CN118045206A - 一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途 - Google Patents

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CN118045206A CN202410437106.1A CN202410437106A CN118045206A CN 118045206 A CN118045206 A CN 118045206A CN 202410437106 A CN202410437106 A CN 202410437106A CN 118045206 A CN118045206 A CN 118045206A
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董飚
刘瑜
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Abstract

本发明涉及一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途，属于基因治疗领域。所述药物组合物包括治疗脊髓型肌肉萎缩症（Spinal Muscular Atrophy,SMA）的表达载体和治疗脊髓型肌肉萎缩的小分子化合物，以及CD4单克隆抗体（Anti‑mouse CD4‑InVivo,anti‑CD4），所述表达载体包括编码运动神经元存活基因1（SMN1）蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸，用于治疗脊髓型肌肉萎缩。

Description

一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途
技术领域
本发明涉及基因治疗领域，具体涉及一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途。
背景技术
脊髓型肌肉萎缩症（Spinal Muscular Atrophy, SMA）是一种由SMN1基因突变或缺失引起的神经肌肉疾病，主要影响运动神经元，导致肌肉萎缩和运动功能损失，对患者的生活质量和寿命有很大影响。目前，基于患者发病年龄和病情严重程度主要分为五种类型。其中，急性婴儿型SMA（I型）是最常见且最严重的类型，患病婴儿会在出生后几个月内表现出明显的运动功能障碍和呼吸困难，大多数患者在2岁前死亡。
由于目前仍缺少腺相关病毒（rAAV）基因治疗相关临床数据明确其长期有效性，因此对于一些rAAV治疗的新生儿遗传性疾病很可能在治疗中后期需要进行二次注射才能够维持rAAV基因治疗的效果。经过rAAV药物治疗后的患者体内将产生大量衣壳特异的抗体，导致rAAV基因治疗药物的二次注射也成为亟待解决的主要问题之一。因此，有必要进一步研发更有效的SMA治疗策略，以拓宽SMA患者的“治疗窗口”，并提高患者的生活质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途，该药物组合物在SMA小鼠中发现证实了rAAV基因疗法与小分子化合物联合治疗SMA疾病能达到更好的治疗效果；并发现结合CD4单克隆抗体（Anti-mouse CD4-InVivo, anti-CD4）将小分子化合物联合治疗的策略综合应用于治疗SMA小鼠，能够对其进行二次注射，进一步显著延长了SMA小鼠的存活时间。本发明还提供联合治疗脊髓型肌肉萎缩的方法，以及其制药用途。
在一个方面，本文提供了一种用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物，其包含治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体和治疗脊髓型肌肉萎缩的小分子化合物，所述表达载体包含治疗脊髓型肌肉萎缩的转基因。
在一个方面，本文提供了一种用于治疗脊髓型肌肉萎缩的方法，其包括向患者施用有效剂量的治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体和治疗脊髓型肌肉萎缩的小分子化合物，所述表达载体含有编码运动神经元存活基因1（SMN1）蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
在一个方面，本文提供了一种包含治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体联合治疗脊髓型肌肉萎缩的小分子化合物在制备用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物中的用途。
在一些实施方案中，用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物还可以包括：药学上可接受的辅料、小配件等。药物组合物的各种成份可分别装在不同的容器中，可以根据需要先后或组合向患者施用。
在一些实施方案中，治疗脊髓型肌肉萎缩的转基因可通过表达载体进行转导或递送。
在一些实施方案中，所述治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体包括DNA载体或RNA载体，优选是病毒载体。
在一些实施方案中，所述治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体包括非病毒载体和病毒载体等。常用的非病毒载体有脂质体、树枝状大分子、非天然阳离子聚合物、天然多糖等。非病毒基因递送载体比较安全、稳定，但其转染效率通常较低。病毒载体是将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性将外源基因导入细胞中。常见的病毒载体包括逆转录病毒(recombinant retrovirus, rRV)、重组慢病毒(recombinantlentivirus, rLV)、腺病毒(recombinant adenovirus, rAd)、腺相关病毒(recombinantadeno-associated virus, rAAV)等。
在一些实施方案中，所述的治疗脊髓型肌肉萎缩的病毒载体包含编码SMN1蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
在一些实施方案中，所述的编码SMN1蛋白（SEQ ID NO：1）的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列同一性至少约70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%。
在一些实施方案中，治疗脊髓型肌肉萎缩的病毒载体是重组腺相关病毒（rAAV）。rAAV载体也可以是单链重组腺相关病毒（ssAAV）或自身互补重组腺相关病毒（scAAV）。scAAV是指其中由重组AAV核酸序列携带的编码区已被设计为形成分子内双链DNA模板的一种构建体。在感染时，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见D M麦卡迪(D MMcCarty)等人，“Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectorspromoteefficient transduction independently of DNA synthesis”，GeneTherapy，2001年8月，第8卷，第16期，第1248-1254页。scAAV描述于例如美国专利号US 6,596,535；US7,125,717；以及US 7,456,683。
