使用も、非限定的である。
含まれた」など、他の形態の使用も、非限定的である。
本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または
「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、また
は特徴が、本開示の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、
必ずしも含まれないことを意味する。
「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、また
は特徴が、本開示の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、
必ずしも含まれないことを意味する。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「~を含むこと(comprising)」(「~を
含む(comprise)」および「~を含む(comprises)」など、「~を含むこと(comprisin
g)」の任意の形態)、「~を有すること」(「~を有する(have)」および「~を有す
る(has)」など、「~を有すること」の任意の形態)、「~を含むこと(including)」
(「~を含む(include)」および「~を含む(includes)」など、「~を含むこと(inc
luding)」の任意の形態)、または「~を含有すること」(「~を含有する(contain)
」および「~を含有する(contains)」など、「~を含有すること」の任意の形態)とい
う語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方
法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法
または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。
さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。
含む(comprise)」および「~を含む(comprises)」など、「~を含むこと(comprisin
g)」の任意の形態)、「~を有すること」(「~を有する(have)」および「~を有す
る(has)」など、「~を有すること」の任意の形態)、「~を含むこと(including)」
(「~を含む(include)」および「~を含む(includes)」など、「~を含むこと(inc
luding)」の任意の形態)、または「~を含有すること」(「~を含有する(contain)
」および「~を含有する(contains)」など、「~を含有すること」の任意の形態)とい
う語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方
法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法
または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。
さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。
基準数値に関して、本明細書で使用される、「約」という用語、およびその文法的同等
物は、数値自体、およびこの数値から±10%の範囲の値を含みうる。
物は、数値自体、およびこの数値から±10%の範囲の値を含みうる。
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される、特定の値についての
、許容可能な誤差範囲内であって、部分的に、値がどのようにして測定または決定される
のか、すなわち、測定系の限界に依存する誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当
技術分野における慣行に従い、1標準偏差または1標準偏差を超える範囲内を意味しうる
。代替的に、「約」は、所与の値の、最大で20%、例えば、最大で10%、最大で5%
、または最大で1%の範囲も意味しうる。別の例では、「約10」の量は、10および9
~11の任意の量を含む。さらに別の例では、基準数値との関係における「約」という用
語はまた、値±この値から10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、
または1%の範囲も含む。代替的に、特に、生物学的系または生物学的過程に関して、「
約」という用語は、値の桁数内、好ましくは、5倍以内、より好ましくは2倍以内も意味
しうる。特定の値を、本出願および特許請求の範囲において記載する場合、そうでないこ
とが言明されない限りにおいて、特定の値について、許容可能な誤差範囲内を意味する「
約」という用語を仮定すべきである。
、許容可能な誤差範囲内であって、部分的に、値がどのようにして測定または決定される
のか、すなわち、測定系の限界に依存する誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当
技術分野における慣行に従い、1標準偏差または1標準偏差を超える範囲内を意味しうる
。代替的に、「約」は、所与の値の、最大で20%、例えば、最大で10%、最大で5%
、または最大で1%の範囲も意味しうる。別の例では、「約10」の量は、10および9
~11の任意の量を含む。さらに別の例では、基準数値との関係における「約」という用
語はまた、値±この値から10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、
または1%の範囲も含む。代替的に、特に、生物学的系または生物学的過程に関して、「
約」という用語は、値の桁数内、好ましくは、5倍以内、より好ましくは2倍以内も意味
しうる。特定の値を、本出願および特許請求の範囲において記載する場合、そうでないこ
とが言明されない限りにおいて、特定の値について、許容可能な誤差範囲内を意味する「
約」という用語を仮定すべきである。
本明細書で使用される「単離」という用語およびその文法的同等物は、その天然環境か
らの核酸の摘出を意味する。本明細書で使用される「精製」という用語およびその文法的
同等物は、分子または組成物が、天然から摘出されたもの(ゲノムDNAおよびmRNA
を含む)であれ、合成されたもの(cDNAを含む)であれ、かつ/または検査室条件下
で増幅されたのであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であ
り、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤また
はアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているも
のとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、
許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。本明細書で使用される「実
質的に精製された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、ポリペプチド、タンパ
ク質、または他の化合物が、天然では会合する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペ
プチド、および他の分子を本質的に含まない、すなわち、約50%を超えて含まない、約
70%を超えて含まない、約90%を超えて含まない、核酸配列、ポリペプチド、タンパ
ク質または他の化合物を指す。
らの核酸の摘出を意味する。本明細書で使用される「精製」という用語およびその文法的
同等物は、分子または組成物が、天然から摘出されたもの(ゲノムDNAおよびmRNA
を含む)であれ、合成されたもの(cDNAを含む)であれ、かつ/または検査室条件下
で増幅されたのであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であ
り、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤また
はアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているも
のとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、
許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。本明細書で使用される「実
質的に精製された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、ポリペプチド、タンパ
ク質、または他の化合物が、天然では会合する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペ
プチド、および他の分子を本質的に含まない、すなわち、約50%を超えて含まない、約
70%を超えて含まない、約90%を超えて含まない、核酸配列、ポリペプチド、タンパ
ク質または他の化合物を指す。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレ
オチド構築物」、「遺伝子」、「遺伝子構築物」、「異種遺伝子」、およびこれらの文法
的同等物は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌ
クレオチドまたは核酸のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。
したがって、この用語は、二本鎖DNAおよび一本鎖DNA、三重鎖DNAのほか、二本
鎖RNAおよび一本鎖RNAも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチ
ル化および/またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形
態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドの
ほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。本明細書で開示または想定
される核酸配列およびベクターは、細胞へと、トランスフェクション、形質転換、または
形質導入により導入することができる。
オチド構築物」、「遺伝子」、「遺伝子構築物」、「異種遺伝子」、およびこれらの文法
的同等物は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌ
クレオチドまたは核酸のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。
したがって、この用語は、二本鎖DNAおよび一本鎖DNA、三重鎖DNAのほか、二本
鎖RNAおよび一本鎖RNAも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチ
ル化および/またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形
態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドの
ほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。本明細書で開示または想定
される核酸配列およびベクターは、細胞へと、トランスフェクション、形質転換、または
形質導入により導入することができる。
本明細書で使用される、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入
」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、1または複数の外因性ポリ
ヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトランスフェクショ
ン法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムDNA共沈殿法(例えば、Murray E. J. (
ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protoco
ls, Humana Press (1991)を参照されたい);DEAE-デキストラン法;電気穿孔法;
カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法;タングステン粒子促進型遺伝子銃
法(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990));およびリン酸ストロンチウムDNA共沈
殿法(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))を含む。ファージベクタ
ーまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細
胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、1または複数の外因性ポリ
ヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。当技術分野では、多くのトランスフェクショ
ン法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムDNA共沈殿法(例えば、Murray E. J. (
ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protoco
ls, Humana Press (1991)を参照されたい);DEAE-デキストラン法;電気穿孔法;
カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法;タングステン粒子促進型遺伝子銃
法(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990));およびリン酸ストロンチウムDNA共沈
殿法(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))を含む。ファージベクタ
ーまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細
胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
本明細書で使用される、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「ポリペプチド構築物」、
「ペプチド構築物」、およびこれらの文法的同等物は、アミノ酸残基のポリマーを指す。
「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化または所与
の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。本明細書で開
示されるポリペプチドおよびタンパク質(これらの機能的部分および機能的変異体を含む
)は、1または複数の、天然に存在するアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。
当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサン
カルボン酸、ノルロイシン、α-アミノ-n-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミ
ノメチルシステイン、trans-3-ヒドロキシプロリンおよびtrans-4-ヒド
ロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロ
ロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン、β-ヒド
ロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルア
ラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テト
ラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、
N’-ベンジル-N’-メチルリシン、N’,N’-ジベンジルリシン、6-ヒドロキシ
リシン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサン
カルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナ
ン)カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニル
アラニン、およびα-tert-ブチルグリシンを含む。本開示は、操作細胞内の、本明
細書で記載されるポリペプチドの発現が、ポリペプチド構築物の、1または複数のアミノ
酸の翻訳後修飾と関連しうることをさらに想定する。翻訳後修飾の非限定例は、リン酸化
、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化(N連結型およびO連結型
を含む)、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビ
キチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイ
ル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピオン化、
リポイル化、およびヨード化を含む。
「ペプチド構築物」、およびこれらの文法的同等物は、アミノ酸残基のポリマーを指す。
「成熟タンパク質」とは、全長タンパク質であり、任意選択で、グリコシル化または所与
の細胞内環境内のタンパク質に典型的な他の修飾を含むタンパク質である。本明細書で開
示されるポリペプチドおよびタンパク質(これらの機能的部分および機能的変異体を含む
)は、1または複数の、天然に存在するアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。
当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサン
カルボン酸、ノルロイシン、α-アミノ-n-デカン酸、ホモセリン、S-アセチルアミ
ノメチルシステイン、trans-3-ヒドロキシプロリンおよびtrans-4-ヒド
ロキシプロリン、4-アミノフェニルアラニン、4-ニトロフェニルアラニン、4-クロ
ロフェニルアラニン、4-カルボキシフェニルアラニン、β-フェニルセリン、β-ヒド
ロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α-ナフチルアラニン、シクロヘキシルア
ラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン-2-カルボン酸、1,2,3,4-テト
ラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、
N’-ベンジル-N’-メチルリシン、N’,N’-ジベンジルリシン、6-ヒドロキシ
リシン、オルニチン、α-アミノシクロペンタンカルボン酸、α-アミノシクロヘキサン
カルボン酸、α-アミノシクロヘプタンカルボン酸、α-(2-アミノ-2-ノルボルナ
ン)カルボン酸、α,γ-ジアミノ酪酸、α,β-ジアミノプロピオン酸、ホモフェニル
アラニン、およびα-tert-ブチルグリシンを含む。本開示は、操作細胞内の、本明
細書で記載されるポリペプチドの発現が、ポリペプチド構築物の、1または複数のアミノ
酸の翻訳後修飾と関連しうることをさらに想定する。翻訳後修飾の非限定例は、リン酸化
、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化(N連結型およびO連結型
を含む)、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビ
キチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイ
ル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピオン化、
リポイル化、およびヨード化を含む。
核酸および/または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配
列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および/またはタンパク質配列は、それ
らのコードDNAが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する
場合、「相同」である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で
記載される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾する
ことができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパ
ク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、2つまたはこれを超える核酸
またはタンパク質(またはこれらの配列)の間の配列同一性から推定される。相同性を確
立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と
共に変動するが、少なくとも25%の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベ
ルの配列同一性、例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、
95%、もしくは99%、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに
使用することができる。本明細書では、配列同一性百分率を決定するための方法(例えば
、デフォルトパラメータを使用する、BLASTPおよびBLASTN)について記載す
るが、これらは、一般に利用可能である。
列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および/またはタンパク質配列は、それ
らのコードDNAが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する
場合、「相同」である。相同な分子は、相同体と称する場合がある。例えば、本明細書で
記載される、任意の天然タンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発法により修飾する
ことができる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパ
ク質と相同なポリペプチドをコードする。相同性は一般に、2つまたはこれを超える核酸
またはタンパク質(またはこれらの配列)の間の配列同一性から推定される。相同性を確
立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と
共に変動するが、少なくとも25%の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベ
ルの配列同一性、例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、
95%、もしくは99%、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに
使用することができる。本明細書では、配列同一性百分率を決定するための方法(例えば
、デフォルトパラメータを使用する、BLASTPおよびBLASTN)について記載す
るが、これらは、一般に利用可能である。
ポリペプチドの、2つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、本明細書で使用
される、「同一」または「配列同一性」という用語およびその文法的同等物は、指定され
た比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、2つ
の配列内の残基を指す。本明細書で使用される「比較域」とは、少なくとも約20、通例
、約50~約200、より通例では、約100~約150の連続する位置によるセグメン
トであって、2つの配列を、最適にアライメントした後で、その中の配列を、同じ数の、
連続する位置による基準配列と比較しうるセグメントを指す。当技術分野では、比較のた
めの配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、Smith
and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム;Needleman
and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)のアライメントアルゴリズム;Pearson and
Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性検索法;これらのアル
ゴリズムのコンピュータ化された実装(Intelligentics、Mountai
n View Calif.によるPC/Geneプログラム内のCLUSTAL、Wi
sconsin Genetics Software Package、Geneti
cs Computer Group(GCG)、575 Science Dr.、M
adison、Wis.、U.S.A.における、GAP、BESTFIT、BLAST
、FASTA、およびTFASTAを含むがこれらに限定されない)により行うことがで
き、CLUSTALプログラムについては、Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (198
8)およびHiggins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)、Corpet et al., Nucleic Acid
s Res., 16:10881-10890 (1988)、Huang et al., Computer Applications in the Biosci
ences, 8:155-165 (1992)、およびPearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:
307-331 (1994)により十分に記載されている。アライメントはまた、目視および手作業の
アライメントにより実施されることも多い。実施形態の1つのクラスでは、本明細書のポ
リペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、BLASTP(もしくはCL
USTAL、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア)により測定される
通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも80%、85%、90%、98%の
99%、または100%同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載する
こともでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、BLAST
N(もしくはCLUSTAL、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア)
により測定される通り、基準核酸またはこの断片と50%、60%、70%、75%、8
0%、85%、90%、98%、99%、または100%同一でありうる。1つの分子が
、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、2
つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、前記百分率の残基は、2つの
分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを
意味する。
される、「同一」または「配列同一性」という用語およびその文法的同等物は、指定され
た比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、2つ
の配列内の残基を指す。本明細書で使用される「比較域」とは、少なくとも約20、通例
、約50~約200、より通例では、約100~約150の連続する位置によるセグメン
トであって、2つの配列を、最適にアライメントした後で、その中の配列を、同じ数の、
連続する位置による基準配列と比較しうるセグメントを指す。当技術分野では、比較のた
めの配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、Smith
and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム;Needleman
and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)のアライメントアルゴリズム;Pearson and
Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性検索法;これらのアル
ゴリズムのコンピュータ化された実装(Intelligentics、Mountai
n View Calif.によるPC/Geneプログラム内のCLUSTAL、Wi
sconsin Genetics Software Package、Geneti
cs Computer Group(GCG)、575 Science Dr.、M
adison、Wis.、U.S.A.における、GAP、BESTFIT、BLAST
、FASTA、およびTFASTAを含むがこれらに限定されない)により行うことがで
き、CLUSTALプログラムについては、Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (198
8)およびHiggins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)、Corpet et al., Nucleic Acid
s Res., 16:10881-10890 (1988)、Huang et al., Computer Applications in the Biosci
ences, 8:155-165 (1992)、およびPearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:
307-331 (1994)により十分に記載されている。アライメントはまた、目視および手作業の
アライメントにより実施されることも多い。実施形態の1つのクラスでは、本明細書のポ
リペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、BLASTP(もしくはCL
USTAL、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア)により測定される
通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも80%、85%、90%、98%の
99%、または100%同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載する
こともでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、BLAST
N(もしくはCLUSTAL、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア)
により測定される通り、基準核酸またはこの断片と50%、60%、70%、75%、8
0%、85%、90%、98%、99%、または100%同一でありうる。1つの分子が
、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、2
つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、前記百分率の残基は、2つの
分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを
意味する。
核酸配列またはアミノ酸配列に対して適用される「実質的に同一な」という用語および
その文法的同等物は、核酸配列またはアミノ酸配列が、上記で記載したプログラム、例え
ば、標準的なパラメータを使用するBLASTを使用する基準配列と比較して、少なくと
も90%の配列同一性、またはこれを超える配列同一性、少なくとも95%、少なくとも
98%、および少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例え
ば、BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列のための)は、デフォルトとして、11
のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を使
用する。アミノ酸配列のために、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワ
ード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス
を使用する(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参
照されたい)。配列同一性百分率は、2つの最適にアライメントされた配列を、比較域に
わたり比較することにより決定し、比較域内のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配
列の最適なアライメントのために、基準配列(付加または欠失を含まない)と比較して、
付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含みうる。百分率は、同一な核酸塩基またはア
ミノ酸残基が、両方の配列内で生じる位置の数を決定して、マッチさせた位置の数を求め
、マッチさせた位置の数を、比較域内の位置の総数で除し、結果に、100を乗じて、配
列同一性百分率を求めることにより計算する。複数の実施形態では、実質的な同一性は、
少なくとも約50残基の長さの配列の領域にわたり、少なくとも約100残基の領域にわ
たり存在し、複数の実施形態では、配列は、少なくとも約150残基にわたり、実質的に
同一である。複数の実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたり、実質的に同一で
ある。
その文法的同等物は、核酸配列またはアミノ酸配列が、上記で記載したプログラム、例え
ば、標準的なパラメータを使用するBLASTを使用する基準配列と比較して、少なくと
も90%の配列同一性、またはこれを超える配列同一性、少なくとも95%、少なくとも
98%、および少なくとも99%の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例え
ば、BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列のための)は、デフォルトとして、11
のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両方の鎖の比較を使
用する。アミノ酸配列のために、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワ
ード長(W)、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス
を使用する(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参
照されたい)。配列同一性百分率は、2つの最適にアライメントされた配列を、比較域に
わたり比較することにより決定し、比較域内のポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配
列の最適なアライメントのために、基準配列(付加または欠失を含まない)と比較して、
付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含みうる。百分率は、同一な核酸塩基またはア
ミノ酸残基が、両方の配列内で生じる位置の数を決定して、マッチさせた位置の数を求め
、マッチさせた位置の数を、比較域内の位置の総数で除し、結果に、100を乗じて、配
列同一性百分率を求めることにより計算する。複数の実施形態では、実質的な同一性は、
少なくとも約50残基の長さの配列の領域にわたり、少なくとも約100残基の領域にわ
たり存在し、複数の実施形態では、配列は、少なくとも約150残基にわたり、実質的に
同一である。複数の実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたり、実質的に同一で
ある。
「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的
単位として挙動する(すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である)か、また
は宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば
、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複
製および/または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを
接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、
バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望
の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメント
の発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿
主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサ
ー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現
ベクターは、ベクターの、宿主細胞のDNA配列へのライゲーションまたは組込みを伴わ
ずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選択
的圧の存在下で、宿主細胞内のDNAの染色体外セグメントとして存続する、「エピソー
ム発現ベクター」または「エピソーム」である(例えば、Conese et al., Gene Therapy,
11:1735-1742 (2004)を参照されたい)。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは、
エプスタイン-バー核抗原1(EBNA1)およびエプスタイン-バーウイルス(EBV
)複製起点(oriP)を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない。
ベクターである、pREP4、pCEP4、pREP7、ならびにInvitrogen
(Carlsbad、Calif.)製のpcDNA3.1およびStratagene
(LaJolla、Calif.)製のpBK-CMVは、EBNA1およびoriPの
代わりに、T抗原およびSV40の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定的
な例を表す。ベクターはまた、選択用マーカー遺伝子も含みうる。
単位として挙動する(すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である)か、また
は宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば
、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複
製および/または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを
接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、
バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望
の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメント
の発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿
主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサ
ー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現
ベクターは、ベクターの、宿主細胞のDNA配列へのライゲーションまたは組込みを伴わ
ずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。
一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選択
的圧の存在下で、宿主細胞内のDNAの染色体外セグメントとして存続する、「エピソー
ム発現ベクター」または「エピソーム」である(例えば、Conese et al., Gene Therapy,
11:1735-1742 (2004)を参照されたい)。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは、
エプスタイン-バー核抗原1(EBNA1)およびエプスタイン-バーウイルス(EBV
)複製起点(oriP)を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない。
ベクターである、pREP4、pCEP4、pREP7、ならびにInvitrogen
(Carlsbad、Calif.)製のpcDNA3.1およびStratagene
(LaJolla、Calif.)製のpBK-CMVは、EBNA1およびoriPの
代わりに、T抗原およびSV40の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定的
な例を表す。ベクターはまた、選択用マーカー遺伝子も含みうる。
本明細書で使用される、「アデノウイルス」という用語は、アデノウイルスの生活環に
参与する能力を保持し、例えば、破壊(例えば、超音波処理)、変性(例えば、熱または
溶媒の使用)、または架橋(例えば、ホルマリン架橋を介する)により、物理的に不活化
されていない、アデノウイルスを指す。「アデノウイルスの生活環」は、(1)ウイルス
の、細胞への結合および侵入、(2)アデノウイルスゲノムへの転写およびアデノウイル
スタンパク質への翻訳、(3)アデノウイルスゲノムの複製、ならびに(4)ウイルス粒
子のアセンブリーを含む(例えば、Fields Virology, 5th ed., Knipe et al. (eds.), L
ippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2006)を参照されたい)。本明細書
で使用される、「アデノウイルスベクター」という用語は、アデノウイルスゲノムが、ア
デノウイルスゲノムに照らして非天然である核酸配列に適合するように操作されたアデノ
ウイルスを指す。典型的に、アデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスへの遺
伝子導入のための、非天然の核酸配列の挿入に適合するように、アデノウイルスのアデノ
ウイルスゲノムへと、1または複数の突然変異(例えば、欠失、挿入、または置換)を導
入することにより作出される。
参与する能力を保持し、例えば、破壊(例えば、超音波処理)、変性(例えば、熱または
溶媒の使用)、または架橋(例えば、ホルマリン架橋を介する)により、物理的に不活化
されていない、アデノウイルスを指す。「アデノウイルスの生活環」は、(1)ウイルス
の、細胞への結合および侵入、(2)アデノウイルスゲノムへの転写およびアデノウイル
スタンパク質への翻訳、(3)アデノウイルスゲノムの複製、ならびに(4)ウイルス粒
子のアセンブリーを含む(例えば、Fields Virology, 5th ed., Knipe et al. (eds.), L
ippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2006)を参照されたい)。本明細書
で使用される、「アデノウイルスベクター」という用語は、アデノウイルスゲノムが、ア
デノウイルスゲノムに照らして非天然である核酸配列に適合するように操作されたアデノ
ウイルスを指す。典型的に、アデノウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスへの遺
伝子導入のための、非天然の核酸配列の挿入に適合するように、アデノウイルスのアデノ
ウイルスゲノムへと、1または複数の突然変異(例えば、欠失、挿入、または置換)を導
入することにより作出される。
本明細書で使用される「選択用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現させる
細胞を、対応する選択用薬剤の存在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択す
ることを可能とする核酸配列を指す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公
知であり、例えば、国際特許出願公開第1992/08796号パンフレットおよび同第
1994/28143号パンフレット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
7: 3567 (1980)、O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mul
ligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et a
l., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et
al., Science, 237: 901-903 (1987)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalsk
a & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 2
2: 817 (1980)、ならびに米国特許第5,122,464号明細書および同第5,770
,359号明細書において記載されている。
細胞を、対応する選択用薬剤の存在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択す
ることを可能とする核酸配列を指す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公
知であり、例えば、国際特許出願公開第1992/08796号パンフレットおよび同第
1994/28143号パンフレット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
7: 3567 (1980)、O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mul
ligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et a
l., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et
al., Science, 237: 901-903 (1987)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalsk
a & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 2
2: 817 (1980)、ならびに米国特許第5,122,464号明細書および同第5,770
,359号明細書において記載されている。
本明細書で使用される「コード配列」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド
のセグメントを指す。領域または配列には、5’末端の近傍では、開始コドンが結合し、
3’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディング
フレームと称することもできる。
のセグメントを指す。領域または配列には、5’末端の近傍では、開始コドンが結合し、
3’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディング
フレームと称することもできる。
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、DNAセグメントの、別のDN
Aセグメントへの、物理的な連結および/または機能的な連結であって、セグメントが、
それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコ
ードするDNA配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および/または
サイレンサーなどの調節配列に、DNA配列の転写のモジュレーションを、直接的または
間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている
。例えば、DNA配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において
、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲー
ションされており、DNA配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に
、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それ
が、それぞれ、DNA配列の転写を増加または減少させるように、DNA配列へとライゲ
ーションされている場合に、遺伝子産物をコードするDNA配列に作動可能に連結されて
いる。エンハンサーおよびサイレンサーは、DNA配列のコード領域の上流に位置する場
合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグ
ナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナ
ル配列のDNAは、ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されている。DN
A配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションによ
り、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、ア
ダプターまたはリンカーを介して達せられる。
Aセグメントへの、物理的な連結および/または機能的な連結であって、セグメントが、
それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコ
ードするDNA配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および/または
サイレンサーなどの調節配列に、DNA配列の転写のモジュレーションを、直接的または
間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている
。例えば、DNA配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において
、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲー
ションされており、DNA配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に
、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それ
が、それぞれ、DNA配列の転写を増加または減少させるように、DNA配列へとライゲ
ーションされている場合に、遺伝子産物をコードするDNA配列に作動可能に連結されて
いる。エンハンサーおよびサイレンサーは、DNA配列のコード領域の上流に位置する場
合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグ
ナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナ
ル配列のDNAは、ポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されている。DN
A配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションによ
り、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、ア
ダプターまたはリンカーを介して達せられる。
本明細書で使用される「~を誘導する」、「誘導」という用語、およびその文法的同等
物は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および
/またはプロモーターの発現の、何らかの基礎転写レベルと比べた上昇を指す。
物は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および
/またはプロモーターの発現の、何らかの基礎転写レベルと比べた上昇を指す。
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性DNA
配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント(例えば、リプレ
ッサータンパク質または核阻害性タンパク質)、または、ある特定の環境条件下で、プロ
モーター駆動性DNA配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化
学的エレメント(例えば、インデューサーまたはエンハンサー)を指す。
配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント(例えば、リプレ
ッサータンパク質または核阻害性タンパク質)、または、ある特定の環境条件下で、プロ
モーター駆動性DNA配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化
学的エレメント(例えば、インデューサーまたはエンハンサー)を指す。
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結
された核酸配列の転写を増大させるDNA配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコー
ド領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、DNA
のメチル化パターン、またはDNA構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異
なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌク
レオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である(例え
ば、ATCCなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から)。プロモ
ーター(一般に使用されるCMVプロモーターなど)を含む、多数のポリヌクレオチドは
また、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあ
り、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Igエンハンサー
」という用語は、免疫グロブリン(Ig)遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に
由来するエンハンサーエレメント(このようなエンハンサーは、例えば、重鎖(ミュー)
5’側エンハンサー、軽鎖(カッパ)5’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサ
ーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに3’側エンハンサーを含む)を指す(
一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New Y
ork (1993), pages 353-363、および米国特許第5,885,827号明細書を参照され
たい)。
された核酸配列の転写を増大させるDNA配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコー
ド領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、DNA
のメチル化パターン、またはDNA構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異
なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌク
レオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である(例え
ば、ATCCなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から)。プロモ
ーター(一般に使用されるCMVプロモーターなど)を含む、多数のポリヌクレオチドは
また、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあ
り、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Igエンハンサー
」という用語は、免疫グロブリン(Ig)遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に
由来するエンハンサーエレメント(このようなエンハンサーは、例えば、重鎖(ミュー)
5’側エンハンサー、軽鎖(カッパ)5’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサ
ーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに3’側エンハンサーを含む)を指す(
一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New Y
ork (1993), pages 353-363、および米国特許第5,885,827号明細書を参照され
たい)。
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す
。プロモーターは、DNAの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、
上流に(センス鎖の5’側領域に向かって)位置する。あるプロモーターが、細胞内の全
ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、
誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。本明細書で使用さ
れる「プロモーター活性」という用語およびその文法的同等物は、その活性が測定される
プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモータ
ー活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるRNA転写物の量を決定す
ることにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸
配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接
的に測定することもできる。
。プロモーターは、DNAの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、
上流に(センス鎖の5’側領域に向かって)位置する。あるプロモーターが、細胞内の全
ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、
誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。本明細書で使用さ
れる「プロモーター活性」という用語およびその文法的同等物は、その活性が測定される
プロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモータ
ー活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるRNA転写物の量を決定す
ることにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸
配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接
的に測定することもできる。
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子
または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。
誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、
組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。
誘導性プロモーターの非限定例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調
節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序
調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターを含む。誘
導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部または遺伝子スイッチでありうる。誘導性プ
ロモーターは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって
、誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジ
ソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それ
らの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、国際特許出願第2001/07
0816号パンフレット;同第2002/029075号パンフレット;同第2002/
066613号パンフレット;同第2002/066614号パンフレット;同第200
2/066612号パンフレット;同第2002/066615号パンフレット;同第2
003/027266号パンフレット;同第2003/027289号パンフレット;同
第2005/108617号パンフレット;同第2009/045370号パンフレット
;同第2009/048560号パンフレット;同第2010/042189号パンフレ
ット;同第2010/042189号パンフレット;同第2011/119773号パン
フレット号パンフレット;および同第2012/122025号パンフレット;ならびに
米国特許第7,091,038号明細書;同第7,776,587号明細書;同第7,8
07,417号明細書;同第8,202,718号明細書;同第8,105,825号明
細書;同第8,168,426号明細書;同第7,531,326号明細書;同第8,2
36,556号明細書;同第8,598,409号明細書;同第8,715,959号明
細書;同第7,601,508号明細書;同第7,829,676号明細書;同第7,9
19,269号明細書;同第8,030,067号明細書;同第7,563,879号明
細書;同第8,021,878号明細書;同第8,497,093号明細書;同第7,9
35,510号明細書;同第8,076,454号明細書;同第9,402,919号明
細書;同第9,493,540号明細書;同第9,249,207号明細書;および同第
9,492,482号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソン
ベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限定されない。
または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。
誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、
組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。
誘導性プロモーターの非限定例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調
節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序
調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターを含む。誘
導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部または遺伝子スイッチでありうる。誘導性プ
ロモーターは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって
、誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジ
ソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それ
らの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、国際特許出願第2001/07
0816号パンフレット;同第2002/029075号パンフレット;同第2002/
066613号パンフレット;同第2002/066614号パンフレット;同第200
2/066612号パンフレット;同第2002/066615号パンフレット;同第2
003/027266号パンフレット;同第2003/027289号パンフレット;同
第2005/108617号パンフレット;同第2009/045370号パンフレット
;同第2009/048560号パンフレット;同第2010/042189号パンフレ
ット;同第2010/042189号パンフレット;同第2011/119773号パン
フレット号パンフレット;および同第2012/122025号パンフレット;ならびに
米国特許第7,091,038号明細書;同第7,776,587号明細書;同第7,8
07,417号明細書;同第8,202,718号明細書;同第8,105,825号明
細書;同第8,168,426号明細書;同第7,531,326号明細書;同第8,2
36,556号明細書;同第8,598,409号明細書;同第8,715,959号明
細書;同第7,601,508号明細書;同第7,829,676号明細書;同第7,9
19,269号明細書;同第8,030,067号明細書;同第7,563,879号明
細書;同第8,021,878号明細書;同第8,497,093号明細書;同第7,9
35,510号明細書;同第8,076,454号明細書;同第9,402,919号明
細書;同第9,493,540号明細書;同第9,249,207号明細書;および同第
9,492,482号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソン
ベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限定されない。
「遺伝子スイッチ(gene switch)」または「遺伝子スイッチ(genetic switch)」と
いう用語は、プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、1または
複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発
現をモジュレートする、EcRベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系
または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞
ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、ならびにト
ランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適
用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を
含みうる。
いう用語は、プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを指し、例えば、1または
複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターを組み込んだ遺伝子の発
現をモジュレートする、EcRベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系
または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞
ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的なゲノミクス、ならびにト
ランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適
用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を
含みうる。
「Sleeping Beauty(SB)トランスポゾン系」とは、DNA配列を、
脊椎動物の染色体へと導入するための合成DNAトランスポゾン系を指す。系についての
、一部の例示的な実施形態については、例えば、米国特許第6,489,458号明細書
、同第8,227,432号明細書、同第9,228,180号明細書、および国際公開
第2016/145146号パンフレットにおいて記載されている。Sleeping
Beautyトランスポゾン系は、Sleeping Beauty(SB)トランスポ
ザーゼおよびSBトランスポゾンから構成される。複数の実施形態では、Sleepin
g Beautyトランスポゾン系は、SB11トランスポゾン系、SB100Xトラン
スポゾン系、またはSB110トランスポゾン系を含みうる。
脊椎動物の染色体へと導入するための合成DNAトランスポゾン系を指す。系についての
、一部の例示的な実施形態については、例えば、米国特許第6,489,458号明細書
、同第8,227,432号明細書、同第9,228,180号明細書、および国際公開
第2016/145146号パンフレットにおいて記載されている。Sleeping
Beautyトランスポゾン系は、Sleeping Beauty(SB)トランスポ
ザーゼおよびSBトランスポゾンから構成される。複数の実施形態では、Sleepin
g Beautyトランスポゾン系は、SB11トランスポゾン系、SB100Xトラン
スポゾン系、またはSB110トランスポゾン系を含みうる。
「トランスポゾン」または「転移性エレメント」(TE)とは、ゲノム内のその位置を
変化させ、場合によって、突然変異を創出するか、または復帰させ、細胞のゲノムサイズ
を変更するベクターDNA配列である。転移は、TEの重複を結果としてもたらすことが
多い。クラスIのTEは、2段階でコピーされる:まず、クラスIのTEは、DNAから
RNAへと転写され、次いで、産生されたRNAは、DNAへと逆転写される。次いで、
この、コピーされたDNAは、ゲノム内の新たな位置に挿入される。逆転写ステップは、
TE自身によりコードされうる逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特
徴は、HIVなどのレトロウイルスと同様である。クラスIIのTEによるカットアンド
ペースト転移機構は、RNA中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵
素により触媒される。あるトランスポザーゼは、DNA内の任意の標的部位に非特異的に
結合するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的DNA配列標的に結合する。トラン
スポザーゼは、標的部位において、互い違いの(staggered)切断をもたらす結果として
、5’側または3’側における、一本鎖のDNA突出(粘着(sticky)末端)をもたらす
。このステップは、DNAトランスポゾンを切り出し、次いで、DNAトランスポゾンは
、新たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるDNAポ
リメラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせるDNAリガーゼの活性とを伴う。こ
れは、標的部位の重複を結果としてもたらす。DNAトランスポゾンの挿入部位は、標的
DNA内が互い違いに切断され、DNAポリメラーゼにより埋められることにより創出さ
れうる短い直接リピート、およびそれに後続する、トランスポザーゼによるTEの切出し
に重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。カットアンドペーストTEは、ドナー
部位は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない、細胞周期のS期におい
て、転移が生じる場合に重複しうる。転移は、クラスI TEおよびクラスII TEの
いずれにおいても、自律型転移または非自律型転移として分類することができる。自律型
TEが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型TEは、移動するのに、別のTEの存
在を必要とする。これは、非自律型TEが、トランスポザーゼ(クラスIIの場合)また
は逆転写酵素(クラスIの場合)を欠くためであることが多い。
変化させ、場合によって、突然変異を創出するか、または復帰させ、細胞のゲノムサイズ
を変更するベクターDNA配列である。転移は、TEの重複を結果としてもたらすことが
多い。クラスIのTEは、2段階でコピーされる:まず、クラスIのTEは、DNAから
RNAへと転写され、次いで、産生されたRNAは、DNAへと逆転写される。次いで、
この、コピーされたDNAは、ゲノム内の新たな位置に挿入される。逆転写ステップは、
TE自身によりコードされうる逆転写酵素により触媒される。レトロトランスポゾンの特
徴は、HIVなどのレトロウイルスと同様である。クラスIIのTEによるカットアンド
ペースト転移機構は、RNA中間体を伴わない。転移は、いくつかのトランスポザーゼ酵
素により触媒される。あるトランスポザーゼは、DNA内の任意の標的部位に非特異的に
結合するのに対し、他のトランスポザーゼは、特異的DNA配列標的に結合する。トラン
スポザーゼは、標的部位において、互い違いの(staggered)切断をもたらす結果として
、5’側または3’側における、一本鎖のDNA突出(粘着(sticky)末端)をもたらす
。このステップは、DNAトランスポゾンを切り出し、次いで、DNAトランスポゾンは
、新たな標的部位へとライゲーションされるが、この過程は、ギャップを埋めるDNAポ
リメラーゼの活性と、糖リン酸骨格をつなぎ合わせるDNAリガーゼの活性とを伴う。こ
れは、標的部位の重複を結果としてもたらす。DNAトランスポゾンの挿入部位は、標的
DNA内が互い違いに切断され、DNAポリメラーゼにより埋められることにより創出さ
れうる短い直接リピート、およびそれに後続する、トランスポザーゼによるTEの切出し
に重要な一連の逆位リピートにより同定されうる。カットアンドペーストTEは、ドナー
部位は既に複製されているが、標的部位はまだ複製されていない、細胞周期のS期におい
て、転移が生じる場合に重複しうる。転移は、クラスI TEおよびクラスII TEの
いずれにおいても、自律型転移または非自律型転移として分類することができる。自律型
TEが、それ自身で移動しうるのに対し、非自律型TEは、移動するのに、別のTEの存
在を必要とする。これは、非自律型TEが、トランスポザーゼ(クラスIIの場合)また
は逆転写酵素(クラスIの場合)を欠くためであることが多い。
