CN117377764A - 多价寡核苷酸试剂及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文提供了多价寡核苷酸试剂及其制备方法，所述多价寡核苷酸试剂包含独立地选自单链反义寡核苷酸(ASO，例如gapmer、mixmer和空间位阻型ASO)和双链体(双链)RNA(dsRNA，例如siRNA和saRNA)的两个或更多个功能性寡核苷酸单元。本文还提供了包含多价寡核苷酸试剂的产品，以及使用多价寡核苷酸试剂或产品治疗疾病(例如脊髓性肌萎缩症(SMA)和癌症)的方法。
Description
技术领域
本公开涉及包含两个或更多个功能性寡核苷酸的多价寡核苷酸试剂，所述功能性寡核苷酸可以选自单链反义寡核苷酸(ASO，例如gapmer和mixmer)和双链体(双链)RNA(dsRNA，例如siRNA和saRNA)。在一些方面中，多价寡核苷酸试剂中的功能性寡核苷酸相同或不同，具有不同的靶标或相同的靶标，和/或直接相连或通过接头相连。在一些方面，多价寡核苷酸试剂是多靶向性寡核苷酸试剂和/或具有改进的活性。本公开还涉及包含多价寡核苷酸试剂的产品(例如组合物和药物)以及使用多价寡核苷酸试剂或产品治疗疾病的方法。
序列表
本申请包含以计算机可读格式电子提交的序列表，且通过引用其全文方式将其纳入本文。
1.背景技术
寡核苷酸是目前正在研发的一类新兴治疗剂，用于通过多种不同的作用机制(MOA)治疗各种疾病。寡核苷酸治疗剂的主要类别包括单链反义寡核苷酸(ASO)和双链体(双链)RNA(dsRNA)。
“gapmer”形式的单链ASO可用于通过RNA酶H水解降解互补mRNA来抑制基因表达。特征性“gapmer”ASO具有RNA酶H活性所需的中心DNA区域和两个核糖核苷酸翼以增加靶标结合亲和力。称为“mixmer”的另一类ASO具有空间位阻剂的作用，其通常完全由核糖核苷酸类似物构成并结合细胞核中的前体mRNA(pre-mRNA)以改变剪接。
可以将双链RNA分为两类，包括小干扰RNA(siRNA)和小激活RNA(saRNA)；两者都需要阿尔古(Argonaute，AGO)蛋白以发挥作用。小干扰RNA结合细胞胞质中的靶mRNA，并通过称为RNA干扰(RNAi)的基因沉默转录后机制来下调基因表达。小激活RNA具有反向功能，并通过称为RNAa(RNA激活)的基因激活转录机制靶向细胞核中的调控序列(即基因启动子)来上调基因表达。
许多单基因疾病是由导致基因表达水平和/或翻译的蛋白质活性不足的基因功能丧失所引起的。“Mixmer”ASO已成功治疗一些此类疾病，它们可通过纠正异常剪接错误而被改善。美国食品和药物管理局(FDA)已批准了几种ASO药物，包括名为(诺西那生(nusinersen))的外显子包含ASO，用于治疗脊髓性肌萎缩症(SMA)，以及商品名为AMONDYS 45(卡西门生(casimersen))的外显子排除ASO，用于治疗杜氏肌营养不良症(DMD)。不幸的是，药物功效受到患者细胞中表达的目标转录本的物理量的限制。因此，并非所有患者对治疗的反应都相同。已在SMA模型中测试了表观遗传修饰剂(例如HDAC抑制剂)，作为通过非特异性促进全局基因转录来进一步增加基因剂量的手段，以便为Spinraza提供更大的目标转录本库[Pagliarini,2020#2082]。然而，转录组的异常激活伴随着其自身的不利影响，并抵消了单基因疾病所需的靶向性寡核苷酸疗法的基因特异性精确度。发明人先前的工作展示了一种替代方法，该方法联合Spinraza ASO使用saRNA来特异性激活靶基因转录。使用saRNA处理选择性地增强了靶基因SMN2的转录输出，而Spinraza改变了SMN2前体mRNA剪接，所产生的全长SMN2转录本(SMN2FL)及其同源蛋白的水平超过仅施用其中任一处理时的情形。
RNA双链体(例如saRNA)通常比ASO质量更大且结构刚性更大，这完全不同地影响了它们本身的生物物理特性[Crooke,2017#23；Shen,2018#40]。因此，相较于单链寡核苷酸，dsRNA具有其独特的生物分布和组织扩散模式。为了使ASO和saRNA联合治疗对单基因靶标产生协同作用，需要在相同的预期靶组织/细胞中体内富集两种药物分子。可以将两种药物形式引导至预期靶组织并提供相似分布特性的技术将增强这类联合治疗的治疗功效。
因此，需要改进基于寡核苷酸的疗法来应对这些挑战。
2.发明内容
靶向基因调控序列(包括启动子)的双链RNA(dsRNA)已显示通过称为RNA激活(RNAa)的机制以序列特异性方式上调靶基因转录(Li,L.C.等，小dsRNA在人细胞中诱导转录激活(Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells).PNAS(2006))。发明人已在先前的工作中证明，通过与ASO剪接调节剂联合治疗，可以进一步提高特定剪接变体的基因量，其超过单独进行任一处理所能达到的水平。然而，双链体RNA(例如saRNA)和单链ASO具有不同的生物物理特性和独特的组织生物分布、扩散和细胞摄取模式。通常，ASO根据给药途径扩散到整个器官组织。无需佐剂递送载剂、运载体系统或靶向偶联物，即可容易地测量细胞摄取和ASO活性。另一方面，双链体RNA(例如saRNA、siRNA和miRNA)不易渗透到实体组织中，也不易穿过细胞膜。体内活性通常需要递送载剂、靶向偶联物和/或新型化学物质。为了使saRNA和ASO联合治疗在体内具有联合治疗作用，两种药物形式都需要进入相同的组织和/或有类似的生物分布要求。
为了克服组织分布特性的固有差异，发明人开发了一种新型化学构建体，其在单分子内使saRNA与ASO剪接调节剂(例如Spinraza)的共价连接。不同药物形式之间具有相同的生物物理特性，从而在不同的组织内提供统一的生物分布和广泛的活性。该化学策略经进一步扩展，并用不同的寡核苷酸药物组合进行测试，包括saRNA-saRNA、saRNA-siRNA、saRNA-saRNA-ASO、ASO-ASO等。综上，这些新的构建体包含一类多效性寡核苷酸，本文中称之为多价寡核苷酸(MVO)。