在一些实施方案中，本发明的AAV载体可包括或衍生自任何天然或重组AAV血清型。根据本公开，AAV载体可以利用或基于一种血清型或包括下列任何一种或多种:AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV2G9、AAV3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13和任何其他已知或后来发现的AAV血清型（参见例如，Fields等人，VIROLOGY, 第4版. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia,1996）。任何血清型的AAV均可用于本文，并且AAV血清型的选择将部分取决于基因疗法靶向的一种或多种细胞类型。
在一些实施方案中，AAV载体的血清型选自AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9或其变体。AAV血清型对身体的特定器官和组织具有特定的趋向性，AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9血清型对肌肉组织具有靶向性（参见Issa S S等人. Various AAV Serotypesand Their Applications in Gene Therapy: An Overview[J]. Cells, 2023, 12(5):785.）。
在一些实施方案中，小分子化合物RG7916的化学结构式如下：
。
在一些实施方案中，所述表达载体是用于肌内注射或静脉注射的。
在一些实施方案中，所述小分子化合物是用于肌内注射或静脉注射的。
在一些实施方案中，向患者施用的病毒载体的剂量为1.0×1011~5.0×1014 vg/kg。优选的，向患者施用的病毒载体的剂量为1.0×1012~3.0×1014 vg/kg。更优选的，向患者施用的病毒载体的剂量为1×1013~2×1014 vg/kg，例如1.0×1013 vg/kg，1.1×1013 vg/kg，1.2×1013 vg/kg，1.5×1013 vg/kg，2×1013 vg/kg，2.5×1013 vg/kg，3.0×1013 vg/kg，3.5×1013 vg/kg，4×1013 vg/kg，5×1013 vg/kg，6×1013 vg/kg，7×1013 vg/kg，8×1013vg/kg，9×1013 vg/kg，1.0×1014 vg/kg，2.0×1014 vg/kg等。
在一些实施方案中，向患者施用的小分子化合物的剂量为5-300mg/kg。优选的，向患者施用的小分子化合物的剂量为10-100mg/kg。更优选的，向患者施用的小分子化合物的剂量为25-45mg/kg，例如25mg/kg，27mg/kg，29mg/kg，31mg/kg，32mg/kg，33mg/kg，34mg/kg，35mg/kg，36mg/kg，37mg/kg，38mg/kg，39mg/kg，40mg/kg，41mg/kg，42mg/kg，43mg/kg，44mg/kg，45mg/kg。
在一个方面，本文提供了一种用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物，其包含治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体、治疗脊髓型肌肉萎缩的小分子化合物和CD4单克隆抗体，所述rAAV载体含有编码运动神经元存活基因1（SMN1）蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
在一个方面，本文提供了一种用于治疗脊髓型肌肉萎缩的方法，其包括向患者施用有效剂量的治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体、治疗脊髓型肌肉萎缩的小分子化合物和CD4单克隆抗体，所述载体含有编码运动神经元存活基因1（SMN1）蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
在一个方面，本文提供了一种包含治疗脊髓型肌肉萎缩的病毒载体联合治疗脊髓型肌肉萎缩的小分子化合物和CD4单克隆抗体在制备用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物中的用途。
在一些实施方案中，治疗脊髓型肌肉萎缩的转基因可通过表达载体进行转导或递送。
在一些实施方案中，所述治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体包括DNA载体或RNA载体，优选是病毒载体。
在一些实施方案中，用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物还可以包括：药学上可接受的辅料、小配件等。药物组合物的各种成份可分别装在不同的容器中，可以根据需要先后或组合向患者施用。
在一些实施方案中，所述治疗脊髓型肌肉萎缩的表达载体包括非病毒载体和病毒载体等。常用的非病毒载体有脂质体、树枝状大分子、非天然阳离子聚合物、天然多糖等。非病毒基因递送载体比较安全、稳定，但其转染效率通常较低。病毒载体是将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性将外源基因导入细胞中。常见的病毒载体包括逆转录病毒(recombinant retrovirus, rRV)、重组慢病毒(recombinantlentivirus, rLV)、腺病毒(recombinant adenovirus, rAd)、腺相关病毒(recombinantadeno-associated virus, rAAV)等。
在一些实施方案中，所述的治疗脊髓型肌肉萎缩的病毒载体包含编码SMN1蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
在一些实施方案中，所述的编码SMN1蛋白（SEQ ID NO：1）的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3序列同一性至少约70%、75%、80%、85%、90%、92%、95%、96%、97%、98%、99%。
在一些实施方案中，治疗脊髓型肌肉萎缩的病毒载体是重组腺相关病毒（rAAV）。rAAV载体也可以是单链重组腺相关病毒（ssAAV）或自身互补重组腺相关病毒（scAAV）。scAAV是指其中由重组AAV核酸序列携带的编码区已被设计为形成分子内双链DNA模板的一种构建体。在感染时，未等待细胞介导的第二条链合成，而是两条互补的半scAAV将缔合以形成易于立即复制和转录的一条双链DNA(dsDNA)。参见D M麦卡迪(D MMcCarty)等人，“Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectorspromoteefficient transduction independently of DNA synthesis”，GeneTherapy，2001年8月，第8卷，第16期，第1248-1254页。scAAV描述于例如美国专利号US 6,596,535；US7,125,717；以及US 7,456,683。
在一些实施方案中，本发明的AAV载体可包括或衍生自任何天然或重组AAV血清型。根据本公开，AAV载体可以利用或基于一种血清型或包括下列任何一种或多种:AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV2G9、AAV3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、AAV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13和任何其他已知或后来发现的AAV血清型（参见例如，Fields等人，VIROLOGY, 第4版. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia,1996）。任何血清型的AAV均可用于本文，并且AAV血清型的选择将部分取决于基因疗法靶向的一种或多种细胞类型。