「トランスポザーゼ」とは、トランスポゾンの末端に結合し、カットアンドペースト機
構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒す
る酵素を指す。
構または複製性転移機構による、トランスポゾンの、ゲノムの別の部分への移動を触媒す
る酵素を指す。
本明細書で使用される「T細胞」または「Tリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において
、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「T細胞」または「Tリンパ球」は、
細胞表面上のT細胞受容体(TCR)の存在により、B細胞およびナチュラルキラー細胞
(NK細胞)など、他のリンパ球と区別されうる。
、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「T細胞」または「Tリンパ球」は、
細胞表面上のT細胞受容体(TCR)の存在により、B細胞およびナチュラルキラー細胞
(NK細胞)など、他のリンパ球と区別されうる。
「ヘルパーT細胞」(TH細胞)は、B細胞の、血漿細胞およびメモリーB細胞への成
熟、ならびに細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、
他の白血球を支援する。これらの細胞はまた、細胞表面上において、CD4糖タンパク質
を発現するために、CD4+ T細胞としても公知である。ヘルパーT細胞は、抗原提示
細胞(APC)の表面上で発現する、MHCクラスII分子により、ペプチド抗原を提示
されると、活性化する。活性化すると、ヘルパーT細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応
答を調節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質
を分泌する。これらの細胞は、TH1、TH2、TH3、TH9、TH17、TH22、
またはTFH(濾胞性ヘルパーT細胞)を含む、いくつかの亜型であって、異なるサイト
カインを分泌して、異なる種類の免疫応答を容易とする、いくつかの亜型のうちの1つへ
と分化しうる。APCからのシグナル伝達は、T細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
熟、ならびに細胞傷害性T細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫過程において、
他の白血球を支援する。これらの細胞はまた、細胞表面上において、CD4糖タンパク質
を発現するために、CD4+ T細胞としても公知である。ヘルパーT細胞は、抗原提示
細胞(APC)の表面上で発現する、MHCクラスII分子により、ペプチド抗原を提示
されると、活性化する。活性化すると、ヘルパーT細胞は、急速に分裂し、活性の免疫応
答を調節するか、またはこれらを支援する、サイトカインと呼ばれる、小型のタンパク質
を分泌する。これらの細胞は、TH1、TH2、TH3、TH9、TH17、TH22、
またはTFH(濾胞性ヘルパーT細胞)を含む、いくつかの亜型であって、異なるサイト
カインを分泌して、異なる種類の免疫応答を容易とする、いくつかの亜型のうちの1つへ
と分化しうる。APCからのシグナル伝達は、T細胞を、特定の亜型へと方向付ける。
「細胞傷害性T細胞」(TC細胞またはCTL)または「細胞傷害性Tリンパ球」は、
ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶にも関与している。これらの
細胞はまた、それらの表面において、CD8糖タンパク質を発現するので、CD8+ T
細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、MHC
クラスI分子と会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性T
細胞により分泌される、IL-10、アデノシン、および他の分子を介して、CD8+細
胞は、アネルギー状態へと不活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止す
る。
ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また、移植拒絶にも関与している。これらの
細胞はまた、それらの表面において、CD8糖タンパク質を発現するので、CD8+ T
細胞としても公知である。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在する、MHC
クラスI分子と会合する抗原に結合することにより、それらの標的を認識する。調節性T
細胞により分泌される、IL-10、アデノシン、および他の分子を介して、CD8+細
胞は、アネルギー状態へと不活化される場合があり、これにより、自己免疫疾患を防止す
る。
「メモリーT細胞」は、感染が消失した後で、長期にわたり存続する、抗原特異的T細
胞のサブセットである。メモリーT細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると
、多数のエフェクターT細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染
に対する「メモリー」をもたらす。メモリーT細胞は、3つの亜型:セントラルメモリー
T細胞(TCM細胞)および2種類のエフェクターメモリーT細胞(TEM細胞およびT
EMRA細胞)を含む。メモリー細胞は、CD4+細胞の場合もあり、CD8+細胞の場
合もある。メモリーT細胞は、典型的には細胞表面タンパク質である、CD45RO、C
D45RA、および/またはCCR7を発現する。
胞のサブセットである。メモリーT細胞は、それらのコグネイト抗原へと再曝露されると
、多数のエフェクターT細胞へと急速に拡大増殖し、これにより、免疫系に、過去の感染
に対する「メモリー」をもたらす。メモリーT細胞は、3つの亜型:セントラルメモリー
T細胞(TCM細胞)および2種類のエフェクターメモリーT細胞(TEM細胞およびT
EMRA細胞)を含む。メモリー細胞は、CD4+細胞の場合もあり、CD8+細胞の場
合もある。メモリーT細胞は、典型的には細胞表面タンパク質である、CD45RO、C
D45RA、および/またはCCR7を発現する。
かつては、サプレッサーT細胞として公知であった、「調節性T細胞」(Treg細胞
)は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性T細胞の主要な役割は、T細胞媒介
性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性T
細胞を抑制することである。
)は、免疫寛容の維持において役割を果たす。調節性T細胞の主要な役割は、T細胞媒介
性免疫を遮断して、免疫反応を終了させ、胸腺内の陰性選択過程を回避した自己反応性T
細胞を抑制することである。
「ナチュラルキラーT細胞」(NKT細胞(自然免疫系のナチュラルキラー細胞と混同
しないこと))は、獲得免疫系を、自然免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体(M
HC)分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のT細胞と異なり、NKT細胞
は、CD1dと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。活性化すると、こ
れらの細胞は、Tヘルパー(TH)細胞および細胞傷害性T(TC)細胞の両方に帰せら
れた機能(すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性/細胞殺滅分子の放出)を果
たしうる。NKT細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を
認識し、これらを消失させることも可能である。
しないこと))は、獲得免疫系を、自然免疫系と橋渡しする。主要組織適合性複合体(M
HC)分子により提示されるペプチド抗原を認識する従来のT細胞と異なり、NKT細胞
は、CD1dと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。活性化すると、こ
れらの細胞は、Tヘルパー(TH)細胞および細胞傷害性T(TC)細胞の両方に帰せら
れた機能(すなわち、サイトカインの産生および細胞溶解性/細胞殺滅分子の放出)を果
たしうる。NKT細胞はまた、一部の腫瘍細胞およびヘルペスウイルスに感染した細胞を
認識し、これらを消失させることも可能である。
「養子T細胞移入」とは、腫瘍特異的T細胞の単離およびex vivoにおける拡大
増殖であって、ワクチン接種単独または患者の天然の腫瘍応答により得られうる数の細胞
より大きな数のT細胞を達成する、単離および拡大増殖を指す。次いで、それらの免疫系
に、がんに攻撃し、これらを死滅させうるT細胞を介して、残りの腫瘍を圧倒する能力を
もたらそうとする試みにおいて、がんを伴う患者へと、腫瘍特異的T細胞を輸注する。が
ん処置のための、養子T細胞療法の多くの形態であって、腫瘍浸潤リンパ球またはTIL
を培養する形態と、1つの特定のT細胞またはクローンを単離および拡大増殖させる形態
とが使用されており、なお、腫瘍を強力に認識し、これらに攻撃するように操作されたT
細胞を使用する形態も使用されている。
増殖であって、ワクチン接種単独または患者の天然の腫瘍応答により得られうる数の細胞
より大きな数のT細胞を達成する、単離および拡大増殖を指す。次いで、それらの免疫系
に、がんに攻撃し、これらを死滅させうるT細胞を介して、残りの腫瘍を圧倒する能力を
もたらそうとする試みにおいて、がんを伴う患者へと、腫瘍特異的T細胞を輸注する。が
ん処置のための、養子T細胞療法の多くの形態であって、腫瘍浸潤リンパ球またはTIL
を培養する形態と、1つの特定のT細胞またはクローンを単離および拡大増殖させる形態
とが使用されており、なお、腫瘍を強力に認識し、これらに攻撃するように操作されたT
細胞を使用する形態も使用されている。
本明細書で使用される「抗体」とは、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を
指す。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、B細胞の単一のクロ
ーンにより産生され、同じエピトープに結合する抗体を指す。これに対し、「ポリクロー
ナル抗体」とは、異なるB細胞により産生され、同じ抗原の異なるエピトープに結合する
抗体の集団を指す。全抗体は、典型的に、4つのポリペプチド:重(H)鎖ポリペプチド
の2つの同一なコピー、および軽(L)鎖ポリペプチドの2つの同一なコピーからなる。
重鎖の各々は、1つのN末端の可変(VH)領域と、3つのC末端の定常(CH1、CH
2、およびCH3)領域とを含有し、各軽鎖は、1つのN末端の可変(VL)領域と、1
つのC末端の定常(CL)領域とを含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体
の抗原結合性部位を形成する。VH領域と、VL領域とは、各領域が、それらの配列が比
較的保存されている、4つのフレームワーク領域を含む、共通の一般的な構造を有する。
フレームワーク領域は、3つの相補性決定領域(CDR)により接続されている。CDR
1、CDR2、およびCDR3として公知である、3つのCDRは、抗原への結合の一因
となる、抗体の「超可変領域」を形成する。
指す。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、B細胞の単一のクロ
ーンにより産生され、同じエピトープに結合する抗体を指す。これに対し、「ポリクロー
ナル抗体」とは、異なるB細胞により産生され、同じ抗原の異なるエピトープに結合する
抗体の集団を指す。全抗体は、典型的に、4つのポリペプチド:重(H)鎖ポリペプチド
の2つの同一なコピー、および軽(L)鎖ポリペプチドの2つの同一なコピーからなる。
重鎖の各々は、1つのN末端の可変(VH)領域と、3つのC末端の定常(CH1、CH
2、およびCH3)領域とを含有し、各軽鎖は、1つのN末端の可変(VL)領域と、1
つのC末端の定常(CL)領域とを含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体
の抗原結合性部位を形成する。VH領域と、VL領域とは、各領域が、それらの配列が比
較的保存されている、4つのフレームワーク領域を含む、共通の一般的な構造を有する。
フレームワーク領域は、3つの相補性決定領域(CDR)により接続されている。CDR
1、CDR2、およびCDR3として公知である、3つのCDRは、抗原への結合の一因
となる、抗体の「超可変領域」を形成する。
「抗体様分子」は、例えば、パートナーに選択的に結合することが可能な、Igスーパ
ーファミリーのメンバーであるタンパク質でありうる。MHC分子およびT細胞受容体は
、このような分子である。一実施形態では、抗体様分子は、TCRである。一実施形態で
は、TCRは、そのMHCへの結合アフィニティーを増大させるように改変されている。
ーファミリーのメンバーであるタンパク質でありうる。MHC分子およびT細胞受容体は
、このような分子である。一実施形態では、抗体様分子は、TCRである。一実施形態で
は、TCRは、そのMHCへの結合アフィニティーを増大させるように改変されている。
本明細書では、「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の機能的断片」、「抗原結合性
部分」という用語、またはこれらの文法的同等物を、抗原に特異的に結合する能力を保持
する抗体の、1または複数の断片または部分を意味するように、互換的に使用する(一般
に、Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)を参照されたい)。抗体
断片は、例えば、1もしくは複数のCDR、可変領域(またはこの部分)、定常領域(ま
たはこの部分)、またはこれらの組合せを含むことが所望される。抗体断片の非限定例は
、(i)VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一
価断片である、Fab断片;(ii)ストーク領域におけるジスルフィド架橋により連結
された2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab’)2断片;(iii)抗体の
単一のアームのVLドメインおよびVHドメインからなる、Fv断片;(iv)2つのド
メインを、単一のポリペプチド鎖として合成することを可能とする合成リンカーにより接
合された、Fv断片の2つのドメイン(すなわち、VLおよびVH)からなる一価分子で
ある、単鎖Fv(scFv)(例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); H
uston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et a
l., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照されたい);ならびに(v)各ポリペプチ
ド鎖が、同じポリペプチド鎖上のVHとVLとの間の対合を可能とするには短すぎるペプ
チドリンカーにより、VLへと接続されたVHを含み、これにより、2つの機能的な抗原
結合性部位を有する二量体分子を作出するように、異なるVH-VLポリペプチド鎖上の
相補的ドメインの間の対合を駆動する、ポリペプチド鎖の二量体である、ダイアボディー
を含む。当技術分野では、抗体断片が公知であり、例えば、米国特許第8,603,95
0号明細書において、より詳細に記載されている。
部分」という用語、またはこれらの文法的同等物を、抗原に特異的に結合する能力を保持
する抗体の、1または複数の断片または部分を意味するように、互換的に使用する(一般
に、Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)を参照されたい)。抗体
断片は、例えば、1もしくは複数のCDR、可変領域(またはこの部分)、定常領域(ま
たはこの部分)、またはこれらの組合せを含むことが所望される。抗体断片の非限定例は
、(i)VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一
価断片である、Fab断片;(ii)ストーク領域におけるジスルフィド架橋により連結
された2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab’)2断片;(iii)抗体の
単一のアームのVLドメインおよびVHドメインからなる、Fv断片;(iv)2つのド
メインを、単一のポリペプチド鎖として合成することを可能とする合成リンカーにより接
合された、Fv断片の2つのドメイン(すなわち、VLおよびVH)からなる一価分子で
ある、単鎖Fv(scFv)(例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); H
uston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et a
l., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照されたい);ならびに(v)各ポリペプチ
ド鎖が、同じポリペプチド鎖上のVHとVLとの間の対合を可能とするには短すぎるペプ
チドリンカーにより、VLへと接続されたVHを含み、これにより、2つの機能的な抗原
結合性部位を有する二量体分子を作出するように、異なるVH-VLポリペプチド鎖上の
相補的ドメインの間の対合を駆動する、ポリペプチド鎖の二量体である、ダイアボディー
を含む。当技術分野では、抗体断片が公知であり、例えば、米国特許第8,603,95
0号明細書において、より詳細に記載されている。
「抗原認識部分」または「抗原認識ドメイン」とは、抗原に特異的に結合する分子また
は分子の部分を指す。一実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、またはこれ
らの断片であり、抗原は、腫瘍抗原である。
は分子の部分を指す。一実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、またはこれ
らの断片であり、抗原は、腫瘍抗原である。
「保存的アミノ酸置換」または「保存的突然変異」という用語は、1つのアミノ酸の、
共通の特性を伴う、別のアミノ酸による置き換えを指す。個別のアミノ酸の間の共通の特
性を規定する、機能的な方式は、相同な生物の、対応するタンパク質の間の、アミノ酸変
化の標準化頻度を解析することである(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principle
s of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979))。このような解析に従い
、群内のアミノ酸が、互いと優先的に交換され、したがって、全体的なタンパク質構造に
対するそれらの影響において、最も互いと相似する、アミノ酸群を規定することができる
(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.、前出)。保存的突然変異の例は、上記の亜群内
のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、正の電荷を維持しうるような、リシンによる、アル
ギニンの置換、およびこの逆の置換;負の電荷を維持しうるような、グルタミン酸による
、アスパラギン酸の置換、およびこの逆の置換;遊離-OHを維持しうるような、セリン
による、トレオニンの置換;ならびに遊離-NH2を維持しうるような、グルタミンによ
る、アスパラギンの置換を含む。代替的に、または加えて、機能的変異体は、少なくとも
1つの非保存的アミノ酸置換を伴う、基準タンパク質のアミノ酸配列を含みうる。
共通の特性を伴う、別のアミノ酸による置き換えを指す。個別のアミノ酸の間の共通の特
性を規定する、機能的な方式は、相同な生物の、対応するタンパク質の間の、アミノ酸変
化の標準化頻度を解析することである(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principle
s of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979))。このような解析に従い
、群内のアミノ酸が、互いと優先的に交換され、したがって、全体的なタンパク質構造に
対するそれらの影響において、最も互いと相似する、アミノ酸群を規定することができる
(Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.、前出)。保存的突然変異の例は、上記の亜群内
のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、正の電荷を維持しうるような、リシンによる、アル
ギニンの置換、およびこの逆の置換;負の電荷を維持しうるような、グルタミン酸による
、アスパラギン酸の置換、およびこの逆の置換;遊離-OHを維持しうるような、セリン
による、トレオニンの置換;ならびに遊離-NH2を維持しうるような、グルタミンによ
る、アスパラギンの置換を含む。代替的に、または加えて、機能的変異体は、少なくとも
1つの非保存的アミノ酸置換を伴う、基準タンパク質のアミノ酸配列を含みうる。
「非保存的突然変異」という用語は、異なる群の間のアミノ酸置換、例えば、リシンに
よるトリプトファンの置換、またはフェニルアラニンによるセリンの置換などを伴う。こ
の場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性に干渉したり、これを阻
害したりしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性
が、親タンパク質と比較して増大するように、機能的変異体の生物学的活性を増強しうる
。
よるトリプトファンの置換、またはフェニルアラニンによるセリンの置換などを伴う。こ
の場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性に干渉したり、これを阻
害したりしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性
が、親タンパク質と比較して増大するように、機能的変異体の生物学的活性を増強しうる
。
「アンキリン」という用語は、内在性膜タンパク質の、スペクトリン-アクチンベース
の膜細胞骨格への接合を媒介する、アダプタータンパク質のファミリーを指す。アンキリ
ンは、スペクトリンのベータサブユニット、および内在性膜タンパク質の、少なくとも1
2のファミリーに対する結合性部位を有する。この連結は、細胞膜の完全性を維持し、細
胞膜内の、特異的なイオンチャネル、イオン交換体、およびイオン輸送体にアンカリング
するのに必要とされる。アンキリンは、4つの機能的ドメイン:24のタンデムアンキリ
ンリピートを含有するN末端ドメイン、スペクトリンに結合する中央ドメイン、アポトー
シスに関与するタンパク質に結合する死ドメイン、異なるアンキリンタンパク質の間で高
度に可変的な、C末端調節ドメインを含有する。24のタンデムアンキリンリピートは、
広範にわたる膜タンパク質の認識の一因となる。これらの24のリピートは、1~14リ
ピートの範囲の、3つの、構造的に顕著に異なる結合性部位を含有する。これらの結合性
部位は、互いに対して半独立性であり、組み合わせて使用することができる。部位が、膜
タンパク質に結合するのに使用する相互作用は、非特異性であり、水素結合、疎水性相互
作用、および静電相互作用からなる。配列は、アミノ酸の特性を保存しなくてもよいので
、これらの非特異性相互作用は、アンキリンに、広範にわたるタンパク質を認識する特性
を与える。半独立性とは、結合性部位が使用されない場合、結合の全体に対して、大きな
影響を及ぼさないことを意味する。これらの2つの特性の組合せは、アンキリンが認識し
うるタンパク質の、大きなレパートリーをもたらす。哺乳動物では、アンキリンは、3つ
の遺伝子(ANK1、ANK2、およびANK3)によりコードされる。各遺伝子は、代
替的スプライシングを介して、複数のタンパク質をもたらす。
の膜細胞骨格への接合を媒介する、アダプタータンパク質のファミリーを指す。アンキリ
ンは、スペクトリンのベータサブユニット、および内在性膜タンパク質の、少なくとも1
2のファミリーに対する結合性部位を有する。この連結は、細胞膜の完全性を維持し、細
胞膜内の、特異的なイオンチャネル、イオン交換体、およびイオン輸送体にアンカリング
するのに必要とされる。アンキリンは、4つの機能的ドメイン:24のタンデムアンキリ
ンリピートを含有するN末端ドメイン、スペクトリンに結合する中央ドメイン、アポトー
シスに関与するタンパク質に結合する死ドメイン、異なるアンキリンタンパク質の間で高
度に可変的な、C末端調節ドメインを含有する。24のタンデムアンキリンリピートは、
広範にわたる膜タンパク質の認識の一因となる。これらの24のリピートは、1~14リ
ピートの範囲の、3つの、構造的に顕著に異なる結合性部位を含有する。これらの結合性
部位は、互いに対して半独立性であり、組み合わせて使用することができる。部位が、膜
タンパク質に結合するのに使用する相互作用は、非特異性であり、水素結合、疎水性相互
作用、および静電相互作用からなる。配列は、アミノ酸の特性を保存しなくてもよいので
、これらの非特異性相互作用は、アンキリンに、広範にわたるタンパク質を認識する特性
を与える。半独立性とは、結合性部位が使用されない場合、結合の全体に対して、大きな
影響を及ぼさないことを意味する。これらの2つの特性の組合せは、アンキリンが認識し
うるタンパク質の、大きなレパートリーをもたらす。哺乳動物では、アンキリンは、3つ
の遺伝子(ANK1、ANK2、およびANK3)によりコードされる。各遺伝子は、代
替的スプライシングを介して、複数のタンパク質をもたらす。
本明細書で言及される「増殖性疾患」とは、細胞の過剰な増殖および/または細胞マト
リックスの過剰な代謝回転が、がんを含む疾患の発症機序に著明に寄与する、という統一
的概念を指す。
リックスの過剰な代謝回転が、がんを含む疾患の発症機序に著明に寄与する、という統一
的概念を指す。
本明細書で使用される「患者」または「対象」とは、がんなどの増殖性障害を伴うと診
断されるか、またはこれを有するかもしくは発症することが疑われる哺乳動物対象を指す
。一部の実施形態では、「患者」という用語は、がんなどの増殖性障害を発症する可能性
が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ
、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯動物、および本明細書で開示される療法から利益を得
うる、他の哺乳動物でありうる。例示的なヒト患者は、男性および/または女性でありう
る。本明細書では、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」を、例え
ば慢性B型肝炎ウイルス感染であるが、これに限定されない疾患または障害を伴うと診断
されているか、またはこれを有することか疑われる患者とみなす。
断されるか、またはこれを有するかもしくは発症することが疑われる哺乳動物対象を指す
。一部の実施形態では、「患者」という用語は、がんなどの増殖性障害を発症する可能性
が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ
、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯動物、および本明細書で開示される療法から利益を得
うる、他の哺乳動物でありうる。例示的なヒト患者は、男性および/または女性でありう
る。本明細書では、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」を、例え
ば慢性B型肝炎ウイルス感染であるが、これに限定されない疾患または障害を伴うと診断
されているか、またはこれを有することか疑われる患者とみなす。
本明細書では、「~を投与すること」は、本明細書で記載される、1または複数の組成
物を、患者または対象に施すこととみなす。例を目的として、限定せずに述べると、組成
物の投与、例えば、注射は、静脈内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i
.d.)注射、腹腔内(i.p.)注射、または筋内(i.m.)注射により実施するこ
とができる。1または複数のこのような経路を利用することができる。非経口投与は、例
えば、ボーラス注射による場合もあり、時間経過にわたる、漸次的な灌流による場合もあ
る。代替的に、または共時的に、投与は、経口経路による投与でありうる。加えて、投与
はまた、ボーラスまたは細胞ペレットのデポ手術による場合もあり、医療用デバイスの設
置による場合もある。ある実施形態では、本開示の組成物は、本明細書で記載される核酸
配列を発現する操作細胞もしくは宿主細胞、または本明細書で記載される、少なくとも1
つの核酸配列を含むベクターを、増殖性障害を処置または防止するのに有効な量で含みう
る。医薬組成物は、本明細書で記載される標的細胞集団を、1または複数の、薬学的また
は生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含みうる。このよう
な組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液;グルコース、マ
ンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;
ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンな
どのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);および保存剤を含みう
る。
物を、患者または対象に施すこととみなす。例を目的として、限定せずに述べると、組成
物の投与、例えば、注射は、静脈内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射、皮内(i
.d.)注射、腹腔内(i.p.)注射、または筋内(i.m.)注射により実施するこ
とができる。1または複数のこのような経路を利用することができる。非経口投与は、例
えば、ボーラス注射による場合もあり、時間経過にわたる、漸次的な灌流による場合もあ
る。代替的に、または共時的に、投与は、経口経路による投与でありうる。加えて、投与
はまた、ボーラスまたは細胞ペレットのデポ手術による場合もあり、医療用デバイスの設
置による場合もある。ある実施形態では、本開示の組成物は、本明細書で記載される核酸
配列を発現する操作細胞もしくは宿主細胞、または本明細書で記載される、少なくとも1
つの核酸配列を含むベクターを、増殖性障害を処置または防止するのに有効な量で含みう
る。医薬組成物は、本明細書で記載される標的細胞集団を、1または複数の、薬学的また
は生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含みうる。このよう
な組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液;グルコース、マ
ンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;
ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンな
どのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);および保存剤を含みう
る。
本明細書で使用される「処置」、「~を処置すること」という用語、またはそれらの文
法的同等物は、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを指す。複数
の実施形態では、効果は、治療的である、すなわち、効果は、疾患および/または疾患に
帰せられうる有害症状を、部分的または完全に治癒させる。この目的で、本発明の方法は
、本発明の核酸配列を発現する宿主細胞、または本発明の核酸配列を含むベクターを含む
、治療有効量の組成物を投与するステップを含む。
法的同等物は、所望の薬理学的効果および/または生理学的効果を得ることを指す。複数
の実施形態では、効果は、治療的である、すなわち、効果は、疾患および/または疾患に
帰せられうる有害症状を、部分的または完全に治癒させる。この目的で、本発明の方法は
、本発明の核酸配列を発現する宿主細胞、または本発明の核酸配列を含むベクターを含む
、治療有効量の組成物を投与するステップを含む。
「治療有効量」、「治療的量」、「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害
有効量」という用語、またはそれらの文法的同等物は、所望の治療結果を達成するのに必
要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患状
態、年齢、性別、および体重、ならびに1つまたは複数の対象において所望の応答を誘発
する、本明細書で記載される組成物の能力などの因子に従い変動しうる。投与される、本
開示の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の
程度、および状態の個別差を考慮して、医師により決定されうる。
有効量」という用語、またはそれらの文法的同等物は、所望の治療結果を達成するのに必
要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患状
態、年齢、性別、および体重、ならびに1つまたは複数の対象において所望の応答を誘発
する、本明細書で記載される組成物の能力などの因子に従い変動しうる。投与される、本
開示の組成物の正確な量は、患者(対象)の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の
程度、および状態の個別差を考慮して、医師により決定されうる。
代替的に、本明細書で記載される、1または複数の組成物の、患者または対象への投与
の、薬理学的効果および/または生理学的効果は、「予防的」な場合もある、すなわち、
効果は、疾患またはその症状を、完全に、または部分的に予防する場合もある。「予防有
効量」とは、所望の予防結果(例えば、疾患の発症の防止)を達成するのに必要な投与量
において、必要な期間にわたり有効な量を指す。
の、薬理学的効果および/または生理学的効果は、「予防的」な場合もある、すなわち、
効果は、疾患またはその症状を、完全に、または部分的に予防する場合もある。「予防有
効量」とは、所望の予防結果(例えば、疾患の発症の防止)を達成するのに必要な投与量
において、必要な期間にわたり有効な量を指す。
HBV分子ワクチン
B型肝炎(HepB)とは、B型肝炎ウイルス(HBV)により引き起こされる、潜在
的に致死性の肝感染である。HBVは、慢性感染を引き起こす場合があり、人々を、肝硬
変および肝がんによる死の危険性に陥れる。HBVの進化は、遺伝子型の地理的分布によ
り顕示される。HBVの遺伝子型/遺伝子亜型は、肝疾患の重症度および抗ウイルス治療
に対する応答など、臨床的特徴およびウイルス学的特徴の差違との関連が、ますます大き
くなっている。配列を比較すると、HBVは、各々の地理的分布が、顕著に異なる、8つ
の遺伝子型(A~H)へと分類される。研究者らは、異なるHBV遺伝子型とHBV疾患
の重症度および転帰との関連を相関させている。
B型肝炎(HepB)とは、B型肝炎ウイルス(HBV)により引き起こされる、潜在
的に致死性の肝感染である。HBVは、慢性感染を引き起こす場合があり、人々を、肝硬
変および肝がんによる死の危険性に陥れる。HBVの進化は、遺伝子型の地理的分布によ
り顕示される。HBVの遺伝子型/遺伝子亜型は、肝疾患の重症度および抗ウイルス治療
に対する応答など、臨床的特徴およびウイルス学的特徴の差違との関連が、ますます大き
くなっている。配列を比較すると、HBVは、各々の地理的分布が、顕著に異なる、8つ
の遺伝子型(A~H)へと分類される。研究者らは、異なるHBV遺伝子型とHBV疾患
の重症度および転帰との関連を相関させている。
HBVは、肝臓指向性の大きな、二本鎖DNAウイルスである。HBV DNAは、3
.2kbの、環状、エンベロープ型で、部分的に二本鎖のDNAゲノム(図3A~3D)
である。HBVは、4つの遺伝子(S、C、P、およびX)を有する。S遺伝子は、小型
表面タンパク質(S)、中型表面タンパク質(S+プレS2)、および大型表面タンパク
質(S+プレS2+プレS1)からなる、エンベロープ(脂質二重層)表面タンパク質(
HBsAg)をコードする。C遺伝子は、カプシドタンパク質またはコアタンパク質をコ
ードする。C遺伝子は、プレコア領域およびコア領域を有する。翻訳が、プレコア領域で
開始される場合、タンパク質は、HBeAgである。翻訳が、コア領域で開始される場合
、タンパク質は、HBcAgである。P遺伝子は、DNAポリメラーゼ(Pol)をコー
ドする。X遺伝子は、xタンパク質(HBxAg)(図3A~3D)をコードする。HB
Vゲノムは、TP、SP、RT、およびRHを含むPol(832アミノ酸);プレS1
(108アミノ酸);プレS2(55アミノ酸);S(226アミノ酸);プレC(29
アミノ酸);C(183アミノ酸);ならびにHBx(154アミノ酸)(図3A~3D
)を含む。
.2kbの、環状、エンベロープ型で、部分的に二本鎖のDNAゲノム(図3A~3D)
である。HBVは、4つの遺伝子(S、C、P、およびX)を有する。S遺伝子は、小型
表面タンパク質(S)、中型表面タンパク質(S+プレS2)、および大型表面タンパク
質(S+プレS2+プレS1)からなる、エンベロープ(脂質二重層)表面タンパク質(
HBsAg)をコードする。C遺伝子は、カプシドタンパク質またはコアタンパク質をコ
ードする。C遺伝子は、プレコア領域およびコア領域を有する。翻訳が、プレコア領域で
開始される場合、タンパク質は、HBeAgである。翻訳が、コア領域で開始される場合
、タンパク質は、HBcAgである。P遺伝子は、DNAポリメラーゼ(Pol)をコー
ドする。X遺伝子は、xタンパク質(HBxAg)(図3A~3D)をコードする。HB
Vゲノムは、TP、SP、RT、およびRHを含むPol(832アミノ酸);プレS1
(108アミノ酸);プレS2(55アミノ酸);S(226アミノ酸);プレC(29
アミノ酸);C(183アミノ酸);ならびにHBx(154アミノ酸)(図3A~3D
)を含む。
急性HBV感染は、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、およびコア抗原である、HBc
Agに対する、免疫グロブリンM(IgM)抗体の存在により特徴づけられる。感染の初
期において、患者はまた、B型肝炎e抗原(HBeAg)についても血清陽性である。H
BeAgは、通例、高レベルのウイルス複製のマーカーである。HBeAgの存在は、感
染個体の血液および体液が、高度に感染性であることを指し示す。慢性感染は、HBsA
gの、少なくとも6カ月間にわたる存続(HBeAgの併存を伴うか、または伴わない)
により特徴づけられる。HBsAgの存続は、老齢において、慢性肝疾患および肝がん(
肝細胞癌)を発症する危険性についての、主要なマーカーである。
Agに対する、免疫グロブリンM(IgM)抗体の存在により特徴づけられる。感染の初
期において、患者はまた、B型肝炎e抗原(HBeAg)についても血清陽性である。H
BeAgは、通例、高レベルのウイルス複製のマーカーである。HBeAgの存在は、感
染個体の血液および体液が、高度に感染性であることを指し示す。慢性感染は、HBsA
gの、少なくとも6カ月間にわたる存続(HBeAgの併存を伴うか、または伴わない)
により特徴づけられる。HBsAgの存続は、老齢において、慢性肝疾患および肝がん(
肝細胞癌)を発症する危険性についての、主要なマーカーである。
B型肝炎ウイルスは、体外で、少なくとも7日間にわたり生存しうる。この期間中、ウ
イルスは、それが、ワクチンにより防御されていない人の体内に侵入する場合、やはり、
感染を引き起こしうる。B型肝炎ウイルスのインキュベーション期間は、平均で75日間
であるが、30~180日間で変動しうる。ウイルスは、感染後30~60日間以内に検
出される場合があり、存続し、慢性B型肝炎へと発症しうる。高度の流行地域では、B型
肝炎は、母体から、出生時の小児へと拡散する(周産期伝染)か、または、とりわけ、生
後最初の5年間において、感染小児から、非感染小児へと、水平伝染(感染血液への曝露
)を介して拡散することが、最も一般的である。慢性感染の発症は、それらの母体から、
または5歳以前に感染した乳児において、極めて一般的である。B型肝炎はまた、感染血
および多様な体液への経皮曝露または粘膜曝露によるほか、唾液、月経液、膣液、および
精液を介しても拡散する。また、B型肝炎の性伝染も、一般に生じうる。成人における感
染は、症例の5%未満において、慢性肝炎をもたらす。ウイルスの伝染はまた、医療状況
における、または薬物を注射する者の間の、注射針およびシリンジの再使用を介しても生
じうる。加えて、感染は、医療手順、手術手順、および歯科手順において生じる場合もあ
り、タトゥーの彫込みを介して生じる場合もあり、感染血で汚染されたカミソリおよび類
似の対象物の使用を介して生じる場合もある。
イルスは、それが、ワクチンにより防御されていない人の体内に侵入する場合、やはり、
感染を引き起こしうる。B型肝炎ウイルスのインキュベーション期間は、平均で75日間
であるが、30~180日間で変動しうる。ウイルスは、感染後30~60日間以内に検
出される場合があり、存続し、慢性B型肝炎へと発症しうる。高度の流行地域では、B型
肝炎は、母体から、出生時の小児へと拡散する(周産期伝染)か、または、とりわけ、生
後最初の5年間において、感染小児から、非感染小児へと、水平伝染(感染血液への曝露
)を介して拡散することが、最も一般的である。慢性感染の発症は、それらの母体から、
または5歳以前に感染した乳児において、極めて一般的である。B型肝炎はまた、感染血
および多様な体液への経皮曝露または粘膜曝露によるほか、唾液、月経液、膣液、および
精液を介しても拡散する。また、B型肝炎の性伝染も、一般に生じうる。成人における感
染は、症例の5%未満において、慢性肝炎をもたらす。ウイルスの伝染はまた、医療状況
における、または薬物を注射する者の間の、注射針およびシリンジの再使用を介しても生
じうる。加えて、感染は、医療手順、手術手順、および歯科手順において生じる場合もあ
り、タトゥーの彫込みを介して生じる場合もあり、感染血で汚染されたカミソリおよび類
似の対象物の使用を介して生じる場合もある。
大半の人々は、急性感染期に、症状を経ない。しかし、一部の人々は、皮膚および眼の
黄染(黄疸)、暗色尿、極度の疲労、悪心、嘔吐、ならびに腹痛を含む、数週間続く症状
を伴う、急性疾病を呈する。急性肝炎を伴う人のうちの、小さなサブセットは、急性肝不
全を発症する場合があり、これは、死をもたらしうる。一部の人々では、B型肝炎ウイル
スはまた、慢性肝感染も引き起こす場合があり、これは、その後、肝硬変(肝臓の瘢痕化
)または肝がんへと増悪しうる。感染が、慢性となる可能性は、感染する年齢に依存する
。B型肝炎ウイルスに感染する、6歳未満の小児は、慢性感染を発症する可能性が最も高
い。1歳時に感染した乳児のうちの80~90%が、慢性感染を発症し;6歳以前に感染
した小児のうちの30~50%が、慢性感染を発症する。成人では、成人になって感染し
たが、他の点では健常な者のうちの5%未満が、慢性感染を発症し;慢性感染した成人の
うちの20~30%が、肝硬変および/または肝がんを発症する(図1および図2)。
黄染(黄疸)、暗色尿、極度の疲労、悪心、嘔吐、ならびに腹痛を含む、数週間続く症状
を伴う、急性疾病を呈する。急性肝炎を伴う人のうちの、小さなサブセットは、急性肝不
全を発症する場合があり、これは、死をもたらしうる。一部の人々では、B型肝炎ウイル
スはまた、慢性肝感染も引き起こす場合があり、これは、その後、肝硬変(肝臓の瘢痕化
)または肝がんへと増悪しうる。感染が、慢性となる可能性は、感染する年齢に依存する
。B型肝炎ウイルスに感染する、6歳未満の小児は、慢性感染を発症する可能性が最も高
い。1歳時に感染した乳児のうちの80~90%が、慢性感染を発症し;6歳以前に感染
した小児のうちの30~50%が、慢性感染を発症する。成人では、成人になって感染し
たが、他の点では健常な者のうちの5%未満が、慢性感染を発症し;慢性感染した成人の
うちの20~30%が、肝硬変および/または肝がんを発症する(図1および図2)。
急性B型肝炎のための特別な処置は存在しない。したがって、ケアは、嘔吐および下痢
により失われた体液の置き換えを含む、快適さおよび十分な栄養バランスの維持を目的と
する。慢性B型肝炎感染は、経口抗ウイルス剤を含む薬により処置されうる。処置(例え
ば、肝臓移植またはIFN-αヌクレオチド類似体)は、肝硬変の進行を緩徐化し、肝が
んの発生率を低減し、長期にわたる生存を改善する。近年のより発展的な治療用ワクチン
(すなわち、GS-4777、Gilead;ABX203、Abivax)は、臨床試
験の2/3相で不奏効であった。しかし、大半の人々では、処置は、B型肝炎感染を治癒
させず、ウイルスの複製を抑制するにとどまる。したがって、B型肝炎の処置を始めた人
々は、それを、一生続けなければならない。多くの資源制約的状況下では、B型肝炎の診
断および処置へのアクセスは、依然として限定されている。
により失われた体液の置き換えを含む、快適さおよび十分な栄養バランスの維持を目的と
する。慢性B型肝炎感染は、経口抗ウイルス剤を含む薬により処置されうる。処置(例え
ば、肝臓移植またはIFN-αヌクレオチド類似体)は、肝硬変の進行を緩徐化し、肝が
んの発生率を低減し、長期にわたる生存を改善する。近年のより発展的な治療用ワクチン
(すなわち、GS-4777、Gilead;ABX203、Abivax)は、臨床試
験の2/3相で不奏効であった。しかし、大半の人々では、処置は、B型肝炎感染を治癒
させず、ウイルスの複製を抑制するにとどまる。したがって、B型肝炎の処置を始めた人
々は、それを、一生続けなければならない。多くの資源制約的状況下では、B型肝炎の診
断および処置へのアクセスは、依然として限定されている。
推定2億5,700万人が、慢性B型肝炎ウイルス(HBV)感染(表面抗原の検出を
介する陽性の確認)と共に生活している。2015年に、B型肝炎感染は、最多の死亡原
因を、肝不全または肝がんとする、88万7,000人の死者を結果としてもたらした。
現在、HBVワクチンは、症例のうちの95%において、感染を防止し、これにより、B
型肝炎ウイルスに起因する感染、肝がん、および慢性疾患を防止する。しかし、複数のH
BV亜型に対する広域カバレッジ、および肝がんに対する機能性を伴う、HBVワクチン
を開発することが、依然として強く必要とされている。本開示は、バイオインフォマティ
クス法およびタンパク質操作法に基づく、新規のHBVワクチン抗原に関する。これらの
新規のHBVワクチン候補物質は、HBVおよびHBV関連疾患に対する治療用ワクチン
として使用することができる。
介する陽性の確認)と共に生活している。2015年に、B型肝炎感染は、最多の死亡原
因を、肝不全または肝がんとする、88万7,000人の死者を結果としてもたらした。
現在、HBVワクチンは、症例のうちの95%において、感染を防止し、これにより、B
型肝炎ウイルスに起因する感染、肝がん、および慢性疾患を防止する。しかし、複数のH
BV亜型に対する広域カバレッジ、および肝がんに対する機能性を伴う、HBVワクチン
を開発することが、依然として強く必要とされている。本開示は、バイオインフォマティ
クス法およびタンパク質操作法に基づく、新規のHBVワクチン抗原に関する。これらの
新規のHBVワクチン候補物質は、HBVおよびHBV関連疾患に対する治療用ワクチン
として使用することができる。
処置選択肢
慢性B型肝炎ウイルス感染の標準治療(SOC)は、PEG-IFNおよび/またはヌ
クレオチド類似体を含む。しかし、cccDNAならびに免疫寛容および免疫疲弊は、遷
延しうる(図4)。HBVの感染は、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌(HCC)を結果
としてもたらしうる、肝炎を引き起こす。HBVの診断は、血清学的所見に基づく。実際
、ウイルスDNA、ウイルス抗原、およびこれらのそれぞれの抗体は、血清中に見出すこ
とができる。HBVは、HBsAg上に見出される、共通の抗原決定基(a)と、2つの
相互に排他的な決定基対(d/yおよびw/r)とに基づき、4つの主要な血清型(ad
r、adw、ayr、ayw)へと細分される。ゲノムの全ヌクレオチド配列変動に従い
、10の公知の遺伝子型(A~J)と、40の公知の遺伝子亜型が存在する。遺伝子型は
、顕著に異なる地理的分布を有し、異なる遺伝子型は、異なる疾患重症度、合併症の異な
る経過および可能性、ならびに処置、および、おそらくは、ワクチン接種に対する異なる
応答を示す。血清型と、遺伝子型とは、必ずしも、対応しない(例えば、遺伝子型Dは、
10の遺伝子亜型を有する)。
慢性B型肝炎ウイルス感染の標準治療(SOC)は、PEG-IFNおよび/またはヌ
クレオチド類似体を含む。しかし、cccDNAならびに免疫寛容および免疫疲弊は、遷
延しうる(図4)。HBVの感染は、肝硬変、肝不全、および肝細胞癌(HCC)を結果
としてもたらしうる、肝炎を引き起こす。HBVの診断は、血清学的所見に基づく。実際
、ウイルスDNA、ウイルス抗原、およびこれらのそれぞれの抗体は、血清中に見出すこ
とができる。HBVは、HBsAg上に見出される、共通の抗原決定基(a)と、2つの
相互に排他的な決定基対(d/yおよびw/r)とに基づき、4つの主要な血清型(ad
r、adw、ayr、ayw)へと細分される。ゲノムの全ヌクレオチド配列変動に従い
、10の公知の遺伝子型(A~J)と、40の公知の遺伝子亜型が存在する。遺伝子型は
、顕著に異なる地理的分布を有し、異なる遺伝子型は、異なる疾患重症度、合併症の異な
る経過および可能性、ならびに処置、および、おそらくは、ワクチン接種に対する異なる
応答を示す。血清型と、遺伝子型とは、必ずしも、対応しない(例えば、遺伝子型Dは、
10の遺伝子亜型を有する)。
現在、慢性HBV感染には、治癒が存在しない。処置選択肢は、肝硬変の進行およびウ
イルスの複製を緩徐化し、HCCおよび肝不全の発生率を低減することを目的とする。現
行の処置は、2つの主要な類型:(1)免疫調節剤薬物、すなわち、主に、免疫系をブー
ストし、ウイルス感染細胞と戦うようにデザインされた、I型インターフェロン(インタ
ーフェロンアルファおよびPEG化インターフェロンアルファ);ならびに(2)ヌクレ
オシド類似体(ラミブジン、エンテカビル、およびテルビブジン)、およびヌクレオチド
類似体(アデフォビル、ジピボキシル、およびテノフォビル)を含む抗ウイルス薬へと分
けられ、ウイルス複製に対する干渉を目的とする。HBV感染による死者数は、現在のと
ころ、毎年ほぼ70万人であり、HIVおよび結核と同等である。新たなHBV感染率は
、低下しつつあるが、肝炎による総死亡者数の増大は、新たな処置選択肢の開発を、火急
に必要とする。
イルスの複製を緩徐化し、HCCおよび肝不全の発生率を低減することを目的とする。現
行の処置は、2つの主要な類型:(1)免疫調節剤薬物、すなわち、主に、免疫系をブー
ストし、ウイルス感染細胞と戦うようにデザインされた、I型インターフェロン(インタ
ーフェロンアルファおよびPEG化インターフェロンアルファ);ならびに(2)ヌクレ
オシド類似体(ラミブジン、エンテカビル、およびテルビブジン)、およびヌクレオチド
類似体(アデフォビル、ジピボキシル、およびテノフォビル)を含む抗ウイルス薬へと分
けられ、ウイルス複製に対する干渉を目的とする。HBV感染による死者数は、現在のと
ころ、毎年ほぼ70万人であり、HIVおよび結核と同等である。新たなHBV感染率は
、低下しつつあるが、肝炎による総死亡者数の増大は、新たな処置選択肢の開発を、火急
に必要とする。
治療法
表面タンパク質(S)、コアタンパク質(C)、およびポリメラーゼタンパク質(Po
l)に由来するHBVエピトープは、感染時に、T細胞によりターゲティングされ、これ
は、HBVに対する細胞性免疫応答を媒介する。MHC-IエピトープおよびMHC-I
Iエピトープを含む、HBV Xタンパク質(HBx)は、ウイルス性の発症機序および
癌発症に関与する、多機能性の調節タンパク質である。本明細書で記載されるHBVワク
チンデザインは、潜在的なT細胞エピトープを有する、全ての主要構成要素を含む。具体
的に、本明細書では、Pol、コア、Env、およびHBxにおいて、遺伝子改変(点突
然変異の情報)およびトランケーションを伴う、2つの、異なる、固有のデザインを含む
HBVワクチンが提示される。本明細書ではまた、固有にデザインされた多重エピトープ
構築物(すなわち、細胞傷害性Tリンパ球)であって、特異性ペプチドを、ヒトタンパク
質足場へとグラフトされ、HBV感染を制御し、除去するために必要とされる、細胞性免
疫応答を刺激しうる、帯電ジペプチドにより連結された、多重エピトープ構築物も提示さ
れる。
表面タンパク質(S)、コアタンパク質(C)、およびポリメラーゼタンパク質(Po
l)に由来するHBVエピトープは、感染時に、T細胞によりターゲティングされ、これ
は、HBVに対する細胞性免疫応答を媒介する。MHC-IエピトープおよびMHC-I
Iエピトープを含む、HBV Xタンパク質(HBx)は、ウイルス性の発症機序および
癌発症に関与する、多機能性の調節タンパク質である。本明細書で記載されるHBVワク
チンデザインは、潜在的なT細胞エピトープを有する、全ての主要構成要素を含む。具体
的に、本明細書では、Pol、コア、Env、およびHBxにおいて、遺伝子改変(点突
然変異の情報)およびトランケーションを伴う、2つの、異なる、固有のデザインを含む
HBVワクチンが提示される。本明細書ではまた、固有にデザインされた多重エピトープ
構築物(すなわち、細胞傷害性Tリンパ球)であって、特異性ペプチドを、ヒトタンパク
質足場へとグラフトされ、HBV感染を制御し、除去するために必要とされる、細胞性免
疫応答を刺激しうる、帯電ジペプチドにより連結された、多重エピトープ構築物も提示さ
れる。
本明細書では、HBV感染を処置する、多様な遺伝子治療法が提示される。例えば、表
1には、HBVの、免疫系媒介型制御を改善するのに使用される、戦略の一部が記載され
る。本明細書ではまた、HBV治療用ワクチン、プライム/ブースト型DNAベースワク
チンの高度デザインであって、プライミングのための、HBVの主要構成要素(HBsA
g、HBcAg、HBxAg、HBeAg、およびHB PolAg)による、免疫原性
領域の組合せと、ブースティングのための、アゴニストCD8 T細胞エピトープの組合
せとを包含する高度デザインも提示される。
1には、HBVの、免疫系媒介型制御を改善するのに使用される、戦略の一部が記載され
る。本明細書ではまた、HBV治療用ワクチン、プライム/ブースト型DNAベースワク
チンの高度デザインであって、プライミングのための、HBVの主要構成要素(HBsA
g、HBcAg、HBxAg、HBeAg、およびHB PolAg)による、免疫原性
領域の組合せと、ブースティングのための、アゴニストCD8 T細胞エピトープの組合
せとを包含する高度デザインも提示される。
本明細書では、HBV組換えワクチンの組成物、キット、およびこれを含むシステム、
ならびにこれを作る方法が提示される。本開示におけるHBV組換えワクチン(例えば、
HBVデザイン1~5)は、HBe、HBx、LHBs、Pol、およびHBSPに対す
るタンパク質操作を介して操作される。各HBVワクチンの抗原デザインは、バイオイン
フォマティクス解析およびコンピュータによるタンパク質操作法を使用して、本発明者に
より選択されたコンビナトリアルガイダンス(例えば、コンセンサス配列に、より緊密に
マッチする抗原配列の選択、抗原性の予測、ならびにMHC-Iへの結合、およびT細胞
活性化後におけるサイトカインの産生をもたらしうるT細胞エピトープマッピング)を介
してその着想を得た。本明細書で提示される、HBVワクチンデザインについての、全体
的なワークフローを、図5に示し、実施例1で、さらに詳述する。本開示は、多重欠失ゴ
リラアデノベクター(GC46)内に構築された、5つのHBV抗原デザイン(HBVデ
ザイン1~5)を提示する。
ならびにこれを作る方法が提示される。本開示におけるHBV組換えワクチン(例えば、
HBVデザイン1~5)は、HBe、HBx、LHBs、Pol、およびHBSPに対す
るタンパク質操作を介して操作される。各HBVワクチンの抗原デザインは、バイオイン
フォマティクス解析およびコンピュータによるタンパク質操作法を使用して、本発明者に
より選択されたコンビナトリアルガイダンス(例えば、コンセンサス配列に、より緊密に
マッチする抗原配列の選択、抗原性の予測、ならびにMHC-Iへの結合、およびT細胞
活性化後におけるサイトカインの産生をもたらしうるT細胞エピトープマッピング)を介
してその着想を得た。本明細書で提示される、HBVワクチンデザインについての、全体
的なワークフローを、図5に示し、実施例1で、さらに詳述する。本開示は、多重欠失ゴ
リラアデノベクター(GC46)内に構築された、5つのHBV抗原デザイン(HBVデ
ザイン1~5)を提示する。
4つの抗原デザイン(HBVデザイン1~4)および対照抗原を合成し、アデノベクタ
ー構築のための発現プラスミド(pAdShuttle)へとクローニングした(図6)
。HBVデザインを解析して、異なるリンカーが、異なるエピトープの予測をもたらすの
かどうかについて評価した。初期抗原スクリーニングは、一過性のトランスフェクション
における、in vitroの抗原発現、単球由来の樹状細胞についての、一過性のトラ
ンスフェクション研究における、in vitroの抗原プロセシングおよび抗原提示に
ついて査定した。図6に示される通り、HBVデザイン1および2は、クレードDコンセ
ンサスに基づきデザインした。コアペプチド(8)、表面ペプチド(8)、ポリメラーゼ
ペプチド(8)、HBxペプチド(6)、およびHBPSペプチド(2)に由来する、3
2のHBVペプチドは、免疫原性データ、質量分析などなどの、実験データおよび機能デ
ータを有する文献からキュレートした(表4)。HBVデザイン3のために、ヒトアンキ
リン様リピート(ALR)タンパク質足場(PDBコード:1QYM)ペプチドを、ヘリ
ックス/ループ領域に、タンデムにグラフトした。2つのALR足場を使用し、切断可能
リンカーである、VSQTSKLTR(配列番号111)により接続した。ALRタンパ
ク質は、一般に、発現が高度であり、高安定性を有する。したがって、ALRタンパク質
を、HBVペプチドのための足場として使用して、新規のCTLを創出した。HBVデザ
イン4エピトープは、KKリンカーにより隔てた(図6)。RNA qPCR相対発現ア
ッセイのために、5’-TGCCAAGAGTGACGTGTCCA-3’(配列番号1
10)を、スプライスプライマーとして使用し、5’-CCCAGGTCCAACTGC
AGCCGG-3’(配列番号128)を、スプライスプローブとして使用した。各抗原
についてデザインされた、特異的プライマーを、リバースプライマーとして使用した(図
14)。
ー構築のための発現プラスミド(pAdShuttle)へとクローニングした(図6)
。HBVデザインを解析して、異なるリンカーが、異なるエピトープの予測をもたらすの
かどうかについて評価した。初期抗原スクリーニングは、一過性のトランスフェクション
における、in vitroの抗原発現、単球由来の樹状細胞についての、一過性のトラ
ンスフェクション研究における、in vitroの抗原プロセシングおよび抗原提示に
ついて査定した。図6に示される通り、HBVデザイン1および2は、クレードDコンセ
ンサスに基づきデザインした。コアペプチド(8)、表面ペプチド(8)、ポリメラーゼ
ペプチド(8)、HBxペプチド(6)、およびHBPSペプチド(2)に由来する、3
2のHBVペプチドは、免疫原性データ、質量分析などなどの、実験データおよび機能デ
ータを有する文献からキュレートした(表4)。HBVデザイン3のために、ヒトアンキ
リン様リピート(ALR)タンパク質足場(PDBコード:1QYM)ペプチドを、ヘリ
ックス/ループ領域に、タンデムにグラフトした。2つのALR足場を使用し、切断可能
リンカーである、VSQTSKLTR(配列番号111)により接続した。ALRタンパ
ク質は、一般に、発現が高度であり、高安定性を有する。したがって、ALRタンパク質
を、HBVペプチドのための足場として使用して、新規のCTLを創出した。HBVデザ
イン4エピトープは、KKリンカーにより隔てた(図6)。RNA qPCR相対発現ア
ッセイのために、5’-TGCCAAGAGTGACGTGTCCA-3’(配列番号1
10)を、スプライスプライマーとして使用し、5’-CCCAGGTCCAACTGC
AGCCGG-3’(配列番号128)を、スプライスプローブとして使用した。各抗原
についてデザインされた、特異的プライマーを、リバースプライマーとして使用した(図
14)。
送達系
ゴリラアデノウイルスによるシャトルベクター
本開示の、ある特定の態様は、1または複数の免疫応答誘導性HBVポリペプチドを含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。ある特定の
実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。特定の実施形態では、ベクターは
、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、一般に、ヒトにおいて、良性の病
態と関連し、ヒトを含む様々な種から単離されているアデノウイルスのゲノムについては
、広範に研究されている。アデノウイルスは、中程度のサイズ(90~100nm)で、
エンベロープを伴わず、約36kbの二本鎖DNAを含有する、二十面体ウイルスである
。アデノウイルスのカプシドは、ウイルスによる細胞への感染の早期段階の、鍵となる相
互作用を媒介し、アデノウイルスの生活環の終端において、アデノウイルスゲノムをパッ
ケージングするために必要とされる。カプシドは、240のヘキソン、12のペントンベ
ースタンパク質、および12の線維を含む、252カプソマーを含む(Ginsberg et al.,
Virology, 28: 782-83 (1966))。ヘキソンは、3つの同一なタンパク質、すなわち、ポ
リペプチドIIを含む(Roberts et al., Science, 232: 1148-51 (1986))。ペントンベ
ースは、5つの同一なタンパク質を含み、線維は、3つの同一なタンパク質を含む。タン
パク質IIIa、VI、およびIXは、アデノウイルスのコート内に存在し、ウイルスカ
プシドを安定化させると考えられる(Stewart et al., Cell, 67: 145-54 (1991);およ
びStewart et al., EMBO J., 12(7): 2589-99 (1993))。カプシドタンパク質の発現は、
pIXを例外として、アデノウイルスポリメラーゼタンパク質に依存する。したがって、
アデノウイルス粒子の主要構成要素は、ポリメラーゼタンパク質遺伝子が存在し、発現す
る場合に限り、ゲノムから発現する。
ゴリラアデノウイルスによるシャトルベクター
本開示の、ある特定の態様は、1または複数の免疫応答誘導性HBVポリペプチドを含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを対象とする。ある特定の
実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。特定の実施形態では、ベクターは
、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、一般に、ヒトにおいて、良性の病
態と関連し、ヒトを含む様々な種から単離されているアデノウイルスのゲノムについては
、広範に研究されている。アデノウイルスは、中程度のサイズ(90~100nm)で、
エンベロープを伴わず、約36kbの二本鎖DNAを含有する、二十面体ウイルスである
。アデノウイルスのカプシドは、ウイルスによる細胞への感染の早期段階の、鍵となる相
互作用を媒介し、アデノウイルスの生活環の終端において、アデノウイルスゲノムをパッ
ケージングするために必要とされる。カプシドは、240のヘキソン、12のペントンベ
ースタンパク質、および12の線維を含む、252カプソマーを含む(Ginsberg et al.,
Virology, 28: 782-83 (1966))。ヘキソンは、3つの同一なタンパク質、すなわち、ポ
リペプチドIIを含む(Roberts et al., Science, 232: 1148-51 (1986))。ペントンベ
ースは、5つの同一なタンパク質を含み、線維は、3つの同一なタンパク質を含む。タン
パク質IIIa、VI、およびIXは、アデノウイルスのコート内に存在し、ウイルスカ
プシドを安定化させると考えられる(Stewart et al., Cell, 67: 145-54 (1991);およ
びStewart et al., EMBO J., 12(7): 2589-99 (1993))。カプシドタンパク質の発現は、
pIXを例外として、アデノウイルスポリメラーゼタンパク質に依存する。したがって、
アデノウイルス粒子の主要構成要素は、ポリメラーゼタンパク質遺伝子が存在し、発現す
る場合に限り、ゲノムから発現する。
アデノウイルスの、いくつかの特徴は、それらを、治療適用(すなわち、「遺伝子治療
」)のために、またはワクチン適用のための、抗原送達系としての使用のために、遺伝子
素材を、細胞へと導入するための理想的な媒体とする。例えば、アデノウイルスは、高力
価(例えば、約1013粒子単位(pu))で作製することができ、遺伝子素材を、非複
製用細胞および複製用細胞へと導入することができる。アデノウイルスゲノムは、大量の
外因性DNA(最大で、約8kb)を運ぶように操作することができ、アデノウイルスカ
プシドは、さらに長い配列の導入を強化しうる(Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3: 1
47-154 (1992))。加えて、アデノウイルスは、一般に、宿主細胞の染色体へと組み込ま
れず、直鎖状エピソームとして維持され、これにより、組換えアデノウイルスが、正常な
細胞機能に干渉する可能性を最小化する。
」)のために、またはワクチン適用のための、抗原送達系としての使用のために、遺伝子
素材を、細胞へと導入するための理想的な媒体とする。例えば、アデノウイルスは、高力
価(例えば、約1013粒子単位(pu))で作製することができ、遺伝子素材を、非複
製用細胞および複製用細胞へと導入することができる。アデノウイルスゲノムは、大量の
外因性DNA(最大で、約8kb)を運ぶように操作することができ、アデノウイルスカ
プシドは、さらに長い配列の導入を強化しうる(Curiel et al., Hum. Gene Ther., 3: 1
47-154 (1992))。加えて、アデノウイルスは、一般に、宿主細胞の染色体へと組み込ま
れず、直鎖状エピソームとして維持され、これにより、組換えアデノウイルスが、正常な
細胞機能に干渉する可能性を最小化する。
一部の実施形態では、本明細書で記載されるアデノウイルスは、ゴリラから単離される
。2つの種である、ヒガシゴリラ(Gorilla beringei)およびニシゴリラ(Gorilla gori
lla)の中には、広く認知された、4つのゴリラ亜種が存在する。ニシゴリラ種は、亜種
である、ニシローランドゴリラ(Gorilla gorilla gorilla)およびクロスリバーゴリラ
(Gorilla gorilla diehli)を含む。ヒガシゴリラ種は、亜種である、マウンテンゴリラ
(Gorilla beringei beringei)およびヒガシローランドゴリラ(Gorilla beringei grau
eri)を含む(例えば、Wilson and Reeder, eds., Mammalian Species of the World, 3r
d ed., Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland (2005)を参照されたい
)。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスは、マウンテンゴリラ(Gorilla beri
ngei beringei)から単離される。
。2つの種である、ヒガシゴリラ(Gorilla beringei)およびニシゴリラ(Gorilla gori
lla)の中には、広く認知された、4つのゴリラ亜種が存在する。ニシゴリラ種は、亜種
である、ニシローランドゴリラ(Gorilla gorilla gorilla)およびクロスリバーゴリラ
(Gorilla gorilla diehli)を含む。ヒガシゴリラ種は、亜種である、マウンテンゴリラ
(Gorilla beringei beringei)およびヒガシローランドゴリラ(Gorilla beringei grau
eri)を含む(例えば、Wilson and Reeder, eds., Mammalian Species of the World, 3r
d ed., Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland (2005)を参照されたい
)。一部の実施形態では、本開示のアデノウイルスは、マウンテンゴリラ(Gorilla beri
ngei beringei)から単離される。
多様なゴリラアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスベクターについては、それら
の各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第2
013/052832号パンフレット;同第2013/052811号パンフレット;お
よび同第2013/052799号パンフレットにおいて記載されている。
の各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第2
013/052832号パンフレット;同第2013/052811号パンフレット;お
よび同第2013/052799号パンフレットにおいて記載されている。
いくつかのこのようなアデノウイルスのゲノムが解析されており、アデノウイルスは、
それらの各々が、アデノウイルスを固有に規定するのに用いられる、多数の部分配列、す
なわち、核酸配列である、配列番号1~10、およびアミノ酸配列である、配列番号11
~20を含む、例えば、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、ま
たは配列番号25の核酸配列を有しうることが決定されている。配列番号6~10は、そ
れぞれ、配列番号16~20のアミノ酸配列をコードする。配列番号1~5は、それぞれ
、配列番号6~10の核酸配列のサブセットである。配列番号11~15は、それぞれ、
配列番号16~20のアミノ酸配列のサブセットである。
それらの各々が、アデノウイルスを固有に規定するのに用いられる、多数の部分配列、す
なわち、核酸配列である、配列番号1~10、およびアミノ酸配列である、配列番号11
~20を含む、例えば、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、ま
たは配列番号25の核酸配列を有しうることが決定されている。配列番号6~10は、そ
れぞれ、配列番号16~20のアミノ酸配列をコードする。配列番号1~5は、それぞれ
、配列番号6~10の核酸配列のサブセットである。配列番号11~15は、それぞれ、
配列番号16~20のアミノ酸配列のサブセットである。
アデノウイルスは、アデノウイルスベクター、例えば、遺伝子送達媒体として使用され
るように、既に公知のアデノウイルスと同じ方式で改変されうる。アデノウイルスおよび
アデノウイルスベクターは、複製コンピテント型の場合もあり、条件付き複製コンピテン
ト型の場合もあり、複製欠損型の場合もある。
るように、既に公知のアデノウイルスと同じ方式で改変されうる。アデノウイルスおよび
アデノウイルスベクターは、複製コンピテント型の場合もあり、条件付き複製コンピテン
ト型の場合もあり、複製欠損型の場合もある。
複製コンピテント型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、典型的な宿主
細胞内、すなわち、典型的に、アデノウイルスが感染することが可能な細胞内で複製され
うる。複製コンピテント型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、宿主細胞
内のウイルス複製を阻害しないアデノウイルスゲノム内に、野生型アデノウイルスと比較
した、1または複数の突然変異(例えば、1または複数の欠失、挿入、および/または置
換)を有しうる。例えば、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイ
ルスまたはアデノウイルスゲノムの繁殖に必須ではない、E3領域として公知の、アデノ
ウイルス早期領域の、部分的欠失または完全な欠失を有しうる。
細胞内、すなわち、典型的に、アデノウイルスが感染することが可能な細胞内で複製され
うる。複製コンピテント型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、宿主細胞
内のウイルス複製を阻害しないアデノウイルスゲノム内に、野生型アデノウイルスと比較
した、1または複数の突然変異(例えば、1または複数の欠失、挿入、および/または置
換)を有しうる。例えば、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイ
ルスまたはアデノウイルスゲノムの繁殖に必須ではない、E3領域として公知の、アデノ
ウイルス早期領域の、部分的欠失または完全な欠失を有しうる。
条件付き複製型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、所定の条件下で、
複製されるように操作された、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。例
えば、複製に必須の遺伝子機能、例えば、アデノウイルス早期領域によりコードされる遺
伝子機能は、誘導性転写制御配列、抑制性転写制御配列、または組織特異性転写制御配列
、例えば、プロモーターに作動可能に連結することができる。このような実施形態では、
複製は、転写制御配列と相互作用する、特異性因子の存在または非存在を必要とする。条
件付き複製型アデノウイルスベクターについては、米国特許第5,998,205号明細
書において、さらに記載されている。
複製されるように操作された、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。例
えば、複製に必須の遺伝子機能、例えば、アデノウイルス早期領域によりコードされる遺
伝子機能は、誘導性転写制御配列、抑制性転写制御配列、または組織特異性転写制御配列
、例えば、プロモーターに作動可能に連結することができる。このような実施形態では、
複製は、転写制御配列と相互作用する、特異性因子の存在または非存在を必要とする。条
件付き複製型アデノウイルスベクターについては、米国特許第5,998,205号明細
書において、さらに記載されている。
複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、例えば、典型的な宿主
細胞、とりわけ、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに感染させるヒトにおけ
る宿主細胞内でアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが複製されないような、1
または複数の、複製に必須の遺伝子機能または遺伝子領域の欠損の結果として、複製に必
要とされる、アデノウイルスゲノムの、1または複数の遺伝子機能または遺伝子領域の補
完を必要とするアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。
細胞、とりわけ、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターに感染させるヒトにおけ
る宿主細胞内でアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが複製されないような、1
または複数の、複製に必須の遺伝子機能または遺伝子領域の欠損の結果として、複製に必
要とされる、アデノウイルスゲノムの、1または複数の遺伝子機能または遺伝子領域の補
完を必要とするアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターである。
本明細書で使用される、遺伝子機能またはゲノム領域の欠損は、その核酸配列の一部ま
たは全部が破壊された(例えば、欠失させた)遺伝子の機能(例えば、遺伝子産物の機能
が、少なくとも約2分の1、5分の1、10分の1、20分の1、30分の1、または5
0分の1に低減されるように)を消失させるか、または損なうのに十分な、アデノウイル
スゲノムの遺伝子的素材の破壊(例えば、欠失)として規定される。完全な遺伝子領域の
欠失は、複製に必須の遺伝子機能の破壊に必要とされない。しかし、1または複数のトラ
ンス遺伝子のために、アデノウイルスゲノム内に、十分なスペースをもたらす目的で、1
または複数の遺伝子領域の大部分の除去が所望される場合がある。遺伝子素材の欠失が好
ましいが、付加または置換による遺伝子素材の突然変異もまた、遺伝子機能を破壊するた
めに適切である。複製に必須の遺伝子機能は、アデノウイルスの複製(例えば、繁殖)に