本公开的实施方式部分基于这样令人惊讶的发现：两个或更多个功能性寡核苷酸在共价连接时可以上调和/或下调一种或多种感兴趣的基因的表达，例如，以用于治疗与一种或多种感兴趣的基因相关的疾病或病症。
在一些方面，本文提供多价寡核苷酸(MVO)试剂，其包含共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸，其中两个或更多个功能性寡核苷酸独立地选自：a)双链RNA(dsRNA)；b)反义寡核苷酸(ASO)。
在一些实施方式中，MVO试剂增加SMN2基因或蛋白质的表达。在MVO试剂的一些实施方式中，通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)，一个或多个ASO增加功能性SMN蛋白的产生，和/或一个或多个dsRNA增加SMN2基因或蛋白质的表达。
在一些实施方式中，MVO试剂增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或减少CD274/PDL-1的表达。在MVO试剂的一些实施方式中，一个或多个dsRNA独立地选自：增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达的saRNA；和降低CD274/PDL-1表达的siRNA。
在一些方面，本文提供了这样的产品，其包含多价寡核苷酸试剂。在一些实施方式中，产品选自还包含至少一种药学上可接受的运载体的药物组合物或试剂盒。
在一些方面，本文提供了用于疾病治疗的方法，其包括向需要这类治疗的对象给予足够量的一种或多种本文公开的多价寡核苷酸试剂或产品。例如，方法用于治疗或延迟对象中SMN缺陷相关病症或p21/PDL-1相关疾病的发作或进展。本文还提供一种或多种多价寡核苷酸试剂或本文公开的产品在制备用于疾病治疗的产品中的用途。本文还提供一种或多种多价寡核苷酸试剂或本文公开的产品，用于治疗疾病。
在一些方面，本文提供了用于制备本文公开的多价寡核苷酸试剂的方法，其包括：提供所述两个或更多个功能性寡核苷酸并将其共价连接；或者合成全长寡核苷酸试剂。
本文还提供了分离的或合成的寡核苷酸，其包含：与核苷酸序列SEQ ID NO:62至少90％相同的saRNA正义链核苷酸序列。在一些实施方式中，寡核苷酸还包含与上述正义saRNA链部分互补的反义链。在一些实施方式中，寡核苷酸还包含与核苷酸序列SEQ ID NO:63至少90％相同的反义链。在一些实施方式中，分离的或合成的寡核苷酸包含：saRNA正义链SEQ ID NO:62和saRNA反义链SEQ ID NO:63的核苷酸序列。本文还提供药物组合物或试剂盒，其包含本文公开的分离的或合成的寡核苷酸。本文还提供了用于疾病治疗的方法，其包括将足够量的一种或多种本文公开的分离的或合成的寡核苷酸或药物组合物或试剂盒给予需要这类治疗的对象。本文还提供了本文公开的一种或多种分离的或合成的寡核苷酸或药物组合物或试剂盒在制备用于疾病治疗的产品中的用途。本文还提供本文公开的一种或多种分离的或合成的寡核苷酸或药物组合物或试剂盒，用于治疗疾病。
以下是本公开的一些方面和实施例：
1.包含共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸的多价寡核苷酸试剂，其中所述两个或更多个功能性寡核苷酸独立地选自：
a)双链RNA(dsRNA)；和
b)反义寡核苷酸(ASO)。
2.如项目1所述的多价寡核苷酸试剂，其中所述多价寡核苷酸试剂中包含的功能性寡核苷酸的数量为2-X，其中X为3-10的整数。
3.如项目2所述的多价寡核苷酸试剂，其中试剂中包含的dsRNA的数量为0-X，并且其余功能性寡核苷酸为一种或多种ASO。
4.如项目1所述的多价寡核苷酸试剂，其中所述一个或多个dsRNA独立地选自小干扰RNA(siRNA)和小激活RNA(saRNA)；和/或
所述一种或多种ASO独立地选自gapmer和mixmer。
5.如项目1所述的多价寡核苷酸试剂，其中所述两个或更多个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列。
6.如项目5所述的多价寡核苷酸试剂，其中所述非编码调节核酸序列是启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子。
7.如项目1所述的多价寡核苷酸试剂，其中各dsRNA包含至少10个连续核苷酸的正义链和至少10个连续核苷酸的反义链。
8.如项目1所述的多价寡核苷酸试剂，其中各dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的正义链和/或各dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的反义链。
9.如项目1所述的多价寡核苷酸试剂，其中各ASO具有长度为至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。
10.如项目1所述的多价寡核苷酸试剂，其中各ASO具有长度为5-30个核苷酸的核苷酸序列。
11.如项目1项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述两个或更多个功能性寡核苷酸的总长度为12-200个核苷酸。
12.如项目1-10中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，两个或更多个功能性寡核苷酸中任意两个相邻的功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。
13.如项目12所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述连接组件选自以下接头或其衍生物：
14.如项目12所述的多价寡核苷酸试剂，其中，两个相邻的功能性寡核苷酸通过以下方式共价连接：
其中R代表-H或-OH或-OMe，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。