在一些实施方案中，AAV载体的血清型选自AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9或其变体。AAV血清型对身体的特定器官和组织具有特定的趋向性，AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9血清型对肌肉组织具有靶向性（参见Issa S S等人. Various AAV Serotypesand Their Applications in Gene Therapy: An Overview[J]. Cells, 2023, 12(5):785.）。
在一些实施方案中，小分子化合物RG7916的化学结构式如下：
。
在一些实施方案中，所述表达载体是用于肌内注射或静脉注射的。
在一些实施方案中，所述小分子化合物是用于肌内注射或静脉注射的。
在一些实施方案中，所述CD4单克隆抗体是用于肌内注射或静脉注射的。
在一些实施方案中，向患者施用的病毒载体的剂量为1.0×1011~5.0×1014 vg/kg。优选的，向患者施用的病毒载体的剂量为1.0×1012~3.0×1014 vg/kg。更优选的，向患者施用的病毒载体的剂量为1×1013~2×1014 vg/kg，例如1.0×1013 vg/kg，1.1×1013 vg/kg，1.2×1013 vg/kg，1.5×1013 vg/kg，2×1013 vg/kg，2.5×1013 vg/kg，3.0×1013 vg/kg，3.5×1013 vg/kg，4×1013 vg/kg，5×1013 vg/kg，6×1013 vg/kg，7×1013 vg/kg，8×1013vg/kg，9×1013 vg/kg，1.0×1014 vg/kg，2.0×1014 vg/kg等。
在一些实施方案中，向患者施用的小分子化合物的剂量为5-300mg/kg。优选的，向患者施用的小分子化合物的剂量为10-100mg/kg。更优选的，向患者施用的小分子化合物的剂量为25-45mg/kg，例如25mg/kg，27mg/kg，29mg/kg，31mg/kg，32mg/kg，33mg/kg，34mg/kg，35mg/kg，36mg/kg，37mg/kg，38mg/kg，39mg/kg，40mg/kg，41mg/kg，42mg/kg，43mg/kg，44mg/kg，45mg/kg。
在一些实施方案中，向患者施用的CD4单克隆抗体的剂量为5-300mg/kg。优选的，向患者施用的CD4单克隆抗体的剂量为10-100mg/kg。更优选的，向患者施用的CD4单克隆抗体的剂量为25-45mg/kg，例如25mg/kg，27mg/kg，29mg/kg，31mg/kg，32mg/kg，33mg/kg，34mg/kg，35mg/kg，36mg/kg，37mg/kg，38mg/kg，39mg/kg，40mg/kg，41mg/kg，42mg/kg，43mg/kg，44mg/kg，45mg/kg。
方案1. 一种用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物，其特征在于，包含rAAV载体、小分子化合物RG7916和CD4单克隆抗体，所述rAAV载体含有编码运动神经元存活基因1（SMN1）蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
方案2. 如方案1所述的药物组合物，所述编码SMN1蛋白的核苷酸与序列SEQ IDNO：2相似度至少99%，或SMN1蛋白变异的核苷酸与序列SEQ ID NO：3相似度至少99%。
方案3. 如方案1所述的药物组合物，所述编码SMN1蛋白的核苷酸序列为SEQ IDNO：2，或SMN1蛋白变异的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
方案4. 如方案1所述的药物组合物，所述rAAV载体血清型是rAAV9。
方案5. 如方案1所述的药物组合物，所述rAAV载体是scAAV。
方案6. rAAV载体、小分子化合物RG7916联合CD4单克隆抗体在制备用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物中的用途，所述rAAV载体含有编码SMN1蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
方案7. 如方案6所述的用途，所述编码SMN1蛋白的核苷酸与序列SEQ ID NO：2相似度至少99%，或SMN1蛋白变异的核苷酸与序列SEQ ID NO：3相似度至少99%。
方案8. 方案8. 如方案6所述的用途，所述编码SMN1蛋白的核苷酸序列为SEQ IDNO：2，或SMN1蛋白变异的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
方案9. 如方案6所述的用途，所述rAAV载体的血清型是rAAV9。
方案10. 如方案6所述的用途，所述rAAV载体是scAAV。
本发明通过研究rAAV载体介导的基因治疗药物的表达时间，并在其稳定表达前使用小分子化合物进行短暂补充，提出了rAAV基因疗法与小分子化合物联合治疗SMA疾病的新策略，达到了更好的治疗效果，并拓宽了rAAV基因治疗SMA患者的“治疗窗口”。此外，本发明利用新生小鼠的模型发现CD4细胞的占比是影响新生小鼠能否二次注射的关键因素，并将该发现与小分子化合物联合治疗的策略综合应用于治疗出生后5天的SMA小鼠（前期研究发现出生后第5天的小鼠原本不能二次注射，但清除CD4细胞后可实现二次注射），进一步显著延长了SMA小鼠的存活时间。
附图说明
图1显示了密码子优化hSMN1基因在细胞水平上的表达验证。图1A显示了用pdsAAV-CB-EGFP、pdsAAV-CB-SMN1、pdsAAV-CB-coSMN1转染的HEK293T细胞和未处理的细胞的SMN蛋白表达水平的比较。图1B显示了感染scAAV9-EGFP、scAAV9-SMN1、scAAV9-coSMN1的U-87 MG细胞和未处理细胞的SMN蛋白表达水平的比较。图1C显示了感染scAAV9-EGFP、scAAV9-SMN1、scAAV9-coSMN1的U-87 MG细胞与未处理细胞的细胞核中gems（合成受体）的数量比较，其中DAPI和SMN分别代表染色的DAPI抗体或染色的SMN抗体，Merge代表这两个抗体合在一起的图片，Zoom是代表区域的放大图片；
图2显示了未处理的SMNΔ7小鼠、用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠的表型的比较。图2A显示了未处理的SMNΔ7小鼠、用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠随年龄增长的体型对比。图2B显示了未处理的SMNΔ7小鼠、用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠随年龄增长的体重对比；
图3显示了野生型小鼠、未处理的SMNΔ7小鼠、用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠的运动功能的比较。图3A显示了野生型小鼠、未处理的SMNΔ7小鼠、用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠的平面翻正运动功能对比。图3B显示了野生型小鼠、未处理的SMNΔ7小鼠、用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠的后肢悬吊运动功能对比。图3C显示了野生型小鼠、未处理的SMNΔ7小鼠、用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠的负趋地性运动功能对比；