必要とされる遺伝子機能であり、例えば、アデノウイルス早期領域(例えば、E1領域、
E2領域、およびE4領域)、後期領域(例えば、L1領域、L2領域、L3領域、L4
領域、およびL5領域)、ウイルスのパッケージングに関与する遺伝子(例えば、IVa
2遺伝子)、およびウイルス関連RNA(例えば、VA-RNA-1および/またはVA
-RNA-2)によりコードされる。
たは全部が破壊された(例えば、欠失させた)遺伝子の機能(例えば、遺伝子産物の機能
が、少なくとも約2分の1、5分の1、10分の1、20分の1、30分の1、または5
0分の1に低減されるように)を消失させるか、または損なうのに十分な、アデノウイル
スゲノムの遺伝子的素材の破壊(例えば、欠失)として規定される。完全な遺伝子領域の
欠失は、複製に必須の遺伝子機能の破壊に必要とされない。しかし、1または複数のトラ
ンス遺伝子のために、アデノウイルスゲノム内に、十分なスペースをもたらす目的で、1
または複数の遺伝子領域の大部分の除去が所望される場合がある。遺伝子素材の欠失が好
ましいが、付加または置換による遺伝子素材の突然変異もまた、遺伝子機能を破壊するた
めに適切である。複製に必須の遺伝子機能は、アデノウイルスの複製(例えば、繁殖)に
必要とされる遺伝子機能であり、例えば、アデノウイルス早期領域(例えば、E1領域、
E2領域、およびE4領域)、後期領域(例えば、L1領域、L2領域、L3領域、L4
領域、およびL5領域)、ウイルスのパッケージングに関与する遺伝子(例えば、IVa
2遺伝子)、およびウイルス関連RNA(例えば、VA-RNA-1および/またはVA
-RNA-2)によりコードされる。
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、複製コンピテントであれ、複製欠損
であれ、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの少な
くとも一部を保持する。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、タンパク質コ
ード領域およびタンパク質非コード領域を含む、アデノウイルスゲノムの任意の部分を含
みうる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスタンパク質を
コードする、少なくとも1つの核酸配列を含むことが所望される。アデノウイルスまたは
アデノウイルスベクターは、例えば、早期領域遺伝子(すなわち、E1A、E1B、E2
A、E2B、E3、および/またはE4領域)のうちのいずれか1つによりコードされる
タンパク質、またはウイルス構造タンパク質をコードする、後期領域遺伝子(すなわち、
L1、L2、L3、L4、およびL5領域)のうちのいずれか1つによりコードされるタ
ンパク質など、任意の適するアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含みうる
。
であれ、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの少な
くとも一部を保持する。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、タンパク質コ
ード領域およびタンパク質非コード領域を含む、アデノウイルスゲノムの任意の部分を含
みうる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスタンパク質を
コードする、少なくとも1つの核酸配列を含むことが所望される。アデノウイルスまたは
アデノウイルスベクターは、例えば、早期領域遺伝子(すなわち、E1A、E1B、E2
A、E2B、E3、および/またはE4領域)のうちのいずれか1つによりコードされる
タンパク質、またはウイルス構造タンパク質をコードする、後期領域遺伝子(すなわち、
L1、L2、L3、L4、およびL5領域)のうちのいずれか1つによりコードされるタ
ンパク質など、任意の適するアデノウイルスタンパク質をコードする核酸配列を含みうる
。
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、pIXタンパク質、DNAポリメラ
ーゼタンパク質、ペントンタンパク質、ヘキソンタンパク質、および/または線維タンパ
ク質をコードする、1または複数の核酸配列を含むことが所望される。アデノウイルスま
たはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスタンパク質の、全長アミノ酸配列をコー
ドする、全長核酸配列を含みうる。代替的に、アデノウイルスまたはアデノウイルスベク
ターは、アデノウイルスタンパク質の、全長アミノ酸配列の部分をコードする、全長核酸
配列の部分を含みうる。
ーゼタンパク質、ペントンタンパク質、ヘキソンタンパク質、および/または線維タンパ
ク質をコードする、1または複数の核酸配列を含むことが所望される。アデノウイルスま
たはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスタンパク質の、全長アミノ酸配列をコー
ドする、全長核酸配列を含みうる。代替的に、アデノウイルスまたはアデノウイルスベク
ターは、アデノウイルスタンパク質の、全長アミノ酸配列の部分をコードする、全長核酸
配列の部分を含みうる。
核酸配列の「部分」は、少なくとも10ヌクレオチド(例えば、約10~約5000ヌ
クレオチド)を含む。好ましくは、核酸配列の「部分」は、10またはこれを超える(例
えば、15もしくはこれを超える、20もしくはこれを超える、25もしくはこれを超え
る、30もしくはこれを超える、35もしくはこれを超える、40もしくはこれを超える
、45もしくはこれを超える、50もしくはこれを超える、または100またはこれを超
える)ヌクレオチドを含むが、5,000未満の(例えば、4900もしくはこれ未満、
4000もしくはこれ未満、3000もしくはこれ未満、2000もしくはこれ未満、1
000もしくはこれ未満、800もしくはこれ未満、500もしくはこれ未満、300も
しくはこれ未満、または100もしくはこれ未満の)ヌクレオチドを含む。好ましくは、
核酸配列の部分は、約10~約3500ヌクレオチド(例えば、約10、20、30、5
0、100、300、500、700、1000、1500、2000、2500、また
は3000ヌクレオチド)、約10~約1000ヌクレオチド(例えば、約25、55、
125、325、525、725、または925ヌクレオチド)、もしくは約10~約5
00ヌクレオチド(例えば、約15、30、40、50、60、70、80、90、15
0、175、250、275、350、375、450、475、480、490、49
5、または499ヌクレオチド)、または前出の値のうちの、任意の2つにより規定され
る範囲である。より好ましくは、核酸配列の「部分」は、約3200ヌクレオチド以下(
例えば、約10~約3200ヌクレオチド、約10~約3000ヌクレオチド、もしくは
約30~約500ヌクレオチド、または前出の値のうちの、任意の2つにより規定される
範囲)を含む。
クレオチド)を含む。好ましくは、核酸配列の「部分」は、10またはこれを超える(例
えば、15もしくはこれを超える、20もしくはこれを超える、25もしくはこれを超え
る、30もしくはこれを超える、35もしくはこれを超える、40もしくはこれを超える
、45もしくはこれを超える、50もしくはこれを超える、または100またはこれを超
える)ヌクレオチドを含むが、5,000未満の(例えば、4900もしくはこれ未満、
4000もしくはこれ未満、3000もしくはこれ未満、2000もしくはこれ未満、1
000もしくはこれ未満、800もしくはこれ未満、500もしくはこれ未満、300も
しくはこれ未満、または100もしくはこれ未満の)ヌクレオチドを含む。好ましくは、
核酸配列の部分は、約10~約3500ヌクレオチド(例えば、約10、20、30、5
0、100、300、500、700、1000、1500、2000、2500、また
は3000ヌクレオチド)、約10~約1000ヌクレオチド(例えば、約25、55、
125、325、525、725、または925ヌクレオチド)、もしくは約10~約5
00ヌクレオチド(例えば、約15、30、40、50、60、70、80、90、15
0、175、250、275、350、375、450、475、480、490、49
5、または499ヌクレオチド)、または前出の値のうちの、任意の2つにより規定され
る範囲である。より好ましくは、核酸配列の「部分」は、約3200ヌクレオチド以下(
例えば、約10~約3200ヌクレオチド、約10~約3000ヌクレオチド、もしくは
約30~約500ヌクレオチド、または前出の値のうちの、任意の2つにより規定される
範囲)を含む。
アミノ酸配列の「部分」は、少なくとも3アミノ酸(例えば、約3~約1,200アミ
ノ酸)を含む。好ましくは、アミノ酸配列の「部分」は、3またはこれを超える(例えば
、5もしくはこれを超える、10もしくはこれを超える、15もしくはこれを超える、2
0もしくはこれを超える、25もしくはこれを超える、30もしくはこれを超える、40
もしくはこれを超える、または50またはこれを超える)アミノ酸を含むが、1,200
未満の(例えば、1,000もしくはこれ未満、800もしくはこれ未満、700もしく
はこれ未満、600もしくはこれ未満、500もしくはこれ未満、400もしくはこれ未
満、300もしくはこれ未満、200もしくはこれ未満、または100もしくはこれ未満
の)アミノ酸を含む。好ましくは、アミノ酸配列の部分は、約3~約500アミノ酸(例
えば、約10、100、200、300、400、または500アミノ酸)、約3~約3
00アミノ酸(例えば、約20、50、75、95、150、175、または200アミ
ノ酸)、もしくは約3~約100アミノ酸(例えば、約15、25、35、40、45、
60、65、70、80、85、90、95、または99アミノ酸)、または前出の値の
うちの、任意の2つにより規定される範囲である。より好ましくは、アミノ酸配列の「部
分」は、約500アミノ酸以下(例えば、約3~約400アミノ酸、約10~約250ア
ミノ酸、もしくは約50~約100アミノ酸、または前出の値のうちの、任意の2つによ
り規定される範囲)を含む。
ノ酸)を含む。好ましくは、アミノ酸配列の「部分」は、3またはこれを超える(例えば
、5もしくはこれを超える、10もしくはこれを超える、15もしくはこれを超える、2
0もしくはこれを超える、25もしくはこれを超える、30もしくはこれを超える、40
もしくはこれを超える、または50またはこれを超える)アミノ酸を含むが、1,200
未満の(例えば、1,000もしくはこれ未満、800もしくはこれ未満、700もしく
はこれ未満、600もしくはこれ未満、500もしくはこれ未満、400もしくはこれ未
満、300もしくはこれ未満、200もしくはこれ未満、または100もしくはこれ未満
の)アミノ酸を含む。好ましくは、アミノ酸配列の部分は、約3~約500アミノ酸(例
えば、約10、100、200、300、400、または500アミノ酸)、約3~約3
00アミノ酸(例えば、約20、50、75、95、150、175、または200アミ
ノ酸)、もしくは約3~約100アミノ酸(例えば、約15、25、35、40、45、
60、65、70、80、85、90、95、または99アミノ酸)、または前出の値の
うちの、任意の2つにより規定される範囲である。より好ましくは、アミノ酸配列の「部
分」は、約500アミノ酸以下(例えば、約3~約400アミノ酸、約10~約250ア
ミノ酸、もしくは約50~約100アミノ酸、または前出の値のうちの、任意の2つによ
り規定される範囲)を含む。
アデノウイルスpIXタンパク質は、アデノウイルスカプシド内に存在し、ヘキソン九
量体相互作用を強化することが示されており、全長ゲノムをパッケージングするために必
須である(例えば、Boulanger et al., J. Gen. Virol., 44: 783-800 (1979); Horwitz
M.S., “Adenoviridae and their replication” in Virology, 2nd ed., B.N. Fields e
t al. (eds.), Raven Press, Ltd., New York, pp. 1679-1721 (1990), Ghosh-Choudhury
et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)および van Oostrum et al, J. Virol., 56: 43
9-448 (1985)を参照されたい)。その、アデノウイルス構造への寄与に加えて、pIXは
また、アデノウイルス主要後期プロモーター(MLP)活性の刺激などの転写特性を呈す
ることも示されている(例えば、Lutz et al., J. Virol., 71(7): 5102-5109 (1997)を
参照されたい)。アデノウイルスpIXタンパク質の全部または一部をコードする核酸配
列は、例えば、配列番号6および配列番号1を含む。全長pIXタンパク質またはその一
部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号16および配列番号11を含む。
量体相互作用を強化することが示されており、全長ゲノムをパッケージングするために必
須である(例えば、Boulanger et al., J. Gen. Virol., 44: 783-800 (1979); Horwitz
M.S., “Adenoviridae and their replication” in Virology, 2nd ed., B.N. Fields e
t al. (eds.), Raven Press, Ltd., New York, pp. 1679-1721 (1990), Ghosh-Choudhury
et al., EMBO J., 6: 1733-1739 (1987)および van Oostrum et al, J. Virol., 56: 43
9-448 (1985)を参照されたい)。その、アデノウイルス構造への寄与に加えて、pIXは
また、アデノウイルス主要後期プロモーター(MLP)活性の刺激などの転写特性を呈す
ることも示されている(例えば、Lutz et al., J. Virol., 71(7): 5102-5109 (1997)を
参照されたい)。アデノウイルスpIXタンパク質の全部または一部をコードする核酸配
列は、例えば、配列番号6および配列番号1を含む。全長pIXタンパク質またはその一
部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号16および配列番号11を含む。
アデノウイルスDNAポリメラーゼタンパク質は、in vitroおよびin vi
voのいずれにおいても、ウイルスのDNA複製に必須である。ポリメラーゼは、アデノ
ウイルスDNAの5’末端へと共有結合的に接合した末端タンパク質(TP)の前駆体(
pTP)との複合体として共精製される(Field et al., J. Biol. Chem., 259: 9487-94
95 (1984))。アデノウイルスDNAポリメラーゼおよびpTPのいずれも、E2領域に
よりコードされる。ポリメラーゼタンパク質は、pIXを除く、全ての構造タンパク質の
発現に必要とされる。ポリメラーゼタンパク質の遺伝子配列を伴わなければ、ポリメラー
ゼタンパク質は、産生されない。結果として、ウイルスゲノムは、複製されず、主要後期
プロモーターは、活性化せず、カプシドタンパク質も発現しない。アデノウイルスDNA
ポリメラーゼタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号7
および配列番号2を含む。全長アデノウイルスDNAポリメラーゼまたはその一部を含む
アミノ酸配列は、例えば、配列番号17および配列番号12を含む。
voのいずれにおいても、ウイルスのDNA複製に必須である。ポリメラーゼは、アデノ
ウイルスDNAの5’末端へと共有結合的に接合した末端タンパク質(TP)の前駆体(
pTP)との複合体として共精製される(Field et al., J. Biol. Chem., 259: 9487-94
95 (1984))。アデノウイルスDNAポリメラーゼおよびpTPのいずれも、E2領域に
よりコードされる。ポリメラーゼタンパク質は、pIXを除く、全ての構造タンパク質の
発現に必要とされる。ポリメラーゼタンパク質の遺伝子配列を伴わなければ、ポリメラー
ゼタンパク質は、産生されない。結果として、ウイルスゲノムは、複製されず、主要後期
プロモーターは、活性化せず、カプシドタンパク質も発現しない。アデノウイルスDNA
ポリメラーゼタンパク質の全部または一部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号7
および配列番号2を含む。全長アデノウイルスDNAポリメラーゼまたはその一部を含む
アミノ酸配列は、例えば、配列番号17および配列番号12を含む。
アデノウイルスヘキソンタンパク質は、アデノウイルスのカプシド内で、最も大型、か
つ、最も豊富なタンパク質である。ヘキソンタンパク質は、ウイルスカプシドのアセンブ
リー、カプシドの二十面体の対称性(これが、カプシド容量およびDNAパッケージング
サイズを規定する)の決定、およびカプシドの完全性に必須である。加えて、ヘキソンは
、アデノウイルスベクターの中和を低減するための改変のための、第1の標的である(例
えば、Gall et al., J. Virol., 72: 10260-264 (1998)およびRux et al., J. Virol., 7
7(17): 9553-9566 (2003)を参照されたい)。ヘキソンタンパク質の、主要な構造特徴は
、血清型にわたり、アデノウイルスにより共有されているが、ヘキソンタンパク質は、血
清型間で、サイズおよび免疫学的特性が異なる(Jornvall et al., J. Biol. Chem., 256
(12): 6181-6186 (1981))。15のアデノウイルスヘキソンタンパク質の比較は、ヘキソ
ンの、主要な抗原領域および血清型特異性領域が、ループ1および2(すなわち、それぞ
れ、LIまたはl1、およびLIIまたはl2)であり、この中には、アデノウイルス血
清型の間で、長さおよび配列が変動する、7つの、個別の超可変領域(HVR1~HVR
7)が存在することを明らかにした(Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70(3): 1836
-1844 (1996))。アデノウイルスヘキソンタンパク質の全部または一部をコードする核酸
配列は、例えば、配列番号9および配列番号4を含む。全長アデノウイルスヘキソンタン
パク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号19および配列番号1
4を含む。
つ、最も豊富なタンパク質である。ヘキソンタンパク質は、ウイルスカプシドのアセンブ
リー、カプシドの二十面体の対称性(これが、カプシド容量およびDNAパッケージング
サイズを規定する)の決定、およびカプシドの完全性に必須である。加えて、ヘキソンは
、アデノウイルスベクターの中和を低減するための改変のための、第1の標的である(例
えば、Gall et al., J. Virol., 72: 10260-264 (1998)およびRux et al., J. Virol., 7
7(17): 9553-9566 (2003)を参照されたい)。ヘキソンタンパク質の、主要な構造特徴は
、血清型にわたり、アデノウイルスにより共有されているが、ヘキソンタンパク質は、血
清型間で、サイズおよび免疫学的特性が異なる(Jornvall et al., J. Biol. Chem., 256
(12): 6181-6186 (1981))。15のアデノウイルスヘキソンタンパク質の比較は、ヘキソ
ンの、主要な抗原領域および血清型特異性領域が、ループ1および2(すなわち、それぞ
れ、LIまたはl1、およびLIIまたはl2)であり、この中には、アデノウイルス血
清型の間で、長さおよび配列が変動する、7つの、個別の超可変領域(HVR1~HVR
7)が存在することを明らかにした(Crawford-Miksza et al., J. Virol., 70(3): 1836
-1844 (1996))。アデノウイルスヘキソンタンパク質の全部または一部をコードする核酸
配列は、例えば、配列番号9および配列番号4を含む。全長アデノウイルスヘキソンタン
パク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号19および配列番号1
4を含む。
アデノウイルス線維タンパク質は、3つのドメイン:テール、シャフト、およびノブを
有する、アデノウイルスIV型ポリペプチドのホモ三量体である(Devaux et al., J. Mo
lec. Biol., 215: 567-88 (1990), Yeh et al., Virus Res., 33: 179-98 (1991))。線
維タンパク質は、ノブドメインおよびシャフトドメインを介して、細胞表面上の受容体へ
の、一次ウイルス結合を媒介する(Henry et al., J. Virol., 68(8): 5239-46 (1994))
。三量体化のためのアミノ酸配列は、線維のアミノ末端(テール)が、ペントンベースと
、適正に会合するのに必要であると考えられる、ノブ内に位置する(Novelli et al., Vi
rology, 185: 365-76 (1991))。細胞受容体を認識し、ペントンベースに結合することに
加えて、線維は、血清型の識別にも寄与する。異なるアデノウイルス血清型に由来する線
維タンパク質は、大幅に異なる(例えば、Green et al., EMBO J., 2: 1357-65 (1983),
Chroboczek et al., Virology, 186: 280-85 (1992);およびSignas et al., J. Virol.,
53: 672-78 (1985)を参照されたい)。したがって、線維タンパク質は、アデノウイルス
の生活環に重要な、複数の機能を有する。アデノウイルス線維タンパク質の全部または一
部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号10および配列番号5を含む。全長アデノ
ウイルス線維タンパク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号20
および配列番号15を含む。
有する、アデノウイルスIV型ポリペプチドのホモ三量体である(Devaux et al., J. Mo
lec. Biol., 215: 567-88 (1990), Yeh et al., Virus Res., 33: 179-98 (1991))。線
維タンパク質は、ノブドメインおよびシャフトドメインを介して、細胞表面上の受容体へ
の、一次ウイルス結合を媒介する(Henry et al., J. Virol., 68(8): 5239-46 (1994))
。三量体化のためのアミノ酸配列は、線維のアミノ末端(テール)が、ペントンベースと
、適正に会合するのに必要であると考えられる、ノブ内に位置する(Novelli et al., Vi
rology, 185: 365-76 (1991))。細胞受容体を認識し、ペントンベースに結合することに
加えて、線維は、血清型の識別にも寄与する。異なるアデノウイルス血清型に由来する線
維タンパク質は、大幅に異なる(例えば、Green et al., EMBO J., 2: 1357-65 (1983),
Chroboczek et al., Virology, 186: 280-85 (1992);およびSignas et al., J. Virol.,
53: 672-78 (1985)を参照されたい)。したがって、線維タンパク質は、アデノウイルス
の生活環に重要な、複数の機能を有する。アデノウイルス線維タンパク質の全部または一
部をコードする核酸配列は、例えば、配列番号10および配列番号5を含む。全長アデノ
ウイルス線維タンパク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番号20
および配列番号15を含む。
アデノウイルスペントンベースタンパク質は、二十面体カプシドの頂点に位置し、5つ
の、同一な単量体を含む。ペントンベースタンパク質は、二十面体カプシドの、複数のフ
ァセット上で、ヘキソンタンパク質を架橋する構造をもたらし、線維タンパク質が、カプ
シド内に組み込まれるために必須のインターフェースをもたらす。ペントンベースの各単
量体は、RGDトリペプチドモチーフを含有する(Neumann et al., Gene, 69: 153-157
(1988))。RGDトリペプチドは、αvインテグリンへの結合を媒介し、ペントンベース
のRGD配列内に点突然変異を有するアデノウイルスは、細胞に感染する、それらの能力
が制限される(Bai et al., J. Virol., 67: 5198-5205 (1993))。したがって、ペント
ンベースタンパク質は、カプシドのアーキテクチャーおよびウイルス-細胞間相互作用の
最大限の効率に必須である。アデノウイルスペントンベースタンパク質の全部または一部
をコードする核酸配列は、例えば、配列番号8および配列番号3を含む。全長アデノウイ
ルスペントンベースタンパク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番
号18および配列番号13を含む。
の、同一な単量体を含む。ペントンベースタンパク質は、二十面体カプシドの、複数のフ
ァセット上で、ヘキソンタンパク質を架橋する構造をもたらし、線維タンパク質が、カプ
シド内に組み込まれるために必須のインターフェースをもたらす。ペントンベースの各単
量体は、RGDトリペプチドモチーフを含有する(Neumann et al., Gene, 69: 153-157
(1988))。RGDトリペプチドは、αvインテグリンへの結合を媒介し、ペントンベース
のRGD配列内に点突然変異を有するアデノウイルスは、細胞に感染する、それらの能力
が制限される(Bai et al., J. Virol., 67: 5198-5205 (1993))。したがって、ペント
ンベースタンパク質は、カプシドのアーキテクチャーおよびウイルス-細胞間相互作用の
最大限の効率に必須である。アデノウイルスペントンベースタンパク質の全部または一部
をコードする核酸配列は、例えば、配列番号8および配列番号3を含む。全長アデノウイ
ルスペントンベースタンパク質、またはその一部を含むアミノ酸配列は、例えば、配列番
号18および配列番号13を含む。
本明細書で記載される、核酸配列またはアミノ酸配列の「同一性」は、目的の核酸配列
またはアミノ酸配列を、基準の核酸配列またはアミノ酸配列と比較することにより決定し
うる。結果として目的の配列をもたらすように、基準配列内で、変化させられ、かつ/ま
たは修飾される(例えば、点突然変異、挿入、または欠失などにより)、ヌクレオチドま
たはアミノ酸残基の数をカウントする。このような変化の総数を、目的の配列の全長から
減じ、差を、目的の配列の長さで除し、百分率として表す。最適のアライメントを得、2
つまたはこれを超える配列の間の同一性を計算するための、多数の数学的アルゴリズムが
公知であり、多数の、利用可能なソフトプログラムへと組み込まれている。このようなプ
ログラムの例は、CLUSTAL-W、T-Coffee、およびALIGN(核酸配列
およびアミノ酸配列のアライメントのための)、BLASTプログラム(例えば、BLA
ST 2.1、BL2SEQ、およびこれらの最新バージョン)、およびFASTAプロ
グラム(例えば、FASTA3x、FASTM、およびSSEARCH)(配列アライメ
ントおよび配列類似性の検索のための)を含む。配列アライメントアルゴリズムはまた、
例えば、Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds.,
Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acid
s, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(
7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997
)およびGusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge Universit
y Press, Cambridge UK (1997)においても開示されている。
またはアミノ酸配列を、基準の核酸配列またはアミノ酸配列と比較することにより決定し
うる。結果として目的の配列をもたらすように、基準配列内で、変化させられ、かつ/ま
たは修飾される(例えば、点突然変異、挿入、または欠失などにより)、ヌクレオチドま
たはアミノ酸残基の数をカウントする。このような変化の総数を、目的の配列の全長から
減じ、差を、目的の配列の長さで除し、百分率として表す。最適のアライメントを得、2
つまたはこれを超える配列の間の同一性を計算するための、多数の数学的アルゴリズムが
公知であり、多数の、利用可能なソフトプログラムへと組み込まれている。このようなプ
ログラムの例は、CLUSTAL-W、T-Coffee、およびALIGN(核酸配列
およびアミノ酸配列のアライメントのための)、BLASTプログラム(例えば、BLA
ST 2.1、BL2SEQ、およびこれらの最新バージョン)、およびFASTAプロ
グラム(例えば、FASTA3x、FASTM、およびSSEARCH)(配列アライメ
ントおよび配列類似性の検索のための)を含む。配列アライメントアルゴリズムはまた、
例えば、Altschul et al., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin et al., eds.,
Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acid
s, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(
7): 951-960 (2005), Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997
)およびGusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge Universit
y Press, Cambridge UK (1997)においても開示されている。
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、前述の配列のうちの、1つ、2つ、
3つ、4つ、または5つ全てを、単独で、または任意の組合せで含みうる。この点で、ア
デノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、前述の配列のうちの、任意の2つの、任
意の組合せ、前述の配列のうちの、任意の3つの、任意の組合せ、前述の配列のうちの、
任意の4つの、任意の組合せ、または前述の配列の5つ全てを含みうる。
3つ、4つ、または5つ全てを、単独で、または任意の組合せで含みうる。この点で、ア
デノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、前述の配列のうちの、任意の2つの、任
意の組合せ、前述の配列のうちの、任意の3つの、任意の組合せ、前述の配列のうちの、
任意の4つの、任意の組合せ、または前述の配列の5つ全てを含みうる。
本明細書で論じられる通り、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製コ
ンピテント型の場合もあり、条件付き複製型の場合もあり、複製欠損型の場合もある。好
ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型のアデノウイル
スまたはアデノウイルスベクターが、繁殖のために(例えば、アデノウイルスベクター粒
子を形成するために)、アデノウイルスゲノムの、1または複数の領域の、少なくとも1
つの、複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とするように、複製欠損型である。
ンピテント型の場合もあり、条件付き複製型の場合もあり、複製欠損型の場合もある。好
ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型のアデノウイル
スまたはアデノウイルスベクターが、繁殖のために(例えば、アデノウイルスベクター粒
子を形成するために)、アデノウイルスゲノムの、1または複数の領域の、少なくとも1
つの、複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とするように、複製欠損型である。
複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のための、アデノ
ウイルスゲノムの、1または複数の領域内の、1または複数の、複製に必須の遺伝子機能
の欠損を引き起こすのに適する、任意の方式で改変することができる。アデノウイルスゲ
ノムの、1または複数の領域の、1または複数の、複製に必須の遺伝子機能の欠損の補完
とは、欠損させた、複製に必須の遺伝子機能をもたらす、外因性手段の使用を指す。この
ような補完は、例えば、細胞、および/または、破壊された、複製に必須の遺伝子機能を
コードする、外因性DNA(例えば、ヘルパーアデノウイルス)の補完を使用することに
より、任意の適切な方式でなされうる。
ウイルスゲノムの、1または複数の領域内の、1または複数の、複製に必須の遺伝子機能
の欠損を引き起こすのに適する、任意の方式で改変することができる。アデノウイルスゲ
ノムの、1または複数の領域の、1または複数の、複製に必須の遺伝子機能の欠損の補完
とは、欠損させた、複製に必須の遺伝子機能をもたらす、外因性手段の使用を指す。この
ような補完は、例えば、細胞、および/または、破壊された、複製に必須の遺伝子機能を
コードする、外因性DNA(例えば、ヘルパーアデノウイルス)の補完を使用することに
より、任意の適切な方式でなされうる。
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの、早期領域
(すなわち、E1~E4領域)だけ、アデノウイルスゲノムの、後期領域(すなわち、L
1~L5領域)だけ、アデノウイルスゲノムの、早期領域および後期領域の両方、または
全てのアデノウイルス遺伝子(すなわち、高容量アデノベクター(HC-Ad))のうち
の、1または複数の、複製に必須の遺伝子機能を欠損させることができる。Morsy et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 965-976 (1998); Chen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 94: 1645-1650 (1997);およびKochanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451
-2459 (1999)を参照されたい。複製欠損型アデノウイルスベクターの例は、米国特許第5
,837,511号明細書;同第5,851,806号明細書;同第5,994,106
号明細書;同第6,127,175号明細書;同第6,482,616号明細書;および
同第7,195,896号明細書、ならびに国際特許出願公開第1994/028152
号パンフレット、同第1995/002697号パンフレット、同第1995/0167
72号パンフレット、同第1995/034671号パンフレット、同第1996/02
2378号パンフレット、同第1997/012986号パンフレット、同第1997/
021826号パンフレット、および同第2003/022311号パンフレットにおい
て開示されている。
(すなわち、E1~E4領域)だけ、アデノウイルスゲノムの、後期領域(すなわち、L
1~L5領域)だけ、アデノウイルスゲノムの、早期領域および後期領域の両方、または
全てのアデノウイルス遺伝子(すなわち、高容量アデノベクター(HC-Ad))のうち
の、1または複数の、複製に必須の遺伝子機能を欠損させることができる。Morsy et al.
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 965-976 (1998); Chen et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 94: 1645-1650 (1997);およびKochanek et al., Hum. Gene Ther., 10: 2451
-2459 (1999)を参照されたい。複製欠損型アデノウイルスベクターの例は、米国特許第5
,837,511号明細書;同第5,851,806号明細書;同第5,994,106
号明細書;同第6,127,175号明細書;同第6,482,616号明細書;および
同第7,195,896号明細書、ならびに国際特許出願公開第1994/028152
号パンフレット、同第1995/002697号パンフレット、同第1995/0167
72号パンフレット、同第1995/034671号パンフレット、同第1996/02
2378号パンフレット、同第1997/012986号パンフレット、同第1997/
021826号パンフレット、および同第2003/022311号パンフレットにおい
て開示されている。
アデノウイルスゲノムの早期領域は、E1領域、E2領域、E3領域、およびE4領域
を含む。E1領域は、E1A亜領域およびE1B亜領域を含み、E1領域内の、複製に必
須の遺伝子機能の、1または複数の欠損は、E1A亜領域およびE1B亜領域の一方また
は両方における、複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の欠損、これにより、アデノ
ウイルスまたはアデノウイルスベクターが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベ
クター粒子を形成するために)、アデノウイルスゲノムの、E1A亜領域および/または
E1B亜領域の補完を必要とする。E2領域は、E2A亜領域およびE2B亜領域を含み
、E2領域内の、複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の欠損は、E2A亜領域およ
びE2B亜領域の一方または両方における、複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の
欠損を含むことが可能であり、これにより、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクタ
ーが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、アデ
ノウイルスゲノムの、E2A亜領域および/またはE2B亜領域の補完を必要とする。
を含む。E1領域は、E1A亜領域およびE1B亜領域を含み、E1領域内の、複製に必
須の遺伝子機能の、1または複数の欠損は、E1A亜領域およびE1B亜領域の一方また
は両方における、複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の欠損、これにより、アデノ
ウイルスまたはアデノウイルスベクターが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベ
クター粒子を形成するために)、アデノウイルスゲノムの、E1A亜領域および/または
E1B亜領域の補完を必要とする。E2領域は、E2A亜領域およびE2B亜領域を含み
、E2領域内の、複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の欠損は、E2A亜領域およ
びE2B亜領域の一方または両方における、複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の
欠損を含むことが可能であり、これにより、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクタ
ーが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、アデ
ノウイルスゲノムの、E2A亜領域および/またはE2B亜領域の補完を必要とする。
E3領域は、E3領域の、一部または全部の欠失が、アデノウイルスまたはアデノウイ
ルスベクターが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するため
に)、E3領域内の、任意の遺伝子機能の補完を必要としないように、複製に必須の遺伝
子機能を含まない。本開示の文脈では、E3領域は、ヒトアデノウイルス5のE3領域に
由来する、12.5Kのタンパク質(NCBI基準配列:AP_000218)に対する
、高度の相同性を伴うタンパク質をコードするオープンリーディングフレームで始まり、
ヒトアデノウイルス5のE3領域に由来する、14.7Kのタンパク質(NCBI基準配
列:AP_000224.1)に対する、高度の相同性を伴うタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームで終わる領域として規定される。E3領域は、一部または全
部を欠失させることもでき、一部または全部を保持することもできる。欠失のサイズは、
そのゲノムが、最適のゲノムパッケージングサイズに、緊密にマッチする、アデノウイル
スまたはアデノウイルスベクターを保持するように、微調整することができる。大型の欠
失は、アデノウイルス内またはアデノウイルスゲノム内の、大型の異種核酸配列の挿入に
適合するであろう。本開示の一実施形態では、E3領域内に存在する、L4ポリアデニル
化シグナル配列は、保持される。
ルスベクターが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するため
に)、E3領域内の、任意の遺伝子機能の補完を必要としないように、複製に必須の遺伝
子機能を含まない。本開示の文脈では、E3領域は、ヒトアデノウイルス5のE3領域に
由来する、12.5Kのタンパク質(NCBI基準配列:AP_000218)に対する
、高度の相同性を伴うタンパク質をコードするオープンリーディングフレームで始まり、
ヒトアデノウイルス5のE3領域に由来する、14.7Kのタンパク質(NCBI基準配
列:AP_000224.1)に対する、高度の相同性を伴うタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームで終わる領域として規定される。E3領域は、一部または全
部を欠失させることもでき、一部または全部を保持することもできる。欠失のサイズは、
そのゲノムが、最適のゲノムパッケージングサイズに、緊密にマッチする、アデノウイル
スまたはアデノウイルスベクターを保持するように、微調整することができる。大型の欠
失は、アデノウイルス内またはアデノウイルスゲノム内の、大型の異種核酸配列の挿入に
適合するであろう。本開示の一実施形態では、E3領域内に存在する、L4ポリアデニル
化シグナル配列は、保持される。
E4領域は、複数のオープンリーディングフレーム(ORF)を含む。ORF6を除き
、場合によって、ORF3を除く、E4領域のオープンリーディングフレームの全てを欠
失させた、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはアデ
ノウイルスベクターが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成す
るために)、E4領域内の、任意の遺伝子機能の補完を必要としない。逆に、E4領域の
、ORF6の破壊または欠失であり、場合によって、ORF3の破壊または欠失を伴い(
例えば、E4領域の、ORF6および/またはORF3に基づく、複製に必須の遺伝子機
能を欠損させ)、E4領域、または天然のE4プロモーター、ポリアデニル化配列、およ
び/もしくは右側のITR(inverted terminal repeat)の、
他のオープンリーディングフレームのうちのいずれかの、破壊または欠失を伴うか、また
は伴わない、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはア
デノウイルスベクターが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成
するために)、E4領域の補完(具体的には、E4領域のうちの、ORF6および/また
はORF3の補完)を必要とする。アデノウイルスゲノムの後期領域は、L1領域、L2
領域、L3領域、L4領域、およびL5領域を含む。アデノウイルスまたはアデノウイル
スベクターはまた、主要後期プロモーター(MLP)内の突然変異であって、国際特許出
願公開第2000/000628号パンフレットにおいて論じられている通り、所望の場
合、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを、複製欠損型としうる突然変異も有
しうる。
、場合によって、ORF3を除く、E4領域のオープンリーディングフレームの全てを欠
失させた、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはアデ
ノウイルスベクターが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成す
るために)、E4領域内の、任意の遺伝子機能の補完を必要としない。逆に、E4領域の
、ORF6の破壊または欠失であり、場合によって、ORF3の破壊または欠失を伴い(
例えば、E4領域の、ORF6および/またはORF3に基づく、複製に必須の遺伝子機
能を欠損させ)、E4領域、または天然のE4プロモーター、ポリアデニル化配列、およ
び/もしくは右側のITR(inverted terminal repeat)の、
他のオープンリーディングフレームのうちのいずれかの、破壊または欠失を伴うか、また
は伴わない、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスまたはア
デノウイルスベクターが、繁殖するために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成
するために)、E4領域の補完(具体的には、E4領域のうちの、ORF6および/また
はORF3の補完)を必要とする。アデノウイルスゲノムの後期領域は、L1領域、L2
領域、L3領域、L4領域、およびL5領域を含む。アデノウイルスまたはアデノウイル
スベクターはまた、主要後期プロモーター(MLP)内の突然変異であって、国際特許出
願公開第2000/000628号パンフレットにおいて論じられている通り、所望の場
合、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを、複製欠損型としうる突然変異も有
しうる。
複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の欠損を含有する、アデノウイルスゲノムの
、1または複数の領域は、1または複数のアデノウイルスゲノムの早期領域、すなわち、
任意選択で、E3領域の一部または全部における欠失を伴う、E1領域、E2領域、およ
び/またはE4領域であることが所望される。
、1または複数の領域は、1または複数のアデノウイルスゲノムの早期領域、すなわち、
任意選択で、E3領域の一部または全部における欠失を伴う、E1領域、E2領域、およ
び/またはE4領域であることが所望される。
複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターはまた、宿主細胞内のウイ
ルス複製を阻害しないアデノウイルスゲノム内に、野生型アデノウイルスと比較した、1
または複数の突然変異(例えば、1または複数の欠失、挿入、および/または置換)も有
しうる。したがって、複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の欠損に加えて、アデノ
ウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製に必須ではない、他の点でも欠損させる
ことができる。例えば、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイル
スまたはアデノウイルスゲノムの繁殖に必須ではない、E3領域として公知の、アデノウ
イルス早期領域の、部分的欠失または完全な欠失を有しうる。
ルス複製を阻害しないアデノウイルスゲノム内に、野生型アデノウイルスと比較した、1
または複数の突然変異(例えば、1または複数の欠失、挿入、および/または置換)も有
しうる。したがって、複製に必須の遺伝子機能の、1または複数の欠損に加えて、アデノ
ウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製に必須ではない、他の点でも欠損させる
ことができる。例えば、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイル
スまたはアデノウイルスゲノムの繁殖に必須ではない、E3領域として公知の、アデノウ
イルス早期領域の、部分的欠失または完全な欠失を有しうる。
一実施形態では、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型であり
、繁殖のために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、最大で、ア
デノウイルスゲノムのE1領域またはE4領域の補完を必要とする。したがって、複製欠
損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために(例えば、アデノ
ウイルスベクター粒子を形成するために)、少なくとも1つの、アデノウイルスゲノム(
E1欠損アデノウイルスベクターを表示した)のE1A亜領域および/またはE1B領域
、またはアデノウイルスゲノム(E4欠損アデノウイルスベクターを表示した)のE4領
域の、複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイル
スベクターは、アデノウイルスゲノムのE1領域の、少なくとも1つの、複製に必須の遺
伝子機能(複製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される)と、アデノウイル
スゲノム(E1/E3欠損アデノウイルスベクターを表示した)の、非必須E3領域の、
少なくとも1つの遺伝子機能とを欠損させることができる。アデノウイルスまたはアデノ
ウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのE4領域の、少なくとも1つの、複製に必
須の遺伝子機能(複製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される)、およびア
デノウイルスゲノム(E3/E4欠損アデノウイルスベクターを表示した)の、非必須E
3領域の、少なくとも1つの遺伝子機能を欠損させることができる。
、繁殖のために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、最大で、ア
デノウイルスゲノムのE1領域またはE4領域の補完を必要とする。したがって、複製欠
損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために(例えば、アデノ
ウイルスベクター粒子を形成するために)、少なくとも1つの、アデノウイルスゲノム(
E1欠損アデノウイルスベクターを表示した)のE1A亜領域および/またはE1B領域
、またはアデノウイルスゲノム(E4欠損アデノウイルスベクターを表示した)のE4領
域の、複製に必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイル
スベクターは、アデノウイルスゲノムのE1領域の、少なくとも1つの、複製に必須の遺
伝子機能(複製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される)と、アデノウイル
スゲノム(E1/E3欠損アデノウイルスベクターを表示した)の、非必須E3領域の、
少なくとも1つの遺伝子機能とを欠損させることができる。アデノウイルスまたはアデノ
ウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのE4領域の、少なくとも1つの、複製に必
須の遺伝子機能(複製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される)、およびア
デノウイルスゲノム(E3/E4欠損アデノウイルスベクターを表示した)の、非必須E
3領域の、少なくとも1つの遺伝子機能を欠損させることができる。
一実施形態では、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型であり
、繁殖のために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、最大で、ア
デノウイルスゲノムのE2領域、好ましくはE2A亜領域の補完を必要とする。したがっ
て、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために(例え
ば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、少なくとも1つの、アデノウイル
スゲノム(E2A欠損アデノウイルスベクターを表示した)のE2A亜領域の、複製に必
須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、
アデノウイルスゲノムのE2A領域の、少なくとも1つの、複製に必須の遺伝子機能(複
製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される)、およびアデノウイルスゲノム
(E2A/E3欠損アデノウイルスベクターを表示した)の、非必須E3領域の、少なく
とも1つの遺伝子機能を欠損させることができる。
、繁殖のために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、最大で、ア
デノウイルスゲノムのE2領域、好ましくはE2A亜領域の補完を必要とする。したがっ
て、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために(例え
ば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、少なくとも1つの、アデノウイル
スゲノム(E2A欠損アデノウイルスベクターを表示した)のE2A亜領域の、複製に必
須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、
アデノウイルスゲノムのE2A領域の、少なくとも1つの、複製に必須の遺伝子機能(複
製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される)、およびアデノウイルスゲノム
(E2A/E3欠損アデノウイルスベクターを表示した)の、非必須E3領域の、少なく
とも1つの遺伝子機能を欠損させることができる。
一実施形態では、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型であり
、繁殖のために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、アデノウイ
ルスゲノムのE1領域およびE4領域の補完を必要とする。したがって、複製欠損型のア
デノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために(例えば、アデノウイルス
ベクター粒子を形成するために)、アデノウイルスゲノム(E1/E4欠損アデノウイル
スベクターを表示した)のE1領域およびE4領域の両方の、少なくとも1つの、複製に
必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは
、アデノウイルスゲノムのE1領域の、少なくとも1つの、複製に必須の遺伝子機能(複
製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される)、アデノウイルスゲノムのE4
領域の、少なくとも1つの、複製に必須の遺伝子機能、およびアデノウイルスゲノム(E
1/E3/E4欠損アデノウイルスベクターを表示した)の、非必須E3領域の、少なく
とも1つの遺伝子機能を欠損させることができる。アデノウイルスまたはアデノウイルス
ベクターは、好ましくは、最大で、繁殖のために、アデノウイルスゲノムのE1領域の補
完を必要とするが、繁殖のために、アデノウイルスゲノムの、他の任意の欠損の補完を必
要としない。より好ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、最大で
、繁殖のために、アデノウイルスゲノムのE1領域およびE4領域の補完を必要とするが
、繁殖のために、アデノウイルスゲノムの、他の任意の欠損の補完を必要としない。
、繁殖のために(例えば、アデノウイルスベクター粒子を形成するために)、アデノウイ
ルスゲノムのE1領域およびE4領域の補完を必要とする。したがって、複製欠損型のア
デノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、繁殖のために(例えば、アデノウイルス
ベクター粒子を形成するために)、アデノウイルスゲノム(E1/E4欠損アデノウイル
スベクターを表示した)のE1領域およびE4領域の両方の、少なくとも1つの、複製に
必須の遺伝子機能の補完を必要とする。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは
、アデノウイルスゲノムのE1領域の、少なくとも1つの、複製に必須の遺伝子機能(複
製に必須の、全ての遺伝子機能であることが所望される)、アデノウイルスゲノムのE4
領域の、少なくとも1つの、複製に必須の遺伝子機能、およびアデノウイルスゲノム(E
1/E3/E4欠損アデノウイルスベクターを表示した)の、非必須E3領域の、少なく
とも1つの遺伝子機能を欠損させることができる。アデノウイルスまたはアデノウイルス
ベクターは、好ましくは、最大で、繁殖のために、アデノウイルスゲノムのE1領域の補
完を必要とするが、繁殖のために、アデノウイルスゲノムの、他の任意の欠損の補完を必
要としない。より好ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、最大で
、繁殖のために、アデノウイルスゲノムのE1領域およびE4領域の補完を必要とするが
、繁殖のために、アデノウイルスゲノムの、他の任意の欠損の補完を必要としない。
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの、複数の、
複製に必須の遺伝子機能を欠損させた場合(例えば、E1/E4欠損アデノウイルスベク
ター)は、単一の、複製に必須の遺伝子機能を欠損させた、アデノウイルスまたはアデノ
ウイルスベクター(例えば、E1欠損アデノウイルスベクター)により達成されるウイル
ス増殖と同様の、補完細胞系内のウイルス増殖をもたらす、スペーサー配列を含みうる。
スペーサー配列は、少なくとも約15塩基対(例えば、約15ヌクレオチド~約12,0
00ヌクレオチドの間)、好ましくは、約100ヌクレオチド~約10,000ヌクレオ
チド、より好ましくは、約500ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、なおより好
ましくは、約1,500ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチドであり、最も好ましく
は、約2,000~約3,000ヌクレオチドの長さ、または前出の値のうちの、任意の
2つにより規定される範囲の配列など、所望の長さである、任意の、1または複数のヌク
レオチド配列を含有しうる。スペーサー配列は、アデノウイルスゲノムに照らして、コー
ド配列の場合もあり、非コード配列の場合もあり、天然配列の場合もあり非天然配列の場
合もあるが、複製に必須の機能を、欠損させた領域へと復帰させない。スペーサーはまた
、発現カセットも含有しうる。より好ましくは、スペーサーは、アデノウイルスまたはア
デノウイルスベクターに照らして非天然である、ポリアデニル化配列および/またはポリ
アデニル化遺伝子を含む。アデノウイルスベクター内の、スペーサーの使用については、
例えば、米国特許第5,851,806号明細書、および国際特許出願公開第1997/
021826号パンフレットにおいて、さらに記載されている。
複製に必須の遺伝子機能を欠損させた場合(例えば、E1/E4欠損アデノウイルスベク
ター)は、単一の、複製に必須の遺伝子機能を欠損させた、アデノウイルスまたはアデノ
ウイルスベクター(例えば、E1欠損アデノウイルスベクター)により達成されるウイル
ス増殖と同様の、補完細胞系内のウイルス増殖をもたらす、スペーサー配列を含みうる。
スペーサー配列は、少なくとも約15塩基対(例えば、約15ヌクレオチド~約12,0
00ヌクレオチドの間)、好ましくは、約100ヌクレオチド~約10,000ヌクレオ
チド、より好ましくは、約500ヌクレオチド~約8,000ヌクレオチド、なおより好
ましくは、約1,500ヌクレオチド~約6,000ヌクレオチドであり、最も好ましく
は、約2,000~約3,000ヌクレオチドの長さ、または前出の値のうちの、任意の
2つにより規定される範囲の配列など、所望の長さである、任意の、1または複数のヌク
レオチド配列を含有しうる。スペーサー配列は、アデノウイルスゲノムに照らして、コー
ド配列の場合もあり、非コード配列の場合もあり、天然配列の場合もあり非天然配列の場
合もあるが、複製に必須の機能を、欠損させた領域へと復帰させない。スペーサーはまた
、発現カセットも含有しうる。より好ましくは、スペーサーは、アデノウイルスまたはア
デノウイルスベクターに照らして非天然である、ポリアデニル化配列および/またはポリ
アデニル化遺伝子を含む。アデノウイルスベクター内の、スペーサーの使用については、
例えば、米国特許第5,851,806号明細書、および国際特許出願公開第1997/
021826号パンフレットにおいて、さらに記載されている。
アデノウイルスゲノムの全部または一部、例えば、アデノウイルスゲノムのE1領域、
E3領域、およびE4領域を除去することにより、結果として得られるアデノウイルスま
たはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスカプシドへとパッケージングされる能力
を保持しながら、外因性核酸配列のインサートを許容することが可能である。外因性核酸
配列は、位置への挿入が、アデノウイルス粒子またはアデノウイルスベクター粒子の形成
を可能とする限りにおいて、アデノウイルスゲノム内の、任意の位置に挿入されうる。外
因性核酸配列は、アデノウイルスゲノムのE1領域内、E3領域内、またはE4領域内に
位置させることが好ましい。
E3領域、およびE4領域を除去することにより、結果として得られるアデノウイルスま
たはアデノウイルスベクターは、アデノウイルスカプシドへとパッケージングされる能力
を保持しながら、外因性核酸配列のインサートを許容することが可能である。外因性核酸
配列は、位置への挿入が、アデノウイルス粒子またはアデノウイルスベクター粒子の形成
を可能とする限りにおいて、アデノウイルスゲノム内の、任意の位置に挿入されうる。外
因性核酸配列は、アデノウイルスゲノムのE1領域内、E3領域内、またはE4領域内に
位置させることが好ましい。
本開示の、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、複製欠損型
のアデノウイルス内またはアデノウイルスベクター内に存在しない遺伝子機能をもたらす
、補完細胞系内で産生されうるが、高力価のウイルスベクター株を発生させるための、適
切なレベルにおける、ウイルスの繁殖のために必要とされる。このような補完細胞系は、
公知であり、293細胞(例えば、Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59-72 (1977)
に記載されている)、PER.C6細胞(例えば、国際特許出願公開第1997/000
326号パンフレット、ならびに米国特許第5,994,128号明細書および同第6,
033,908号明細書に記載されている)、および293-ORF6細胞(例えば、国
際特許出願公開第95/34671号パンフレットおよびBrough et al., J. Virol., 71
: 9206-9213 (1997)に記載されている)を含むがこれらに限定されない。本開示の、複製
欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを作製するのに適する、他の補完
細胞系は、その発現が、宿主細胞内のウイルス増殖を阻害するトランス遺伝子をコードす
る、アデノウイルスベクターを繁殖させるように作出された補完細胞(例えば、米国特許
出願公開第2008/0233650号明細書を参照されたい)を含む。さらなる、適切
な補完細胞については、例えば、米国特許第6,677,156号明細書および同第6,
682,929号明細書、および国際特許出願公開第2003/020879号パンフレ
ットにおいて記載されている。場合によって、細胞内ゲノムは、その遺伝子産物が、複製
欠損型アデノウイルスベクターの欠損の全てを補完する、核酸配列を含む必要がない。複
製欠損型アデノウイルスベクター内で欠如する、1または複数の、複製に必須の遺伝子機
能は、ヘルパーウイルス、例えば、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベ
クターの複製に必要とされる、1または複数の必須遺伝子機能を、トランスで供給する、
アデノウイルスベクターにより供給されうる。代替的に、本発明のアデノウイルスまたは
アデノウイルスベクターは、本発明の、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイル
スベクター内で欠如する、1または複数の、複製に必須の遺伝子機能を補完する、非天然
の、複製に必須の遺伝子を含みうる。例えば、E1/E4欠損アデノウイルスベクターは
、異なるアデノウイルス(例えば、本発明のアデノウイルスもしくはアデノウイルスベク
ターと異なる血清型のアデノウイルス、または本発明のアデノウイルスもしくはアデノウ
イルスベクターと異なる種のアデノウイルス)から得られるか、またはこれらに由来する
、E4 ORF 6をコードする核酸配列を含有するように操作することができる。
のアデノウイルス内またはアデノウイルスベクター内に存在しない遺伝子機能をもたらす
、補完細胞系内で産生されうるが、高力価のウイルスベクター株を発生させるための、適
切なレベルにおける、ウイルスの繁殖のために必要とされる。このような補完細胞系は、
公知であり、293細胞(例えば、Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59-72 (1977)
に記載されている)、PER.C6細胞(例えば、国際特許出願公開第1997/000
326号パンフレット、ならびに米国特許第5,994,128号明細書および同第6,
033,908号明細書に記載されている)、および293-ORF6細胞(例えば、国
際特許出願公開第95/34671号パンフレットおよびBrough et al., J. Virol., 71
: 9206-9213 (1997)に記載されている)を含むがこれらに限定されない。本開示の、複製
欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを作製するのに適する、他の補完
細胞系は、その発現が、宿主細胞内のウイルス増殖を阻害するトランス遺伝子をコードす
る、アデノウイルスベクターを繁殖させるように作出された補完細胞(例えば、米国特許
出願公開第2008/0233650号明細書を参照されたい)を含む。さらなる、適切
な補完細胞については、例えば、米国特許第6,677,156号明細書および同第6,
682,929号明細書、および国際特許出願公開第2003/020879号パンフレ
ットにおいて記載されている。場合によって、細胞内ゲノムは、その遺伝子産物が、複製
欠損型アデノウイルスベクターの欠損の全てを補完する、核酸配列を含む必要がない。複
製欠損型アデノウイルスベクター内で欠如する、1または複数の、複製に必須の遺伝子機
能は、ヘルパーウイルス、例えば、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイルスベ
クターの複製に必要とされる、1または複数の必須遺伝子機能を、トランスで供給する、
アデノウイルスベクターにより供給されうる。代替的に、本発明のアデノウイルスまたは
アデノウイルスベクターは、本発明の、複製欠損型のアデノウイルスまたはアデノウイル
スベクター内で欠如する、1または複数の、複製に必須の遺伝子機能を補完する、非天然
の、複製に必須の遺伝子を含みうる。例えば、E1/E4欠損アデノウイルスベクターは
、異なるアデノウイルス(例えば、本発明のアデノウイルスもしくはアデノウイルスベク
ターと異なる血清型のアデノウイルス、または本発明のアデノウイルスもしくはアデノウ
イルスベクターと異なる種のアデノウイルス)から得られるか、またはこれらに由来する
、E4 ORF 6をコードする核酸配列を含有するように操作することができる。
アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、トランス遺伝子をさらに含みうる。
本明細書では、「トランス遺伝子」という用語は、非天然の核酸配列を発現させて、タン
パク質(例えば、ペプチドまたはポリペプチド)を産生するように、適切な調節エレメン
ト(例えば、プロモーター)に作動可能に連結された、非天然の核酸配列として規定され
る。調節エレメント(例えば、プロモーター)は、アデノウイルスまたはアデノウイルス
ベクターに対して、天然の場合もあり、非天然の場合もある。
本明細書では、「トランス遺伝子」という用語は、非天然の核酸配列を発現させて、タン
パク質(例えば、ペプチドまたはポリペプチド)を産生するように、適切な調節エレメン
ト(例えば、プロモーター)に作動可能に連結された、非天然の核酸配列として規定され
る。調節エレメント(例えば、プロモーター)は、アデノウイルスまたはアデノウイルス
ベクターに対して、天然の場合もあり、非天然の場合もある。
「非天然の」核酸配列とは、天然に存在する位置における、アデノウイルスの天然に存
在する核酸配列ではない、任意の核酸配列(例えば、DNA配列、RNA配列、またはc
DNA配列)である。したがって、非天然の核酸配列は、アデノウイルス内で、天然で見
出されうるが、アデノウイルスゲノム内の、非天然の位置に位置し、かつ/または非天然
のプロモーターに作動可能に連結されうる。本開示の文脈では、「非天然の核酸配列」、
「異種核酸配列」、および「外因性核酸配列」という用語は、同義であり、互換的に使用
することができる。非天然の核酸配列は、好ましくは、DNAであり、好ましくは、タン
パク質をコードする(すなわち、1または複数のタンパク質をコードする、1または複数
の核酸配列である)。
在する核酸配列ではない、任意の核酸配列(例えば、DNA配列、RNA配列、またはc
DNA配列)である。したがって、非天然の核酸配列は、アデノウイルス内で、天然で見
出されうるが、アデノウイルスゲノム内の、非天然の位置に位置し、かつ/または非天然
のプロモーターに作動可能に連結されうる。本開示の文脈では、「非天然の核酸配列」、
「異種核酸配列」、および「外因性核酸配列」という用語は、同義であり、互換的に使用
することができる。非天然の核酸配列は、好ましくは、DNAであり、好ましくは、タン
パク質をコードする(すなわち、1または複数のタンパク質をコードする、1または複数
の核酸配列である)。
非天然の核酸配列は、哺乳動物を、疾患について、予防的に、または治療的に処置する
のに使用されうる、治療用タンパク質をコードしうる。適切な治療用タンパク質の例は、
サイトカイン、毒素、腫瘍抑制性タンパク質、増殖因子、ホルモン、受容体、マイトジェ
ン、免疫グロブリン、神経ペプチド、神経伝達物質、および酵素を含む。代替的に、非天
然の核酸配列は、病原体(例えば、細菌またはウイルス)の抗原をコードすることが可能
であり、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、ワクチンとして使用すること
ができる。
のに使用されうる、治療用タンパク質をコードしうる。適切な治療用タンパク質の例は、
サイトカイン、毒素、腫瘍抑制性タンパク質、増殖因子、ホルモン、受容体、マイトジェ
ン、免疫グロブリン、神経ペプチド、神経伝達物質、および酵素を含む。代替的に、非天
然の核酸配列は、病原体(例えば、細菌またはウイルス)の抗原をコードすることが可能
であり、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、ワクチンとして使用すること
ができる。
ウイルスベースの送達系
本開示はまた、本明細書で記載される核酸を挿入したウイルスのベースの系などの送達
系も提供する。代表的なウイルス発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノ
ウイルスベースのベクター、レンチウイルスベースのベクター、レトロウイルスベクター
、およびヘルペスウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない。ある実施形
態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレ
トロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる
、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成する
のに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質
導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベク
ターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加
の利点も有する。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベク
ターである。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであ
る。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも1つの生物にお
いて機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、およ
び1または複数の選択用マーカーを含有する。
本開示はまた、本明細書で記載される核酸を挿入したウイルスのベースの系などの送達
系も提供する。代表的なウイルス発現ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノ
ウイルスベースのベクター、レンチウイルスベースのベクター、レトロウイルスベクター
、およびヘルペスウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない。ある実施形
態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスなどのレ
トロウイルスに由来するベクターは、トランス遺伝子の、娘細胞における、長期にわたる
、安定的な組込みおよびその繁殖を可能とするので、長期にわたる遺伝子導入を達成する
のに適するツールである。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質
導入しうるという点で、マウス白血病ウイルスなど、がんレトロウイルスに由来するベク
ターに優る追加の利点を有する。レンチウイルスベクターはまた、低免疫原性という追加
の利点も有する。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベク
ターである。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであ
る。一般に、かつ、複数の実施形態では、適切なベクターは、少なくとも1つの生物にお
いて機能的な複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、およ
び1または複数の選択用マーカーを含有する。
さらなる、適切なベクターは、宿主細胞のDNAへと、ランダムに組み込まれる場合も
あり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含
む場合もある、組込み用発現ベクターを含む。このような組込み用発現ベクターは、宿主
細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。
部位特異的に組み込むベクターの例は、例えば、Invitrogen(Carlsba
d、Calif.)(例えば、pcDNA(商標)5/FRT)製のflp-in系、ま
たはStratagene(LaJolla、Calif.)製のpExchange-
6 Core Vectorsにおいて見出されうるcre-lox系などのcre-l
ox系の構成要素を含む。宿主細胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、
例えば、Invitrogen(Carlsbad、Calif.)製のpcDNA3.
1(T抗原の非存在下で導入される場合)、およびPromega(Madison、W
is.)製のpCIまたはpFN10A(ACT)FLEXI(商標)を含む。さらなる
プロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的
に、プロモーターエレメントは、開始部位の30~110bp上流の領域内に位置するが
、多数のプロモーターは、開始部位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近
年示されている。エレメントが、互いに対して逆位であるか、または移動している場合に
も、プロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメントの間のスペーシング
は、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、活性が減衰し
始める前に、プロモーターエレメントの間のスペーシングが、50bpの距離まで増大す
る場合がある。個別のエレメントは、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて
、共作動的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もあると考えられる。
あり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位を含
む場合もある、組込み用発現ベクターを含む。このような組込み用発現ベクターは、宿主
細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。
部位特異的に組み込むベクターの例は、例えば、Invitrogen(Carlsba
d、Calif.)(例えば、pcDNA(商標)5/FRT)製のflp-in系、ま
たはStratagene(LaJolla、Calif.)製のpExchange-
6 Core Vectorsにおいて見出されうるcre-lox系などのcre-l
ox系の構成要素を含む。宿主細胞染色体へとランダムに組み込まれるベクターの例は、
例えば、Invitrogen(Carlsbad、Calif.)製のpcDNA3.
1(T抗原の非存在下で導入される場合)、およびPromega(Madison、W
is.)製のpCIまたはpFN10A(ACT)FLEXI(商標)を含む。さらなる
プロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。典型的
に、プロモーターエレメントは、開始部位の30~110bp上流の領域内に位置するが
、多数のプロモーターは、開始部位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近
年示されている。エレメントが、互いに対して逆位であるか、または移動している場合に
も、プロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメントの間のスペーシング
は、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターでは、活性が減衰し
始める前に、プロモーターエレメントの間のスペーシングが、50bpの距離まで増大す
る場合がある。個別のエレメントは、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて
、共作動的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もあると考えられる。
適切なプロモーターの1つの例は、サイトメガロウイルス(CMV)即初期プロモータ
ー配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌク
レオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモータ
ー配列である。
ー配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌク
レオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモータ
ー配列である。
しかし、サルウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス(
MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)LTR(long terminal r
epeat)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモータ
ー、エプスタイン-バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター
のほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、お
よびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プ
ロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用す
ることができる。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとす
る。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として想定される。誘導性プロモーターの
使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連結されたポリヌクレオチ
ド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に、発現をオフにすること
が可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモ
ーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラ
サイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)LTR(long terminal r
epeat)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモータ
ー、エプスタイン-バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター
のほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、お
よびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プ
ロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用す
ることができる。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとす
る。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として想定される。誘導性プロモーターの
使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連結されたポリヌクレオチ
ド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に、発現をオフにすること
が可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモ
ーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラ
サイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
レポーター遺伝子を、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の
機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レ
シピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その
発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペ
プチドをコードする遺伝子である。DNAを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な
時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子
は、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タン
パク質遺伝子(例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000))を含みうる
。適切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、市販品を購入
することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小限の5’
側フランキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモ
ーター領域は、レポーター遺伝子へと連結し、薬剤を、プロモーター駆動型転写をモジュ
レートする能力について査定するのに使用することができる。
機能性について査定するために使用することができる。一般に、レポーター遺伝子は、レ
シピエントの生物または組織において存在しないか、またはこれらにより発現せず、その
発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペ
プチドをコードする遺伝子である。DNAを、レシピエント細胞へと導入した後の適切な
時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイする。適切なレポーター遺伝子
は、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タン
パク質遺伝子(例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000))を含みうる
。適切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製することもでき、市販品を購入
することもできる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小限の5’
側フランキング領域を伴う構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモ
ーター領域は、レポーター遺伝子へと連結し、薬剤を、プロモーター駆動型転写をモジュ
レートする能力について査定するのに使用することができる。
当技術分野では、遺伝子を細胞へと導入し発現させる方法が公知である。発現ベクター
の文脈では、ベクターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺
乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる
。例えば、発現ベクターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学
的手段により導入することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
の文脈では、ベクターを、当技術分野における任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺
乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入することができる
。例えば、発現ベクターは、宿主細胞へと、物理的手段により導入することもでき、化学
的手段により導入することもでき、生物学的手段により導入することもできる。
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈
殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法など
を含む。当技術分野では、ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞を作製するため
の方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))を参照されたい。複数の実施形
態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための方法は、リン酸カルシウムト
ランスフェクションまたはポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクションである。
殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法など
を含む。当技術分野では、ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞を作製するため
の方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Man
ual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))を参照されたい。複数の実施形
態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための方法は、リン酸カルシウムト
ランスフェクションまたはポリエチレンイミン(PEI)トランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための生物学的方法は、DNAベク
ターおよびRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクターと、とりわけ、レトロウイル
スベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へと挿入するための、最も
広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックス
ウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに
由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号明細書および同第5,585,3
62号明細書を参照されたい。
ターおよびRNAベクターの使用を含む。ウイルスベクターと、とりわけ、レトロウイル
スベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へと挿入するための、最も
広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックス
ウイルス、単純ヘルペスウイルスI、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに
由来しうる。例えば、米国特許第5,350,674号明細書および同第5,585,3
62号明細書を参照されたい。
非ウイルスベースの送達系
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノ
カプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミ
セル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。in vi
troおよびin vivoにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイ
ド状系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
カプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミ
セル、およびリポソームを含む脂質ベースの系などのコロイド分散系を含む。in vi
troおよびin vivoにおける、送達媒体としての使用のための、例示的なコロイ
ド状系は、リポソーム(例えば、人工膜小胞)である。
核酸の、宿主細胞への導入(in vitro、ex vivo、またはin viv
oにおける)のために、脂質製剤の使用が想定される。別の態様では、核酸は、脂質と会
合させることができる。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する
、水性のリポソーム内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの
いずれとも会合する連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソー
ム内に取り込むこともでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶
液中に分散させることもでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもで
き、脂質中の懸濁液として含有することもでき、ミセルと共に含有するかもしくは複合体
化させることもでき、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質/DN
A、または脂質/発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定
されない。例えば、組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コ
ラプシング」構造を伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液
中に散在させ、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成する場合もある
。脂質とは、天然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば
、脂質は、天然では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、なら
びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど、それらの
誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
oにおける)のために、脂質製剤の使用が想定される。別の態様では、核酸は、脂質と会
合させることができる。脂質と会合させた核酸は、リポソームの脂質二重層内に散在する
、水性のリポソーム内部に封入することもでき、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの
いずれとも会合する連結分子を介して、リポソームへと接合させることもでき、リポソー
ム内に取り込むこともでき、リポソームと複合体化させることもでき、脂質を含有する溶
液中に分散させることもでき、脂質と混合することもでき、脂質と組み合わせることもで
き、脂質中の懸濁液として含有することもでき、ミセルと共に含有するかもしくは複合体
化させることもでき、または他の形で脂質と会合させることもできる。脂質、脂質/DN
A、または脂質/発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の、任意の特定の構造に限定
されない。例えば、組成物は、ミセルとしての二重層構造内に存在する場合もあり、「コ
ラプシング」構造を伴う二重層構造内に存在する場合もある。組成物はまた、単に、溶液
中に散在させ、おそらく、サイズまたは形状が均質ではない凝集物を形成する場合もある
。脂質とは、天然脂質の場合もあり、合成脂質の場合もある、脂肪性物質である。例えば
、脂質は、天然では、細胞質内で発生する脂肪性液滴のほか、長鎖脂肪族炭化水素、なら
びに脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドなど、それらの
誘導体を含有する化合物のクラスを含む。
使用に適する脂質は、市販元から購入することができる。例えば、ジミリスチルホスフ
ァチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma、St.Louis、Mo.から購入す
ることができ、ジセチルリン酸(「DCP」)は、K & K Laboratorie
s(Plainview、N.Y.)から購入することができ、コレステロール(「Ch
oi」)は、Calbiochem-Behringから購入することができ、ジミリス
チルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、Avanti P
olar Lipids,Inc.(Birmingham、Ala.)から購入するこ
とができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質原液は、約-20℃
で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するので、唯一
の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物
の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般
的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造
を有するものとして特徴づけることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離
された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸
濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経
、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む(Ghosh et al., Glycobiology
5: 505-10 (1991))。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物も
また、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、脂質分子による不均
質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン-核酸複合体も想定され
る。
ァチジルコリン(「DMPC」)は、Sigma、St.Louis、Mo.から購入す
ることができ、ジセチルリン酸(「DCP」)は、K & K Laboratorie
s(Plainview、N.Y.)から購入することができ、コレステロール(「Ch
oi」)は、Calbiochem-Behringから購入することができ、ジミリス
チルホスファチジルグリセロール(「DMPG」)および他の脂質は、Avanti P
olar Lipids,Inc.(Birmingham、Ala.)から購入するこ
とができる。クロロホルムまたはクロロホルム/メタノール中の脂質原液は、約-20℃
で保存することができる。クロロホルムは、メタノールよりたやすく蒸発するので、唯一
の溶媒として使用される。「リポソーム」とは、封入された脂質の二重層または脂凝集物
の作出により形成される、様々な単一の脂質媒体および多層性脂質媒体を包含する、一般
的な用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒質を伴う小胞構造
を有するものとして特徴づけることができる。多層性リポソームは、水性媒質により分離
された複数の脂質層を有する。多層性リポソームは、リン脂質を、過剰量の水溶液中に懸
濁させると、自発的に形成される。脂質成分は、閉止構造を形成する前に、自己転移を経
、脂質二重層の間に、水および溶解させた溶質を取り込む(Ghosh et al., Glycobiology
5: 505-10 (1991))。しかし、溶液中に通常の小胞構造と異なる構造を有する組成物も
また、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造を取る場合もあり、脂質分子による不均
質の凝集物として存在する場合もある。また、リポフェクタミン-核酸複合体も想定され
る。
場合によって、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはまた、DNA配列を、脊
椎動物の染色体へと導入するための、合成DNAトランスポゾン系を指す、「Sleep
ing Beauty(SB)トランスポゾン系」など、非ウイルスベースの送達系を使
用して、細胞へと導入することもできる。系の、一部の例示的な実施形態については、例
えば、米国特許第6,489,458号明細書、同第8,227,432号明細書におい
て記載されている。Sleeping Beautyトランスポゾン系は、Sleepi
ng Beauty(SB)トランスポザーゼおよびSBトランスポゾンから構成される
。複数の実施形態では、Sleeping Beautyトランスポゾン系は、SB11
トランスポゾン系、SB100Rトランスポゾン系、またはSB110トランスポゾン系
を含みうる。
椎動物の染色体へと導入するための、合成DNAトランスポゾン系を指す、「Sleep
ing Beauty(SB)トランスポゾン系」など、非ウイルスベースの送達系を使
用して、細胞へと導入することもできる。系の、一部の例示的な実施形態については、例
えば、米国特許第6,489,458号明細書、同第8,227,432号明細書におい
て記載されている。Sleeping Beautyトランスポゾン系は、Sleepi
ng Beauty(SB)トランスポザーゼおよびSBトランスポゾンから構成される
。複数の実施形態では、Sleeping Beautyトランスポゾン系は、SB11
トランスポゾン系、SB100Rトランスポゾン系、またはSB110トランスポゾン系
を含みうる。
DNAトランスポゾンは、1つのDNA部位から、別のDNA部位へと、単純なカット
アンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたDNAセグメントを、1つのDNA
分子から切り出し、同じDNA分子内もしくはゲノム内、または異なるDNA分子内もし
くはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のTc1/marine
r型トランスポザーゼと同様、SBトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエン
トDNA配列内の、TAジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じDNA分
子内の別の部位の場合もあり、別のDNA分子(または染色体)内の場合もある。ヒトゲ
ノムを含む哺乳動物ゲノムには、約2億カ所のTA部位が存在する。TA挿入部位は、ト
ランスポゾン組込みの過程において、重複される。このTA配列の重複は、転移の顕著な
特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、ト
ランスポゾン内でコードされる場合もあり、トランスポザーゼは、別の供給源、例えば、
DNA供給源またはmRNA供給源により供給される場合もあり、この場合、トランスポ
ゾンは、非自律型エレメントとなる。非自律型トランスポゾンは、挿入の後、独立では切
出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツールとして最も有用である。SBトランス
ポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入および遺伝子治療のための非ウイルスベク
ターとして使用することが想定されている。
アンドペースト方式で転座する。転移は、規定されたDNAセグメントを、1つのDNA
分子から切り出し、同じDNA分子内もしくはゲノム内、または異なるDNA分子内もし
くはゲノム内の別の部位へと移動させる、正確な過程である。他のTc1/marine
r型トランスポザーゼと同様、SBトランスポザーゼも、トランスポゾンを、レシピエン
トDNA配列内の、TAジヌクレオチド塩基対へと挿入する。挿入部位は、同じDNA分
子内の別の部位の場合もあり、別のDNA分子(または染色体)内の場合もある。ヒトゲ
ノムを含む哺乳動物ゲノムには、約2億カ所のTA部位が存在する。TA挿入部位は、ト
ランスポゾン組込みの過程において、重複される。このTA配列の重複は、転移の顕著な
特徴であり、一部の実験では、機構を確認するのに使用される。トランスポザーゼは、ト
ランスポゾン内でコードされる場合もあり、トランスポザーゼは、別の供給源、例えば、
DNA供給源またはmRNA供給源により供給される場合もあり、この場合、トランスポ
ゾンは、非自律型エレメントとなる。非自律型トランスポゾンは、挿入の後、独立では切
出しおよび再挿入を行いえないため、遺伝子ツールとして最も有用である。SBトランス
ポゾンは、脊椎動物のゲノムへの遺伝子の導入および遺伝子治療のための非ウイルスベク
ターとして使用することが想定されている。
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するか、または細胞を、本開示の阻害剤へと、他の形
で曝露するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の組換えDNA配列の存在を確
認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば
、サザンブロット法およびノーザンブロット法、RT-PCRおよびPCRなど、当業者
に周知の分子アッセイ;例えば、免疫学的手段(ELISAおよびウェスタンブロット)
、または薬剤を同定するための、本明細書で記載されるアッセイであって、本開示の範囲
内に収まるアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出するアッセイなどの「生化学的
」アッセイを含む。
で曝露するのに使用される方法にかかわらず、宿主細胞内の組換えDNA配列の存在を確
認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば
、サザンブロット法およびノーザンブロット法、RT-PCRおよびPCRなど、当業者
に周知の分子アッセイ;例えば、免疫学的手段(ELISAおよびウェスタンブロット)
、または薬剤を同定するための、本明細書で記載されるアッセイであって、本開示の範囲
内に収まるアッセイにより、特定のペプチドの有無を検出するアッセイなどの「生化学的
」アッセイを含む。
複数の実施形態では、SB11トランスポゾン系、SB100Xトランスポゾン系、S
B110トランスポゾン系、piggyBacトランスポゾン系(例えば、参照によりそ
の全体において本明細書に組み込まれる、Wilson et al, “PiggyBac Transposon-mediat
ed Gene Transfer in Human Cells,” Molecular Therapy 15:139-145 (2007)を参照され
たい)、および/またはpiggyBatトランスポゾン系(例えば、Mitra et al., “
Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an
active mammalian DNA transposon,” Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)
を参照されたい)を使用して、本明細書で説明される改変エフェクター細胞および他の遺
伝子エレメントを、細胞へと送達する。さらなるトランスポザーゼおよびトランスポゾン
系については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、
米国特許第6,489,458号明細書、同第6,613,752号明細書、同第7,1
48,203号明細書、同第7,985,739号明細書、同第8,227,432号明
細書、同第9,228,180号明細書、米国特許公開第2011/0117072号明
細書、Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 20
09 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Ma
r 31 およびIvics et al., Cell. 91(4):501-10, (1997)において提示されている。
B110トランスポゾン系、piggyBacトランスポゾン系(例えば、参照によりそ
の全体において本明細書に組み込まれる、Wilson et al, “PiggyBac Transposon-mediat
ed Gene Transfer in Human Cells,” Molecular Therapy 15:139-145 (2007)を参照され
たい)、および/またはpiggyBatトランスポゾン系(例えば、Mitra et al., “
Functional characterization of piggyBat from the bat Myotis lucifugus unveils an
active mammalian DNA transposon,” Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013)
を参照されたい)を使用して、本明細書で説明される改変エフェクター細胞および他の遺
伝子エレメントを、細胞へと送達する。さらなるトランスポザーゼおよびトランスポゾン
系については、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、
米国特許第6,489,458号明細書、同第6,613,752号明細書、同第7,1
48,203号明細書、同第7,985,739号明細書、同第8,227,432号明
細書、同第9,228,180号明細書、米国特許公開第2011/0117072号明
細書、Mates et al., Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 20
09 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Ma
r 31 およびIvics et al., Cell. 91(4):501-10, (1997)において提示されている。
さらなる、適切な非ウイルス系は、宿主細胞のDNAへと、ランダムに組み込まれる場
合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位
を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含みうる。トランス遺伝子の、所定の遺伝子
座への組込みのターゲティングが、多くの適用に所望される目標である。まず、部位特異
的リコンビナーゼの第1の組換え部位を、ゲノム部位に、ランダムに、または所定の位置
に挿入する。続いて、細胞に、目的の遺伝子またはDNA、ならびに第2の組換え部位お
よびリコンビナーゼの供給源(リコンビナーゼを発現させる、発現プラスミド、RNA、
タンパク質、またはウイルス)を保有するプラスミドをトランスフェクトする。第1の組
換え部位と第2の組換え部位との組換えは、プラスミドDNAの組込みをもたらす。
合もあり、発現ベクターと、宿主細胞の染色体との特異的組換えを可能とする組換え部位
を含む場合もある、組込み用発現ベクターを含みうる。トランス遺伝子の、所定の遺伝子
座への組込みのターゲティングが、多くの適用に所望される目標である。まず、部位特異
的リコンビナーゼの第1の組換え部位を、ゲノム部位に、ランダムに、または所定の位置
に挿入する。続いて、細胞に、目的の遺伝子またはDNA、ならびに第2の組換え部位お
よびリコンビナーゼの供給源(リコンビナーゼを発現させる、発現プラスミド、RNA、
タンパク質、またはウイルス)を保有するプラスミドをトランスフェクトする。第1の組
換え部位と第2の組換え部位との組換えは、プラスミドDNAの組込みをもたらす。
このような組込み用発現ベクターは、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を用いて
、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチ
ド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在により、組込みのターゲ
ティングを促進する。例えば、本明細書で記載されるドナーポリヌクレオチドを使用する
、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェクション法、例えば、相同組換えによ
り、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出するのに使用される技法に従い達成す
ることができる。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み
部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異的リコンビナーゼの存在下で、細胞
を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方により、組込みのターゲティングを
促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に、リコンビナーゼとは、その適合性
の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触媒するポリペプチドを意味する。本
明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天然ポリペプチドのほか、活性を保持
する誘導体、変異体、および/または断片、ならびに天然ポリヌクレオチド、活性を保持
するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、および/または断片を含む。
、所望のタンパク質の発現をもたらしうる。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチ
ド上の配列であって、組込み部位を挟む配列と相同な配列の存在により、組込みのターゲ
ティングを促進する。例えば、本明細書で記載されるドナーポリヌクレオチドを使用する
、組込みのターゲティングは、従来のトランスフェクション法、例えば、相同組換えによ
り、遺伝子のノックアウトまたはノックインを創出するのに使用される技法に従い達成す
ることができる。他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド上の配列であって、組込み
部位を挟む配列と相同な配列の存在、および部位特異的リコンビナーゼの存在下で、細胞
を、ドナーポリヌクレオチドと接触させることの両方により、組込みのターゲティングを
促進する。部位特異的リコンビナーゼ、または、単に、リコンビナーゼとは、その適合性
の組換え部位の間の、保存的な部位特異的組換えを触媒するポリペプチドを意味する。本
明細書で使用される部位特異的リコンビナーゼは、天然ポリペプチドのほか、活性を保持
する誘導体、変異体、および/または断片、ならびに天然ポリヌクレオチド、活性を保持
するリコンビナーゼをコードする誘導体、変異体、および/または断片を含む。
本明細書ではまた、宿主細胞内において異種遺伝子を組み込むための系であって、1ま
たは複数の遺伝子発現カセットを含む系も提示される。場合によって、系は、第1のポリ
ペプチド構築物をコードする、第1のポリヌクレオチドを含む、第1の遺伝子発現カセッ
トを含む。他の場合には、系は、第2のポリペプチド構築物をコードする、第2のポリヌ
クレオチドを含む、第2の遺伝子発現カセットを含みうる。さらに他の場合には、系は、
第3の遺伝子発現カセットを含みうる。一実施形態では、遺伝子発現カセットのうちの1
つは、(i)トランス活性化ドメイン;(ii)核内受容体リガンド結合性ドメイン;(
iii)DNA結合性ドメイン;、および(iv)エクジソン受容体結合性ドメインのう
ちの1または複数をコードする、遺伝子スイッチポリヌクレオチドを含みうる。別の実施
形態では、系は、前記宿主細胞を、セリンリコンビナーゼの存在下で、少なくとも前記第
1の遺伝子発現カセットと接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞へと組み込ま
れるように、組換え接合部位およびセリンリコンビナーゼをさらに含む。
たは複数の遺伝子発現カセットを含む系も提示される。場合によって、系は、第1のポリ
ペプチド構築物をコードする、第1のポリヌクレオチドを含む、第1の遺伝子発現カセッ
トを含む。他の場合には、系は、第2のポリペプチド構築物をコードする、第2のポリヌ
クレオチドを含む、第2の遺伝子発現カセットを含みうる。さらに他の場合には、系は、
第3の遺伝子発現カセットを含みうる。一実施形態では、遺伝子発現カセットのうちの1
つは、(i)トランス活性化ドメイン;(ii)核内受容体リガンド結合性ドメイン;(
iii)DNA結合性ドメイン;、および(iv)エクジソン受容体結合性ドメインのう
ちの1または複数をコードする、遺伝子スイッチポリヌクレオチドを含みうる。別の実施
形態では、系は、前記宿主細胞を、セリンリコンビナーゼの存在下で、少なくとも前記第
1の遺伝子発現カセットと接触させると、前記異種遺伝子が、前記宿主細胞へと組み込ま
れるように、組換え接合部位およびセリンリコンビナーゼをさらに含む。
場合によって、系は、前記宿主細胞を、前記リガンドの存在下で接触させると、前記異
種遺伝子が、前記宿主細胞内で発現するように、リガンドをさらに含む。1つの場合には
、系はまた、組換え接合部位も含む。場合によって、1つの組換え接合部位は、ファージ
ゲノム組換え接合部位(attP)または細菌ゲノム組換え接合部位(attB)である
。1つの場合には、宿主細胞は、真核細胞である。別の場合には、宿主細胞は、ヒト細胞
である。さらなる場合には、宿主細胞は、T細胞またはNK細胞である。
種遺伝子が、前記宿主細胞内で発現するように、リガンドをさらに含む。1つの場合には
、系はまた、組換え接合部位も含む。場合によって、1つの組換え接合部位は、ファージ
ゲノム組換え接合部位(attP)または細菌ゲノム組換え接合部位(attB)である
。1つの場合には、宿主細胞は、真核細胞である。別の場合には、宿主細胞は、ヒト細胞
である。さらなる場合には、宿主細胞は、T細胞またはNK細胞である。
プロモーター
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す
。プロモーターは、DNAの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、
上流に(センス鎖の5’側領域に向かって)位置する。あるプロモーターが、細胞内の全
ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、
誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。さらに他のプロモ
ーターは、T細胞特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない、組織特異的プロモ
ーターまたは活性化プロモーターである。
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す
。プロモーターは、DNAの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、
上流に(センス鎖の5’側領域に向かって)位置する。あるプロモーターが、細胞内の全
ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、
誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。さらに他のプロモ
ーターは、T細胞特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない、組織特異的プロモ
ーターまたは活性化プロモーターである。
本明細書で使用される「プロモーター活性」という用語およびその文法的同等物は、そ
の活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度
を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるRNA
転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結さ
れたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定す
ることにより、間接的に測定することもできる。
の活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度
を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるRNA
転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結さ
れたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定す
ることにより、間接的に測定することもできる。
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子
または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。
誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現が、生物、または、
特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用で
ある。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調
節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序
調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一
実施形態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。誘導性プロモータ
ーは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性
プロモーターは、RHEOSWITCH(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガン
ド誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであ
りうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体におい
て組み込まれる、PCT/米国出願第2001/009050号明細書(国際公開第20
01/070816号パンフレット);米国特許第7,091,038号明細書;同第7
,776,587号明細書;同第7,807,417号明細書;同第8,202,718
号明細書;PCT/米国出願第2001/030608号明細書(国際公開第2002/
029075号パンフレット);米国特許第8,105,825号明細書;同第8,16
8,426号明細書;PCT/米国出願第2002/005235号明細書(国際公開第
2002/066613号パンフレット);米国特許出願公開第10/468,200号
明細書(米国公開第20120167239号明細書);PCT/米国出願第2002/
005706号明細書(国際公開第2002/066614号パンフレット);米国特許
第7,531,326号明細書;同第8,236,556号明細書;同第8,598,4
09号明細書;PCT/米国出願第2002/005090号明細書(国際公開第200
2/066612号パンフレット);米国特許第8,715,959号明細書(米国公開
第20060100416号明細書);PCT/米国出願第2002/005234号明
細書(国際公開第2003/027266号パンフレット);米国特許第7,601,5
08号明細書;同第7,829,676号明細書;同第7,919,269号明細書;同
第8,030,067号明細書;PCT/米国出願第2002/005708号明細書(
国際公開第2002/066615号パンフレット);米国特許出願公開第10/468
,192号明細書(米国公開第20110212528号明細書);PCT/米国出願第
2002/005026号明細書(国際公開第2003/027289号パンフレット)
;米国特許第7,563,879号明細書;同第8,021,878号明細書;同第8,
497,093号明細書;PCT/米国出願第2005/015089号明細書(国際公
開第2005/108617号パンフレット);米国特許第7,935,510号明細書
;同第8,076,454号明細書;PCT/米国出願第52008/011270号明
細書(国際公開第2009/045370号パンフレット);米国特許出願公開第12/
241,018号明細書(米国公開第20090136465号明細書);PCT/米国
出願第2008/011563号明細書(国際公開第2009/048560号パンフレ
ット);米国特許出願公開第12/247,738号明細書(米国公開第2009012
3441号明細書);PCT/米国出願第2009/005510号明細書(国際公開第
2010/042189号パンフレット);米国特許出願公開第13/123,129号
明細書(米国公開第20110268766号明細書);PCT/米国出願第2011/
029682号明細書(国際公開第2011/119773号パンフレット);米国特許
出願公開第13/636,473号明細書(米国公開第20130195800号明細書
);PCT/米国出願第2012/027515号明細書(国際公開第2012/122
025号パンフレット);および米国特許第9,402,919号明細書において記載さ
れている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しう
るが、これらに限定されない。
または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。
誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現が、生物、または、
特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用で
ある。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調
節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序
調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。一
実施形態では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部である。誘導性プロモータ
ーは、遺伝子スイッチのリガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性
プロモーターは、RHEOSWITCH(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガン
ド誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチであ
りうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体におい
て組み込まれる、PCT/米国出願第2001/009050号明細書(国際公開第20
01/070816号パンフレット);米国特許第7,091,038号明細書;同第7
,776,587号明細書;同第7,807,417号明細書;同第8,202,718
号明細書;PCT/米国出願第2001/030608号明細書(国際公開第2002/
029075号パンフレット);米国特許第8,105,825号明細書;同第8,16
8,426号明細書;PCT/米国出願第2002/005235号明細書(国際公開第
2002/066613号パンフレット);米国特許出願公開第10/468,200号
明細書(米国公開第20120167239号明細書);PCT/米国出願第2002/
005706号明細書(国際公開第2002/066614号パンフレット);米国特許
第7,531,326号明細書;同第8,236,556号明細書;同第8,598,4
09号明細書;PCT/米国出願第2002/005090号明細書(国際公開第200
2/066612号パンフレット);米国特許第8,715,959号明細書(米国公開
第20060100416号明細書);PCT/米国出願第2002/005234号明
細書(国際公開第2003/027266号パンフレット);米国特許第7,601,5
08号明細書;同第7,829,676号明細書;同第7,919,269号明細書;同
第8,030,067号明細書;PCT/米国出願第2002/005708号明細書(
国際公開第2002/066615号パンフレット);米国特許出願公開第10/468
,192号明細書(米国公開第20110212528号明細書);PCT/米国出願第
2002/005026号明細書(国際公開第2003/027289号パンフレット)
;米国特許第7,563,879号明細書;同第8,021,878号明細書;同第8,
497,093号明細書;PCT/米国出願第2005/015089号明細書(国際公
開第2005/108617号パンフレット);米国特許第7,935,510号明細書
;同第8,076,454号明細書;PCT/米国出願第52008/011270号明
細書(国際公開第2009/045370号パンフレット);米国特許出願公開第12/
241,018号明細書(米国公開第20090136465号明細書);PCT/米国
出願第2008/011563号明細書(国際公開第2009/048560号パンフレ
ット);米国特許出願公開第12/247,738号明細書(米国公開第2009012
3441号明細書);PCT/米国出願第2009/005510号明細書(国際公開第
2010/042189号パンフレット);米国特許出願公開第13/123,129号
明細書(米国公開第20110268766号明細書);PCT/米国出願第2011/
029682号明細書(国際公開第2011/119773号パンフレット);米国特許
出願公開第13/636,473号明細書(米国公開第20130195800号明細書
);PCT/米国出願第2012/027515号明細書(国際公開第2012/122
025号パンフレット);および米国特許第9,402,919号明細書において記載さ
れている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しう
るが、これらに限定されない。
本明細書では、対象へと、少なくとも2つの機能的タンパク質またはこれらの部分;少
なくとも1つのプロモーター;および少なくとも1つの操作組換え部位を含む、本明細書
で記載されるポリペプチド配列をコードする、ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1つ
の非ウイルスベクターを投与するステップを含み;前記少なくとも1つのプロモーターが
、前記少なくとも2つの機能的タンパク質の発現を駆動する、方法が提示される。場合に
よって、少なくとも1つのプロモーターは、構成的プロモーターでありうる。場合によっ
て、少なくとも1つのプロモーターは、組織特異的プロモーターでありうる。場合によっ
て、少なくとも1つのプロモーターは、誘導性プロモーターでありうる。場合によって、
誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジソ
ン受容体ベースの遺伝子スイッチである。他の場合には、少なくとも1つのプロモーター
が、誘導性であることが可能であり、少なくとも1つのプロモーターが、活性化特異的で
ありうる、プロモーターの組合せを用いることができる。
なくとも1つのプロモーター;および少なくとも1つの操作組換え部位を含む、本明細書
で記載されるポリペプチド配列をコードする、ポリヌクレオチドを含む、少なくとも1つ
の非ウイルスベクターを投与するステップを含み;前記少なくとも1つのプロモーターが
、前記少なくとも2つの機能的タンパク質の発現を駆動する、方法が提示される。場合に
よって、少なくとも1つのプロモーターは、構成的プロモーターでありうる。場合によっ
て、少なくとも1つのプロモーターは、組織特異的プロモーターでありうる。場合によっ
て、少なくとも1つのプロモーターは、誘導性プロモーターでありうる。場合によって、
誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、2つのポリペプチドによる、エクジソ
ン受容体ベースの遺伝子スイッチである。他の場合には、少なくとも1つのプロモーター
が、誘導性であることが可能であり、少なくとも1つのプロモーターが、活性化特異的で
ありうる、プロモーターの組合せを用いることができる。
誘導性プロモーターは、前記少なくとも2つの遺伝子の発現の、用量調節性制御のため
に、リガンドを用いる。場合によって、リガンドは、ecdyステロイド、9-cis-
レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、N,N’-ジアシルヒドラジン、オキサゾリ
ン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、N-アルキル-N,N’-ジアロイルヒド
ラジン、N-アシル-N-アルキルカルボニルヒドラジン、N-アロイル-N-アルキル
-N’-アロイルヒドラジン、アルニドケトン、3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒ
ドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-アセチルハルパジド、オキシステロ
ール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコレステロール、2
5-エポキシコレステロール、T0901317、5-アルファ-6-アルファ-エポキ
シコレステロール-3-スルフェート(sulfate)(ECHS)、7-ケトコレステロー
ル-3-スルフェート(sulfate)、フラメゾール、胆汁酸、1,1-ビホスホネート(b
iphosphonate)エステル、若年性ホルモンIII、RG-115819(3,5-ジメチ
ル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メチル-
3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド-)、RG-115932((R)-3,5-
ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-
メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド)、およびRG-115830(3,5-ジメチル
-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ
-ベンゾイル)-ヒドラジド)、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択する
ことができる。
に、リガンドを用いる。場合によって、リガンドは、ecdyステロイド、9-cis-
レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、N,N’-ジアシルヒドラジン、オキサゾリ
ン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、N-アルキル-N,N’-ジアロイルヒド
ラジン、N-アシル-N-アルキルカルボニルヒドラジン、N-アロイル-N-アルキル
-N’-アロイルヒドラジン、アルニドケトン、3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒ
ドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-アセチルハルパジド、オキシステロ
ール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコレステロール、2
5-エポキシコレステロール、T0901317、5-アルファ-6-アルファ-エポキ
シコレステロール-3-スルフェート(sulfate)(ECHS)、7-ケトコレステロー
ル-3-スルフェート(sulfate)、フラメゾール、胆汁酸、1,1-ビホスホネート(b
iphosphonate)エステル、若年性ホルモンIII、RG-115819(3,5-ジメチ
ル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メチル-
3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド-)、RG-115932((R)-3,5-
ジメチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-
メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド)、およびRG-115830(3,5-ジメチル
-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ
-ベンゾイル)-ヒドラジド)、ならびにこれらの任意の組合せからなる群から選択する
ことができる。
一部の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態で
は、プロモーターは、非誘導性プロモーターである。場合によって、プロモーターは、組
織特異的プロモーターでありうる。本明細書では、「組織特異的」とは、組織または細胞
型のサブセット内の、遺伝子発現の調節を指す。場合によって、組織特異的プロモーター
は、プロモーターが、生物の、ある特定の組織または細胞型における発現だけを駆動する
ように、空間的に調節することができる。他の場合には、組織特異的プロモーターは、プ
ロモーターが、生物の発生時を含む時間にわたり、細胞型または組織における発現を、示
差的に駆動するように、時間的に調節することができる。場合によって、組織特異的プロ
モーターは、空間的に、かつ、時間的に調節される。ある特定の実施形態では、組織特異
的プロモーターは、ある特定の細胞型内で、構成的に、または特定の時点または細胞型の
特定の段階において、間欠的に活性化する。例えば、組織特異的プロモーターは、T細胞
またはNK細胞など、特異的細胞が活性化する場合に活性化するプロモーターでありうる
。T細胞は、様々な形で、例えば、MHCクラスII分子により、ペプチド抗原と共に提
示される場合に活性化しうる。
は、プロモーターは、非誘導性プロモーターである。場合によって、プロモーターは、組
織特異的プロモーターでありうる。本明細書では、「組織特異的」とは、組織または細胞
型のサブセット内の、遺伝子発現の調節を指す。場合によって、組織特異的プロモーター
は、プロモーターが、生物の、ある特定の組織または細胞型における発現だけを駆動する
ように、空間的に調節することができる。他の場合には、組織特異的プロモーターは、プ
ロモーターが、生物の発生時を含む時間にわたり、細胞型または組織における発現を、示
差的に駆動するように、時間的に調節することができる。場合によって、組織特異的プロ
モーターは、空間的に、かつ、時間的に調節される。ある特定の実施形態では、組織特異
的プロモーターは、ある特定の細胞型内で、構成的に、または特定の時点または細胞型の
特定の段階において、間欠的に活性化する。例えば、組織特異的プロモーターは、T細胞
またはNK細胞など、特異的細胞が活性化する場合に活性化するプロモーターでありうる
。T細胞は、様々な形で、例えば、MHCクラスII分子により、ペプチド抗原と共に提
示される場合に活性化しうる。
1つの場合には、少なくとも1つのプロモーターは、操作プロモーターまたはこの変異
体である。本明細書で記載される通り、プロモーターは、IL-2に由来する最小プロモ
ーター配列と、以下:活性化T細胞核内因子(NFAT)応答エレメント;NFIL2D
応答エレメント、NFkB/TCF応答エレメント、NF_AT/NFIL2B応答エレ
メント、またはNFIL2A/OCT応答エレメントのうちの1または複数とを組み込み
うる。応答エレメントの例については、その全体において本明細書に組み込まれる、Matt
ila et al., EMBO J. 9(13):4425-33 (1990)において記載されている。
体である。本明細書で記載される通り、プロモーターは、IL-2に由来する最小プロモ
ーター配列と、以下:活性化T細胞核内因子(NFAT)応答エレメント;NFIL2D
応答エレメント、NFkB/TCF応答エレメント、NF_AT/NFIL2B応答エレ
メント、またはNFIL2A/OCT応答エレメントのうちの1または複数とを組み込み
うる。応答エレメントの例については、その全体において本明細書に組み込まれる、Matt
ila et al., EMBO J. 9(13):4425-33 (1990)において記載されている。
一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、IL-2コアプロモーター(
配列番号26)を含む。一実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、IL-2最
小プロモーター(配列番号27)を含む。別の実施形態では、少なくとも1つのプロモー
ターは、IL-2エンハンサー/プロモーター変異体(配列番号26~28)を含む。さ
らに別の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、NF-κB結合部位(配列番
号30~32)を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、(NF
-κB)1-IL2プロモーター変異体(配列番号30)を含む。一部の実施形態では、
少なくとも1つのプロモーターは、(NF-κB)3-IL2プロモーター変異体(配列
番号31)を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、(NF-κ
B)6-IL2プロモーター変異体(配列番号32)を含む。一実施形態では、少なくと
も1つのプロモーターは、1×活性化T細胞核内因子(NFAT)応答エレメント-IL
2プロモーター変異体(配列番号33)を含む。別の実施形態では、少なくとも1つのプ
ロモーターは、3×NFAT応答エレメント(配列番号34~35)を含む。さらに別の
実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、6×NFAT応答エレメント-IL2
プロモーター変異体(配列番号36~39)を含む。一部の実施形態では、少なくとも1
つのプロモーターは、ヒトEF1A1プロモーター変異体(配列番号40~41)を含む
。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、ヒトEF1A1プロモーター
/エンハンサー(配列番号42)を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモ
ーターは、ヒトUBCプロモーター(配列番号43)を含む。一部の実施形態では、少な
くとも1つのプロモーターは、6部位GAL4誘導性近位因子結合エレメント(PFB)
を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、合成最小プロモーター
1(誘導性プロモーター)(配列番号44)を含む。
配列番号26)を含む。一実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、IL-2最
小プロモーター(配列番号27)を含む。別の実施形態では、少なくとも1つのプロモー
ターは、IL-2エンハンサー/プロモーター変異体(配列番号26~28)を含む。さ
らに別の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、NF-κB結合部位(配列番
号30~32)を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、(NF
-κB)1-IL2プロモーター変異体(配列番号30)を含む。一部の実施形態では、
少なくとも1つのプロモーターは、(NF-κB)3-IL2プロモーター変異体(配列
番号31)を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、(NF-κ
B)6-IL2プロモーター変異体(配列番号32)を含む。一実施形態では、少なくと
も1つのプロモーターは、1×活性化T細胞核内因子(NFAT)応答エレメント-IL
2プロモーター変異体(配列番号33)を含む。別の実施形態では、少なくとも1つのプ
ロモーターは、3×NFAT応答エレメント(配列番号34~35)を含む。さらに別の
実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、6×NFAT応答エレメント-IL2
プロモーター変異体(配列番号36~39)を含む。一部の実施形態では、少なくとも1
つのプロモーターは、ヒトEF1A1プロモーター変異体(配列番号40~41)を含む
。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、ヒトEF1A1プロモーター
/エンハンサー(配列番号42)を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモ
ーターは、ヒトUBCプロモーター(配列番号43)を含む。一部の実施形態では、少な
くとも1つのプロモーターは、6部位GAL4誘導性近位因子結合エレメント(PFB)
を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのプロモーターは、合成最小プロモーター
1(誘導性プロモーター)(配列番号44)を含む。
本明細書で記載される、IL-12発現のリガンド誘導性制御のための、遺伝子スイッ
チの使用は、例えば、発現の調節および治療指数の改善を可能とすることにより、IL-
12の安全性プロファイルを改善しうる。しかし、遺伝子スイッチを使用する、リガンド
用量依存性のIL-12の発現のための条件は、活性化リガンド(例えば、ベレジメクス
)の存在または非存在である。ある特定の実施形態では、誘導IL-12発現に対する、
さらなる条件付け制御も想定される。T細胞活性化特異的プロモーターの制御下にある遺
伝子スイッチ構成要素が提供される。これは、遺伝子スイッチの制御下にある、トランス
遺伝子の、ベレジメクス制御型発現に必要な遺伝子スイッチ構成要素の条件付け(例えば
、T細胞の活性化)発現を結果としてもたらす。一部の実施形態では、これは、ベレジメ
クスが、存在し、T細胞が、活性化している場合における、腫瘍特異的T細胞による、I
L-12またはIL-15などのサイトカインの優先的な発現を結果としてもたらす。こ
れは、遺伝子スイッチに制御される、トランス遺伝子発現の局在化レベルの上昇をもたら
しうる。
チの使用は、例えば、発現の調節および治療指数の改善を可能とすることにより、IL-
12の安全性プロファイルを改善しうる。しかし、遺伝子スイッチを使用する、リガンド
用量依存性のIL-12の発現のための条件は、活性化リガンド(例えば、ベレジメクス
)の存在または非存在である。ある特定の実施形態では、誘導IL-12発現に対する、
さらなる条件付け制御も想定される。T細胞活性化特異的プロモーターの制御下にある遺
伝子スイッチ構成要素が提供される。これは、遺伝子スイッチの制御下にある、トランス
遺伝子の、ベレジメクス制御型発現に必要な遺伝子スイッチ構成要素の条件付け(例えば
、T細胞の活性化)発現を結果としてもたらす。一部の実施形態では、これは、ベレジメ
クスが、存在し、T細胞が、活性化している場合における、腫瘍特異的T細胞による、I
L-12またはIL-15などのサイトカインの優先的な発現を結果としてもたらす。こ
れは、遺伝子スイッチに制御される、トランス遺伝子発現の局在化レベルの上昇をもたら
しうる。
例えば、遺伝子スイッチ構成要素の、T細胞活性化特異的発現は、活性化T細胞核内因
子(NFAT)応答エレメントを含むプロモーターにより制御することができる。NFA
T転写因子は、エフェクターT細胞状態の、鍵となるモジュレーターである。NFATは
、疲弊を漸進的に駆動する、早期転写チェックポイントである。NFATは、TCRの刺
激後に、T細胞内で迅速に活性化し、適切な共刺激シグナル伝達により誘導されて、AP
-1と共に、タンパク質複合体を形成し、エフェクター遺伝子およびT細胞機能を調節す
る。NFAT応答エレメントは、他の最小プロモーター配列(例えば、IL2最小プロモ
ーター)と融合させて、T細胞の活性化に応答した、トランス遺伝子の発現を駆動するこ
とができる。
子(NFAT)応答エレメントを含むプロモーターにより制御することができる。NFA
T転写因子は、エフェクターT細胞状態の、鍵となるモジュレーターである。NFATは
、疲弊を漸進的に駆動する、早期転写チェックポイントである。NFATは、TCRの刺
激後に、T細胞内で迅速に活性化し、適切な共刺激シグナル伝達により誘導されて、AP
-1と共に、タンパク質複合体を形成し、エフェクター遺伝子およびT細胞機能を調節す
る。NFAT応答エレメントは、他の最小プロモーター配列(例えば、IL2最小プロモ
ーター)と融合させて、T細胞の活性化に応答した、トランス遺伝子の発現を駆動するこ
とができる。
活性化特異的プロモーターの他の例は、インターロイキン2(IL2)プロモーターお
よびプログラム細胞死(PD)1(CD279)プロモーターを含むがこれらに限定され
ない。遺伝子スイッチ構成要素はまた、炎症促進性シグナル伝達経路のNF-κBなど、
他の核内因子に対する結合性部位を、最小プロモーター配列(例えば、IL2)へと融合
させることにより、免疫細胞の活性化時にも、条件付けで発現させることができる。
よびプログラム細胞死(PD)1(CD279)プロモーターを含むがこれらに限定され