图4显示了野生型小鼠、未处理的SMNΔ7小鼠和用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠运动神经元数量的比较。图4A-4D显示了野生型小鼠、未处理的SMNΔ7小鼠和用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠脊髓颈膨大处运动神经元数量。图4E-AH显示了野生型小鼠、未处理的SMNΔ7小鼠和用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠腰骶膨大处运动神经元数量；
图5显示了未处理的SMNΔ7小鼠和用scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠的存活时间的比较；
图6显示了PND1（1天龄）小鼠注射ssAAV9-Luciferase载体后不同时间点的体内生物发光成像。图6A显示了未处理的SMNΔ7小鼠和用scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠的体内生物发光成像比较。图6B显示了用scAAV9-coSMN1处理的SMNΔ7小鼠的体内平均生物发光强度；
图7显示了小分子化合物RG7916与rAAV基因治疗药物的联合治疗方案对SMA小鼠体重的影响：未处理的SMNΔ7小鼠、用scAAV9-SMN1、RG7916、低剂量scAAV9-SMN1+ RG7916和中剂量scAAV9-SMN1+ RG7916处理的SMNΔ7小鼠体重的比较；
图8显示了小分子化合物RG7916与rAAV基因治疗药物的联合治疗方案对SMA小鼠尾巴长度的影响；
图9显示了小分子化合物RG7916与rAAV基因治疗药物的联合治疗方案对SMA小鼠存活时间的影响；
图10显示了野生型小鼠、未治疗的SMNΔ7小鼠、rAAV基因治疗药物单独治疗的SMNΔ7小鼠、小分子化合物RG7916单独治疗的SMNΔ7小鼠和小分子化合物RG7916与rAAV基因治疗药物的联合治疗的SMNΔ7小鼠运动功能的比较对比。图10A显示了野生型小鼠、未治疗的SMNΔ7小鼠、rAAV基因治疗药物单独治疗的SMNΔ7小鼠、小分子化合物RG7916单独治疗的SMNΔ7小鼠和小分子化合物RG7916与rAAV基因治疗药物的联合治疗的SMNΔ7小鼠的平面翻正运动功能对比。图10B显示了野生型小鼠、未治疗的SMNΔ7小鼠、rAAV基因治疗药物单独治疗的SMNΔ7小鼠、小分子化合物RG7916单独治疗的SMNΔ7小鼠和小分子化合物RG7916与rAAV基因治疗药物的联合治疗的SMNΔ7小鼠的后肢悬吊运动功能对比。图10C显示了野生型小鼠、未治疗的SMNΔ7小鼠、rAAV基因治疗药物单独治疗的SMNΔ7小鼠、小分子化合物RG7916单独治疗的SMNΔ7小鼠和小分子化合物RG7916与rAAV基因治疗药物的联合治疗的SMNΔ7小鼠的负趋地性运动功能对比；
图11显示了不同年龄新生小鼠脾脏中T细胞亚群的流式细胞术分析。图11A显示了流式细胞术分析不同年龄新生小鼠脾脏T细胞亚群中CD3细胞、CD4细胞和CD8细胞分布情况，目标细胞群被圈出。图11B显示了不同年龄新生小鼠脾脏中CD3阳性细胞群的百分比情况。图11C显示了不同年龄新生小鼠脾脏中CD4阳性CD8阴性细胞群的百分比情况。图11D显示了不同年龄新生小鼠脾脏中CD4阴性CD8阳性细胞群的百分比情况；
图12显示了不同年龄新生小鼠外周血中T细胞亚群的流式细胞术分析。图12A显示了流式细胞术分析不同年龄新生小鼠外周血T细胞亚群中CD3细胞、CD4细胞和CD8细胞分布情况，目标细胞群被圈出。图12B显示了不同年龄新生小鼠外周血中CD3阳性细胞群的百分比情况。图12C显示了不同年龄新生小鼠外周血中CD4阳性CD8阴性细胞群的百分比情况。图12D显示了不同年龄新生小鼠外周血中CD4阴性CD8阳性细胞群的百分比情况；
图13显示了PND5（5天龄）新生小鼠一次注射rAAV后体内AAV9特异性结合抗体的含量检测；
图14显示了活体成像检测PND5新生小鼠一次注射和二次注射后的发光情况；
图15显示了小分子化合物RG7916与anti-CD4介导的二次注射rAAV基因治疗药物的方案对PND5 SMA小鼠体重的影响；
图16小分子化合物RG7916与anti-CD4介导的二次注射rAAV基因治疗药物的方案对PND5 SMA小鼠存活时间的影响。
具体实施方式
下述公开了多种不同的实施所述的主题技术方案的实施方式或实施例。为简化公开内容，下面描述了具体实例，当然，这些仅仅为例子而已，并非是对本发明的保护范围进行限制。另外，这些公开内容中可能会在不同的例子中重复附图标记和/或字母，该重复是为了简要和清楚，其本身不表示要讨论的各实施方式和/或结构间的关系。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交相关的术语和技术是本领域中已知和常用的术语。
术语“一”是指该实体中的一个或多个；例如，“一病毒载体”被理解为代表一种或多种病毒载体。
如本文所用，术语“约”或“大约”用于表示一个值包括设备的固有误差变化、用于确定该值的方法或研究对象之间存在的变化。术语“大约”包含所述的确切数字。在一些实施例中，“大约”是指在给定值或范围的正负10%以内。在一些实施例中，“大约”是指变化是所述值的±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0.5%、±0.2%或±0.1%。在一些实施例中，“大约”是指变化是所述值的±1%、±0.5%、±0.2%或±0.1%。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”、“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶结合到聚合物中的任何底物。
本文可互换使用的术语“肽”、“多肽”、“蛋白”是指任何长度的氨基酸的聚合物，其可以是直链或支链的。它可以包括非天然的或修饰的氨基酸，或者被非氨基酸打断。多肽、肽、多肽链、肽链或蛋白质也可以通过例如二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰来修饰。
本文中在两种或多种多核苷酸或多肽的上下文中使用的术语“相同”、“同一性”、“相似度”百分比及其等同表达，是指在比较和比对时（如有必要，引入间隙）相同或具有特定百分比相同核苷酸或氨基酸残基的两个或多个序列或子序列为了最大限度地对应，不考虑任何保守的氨基酸取代作为序列同一性的一部分。可以使用序列比较软件或算法或通过视觉检查来测量同一性百分比。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件在本领域是众所周知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG WisconsinPackage及其变体。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可以使用序列比较计算机程序BLAST来生成百分比序列同一性值。
在一些实施方案中，本文提供的两种多核苷酸或多肽基本上相同，这意味着当进行比较和比对以获得最大对应性时，它们具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%，并且在一些实施例中具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%或100%的核苷酸或氨基酸残基同一性，如使用序列比较算法或通过视觉检查所测量的。在一些实施方案中，同一性存在于氨基酸序列的长度为至少约10个残基、至少约20个残基，至少约40-60个残基和至少约60-80个残基或其间的任何整数值的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于比60-80个残基更长的区域上，例如至少约80-100个残基，并且在一些实施方式中，所述序列在被比较的序列的全长上基本相同，例如靶蛋白或抗体的编码区。在一些实施方案中，同一性存在于核苷酸序列的长度为至少约10个碱基、至少约20个碱基、最少约40-60个碱基、最多约60-80个碱基或其间的任何整数值的区域上。在一些实施方案中，同一性存在于比60-80个碱基更长的区域上，例如至少约80-100个碱基或更多，并且在一些实施例中，序列在被比较的序列的全长上基本相同，例如编码目的蛋白质的核苷酸序列。