ない。遺伝子スイッチ構成要素はまた、炎症促進性シグナル伝達経路のNF-κBなど、
他の核内因子に対する結合性部位を、最小プロモーター配列(例えば、IL2)へと融合
させることにより、免疫細胞の活性化時にも、条件付けで発現させることができる。
ある特定の実施形態では、プロモーターは、IL-2コアプロモーター、IL-2最小
プロモーター、IL-2エンハンサー/プロモーター変異体、(NF-κB)1-IL2
プロモーター変異体、(NF-κB)3-IL2プロモーター変異体、(NF-κB)6
-IL2プロモーター変異体、1×NFAT応答エレメント-IL2プロモーター変異体
、3×NFAT応答エレメント-IL2プロモーター変異体、6×NFAT応答エレメン
ト-IL2プロモーター変異体、ヒトEEF1A1プロモーター変異体、ヒトEEF1A
1プロモーター/エンハンサー、ヒトUBCプロモーター、および合成最小プロモーター
1のうちの、任意の1または複数でありうる。ある特定の実施形態では、プロモーターヌ
クレオチドは、配列番号26~44を含みうる。
プロモーター、IL-2エンハンサー/プロモーター変異体、(NF-κB)1-IL2
プロモーター変異体、(NF-κB)3-IL2プロモーター変異体、(NF-κB)6
-IL2プロモーター変異体、1×NFAT応答エレメント-IL2プロモーター変異体
、3×NFAT応答エレメント-IL2プロモーター変異体、6×NFAT応答エレメン
ト-IL2プロモーター変異体、ヒトEEF1A1プロモーター変異体、ヒトEEF1A
1プロモーター/エンハンサー、ヒトUBCプロモーター、および合成最小プロモーター
1のうちの、任意の1または複数でありうる。ある特定の実施形態では、プロモーターヌ
クレオチドは、配列番号26~44を含みうる。
遺伝子スイッチ
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドおよび/またはポリ
ヌクレオチドを組み込む方法およびシステムが提示される。ある特定の態様では、本開示
は、異種遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、1または複数
のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子ス
イッチ系により調節され;前記異種遺伝子が、本明細書で開示される、1または複数の免
疫応答誘導性B型肝炎ウイルス(HBV)ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを対象とする。
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドおよび/またはポリ
ヌクレオチドを組み込む方法およびシステムが提示される。ある特定の態様では、本開示
は、異種遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、1または複数
のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子ス
イッチ系により調節され;前記異種遺伝子が、本明細書で開示される、1または複数の免
疫応答誘導性B型肝炎ウイルス(HBV)ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを対象とする。
「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモーターと関連する応答エレメントの組合せを
指し、例えば、1または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーター
を組み込んだ遺伝子の発現をモジュレートする、EcRベースの系を指す。緊密に調節さ
れた誘導性遺伝子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールの
タンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的な
ゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形
質の調節など、多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘
導性異種遺伝子発現系を含みうる。
指し、例えば、1または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーター
を組み込んだ遺伝子の発現をモジュレートする、EcRベースの系を指す。緊密に調節さ
れた誘導性遺伝子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールの
タンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的な
ゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形
質の調節など、多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘
導性異種遺伝子発現系を含みうる。
EcRベースの遺伝子スイッチの初期形は、キイロショウジョウバエ(Drosophila mel
anogaster)EcR(DmEcR)ポリペプチドおよびマウス(Mus musculus)RXR(
MmRXR)ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロン
Aの存在下で、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺
伝子をトランス活性化させることを示した(Christopherson et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89(14):6314-18 (1992); No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8):334
6-51 (1996))。その後、Suhr et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14):7999-8004
(1998))は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが、外因性ヘ
テロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ(Bombyx mori)EcR(BmEcR)を介
して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのトランス活性化を誘導すること
を示した。
anogaster)EcR(DmEcR)ポリペプチドおよびマウス(Mus musculus)RXR(
MmRXR)ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロン
Aの存在下で、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺
伝子をトランス活性化させることを示した(Christopherson et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89(14):6314-18 (1992); No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8):334
6-51 (1996))。その後、Suhr et al.(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14):7999-8004
(1998))は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストであるテブフェノジドが、外因性ヘ
テロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ(Bombyx mori)EcR(BmEcR)を介
して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのトランス活性化を誘導すること
を示した。
PCT国際特許出願/米国出願第97/05330号明細書(国際公開第97/381
17号パンフレット)およびPCT国際特許出願/米国出願第99/08381号明細書
(国際公開第99/58155号パンフレット)は、外因性遺伝子の発現をモジュレート
するための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むDNA構
築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーと
して作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺
伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第2のDNA構築物により活性化する方法
について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ(Dr
osophila melanogaster)から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をも
たらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドX受容体(RXR)の存在
を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体(EcR)は、哺乳動物レチ
ノイドX受容体(RXR)と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺
伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。PCT国際特
許出願/米国出願第98/14215号明細書(国際公開第99/02683号パンフレ
ット)は、カイコガであるカイコ(Bombyx mori)から単離されたエクジソン受容体が、
外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開
示している。
17号パンフレット)およびPCT国際特許出願/米国出願第99/08381号明細書
(国際公開第99/58155号パンフレット)は、外因性遺伝子の発現をモジュレート
するための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むDNA構
築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーと
して作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺
伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第2のDNA構築物により活性化する方法
について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ(Dr
osophila melanogaster)から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をも
たらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドX受容体(RXR)の存在
を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体(EcR)は、哺乳動物レチ
ノイドX受容体(RXR)と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺
伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。PCT国際特
許出願/米国出願第98/14215号明細書(国際公開第99/02683号パンフレ
ット)は、カイコガであるカイコ(Bombyx mori)から単離されたエクジソン受容体が、
外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開
示している。
米国特許第6,265,173号明細書は、受容体のステロイド/甲状腺スーパーファ
ミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、USPの、少なくとも
二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)ウルトラ
スピラクル受容体(USP)またはこの断片と組み合わせうることについて開示している
。米国特許第5,880,333号明細書は、植物において使用された、キイロショウジ
ョウバエ(Drosophila melanogaster)のEcRおよびウルトラスピラクル(USP)に
よるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびDNA結合性ドメインが、
2つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示してい
る。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびDNA結合性ドメイン(P
CT国際特許出願/米国出願第98/14215号明細書における通りに、天然のEcR
として、またはPCT国際特許出願/米国出願第97/05330号明細書における通り
に、修飾EcRとして)を、単一の分子へと組み込み、USPまたはRXRである、他の
ヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。
ミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、USPの、少なくとも
二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)ウルトラ
スピラクル受容体(USP)またはこの断片と組み合わせうることについて開示している
。米国特許第5,880,333号明細書は、植物において使用された、キイロショウジ
ョウバエ(Drosophila melanogaster)のEcRおよびウルトラスピラクル(USP)に
よるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびDNA結合性ドメインが、
2つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示してい
る。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびDNA結合性ドメイン(P
CT国際特許出願/米国出願第98/14215号明細書における通りに、天然のEcR
として、またはPCT国際特許出願/米国出願第97/05330号明細書における通り
に、修飾EcRとして)を、単一の分子へと組み込み、USPまたはRXRである、他の
ヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。
PCT国際特許出願/米国出願第01/0905号明細書は、トランス活性化ドメイン
と、DNA結合ドメインとを2つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた
、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラ
ウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンド
を上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この2ハイ
ブリッド系は、PCT/米国出願第97/05330号明細書およびPCT/米国出願第
98/14215号明細書において開示されている、2つの系と比較して、著明に改善さ
れた誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。2ハイブリッド系は、DNA結合性ド
メインが、遺伝子上のDNA結合性部位に結合すると、トランス活性化ドメインが、プロ
モーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対が、転写活性化
ドメインを、DNA結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力を利用すると考
えられる(例えば、米国特許第5,283,173号明細書を参照されたい)。2ハイブ
リッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたDNA結合性ドメインを
コードする、第1の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペプチドへと融合
させたトランス活性化ドメインをコードする、第2の遺伝子発現カセットである、2つの
遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、第1のポリペプチドの、第2のポリ
ペプチドとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、これにより、DN
A結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果としてもたらされると
考えられる。DNA結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、2つの異なる分子
上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、大幅に低減され
る。
と、DNA結合ドメインとを2つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた
、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラ
ウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンド
を上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この2ハイ
ブリッド系は、PCT/米国出願第97/05330号明細書およびPCT/米国出願第
98/14215号明細書において開示されている、2つの系と比較して、著明に改善さ
れた誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。2ハイブリッド系は、DNA結合性ド
メインが、遺伝子上のDNA結合性部位に結合すると、トランス活性化ドメインが、プロ
モーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対が、転写活性化
ドメインを、DNA結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力を利用すると考
えられる(例えば、米国特許第5,283,173号明細書を参照されたい)。2ハイブ
リッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたDNA結合性ドメインを
コードする、第1の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペプチドへと融合
させたトランス活性化ドメインをコードする、第2の遺伝子発現カセットである、2つの
遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、第1のポリペプチドの、第2のポリ
ペプチドとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、これにより、DN
A結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果としてもたらされると
考えられる。DNA結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、2つの異なる分子
上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、大幅に低減され
る。
別の驚くべき発見は、2ハイブリッド系のある特定の改変がまた、ステロイド性リガン
ド、例えば、ポナステロンA(「PonA」)またはムリステロンA(「MurA」)と
比較した場合に、非ステロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する感受性
の改善ももたらすことであった。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性
リガンドは、低リガンド濃度で、より大きな遺伝子転写活性をもたらした。さらに、2ハ
イブリッド系は、非修飾RXRを切り替えパートナーとして使用する場合に生じうる、R
XRの過剰発現に起因する一部の副作用も回避する。好ましい2ハイブリッド系では、E
cRまたはRXRの、天然のDNA結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは除去
され、結果として、これらのハイブリッド分子は、細胞内に存在する、他のステロイドホ
ルモン受容体との相互作用の可能性を低下させ、これにより、副作用の低減を結果として
もたらす。
ド、例えば、ポナステロンA(「PonA」)またはムリステロンA(「MurA」)と
比較した場合に、非ステロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する感受性
の改善ももたらすことであった。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性
リガンドは、低リガンド濃度で、より大きな遺伝子転写活性をもたらした。さらに、2ハ
イブリッド系は、非修飾RXRを切り替えパートナーとして使用する場合に生じうる、R
XRの過剰発現に起因する一部の副作用も回避する。好ましい2ハイブリッド系では、E
cRまたはRXRの、天然のDNA結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは除去
され、結果として、これらのハイブリッド分子は、細胞内に存在する、他のステロイドホ
ルモン受容体との相互作用の可能性を低下させ、これにより、副作用の低減を結果として
もたらす。
エクジソン受容体(EcR)とは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、
サブファミリー1、群H(本明細書では、「群H核内受容体」と称する)へと分類される
。各群のメンバーは、E(リガンド結合)ドメイン内で、40~60%のアミノ酸同一性
を共有する(Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Recepto
r Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163)。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体
サブファミリー1、群Hの他のメンバーは、ユビキタス受容体(UR)、オーファン受容
体1(OR-1)、ステロイドホルモン核内受容体1(NER-1)、RXR相互作用性
タンパク質15(RIP-15)、肝臓x受容体β(LXRβ)、ステロイドホルモン受
容体様タンパク質(RLD-1)、肝臓x受容体(LXR)、肝臓x受容体α(LXRα
)、ファルネソイドx受容体(FXR)、受容体相互作用性タンパク質14(RIP-1
4)、およびファルネソール受容体(HRR-1)を含む。
サブファミリー1、群H(本明細書では、「群H核内受容体」と称する)へと分類される
。各群のメンバーは、E(リガンド結合)ドメイン内で、40~60%のアミノ酸同一性
を共有する(Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Recepto
r Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163)。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体
サブファミリー1、群Hの他のメンバーは、ユビキタス受容体(UR)、オーファン受容
体1(OR-1)、ステロイドホルモン核内受容体1(NER-1)、RXR相互作用性
タンパク質15(RIP-15)、肝臓x受容体β(LXRβ)、ステロイドホルモン受
容体様タンパク質(RLD-1)、肝臓x受容体(LXR)、肝臓x受容体α(LXRα
)、ファルネソイドx受容体(FXR)、受容体相互作用性タンパク質14(RIP-1
4)、およびファルネソール受容体(HRR-1)を含む。
場合によって、誘導性プロモーターは、Intrexon Corporation製
のRHEOSWITCH(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、2
つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合に
よって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる
、PCT/米国出願第2001/009050号明細書(国際公開第2001/0708
16号パンフレット);米国特許第7,091,038号明細書;同第7,776,58
7号明細書;同第7,807,417号明細書;同第8,202,718号明細書;PC
T/米国出願第2001/030608号明細書(国際公開第2002/029075号
パンフレット);米国特許第8,105,825号明細書;同第8,168,426号明
細書;PCT/米国出願第2002/005235号明細書(国際公開第2002/06
6613号パンフレット);米国特許出願公開第10/468,200号明細書(米国公
開第20120167239号明細書);PCT/米国出願第2002/005706号
明細書(国際公開第2002/066614号パンフレット);米国特許第7,531,
326号明細書;同第8,236,556号明細書;同第8,598,409号明細書;
PCT/米国出願第2002/005090号明細書(国際公開第2002/06661
2号パンフレット);米国特許第8,715,959号明細書(米国公開第200601
00416号明細書);PCT/米国出願第2002/005234号明細書(国際公開
第2003/027266号パンフレット);米国特許第7,601,508号明細書;
同第7,829,676号明細書;同第7,919,269号明細書;同第8,030,
067号明細書;PCT/米国出願第2002/005708号明細書(国際公開第20
02/066615号パンフレット);米国特許出願公開第10/468,192号明細
書(米国公開第20110212528号明細書);PCT/米国出願第2002/00
5026号明細書(国際公開第2003/027289号パンフレット);米国特許第7
,563,879号明細書;同第8,021,878号明細書;同第8,497,093
号明細書;PCT/米国出願第2005/015089号明細書(国際公開第2005/
108617号パンフレット);米国特許第7,935,510号明細書;同第8,07
6,454号明細書;PCT/米国出願第2008/011270号明細書(国際公開第
2009/045370号パンフレット);米国特許出願公開第12/241,018号
明細書(米国公開第20090136465号明細書);PCT/米国出願第2008/
011563号明細書(国際公開第2009/048560号パンフレット);米国特許
出願公開第12/247,738号明細書(米国公開第20090123441号明細書
);PCT/米国出願第2009/005510号明細書(国際公開第2010/042
189号パンフレット);米国特許出願公開第13/123,129号明細書(米国公開
第20110268766号明細書);PCT/米国出願第2011/029682号明
細書(国際公開第2011/119773号パンフレット);米国特許出願公開第13/
636,473号明細書(米国公開第20130195800号明細書);PCT/米国
出願第2012/027515号明細書(国際公開第2012/122025号パンフレ
ット);および米国特許第9,402,919号明細書において記載されている系のうち
のいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限
定されない。
のRHEOSWITCH(登録商標)遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、2
つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合に
よって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる
、PCT/米国出願第2001/009050号明細書(国際公開第2001/0708
16号パンフレット);米国特許第7,091,038号明細書;同第7,776,58
7号明細書;同第7,807,417号明細書;同第8,202,718号明細書;PC
T/米国出願第2001/030608号明細書(国際公開第2002/029075号
パンフレット);米国特許第8,105,825号明細書;同第8,168,426号明
細書;PCT/米国出願第2002/005235号明細書(国際公開第2002/06
6613号パンフレット);米国特許出願公開第10/468,200号明細書(米国公
開第20120167239号明細書);PCT/米国出願第2002/005706号
明細書(国際公開第2002/066614号パンフレット);米国特許第7,531,
326号明細書;同第8,236,556号明細書;同第8,598,409号明細書;
PCT/米国出願第2002/005090号明細書(国際公開第2002/06661
2号パンフレット);米国特許第8,715,959号明細書(米国公開第200601
00416号明細書);PCT/米国出願第2002/005234号明細書(国際公開
第2003/027266号パンフレット);米国特許第7,601,508号明細書;
同第7,829,676号明細書;同第7,919,269号明細書;同第8,030,
067号明細書;PCT/米国出願第2002/005708号明細書(国際公開第20
02/066615号パンフレット);米国特許出願公開第10/468,192号明細
書(米国公開第20110212528号明細書);PCT/米国出願第2002/00
5026号明細書(国際公開第2003/027289号パンフレット);米国特許第7
,563,879号明細書;同第8,021,878号明細書;同第8,497,093
号明細書;PCT/米国出願第2005/015089号明細書(国際公開第2005/
108617号パンフレット);米国特許第7,935,510号明細書;同第8,07
6,454号明細書;PCT/米国出願第2008/011270号明細書(国際公開第
2009/045370号パンフレット);米国特許出願公開第12/241,018号
明細書(米国公開第20090136465号明細書);PCT/米国出願第2008/
011563号明細書(国際公開第2009/048560号パンフレット);米国特許
出願公開第12/247,738号明細書(米国公開第20090123441号明細書
);PCT/米国出願第2009/005510号明細書(国際公開第2010/042
189号パンフレット);米国特許出願公開第13/123,129号明細書(米国公開
第20110268766号明細書);PCT/米国出願第2011/029682号明
細書(国際公開第2011/119773号パンフレット);米国特許出願公開第13/
636,473号明細書(米国公開第20130195800号明細書);PCT/米国
出願第2012/027515号明細書(国際公開第2012/122025号パンフレ
ット);および米国特許第9,402,919号明細書において記載されている系のうち
のいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択しうるが、これらに限
定されない。
宿主細胞内の、異種遺伝子およびインターロイキンの発現をモジュレートするための系
であって、本明細書で開示される遺伝子スイッチポリペプチドを発現させるポリヌクレオ
チドを含む系が提供される。
であって、本明細書で開示される遺伝子スイッチポリペプチドを発現させるポリヌクレオ
チドを含む系が提供される。
一部の実施形態では、宿主細胞内の、異種遺伝子およびサイトカインの発現をモジュレ
ートするための系であって、第1のポリペプチドをコードする、第1のポリヌクレオチド
を含む、第1の遺伝子発現カセット;第2のポリペプチドをコードする、第2のポリヌク
レオチドを含む、第2の遺伝子発現カセット;およびリガンドを含み、前記宿主細胞を、
前記リガンドの存在下で、前記第1の遺伝子発現カセットおよび前記第2の遺伝子発現カ
セットと接触させると、前記異種遺伝子および前記サイトカインが、前記宿主細胞内で発
現するように、前記第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが、(i)トランス活
性化ドメイン;(ii)DNA結合性ドメイン;および(iii)リガンド結合性ドメイ
ン;(iv)前記異種遺伝子;ならびに(vi)前記サイトカインのうちの1または複数
を含む系である。場合によって、異種遺伝子は、本明細書で記載される抗原結合性ポリペ
プチドを含む。場合によって、サイトカインは、少なくとも1つの、ケモカイン、インタ
ーフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの変異体も
しくは組合せを含む。場合によって、サイトカインは、インターロイキンである。場合に
よって、インターロイキンは、IL12、IL2、IL15、IL21、ならびにこれら
の機能的な変異体および断片のうちの少なくとも1つである。一部の実施形態では、サイ
トカインは、膜結合型の場合もあり、分泌型の場合もある。他の実施形態では、サイトカ
インは、細胞内サイトカインでありうる。インターロイキンは、膜結合型IL-15(m
bIL-15)、IL-15とIL-15Rαとの融合体を含みうる。一部の実施形態で
は、mbIL-15は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させ
うる膜結合型キメラIL-15である。一部の実施形態では、mbIL-15は、全長I
L-15Rα、またはこの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた全長
IL-15(例えば、天然IL-15ポリペプチド)またはこの断片もしくは変異体を含
む。場合によって、IL-15は、リンカーを介して、IL-15Rαへと間接的に連結
される。場合によって、mbIL-15は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments
antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T c
ells,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(48):E7788-E7797 (2016)において記載されて
いる通りである。別の態様では、インターロイキンは、IL-12を含みうる。一部の実
施形態では、IL-12は、単鎖IL-12(scIL-12)、プロテアーゼ感受性I
L-12、不安定化IL-12、膜結合型IL-12、または挿入IL-12である。一
部の実施形態では、IL-12は、マウスIL-12サブユニットベータ(p40)(配
列番号206)である。一部の実施形態では、IL-12は、マウスのIL-12サブユ
ニットアルファ(p35)(配列番号207)である。場合によって、IL-12変異体
は、それらの全てが、参照によりそれらの全体において組み込まれる、国際公開第201
5/095249号パンフレット、国際公開第2016/048903号パンフレット、
および国際公開第2017/062953号パンフレットにおいて記載されている通りで
ある。
ートするための系であって、第1のポリペプチドをコードする、第1のポリヌクレオチド
を含む、第1の遺伝子発現カセット;第2のポリペプチドをコードする、第2のポリヌク
レオチドを含む、第2の遺伝子発現カセット;およびリガンドを含み、前記宿主細胞を、
前記リガンドの存在下で、前記第1の遺伝子発現カセットおよび前記第2の遺伝子発現カ
セットと接触させると、前記異種遺伝子および前記サイトカインが、前記宿主細胞内で発
現するように、前記第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが、(i)トランス活
性化ドメイン;(ii)DNA結合性ドメイン;および(iii)リガンド結合性ドメイ
ン;(iv)前記異種遺伝子;ならびに(vi)前記サイトカインのうちの1または複数
を含む系である。場合によって、異種遺伝子は、本明細書で記載される抗原結合性ポリペ
プチドを含む。場合によって、サイトカインは、少なくとも1つの、ケモカイン、インタ
ーフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、またはこれらの変異体も
しくは組合せを含む。場合によって、サイトカインは、インターロイキンである。場合に
よって、インターロイキンは、IL12、IL2、IL15、IL21、ならびにこれら
の機能的な変異体および断片のうちの少なくとも1つである。一部の実施形態では、サイ
トカインは、膜結合型の場合もあり、分泌型の場合もある。他の実施形態では、サイトカ
インは、細胞内サイトカインでありうる。インターロイキンは、膜結合型IL-15(m
bIL-15)、IL-15とIL-15Rαとの融合体を含みうる。一部の実施形態で
は、mbIL-15は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させ
うる膜結合型キメラIL-15である。一部の実施形態では、mbIL-15は、全長I
L-15Rα、またはこの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させた全長
IL-15(例えば、天然IL-15ポリペプチド)またはこの断片もしくは変異体を含
む。場合によって、IL-15は、リンカーを介して、IL-15Rαへと間接的に連結
される。場合によって、mbIL-15は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments
antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T c
ells,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(48):E7788-E7797 (2016)において記載されて
いる通りである。別の態様では、インターロイキンは、IL-12を含みうる。一部の実
施形態では、IL-12は、単鎖IL-12(scIL-12)、プロテアーゼ感受性I
L-12、不安定化IL-12、膜結合型IL-12、または挿入IL-12である。一
部の実施形態では、IL-12は、マウスIL-12サブユニットベータ(p40)(配
列番号206)である。一部の実施形態では、IL-12は、マウスのIL-12サブユ
ニットアルファ(p35)(配列番号207)である。場合によって、IL-12変異体
は、それらの全てが、参照によりそれらの全体において組み込まれる、国際公開第201
5/095249号パンフレット、国際公開第2016/048903号パンフレット、
および国際公開第2017/062953号パンフレットにおいて記載されている通りで
ある。
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
前記遺伝子スイッチポリペプチドが、a)核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合さ
せたDNA結合性ドメインを含む、第1の遺伝子スイッチポリペプチド、およびb)核内
受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第2の遺
伝子スイッチポリペプチドを含み、第1の遺伝子スイッチポリペプチドと、第2の遺伝子
スイッチポリペプチドとが、リンカーにより接続されている、ポリヌクレオチドが提示さ
れる。場合によって、リンカーは、本明細書で記載されるリンカー、例えば、GSGリン
カー、フューリンリンク(furinlink)、F/T2A、T2A、p2A、GSG-p2A
などの2Aリンカー、ならびにこれらの変異体および誘導体でありうる。他の場合には、
リンカーは、IRESでありうる。
前記遺伝子スイッチポリペプチドが、a)核内受容体リガンド結合性ドメインへと融合さ
せたDNA結合性ドメインを含む、第1の遺伝子スイッチポリペプチド、およびb)核内
受容体リガンド結合性ドメインへと融合させたトランス活性化ドメインを含む、第2の遺
伝子スイッチポリペプチドを含み、第1の遺伝子スイッチポリペプチドと、第2の遺伝子
スイッチポリペプチドとが、リンカーにより接続されている、ポリヌクレオチドが提示さ
れる。場合によって、リンカーは、本明細書で記載されるリンカー、例えば、GSGリン
カー、フューリンリンク(furinlink)、F/T2A、T2A、p2A、GSG-p2A
などの2Aリンカー、ならびにこれらの変異体および誘導体でありうる。他の場合には、
リンカーは、IRESでありうる。
場合によって、DNA結合性ドメイン(DBD)は、本明細書で記載されるDBD、例
えば、GAL4(GAL4 DBD)、LexADBD、転写因子DBD、ステロイド/
甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーDBD、細菌LacZ DBD、
および酵母DBDのうちの少なくとも1つを含む。トランス活性化ドメインは、本明細書
で記載されるトランス活性化ドメイン、例えば、VP16トランス活性化ドメイン、p5
3トランス活性化ドメイン、およびB42酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうち
の1つを含みうる。核内受容体リガンド結合性ドメインは、エクジソン受容体(EcR)
、ユビキタス受容体、オーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体
1、レチノイドX受容体相互作用性タンパク質15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモ
ン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容
体相互作用性タンパク質14、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも1つを含
みうる。
えば、GAL4(GAL4 DBD)、LexADBD、転写因子DBD、ステロイド/
甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメンバーDBD、細菌LacZ DBD、
および酵母DBDのうちの少なくとも1つを含む。トランス活性化ドメインは、本明細書
で記載されるトランス活性化ドメイン、例えば、VP16トランス活性化ドメイン、p5
3トランス活性化ドメイン、およびB42酸性活性化因子トランス活性化ドメインのうち
の1つを含みうる。核内受容体リガンド結合性ドメインは、エクジソン受容体(EcR)
、ユビキタス受容体、オーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体
1、レチノイドX受容体相互作用性タンパク質15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモ
ン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容
体相互作用性タンパク質14、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも1つを含
みうる。
場合によって、ポリペプチドリンカーまたはリボソームスキッピング配列により接続さ
れた遺伝子スイッチポリペプチドは、遺伝子発現に対する、用量依存性のリガンド誘導性
制御の、リガンド誘導性遺伝子スイッチと比較した改善を呈するが、この場合、遺伝子ス
イッチポリペプチドは、IRESなど、非コード配列により接続されている。場合によっ
て、2Aリンカーにより接続された遺伝子スイッチポリペプチドは、異種遺伝子発現に対
する、用量依存性のリガンド誘導性制御の、遺伝子スイッチと比較した改善を呈するが、
この場合、前記遺伝子スイッチポリペプチドは、IRESにより隔てられている。
れた遺伝子スイッチポリペプチドは、遺伝子発現に対する、用量依存性のリガンド誘導性
制御の、リガンド誘導性遺伝子スイッチと比較した改善を呈するが、この場合、遺伝子ス
イッチポリペプチドは、IRESなど、非コード配列により接続されている。場合によっ
て、2Aリンカーにより接続された遺伝子スイッチポリペプチドは、異種遺伝子発現に対
する、用量依存性のリガンド誘導性制御の、遺伝子スイッチと比較した改善を呈するが、
この場合、前記遺伝子スイッチポリペプチドは、IRESにより隔てられている。
一部の実施形態では、遺伝子スイッチは、VP16トランス活性化ドメインを含む。一
実施形態では、遺伝子スイッチは、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体、オ
ーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体
相互作用性タンパク質15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、
肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用性タンパク質
14、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも1つを含む。別の実施形態では、
遺伝子スイッチのDNA結合性ドメインは、GAL4(GAL4 DBD)、LexAD
BD、転写因子DBD、ステロイド/甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメン
バーDBD、細菌LacZ DBD、および酵母DBDのうちの少なくとも1つを含む。
さらに別の場合には、遺伝子スイッチは、ウルトラスピラクルタンパク質(USP)、レ
チノイド受容体X(RXR)、これらの機能的な断片および変異体のうちの少なくとも1
つをさらに含み、この場合、前記これらの機能的な断片および変異体は、EcRの少なく
とも1つに結合することが可能である。
実施形態では、遺伝子スイッチは、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体、オ
ーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体
相互作用性タンパク質15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、
肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用性タンパク質
14、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも1つを含む。別の実施形態では、
遺伝子スイッチのDNA結合性ドメインは、GAL4(GAL4 DBD)、LexAD
BD、転写因子DBD、ステロイド/甲状腺ホルモン核内受容体スーパーファミリーメン
バーDBD、細菌LacZ DBD、および酵母DBDのうちの少なくとも1つを含む。
さらに別の場合には、遺伝子スイッチは、ウルトラスピラクルタンパク質(USP)、レ
チノイド受容体X(RXR)、これらの機能的な断片および変異体のうちの少なくとも1
つをさらに含み、この場合、前記これらの機能的な断片および変異体は、EcRの少なく
とも1つに結合することが可能である。
本明細書で記載されるポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、操作細胞内で発現させ
ることができる。本明細書では、操作細胞とは、その天然状態または内因性状態から改変
された細胞である。操作細胞の例は、例えば、遺伝子スイッチポリペプチド、目的の遺伝
子(GOI)、細胞タグ、異種遺伝子、ならびに本明細書で記載される、他の任意のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドをコードするように改変された(例えば、ポリヌクレオ
チドの、細胞へのトランスフェクションにより)、本明細書で記載される細胞である。
ることができる。本明細書では、操作細胞とは、その天然状態または内因性状態から改変
された細胞である。操作細胞の例は、例えば、遺伝子スイッチポリペプチド、目的の遺伝
子(GOI)、細胞タグ、異種遺伝子、ならびに本明細書で記載される、他の任意のポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドをコードするように改変された(例えば、ポリヌクレオ
チドの、細胞へのトランスフェクションにより)、本明細書で記載される細胞である。
リガンド
一部の実施形態では、誘導性遺伝子スイッチの調節のために使用されるリガンドは、以
下:
N-[(1R)-1-(1,1-ジメチルエチル)ブチル]-N’-(2-エチル-3-
メトキシベンゾイル)-3,5-ジメチルベンゾヒドラジド(ベレジメクスともまた称す
る)、(2S,3R,5R,9R,10R,13R,14S,17R)-17-[(2S
,3R)-3,6-ジヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル]-2,3,14-ト
リヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,3,4,5,9,11,12,15,16,
17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-6-オン;N’-(3,
5-ジメチルベンゾイル)-N’-[(3R)-2,2-ジメチル-3-ヘキサニル]-
2-エチル-3-メトキシベンゾヒドラジド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[
1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-
(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-メチル-2,3-ジヒ
ドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-
メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジ
ド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’
-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒド
ラジド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸
N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-
ベンゾイル)-ヒドラジド;5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシ
ン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2
,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1
,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイ
ル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-エチル-
2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert
-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;5-エチ
ル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-te
rt-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒ
ドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル
)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメトキ
シ-4-メチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(
3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N
-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル
)-ヒドラジド;3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-tert-ブチ
ル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5
-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-
エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメトキシ-4-メチル-
安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-
メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-tert
-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;
3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N
’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;2-メトキシ-ニコチン
酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒド
ラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル
)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-
(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル
)-ヒドラジド;および3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-tert
-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド
のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。
一部の実施形態では、誘導性遺伝子スイッチの調節のために使用されるリガンドは、以
下:
N-[(1R)-1-(1,1-ジメチルエチル)ブチル]-N’-(2-エチル-3-
メトキシベンゾイル)-3,5-ジメチルベンゾヒドラジド(ベレジメクスともまた称す
る)、(2S,3R,5R,9R,10R,13R,14S,17R)-17-[(2S
,3R)-3,6-ジヒドロキシ-6-メチルヘプタン-2-イル]-2,3,14-ト
リヒドロキシ-10,13-ジメチル-2,3,4,5,9,11,12,15,16,
17-デカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-6-オン;N’-(3,
5-ジメチルベンゾイル)-N’-[(3R)-2,2-ジメチル-3-ヘキサニル]-
2-エチル-3-メトキシベンゾヒドラジド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[
1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-
(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-メチル-2,3-ジヒ
ドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-
メチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジ
ド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’
-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒド
ラジド;5-メチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸
N’-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-
ベンゾイル)-ヒドラジド;5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシ
ン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-N’-(1-エチル-2
,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-エチル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1
,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイ
ル)-N’-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-ヒドラジド;5-エチル-
2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-tert
-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;5-エチ
ル-2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-カルボン酸N’-(1-te
rt-ブチル-ブチル)-N’-(3,5-ジメトキシ-4-メチル-ベンゾイル)-ヒ
ドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル
)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメトキ
シ-4-メチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(
3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N
-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル
)-ヒドラジド;3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-tert-ブチ
ル-ブチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5
-ジメチル-安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-
エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメトキシ-4-メチル-
安息香酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-エチル-3-
メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(1-tert
-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;
3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N
’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル)-ヒドラジド;2-メトキシ-ニコチン
酸N-(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒド
ラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-(2,2-ジメチル-1-フェニル-プロピル
)-N’-(4-エチル-ベンゾイル)-ヒドラジド;3,5-ジメチル-安息香酸N-
(1-tert-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル
)-ヒドラジド;および3,5-ジメトキシ-4-メチル-安息香酸N-(1-tert
-ブチル-ペンチル)-N’-(3-メトキシ-2-メチル-ベンゾイル)-ヒドラジド
のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。
場合によって、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子スイッチの、用量調節性制御の
ために使用されるリガンドは、エクジソン、20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロン
A、ムリステロンAなどのecdyステロイド、9-cis-レチノイン酸、レチノイン
酸の合成類似体、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,0
13,836号明細書;同第5,117,057号明細書;同第5,530,028号明
細書;および同第5,378,726号明細書、ならびに米国出願公開第2005/02
09283号明細書および同第2006/0020146号明細書において開示されてい
るN,N’-ジアシルヒドラジンなどのN,N’-ジアシルヒドラジン;米国出願公開第
2004/0171651号明細書において記載されているオキサゾリン;欧州出願第4
61,809号明細書において開示されているジベンゾイルアルキルシアノヒドラジンな
どのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン;米国特許第5,225,443号明細書に
おいて開示されているN-アルキル-N,N’-ジアロイルヒドラジンなどのN-アルキ
ル-N,N’-ジアロイルヒドラジン;欧州出願第234,994号明細書において開示
されているN-アシル-N-アルキルカルボニルヒドラジンなどのN-アシル-N-アル
キルカルボニルヒドラジン;米国特許第4,985,461号明細書において記載されて
いるN-アロイル-N-アルキル-N’-アロイルヒドラジンなどのN-アロイル-N-
アルキル-N’-アロイルヒドラジン;米国出願公開第2004/0049037号明細
書において記載されているアルニドケトンなどのアルニドケトン;3,5-ジ-tert
-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-アセチルハルパジ
ド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコ
レステロール、25-エポキシコレステロール、T0901317、5-アルファ-6-
アルファ-エポキシコレステロール-3-スルフェート(sulfate)(ECHS)、7-
ケトコレステロール-3-スルフェート(sulfate)、フラメゾール、胆汁酸、1,1-
ビホスホネート(biphosphonate)エステル、若年性ホルモンIIIなどを含む、他の類
似の材料のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。本開示において有用
なジアシルヒドラジンリガンドの例は、RG-115819(3,5-ジメチル-安息香
酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メチル-3-メトキ
シ-ベンゾイル)-ヒドラジド)、RG-115932((R)-3,5-ジメチル-安
息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベ
ンゾイル)-ヒドラジド)、およびRG-115830(3,5-ジメチル-安息香酸N
-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル
)-ヒドラジド)を含む。例えば、それらのいずれもが参照によりそれらの全体において
本明細書に組み込まれる、米国特許出願第12/155,111号明細書およびPCT出
願/米国出願第2008/006757号明細書を参照されたい。
ために使用されるリガンドは、エクジソン、20-ヒドロキシエクジソン、ポナステロン
A、ムリステロンAなどのecdyステロイド、9-cis-レチノイン酸、レチノイン
酸の合成類似体、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,0
13,836号明細書;同第5,117,057号明細書;同第5,530,028号明
細書;および同第5,378,726号明細書、ならびに米国出願公開第2005/02
09283号明細書および同第2006/0020146号明細書において開示されてい
るN,N’-ジアシルヒドラジンなどのN,N’-ジアシルヒドラジン;米国出願公開第
2004/0171651号明細書において記載されているオキサゾリン;欧州出願第4
61,809号明細書において開示されているジベンゾイルアルキルシアノヒドラジンな
どのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン;米国特許第5,225,443号明細書に
おいて開示されているN-アルキル-N,N’-ジアロイルヒドラジンなどのN-アルキ
ル-N,N’-ジアロイルヒドラジン;欧州出願第234,994号明細書において開示
されているN-アシル-N-アルキルカルボニルヒドラジンなどのN-アシル-N-アル
キルカルボニルヒドラジン;米国特許第4,985,461号明細書において記載されて
いるN-アロイル-N-アルキル-N’-アロイルヒドラジンなどのN-アロイル-N-
アルキル-N’-アロイルヒドラジン;米国出願公開第2004/0049037号明細
書において記載されているアルニドケトンなどのアルニドケトン;3,5-ジ-tert
-ブチル-4-ヒドロキシ-N-イソブチル-ベンズアミド、8-O-アセチルハルパジ
ド、オキシステロール、22(R)ヒドロキシコレステロール、24(S)ヒドロキシコ
レステロール、25-エポキシコレステロール、T0901317、5-アルファ-6-
アルファ-エポキシコレステロール-3-スルフェート(sulfate)(ECHS)、7-
ケトコレステロール-3-スルフェート(sulfate)、フラメゾール、胆汁酸、1,1-
ビホスホネート(biphosphonate)エステル、若年性ホルモンIIIなどを含む、他の類
似の材料のうちのいずれかから選択しうるがこれらに限定されない。本開示において有用
なジアシルヒドラジンリガンドの例は、RG-115819(3,5-ジメチル-安息香
酸N-(1-エチル-2,2-ジメチル-プロピル)-N’-(2-メチル-3-メトキ
シ-ベンゾイル)-ヒドラジド)、RG-115932((R)-3,5-ジメチル-安
息香酸N-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベ
ンゾイル)-ヒドラジド)、およびRG-115830(3,5-ジメチル-安息香酸N
-(1-tert-ブチル-ブチル)-N’-(2-エチル-3-メトキシ-ベンゾイル
)-ヒドラジド)を含む。例えば、それらのいずれもが参照によりそれらの全体において
本明細書に組み込まれる、米国特許出願第12/155,111号明細書およびPCT出
願/米国出願第2008/006757号明細書を参照されたい。
サイトカイン
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるHBVワクチン抗原は、他のサイトカ
インと共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達ベク
ターの一部として、または別個のベクターを介して)。本明細書では、遺伝子スイッチポ
リペプチドおよびサイトカイン、またはこれらの変異体もしくは誘導体をコードするポリ
ヌクレオチド、ならびにこれらを組み込む方法および系が提示される。サイトカインとは
、細胞のシグナル伝達に関与する、約5~20kDaの間の、小型タンパク質の類別であ
る。一部の場合には、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキ
ン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子を含む。一部の実施形態では、ケモカインは
、細胞の遊走を導く、化学誘引物質としての役割を果たし、4つのサブファミリー:CX
C、CC、CX3C、およびXCへと分類される。例示的なケモカインは、CCサブファ
ミリー:CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANT
ES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(またはCCL10)、CCL11、
CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL1
8、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CC
L25、CCL26、CCL27、およびCCL28;CXCサブファミリー:CXCL
1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CX
CL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CX
CL14、CXCL15、CXCL16、およびCXCL17;XCサブファミリー:X
CL1およびXCL2;ならびにCX3CサブファミリーであるCX3CL1に由来する
ケモカインを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるHBVワクチン抗原は、他のサイトカ
インと共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達ベク
ターの一部として、または別個のベクターを介して)。本明細書では、遺伝子スイッチポ
リペプチドおよびサイトカイン、またはこれらの変異体もしくは誘導体をコードするポリ
ヌクレオチド、ならびにこれらを組み込む方法および系が提示される。サイトカインとは
、細胞のシグナル伝達に関与する、約5~20kDaの間の、小型タンパク質の類別であ
る。一部の場合には、サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキ
ン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子を含む。一部の実施形態では、ケモカインは
、細胞の遊走を導く、化学誘引物質としての役割を果たし、4つのサブファミリー:CX
C、CC、CX3C、およびXCへと分類される。例示的なケモカインは、CCサブファ
ミリー:CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANT
ES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(またはCCL10)、CCL11、
CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL1
8、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CC
L25、CCL26、CCL27、およびCCL28;CXCサブファミリー:CXCL
1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CX
CL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CX
CL14、CXCL15、CXCL16、およびCXCL17;XCサブファミリー:X
CL1およびXCL2;ならびにCX3CサブファミリーであるCX3CL1に由来する
ケモカインを含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるHBVワクチン抗原は、他のインター
フェロンと共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達
ベクターの一部として、または別個のベクターを介して)。インターフェロン(IFN)
は、I型インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ
、およびIFN-ω)、II型インターフェロン(例えば、IFN-γ)、およびIII
型インターフェロンを含む。一部の実施形態では、IFN-αは、IFNA1、IFNA
2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、I
FNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、およびIFNA21を含む、
約13の亜型へとさらに分類される。
フェロンと共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達
ベクターの一部として、または別個のベクターを介して)。インターフェロン(IFN)
は、I型インターフェロン(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ
、およびIFN-ω)、II型インターフェロン(例えば、IFN-γ)、およびIII
型インターフェロンを含む。一部の実施形態では、IFN-αは、IFNA1、IFNA
2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、I
FNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、およびIFNA21を含む、