如本领域技术人员所理解的，如本文所使用的，为了确定百分比序列同一性的目的，RNA分子中的尿苷核苷被认为等同于DNA分子中的胸苷核苷。因此，如果RNA等价物和DNA多核苷酸仅通过用DNA多核苷酸中的胸苷核苷取代RNA等价物中的尿苷核苷而彼此不同，则可以认为RNA等价物与DNA多核苷酸具有100%序列同一性。
本文中所用的与具有特定序列特征的核酸或蛋白质有关的术语“变体”或“变异”是指具有一种或多种的不同核酸或蛋白质与参考核酸或参考蛋白质相比，核苷酸或氨基酸的取代、缺失和/或添加。在一些实施方案中，与参考核酸或参考蛋白质相比，核酸变体或蛋白质变体可以具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少93%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。核酸或蛋白质的变体通常保持参考核酸或参考蛋白质的基本结构和功能特征。
如本文所用，术语“基因”是指编码蛋白质的DNA区域。基因可以包括调控区和蛋白质编码区。在一些实施方案中，基因包括两个或更多内含子和三个或更多外显子，其中每个内含子在两个外显子之间形成插入序列。如本文所用，基因的术语“RNA等价物”是指与编码该基因的DNA多核苷酸相对应的RNA多核苷酸，例如通过转录包含该基因的脱氧核糖核酸多核苷酸可获得的RNA转录物。
如本文所用，术语“转基因”是指使用分子和遗传技术转移或递送以在靶细胞中表达的基因。转基因可以编码感兴趣的产物，例如治疗蛋白。转基因也可以编码肽、酶或RNA。可由转基因编码的RNA分子包括miRNA、shRNA、tRNA、dsRNA、核糖体RNA、催化RNA或反义RNA。转基因可以是靶细胞的内源性基因的外源拷贝。转基因也可以与靶细胞异源。在一些实施方案中，靶细胞的内源性基因突变、沉默或以其他方式功能失调，并且转基因提供功能拷贝以补救靶细胞中内源性基因的功能缺失。在一些实施方案中，转基因可以编码治疗性蛋白质。
如本文所用，术语“编码”及其语法等价物是指多核苷酸或核酸（如基因、cDNA或信使核糖核酸）中特定核苷酸序列的固有特性，用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，这些聚合物和大分子具有定义的核苷酸序列（即rRNA、tRNA和信使核糖核酸或定义的氨基酸序列及其产生的生物特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。除非另有规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并版本且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。
如本文中参考核酸分子中的序列元件所使用的，术语“可操作连接”是指这些序列元件（例如启动子和编码序列）在功能上彼此相关。例如，如果启动子调节细胞中感兴趣的可转录多核苷酸分子的转录，则启动子可操作地连接到可转录多核酸分子。
本文使用的术语“密码子”是指给定信使RNA分子或DNA编码链中的任何一组三个连续的核苷酸碱基，其指定特定的氨基酸或翻译的起始或终止信号。术语密码子也指DNA链中的碱基三联体。
如本文所用，术语“载体”是指用于将感兴趣的基因递送到宿主细胞中的载体。载体可以是病毒载体，例如腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体等。载体也可以是非病毒载体，例如基于脂质的纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、裸核酸等。当感兴趣的基因编码要在原核生物或真核生物细胞中表达的外源蛋白时，该载体可以称为“表达载体”此类表达载体的实例公开于例如WO 1994/11026中。本文所述的表达载体包含多核苷酸序列以及例如用于蛋白质表达和/或将这些多核苷酸序列整合到哺乳动物细胞基因组中的附加序列元件。可用于表达本文所述转基因的某些载体包括含有调控序列（如启动子和增强子区）的质粒，所述调控序列指导基因转录。用于表达转基因的其他有用载体包含多核苷酸序列，其提高这些基因的翻译速率或提高由基因转录产生的mRNA的稳定性或核输出。这些序列元件包括例如5'和3'非翻译区、内部核糖体进入位点（IRES）和多腺苷酸化信号位点，以指导表达载体上携带的基因的有效转录。本文所述的表达载体还可以包含编码用于选择含有这种载体的细胞的标记物的多核苷酸。合适的标记物的例子包括编码对抗生素如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素或牛毒素的耐药性的基因。
如本文所用，术语“腺相关病毒”或“AAV”是指细小病毒科的小型复制缺陷型腺病毒依赖性病毒。它们有一个直径为20-25nm的二十面体衣壳和一个4.8kb的基因组，两侧有两个反向末端重复序列（ITRs）。在宿主细胞中解开外壳后，AAV基因组可以通过形成高分子量头尾圆形连接体而保持稳定的附加体状态，或者可以整合到宿主细胞基因组中。这两种情况都提供了长期和高水平的转基因表达。
腺相关病毒（AAV）被认为是最有前途的人类基因治疗病毒载体之一。AAV具有有效感染分裂细胞和非分裂细胞的能力。野生型AAV病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的单个染色体位点，最重要的是，尽管AAV存在于许多人类中，但它与任何疾病都没有关联。重组腺相关病毒来源于野生型腺相关病毒，可以使用分子方法从病毒序列中去除野生型基因，并用非天然核酸（如报告基因转基因）代替。因此，在AAV的情况下，引入非天然序列，如报告转基因，将病毒载体定义为“重组”载体，可称为“rAAV”。如本文所用，术语“重组腺相关病毒”、“重组腺相关性病毒载体”、“rAAV”、“rAAV载体”、“重组AAV”或“重组AAV载体”通常是可互换的。
如本文所用，“表达盒”是指包含可操作地连接到启动子的hSMN1序列的核酸分子，并且可以包括其他调控序列。在一些方面，表达盒被包装到病毒载体（例如，病毒颗粒）的衣壳中。通常，这种用于产生病毒载体的表达盒包含本文所述的hSMN1序列，该序列两侧为病毒基因组的包装信号和其他表达控制序列，如本文所述。例如，对于AAV病毒载体，包装信号是5′反向末端重复序列（ITR）和3′ITR。当包装到AAV衣壳中时，ITR与表达盒一起在本文中被称为rAAV颗粒或衣壳内的“重组AAV（rAAV）基因组”或“载体基因组”。
如本文所用，术语“药物组合物”是指含有治疗剂的混合物，所述治疗剂将被给予受试者，例如哺乳动物，例如人类，以预防、治疗或控制影响或可能影响受试者的特定疾病或状况。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指那些适合与受试者（如哺乳动物（如人））的组织接触的化合物、材料、组合物和/或剂型，而没有与合理的益处/风险比相称的过度毒性、刺激性、过敏反应和其他问题并发症。
如本文中与疾病或病症或患有疾病或病症（例如，SMA）的受试者相关使用的术语“治疗”是指预防或减缓（减轻）不期望的生理变化或病症，抑制、消除、减少和/或改善症状、症状的严重性，和/或与正在治疗的疾病或病症相关的症状的频率。有益或期望的临床结果包括但不限于症状减轻、疾病程度减轻、疾病状态稳定（即不恶化）、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或缓解以及缓解（无论是部分还是全部，无论是可检测的还是不可检测的）。