約13の亜型へとさらに分類される。
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるHBVワクチン抗原は、他のインター
ロイキンと共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達
ベクターの一部として、または別個のベクターを介して)。インターロイキンは、白血球
(leukocyte)または白血球(white blood cell)により発現され、Tリンパ球およびB
リンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。例示的なインターロイキンは、
IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(
CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-1
4、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL
-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、
IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-3
5、およびIL-36を含む。一部の実施形態では、インターロイキンは、IL-2、I
L-12、IL-15、IL-21、またはIL-15とIL-15Rαとの融合体であ
る。
ロイキンと共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達
ベクターの一部として、または別個のベクターを介して)。インターロイキンは、白血球
(leukocyte)または白血球(white blood cell)により発現され、Tリンパ球およびB
リンパ球ならびに造血細胞の発生および分化を促進する。例示的なインターロイキンは、
IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(
CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-1
4、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL
-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、
IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-3
5、およびIL-36を含む。一部の実施形態では、インターロイキンは、IL-2、I
L-12、IL-15、IL-21、またはIL-15とIL-15Rαとの融合体であ
る。
一部の態様では、インターロイキンは、IL-12を含みうる。一部の実施形態では、
IL-12は、単鎖IL-12(scIL-12)、プロテアーゼ感受性IL-12、不
安定化IL-12、膜結合型IL-12、または挿入IL-12である。一部の実施形態
では、IL-12は、マウスIL-12サブユニットベータ(p40)(配列番号206
)である。場合によって、IL-12変異体は、それらの全てが、参照によりそれらの全
体において組み込まれる、国際公開第2015/095249号パンフレット、国際公開
第2016/048903号パンフレット、国際公開第2017/062953号パンフ
レットにおいて記載されている通りである。
IL-12は、単鎖IL-12(scIL-12)、プロテアーゼ感受性IL-12、不
安定化IL-12、膜結合型IL-12、または挿入IL-12である。一部の実施形態
では、IL-12は、マウスIL-12サブユニットベータ(p40)(配列番号206
)である。場合によって、IL-12変異体は、それらの全てが、参照によりそれらの全
体において組み込まれる、国際公開第2015/095249号パンフレット、国際公開
第2016/048903号パンフレット、国際公開第2017/062953号パンフ
レットにおいて記載されている通りである。
一部の実施形態では、インターロイキンは、mbIL-15を含む。一部の実施形態で
は、mbIL-15は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させ
うる、膜結合型キメラIL-15である。一部の実施形態では、mbIL-15は、全長
IL-15Rα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させ
た、全長IL-15(例えば、天然IL-15ポリペプチド)、またはこれらの断片もし
くは変異体を含む。場合によって、IL-15を、IL-15Rαへと、リンカーを介し
て、間接的に連結する。場合によって、IL-15は、IL-15Rαへと、リンカーを
介して、間接的に連結される。場合によって、mbIL-15は、Hurton et al., 2016
において記載されている通りである。
は、mbIL-15は、本明細書で記載される改変エフェクター細胞を用いて共発現させ
うる、膜結合型キメラIL-15である。一部の実施形態では、mbIL-15は、全長
IL-15Rα、またはこれらの機能的な断片もしくは変異体とインフレームで融合させ
た、全長IL-15(例えば、天然IL-15ポリペプチド)、またはこれらの断片もし
くは変異体を含む。場合によって、IL-15を、IL-15Rαへと、リンカーを介し
て、間接的に連結する。場合によって、IL-15は、IL-15Rαへと、リンカーを
介して、間接的に連結される。場合によって、mbIL-15は、Hurton et al., 2016
において記載されている通りである。
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるHBVワクチン抗原は、他の腫瘍壊死
因子と共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達ベク
ターの一部として、または別個のベクターを介して)。腫瘍壊死因子(TNF)とは、ア
ポトーシスをモジュレートするサイトカインの群である。一部の場合には、TNFファミ
リー内には、TNFα、リンホトキシンアルファ(LT-アルファ)、リンホトキシンベ
ータ(LT-ベータ)、T細胞抗原であるgp39(CD40L)、CD27L、CD3
0L、FASL、4-1BBL、OX40L、およびTNF放出型アポトーシス誘導リガ
ンド(TRAIL)を含むがこれらに限定されない、約19のメンバーが存在する。
因子と共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達ベク
ターの一部として、または別個のベクターを介して)。腫瘍壊死因子(TNF)とは、ア
ポトーシスをモジュレートするサイトカインの群である。一部の場合には、TNFファミ
リー内には、TNFα、リンホトキシンアルファ(LT-アルファ)、リンホトキシンベ
ータ(LT-ベータ)、T細胞抗原であるgp39(CD40L)、CD27L、CD3
0L、FASL、4-1BBL、OX40L、およびTNF放出型アポトーシス誘導リガ
ンド(TRAIL)を含むがこれらに限定されない、約19のメンバーが存在する。
ある特定の実施形態では、本明細書で提示されるHBVワクチン抗原は、他のコロニー
刺激因子と共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達
ベクターの一部として、または別個のベクターを介して)。コロニー刺激因子(CSF)
とは、造血幹細胞の表面上の受容体タンパク質と相互作用する、分泌糖タンパク質であっ
て、その後、細胞の増殖および特異的種類の血液細胞への分化をモジュレートする分泌糖
タンパク質である。一部の場合には、CSFは、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-C
SF)、またはプロメガポエチンを含む。
刺激因子と共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達
ベクターの一部として、または別個のベクターを介して)。コロニー刺激因子(CSF)
とは、造血幹細胞の表面上の受容体タンパク質と相互作用する、分泌糖タンパク質であっ
て、その後、細胞の増殖および特異的種類の血液細胞への分化をモジュレートする分泌糖
タンパク質である。一部の場合には、CSFは、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-C
SF)、またはプロメガポエチンを含む。
一部の実施形態では、サイトカインは、本明細書で記載されるキメラ抗原受容体と共に
共発現する膜結合型サイトカインである。一部の実施形態では、1または複数の、本明細
書で記載される方法は、サイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、サイトカイ
ンは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫
瘍壊死因子を含む。一部の場合には、1または複数の本明細書で記載される方法は、ケモ
カイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子
から選択されるサイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、1または複数の、本
明細書で記載される方法は、IL2、IL7、IL12、IL-15、IL-15とIL
-15Rαとの融合体、IL-21、IFNγ、またはTNF-αから選択されるサイト
カインの投与をさらに含む。
共発現する膜結合型サイトカインである。一部の実施形態では、1または複数の、本明細
書で記載される方法は、サイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、サイトカイ
ンは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫
瘍壊死因子を含む。一部の場合には、1または複数の本明細書で記載される方法は、ケモ
カイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子、または腫瘍壊死因子
から選択されるサイトカインの投与をさらに含む。一部の場合には、1または複数の、本
明細書で記載される方法は、IL2、IL7、IL12、IL-15、IL-15とIL
-15Rαとの融合体、IL-21、IFNγ、またはTNF-αから選択されるサイト
カインの投与をさらに含む。
インターロイキン12
特定の実施形態では、本明細書で提示されるHBVワクチン抗原は、インターロイキン
12と共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達ベク
ターの一部として、または別個のベクターを介して)。インターロイキン12(IL-1
2)とは、抗原の刺激に応答して、樹状細胞、マクロファージ、好中球、およびヒトBリ
ンパ芽球様細胞(NC-37)により、天然で産生されるインターロイキンである。IL
-12は、4つのアルファヘリックスによるバンドルから構成される。IL-12は、2
つの別個の遺伝子である、IL-12A(p35)およびIL-12B(p40)により
コードされる、ヘテロ二量体のサイトカインである。活性のヘテロ二量体(p70と称す
る)およびp40のホモ二量体は、タンパク質の合成後に形成される。IL-12は、免
疫系の、最強の調節因子である。IL-12は、NK細胞およびT細胞を活性化させるこ
とにより、免疫応答を促進する(図18)。
特定の実施形態では、本明細書で提示されるHBVワクチン抗原は、インターロイキン
12と共に、共送達され、かつ/または共発現しうる(例えば、同じHBV抗原送達ベク
ターの一部として、または別個のベクターを介して)。インターロイキン12(IL-1
2)とは、抗原の刺激に応答して、樹状細胞、マクロファージ、好中球、およびヒトBリ
ンパ芽球様細胞(NC-37)により、天然で産生されるインターロイキンである。IL
-12は、4つのアルファヘリックスによるバンドルから構成される。IL-12は、2
つの別個の遺伝子である、IL-12A(p35)およびIL-12B(p40)により
コードされる、ヘテロ二量体のサイトカインである。活性のヘテロ二量体(p70と称す
る)およびp40のホモ二量体は、タンパク質の合成後に形成される。IL-12は、免
疫系の、最強の調節因子である。IL-12は、NK細胞およびT細胞を活性化させるこ
とにより、免疫応答を促進する(図18)。
本明細書では、HBV組換えワクチンの組成物、キット、およびこれを含むシステム、
ならびにこれを作る方法が提示される。本開示は、多重欠失ゴリラアデノベクター(GC
46)(配列番号61~63)内に構築された、HBV抗原デザイン(HBVデザイン1
~5)を提示する。本明細書ではまた、遺伝子スイッチポリペプチドおよびIL-12、
またはこれらの変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれを組
み込む方法およびシステム(図8)も提示される。
ならびにこれを作る方法が提示される。本開示は、多重欠失ゴリラアデノベクター(GC
46)(配列番号61~63)内に構築された、HBV抗原デザイン(HBVデザイン1
~5)を提示する。本明細書ではまた、遺伝子スイッチポリペプチドおよびIL-12、
またはこれらの変異体もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれを組
み込む方法およびシステム(図8)も提示される。
リンカー
また、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現および機能性
を促進するリンカーを含む構築物も開示される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド
リンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いることができる。ポリヌク
レオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターと適合性で
ある末端構造を創出するように付加されうる、所望の制限部位を含有する、DNAの二本
鎖セグメントでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載
されるポリヌクレオチドを含むベクターを修飾するために有用でありうる。例えば、ポリ
ヌクレオチドリンカーを含む、ベクターの修飾は、複数のクローニング部位の変化、また
はポリヒスチジンテールの付加でありうる。ポリヌクレオチドリンカーはまた、平滑末端
インサートDNAの末端を、制限酵素により切断され、粘着末端を伴うベクターへのクロ
ーニングに適応させるのに使用することもできる。ポリヌクレオチドリンカーの使用は、
ベクターへの平滑末端ライゲーションより効率的な場合があり、後段の適用において、イ
ンサートを、ベクターから放出する方法をもたらしうる。場合によって、インサートは、
治療適用に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列でありうる。場合によ
って、リンカーは、切断可能リンカーでありうる。
また、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現および機能性
を促進するリンカーを含む構築物も開示される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド
リンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いることができる。ポリヌク
レオチドリンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターと適合性で
ある末端構造を創出するように付加されうる、所望の制限部位を含有する、DNAの二本
鎖セグメントでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、本明細書で記載
されるポリヌクレオチドを含むベクターを修飾するために有用でありうる。例えば、ポリ
ヌクレオチドリンカーを含む、ベクターの修飾は、複数のクローニング部位の変化、また
はポリヒスチジンテールの付加でありうる。ポリヌクレオチドリンカーはまた、平滑末端
インサートDNAの末端を、制限酵素により切断され、粘着末端を伴うベクターへのクロ
ーニングに適応させるのに使用することもできる。ポリヌクレオチドリンカーの使用は、
ベクターへの平滑末端ライゲーションより効率的な場合があり、後段の適用において、イ
ンサートを、ベクターから放出する方法をもたらしうる。場合によって、インサートは、
治療適用に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列でありうる。場合によ
って、リンカーは、切断可能リンカーでありうる。
ポリヌクレオチドリンカーは、オリゴマーでありうる。ポリヌクレオチドリンカーは、
DNA二本鎖、DNA一本鎖、またはこれらの組合せでありうる。場合によって、リンカ
ーは、RNAでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、T4リガーゼに
より、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターへとライゲーションするこ
とができる。ライゲーションを容易とするために、過剰量のポリヌクレオチドリンカーを
、インサートおよびベクターを含む組成物へと添加することができる。場合によって、リ
ンカーを導入する前に、インサートおよびベクターを前処理する。例えば、メチラーゼに
よる前処理により、インサートDNAの望ましくない切断を防止することができる。
DNA二本鎖、DNA一本鎖、またはこれらの組合せでありうる。場合によって、リンカ
ーは、RNAでありうる。場合によって、ポリヌクレオチドリンカーは、T4リガーゼに
より、本明細書で記載されるポリヌクレオチドを含むベクターへとライゲーションするこ
とができる。ライゲーションを容易とするために、過剰量のポリヌクレオチドリンカーを
、インサートおよびベクターを含む組成物へと添加することができる。場合によって、リ
ンカーを導入する前に、インサートおよびベクターを前処理する。例えば、メチラーゼに
よる前処理により、インサートDNAの望ましくない切断を防止することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる
、2つまたはこれを超えるポリペプチドは、介在リンカーポリペプチドをコードする介在
配列により隔てることができる。本明細書では、ポリヌクレオチドによりコードされる、
2つまたはこれを超えるポリペプチドを隔てるアミノ酸配列を指す、「介在リンカーポリ
ペプチド」という用語は、膜貫通ドメインを、細胞表面ポリペプチド(例えば、天然ポリ
ペプチドのトランケート型変異体を含む)へと接続するように、本明細書で開示されるポ
リペプチド構築物内に、任意選択で組み入れられる、アミノ酸の配列を指す、「ペプチド
リンカー」という用語と区別される。ある特定の場合には、介在リンカーは、易切断性介
在リンカーポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーま
たはリボソームスキッピングリンカーである。一部の実施形態では、切断可能リンカーま
たはリボソームスキッピングリンカー配列は、2A、GSG-2A、GSGリンカー、S
GSGリンカー、フューリンリンク、ならびにこれらの変異体および誘導体からなる群か
ら選択される。一部の実施形態では、2Aリンカーは、p2Aリンカー、T2Aリンカー
、F2Aリンカー、またはE2Aリンカーである。一部の実施形態では、目的のポリペプ
チドは、易切断性介在リンカーポリペプチドにより連結された、融合タンパク質として発
現する。ある特定の実施形態では、易切断性介在リンカーポリペプチドは、F/T2A、
T2A、p2A、2A、GSG-p2A、GSGリンカー、およびフューリンリンク変異
体のうちの、任意の1または複数でありうる。2017年5月18日に公表された、PC
T/米国出願第2016/061668号明細書(国際公開第2017083750号パ
ンフレット)において開示されるリンカー(ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配
列)は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、リンカーポリペ
プチドは、下記の表に開示されたリンカーポリペプチドを含む。
、2つまたはこれを超えるポリペプチドは、介在リンカーポリペプチドをコードする介在
配列により隔てることができる。本明細書では、ポリヌクレオチドによりコードされる、
2つまたはこれを超えるポリペプチドを隔てるアミノ酸配列を指す、「介在リンカーポリ
ペプチド」という用語は、膜貫通ドメインを、細胞表面ポリペプチド(例えば、天然ポリ
ペプチドのトランケート型変異体を含む)へと接続するように、本明細書で開示されるポ
リペプチド構築物内に、任意選択で組み入れられる、アミノ酸の配列を指す、「ペプチド
リンカー」という用語と区別される。ある特定の場合には、介在リンカーは、易切断性介
在リンカーポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーま
たはリボソームスキッピングリンカーである。一部の実施形態では、切断可能リンカーま
たはリボソームスキッピングリンカー配列は、2A、GSG-2A、GSGリンカー、S
GSGリンカー、フューリンリンク、ならびにこれらの変異体および誘導体からなる群か
ら選択される。一部の実施形態では、2Aリンカーは、p2Aリンカー、T2Aリンカー
、F2Aリンカー、またはE2Aリンカーである。一部の実施形態では、目的のポリペプ
チドは、易切断性介在リンカーポリペプチドにより連結された、融合タンパク質として発
現する。ある特定の実施形態では、易切断性介在リンカーポリペプチドは、F/T2A、
T2A、p2A、2A、GSG-p2A、GSGリンカー、およびフューリンリンク変異
体のうちの、任意の1または複数でありうる。2017年5月18日に公表された、PC
T/米国出願第2016/061668号明細書(国際公開第2017083750号パ
ンフレット)において開示されるリンカー(ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配
列)は、参照により本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、リンカーポリペ
プチドは、下記の表に開示されたリンカーポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、介在リンカーポリペプチドは、ホイットローリンカー(配列番号
64)、GSGリンカー(配列番号66)、SGSGリンカー(配列番号67)、(G4
S)3リンカー(配列番号68)、フューリン切断部位/フューリンク(Furlink)1(
配列番号69)、Fmdvリンカー(配列番号70)、トセア・アシグナ(Thosea asign
a)ウイルス2A領域(T2A)(配列番号71)、フューリン-GSG-T2A(配列
番号72)、フューリン-SGSG-T2A(配列番号73)、ブタテッショウウイルス
1 2A領域(P2A)(配列番号74)、GSG-P2A(配列番号75)、A型ウマ
鼻炎ウイルス2A領域(E2A)(配列番号76)、または口蹄疫ウイルス2A領域(F
2A)(配列番号78)のアミノ酸配列との、少なくとも70%、75%、80%、85
%、90%、95%、99%、99.5%、または100%の同一性を有するアミノ酸配
列を含む(表2)。場合によって、介在リンカーポリペプチドは、リンカー(配列番号6
5、79~80)のアミノ酸配列との、少なくとも70%、75%、80%、85%、9
0%、95%、99%、99.5%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含
む。場合によって、ウイルス2A配列を使用することができる。2Aエレメントは、5~
100塩基対を有するIRESより短くなりうる。場合によって、2A配列は、5、10
、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、
80、85、90、または100ヌクレオチドの長さを有しうる。2Aを連結された遺伝
子は、単一のオープンリーディングフレーム内で発現させることができ、「自己切断」は
、2AポリペプチドC末端の、最後の2つのアミノ酸であるG-P間で、共翻訳的に生じ
ることが可能であり、等量の共発現タンパク質をもたらす。
64)、GSGリンカー(配列番号66)、SGSGリンカー(配列番号67)、(G4
S)3リンカー(配列番号68)、フューリン切断部位/フューリンク(Furlink)1(
配列番号69)、Fmdvリンカー(配列番号70)、トセア・アシグナ(Thosea asign
a)ウイルス2A領域(T2A)(配列番号71)、フューリン-GSG-T2A(配列
番号72)、フューリン-SGSG-T2A(配列番号73)、ブタテッショウウイルス
1 2A領域(P2A)(配列番号74)、GSG-P2A(配列番号75)、A型ウマ
鼻炎ウイルス2A領域(E2A)(配列番号76)、または口蹄疫ウイルス2A領域(F
2A)(配列番号78)のアミノ酸配列との、少なくとも70%、75%、80%、85
%、90%、95%、99%、99.5%、または100%の同一性を有するアミノ酸配
列を含む(表2)。場合によって、介在リンカーポリペプチドは、リンカー(配列番号6
5、79~80)のアミノ酸配列との、少なくとも70%、75%、80%、85%、9
0%、95%、99%、99.5%、または100%の同一性を有するアミノ酸配列を含
む。場合によって、ウイルス2A配列を使用することができる。2Aエレメントは、5~
100塩基対を有するIRESより短くなりうる。場合によって、2A配列は、5、10
、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、
80、85、90、または100ヌクレオチドの長さを有しうる。2Aを連結された遺伝
子は、単一のオープンリーディングフレーム内で発現させることができ、「自己切断」は
、2AポリペプチドC末端の、最後の2つのアミノ酸であるG-P間で、共翻訳的に生じ
ることが可能であり、等量の共発現タンパク質をもたらす。
ウイルス2A配列は、約20アミノ酸でありうる。場合によって、ウイルス2A配列は
、コンセンサスモチーフである、Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro
-Gly-Proを含有しうる。コンセンサスモチーフ配列は、共翻訳的に作用しうる。
例えば、グリシン残基とプロリン残基との、正常なペプチド結合の形成を防止することが
でき、これは、リボソームスキッピングおよび新生ポリペプチドの切断を結果としてもた
らしうる。この効果は、等モルレベルで、複数の遺伝子をもたらしうる。
、コンセンサスモチーフである、Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro
-Gly-Proを含有しうる。コンセンサスモチーフ配列は、共翻訳的に作用しうる。
例えば、グリシン残基とプロリン残基との、正常なペプチド結合の形成を防止することが
でき、これは、リボソームスキッピングおよび新生ポリペプチドの切断を結果としてもた
らしうる。この効果は、等モルレベルで、複数の遺伝子をもたらしうる。
2Aペプチドは、単一のオープンリーディングフレーム内の、複数のタンパク質の、そ
の後、リボソームスキッピング機構を介して、個別のポリペプチドへと切断されうる、ポ
リペプチドへの翻訳を可能としうる(Funston et al., J. Gen. Virol. 89(Pt 2):389-96
(2008))。一部の実施形態では、2A配列は、F/T2A、T2A、p2A、2A、T
2A、E2A、F2A、およびBmCPV2A、BmIFV2A、ならびにこれらの任意
の組合せを含みうる。
の後、リボソームスキッピング機構を介して、個別のポリペプチドへと切断されうる、ポ
リペプチドへの翻訳を可能としうる(Funston et al., J. Gen. Virol. 89(Pt 2):389-96
(2008))。一部の実施形態では、2A配列は、F/T2A、T2A、p2A、2A、T
2A、E2A、F2A、およびBmCPV2A、BmIFV2A、ならびにこれらの任意
の組合せを含みうる。
場合によって、ベクターは、IRES配列および2Aリンカー配列を含みうる。他の場
合には、2Aペプチドと連結された、複数の遺伝子の発現は、2Aペプチドに前置された
スペーサー配列(GSG)により容易とすることができる。場合によって、構築物は、ス
ペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはこれらの組合せを組み合わせう
る。例えば、リンカーは、異なる2Aペプチドと共に、スペーサー(SGSGリンカーま
たはGSGリンカーまたはホイットローリンカー)およびフューリンリンカー(R-A-
K-R)切断部位を有しうる。スペーサーは、I-Ceuiでありうる。場合によって、
リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含
むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも2つのリンカー配列は、
同じタンパク質をもたらしうる。他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用す
ることができる。例えば、目的の遺伝子は、少なくとも2つのリンカーにより隔てること
ができる。
合には、2Aペプチドと連結された、複数の遺伝子の発現は、2Aペプチドに前置された
スペーサー配列(GSG)により容易とすることができる。場合によって、構築物は、ス
ペーサー、リンカー、アダプター、プロモーター、またはこれらの組合せを組み合わせう
る。例えば、リンカーは、異なる2Aペプチドと共に、スペーサー(SGSGリンカーま
たはGSGリンカーまたはホイットローリンカー)およびフューリンリンカー(R-A-
K-R)切断部位を有しうる。スペーサーは、I-Ceuiでありうる。場合によって、
リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含
むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも2つのリンカー配列は、
同じタンパク質をもたらしうる。他の場合には、複数のリンカーを、ベクター内で使用す
ることができる。例えば、目的の遺伝子は、少なくとも2つのリンカーにより隔てること
ができる。
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによりコードされる
、2つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列
により隔てることができる。ある特定の場合には、リンカーは、易切断性リンカーである
。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドによ
り連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性リン
カーポリペプチドは、下記で記載されるフューリンリンク、fmdv、p2a、GSG-
p2a、および/またはfp2aのうちの、任意の1つまたは2つでありうる。場合によ
って、リンカーは、APVKQGSG(配列番号96)である。
、2つまたはこれを超えるポリペプチドは、リンカーポリペプチドをコードする介在配列
により隔てることができる。ある特定の場合には、リンカーは、易切断性リンカーである
。一部の実施形態では、目的のポリペプチドは、易切断性介在リンカーポリペプチドによ
り連結された、融合タンパク質として発現する。ある特定の実施形態では、易切断性リン
カーポリペプチドは、下記で記載されるフューリンリンク、fmdv、p2a、GSG-
p2a、および/またはfp2aのうちの、任意の1つまたは2つでありうる。場合によ
って、リンカーは、APVKQGSG(配列番号96)である。
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、アミノ酸配列「RAKR」(配列番号
86)を含みうる。ある特定の場合には、フューリンリンカーポリペプチドは、「CGT
GCAAAGCGT」(配列番号69)または「AGAGCTAAGAGG」(配列番号
130)を含むポリヌクレオチド配列によりコードされうる。
86)を含みうる。ある特定の場合には、フューリンリンカーポリペプチドは、「CGT
GCAAAGCGT」(配列番号69)または「AGAGCTAAGAGG」(配列番号
130)を含むポリヌクレオチド配列によりコードされうる。
一部の実施形態では、リンカーは、本明細書で記載されるポリヌクレオチド内で用いる
ことができる。リンカーは、可動性(flexible)リンカー、剛直性(rigid)リンカー、
in vivo切断可能リンカー、またはこれらの任意の組合せでありうる。場合によっ
て、リンカーは、機能的ドメインを、併せて連結する(可動性リンカーおよび剛直性リン
カーの場合のように)場合もあり、in vivo切断可能リンカーの場合のように、機
能的ドメインを、in vivoにおいて放出する場合もある。
ことができる。リンカーは、可動性(flexible)リンカー、剛直性(rigid)リンカー、
in vivo切断可能リンカー、またはこれらの任意の組合せでありうる。場合によっ
て、リンカーは、機能的ドメインを、併せて連結する(可動性リンカーおよび剛直性リン
カーの場合のように)場合もあり、in vivo切断可能リンカーの場合のように、機
能的ドメインを、in vivoにおいて放出する場合もある。
リンカーは、生物学的活性を改善し、発現収率を増大させ、所望の薬物動態プロファイ
ルを達成しうる。リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエ
ーテル(thioesther)も含みうる。
ルを達成しうる。リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエ
ーテル(thioesther)も含みうる。
場合によって、本明細書で記載されるリンカー配列は、可動性リンカーを含みうる。可
動性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場
合に適用することができる。可動性リンカーは、小型、非極性(例えば、Gly)、また
は極性(例えば、SerまたはThr)のアミノ酸から構成されうる。可動性リンカーは
、Gly残基およびSer残基の連なりから主になる配列(「GS」リンカー)を有しう
る。可動性リンカーの例は、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)nの配列(配
列番号150)を有しうる。コピー数である「n」を調整することにより、この例示的G
Sリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成することもでき、必
要なドメイン間相互作用を維持することもできる。GSリンカーのほかに、他の可動性リ
ンカーも、組換え融合タンパク質に用いることができる。場合によって、可動性リンカー
はまた、GlyおよびSerなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが
、可動性を維持するように、ThrおよびAlaなど、さらなるアミノ酸を含有する場合
もある。他の場合には、LysおよびGluなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改
善することができる。
動性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場
合に適用することができる。可動性リンカーは、小型、非極性(例えば、Gly)、また
は極性(例えば、SerまたはThr)のアミノ酸から構成されうる。可動性リンカーは
、Gly残基およびSer残基の連なりから主になる配列(「GS」リンカー)を有しう
る。可動性リンカーの例は、(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)nの配列(配
列番号150)を有しうる。コピー数である「n」を調整することにより、この例示的G
Sリンカーの長さを最適化して、機能的ドメインの適切な分離を達成することもでき、必
要なドメイン間相互作用を維持することもできる。GSリンカーのほかに、他の可動性リ
ンカーも、組換え融合タンパク質に用いることができる。場合によって、可動性リンカー
はまた、GlyおよびSerなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが
、可動性を維持するように、ThrおよびAlaなど、さらなるアミノ酸を含有する場合
もある。他の場合には、LysおよびGluなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改
善することができる。
本明細書で記載されるリンカー配列内に組み入れられる可動性リンカーは、良好な可動
性および可溶性をもたらすように、GlyおよびSerなど、小型アミノ酸または極性ア
ミノ酸に富む場合がある。可動性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が、融合タ
ンパク質ドメインに所望される場合に適切でありうる。加えて、可動性リンカーは、非可
動性構造を有さない場合もあるが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカー
として用いられる場合もある。可動性リンカーの長さを調整して、適正なフォールディン
グを可能とすることもでき、融合タンパク質の最適な生物学的活性を可能とすることもで
きる。
性および可溶性をもたらすように、GlyおよびSerなど、小型アミノ酸または極性ア
ミノ酸に富む場合がある。可動性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が、融合タ
ンパク質ドメインに所望される場合に適切でありうる。加えて、可動性リンカーは、非可
動性構造を有さない場合もあるが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカー
として用いられる場合もある。可動性リンカーの長さを調整して、適正なフォールディン
グを可能とすることもでき、融合タンパク質の最適な生物学的活性を可能とすることもで
きる。
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、剛直性リンカーをさらに含みうる。
剛直性リンカーを用いて、ポリペプチドのドメイン間で、一定の距離を維持することがで
きる。剛直性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー、Pr
oに富む配列、(XP)n、X-Pro骨格、A(EAAAK)nA(n=2~5)であ
りうる。剛直性リンカーは、場合によって、αヘリックス構造を取ることにより、または
複数のPro残基を含有することにより、比較的剛直な構造を呈しうる。
剛直性リンカーを用いて、ポリペプチドのドメイン間で、一定の距離を維持することがで
きる。剛直性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー、Pr
oに富む配列、(XP)n、X-Pro骨格、A(EAAAK)nA(n=2~5)であ
りうる。剛直性リンカーは、場合によって、αヘリックス構造を取ることにより、または
複数のPro残基を含有することにより、比較的剛直な構造を呈しうる。
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、切断可能でありうる。他の場合に、
リンカーは、切断可能でない。切断可能でないリンカーは、in vivo過程またはe
x vivo過程を通して、1つの分子として作用するように、機能的ドメインを、共有
結合的に、一体に接合しうる。リンカーはまた、in vivoにおいても切断可能であ
りうる。切断可能リンカーは、in vivoにおいて、遊離の機能的ドメインを放出さ
せるように導入することができる。切断可能リンカーは、少数を挙げれば、還元試薬、プ
ロテアーゼの存在により切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を用い
て、切断可能リンカーを作製することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチ
オンなど、チオールとのジスルフィド交換を介する切断イベントが、切断をもたらしうる
であろう。他の場合には、in vivoにおける、組換え融合タンパク質内のリンカー
の切断はまた、in vivoの、病理学的状態(例えば、がんまたは炎症)下、特異的
な細胞内または組織内で発現する場合もあり、ある特定の細胞区画内に拘束される場合も
ある、プロテアーゼによっても実行されうる。場合によって、切断可能リンカーは、切断
のターゲティングを可能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束区画内
のリンカーの緩徐な切断をもたらしうる。切断可能リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチ
ド、ジスルフィド、またはチオエーテルも含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安
定性を付与しうる。他の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸
性区画は、最大で7のpHを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオ
エーテルは、非還元性でありうる。チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のためにデザ
インすることができる。
リンカーは、切断可能でない。切断可能でないリンカーは、in vivo過程またはe
x vivo過程を通して、1つの分子として作用するように、機能的ドメインを、共有
結合的に、一体に接合しうる。リンカーはまた、in vivoにおいても切断可能であ
りうる。切断可能リンカーは、in vivoにおいて、遊離の機能的ドメインを放出さ
せるように導入することができる。切断可能リンカーは、少数を挙げれば、還元試薬、プ
ロテアーゼの存在により切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を用い
て、切断可能リンカーを作製することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチ
オンなど、チオールとのジスルフィド交換を介する切断イベントが、切断をもたらしうる
であろう。他の場合には、in vivoにおける、組換え融合タンパク質内のリンカー
の切断はまた、in vivoの、病理学的状態(例えば、がんまたは炎症)下、特異的
な細胞内または組織内で発現する場合もあり、ある特定の細胞区画内に拘束される場合も
ある、プロテアーゼによっても実行されうる。場合によって、切断可能リンカーは、切断
のターゲティングを可能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束区画内
のリンカーの緩徐な切断をもたらしうる。切断可能リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチ
ド、ジスルフィド、またはチオエーテルも含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安
定性を付与しうる。他の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸
性区画は、最大で7のpHを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオ
エーテルは、非還元性でありうる。チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のためにデザ
インすることができる。
ある特定の実施形態では、fmdvリンカーポリペプチドは、配列番号87と、少なく
とも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、9
0%、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含む。あ
る特定の実施形態では、fmdvリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合
タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数
である。ある特定の場合には、fmdvリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオ
ープンリーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。場合によって
、fmdvをコードするORFは、配列番号70)の配列を含むか、またはこれからなる
。ある特定の実施形態では、fmdvをコードするポリヌクレオチドは、配列番号70と
、少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85
%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一である。
とも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、9
0%、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含む。あ
る特定の実施形態では、fmdvリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合
タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数
である。ある特定の場合には、fmdvリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオ
ープンリーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。場合によって
、fmdvをコードするORFは、配列番号70)の配列を含むか、またはこれからなる
。ある特定の実施形態では、fmdvをコードするポリヌクレオチドは、配列番号70と
、少なくとも45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85
%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一である。
ある特定の場合には、リンカーポリペプチドは、「p2a」リンカーでありうる。ある
特定の実施形態では、p2aポリペプチドは、配列番号91と、少なくとも約45%、5
0%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、9
7%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みうる。ある特定の実施
形態では、p2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合タンパク質を連
結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数でありうる。場
合によって、p2aリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディング
フレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、p2a
をコードするORFは、配列番号74の配列を含むか、またはこれからなる。ある特定の
場合には、p2aをコードするポリヌクレオチドは、配列番号74の場合もあり、これと
、少なくとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、8
5%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一な場合もある。
特定の実施形態では、p2aポリペプチドは、配列番号91と、少なくとも約45%、5
0%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、9
7%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みうる。ある特定の実施
形態では、p2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合タンパク質を連
結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数でありうる。場
合によって、p2aリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープンリーディング
フレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態では、p2a
をコードするORFは、配列番号74の配列を含むか、またはこれからなる。ある特定の
場合には、p2aをコードするポリヌクレオチドは、配列番号74の場合もあり、これと
、少なくとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、8
5%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一な場合もある。
場合によって、リンカーポリペプチドは、「GSG-p2a」リンカーでありうる。あ
る特定の実施形態では、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、配列番号92と、少な
くとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、
90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みう
る。ある特定の実施形態では、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれ
を超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの
1または複数でありうる。場合によって、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、ポリ
ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされう
る。GSG p2aをコードするORFは、配列番号75の配列を含みうる。場合によっ
て、GSG-p2aをコードするポリヌクレオチドは、配列番号75の場合もあり、これ
と、少なくとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一な場合もある。
る特定の実施形態では、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、配列番号92と、少な
くとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、
90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みう
る。ある特定の実施形態では、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれ
を超える融合タンパク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの
1または複数でありうる。場合によって、GSG-p2aリンカーポリペプチドは、ポリ
ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされう
る。GSG p2aをコードするORFは、配列番号75の配列を含みうる。場合によっ
て、GSG-p2aをコードするポリヌクレオチドは、配列番号75の場合もあり、これ
と、少なくとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一な場合もある。
リンカーポリペプチドは、本明細書で提示される「fp2a」リンカーでありうる。あ
る特定の実施形態では、fp2aリンカーポリペプチドは、配列番号95と、少なくとも
約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%
、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みうる。あ
る特定の場合には、fp2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合タン
パク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数であ
りうる。場合によって、fp2aリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープン
リーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態
では、fp2aリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号78の場合もあり、
これと、少なくとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80
%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一な場合もあ
る。
る特定の実施形態では、fp2aリンカーポリペプチドは、配列番号95と、少なくとも
約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%
、95%、97%、98%、99%、または100%同一でありうる配列を含みうる。あ
る特定の場合には、fp2aリンカーポリペプチドは、2つまたはこれを超える融合タン
パク質を連結する、単一のベクター内でコードされるリンカーのうちの1または複数であ
りうる。場合によって、fp2aリンカーポリペプチドは、ポリヌクレオチドのオープン
リーディングフレーム(ORF)の核酸配列によりコードされうる。ある特定の実施形態
では、fp2aリンカーをコードするポリヌクレオチドは、配列番号78の場合もあり、
これと、少なくとも約45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80
%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一な場合もあ
る。
場合によって、リンカーは、操作することができる。例えば、リンカーは、疎水性など
の化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも2つの
リンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。配列は、配列番号82、96、または
97のポリペプチド配列と、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%
、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%
同一でありうるか、またはほぼこれらの比率で同一でありうる。他の場合には、複数のリ
ンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、本明細書で記載される、目的の
遺伝子と、1または複数の遺伝子スイッチポリペプチド配列とは、少なくとも2つのリン
カーにより隔てることができる。場合によって、遺伝子は、2つ、3つ、4つ、5つ、6
つ、7つ、8つ、9つ、または最大で10のリンカーにより隔てることができる。
の化学的特徴を含むようにデザインすることができる。場合によって、少なくとも2つの
リンカー配列は、同じタンパク質をもたらしうる。配列は、配列番号82、96、または
97のポリペプチド配列と、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%
、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%
同一でありうるか、またはほぼこれらの比率で同一でありうる。他の場合には、複数のリ
ンカーを、ベクター内で使用することができる。例えば、本明細書で記載される、目的の
遺伝子と、1または複数の遺伝子スイッチポリペプチド配列とは、少なくとも2つのリン
カーにより隔てることができる。場合によって、遺伝子は、2つ、3つ、4つ、5つ、6
つ、7つ、8つ、9つ、または最大で10のリンカーにより隔てることができる。
リンカーは、操作リンカーでありうる。リンカーをデザインする方法は、コンピュータ
計算による方法でありうる。場合によって、コンピュータ計算による方法は、グラフ法を
含みうる。コンピュータ計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド
構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Brook
haven Protein Data Bank(PDB)を使用して、リンカーの選
択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。
計算による方法でありうる。場合によって、コンピュータ計算による方法は、グラフ法を
含みうる。コンピュータ計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド
構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Brook
haven Protein Data Bank(PDB)を使用して、リンカーの選
択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。
一部の実施形態では、フューリンポリペプチドおよび2Aポリペプチドを含むポリペプ
チド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供されるが、この場合、フューリンポリペ
プチドおよび2Aポリペプチドは、少なくとも3つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチド
リンカーにより接続されている。場合によって、少なくとも3つの疎水性アミノ酸は、グ
リシン(Gly)(G)、アラニン(Ala)(A)、バリン(Val)(V)、ロイシ
ン(Leu)(L)、イソロイシン(Ile)(I)、プロリン(Pro)(P)、フェ
ニルアラニン(Phe)(F)、メチオニン(Met)(M)、トリプトファン(Trp
)(W)からなるリストから選択される。場合によって、ポリペプチドリンカーはまた、
1または複数のGSリンカー配列、例えば、(GS)n、(SG)n、(GSG)n、お
よび(SGSG)n[配列中、nは、0~15の任意の数でありうる]も含みうる。
チド構築物をコードするポリヌクレオチドが提供されるが、この場合、フューリンポリペ
プチドおよび2Aポリペプチドは、少なくとも3つの疎水性アミノ酸を含むポリペプチド
リンカーにより接続されている。場合によって、少なくとも3つの疎水性アミノ酸は、グ
リシン(Gly)(G)、アラニン(Ala)(A)、バリン(Val)(V)、ロイシ
ン(Leu)(L)、イソロイシン(Ile)(I)、プロリン(Pro)(P)、フェ
ニルアラニン(Phe)(F)、メチオニン(Met)(M)、トリプトファン(Trp
)(W)からなるリストから選択される。場合によって、ポリペプチドリンカーはまた、
1または複数のGSリンカー配列、例えば、(GS)n、(SG)n、(GSG)n、お
よび(SGSG)n[配列中、nは、0~15の任意の数でありうる]も含みうる。
ポリペプチド構築物の発現の改善を得る方法であって、第1の機能的ポリペプチドおよ
び第2の機能的ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチ
ドを用意するステップであって、前記第1の機能的ポリペプチドと、第2の機能的ポリペ
プチドとが、配列APVKQとの、少なくとも60%の同一性を伴う配列を含むリンカー
ポリペプチドにより接続されている、ステップと;宿主細胞内で、前記ポリヌクレオチド
を発現させるステップであって、ポリペプチド構築物の発現の、配列APVKQとの、少
なくとも60%の同一性を伴う配列を含むリンカーポリペプチドを有さない、対応するポ
リペプチド構築物と比較した改善を結果としてもたらすステップとを含む方法が提供され
る。
び第2の機能的ポリペプチドを含む前記ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチ
ドを用意するステップであって、前記第1の機能的ポリペプチドと、第2の機能的ポリペ
プチドとが、配列APVKQとの、少なくとも60%の同一性を伴う配列を含むリンカー
ポリペプチドにより接続されている、ステップと;宿主細胞内で、前記ポリヌクレオチド
を発現させるステップであって、ポリペプチド構築物の発現の、配列APVKQとの、少
なくとも60%の同一性を伴う配列を含むリンカーポリペプチドを有さない、対応するポ
リペプチド構築物と比較した改善を結果としてもたらすステップとを含む方法が提供され
る。
IRESエレメント
本明細書ではまた、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現
および機能性を容易とする、IRESエレメントを含む構築物も開示される。本明細書で
使用される「内部リボソーム進入部位(IRES)」という用語は、内部リボソーム進入
部位を意味することが意図されうる。IRES配列を含むベクター内では、第1の遺伝子
が、その独自の5’-UTRを伴う機構である、キャップ依存性のリボソーム走査により
翻訳されうるのに対し、後続の遺伝子の翻訳は、リボソームの、IRESへの直接的な動
員により、キャップ非依存的に達せられうる。IRES配列は、真核リボソームが結合し
、5’キャップ末端に結合せずに、翻訳を開始することを可能としうる。IRES配列は
、1つの転写物からの、複数の遺伝子の発現を可能としうる(Mountford and Smith 1995
)。
本明細書ではまた、本明細書で記載されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現
および機能性を容易とする、IRESエレメントを含む構築物も開示される。本明細書で
使用される「内部リボソーム進入部位(IRES)」という用語は、内部リボソーム進入
部位を意味することが意図されうる。IRES配列を含むベクター内では、第1の遺伝子
が、その独自の5’-UTRを伴う機構である、キャップ依存性のリボソーム走査により
翻訳されうるのに対し、後続の遺伝子の翻訳は、リボソームの、IRESへの直接的な動
員により、キャップ非依存的に達せられうる。IRES配列は、真核リボソームが結合し
、5’キャップ末端に結合せずに、翻訳を開始することを可能としうる。IRES配列は
、1つの転写物からの、複数の遺伝子の発現を可能としうる(Mountford and Smith 1995
)。
本明細書で使用される「キャップ(CAP)」または「キャップ(cap)」という用
語は、一般に、真核生物mRNAの5’末端へと、3’-5’連結された、7-メチルグ
アノシン(7meG-ppp-G)である修飾ヌクレオチドであって、このmRNAから
のタンパク質の発現時に、正常な翻訳開始経路内で必要とされるエレメントとして用いら
れる修飾ヌクレオチドを指す。
語は、一般に、真核生物mRNAの5’末端へと、3’-5’連結された、7-メチルグ
アノシン(7meG-ppp-G)である修飾ヌクレオチドであって、このmRNAから
のタンパク質の発現時に、正常な翻訳開始経路内で必要とされるエレメントとして用いら
れる修飾ヌクレオチドを指す。
ある特定の場合には、IRES領域は、ピコルナウイルス、脳心筋炎ウイルス、C型肝
炎ウイルスのIRES配列など、ウイルスに由来しうる。他の場合には、IRES領域は
、脳心筋炎ウイルスに由来しうる。本明細書で使用される「EMCV」または「脳心筋炎
ウイルス」という用語は、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)の属の、脳心筋炎ウイ
ルス種の、任意のメンバーである単離株または株を指す。例は、EMCV-R(リュッカ
ート)株ウイルス、コロンビアSKウイルスである。場合によって、真核開始因子4G、
免疫グロブリン重鎖結合性タンパク質、c-mycがん原遺伝子、血管内皮増殖因子、線
維芽細胞増殖因子1のIRES、またはこれらの任意の組合せまたは修飾など、細胞性I
RESエレメントを使用することができる。場合によって、細胞性IRESは、ウイルス
IRESと比較した場合の、遺伝子発現の増大を有しうる。
炎ウイルスのIRES配列など、ウイルスに由来しうる。他の場合には、IRES領域は
、脳心筋炎ウイルスに由来しうる。本明細書で使用される「EMCV」または「脳心筋炎
ウイルス」という用語は、ピコルナウイルス科(Picornaviridae)の属の、脳心筋炎ウイ
ルス種の、任意のメンバーである単離株または株を指す。例は、EMCV-R(リュッカ
ート)株ウイルス、コロンビアSKウイルスである。場合によって、真核開始因子4G、
免疫グロブリン重鎖結合性タンパク質、c-mycがん原遺伝子、血管内皮増殖因子、線
維芽細胞増殖因子1のIRES、またはこれらの任意の組合せまたは修飾など、細胞性I
RESエレメントを使用することができる。場合によって、細胞性IRESは、ウイルス
IRESと比較した場合の、遺伝子発現の増大を有しうる。
ウイルスのIRES配列、細胞性IRES配列、またはこれらの組合せを、ベクター内
で用いることができる。IRESは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)またはポリオウイル
ス(PV)に由来しうる。場合によって、IRESエレメントは、ポリオウイルス(PV
)、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ブタテッショウウイ
ルス1(PTV-1)、愛知ウイルス(AiV)、セネカバレーウイルス(SVV)、C
型肝炎ウイルス(HCV)、豚コレラウイルス(CSFV)、ヒト免疫不全ウイルス2(
HIV-2)、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)、モロニーマウス白血病ウイルス
(MoMLV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、マウス乳がんウイルス(MMTV)
、潜伏期ヒトサイトメガロウイルス(pUL138)、エプスタイン-バーウイルス(E
BNA-1)、ヘルペスウイルスマレック病(MDVRLORF9)、SV40ポリシス
トロニック19S(SV4019S)、ムギクビレアブラムシ(Rhopalosiphum padi)ウ
イルス(RhPV)、クリケット麻痺ウイルス(CrPV)、ウスジロエダシャク(Ectr
opis obliqua)ピコルナ様ウイルス(EoPV)、チャバネアオカメムシ(Plautia stal
i)腸ウイルス(PSIV)、サシガメ属(Triatoma)ウイルス(TrV)、ミツバチ麻
痺病シシストウイルス(IAPV、KBV)、ブラックカラン復帰ウイルス(BRV)、
テンジクアオイ属(Pelargonium)斑入りウイルス(PFBV)、ハイビスカス退緑斑ウ
イルス(HCRSV)、アブラナ科感染トバモウイルス(CrTMV)、ジャガイモ葉巻
ウイルス(PLRV)、タバコエッチウイルス(TEV)、ジアルジアウイルス(GLV
)、リーシュマニア属(Leishmania)RNAウイルス1(LRV-1)、およびこれらの
組合せまたは修飾からなる群から選択される。場合によって、IRESは、Apaf-1
、XIAP、HIAP2/c-IAP1、DAP5、Bcl-2、c-myc、CAT-
1、INR、分化LEF-1、PDGF2、HIF-1a、VEGF、FGF2、BiP
、BAG-1、CIRP、p53、SHMT1、PITSLREp58、CDK1、Rp
r、hid、hsp70、grim、skl、Antennapedia、dFoxO、
dInR、Adh-Adhr、HSP101、ADH、URE-2,GPR1、NCE1
02、YMR181a、MSN1、BOI1、FLO8、GIC1、およびこれらの任意
の組合せまたは修飾からなる群から選択される。IRESエレメントを、2つのオープン
リーディングフレーム(ORF)の間に組み入れる場合、翻訳の開始は、第1のORF内
の、カノニカルの5’-m7GpppNキャップ依存性機構、およびIRESエレメント
の下流における、第2のORF内の、キャップ非依存性の機構により生じうる。
で用いることができる。IRESは、脳心筋炎ウイルス(EMCV)またはポリオウイル
ス(PV)に由来しうる。場合によって、IRESエレメントは、ポリオウイルス(PV
)、脳心筋炎ウイルス(EMCV)、口蹄疫ウイルス(FMDV)、ブタテッショウウイ
ルス1(PTV-1)、愛知ウイルス(AiV)、セネカバレーウイルス(SVV)、C
型肝炎ウイルス(HCV)、豚コレラウイルス(CSFV)、ヒト免疫不全ウイルス2(
HIV-2)、ヒト免疫不全ウイルス1(HIV-1)、モロニーマウス白血病ウイルス
(MoMLV)、ネコ免疫不全ウイルス(FIV)、マウス乳がんウイルス(MMTV)
、潜伏期ヒトサイトメガロウイルス(pUL138)、エプスタイン-バーウイルス(E
BNA-1)、ヘルペスウイルスマレック病(MDVRLORF9)、SV40ポリシス
トロニック19S(SV4019S)、ムギクビレアブラムシ(Rhopalosiphum padi)ウ
イルス(RhPV)、クリケット麻痺ウイルス(CrPV)、ウスジロエダシャク(Ectr
opis obliqua)ピコルナ様ウイルス(EoPV)、チャバネアオカメムシ(Plautia stal
i)腸ウイルス(PSIV)、サシガメ属(Triatoma)ウイルス(TrV)、ミツバチ麻
痺病シシストウイルス(IAPV、KBV)、ブラックカラン復帰ウイルス(BRV)、
テンジクアオイ属(Pelargonium)斑入りウイルス(PFBV)、ハイビスカス退緑斑ウ
イルス(HCRSV)、アブラナ科感染トバモウイルス(CrTMV)、ジャガイモ葉巻
ウイルス(PLRV)、タバコエッチウイルス(TEV)、ジアルジアウイルス(GLV
)、リーシュマニア属(Leishmania)RNAウイルス1(LRV-1)、およびこれらの
組合せまたは修飾からなる群から選択される。場合によって、IRESは、Apaf-1
、XIAP、HIAP2/c-IAP1、DAP5、Bcl-2、c-myc、CAT-
1、INR、分化LEF-1、PDGF2、HIF-1a、VEGF、FGF2、BiP
、BAG-1、CIRP、p53、SHMT1、PITSLREp58、CDK1、Rp
r、hid、hsp70、grim、skl、Antennapedia、dFoxO、
dInR、Adh-Adhr、HSP101、ADH、URE-2,GPR1、NCE1
02、YMR181a、MSN1、BOI1、FLO8、GIC1、およびこれらの任意
の組合せまたは修飾からなる群から選択される。IRESエレメントを、2つのオープン
リーディングフレーム(ORF)の間に組み入れる場合、翻訳の開始は、第1のORF内
の、カノニカルの5’-m7GpppNキャップ依存性機構、およびIRESエレメント
の下流における、第2のORF内の、キャップ非依存性の機構により生じうる。
場合によって、遺伝子を、内部リボソーム進入部位(IRES)により連結することが
できる。IRESは、複数の遺伝子の、同時的な発現を可能としうる。例えば、IRES
配列は、単一のmRNA転写物からの、複数のタンパク質の産生を許容しうる。リボソー
ムは、IRESに、5’キャップ非依存的に結合し、翻訳を開始することが可能である。
できる。IRESは、複数の遺伝子の、同時的な発現を可能としうる。例えば、IRES
配列は、単一のmRNA転写物からの、複数のタンパク質の産生を許容しうる。リボソー
ムは、IRESに、5’キャップ非依存的に結合し、翻訳を開始することが可能である。
場合によって、IRES配列は、500塩基対でありうるか、またはほぼこの長さであ
りうる。IRES配列は、300塩基対~1000塩基対でありうる。例えば、IRES
は、300、350、400、450、500、550、600、650、700、75
0、800、850、900、950、または1000塩基対の長さでありうる。
りうる。IRES配列は、300塩基対~1000塩基対でありうる。例えば、IRES
は、300、350、400、450、500、550、600、650、700、75
0、800、850、900、950、または1000塩基対の長さでありうる。
場合によって、IRES配列を含む、ベクター内の下流遺伝子の発現を、低減すること
ができる。例えば、IRES配列に後続する遺伝子は、IRES配列に先行する遺伝子に
対して、発現が低減されうる。発現の低減は、先行する遺伝子に対する、1%~99%の
低減でありうる。
ができる。例えば、IRES配列に後続する遺伝子は、IRES配列に先行する遺伝子に
対して、発現が低減されうる。発現の低減は、先行する遺伝子に対する、1%~99%の
低減でありうる。
発現を調節する方法
一実施形態では、操作細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法が提供される。異種遺
伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド、抗原結合性ポリペプチド、および異種遺伝子が提供される。場合によって、
ポリヌクレオチドは、図1~16のうちのいずれか1つにおいて描示されている、1また
は複数の遺伝子発現カセット内にある。別の場合には、ポリヌクレオチドは、ウイルスベ
クターまたは非ウイルスベクターを介して、操作細胞へと組み込まれる。ウイルスベクタ
ーは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノウイルスベクタ
ーを含みうる。非ウイルスベクターは、Sleeping Beautyトランスポゾン
を含みうる。他の場合には、ポリヌクレオチドは、リコンビナーゼまたは遺伝子編集法を
介して、操作細胞へと組み込まれる。リコンビナーゼの例は、本明細書で記載されるセリ
ンリコンビナーゼである。遺伝子編集法の例は、CRISPR系またはArgnonau
te系を含みうる。本明細書における「CRISPR遺伝子編集系」または「CRISP
R系」とは、DNA配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、
任意のRNA誘導型のCasタンパク質媒介性過程を指す。本明細書における「Argo
naute遺伝子編集系」とは、DNA配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲテ
ィングするための、任意の一本鎖DNA誘導型のArgonauteエンドヌクレアーゼ
媒介性過程を指す。
一実施形態では、操作細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法が提供される。異種遺
伝子発現のリガンド誘導性制御のための遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド、抗原結合性ポリペプチド、および異種遺伝子が提供される。場合によって、
ポリヌクレオチドは、図1~16のうちのいずれか1つにおいて描示されている、1また
は複数の遺伝子発現カセット内にある。別の場合には、ポリヌクレオチドは、ウイルスベ
クターまたは非ウイルスベクターを介して、操作細胞へと組み込まれる。ウイルスベクタ
ーは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはアデノウイルスベクタ
ーを含みうる。非ウイルスベクターは、Sleeping Beautyトランスポゾン
を含みうる。他の場合には、ポリヌクレオチドは、リコンビナーゼまたは遺伝子編集法を
介して、操作細胞へと組み込まれる。リコンビナーゼの例は、本明細書で記載されるセリ
ンリコンビナーゼである。遺伝子編集法の例は、CRISPR系またはArgnonau
te系を含みうる。本明細書における「CRISPR遺伝子編集系」または「CRISP
R系」とは、DNA配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲティングするための、
任意のRNA誘導型のCasタンパク質媒介性過程を指す。本明細書における「Argo
naute遺伝子編集系」とは、DNA配列の変化を、ゲノムの特異的領域へとターゲテ
ィングするための、任意の一本鎖DNA誘導型のArgonauteエンドヌクレアーゼ
媒介性過程を指す。
医薬組成物および投与量
本開示は、本明細書で記載される、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターと、
このための担体(例えば、薬学的に許容される担体)とを含む組成物を提示する。組成物
は、担体、好ましくは、生理学的に(例えば、薬学的に)許容可能な担体と、アデノウイ
ルスまたはアデノウイルスベクターとを含む、生理学的に許容される(例えば、薬学的に
許容される)組成物であることが所望される。本開示の文脈内では、任意の適切な担体の
使用が可能であり、当技術分野では、このような担体が周知である。担体の選出しは、部
分的に、組成物の特定の使用(例えば、動物への投与)、および組成物を投与するのに使
用される、特定の方法により決定されるであろう。理想的には、複製欠損型アデノウイル
スベクターの文脈では、医薬組成物は、好ましくは、複製コンピテント型のアデノウイル
スを含まない。医薬組成物は、任意選択で、滅菌でありうる。
本開示は、本明細書で記載される、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターと、
このための担体(例えば、薬学的に許容される担体)とを含む組成物を提示する。組成物
は、担体、好ましくは、生理学的に(例えば、薬学的に)許容可能な担体と、アデノウイ
ルスまたはアデノウイルスベクターとを含む、生理学的に許容される(例えば、薬学的に
許容される)組成物であることが所望される。本開示の文脈内では、任意の適切な担体の
使用が可能であり、当技術分野では、このような担体が周知である。担体の選出しは、部
分的に、組成物の特定の使用(例えば、動物への投与)、および組成物を投与するのに使
用される、特定の方法により決定されるであろう。理想的には、複製欠損型アデノウイル
スベクターの文脈では、医薬組成物は、好ましくは、複製コンピテント型のアデノウイル
スを含まない。医薬組成物は、任意選択で、滅菌でありうる。
適切な組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤を含有しうる、水性および非水性の
、等張性滅菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み
うる、水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。組成物は、アンプルおよびバイアルなど、
単位用量または複数回投与用量の密封容器により提示しうるが、使用の直前における、滅
菌液体担体、例えば、水の添加だけを必要とする、凍結乾燥(freeze-dried(lyophilize
d))状態で保管することもできる。即席溶液および即席懸濁液は、滅菌粉末、滅菌顆粒
、および滅菌錠剤から調製することができる。好ましくは、担体は、緩衝生理食塩液であ
る。より好ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルス
またはアデノウイルスベクターを、投与の前の損傷から保護するように製剤化された、組
成物の部分である。例えば、組成物は、ガラス容器、シリンジ、または注射針など、アデ
ノウイルスまたはアデノウイルスベクターを、調製、保管、または投与するのに使用され
るデバイス上における、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの喪失を低減する
ように製剤化することができる。組成物は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクタ
ーの、光感受性および/または温度感受性を低下させるように製剤化することができる。
この目的で、組成物は、好ましくは、例えば、上記で記載した液体担体など、薬学的に許
容される液体担体、ならびにポリソルベート80、L-アルギニン、ポリ(ビニルピロリ
ドン)、トレハロース、およびこれらの組合せからなる群から選択される安定化剤を含む
。このような組成物の使用は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの保管寿命
を延長し、その投与を容易とするであろう。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクタ
ーを含有する組成物については、例えば、米国特許第6,225,289号明細書、米国
特許第6,514,943号明細書、および国際特許出願公開第2000/034444
号パンフレットにおいて、さらに記載されている。
、等張性滅菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含み
うる、水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。組成物は、アンプルおよびバイアルなど、
単位用量または複数回投与用量の密封容器により提示しうるが、使用の直前における、滅
菌液体担体、例えば、水の添加だけを必要とする、凍結乾燥(freeze-dried(lyophilize
d))状態で保管することもできる。即席溶液および即席懸濁液は、滅菌粉末、滅菌顆粒
、および滅菌錠剤から調製することができる。好ましくは、担体は、緩衝生理食塩液であ
る。より好ましくは、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターは、アデノウイルス
またはアデノウイルスベクターを、投与の前の損傷から保護するように製剤化された、組
成物の部分である。例えば、組成物は、ガラス容器、シリンジ、または注射針など、アデ
ノウイルスまたはアデノウイルスベクターを、調製、保管、または投与するのに使用され
るデバイス上における、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの喪失を低減する
ように製剤化することができる。組成物は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクタ
ーの、光感受性および/または温度感受性を低下させるように製剤化することができる。
この目的で、組成物は、好ましくは、例えば、上記で記載した液体担体など、薬学的に許
容される液体担体、ならびにポリソルベート80、L-アルギニン、ポリ(ビニルピロリ
ドン)、トレハロース、およびこれらの組合せからなる群から選択される安定化剤を含む
。このような組成物の使用は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターの保管寿命
を延長し、その投与を容易とするであろう。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクタ
ーを含有する組成物については、例えば、米国特許第6,225,289号明細書、米国
特許第6,514,943号明細書、および国際特許出願公開第2000/034444
号パンフレットにおいて、さらに記載されている。
組成物はまた、形質導入効率を増強するようにも製剤化することができる。加えて、当
業者は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、他の治療剤または生物学的活
性薬剤と共に、組成物中に存在しうることも理解するであろう。例えば、アデノウイルス
またはアデノウイルスベクターの、in vivoにおける投与と関連する、腫脹および
炎症を低減するように、イブプロフェンまたはステロイドなど、炎症を制御する因子も、
組成物の一部でありうる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを使用して、抗
原をコードする核酸配列を、宿主へと送達する場合、免疫系刺激因子またはアジュバント
、例えば、インターロイキン、リポ多糖、または二本鎖RNAを投与して、抗原に対する
、任意の免疫応答を増強または修飾することができる。既存の感染を処置し、かつ/また
は遺伝子導入手順と関連する感染など、将来の感染の危険性を低減するように、抗生剤、
すなわち、殺微生物剤および殺真菌剤も存在しうる。
業者は、アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターが、他の治療剤または生物学的活
性薬剤と共に、組成物中に存在しうることも理解するであろう。例えば、アデノウイルス
またはアデノウイルスベクターの、in vivoにおける投与と関連する、腫脹および
炎症を低減するように、イブプロフェンまたはステロイドなど、炎症を制御する因子も、
組成物の一部でありうる。アデノウイルスまたはアデノウイルスベクターを使用して、抗
原をコードする核酸配列を、宿主へと送達する場合、免疫系刺激因子またはアジュバント
、例えば、インターロイキン、リポ多糖、または二本鎖RNAを投与して、抗原に対する
、任意の免疫応答を増強または修飾することができる。既存の感染を処置し、かつ/また
は遺伝子導入手順と関連する感染など、将来の感染の危険性を低減するように、抗生剤、
すなわち、殺微生物剤および殺真菌剤も存在しうる。
本明細書の一部の実施形態では、対象における投与のための、本明細書で開示される、
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物が開示される。場合によって、本明細
書で開示される、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードし、任意選択で、サイト
カインおよび/またはさらなる治療剤を含有する、改変エフェクター細胞組成物が開示さ
れる。場合によって、本明細書にはまた、エフェクター細胞を改変するための、キメラ抗
原受容体の発現を調節するための、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするベクターも
含まれる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む組成物が開示される。場合によって、本明細
書で開示される、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードし、任意選択で、サイト
カインおよび/またはさらなる治療剤を含有する、改変エフェクター細胞組成物が開示さ
れる。場合によって、本明細書にはまた、エフェクター細胞を改変するための、キメラ抗
原受容体の発現を調節するための、遺伝子スイッチポリペプチドをコードするベクターも
含まれる。
一部の場合には、改変エフェクター細胞または遺伝子スイッチポリペプチドおよびキメ
ラ抗原受容体をコードするベクターによる医薬組成物を、活性化合物の、薬学的に使用さ
れうる調製物への加工を容易とする、賦形剤および補助剤を含む、1または複数の生理学
的に許容される担体を使用する、常套的な形で製剤化する。適正な製剤は、選択される投
与経路に依存する。本明細書で記載される医薬組成物の概要については、例えば、Reming
ton: The Science and Practice ofPharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publi
shing Company, 1995); Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mac
k Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds
., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmac
eutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams
& Wilkins 1999)において見出される。
ラ抗原受容体をコードするベクターによる医薬組成物を、活性化合物の、薬学的に使用さ
れうる調製物への加工を容易とする、賦形剤および補助剤を含む、1または複数の生理学
的に許容される担体を使用する、常套的な形で製剤化する。適正な製剤は、選択される投
与経路に依存する。本明細書で記載される医薬組成物の概要については、例えば、Reming
ton: The Science and Practice ofPharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publi
shing Company, 1995); Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mac
k Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds
., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmac
eutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams
& Wilkins 1999)において見出される。
医薬組成物は、任意選択で、例だけを目的として述べると、従来の混合工程、溶解工程
、顆粒化工程、糖衣錠化工程、研和工程、乳化工程、カプセル化工程、封入工程、または
圧縮工程など、従来の方式で製造される。
、顆粒化工程、糖衣錠化工程、研和工程、乳化工程、カプセル化工程、封入工程、または
圧縮工程など、従来の方式で製造される。
ある特定の実施形態では、組成物はまた、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、お
よび塩酸などの酸;水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス-ヒドロキシメチルアミノ
メタンなどの塩基を含む、1または複数のpH調整剤または緩衝剤;ならびにクエン酸塩
/デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液も含みう
る。このような酸、塩基、および緩衝剤は、組成物のpHを、許容可能な範囲で維持する
のに必要とされる量で組み入れられる。
よび塩酸などの酸;水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸
ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス-ヒドロキシメチルアミノ
メタンなどの塩基を含む、1または複数のpH調整剤または緩衝剤;ならびにクエン酸塩
/デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液も含みう
る。このような酸、塩基、および緩衝剤は、組成物のpHを、許容可能な範囲で維持する
のに必要とされる量で組み入れられる。
他の実施形態では、組成物はまた、組成物のオスモル濃度を、許容可能な範囲に収める
のに必要とされる量の、1または複数の塩も含みうる。このような塩は、ナトリウムカチ
オン、カリウムカチオン、またはアンモニウムカチオンと、塩化物アニオン、クエン酸ア
ニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、重炭酸アニオン、
硫酸アニオン、チオ硫酸アニオン、または亜硫酸水素アニオンとを有する塩を含み、適切
な塩は、塩化ナトリウム塩、塩化カリウム塩、チオ硫酸ナトリウム塩、亜硫酸水素ナトリ
ウム塩、および硫酸アンモニウム塩を含む。
のに必要とされる量の、1または複数の塩も含みうる。このような塩は、ナトリウムカチ
オン、カリウムカチオン、またはアンモニウムカチオンと、塩化物アニオン、クエン酸ア
ニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、重炭酸アニオン、
硫酸アニオン、チオ硫酸アニオン、または亜硫酸水素アニオンとを有する塩を含み、適切
な塩は、塩化ナトリウム塩、塩化カリウム塩、チオ硫酸ナトリウム塩、亜硫酸水素ナトリ
ウム塩、および硫酸アンモニウム塩を含む。
本明細書で記載される医薬組成物は、経口投与経路、非経口(例えば、静脈内、皮下、
筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内)投与経路、鼻腔内投与経路、口腔
内投与経路、舌下投与経路、または直腸内投与経路を含むがこれらに限定されない、任意
の適切な投与経路により投与される。一部の場合には、医薬組成物を、非経口(例えば、
静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内)投与のために製剤
化する。
筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内)投与経路、鼻腔内投与経路、口腔
内投与経路、舌下投与経路、または直腸内投与経路を含むがこれらに限定されない、任意
の適切な投与経路により投与される。一部の場合には、医薬組成物を、非経口(例えば、
静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内)投与のために製剤
化する。
本明細書で記載される医薬組成物を、処置される個体による経口の服用のための、水性
経口分散液、液体、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液など、固体経口剤形
、エアゾール剤、制御放出製剤、即時融解製剤、発泡製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、粉剤、
丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製
剤、即時放出製剤と制御放出製剤との混合剤を含むがこれらに限定されない、任意の適切
な剤形へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、カプセル剤へと製剤化する
。一部の実施形態では、医薬組成物を、溶液(例えば、静脈内投与のための)へと製剤化
する。場合によって、医薬組成物を、輸注液として製剤化する。場合によって、医薬組成
物を、注射液として製剤化する。
経口分散液、液体、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液など、固体経口剤形
、エアゾール剤、制御放出製剤、即時融解製剤、発泡製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、粉剤、
丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製
剤、即時放出製剤と制御放出製剤との混合剤を含むがこれらに限定されない、任意の適切
な剤形へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、カプセル剤へと製剤化する
。一部の実施形態では、医薬組成物を、溶液(例えば、静脈内投与のための)へと製剤化
する。場合によって、医薬組成物を、輸注液として製剤化する。場合によって、医薬組成
物を、注射液として製剤化する。
本明細書で記載される、固体の医薬剤形は、任意選択で、本明細書で記載される化合物
と、適合性の担体、結合剤、充填剤、懸濁剤、芳香剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活
性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、保湿剤、可塑化剤、安定化剤、浸透増強剤、
湿潤剤、消泡剤、抗酸化剤、保存剤、またはこれらの1もしくは複数の組合せなど、1ま
たは複数の薬学的に許容される添加剤とを含む。
と、適合性の担体、結合剤、充填剤、懸濁剤、芳香剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活
性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、保湿剤、可塑化剤、安定化剤、浸透増強剤、
湿潤剤、消泡剤、抗酸化剤、保存剤、またはこれらの1もしくは複数の組合せなど、1ま
たは複数の薬学的に許容される添加剤とを含む。
さらなる他の態様では、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)
において記載されている手順など、標準的なコーティング手順を使用して、組成物の周囲
に、薄膜コーティングを施す。一部の実施形態では、組成物を、粒子(例えば、カプセル
による投与のための)へと製剤化し、粒子の一部または全部をコーティングする。一部の
実施形態では、組成物を、粒子(例えば、カプセルによる投与のための)へと製剤化し、
粒子の一部または全部をマイクロカプセル化する。一部の実施形態では、組成物を、粒子
(例えば、カプセルによる投与のための)へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイク
ロカプセル化せず、アンコーティングする。
において記載されている手順など、標準的なコーティング手順を使用して、組成物の周囲
に、薄膜コーティングを施す。一部の実施形態では、組成物を、粒子(例えば、カプセル
による投与のための)へと製剤化し、粒子の一部または全部をコーティングする。一部の
実施形態では、組成物を、粒子(例えば、カプセルによる投与のための)へと製剤化し、
粒子の一部または全部をマイクロカプセル化する。一部の実施形態では、組成物を、粒子
(例えば、カプセルによる投与のための)へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイク
ロカプセル化せず、アンコーティングする。
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される組成物はまた、微生物活性を阻害する
、1または複数の保存剤も含みうる。適切な保存剤は、メルフェンおよびチオメルサール
などの水銀含有物質;安定化二酸化塩素;ならびに塩化ベンザルコニウム、臭化セチルト
リメチルアンモニウム、および塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物を
含む。
、1または複数の保存剤も含みうる。適切な保存剤は、メルフェンおよびチオメルサール
などの水銀含有物質;安定化二酸化塩素;ならびに塩化ベンザルコニウム、臭化セチルト
リメチルアンモニウム、および塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物を
含む。
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡
を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発
泡剤は、シリコンエマルジョン(silicon emulsion)またはセスキオレ
イン酸(sesquoleate)ソルビタンを含む。
を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発
泡剤は、シリコンエマルジョン(silicon emulsion)またはセスキオレ
イン酸(sesquoleate)ソルビタンを含む。
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、アスコルビン酸ナ
トリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。あ
る特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
トリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。あ
る特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合
物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は
、(a)約0.5%~約2%w/vのグリセロール、(b)約0.1%~約1%w/vの
メチオニン、(c)約0.1%~約2%w/vのモノチオグリセロール、(d)約1mM
~約10mMのEDTA、(e)約0.01%~約2%w/vのアスコルビン酸、(f)
0.003%~約0.02%w/vのポリソルベート80、(g)0.001%~約0.
05%w/vのポリソルベート20、(h)アルギニン、(i)ヘパリン、(j)硫酸デ
キストラン、(k)シクロデキストリン、(l)ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリ
ノイド、(m)マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または(n)これらの組合
せを含むがこれらに限定されない。
物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は
、(a)約0.5%~約2%w/vのグリセロール、(b)約0.1%~約1%w/vの
メチオニン、(c)約0.1%~約2%w/vのモノチオグリセロール、(d)約1mM
~約10mMのEDTA、(e)約0.01%~約2%w/vのアスコルビン酸、(f)
0.003%~約0.02%w/vのポリソルベート80、(g)0.001%~約0.
05%w/vのポリソルベート20、(h)アルギニン、(i)ヘパリン、(j)硫酸デ
キストラン、(k)シクロデキストリン、(l)ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリ
ノイド、(m)マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または(n)これらの組合
せを含むがこれらに限定されない。
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩;カルボキシ
メチルセルロース、メチルセルロース(例えば、Methocel(登録商標))、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセ
ルロース(例えば、Klucel(登録商標))、エチルセルロース(例えば、Etho
cel(登録商標))、および結晶セルロース(例えば、Avicel(登録商標))な
どのセルロース誘導体;微晶質デキストロース;アミロース;ケイ酸マグネシウムアルミ
ニウム;多糖酸;ベントナイト;ゼラチン;ポリビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマ
ー;クロスポビドン;ポビドン;デンプン;アルファデンプン;トラガント、デキストリ
ン、スクロース(例えば、Dipac(登録商標))、グルコース、デキストロース、糖
蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール(例えば、Xylitab(登録商標)
)、およびラクトースなどの糖;アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハス
クの粘液、ポリビニルピロリドン(例えば、Polyvidone(登録商標)CL、K
ollidon(登録商標)CL、Polyplasdone(登録商標)XL-10)
、カラマツ由来のアラビノガラクタン(arabogalactan)、Veegum(登録商標)、
ポリエチレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含
む。
メチルセルロース、メチルセルロース(例えば、Methocel(登録商標))、ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセ
ルロース(例えば、Klucel(登録商標))、エチルセルロース(例えば、Etho
cel(登録商標))、および結晶セルロース(例えば、Avicel(登録商標))な
どのセルロース誘導体;微晶質デキストロース;アミロース;ケイ酸マグネシウムアルミ
ニウム;多糖酸;ベントナイト;ゼラチン;ポリビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマ
ー;クロスポビドン;ポビドン;デンプン;アルファデンプン;トラガント、デキストリ
ン、スクロース(例えば、Dipac(登録商標))、グルコース、デキストロース、糖
蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール(例えば、Xylitab(登録商標)
)、およびラクトースなどの糖;アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハス
クの粘液、ポリビニルピロリドン(例えば、Polyvidone(登録商標)CL、K
ollidon(登録商標)CL、Polyplasdone(登録商標)XL-10)
、カラマツ由来のアラビノガラクタン(arabogalactan)、Veegum(登録商標)、
ポリエチレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含
む。
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブ
ルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならび
に所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料
は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢
剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン
、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキス
トリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン(PVP)、コレステ
ロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコー
ル酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム
、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラ
ギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに
限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteent
h Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberm
an, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New
York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, S
eventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
ルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならび
に所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料
は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢
剤、保湿剤、希釈剤などを含む。「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン
、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキス
トリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン(PVP)、コレステ
ロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコー
ル酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム
、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラ
ギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに
限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteent
h Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberm
an, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New
York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, S
eventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)を参照されたい。
「分散剤」および/または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法
またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形
態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリッ
クスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤/分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電
解質、Tween(登録商標)60またはTween(登録商標)80、PEG、ポリビ
ニルピロリドン(PVP;市販品では、Plasdone(登録商標)として公知である
)、and例えば、ヒドロキシプロピルセルロース(例えば、HPC、HPC-SL、お
よびHPC-L)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(例えば、HPMC K100
、HPMC K4M、HPMC K15M、およびHPMC K100M)、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム(carboxymethylcellulose sodium)、メチルセルロース、
ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPM
CAS)、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミ
ニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール(PVA)、ビニルピロリドン/
酢酸ビニルコポリマー(S630)、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、4-
(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェノールポリマー(チロキサポールとして
もまた公知である)、ポロキサマー(例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロ
ックコポリマーである、Pluronics F68(登録商標)、Pluronics
F88(登録商標)、およびPluronics F108(登録商標));およびポ
ロキサミン(例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次
的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Poloxamine 90
8(登録商標)(BASF Corporation、Parsippany、N.J.
)としてもまた公知のTetronic 908(登録商標))、ポリビニルピロリドン
K12、ポリビニルピロリドンK17、ポリビニルピロリドンK25、またはポリビニル
ピロリドンK30、ポリビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマー(S-630)、ポリ
エチレングリコール(例えば、ポリエチレングリコールは、約300~約6000、また
は約3350~約4000、または約7000~約5400の分子量を有しうる)、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート80、アルギン
酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キ
サンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポ
リソルベート80、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン
、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアル
コール(PVA)、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロース
またはトリエチルセルロースなどの可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる
。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイル
ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然
ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である
。
またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形
態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリッ
クスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤/分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電
解質、Tween(登録商標)60またはTween(登録商標)80、PEG、ポリビ
ニルピロリドン(PVP;市販品では、Plasdone(登録商標)として公知である
)、and例えば、ヒドロキシプロピルセルロース(例えば、HPC、HPC-SL、お
よびHPC-L)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(例えば、HPMC K100
、HPMC K4M、HPMC K15M、およびHPMC K100M)、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム(carboxymethylcellulose sodium)、メチルセルロース、
ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPM
CAS)、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミ
ニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール(PVA)、ビニルピロリドン/
酢酸ビニルコポリマー(S630)、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、4-
(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェノールポリマー(チロキサポールとして
もまた公知である)、ポロキサマー(例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロ
ックコポリマーである、Pluronics F68(登録商標)、Pluronics
F88(登録商標)、およびPluronics F108(登録商標));およびポ
ロキサミン(例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次
的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Poloxamine 90
8(登録商標)(BASF Corporation、Parsippany、N.J.
)としてもまた公知のTetronic 908(登録商標))、ポリビニルピロリドン
K12、ポリビニルピロリドンK17、ポリビニルピロリドンK25、またはポリビニル
ピロリドンK30、ポリビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマー(S-630)、ポリ
エチレングリコール(例えば、ポリエチレングリコールは、約300~約6000、また
は約3350~約4000、または約7000~約5400の分子量を有しうる)、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート80、アルギン
酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キ
サンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポ
リソルベート80、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン
、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアル
コール(PVA)、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロース
またはトリエチルセルロースなどの可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる
。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイル
ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然
ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である
。
1または複数のエロージョン促進剤の、1または複数の拡散促進剤との組合せもまた、
本組成物中で使用することができる。
本組成物中で使用することができる。
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物
を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるの
にも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩(これはまた、p
Hの制御または維持ももたらしうる)を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限
定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを
増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分
なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトー
ル、ソルビトール、デキストロース、Avicel(登録商標)などの結晶セルロース;
二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物;リン酸三カルシウム、リン酸
カルシウム;無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース;アルファデンプン、Di-Pac(
登録商標)(Amstar)などの圧縮糖;マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの
希釈剤、粉砂糖;一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物;乳酸カル
シウム三水和物、デキストレート(dextrate);加水分解シリアル固形、アミロース;粉
末セルロース、炭酸カルシウム;グリシン、カオリン;マンニトール、塩化ナトリウム;
イノシトール、ベントナイトなどを含む。
を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるの
にも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩(これはまた、p
Hの制御または維持ももたらしうる)を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限
定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを
増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分
なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトー
ル、ソルビトール、デキストロース、Avicel(登録商標)などの結晶セルロース;
二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物;リン酸三カルシウム、リン酸
カルシウム;無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース;アルファデンプン、Di-Pac(
登録商標)(Amstar)などの圧縮糖;マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの
希釈剤、粉砂糖;一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物;乳酸カル
シウム三水和物、デキストレート(dextrate);加水分解シリアル固形、アミロース;粉
末セルロース、炭酸カルシウム;グリシン、カオリン;マンニトール、塩化ナトリウム;
イノシトール、ベントナイトなどを含む。
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カル
シウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース 粉末、デキストロース、デキス
トレート(dextrate)、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシ
リトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレン
グリコールなどの化合物を含む。
シウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース 粉末、デキストロース、デキス
トレート(dextrate)、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシ
リトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレン
グリコールなどの化合物を含む。
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻
害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑
石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油(S
terotex(登録商標))などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、
カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属
塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Stearow
et(登録商標)、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロ
イシン、ポリエチレングリコール(例えば、PEG-4000)、またはCarbowa
x(商標)などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナ
トリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムま
たはラウリル硫酸ナトリウム、Syloid(商標)、Cab-O-Sil(登録商標)
などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活
性剤などを含む。
害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑
石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油(S
terotex(登録商標))などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、
カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属
塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Stearow
et(登録商標)、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロ
イシン、ポリエチレングリコール(例えば、PEG-4000)、またはCarbowa
x(商標)などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナ
トリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムま
たはラウリル硫酸ナトリウム、Syloid(商標)、Cab-O-Sil(登録商標)
などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活
性剤などを含む。
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、また
はマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑
化剤は、例えば、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450
、PEG 3350、およびPEG 800などのポリエチレングリコール、ステアリン
酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを
含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
はマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑
化剤は、例えば、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1450
、PEG 3350、およびPEG 800などのポリエチレングリコール、ステアリン
酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを
含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸
エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート(doccusate)、ビタミンE
TPGS、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、N-ヒドロキシエチルピロリ
ドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルシクロデキストリン、エタノール、n-ブタノール、イソプロピルアルコール、コレス
テロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール200~600、グリコフロール、トランス
クトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート(doccusate)、ビタミンE
TPGS、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、N-ヒドロキシエチルピロリ
ドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピ
ルシクロデキストリン、エタノール、n-ブタノール、イソプロピルアルコール、コレス
テロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール200~600、グリコフロール、トランス
クトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンK12、ポリビ
ニルピロリドンK17、ポリビニルピロリドンK25、またはポリビニルピロリドンK3
0、ビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマー(S630)、ポリエチレングリコール(
例えば、ポリエチレングリコールは、約300~約6000、または約3350~約40
00、または約7000~約5400の分子量を有しうる)、カルボキシメチルセルロー
スナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸
酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセルロース、
アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどの
ガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベ
ート80、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラ
ウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
ニルピロリドンK17、ポリビニルピロリドンK25、またはポリビニルピロリドンK3
0、ビニルピロリドン/酢酸ビニルコポリマー(S630)、ポリエチレングリコール(
例えば、ポリエチレングリコールは、約300~約6000、または約3350~約40
00、または約7000~約5400の分子量を有しうる)、カルボキシメチルセルロー
スナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸
酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート80、ヒドロキシエチルセルロース、
アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどの
ガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナト
リウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピ
ルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベ
ート80、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラ
ウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート(docusate)、T
ween 60またはTween 80、トリアセチン、ビタミンE TPGS、モノオ
レイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート(
polysorbate)、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化
エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Pluronic(登録商標)(B
ASF)などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン
脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン(60)水素化ヒマシ油;な
らびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、
オクトキシノール10、オクトキシノール40を含む。一部の実施形態では、界面活性剤
は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
ween 60またはTween 80、トリアセチン、ビタミンE TPGS、モノオ
レイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート(
polysorbate)、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化
エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Pluronic(登録商標)(B
ASF)などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン
脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン(60)水素化ヒマシ油;な
らびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、
オクトキシノール10、オクトキシノール40を含む。一部の実施形態では、界面活性剤
は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステ
アリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル
セルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、
およびこれらの組合せを含む。
ルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステ
アリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチル
セルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、
およびこれらの組合せを含む。
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸
、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオ
キシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムド
クセート(docusate)、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムド
クセート(doccusate)、トリアセチン、Tween 80、ビタミンE TPGS、ア
ンモニウム塩などの化合物を含む。
、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオ
キシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムド
クセート(docusate)、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムド
クセート(doccusate)、トリアセチン、Tween 80、ビタミンE TPGS、ア
ンモニウム塩などの化合物を含む。
キット/製品
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、1または複数の方法に
よる使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験
管など、1または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法におい
て使用される個別のエレメントのうち1つを含む容器を受容するように区画化されたキャ
リングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイア
ル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチッ
クなど、様々な材料から形成されている。
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、1または複数の方法に
よる使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験
管など、1または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法におい
て使用される個別のエレメントのうち1つを含む容器を受容するように区画化されたキャ
リングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイア
ル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチッ
クなど、様々な材料から形成されている。
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材
料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択さ
れる製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料
を含むがこれらに限定されない。
料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択さ
れる製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料
を含むがこれらに限定されない。
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および/または使用のための指示書、な
らびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組
み入れられると予想される。
らびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組
み入れられると予想される。
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一
実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されてい
るか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されて
おり、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば
、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、
内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表
示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示
す。
実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されてい
るか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されて
おり、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば
、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、
内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表
示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示
す。
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許
請求の範囲を限定しようとするものではない。
請求の範囲を限定しようとするものではない。
[実施例1]
HBVワクチンデザインのための、抗原バイオインフォマティクスワークフロー
本明細書で提示される、HBVワクチンの抗原デザインは、バイオインフォマティクス
解析およびコンピュータによるタンパク質操作法の使用を介してもたらされる、本発明者
により選択されたコンビナトリアルガイダンスを介してその着想を得た。HBV抗原の配
列は、遺伝子型Dのタンパク質配列、抗原性の予測、ならびにMHC-Iへの結合、およ
びT細胞活性化後におけるサイトカインの産生をもたらしうる広域カバレッジを伴うT細
胞エピトープマッピングに基づき選択した。本明細書で提示される、HBVワクチンデザ
インについての、全体的なワークフローを、図5に示し、下記で、さらに詳述する。
HBVワクチンデザインのための、抗原バイオインフォマティクスワークフロー
本明細書で提示される、HBVワクチンの抗原デザインは、バイオインフォマティクス
解析およびコンピュータによるタンパク質操作法の使用を介してもたらされる、本発明者
により選択されたコンビナトリアルガイダンスを介してその着想を得た。HBV抗原の配
列は、遺伝子型Dのタンパク質配列、抗原性の予測、ならびにMHC-Iへの結合、およ
びT細胞活性化後におけるサイトカインの産生をもたらしうる広域カバレッジを伴うT細
胞エピトープマッピングに基づき選択した。本明細書で提示される、HBVワクチンデザ
インについての、全体的なワークフローを、図5に示し、下記で、さらに詳述する。
コンセンサス配列の取得
HBVゲノムは、ポリメラーゼタンパク質、コアタンパク質、エンベロープ(プレS1
、S2、S)タンパク質、HBeタンパク質、およびHBxタンパク質を含む、いくつか
の重複ウイルスタンパク質(図3A~3D)をコードする。コンセンサスアミノ酸配列は
、A亜型、C亜型、およびD亜型について、B型肝炎ウイルスデータベース(HBVdb
)から得た。
HBVゲノムは、ポリメラーゼタンパク質、コアタンパク質、エンベロープ(プレS1
、S2、S)タンパク質、HBeタンパク質、およびHBxタンパク質を含む、いくつか
の重複ウイルスタンパク質(図3A~3D)をコードする。コンセンサスアミノ酸配列は
、A亜型、C亜型、およびD亜型について、B型肝炎ウイルスデータベース(HBVdb
)から得た。
結合アフィニティーの予測
NetMHC 4.0を、各コンセンサス配列へと適用して、全ての、主要なMHC-
I対立遺伝子(HLA-A0101、HLA-A0201、HLA-A0301、HLA
-A2402、HLA-A2601、HLA-B0702、HLA-B0801、HLA
-B2705、HLA-B3901、HLA-B4001、HLA-B5801、および
HLA-B1501)に対する結合アフィニティーを予測した。NetMHC 4.0は
、人工ニューラルネットワークを使用して、ペプチド配列の結合アフィニティーを予測す
る。この解析は、HBV遺伝子型A、C、およびDにわたり実施した。ランクの0.5%
(強い結合剤)および2%(弱い結合剤)において、任意の閾値を設定した。予測結合ア
フィニティーが、99.5%を超えるペプチドを、強い結合剤として分類し、予測結合ア
フィニティーが、98%を超えるペプチドを、弱い結合剤として分類した。ペプチド配列
内の、各アミノ酸の位置を抽出し、密度曲線(図9A)を作成するのに使用した。これら
の密度曲線を使用して、強い結合剤および弱い結合剤に対するピーク(図9B)を決定す
るために、一階微分および二階微分を計算した。最後に、これらの位置の和集合を使用し
て、応答を誘発する可能性が高いアミノ酸配列を抽出した(図9C)。
NetMHC 4.0を、各コンセンサス配列へと適用して、全ての、主要なMHC-
I対立遺伝子(HLA-A0101、HLA-A0201、HLA-A0301、HLA
-A2402、HLA-A2601、HLA-B0702、HLA-B0801、HLA
-B2705、HLA-B3901、HLA-B4001、HLA-B5801、および
HLA-B1501)に対する結合アフィニティーを予測した。NetMHC 4.0は
、人工ニューラルネットワークを使用して、ペプチド配列の結合アフィニティーを予測す
る。この解析は、HBV遺伝子型A、C、およびDにわたり実施した。ランクの0.5%
(強い結合剤)および2%(弱い結合剤)において、任意の閾値を設定した。予測結合ア
フィニティーが、99.5%を超えるペプチドを、強い結合剤として分類し、予測結合ア
フィニティーが、98%を超えるペプチドを、弱い結合剤として分類した。ペプチド配列
内の、各アミノ酸の位置を抽出し、密度曲線(図9A)を作成するのに使用した。これら
の密度曲線を使用して、強い結合剤および弱い結合剤に対するピーク(図9B)を決定す
るために、一階微分および二階微分を計算した。最後に、これらの位置の和集合を使用し
て、応答を誘発する可能性が高いアミノ酸配列を抽出した(図9C)。
[実施例2]
HBV分子ワクチンのデザイン
本明細書で記載されるHBVワクチンは、以下のHBVデザイン1~5操作タンパク質
(遺伝子改変を伴うペプチド)を含む。デザインが完成したら、各デザインについての完
全な配列を、NetMHC予測にかけて、A遺伝子型、C遺伝子型、およびD遺伝子型(
実施例1)に対して、抗原性およびカバレッジを評価した。本明細書で記載されるワクチ
ンを、現在、臨床試験下にある、アデノウイルスベースの免疫療法用のHBVワクチンで
あって、(a)トランケート型コア、(b)改変ポリメラーゼ、および(c)2つのエン
ベロープドメインから構成される、固有の大型融合タンパク質をコードするHBVワクチ
ンであるTG1050に対して比較した。TG1050のコア領域から、プレコアを除き
、そのポリメラーゼを、4つの点突然変異と共に、3つのセグメントへと分割して、ワク
チン構築物の安定性を改善した(Pol1、Pol2、およびPol3;Δアミノ酸53
8~544およびΔアミノ酸710~742;ならびに突然変異D689H、V769Y
、T776Y、D777H)。2つの、選択されたエンベロープドメインを、図5に示さ
れる通り、これらのポリメラーゼセグメントの間に挿入した。TG1050ポリメラーゼ
の、Env1配列およびEnv2配列は、Genbank(Y07587.1)から得、
TG1050のコア配列は、HBV DB(AB048701)から得た。
HBV分子ワクチンのデザイン
本明細書で記載されるHBVワクチンは、以下のHBVデザイン1~5操作タンパク質
(遺伝子改変を伴うペプチド)を含む。デザインが完成したら、各デザインについての完
全な配列を、NetMHC予測にかけて、A遺伝子型、C遺伝子型、およびD遺伝子型(
実施例1)に対して、抗原性およびカバレッジを評価した。本明細書で記載されるワクチ
ンを、現在、臨床試験下にある、アデノウイルスベースの免疫療法用のHBVワクチンで
あって、(a)トランケート型コア、(b)改変ポリメラーゼ、および(c)2つのエン
ベロープドメインから構成される、固有の大型融合タンパク質をコードするHBVワクチ
ンであるTG1050に対して比較した。TG1050のコア領域から、プレコアを除き
、そのポリメラーゼを、4つの点突然変異と共に、3つのセグメントへと分割して、ワク
チン構築物の安定性を改善した(Pol1、Pol2、およびPol3;Δアミノ酸53
8~544およびΔアミノ酸710~742;ならびに突然変異D689H、V769Y
、T776Y、D777H)。2つの、選択されたエンベロープドメインを、図5に示さ
れる通り、これらのポリメラーゼセグメントの間に挿入した。TG1050ポリメラーゼ
の、Env1配列およびEnv2配列は、Genbank(Y07587.1)から得、
TG1050のコア配列は、HBV DB(AB048701)から得た。
5つの抗原デザイン(HBVデザイン1~5)および対照抗原を合成し、アデノベクタ
ー構築のための発現プラスミド(pAdShuttle)へとクローニングした(図6)
。初期抗原スクリーニングは、一過性のトランスフェクションにおける、in vitr
oの抗原発現、単球由来の樹状細胞についての、一過性のトランスフェクション研究にお
ける、in vitroの抗原プロセシングおよび抗原提示について査定した。図17に
示される通り、HBVデザイン1および2は、クレードDコンセンサスに基づきデザイン