本文所用的术语“给药”或“施用”及其等同表达是指通过本文所述或本领域已知的方法将治疗组合物或药物组合物递送或促使递送至受试者身体的行为。治疗剂可以是任何物质，例如转基因、载体、肽或病毒。施用治疗性组合物或药物组合物包括开出要递送到受试者体内的治疗性组合物或者药物组合物的处方。示例性给药形式包括口服剂型，例如片剂、胶囊、糖浆、悬浮液；可注射的剂型，例如静脉内（IV）、肌肉内（IM）或腹膜内（IP）；透皮剂型，包括乳膏、果冻、粉末或贴剂；口腔剂型；吸入粉末、喷雾剂、悬浮液和直肠栓剂。
本文中使用的术语“有效量”、“治疗有效量”及其语法等效物是指对受试者单独或作为药物组合物的一部分，以单剂量或一系列剂量的一部分给予药剂，其量能够对任何症状、方面，或疾病、病症或病症的特征。治疗有效量可以通过测量相关的生理作用来确定。所需的确切量因受试者而异，这取决于受试者的年龄、体重和一般状况、正在治疗的状况的严重程度、临床医生的判断等。在任何个别情况下，适当的“有效量”可以由本领域的普通技术人员使用常规实验来确定。
本文参考GenBank编号、GI编号和/或SEQ ID NO描述了示例性基因和多肽。应当理解，本领域技术人员可以通过参考序列源来容易地鉴定同源序列，所述序列源包括但不限于GenBank（ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/）和EMBL（EMBL.org/）。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明公开的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所限定的范围。
实施例1
密码子优化hSMN1基因对1型SMA疾病治疗效果的评估
步骤1 细胞水平上检测密码子优化hSMN1基因后的蛋白表达效果
野生型hSMN1蛋白序列SEQ ID NO: 1如下所示：
MAMSSGGSGGGVPEQEDSVLFRRGTGQSDDSDIWDDTALIKAYDKAVASFKHALKNGDICETSGKPKTTPKRKPAKKNKSQKKNTAASLQQWKVGDKCSAIWSEDGCIYPATIASIDFKRETCVVVYTGYGNREEQNLSDLLSPICEVANNIEQNAQENENESQVSTDESENSRSPGNKSDNIKPKSAPWNSFLPPPPPMPGPRLGPGKPGLKFNGPPPPPPPPPPHLLSCWLPPFPSGPPIIPPPPPICPDSLDDADALGSMLISWYMSGYHTGYYMGFRQNQKEGRCSHSLN。
野生型hSMN1的核苷酸序列SEQ ID NO: 2如下所示：
ATGGCGATGAGCAGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAGGAGGATTCCGTGCTGTTCCGGCGCGGCACAGGCCAGAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGCACTGATAAAAGCATATGATAAAGCTGTGGCTTCATTTAAGCATGCTCTAAAGAATGGTGACATTTGTGAAACTTCGGGTAAACCAAAAACCACACCTAAAAGAAAACCTGCTAAGAAGAATAAAAGCCAAAAGAAGAATACTGCAGCTTCCTTACAACAGTGGAAAGTTGGGGACAAATGTTCTGCCATTTGGTCAGAAGACGGTTGCATTTACCCAGCTACCATTGCTTCAATTGATTTTAAGAGAGAAACCTGTGTTGTGGTTTACACTGGATATGGAAATAGAGAGGAGCAAAATCTGTCCGATCTACTTTCCCCAATCTGTGAAGTAGCTAATAATATAGAACAAAATGCTCAAGAGAATGAAAATGAAAGCCAAGTTTCAACAGATGAAAGTGAGAACTCCAGGTCTCCTGGAAATAAATCAGATAACATCAAGCCCAAATCTGCTCCATGGAACTCTTTTCTCCCTCCACCACCCCCCATGCCAGGGCCAAGACTGGGACCAGGAAAGCCAGGTCTAAAATTCAATGGCCCACCACCGCCACCGCCACCACCACCACCCCACTTACTATCATGCTGGCTGCCTCCATTTCCTTCTGGACCACCAATAATTCCCCCACCACCTCCCATATGTCCAGATTCTCTTGATGATGCTGATGCTTTGGGAAGTATGTTAATTTCATGGTACATGAGTGGCTATCATACTGGCTATTATATGGGTTTCAGACAAAATCAAAAAGAAGGAAGGTGCTCACATTCCTTAAATTAA。
在质粒制备中，考虑hSMN1基因在宿主中表达的密码子偏好、GC含量、RNA二级结构、CpG岛、隐性蛋白等因素，对hSMN1基因进行密码子优化。剪接位点和负调控元件，所得coSMN1序列SEQ ID NO: 3如下所示：
ATGGCCATGAGCTCTGGGGGCTCTGGCGGGGGCGTGCCTGAGCAGGAGGACAGCGTGCTGTTCAGGAGAGGGACTGGCCAGAGCGATGACTCCGACATCTGGGATGACACCGCTCTGATCAAGGCCTACGACAAGGCCGTGGCCAGTTTTAAGCATGCCCTGAAGAACGGGGACATCTGTGAGACCAGCGGCAAGCCTAAGACTACCCCTAAGAGAAAGCCTGCCAAGAAGAATAAGAGCCAGAAGAAGAACACCGCCGCCAGCCTGCAGCAGTGGAAGGTGGGGGATAAGTGCAGCGCCATCTGGAGCGAGGATGGCTGCATCTACCCTGCCACCATTGCCAGCATCGACTTCAAGAGGGAGACCTGTGTGGTGGTGTACACCGGCTATGGGAACAGGGAGGAGCAGAACCTGAGCGATCTGCTGAGCCCCATCTGTGAGGTGGCCAACAACATCGAGCAGAACGCCCAGGAGAACGAGAACGAGAGCCAGGTGTCCACCGATGAGAGCGAGAACAGTAGGAGCCCTGGCAACAAGAGTGACAACATCAAGCCCAAGAGCGCCCCTTGGAACAGCTTTCTGCCTCCTCCCCCTCCCATGCCTGGGCCCAGACTGGGCCCTGGGAAGCCCGGGCTGAAGTTCAATGGGCCTCCTCCCCCACCCCCTCCCCCTCCCCCTCACCTGCTGAGCTGCTGGCTGCCCCCCTTCCCCTCCGGGCCCCCCATCATCCCTCCCCCTCCCCCTATCTGTCCCGATTCCCTGGATGATGCCGATGCCCTGGGGAGCATGCTGATCAGCTGGTATATGAGCGGGTATCACACCGGCTATTACATGGGGTTCAGACAGAACCAGAAGGAGGGGAGGTGCAGCCACAGCCTGAACTGA。
质粒pdsAAV-CB-EGFP（四川大学生物治疗国家重点实验室）作为对照。通过以下方案构建质粒pdsAAV-CB-SMN1和pdsAAV-CB-coSMN1。片段SMN1和coSMN1分别通过PCR从HEK293(CRL-1573，ATCC)的cDNA和含有coSMN1片段的合成质粒(通用生物系统(安徽)有限公司)。
采用PolyJet转染试剂（美国思科生物有限公司，Catalog No.: SL100688）将质粒pdsAAV-CB-EGFP（质粒对照组），pdsAAV-CB-SMN1和pdsAAV-CB-coSMN1分别转染至HEK293T细胞(CRL-3216, ATCC)中，并设置未转染细胞作为细胞对照组，其中每个处理3个重复。待细胞转染后24h，收集细胞并提取细胞总蛋白，并使用蛋白免疫印迹技术检测SMN蛋白的表达水平。结果显示，经密码子优化质粒比野生型质粒在转染的细胞中SMN蛋白水平提高了2倍左右（图1A）。随后，为进一步验证密码子优化的效果，使用含不同质粒的rAAV病毒（scAAV9-EGFP，scAAV9-SMN1和scAAV9-coSMN1）以MOI=75,000的滴度分别感染U-87 MG细胞（HTB-14，ATCC），并于48 h后通过蛋白免疫印迹技术或免疫荧光技术检测SMN蛋白的表达。其中，蛋白免疫印迹结果表明，与未处理或感染对照质粒（scAAV9-EGFP）的细胞相比，使用scAAV9-SMN1感染的细胞中SMN蛋白水平有少量增加，而感染scAAV9-coSMN1的细胞中蛋白水平均明显升高（图1B）。而免疫荧光结果也同样表明，与未处理和感染scAAV9-SMN1的细胞相比，在感染scAAV9-coSMN1细胞的细胞核中，gems的数量均明显增多（图1C）。DAPI，SMN分别是指染色的DAPI抗体或者SMN抗体，Merge是指这两个抗体合在一起的图片，Zoom是区域图。综上所述，密码子优化治疗基因hSMN1不仅能够增加细胞中SMN蛋白的表达水平，而且可在细胞核中形成更多的gems，为SMA疾病的治疗奠定了基础。
步骤2 密码子优化hSMN1基因对1型SMA疾病小鼠模型治疗效果的评估
采用面静脉注射方式将rAAV基因治疗药物（未密码子优化的scAAV9-SMN1和密码子优化的scAAV9-coSMN1，5×10^10 vg/只）注射至出生后第1天（1天龄）的1型SMA疾病小鼠（SMNΔ7或SMA）模型中，并检测治疗后的小鼠表型（体型和体重）、运动功能（平面翻正试验评估小鼠从仰卧位翻转双脚的运动能力；后肢悬吊试验评估小鼠的后肢力量；负趋地性试验评估小鼠的运动协调性）、运动神经元变化以及生存曲线等指标，以探究密码子优化hSMN1基因对治疗1型SMA疾病模型小鼠的有效性。首先，小鼠表型结果显示，经密码子优化后的rAAV基因治疗药物处理的SMA小鼠的体型（图2A）和体重（图2B）均明显大于未经密码子优化rAAV基因治疗药物处理的SMA小鼠。其次，与未治疗SMA小鼠的运动功能相比，经rAAV基因治疗药物处理的SMA小鼠的运动功能均有所恢复，且经密码子优化的rAAV基因治疗药物治疗的SMA小鼠的运动功能恢复情况更好（图3A-3C）。此外，经rAAV基因治疗药物处理后11天的小鼠运动神经元尼氏染色结果也同样表明，使用密码子优化rAAV基因治疗药物处理的SMA小鼠的脊髓颈膨大处（图4A-4D）和腰骶膨大处（图4E-4H）的运动神经元明显多于未经密码子优化rAAV基因治疗药物处理的SMA小鼠。最后，SMA小鼠的生存曲线结果显示，未处理的SMA小鼠的平均寿命为15.7 ± 2.5天（中位生存期= 15.5天），通过scAAV9-SMN1（5×10^10vg/只）治疗后的SMNΔ7小鼠的平均寿命延长至26.1±4.0天（中位生存期= 25天），而使用scAAV9-coSMN1（5×10^10 vg/只）处理的SMNΔ7小鼠平均寿命为52.1 ± 25.7天（中位生存期= 51.5天），其中最长存活时间可延长至101天（图5）。以上结果表明，密码子优化hSMN1基因能够明显改善SMA小鼠的表型、运动功能、运动神经元以及存活时间等。
实施例2
小分子化合物给药时间的探究
首先，采用面静脉注射方式将rAAV9-Luciferase（5×10^10 vg/只）或PBS（负对照）递送至出生后第1天（1天龄）的小鼠（基因型为SMN2+/+, Smn+/+, Δ7SMN+/+，#005025，Jackson laboratory）体内。其次，于注射后的24小时、48小时、72小时和96小时时腹腔注射Luciferase底物（15 mg/g），并将小鼠放置到含有异氟烷的麻醉盒中。待小鼠被完全麻醉后（约5 min），转移至活体成像仪。随后设置活体成像仪的成像参数，在距离Luciferase底物注射10 min时点击开始成像。结果显示，与rAAV注射后24 小时的生物发光强度相比，48小时时的生物发光强度显著增加，此后的生物发光强度虽有波动，但均与48小时无显著性差异（图6A和6B）。因此，将小分子化合物的给药时间设置为rAAV基因治疗药物给药后的第2，3，4天。
其次，测量各实验组小鼠体重发现，自小鼠出生后第10天开始，单独使用rAAV基因治疗药物（rAAV单独治疗组）治疗的SMA小鼠的体重显著高于单独使用小分子化合物（RG7916单独治疗组）治疗的SMA小鼠的体重；而与单独药物治疗组相比，使用两种药物的半剂量联合治疗[rAAV (2.5×1010 vg)+RG7916 (1.5 mg/kg)联合治疗组)]与使用两种药物的全剂量联合治疗[rAAV (5×1010 vg)+RG7916 (3 mg/kg)联合治疗组)]的SMA小鼠的体重皆有进一步提高，虽存在波动，但整体较单独使用rAAV基因治疗药物与单独使用小分子化合物治疗的SMA小鼠的体重存在明显上升（图7）。该结果表明，小分子化合物RG7916的前期短暂补充可在一定程度上挽救SMA小鼠的表型。
另外，小鼠尾巴长度的测量结果发现，自小鼠出生后第10天开始，单独使用rAAV基因治疗药物（rAAV单独治疗组）治疗的SMA小鼠的尾巴长度显著高于单独使用小分子化合物（RG7916单独治疗组）治疗的SMA小鼠的尾巴长度，而与使用两种药物的半剂量联合治疗[rAAV (2.5×1010 vg)+RG7916 (1.5 mg/kg)联合治疗组)]SMA小鼠的尾巴长度无显著性差异。然而，使用两种药物的全剂量联合治疗[rAAV (5×1010 vg)+RG7916 (3 mg/kg)联合治疗组)]的SMA小鼠的尾巴长度均显著高于以上三个治疗组的SMA小鼠，且与野生型小鼠（Wild-type, WT）无显著性差异（图8）。该结果进一步表明，小分子化合物RG7916的前期短暂补充可在一定程度上挽救SMA小鼠的表型。
对于存活时间而言，与未治疗的SMA小鼠相比，通过rAAV基因治疗药物或小分子化合物RG7916治疗的小鼠的平均存活时间显著增加[16.4 ± 2.37天(未治疗组) vs 52.1± 25.68天(rAAV单独治疗组) vs 30.6 ± 10.30天(RG7916单独治疗组)]。然而，与单独药物治疗组相比，使用联合治疗的SMA小鼠的平均存活时间可进一步延长{78.1±30.39天[rAAV (2.5×1010 vg)+RG7916 (1.5 mg/kg)联合治疗组]和60±16.18天[rAAV (5×1010vg)+RG7916 (3 mg/kg)联合治疗组]}（图9）。该结果表明小分子化合物和rAAV基因治疗药物的联合治疗方案能够进一步延长SMA小鼠的存活时间。
随后，通过平面翻正、后肢悬吊以及负趋地性等试验分别对治疗后小鼠从仰卧位翻转双脚的运动能力、运动协调性以及后肢力量进行评估，以进一步评价联合治疗方案的有效性。考虑到使用半剂量的小分子化合物和rAAV基因治疗药物方案组的尾长[rAAV (2.5×1010 vg)+RG7916 (1.5 mg/kg)联合治疗组]增加不显著（图8），因此仅对使用全剂量的小分子化合物和rAAV基因治疗药物方案治疗的SMA小鼠[rAAV (5×1010 vg)+RG7916 (3 mg/kg) 联合治疗组]的运动功能进行评估。其中，平面翻正试验结果显示，使用联合方案治疗的SMA小鼠[rAAV (5×1010 vg)+RG7916 (3 mg/kg)联合治疗组]在出生后12天时基本可达到迅速翻正的效果，而单独使用rAAV基因治疗药物或小分子化合物治疗的SMA小鼠需在出生后15和16天才可基本达到该效果（图10A）。其次，后肢悬吊试验结果与负趋地性试验结果也同样发现使用联合治疗的SMA小鼠的后肢力量评分（PND13 vs PND17 vs PND21）和运动协调性（PND12 vs PND14 vs PND 18）也整体优于rAAV基因药物和小分子治疗药物RG7916的单独治疗组，且未观察到明显的波动（图10B-10C）。因此，小分子化合物RG7916和rAAV基因治疗药物的联合治疗方案更有利于SMNΔ7小鼠运动功能的恢复。
综上所述，与单独使用rAAV基因治疗药物或小分子化合物RG7916的治疗方案相比，小分子化合物RG7916和rAAV基因治疗药物联合使用的方案更能帮助改善SMA小鼠的表型、运动功能以及存活时间等指标，为后续SMA疾病的治疗提供了更有效的策略。