した。コア(8)、表面(8)、ポリメラーゼ(8)、HBx(6)、およびHBPS(
2)に由来する、32のHBVペプチドは、免疫原性データ、質量分析などなどの、実験
データおよび機能データを有する文献からキュレートした(表3)。HBVデザイン3の
ために、ヒトアンキリン様リピート(ALR)タンパク質足場(PDBコード:1QYM
)ペプチドを、ヘリックス/ループ領域に、タンデムにグラフトした。2つのALR足場
を使用し、切断可能リンカー(VSQTSKLTR;配列番号111)により接続した。
ALRタンパク質は、一般に、発現が高度であり、高安定性を有する。したがって、AL
Rタンパク質を、HBVペプチドのための足場として使用して、新規のCTLを創出した
。HBVデザイン4エピトープは、KKリンカーにより隔てた(図6)。
ー構築のための発現プラスミド(pAdShuttle)へとクローニングした(図6)
。初期抗原スクリーニングは、一過性のトランスフェクションにおける、in vitr
oの抗原発現、単球由来の樹状細胞についての、一過性のトランスフェクション研究にお
ける、in vitroの抗原プロセシングおよび抗原提示について査定した。図17に
示される通り、HBVデザイン1および2は、クレードDコンセンサスに基づきデザイン
した。コア(8)、表面(8)、ポリメラーゼ(8)、HBx(6)、およびHBPS(
2)に由来する、32のHBVペプチドは、免疫原性データ、質量分析などなどの、実験
データおよび機能データを有する文献からキュレートした(表3)。HBVデザイン3の
ために、ヒトアンキリン様リピート(ALR)タンパク質足場(PDBコード:1QYM
)ペプチドを、ヘリックス/ループ領域に、タンデムにグラフトした。2つのALR足場
を使用し、切断可能リンカー(VSQTSKLTR;配列番号111)により接続した。
ALRタンパク質は、一般に、発現が高度であり、高安定性を有する。したがって、AL
Rタンパク質を、HBVペプチドのための足場として使用して、新規のCTLを創出した
。HBVデザイン4エピトープは、KKリンカーにより隔てた(図6)。
HBVデザイン1
このデザインでは、HBV D遺伝子型タンパク質配列(HBV DB:AB0487
01)を使用した。HBVタンパク質についての抗原性予測解析(実施例1)および相同
性モデルが、このデザインを導いた。HBVデザイン1と、TG1050との比較を、タ
ンパク質抗原についての相同性モデルと共に、図10に示し、配列比較を、図15A~1
5Cに示す。このデザインは、4つ天然HBV抗原:(1)165~382アミノ酸の拡
張Env2/S領域;(2)アミノ酸1~151のコア領域、およびプレコア領域;(3
)アミノ酸1~154のHBx領域;ならびに(4)ポリメラーゼ(アミノ酸339~8
32);アミノ酸538~544、710~742のdelを含有した。TG1050比
較配列は、2つのHBV抗原を、ポリメラーゼと融合させた、第3のエンベロープペプチ
ドと共に有した。
このデザインでは、HBV D遺伝子型タンパク質配列(HBV DB:AB0487
01)を使用した。HBVタンパク質についての抗原性予測解析(実施例1)および相同
性モデルが、このデザインを導いた。HBVデザイン1と、TG1050との比較を、タ
ンパク質抗原についての相同性モデルと共に、図10に示し、配列比較を、図15A~1
5Cに示す。このデザインは、4つ天然HBV抗原:(1)165~382アミノ酸の拡
張Env2/S領域;(2)アミノ酸1~151のコア領域、およびプレコア領域;(3
)アミノ酸1~154のHBx領域;ならびに(4)ポリメラーゼ(アミノ酸339~8
32);アミノ酸538~544、710~742のdelを含有した。TG1050比
較配列は、2つのHBV抗原を、ポリメラーゼと融合させた、第3のエンベロープペプチ
ドと共に有した。
このデザインは、エンベロープ、コア、HBx、およびポリメラーゼの逆転写酵素ドメ
インに由来する、完全なタンパク質ドメインを包含した。TG1050比較配列は、改変
ポリメラーゼドメインへと融合させた、トランケート型コアおよびエンベロープペプチド
を有したが、HBx配列はコードしなかった。
インに由来する、完全なタンパク質ドメインを包含した。TG1050比較配列は、改変
ポリメラーゼドメインへと融合させた、トランケート型コアおよびエンベロープペプチド
を有したが、HBx配列はコードしなかった。
異なるHBVドメインを、1つの長いオープンリーディングフレームとして、継目なし
に、一体に融合させた。TG1050比較配列は、トランケーションならびに欠失を伴い
、2つだけのドメイン(コアおよびポリメラーゼ)を有した。TG1050比較配列は、
エンベロープペプチドの、ポリメラーゼドメイン内の、ランダムな挿入を有した。
に、一体に融合させた。TG1050比較配列は、トランケーションならびに欠失を伴い
、2つだけのドメイン(コアおよびポリメラーゼ)を有した。TG1050比較配列は、
エンベロープペプチドの、ポリメラーゼドメイン内の、ランダムな挿入を有した。
エンベロープタンパク質ドメインおよびポリメラーゼドメインにトランケーションを施
した。このデザインでは、エンベロープタンパク質の、C末端領域だけを使用した。逆転
写酵素の、C末端領域だけを組み入れた。完全なRNアーゼHドメインを組み入れた。逆
転写酵素機能を不活化させるようにΔRT活性モチーフ(538~544:6アミノ酸)
、およびΔRNアーゼHモチーフ(710~742:32アミノ酸)にトランケーション
を施した。
した。このデザインでは、エンベロープタンパク質の、C末端領域だけを使用した。逆転
写酵素の、C末端領域だけを組み入れた。完全なRNアーゼHドメインを組み入れた。逆
転写酵素機能を不活化させるようにΔRT活性モチーフ(538~544:6アミノ酸)
、およびΔRNアーゼHモチーフ(710~742:32アミノ酸)にトランケーション
を施した。
HBVデザイン1の新規性:総じて、HBVデザイン1は、TG1050と比較して、
プレコア領域およびコア領域の両方と共に、拡張Env2/S領域を有した。TG105
0と異なり、HBVデザイン1はまた、HBxドメインも含有した。N末端トランケート
型ポリメラーゼもまた、TG1050と同様の欠失と共に使用した。
プレコア領域およびコア領域の両方と共に、拡張Env2/S領域を有した。TG105
0と異なり、HBVデザイン1はまた、HBxドメインも含有した。N末端トランケート
型ポリメラーゼもまた、TG1050と同様の欠失と共に使用した。
HBVデザイン2
このデザインは、図11に描示される通り、HBxペプチドと連結された、コアタンパ
ク質、表面スプライス変異体タンパク質、およびポリメラーゼタンパク質を含む、3つの
主要タンパク質全てからなった。選択されたタンパク質構成要素は、1つの長いオープン
リーディングフレームを作るように、一体に融合させた。このデザインは、以下:(a)
機能的ゲノミクスデータ(HBVdb:AB 048701);(b)T細胞エピトープ
の予測(実施例1);および(c)図12A~12Dに例示される、入手可能なHBVタ
ンパク質構造についての解析に基づいた。TG1050比較配列およびHBVデザインデ
ザイン1と比較すると、このデザインは、以下の通りに、さらなるタンパク質ドメインお
よび/または改変タンパク質ドメイン:(a)トランケート型C末端;(b)表面タンパ
ク質のスプライス変異体(プレS1およびプレS2、S);(c)分割型のPol N末
端断片およびPol C末端断片;ならびに(d)6つのHBxペプチドを有する。タン
パク質ドメインは、HBVの感染性を回避するようにシャッフルし、HBVデザイン2は
、TG1050比較配列およびHBVデザイン1と異なる順序づけスキームを使用した。
このデザインは、図11に描示される通り、HBxペプチドと連結された、コアタンパ
ク質、表面スプライス変異体タンパク質、およびポリメラーゼタンパク質を含む、3つの
主要タンパク質全てからなった。選択されたタンパク質構成要素は、1つの長いオープン
リーディングフレームを作るように、一体に融合させた。このデザインは、以下:(a)
機能的ゲノミクスデータ(HBVdb:AB 048701);(b)T細胞エピトープ
の予測(実施例1);および(c)図12A~12Dに例示される、入手可能なHBVタ
ンパク質構造についての解析に基づいた。TG1050比較配列およびHBVデザインデ
ザイン1と比較すると、このデザインは、以下の通りに、さらなるタンパク質ドメインお
よび/または改変タンパク質ドメイン:(a)トランケート型C末端;(b)表面タンパ
ク質のスプライス変異体(プレS1およびプレS2、S);(c)分割型のPol N末
端断片およびPol C末端断片;ならびに(d)6つのHBxペプチドを有する。タン
パク質ドメインは、HBVの感染性を回避するようにシャッフルし、HBVデザイン2は
、TG1050比較配列およびHBVデザイン1と異なる順序づけスキームを使用した。
HBVデザイン3
このデザインは、合計32のCTL特異性エピトープ(表3)を含有する多重エピトー
プに基づき、以下:(1)複数の免疫学的アッセイおよびイムノプロテオミクスに基づく
文献の精査;ならびに(2)IEDB;(3)NetMHC 4.0によるエピトープ予
測から選択された。ヒトアンキリン様リピートタンパク質(PDBコード:1QYM)を
、32のペプチドをグラフトしリピート領域を置き換える足場として選択した。このデザ
インについての相同性モデル(図13)を作成したが、これは、ペプチドをグラフトされ
たアンキリン足場が、全体的な三次構造を保持しうることを示唆した。32の、グラフト
されたCTLエピトープを接続する、足場骨格のアミノ酸は、十分なリンカーとして用い
られうる。
このデザインは、合計32のCTL特異性エピトープ(表3)を含有する多重エピトー
プに基づき、以下:(1)複数の免疫学的アッセイおよびイムノプロテオミクスに基づく
文献の精査;ならびに(2)IEDB;(3)NetMHC 4.0によるエピトープ予
測から選択された。ヒトアンキリン様リピートタンパク質(PDBコード:1QYM)を
、32のペプチドをグラフトしリピート領域を置き換える足場として選択した。このデザ
インについての相同性モデル(図13)を作成したが、これは、ペプチドをグラフトされ
たアンキリン足場が、全体的な三次構造を保持しうることを示唆した。32の、グラフト
されたCTLエピトープを接続する、足場骨格のアミノ酸は、十分なリンカーとして用い
られうる。
HBVデザイン4
このデザインは、デザイン3と同じ、コア、表面、Pol、HBx、およびHBSPに
由来する、32のCTLエピトープ(表3)から構成された。ペプチドは、足場へとグラ
フトする代わりに、帯電したジペプチドKK残基リンカーによりアセンブルした。
このデザインは、デザイン3と同じ、コア、表面、Pol、HBx、およびHBSPに
由来する、32のCTLエピトープ(表3)から構成された。ペプチドは、足場へとグラ
フトする代わりに、帯電したジペプチドKK残基リンカーによりアセンブルした。
HBVデザイン5
このデザインは、デザイン1と同様であり、融合体の構成要素(配列番号112および
113;表6;図16)の間に、剛直性リンカー(EAAAK)2(配列番号129)を
有する。
このデザインは、デザイン1と同様であり、融合体の構成要素(配列番号112および
113;表6;図16)の間に、剛直性リンカー(EAAAK)2(配列番号129)を
有する。
RNA qPCR相対発現アッセイのために、5’-TGCCAAGAGTGACGT
GTCCA-3’(配列番号110)を、スプライスプライマーとして使用し、5’-C
CCAGGTCCAACTGCAGCCGG-3’(配列番号128)を、スプライスプ
ローブとして使用した。各抗原についてデザインされた、特異的プライマーを、リバース
プライマーとして使用した(図14)。A549細胞に、リポトランスフェクトし(表4
)、HT1080細胞に、ヌクレオフェクトした(表5)。
GTCCA-3’(配列番号110)を、スプライスプライマーとして使用し、5’-C
CCAGGTCCAACTGCAGCCGG-3’(配列番号128)を、スプライスプ
ローブとして使用した。各抗原についてデザインされた、特異的プライマーを、リバース
プライマーとして使用した(図14)。A549細胞に、リポトランスフェクトし(表4
)、HT1080細胞に、ヌクレオフェクトした(表5)。
[実施例3]
HBVワクチンについての免疫原性試験
抗原の全ては、多重欠失型ゴリラアデノベクター内で構築および作製して、実験のほか
、臨床研究のためのGMP製造へと移行しうるプレGMP株のための、調査研究用材料を
作出した(図6)。
HBVワクチンについての免疫原性試験
抗原の全ては、多重欠失型ゴリラアデノベクター内で構築および作製して、実験のほか
、臨床研究のためのGMP製造へと移行しうるプレGMP株のための、調査研究用材料を
作出した(図6)。
樹状細胞へのトランスフェクションに最適のプラスミド濃度を決定する。慢性PHBV
患者に由来するT細胞を活性化させる、異なる抗原デザインの能力を評価する。HBV感
染した患者の試料に対する、抗原デザインの免疫原性を評価する。in vivoにおけ
る試験計画は、マウスのin vivoにおいて免疫原性研究(例えば、「自家ブースト
」の実行可能性の証拠、投与経路(IM対SC)を含む、単回投与研究、反復投与研究)
を行い、慢性HBV感染のマウスモデル、および、最終的には、HCCのマウスモデルに
おいて、免疫原性研究を行うことである。
患者に由来するT細胞を活性化させる、異なる抗原デザインの能力を評価する。HBV感
染した患者の試料に対する、抗原デザインの免疫原性を評価する。in vivoにおけ
る試験計画は、マウスのin vivoにおいて免疫原性研究(例えば、「自家ブースト
」の実行可能性の証拠、投与経路(IM対SC)を含む、単回投与研究、反復投与研究)
を行い、慢性HBV感染のマウスモデル、および、最終的には、HCCのマウスモデルに
おいて、免疫原性研究を行うことである。
単球由来の樹状細胞は、標準的プロトコールに従い、GM-CSFおよびIL-4によ
り作出する。単球由来の樹状細胞に、異なるHBV抗原構築物を感染させ、37℃で、2
4時間にわたり、ベクターと共にインキュベートする。細胞を洗浄し、10ng/mlの
rhuTNF-αにより、一晩にわたり成熟させた。細胞の成熟は、フローサイトメトリ
ー(CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR)により評価する。サイト
カインの産生は、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12p40、およびMCP
1について評価する。単球由来の樹状細胞を、自家T細胞と共に、1:10の比で、10
日間にわたり共培養する。外因性rhuIL-2(200U/ml)、rhuIL-7、
およびrHuIL-15(10ng/ml)を、3、5、および7日目に添加する。IF
N-γ、TNF-α、CXCL-10、CXCL-9、IL-10、IL-6、IL-4
、IL-5、IL-12p70、およびMCP1について、サイトカインの分泌を評価す
る。T細胞についての活性化マーカーは、CD25、CD69、CD45RA、CD45
RO、PD1、CTLA-4、TIGIT、およびLAG3である。樹状細胞およびT細
胞の活性化に基づき、免疫原性が最も大きな抗原デザインを選択し、HBV感染した患者
の試料に対する、抗原デザインの免疫原性を評価する。
り作出する。単球由来の樹状細胞に、異なるHBV抗原構築物を感染させ、37℃で、2
4時間にわたり、ベクターと共にインキュベートする。細胞を洗浄し、10ng/mlの
rhuTNF-αにより、一晩にわたり成熟させた。細胞の成熟は、フローサイトメトリ
ー(CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR)により評価する。サイト
カインの産生は、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-12p40、およびMCP
1について評価する。単球由来の樹状細胞を、自家T細胞と共に、1:10の比で、10
日間にわたり共培養する。外因性rhuIL-2(200U/ml)、rhuIL-7、
およびrHuIL-15(10ng/ml)を、3、5、および7日目に添加する。IF
N-γ、TNF-α、CXCL-10、CXCL-9、IL-10、IL-6、IL-4
、IL-5、IL-12p70、およびMCP1について、サイトカインの分泌を評価す
る。T細胞についての活性化マーカーは、CD25、CD69、CD45RA、CD45
RO、PD1、CTLA-4、TIGIT、およびLAG3である。樹状細胞およびT細
胞の活性化に基づき、免疫原性が最も大きな抗原デザインを選択し、HBV感染した患者
の試料に対する、抗原デザインの免疫原性を評価する。
具体的実施形態についての、前出の記載は、本発明の一般的な性格を、完全に明らかに
するので、当技術分野の技術の範囲内にある知見を適用することにより、他の実施者も、
本発明の一般的な概念から逸脱しない限りにおいて、不要な実験を伴わずに、このような
具体的実施形態を、たやすく改変し、かつ/または多様な適用に適応させることができる
。したがって、このような適応および改変は、本明細書において提示される教示および指
針に基づき、開示される実施形態の均等物の意義および範囲の中にあることが意図される
。本明細書の用語法または表現法が、教示および指針に照らして、当業者により解釈され
るように、本明細書における表現法または用語法は、説明を目的とするものであり、限定
を目的とするものではないことが理解されるものとする。
するので、当技術分野の技術の範囲内にある知見を適用することにより、他の実施者も、
本発明の一般的な概念から逸脱しない限りにおいて、不要な実験を伴わずに、このような
具体的実施形態を、たやすく改変し、かつ/または多様な適用に適応させることができる
。したがって、このような適応および改変は、本明細書において提示される教示および指
針に基づき、開示される実施形態の均等物の意義および範囲の中にあることが意図される
。本明細書の用語法または表現法が、教示および指針に照らして、当業者により解釈され
るように、本明細書における表現法または用語法は、説明を目的とするものであり、限定
を目的とするものではないことが理解されるものとする。
当業者には、本発明の他の実施形態も、本明細書の検討、および本明細書で開示される
本発明の実施から明らかであろう。本明細書および例は、例示的なものであるに過ぎず、
本発明の、真の範囲および精神は、後続の特許請求の範囲により指し示されることが意図
される。
本発明の実施から明らかであろう。本明細書および例は、例示的なものであるに過ぎず、
本発明の、真の範囲および精神は、後続の特許請求の範囲により指し示されることが意図
される。
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、2018年3月6日
に出願された、米国仮出願第62/639,354号に対する優先権を主張する。
に出願された、米国仮出願第62/639,354号に対する優先権を主張する。
実施形態
E1.少なくとも1または複数の免疫応答誘導性B型肝炎ウイルス(HBV)ポリペプ
チドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
E2.前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBVコアペプチドを含む、E1に
記載のポリヌクレオチド。
E3.前記HBVコアペプチドが、表3に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか
1つを有する、E2に記載のポリヌクレオチド。
E4.前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBV表面ペプチドを含む、E1か
らE3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E5.前記HBV表面ペプチドが、表3に示される表面ペプチド配列のうちのいずれか
1つを有する、E4に記載のポリヌクレオチド。
E6.前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBV Polペプチドを含む、E
1からE5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E7.前記HBV Polペプチドが、表3に示されるPolペプチド配列のうちのい
ずれか1つを有する、E6に記載のポリヌクレオチド。
E8.前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBV HBSP/HBxペプチド
を含む、E1からE7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E9.前記HBV HBSP/HBxペプチドが、表3に示されるHBSP/HBxペ
プチド配列のうちのいずれか1つを有する、E8に記載のポリヌクレオチド。
E10.前記1または複数のHBVポリペプチドが、KKリンカーを含む、E1からE
9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E11.前記KKリンカーが、表3に示されるペプチド配列のうちのいずれか1つを、
表3に示される他の任意のペプチド配列へと接続する、E10に記載のポリヌクレオチド
。
E12.E1からE11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含み、異種遺伝子
発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、1または複数のポリヌクレオ
チドをさらに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイッチ系
により調節され;前記異種遺伝子が、E1からE11のいずれか一項に記載のポリヌクレ
オチドを含む、ポリヌクレオチド。
E13.前記遺伝子スイッチ系が、エクジソン受容体ベースの(EcRベースの)遺伝
子スイッチ系である、E1からE12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E14.前記1または複数のHBVポリペプチドが、ワクチンにおける使用のためのH
BVポリペプチドである、E1からE13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E15.E1からE14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
E16.アデノウイルスベクターである、E15に記載のベクター。
E17.前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、E1
6に記載のベクター。
E18.細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞へと、(i)抑
制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および(ii)発現が、前記遺伝子ス
イッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子であって、1または複数のHBVポリ
ペプチドのうちの少なくとも1つをコードする異種免疫応答誘導性遺伝子を含む、1また
は複数のポリヌクレオチドを導入するステップと;前記細胞を、前記異種免疫応答誘導性
遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十分な量の化合物へと曝露するステップとを含む
方法。
E19.前記標的細胞が、哺乳動物細胞である、E18に記載の方法。
E20.前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体、オ
ーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体
相互作用性タンパク質15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、
肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用性タンパク質
14、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも1つに由来する、リガンド結合性
ドメインを含む、E18またはE19に記載の方法。
E21.少なくとも1つのHBVペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクタ
ーであって、アデノウイルスベクターであるベクター。
E22.少なくとも1つのHBVペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクタ
ーであって、前記ベクターが、アデノウイルスベクターであり、前記アデノウイルスベク
ターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、ベクター。
E23.HBV HBxドメイン、およびHBV Polドメイン、HBVコアドメイ
ン、HBVプレコアドメイン、またはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つを含む
ポリペプチド構築物。
E24.プレコアドメイン、およびHBV Polドメイン、HBV HBxドメイン
、またはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つを含むポリペプチド構築物。
E25.前記HBV HBxドメインが、配列番号98に示される配列を有する、E2
3またはE24に記載のポリペプチド構築物。
E26.前記HBV Polドメインが、野生型HBV Polドメインと比較した、
少なくとも1つのアミノ酸の欠失を含む、E23からE25のいずれか一項に記載のポリ
ペプチド構築物。
E27.前記欠失が、前記野生型HBV Polドメインの欠失部分を含み、前記欠失
部分が、アミノ酸538~544またはアミノ酸710~742のうちの少なくとも1つ
を含む、E26に記載のポリペプチド構築物。
E28.前記欠失部分が、アミノ酸538~544およびアミノ酸710~742の両
方を含む、E27に記載のポリペプチド構築物。
E29.前記HBV Polドメインが、配列番号99に示される配列を有する、E2
8に記載のポリペプチド構築物。
E30.前記HBV表面ドメインが、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、およびS
ドメインのうちの少なくとも1つを含む、E23からE29のいずれか一項に記載のポリ
ペプチド構築物。
E31.前記HBV表面ドメインが、HBV Sドメインを含む、E30に記載のポリ
ペプチド構築物。
E32.前記HBV表面ドメインが、配列番号100に示される配列を有する、E30
またはE31に記載のポリペプチド構築物。
E33.HBVコアドメインをさらに含む、E24からE32のいずれか一項に記載の
ポリペプチド構築物。
E34.コア部分を含み、前記コア部分が、前記HBVコアドメインと、前記HBVプ
レコアドメインとを含む、E23またはE33に記載のポリペプチド。
E35.前記コア部分が、配列番号101に示される配列を有する、E34に記載のポ
リペプチド構築物。
E36.SHB(Env)ドメイン、HBeAgドメイン、HBxドメイン、およびP
olドメインの各々を含む、E23またはE33に記載のポリペプチド構築物。
E37.N末端から、C末端へと、前記SHB(Env)ドメイン、HBeAgドメイ
ン、HBxドメイン、およびPolドメインの構造を含む、E36に記載のポリペプチド
構築物。
E38.前記SHB(Env)ドメインが、配列番号102に示される配列を有する、
E36またはE37に記載のポリペプチド構築物。
E39.前記HBeAgドメインが、配列番号103に示される配列を有する、E36
またはE37に記載のポリペプチド構築物。
E40.前記HBxドメインが、配列番号104に示される配列を有する、E36また
はE37に記載のポリペプチド構築物。
E41.前記Polドメインが、配列番号105に示される配列を有する、E36また
はE37に記載のポリペプチド構築物。
E42.配列番号106に示される配列を有する、E36またはE37に記載のポリペ
プチド構築物。
E43.剛直性リンカーをさらに含む、E36またはE37に記載のポリペプチド構築
物。
E44.前記ポリペプチドが、配列番号112に示される配列を有する、E36または
E37に記載のポリペプチド構築物。
E45.1または複数のHBV HBxリンカー、ならびにコアドメイン、表面ドメイ
ン、およびPolドメインのうちの少なくとも1つを含み、前記コアドメイン、前記表面
ドメイン、および前記Polドメインのうちの1つのドメインが、前記1または複数のH
Bxリンカーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Polドメイン
のうちの別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物。
E46.前記表面ドメインが、HBVプレS1ドメイン、HBVプレS2ドメイン、お
よびHBV Sドメインのうちの少なくとも1つを含む、E45に記載のポリペプチド構
築物。
E47.前記1または複数のHBV HBxリンカーが、複数のHBV HBxリンカ
ーを含む、E45またはE46に記載のポリペプチド構築物。
E48.前記複数のHBV HBxリンカーのうちの、少なくとも2つが、アミノ酸配
列が異なる、E47に記載のポリペプチド構築物。
E49.前記HBV HBxリンカーが、表3のHBx-1、HBx-2、HBx-3
、HBx-4、HBx-5、またはHBx-6のうちのいずれか1つに示される配列を有
する、E45からE48のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
E50.前記コアドメインが、前記表面ドメインと隣接する、E45からE49のいず
れか一項に記載のポリペプチド構築物。
E51.前記表面ドメインが、プレS1ドメインを含む、E50に記載のポリペプチド
構築物。
E52.前記表面ドメインが、前記1または複数のHBxリンカーのうちの1つにより
、前記コアドメインへと接続された、E50またはE51に記載のポリペプチド構築物。
E53.前記Polドメインが、表面ドメインと隣接する、E45からE52のいずれ
か一項に記載のポリペプチド構築物。
E54.前記表面ドメインが、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、およびSドメイ
ンのうちの少なくとも1つを含む、E53に記載のポリペプチド構築物。
E55.前記表面ドメインが、前記プレS1ドメインを含み、前記PolドメインのN
末端部分が、前記プレS1ドメインと隣接する、E54に記載のポリペプチド構築物。
E56.前記Polドメインの、前記N末端部分が、前記1または複数のHBxリンカ
ーのうちの1つにより、前記プレS1ドメインへと接続された、E55に記載のポリペプ
チド構築物。
E57.前記表面ドメインが、前記プレS2ドメインを含み、前記PolドメインのN
末端部分が、前記プレS2ドメインと隣接する、E56に記載のポリペプチド構築物。
E58.前記Polドメインの、前記N末端部分が、前記1または複数のHBxリンカ
ーのうちの1つにより、前記プレS2ドメインへと接続された、E57に記載のポリペプ
チド構築物。
E59.前記表面ドメインが、前記プレS2ドメインを含み、前記PolドメインのC
末端部分が、前記プレS2ドメインと隣接する、E58に記載のポリペプチド構築物。
E60.前記Polドメインの、前記C末端部分が、前記1または複数のHBxリンカ
ーのうちの1つにより、前記プレS2ドメインへと接続された、E59に記載のポリペプ
チド構築物。
E61.前記表面ドメインが、前記Sドメインを含み、前記PolドメインのC末端部
分が、前記Sドメインと隣接する、E60に記載のポリペプチド構築物。
E62.前記Polドメインの、前記C末端部分が、前記1または複数のHBxリンカ
ーのうちの1つにより、前記Sドメインへと接続された、E61に記載のポリペプチド構
築物。
E63.配列番号107に示される配列を有する、E45からE62のいずれか一項に
記載のポリペプチド構築物。
E64.アンキリン様リピートドメイン、および1または複数のHBVペプチドを含む
ポリペプチド構築物。
E65.前記アンキリン様リピートタンパク質が、ヒトアンキリン様リピートタンパク
質である、E64に記載のポリペプチド構築物。
E66.前記1または複数のHBVペプチドが、表3のアミノ酸配列のうちのいずれか
1つに示される配列を有する、E64またはE65に記載のポリペプチド構築物。
E67.前記1または複数のHBVペプチドが、コアペプチド、表面ペプチド、Pol
ペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの1または複数を含む、E64からE
66のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
E68.前記1または複数のHBVペプチドが、コアペプチドを含み、前記コアペプチ
ドが、表3のコアアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する、E67に
記載のポリペプチド構築物。
E69.前記1または複数のHBVペプチドが、表面ペプチドを含み、前記表面ペプチ
ドが、表3の表面アミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する、E67に
記載のポリペプチド構築物。
E70.前記1または複数のHBVペプチドが、Polペプチドを含み、前記Polペ
プチドが、表3のPolアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する、E
67に記載のポリペプチド構築物。
E71.前記1または複数のHBVペプチドが、HBSP/HBxペプチドを含み、前
記HBSP/HBxペプチドが、表3のHBSP/HBxアミノ酸配列のうちのいずれか
1つに示される配列を有する、E67に記載のポリペプチド構築物。
E72.配列番号108に示される配列を有する、E65からE71のいずれか一項に
記載のポリペプチド構築物。
E73.表3に示される少なくとも2つのHBVアミノ酸配列を含み、前記少なくとも
2つのHBVアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリンカー
が、KKリンカーである、ポリペプチド構築物。
E74.前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、表3に示されるコアペプチド、
表面ペプチド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの少なくとも1
つを含む、E73に記載のポリペプチド構築物。
E75.前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、表3に示されるアミノ酸配列の
各々を含む、E73またはE74に記載のポリペプチド構築物。
E76.アミノ酸配列の前記各々が、前記KKリンカーにより、アミノ酸配列の前記各
々のうちの、別のアミノ酸配列へと接続された、E75に記載のポリペプチド構築物。
E77.配列番号109に示される配列を有する、E73からE75のいずれか一項に
記載のポリペプチド構築物。
E78.ワクチンにおける使用のための、E23からE77のいずれか一項に記載のポ
リペプチド構築物。
E79.E25からE78のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードするポ
リヌクレオチド。
E80.E79に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
E81.アデノウイルスベクターである、E80に記載のベクター。
E82.前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、E8
1に記載のベクター。
E1.少なくとも1または複数の免疫応答誘導性B型肝炎ウイルス(HBV)ポリペプ
チドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
E2.前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBVコアペプチドを含む、E1に
記載のポリヌクレオチド。
E3.前記HBVコアペプチドが、表3に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか
1つを有する、E2に記載のポリヌクレオチド。
E4.前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBV表面ペプチドを含む、E1か
らE3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E5.前記HBV表面ペプチドが、表3に示される表面ペプチド配列のうちのいずれか
1つを有する、E4に記載のポリヌクレオチド。
E6.前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBV Polペプチドを含む、E
1からE5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E7.前記HBV Polペプチドが、表3に示されるPolペプチド配列のうちのい
ずれか1つを有する、E6に記載のポリヌクレオチド。
E8.前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBV HBSP/HBxペプチド
を含む、E1からE7のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E9.前記HBV HBSP/HBxペプチドが、表3に示されるHBSP/HBxペ
プチド配列のうちのいずれか1つを有する、E8に記載のポリヌクレオチド。
E10.前記1または複数のHBVポリペプチドが、KKリンカーを含む、E1からE
9のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E11.前記KKリンカーが、表3に示されるペプチド配列のうちのいずれか1つを、
表3に示される他の任意のペプチド配列へと接続する、E10に記載のポリヌクレオチド
。
E12.E1からE11のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含み、異種遺伝子
発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、1または複数のポリヌクレオ
チドをさらに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイッチ系
により調節され;前記異種遺伝子が、E1からE11のいずれか一項に記載のポリヌクレ
オチドを含む、ポリヌクレオチド。
E13.前記遺伝子スイッチ系が、エクジソン受容体ベースの(EcRベースの)遺伝
子スイッチ系である、E1からE12のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E14.前記1または複数のHBVポリペプチドが、ワクチンにおける使用のためのH
BVポリペプチドである、E1からE13のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
E15.E1からE14のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
E16.アデノウイルスベクターである、E15に記載のベクター。
E17.前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、E1
6に記載のベクター。
E18.細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、前記細胞へと、(i)抑
制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および(ii)発現が、前記遺伝子ス
イッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子であって、1または複数のHBVポリ
ペプチドのうちの少なくとも1つをコードする異種免疫応答誘導性遺伝子を含む、1また
は複数のポリヌクレオチドを導入するステップと;前記細胞を、前記異種免疫応答誘導性
遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十分な量の化合物へと曝露するステップとを含む
方法。
E19.前記標的細胞が、哺乳動物細胞である、E18に記載の方法。
E20.前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体、オ
ーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体
相互作用性タンパク質15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、
肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用性タンパク質
14、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも1つに由来する、リガンド結合性
ドメインを含む、E18またはE19に記載の方法。
E21.少なくとも1つのHBVペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクタ
ーであって、アデノウイルスベクターであるベクター。
E22.少なくとも1つのHBVペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクタ
ーであって、前記ベクターが、アデノウイルスベクターであり、前記アデノウイルスベク
ターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、ベクター。
E23.HBV HBxドメイン、およびHBV Polドメイン、HBVコアドメイ
ン、HBVプレコアドメイン、またはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つを含む
ポリペプチド構築物。
E24.プレコアドメイン、およびHBV Polドメイン、HBV HBxドメイン
、またはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つを含むポリペプチド構築物。
E25.前記HBV HBxドメインが、配列番号98に示される配列を有する、E2
3またはE24に記載のポリペプチド構築物。
E26.前記HBV Polドメインが、野生型HBV Polドメインと比較した、
少なくとも1つのアミノ酸の欠失を含む、E23からE25のいずれか一項に記載のポリ
ペプチド構築物。
E27.前記欠失が、前記野生型HBV Polドメインの欠失部分を含み、前記欠失
部分が、アミノ酸538~544またはアミノ酸710~742のうちの少なくとも1つ
を含む、E26に記載のポリペプチド構築物。
E28.前記欠失部分が、アミノ酸538~544およびアミノ酸710~742の両
方を含む、E27に記載のポリペプチド構築物。
E29.前記HBV Polドメインが、配列番号99に示される配列を有する、E2
8に記載のポリペプチド構築物。
E30.前記HBV表面ドメインが、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、およびS
ドメインのうちの少なくとも1つを含む、E23からE29のいずれか一項に記載のポリ
ペプチド構築物。
E31.前記HBV表面ドメインが、HBV Sドメインを含む、E30に記載のポリ
ペプチド構築物。
E32.前記HBV表面ドメインが、配列番号100に示される配列を有する、E30
またはE31に記載のポリペプチド構築物。
E33.HBVコアドメインをさらに含む、E24からE32のいずれか一項に記載の
ポリペプチド構築物。
E34.コア部分を含み、前記コア部分が、前記HBVコアドメインと、前記HBVプ
レコアドメインとを含む、E23またはE33に記載のポリペプチド。
E35.前記コア部分が、配列番号101に示される配列を有する、E34に記載のポ
リペプチド構築物。
E36.SHB(Env)ドメイン、HBeAgドメイン、HBxドメイン、およびP
olドメインの各々を含む、E23またはE33に記載のポリペプチド構築物。
E37.N末端から、C末端へと、前記SHB(Env)ドメイン、HBeAgドメイ
ン、HBxドメイン、およびPolドメインの構造を含む、E36に記載のポリペプチド
構築物。
E38.前記SHB(Env)ドメインが、配列番号102に示される配列を有する、
E36またはE37に記載のポリペプチド構築物。
E39.前記HBeAgドメインが、配列番号103に示される配列を有する、E36
またはE37に記載のポリペプチド構築物。
E40.前記HBxドメインが、配列番号104に示される配列を有する、E36また
はE37に記載のポリペプチド構築物。
E41.前記Polドメインが、配列番号105に示される配列を有する、E36また
はE37に記載のポリペプチド構築物。
E42.配列番号106に示される配列を有する、E36またはE37に記載のポリペ
プチド構築物。
E43.剛直性リンカーをさらに含む、E36またはE37に記載のポリペプチド構築
物。
E44.前記ポリペプチドが、配列番号112に示される配列を有する、E36または
E37に記載のポリペプチド構築物。
E45.1または複数のHBV HBxリンカー、ならびにコアドメイン、表面ドメイ
ン、およびPolドメインのうちの少なくとも1つを含み、前記コアドメイン、前記表面
ドメイン、および前記Polドメインのうちの1つのドメインが、前記1または複数のH
Bxリンカーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Polドメイン
のうちの別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物。
E46.前記表面ドメインが、HBVプレS1ドメイン、HBVプレS2ドメイン、お
よびHBV Sドメインのうちの少なくとも1つを含む、E45に記載のポリペプチド構
築物。
E47.前記1または複数のHBV HBxリンカーが、複数のHBV HBxリンカ
ーを含む、E45またはE46に記載のポリペプチド構築物。
E48.前記複数のHBV HBxリンカーのうちの、少なくとも2つが、アミノ酸配
列が異なる、E47に記載のポリペプチド構築物。
E49.前記HBV HBxリンカーが、表3のHBx-1、HBx-2、HBx-3
、HBx-4、HBx-5、またはHBx-6のうちのいずれか1つに示される配列を有
する、E45からE48のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
E50.前記コアドメインが、前記表面ドメインと隣接する、E45からE49のいず
れか一項に記載のポリペプチド構築物。
E51.前記表面ドメインが、プレS1ドメインを含む、E50に記載のポリペプチド
構築物。
E52.前記表面ドメインが、前記1または複数のHBxリンカーのうちの1つにより
、前記コアドメインへと接続された、E50またはE51に記載のポリペプチド構築物。
E53.前記Polドメインが、表面ドメインと隣接する、E45からE52のいずれ
か一項に記載のポリペプチド構築物。
E54.前記表面ドメインが、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、およびSドメイ
ンのうちの少なくとも1つを含む、E53に記載のポリペプチド構築物。
E55.前記表面ドメインが、前記プレS1ドメインを含み、前記PolドメインのN
末端部分が、前記プレS1ドメインと隣接する、E54に記載のポリペプチド構築物。
E56.前記Polドメインの、前記N末端部分が、前記1または複数のHBxリンカ
ーのうちの1つにより、前記プレS1ドメインへと接続された、E55に記載のポリペプ
チド構築物。
E57.前記表面ドメインが、前記プレS2ドメインを含み、前記PolドメインのN
末端部分が、前記プレS2ドメインと隣接する、E56に記載のポリペプチド構築物。
E58.前記Polドメインの、前記N末端部分が、前記1または複数のHBxリンカ
ーのうちの1つにより、前記プレS2ドメインへと接続された、E57に記載のポリペプ
チド構築物。
E59.前記表面ドメインが、前記プレS2ドメインを含み、前記PolドメインのC
末端部分が、前記プレS2ドメインと隣接する、E58に記載のポリペプチド構築物。
E60.前記Polドメインの、前記C末端部分が、前記1または複数のHBxリンカ
ーのうちの1つにより、前記プレS2ドメインへと接続された、E59に記載のポリペプ
チド構築物。
E61.前記表面ドメインが、前記Sドメインを含み、前記PolドメインのC末端部
分が、前記Sドメインと隣接する、E60に記載のポリペプチド構築物。
E62.前記Polドメインの、前記C末端部分が、前記1または複数のHBxリンカ
ーのうちの1つにより、前記Sドメインへと接続された、E61に記載のポリペプチド構
築物。
E63.配列番号107に示される配列を有する、E45からE62のいずれか一項に
記載のポリペプチド構築物。
E64.アンキリン様リピートドメイン、および1または複数のHBVペプチドを含む
ポリペプチド構築物。
E65.前記アンキリン様リピートタンパク質が、ヒトアンキリン様リピートタンパク
質である、E64に記載のポリペプチド構築物。
E66.前記1または複数のHBVペプチドが、表3のアミノ酸配列のうちのいずれか
1つに示される配列を有する、E64またはE65に記載のポリペプチド構築物。
E67.前記1または複数のHBVペプチドが、コアペプチド、表面ペプチド、Pol
ペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの1または複数を含む、E64からE
66のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
E68.前記1または複数のHBVペプチドが、コアペプチドを含み、前記コアペプチ
ドが、表3のコアアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する、E67に
記載のポリペプチド構築物。
E69.前記1または複数のHBVペプチドが、表面ペプチドを含み、前記表面ペプチ
ドが、表3の表面アミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する、E67に
記載のポリペプチド構築物。
E70.前記1または複数のHBVペプチドが、Polペプチドを含み、前記Polペ
プチドが、表3のPolアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する、E
67に記載のポリペプチド構築物。
E71.前記1または複数のHBVペプチドが、HBSP/HBxペプチドを含み、前
記HBSP/HBxペプチドが、表3のHBSP/HBxアミノ酸配列のうちのいずれか
1つに示される配列を有する、E67に記載のポリペプチド構築物。
E72.配列番号108に示される配列を有する、E65からE71のいずれか一項に
記載のポリペプチド構築物。
E73.表3に示される少なくとも2つのHBVアミノ酸配列を含み、前記少なくとも
2つのHBVアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリンカー
が、KKリンカーである、ポリペプチド構築物。
E74.前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、表3に示されるコアペプチド、
表面ペプチド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの少なくとも1
つを含む、E73に記載のポリペプチド構築物。
E75.前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、表3に示されるアミノ酸配列の
各々を含む、E73またはE74に記載のポリペプチド構築物。
E76.アミノ酸配列の前記各々が、前記KKリンカーにより、アミノ酸配列の前記各
々のうちの、別のアミノ酸配列へと接続された、E75に記載のポリペプチド構築物。
E77.配列番号109に示される配列を有する、E73からE75のいずれか一項に
記載のポリペプチド構築物。
E78.ワクチンにおける使用のための、E23からE77のいずれか一項に記載のポ
リペプチド構築物。
E79.E25からE78のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードするポ
リヌクレオチド。
E80.E79に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
E81.アデノウイルスベクターである、E80に記載のベクター。
E82.前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、E8
1に記載のベクター。
配列
本明細書では、本明細書で提示される実施形態に含まれる、ある特定の配列の代表的リ
ストが提示される(表6)。
本明細書では、本明細書で提示される実施形態に含まれる、ある特定の配列の代表的リ
ストが提示される(表6)。
本願は以下の態様を含み得る。
[1]
1または複数の免疫応答誘導性B型肝炎ウイルス(HBV)ポリペプチドを含むポリペプチドをコードする、天然に存在しないポリヌクレオチド。
[2]
前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBVコアペプチド、HBV表面ペプチド、HBV Polペプチド、HBV HBSP/HBxペプチド、KKリンカー、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。
[3]
(i)前記HBVコアペプチドが、表3に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか1つを有するか、
(ii)前記HBV表面ペプチドが、表3に示される表面ペプチド配列のうちのいずれか1つを有するか、
(iii)前記HBV Polペプチドが、表3に示されるPolペプチド配列のうちのいずれか1つを有するか、
(iv)前記HBV HBSP/HBxペプチドが、表3に示されるHBSP/HBxペプチド配列のうちのいずれか1つを有するか、
(v)前記KKリンカーが、表3に示されるペプチド配列のうちのいずれか1つを、表3に示される他の任意のペプチド配列へと接続するか、または
(vi)(i)~(v)の任意の組合せである、
請求項2に記載のポリヌクレオチド。
[4]
請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含み、異種遺伝子発現の誘導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、1または複数のポリヌクレオチドをさらに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイッチ系により調節され;前記異種遺伝子が、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド。
[5]
前記遺伝子スイッチ系が、エクジソン受容体ベースの(EcRベースの)遺伝子スイッチ系である、請求項4に記載のポリヌクレオチド。
[6]
細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、
(a)前記細胞へと、
(i)抑制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および
(ii)発現が、前記遺伝子スイッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子であって、1または複数のHBVポリペプチドのうちの少なくとも1つをコードする異種免疫応答誘導性遺伝子
を含む、1または複数のポリヌクレオチドを導入するステップと;
(b)前記細胞を、前記異種免疫応答誘導性遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十分な量の化合物へと曝露するステップと
を含む方法。
[7]
前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体、オーファン受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体相互作用性タンパク質15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓X受容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用性タンパク質14、およびファルネソール受容体のうちの少なくとも1つに由来する、リガンド結合性ドメインを含む、請求項6に記載の方法。
[8]
(a)HBV HBxドメイン、およびHBV Polドメイン、HBVコアドメイン、HBVプレコアドメイン、もしくはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つ;または
(b)プレコアドメイン、およびHBV Polドメイン、HBV HBxドメイン、もしくはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つ
を含むポリペプチド構築物。
[9]
(i)前記HBV HBxドメインが、配列番号98に示される配列を有するか;
(ii)前記HBV Polドメインが、野生型HBV Polドメインと比較した、少なくとも1つのアミノ酸の欠失を含むか;
(iii)前記HBV表面ドメインが、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、およびSドメインのうちの少なくとも1つを含むか;または
(iv)これらの任意の組合せである、
請求項8に記載のポリペプチド構築物。
[10]
(i)前記HBV Polドメインが、配列番号99に示される配列を有するか、
(ii)前記HBV表面ドメインが、配列番号100に示される配列を有するか、
(iii)前記HBVコアドメインおよび前記HBVプレコアドメイン(「コア部分」)が、配列番号101に示される配列を有するか、または
(iv)これらの任意の組合せである、請求項8または9に記載のポリペプチド構築物。
[11]
SHB(Env)ドメイン、HBeAgドメイン、HBxドメイン、およびPolドメインの各々を含む、請求項8から10のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
[12]
(i)前記SHB(Env)ドメインが、配列番号102に示される配列を有し、
(ii)前記HBeAgドメインが、配列番号103に示される配列を有し、
(iii)前記HBxドメインが、配列番号104に示される配列を有し、
(iv)前記Polドメインが、配列番号105に示される配列を有する、
請求項11に記載のポリペプチド構築物。
[13]
配列番号106に示される配列を有する、請求項8から12のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
[14]
剛直性リンカーをさらに含む、請求項8から13のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
[15]
前記ポリペプチドが、配列番号112に示される配列を有する、請求項8から14のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
[16]
1または複数のHBV HBxリンカー、ならびにコアドメイン、表面ドメイン、およびPolドメインのうちの少なくとも1つを含み、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Polドメインのうちの1つのドメインが、前記1または複数のHBxリンカーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Polドメインのうちの別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物。
[17]
(i)前記表面ドメインが、HBVプレS1ドメイン、HBVプレS2ドメイン、およびHBV Sドメインのうちの少なくとも1つを含むか;
(ii)前記1または複数のHBV HBxリンカーが、表3のHBx-1、HBx-2、HBx-3、HBx-4、HBx-5、もしくはHBx-6のうちのいずれか1つに示される配列を含むか;または
(iii)(i)および(ii)の両方である、
請求項16に記載のポリペプチド構築物。
[18]
前記コアドメインが、前記表面ドメインと隣接する、請求項16または17に記載のポリペプチド構築物。
[19]
前記表面ドメインが、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、Sドメイン、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項16から18のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
[20]
配列番号107に示される配列を有する、請求項16から19のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
[21]
アンキリン様リピートドメイン、および1または複数のHBVペプチドを含むポリペプチド構築物。
[22]
(i)前記アンキリン様リピートタンパク質が、ヒトアンキリン様リピートタンパク質であり、
(ii)前記1または複数のHBVペプチドが、表3のアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有する、
請求項21に記載のポリペプチド構築物。
[23]
前記1または複数のHBVペプチドが、コアペプチド、表面ペプチド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの1または複数を含む、請求項21または22に記載のポリペプチド構築物。
[24]
(i)前記コアペプチドが、表3のコアアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有するか;
(ii)前記表面ペプチドが、表3の表面アミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有するか;
(iii)前記Polペプチドが、表3のPolアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有するか;
(iv)前記HBSP/HBxペプチドが、表3のHBSP/HBxアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される配列を有するか;または
(v)これらの任意の組合せである
請求項23に記載のポリペプチド構築物。
[25]
配列番号108に示される配列を有する、請求項21から24のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
[26]
表3に示される少なくとも2つのHBVアミノ酸配列を含み、前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリンカーが、KKリンカーである、ポリペプチド構築物。
[27]
前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、表3に示されるコアペプチド、表面ペプチド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの少なくとも1つを含む、請求項26に記載のポリペプチド構築物。
[28]
前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、表3に示されるアミノ酸配列の各々を含む、請求項26または27に記載のポリペプチド構築物。
[29]
配列番号109に示される配列を有する、請求項26から28のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。
[30]
請求項8から29のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド。
[31]
請求項1から5および30のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[32]
アデノウイルスベクターである、請求項31に記載のベクター。
[33]
前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、請求項32に記載のベクター。
[34]
ワクチンにおける使用のための、請求項1から5および30のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項8から29のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物、または請求項31から33のいずれか一項に記載のベクター。
Claims (34)
- 1または複数の免疫応答誘導性B型肝炎ウイルス(HBV)ポリペプチドを含むポリペ
プチドをコードする、天然に存在しないポリヌクレオチド。 - 前記1または複数のHBVポリペプチドが、HBVコアペプチド、HBV表面ペプチド
、HBV Polペプチド、HBV HBSP/HBxペプチド、KKリンカー、または
これらの任意の組合せを含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド。 - (i)前記HBVコアペプチドが、表3に示されるコアペプチド配列のうちのいずれか
1つを有するか、
(ii)前記HBV表面ペプチドが、表3に示される表面ペプチド配列のうちのいずれ
か1つを有するか、
(iii)前記HBV Polペプチドが、表3に示されるPolペプチド配列のうち
のいずれか1つを有するか、
(iv)前記HBV HBSP/HBxペプチドが、表3に示されるHBSP/HBx
ペプチド配列のうちのいずれか1つを有するか、
(v)前記KKリンカーが、表3に示されるペプチド配列のうちのいずれか1つを、表
3に示される他の任意のペプチド配列へと接続するか、または
(vi)(i)~(v)の任意の組合せである、
請求項2に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含み、異種遺伝子発現の誘
導性制御のための遺伝子スイッチ系をコードする、1または複数のポリヌクレオチドをさ
らに含むポリヌクレオチドであって、異種遺伝子発現が、前記遺伝子スイッチ系により調
節され;前記異種遺伝子が、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを
含む、ポリヌクレオチド。 - 前記遺伝子スイッチ系が、エクジソン受容体ベースの(EcRベースの)遺伝子スイッ
チ系である、請求項4に記載のポリヌクレオチド。 - 細胞内の異種遺伝子の発現を調節する方法であって、
(a)前記細胞へと、
(i)抑制性遺伝子スイッチまたは誘導性遺伝子スイッチ、および
(ii)発現が、前記遺伝子スイッチにより調節される異種免疫応答誘導性遺伝子で
あって、1または複数のHBVポリペプチドのうちの少なくとも1つをコードする異種免
疫応答誘導性遺伝子
を含む、1または複数のポリヌクレオチドを導入するステップと;
(b)前記細胞を、前記異種免疫応答誘導性遺伝子の発現を抑制または誘導するのに十
分な量の化合物へと曝露するステップと
を含む方法。 - 前記遺伝子スイッチが、エクジソン受容体(EcR)、ユビキタス受容体、オーファン
受容体1、NER-1、ステロイドホルモン核内受容体1、レチノイドX受容体相互作用
性タンパク質15、肝臓X受容体β、ステロイドホルモン受容体様タンパク質、肝臓X受
容体、肝臓X受容体α、ファルネソイドX受容体、受容体相互作用性タンパク質14、お
よびファルネソール受容体のうちの少なくとも1つに由来する、リガンド結合性ドメイン
を含む、請求項6に記載の方法。 - (a)HBV HBxドメイン、およびHBV Polドメイン、HBVコアドメイン
、HBVプレコアドメイン、もしくはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つ;また
は
(b)プレコアドメイン、およびHBV Polドメイン、HBV HBxドメイン、
もしくはHBV表面ドメインのうちの少なくとも1つ
を含むポリペプチド構築物。 - (i)前記HBV HBxドメインが、配列番号98に示される配列を有するか;
(ii)前記HBV Polドメインが、野生型HBV Polドメインと比較した、
少なくとも1つのアミノ酸の欠失を含むか;
(iii)前記HBV表面ドメインが、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、および
Sドメインのうちの少なくとも1つを含むか;または
(iv)これらの任意の組合せである、
請求項8に記載のポリペプチド構築物。 - (i)前記HBV Polドメインが、配列番号99に示される配列を有するか、
(ii)前記HBV表面ドメインが、配列番号100に示される配列を有するか、
(iii)前記HBVコアドメインおよび前記HBVプレコアドメイン(「コア部分」
)が、配列番号101に示される配列を有するか、または
(iv)これらの任意の組合せである、請求項8または9に記載のポリペプチド構築物
。 - SHB(Env)ドメイン、HBeAgドメイン、HBxドメイン、およびPolドメ
インの各々を含む、請求項8から10のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物。 - (i)前記SHB(Env)ドメインが、配列番号102に示される配列を有し、
(ii)前記HBeAgドメインが、配列番号103に示される配列を有し、
(iii)前記HBxドメインが、配列番号104に示される配列を有し、
(iv)前記Polドメインが、配列番号105に示される配列を有する、
請求項11に記載のポリペプチド構築物。 - 配列番号106に示される配列を有する、請求項8から12のいずれか一項に記載のポ
リペプチド構築物。 - 剛直性リンカーをさらに含む、請求項8から13のいずれか一項に記載のポリペプチド
構築物。 - 前記ポリペプチドが、配列番号112に示される配列を有する、請求項8から14のい
ずれか一項に記載のポリペプチド構築物。 - 1または複数のHBV HBxリンカー、ならびにコアドメイン、表面ドメイン、およ
びPolドメインのうちの少なくとも1つを含み、前記コアドメイン、前記表面ドメイン
、および前記Polドメインのうちの1つのドメインが、前記1または複数のHBxリン
カーにより、前記コアドメイン、前記表面ドメイン、および前記Polドメインのうちの
別のドメインへと接続された、ポリペプチド構築物。 - (i)前記表面ドメインが、HBVプレS1ドメイン、HBVプレS2ドメイン、およ
びHBV Sドメインのうちの少なくとも1つを含むか;
(ii)前記1または複数のHBV HBxリンカーが、表3のHBx-1、HBx-
2、HBx-3、HBx-4、HBx-5、もしくはHBx-6のうちのいずれか1つに
示される配列を含むか;または
(iii)(i)および(ii)の両方である、
請求項16に記載のポリペプチド構築物。 - 前記コアドメインが、前記表面ドメインと隣接する、請求項16または17に記載のポ
リペプチド構築物。 - 前記表面ドメインが、プレS1ドメイン、プレS2ドメイン、Sドメイン、またはこれ
らの任意の組合せを含む、請求項16から18のいずれか一項に記載のポリペプチド構築
物。 - 配列番号107に示される配列を有する、請求項16から19のいずれか一項に記載の
ポリペプチド構築物。 - アンキリン様リピートドメイン、および1または複数のHBVペプチドを含むポリペプ
チド構築物。 - (i)前記アンキリン様リピートタンパク質が、ヒトアンキリン様リピートタンパク質
であり、
(ii)前記1または複数のHBVペプチドが、表3のアミノ酸配列のうちのいずれか
1つに示される配列を有する、
請求項21に記載のポリペプチド構築物。 - 前記1または複数のHBVペプチドが、コアペプチド、表面ペプチド、Polペプチド
、およびHBSP/HBxペプチドのうちの1または複数を含む、請求項21または22
に記載のポリペプチド構築物。 - (i)前記コアペプチドが、表3のコアアミノ酸配列のうちのいずれか1つに示される
配列を有するか;
(ii)前記表面ペプチドが、表3の表面アミノ酸配列のうちのいずれか1つに示され
る配列を有するか;
(iii)前記Polペプチドが、表3のPolアミノ酸配列のうちのいずれか1つに
示される配列を有するか;
(iv)前記HBSP/HBxペプチドが、表3のHBSP/HBxアミノ酸配列のう
ちのいずれか1つに示される配列を有するか;または
(v)これらの任意の組合せである
請求項23に記載のポリペプチド構築物。 - 配列番号108に示される配列を有する、請求項21から24のいずれか一項に記載の
ポリペプチド構築物。 - 表3に示される少なくとも2つのHBVアミノ酸配列を含み、前記少なくとも2つのH
BVアミノ酸配列が、ペプチドリンカーにより接続され、前記ペプチドリンカーが、KK
リンカーである、ポリペプチド構築物。 - 前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、表3に示されるコアペプチド、表面ペプ
チド、Polペプチド、およびHBSP/HBxペプチドのうちの少なくとも1つを含む
、請求項26に記載のポリペプチド構築物。 - 前記少なくとも2つのHBVアミノ酸配列が、表3に示されるアミノ酸配列の各々を含
む、請求項26または27に記載のポリペプチド構築物。 - 配列番号109に示される配列を有する、請求項26から28のいずれか一項に記載の
ポリペプチド構築物。 - 請求項8から29のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物をコードするポリヌクレ
オチド。 - 請求項1から5および30のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- アデノウイルスベクターである、請求項31に記載のベクター。
- 前記アデノウイルスベクターが、ゴリラアデノウイルスベクターである、請求項32に
記載のベクター。 - ワクチンにおける使用のための、請求項1から5および30のいずれか一項に記載のポ
リヌクレオチド、請求項8から29のいずれか一項に記載のポリペプチド構築物、または
請求項31から33のいずれか一項に記載のベクター。
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