实施例3
小分子化合物与anti-CD4介导的二次注射rAAV基因治疗药物方案对SMA疾病治疗作用的评价。
前期研究发现仅在出生后第一天（1天龄）和第二天（2天龄）的新生小鼠体内可以实现rAAV9的二次注射，因此采用流式细胞术分析检测出生后第1天（1天龄）、第2天（2天龄）、第3天（3天龄）、第4天（4天龄）以及第14天（14天龄）的小鼠脾脏（图11A）和外周血（图12A）中主要负责特异性免疫应答的T细胞亚群（CD3细胞、CD4细胞和CD8细胞）的分布情况，并分析比较不同年龄新生小鼠T细胞亚群的分布是否具有差异。结果显示，出生后第1天（1天龄）、第2天（2天龄）、第3天（3天龄）、第4天（4天龄）以及第14天（14天龄）的新生小鼠脾脏中的CD3细胞比例（图11B）和CD8细胞比例（图11D）均无显著性差异，CD4细胞比例（图11C）出现了显著性差异：出生后第1天（1天龄）和第2天（2天龄）的新生小鼠脾脏的CD4细胞比例均无显著性差异，而第3天（3天龄）及以后（>3天龄）的小鼠体内的CD4细胞比例具有显著性差异；出生后第1天（1天龄）、第2天（2天龄）、第3天（3天龄）、第4天（4天龄）以及第14天（14天龄）的新生小鼠外周血中的CD3细胞比例（图12B）和CD8细胞比例（图12D）均无显著性差异，CD4细胞比例（图12C）同样出现了显著性差异：出生后第1天（1天龄）和第2天（2天龄）的新生小鼠外周血的CD4细胞比例均无显著性差异，而第3天（3天龄）及以后（>3天龄）的小鼠体内的CD4细胞比例具有显著性差异；可以得出CD4细胞是影响新生小鼠能否实现rAAV9二次注射的主要免疫细胞类型。
首先使用CD4单克隆抗体（Selleck, A2101）对原本不能实现rAAV9二次注射的出生后第4天（4天龄）小鼠体内的CD4细胞进行清除。24小时后采用面静脉注射方式一次注射ssAAV9-Antares（5×1010 vg/只），并于一次注射后的第30天采用尾静脉的方式二次注射ssAAV9-Luciferase（5×1011 vg/只）。一次注射PBS的小鼠作为阳性对照（PBS，一次成像时的阴性对照），一次注射ssAAV9-Antares且未清除CD4细胞的小鼠作为阴性对照（同型抗体处理，Rat IgG2b isotype control-InVivo, Selleck, A2116）。抗体检测结果显示，使用Anti-Mouse CD4处理的小鼠血清中几乎无AAV9特异性结合抗体产生，而使用同型抗体处理的小鼠血清中都产生了大量抗体（图13）。小鼠成像结果也同样发现，一次注射ssAAV9-Antares的小鼠体内在4周后均可检测到Antares发光，而二次注射ssAAV9-Luciferase的小鼠仅在使用 Anti-Mouse CD4处理的小鼠体内可以观察到Luciferase发光（图14）。该结果进一步表明使用CD4免疫细胞特异的单克隆抗体在小鼠一次注射rAAV前进行CD4细胞耗竭的方式可成功在出生后第五天新生小鼠体内实现rAAV9载体的二次注射。
实施例4
小分子化合物与anti-CD4介导的二次注射rAAV基因治疗药物对PND5的SMA疾病小鼠模型治疗效果的评估
首先，SMA小鼠在出生后第4天通过腹腔注射CD4单克隆抗体（Selleck, A2101, 3mg/kg），出生后第5天采用面静脉注射的方式注射rAAV基因治疗药物（scAAV9-coSMN1, 5×1010 vg/只）。其次，在其出生后的第6、7、8天，每天通过腹腔注射的方式注射小分子化合物RG7916（ MCE, HY-109101, 3 mg/kg）。随后，通过监测小鼠的体重和生存曲线等指标对该方案的治疗效果进行评估，并设置使用小分子化合物与一次注射rAAV基因治疗药物治疗的PND5天SMA小鼠作为对照组（scAAV9-coSMN1+RG7916）。
小鼠体重结果显示，与小分子化合物与一次注射rAAV基因治疗药物治疗的PND5天SMA小鼠（scAAV9-coSMN1+RG7916）相比，小分子化合物与二次注射rAAV基因治疗药物治疗的PND5天SMA小鼠（2×scAAV9-coSMN1+RG7916）自二次注射后观察到明显的差异，且在40天时体重约增加到两倍（6.565 g vs 11.909 g）（图15）。因此，该结果表明小分子化合物与anti-CD4介导的二次注射rAAV基因治疗药物的方案更有利于拯救错过最佳“治疗窗口”的SMA小鼠（最佳“治疗窗口”为出生后前2天）的体重。
对于存活时间而言，与小分子化合物与一次注射rAAV基因治疗药物治疗的PND5天SMA小鼠（scAAV9-coSMN1+RG7916），通过小分子化合物与二次注射rAAV基因治疗药物治疗的PND5天SMA小鼠（2×scAAV9-coSMN1+RG7916）的平均存活时间显著增加[37.2± 5.808天(scAAV9-coSMN1+RG7916) vs 83.3± 16.96天(2×scAAV9-coSMN1+RG7916)（图16）。该结果表明小分子化合物和rAAV基因治疗药物的联合治疗方案能够进一步延长SMA小鼠的存活时间。
综上所述，小分子化合物与anti-CD4介导的二次注射rAAV基因治疗药物的方案不仅能够显著改善小鼠的体重和存活时间等指标，也为后续错过最佳“治疗窗口”的SMA患者的治疗提供了更有效的策略。
本领域技术人员将容易理解，本文描述的方法、组合物和产品代表示例性实施方案，并且不旨在限制本公开的范围。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本公开的范围和精神的情况下，可以对本文公开的内容进行各种替换和修改。
说明书中提及的所有专利和出版物均表明本公开所属领域的技术人员的水平。
本公开不限于本申请中描述的具体实施例，这些具体实施例旨在作为本公开的各个方面的单一说明。在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对本公开做出许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开仅由所附权利要求的术语以及此类权利要求所享有的等同物的完整范围来限制。

Claims (10)

1.一种用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物，其特征在于，包含rAAV载体、小分子化合物RG7916和CD4单克隆抗体，所述rAAV载体含有编码运动神经元存活基因1（SMN1）蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
2. 如权利要求1所述的药物组合物，所述编码SMN1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
3. 如权利要求1所述的药物组合物，所述编码SMN1蛋白变异的核苷酸序列为SEQ IDNO：3。
4.如权利要求1所述的药物组合物，所述rAAV载体的血清型是rAAV9。
5.如权利要求1所述的药物组合物，所述rAAV载体是scAAV。
6. rAAV载体、小分子化合物RG7916联合CD4单克隆抗体在制备用于治疗脊髓型肌肉萎缩的药物中的用途，所述rAAV载体含有编码SMN1蛋白的核苷酸或SMN1蛋白变异的核苷酸。
7. 如权利要求6所述的用途，所述编码SMN1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。
8. 如权利要求6所述的用途，所述编码SMN1蛋白变异的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。
9.如权利要求6所述的用途，所述rAAV载体的血清型是rAAV9。
10.如权利要求6所述的用途，所述rAAV载体是scAAV。
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