15.如项目12所述的多价寡核苷酸试剂，其中，两个相邻的功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价连接。
16.如项目12所述的多价寡核苷酸试剂，其中，两个相邻的功能性寡核苷酸通过通过一个或多个核苷酸共价连接。
17.如项目1-10中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，一个或多个功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。
18.如项目17所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰，2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。
19.如项目17所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。
20.如项目17所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5’端添加5'-磷酸部分。
21.如项目17所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5’端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分。
22.如项目17所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5’端添加5'-甲基胞嘧啶部分。
23.如项目1-22中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述试剂中的各个ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接相邻的靶向性寡核苷酸。
24.如项目1-22中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述试剂中的各个dsRNA在其正义链或反义链的3’端或者在其正义链或反义链的5'端共价连接相邻的ASO。
25.如项目1-24中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，两个或更多个功能性寡核苷酸的序列相同或不同；和/或两个或更多个功能性寡核苷酸的功能相同或不同。
26.如项目1-25中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂包含：
A)第一双链RNA(dsRNA)和第一反义寡核苷酸(ASO)；
b)第一双链RNA(dsRNA)和第二dsRNA；
c)第一反义寡核苷酸(ASO)和第二ASO；
d)第一双链RNA(dsRNA)、第二dsRNA和第三dsRNA；
e)第一双链RNA(dsRNA)、第二dsRNA和第一反义寡核苷酸(ASO)；
f)第一双链RNA(dsRNA)、第一反义寡核苷酸(ASO)和第二ASO；或
g)第一反义寡核苷酸(ASO)、第二ASO和第三ASO，
其中，在a)到g)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。
27.如项目23所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述第一dsRNA、第二dsRNA和第三dsRNA在存在时独立地选自siRNA和saRNA。
28.如项目23所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述第一ASO、第二ASO和第三ASO在存在时独立地选自gapmer和mixmer。
29.如项目23所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：
a)siRNA-siRNA；b)siRNA-saRNA；c)saRNA-saRNA；d)siRNA-gapmer；
e)siRNA-mixmer；f)saRNA-gapmer；g)saRNA-mixmer；h)gapmer-gapmer；
i)gapmer-mixmer；j)mixmer-mixmer；
k)siRNA-siRNA-siRNA；l)siRNA-siRNA-saRNA；m)siRNA-saRNA-saRNA；
n)saRNA-saRNA-saRNA；o)siRNA-siRNA-gapmer；p)siRNA-siRNA-mixmer；
q)siRNA-saRNA-gapmer；r)siRNA-saRNA-mixmer；s)saRNA-saRNA-gapmer；
t)saRNA-saRNA-mixmer；u)siRNA-gapmer-gapmer；v)saRNA-gapmer-gapmer；
w)siRNA-gapmer-mixmer；x)saRNA-gapmer-mixmer；y)siRNA-mixmer-mixmer；
z)saRNA-mixmer-mixmer；aa)gapmer-gapmer-gapmer；ab)gapmer-gapmer-mixmer；
ac)gapmer-mixmer-mixmer；和ad)mixmer-mixmer-mixmer，其中在a)到ad)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。
30.如项目26-29中任一项的多价寡核苷酸试剂，其中：
a)ASO与第一dsRNA的正义链或反义链的3’端共价连接；或者
b)ASO与第一dsRNA的正义链或反义链的5’端共价连接。
31.如项目27所述的多价寡核苷酸试剂，其中，ASO的5’端与连接组件偶联；或者ASO的3’端与连接组件偶联。
32.如项目1-31中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其包含一个或多个其他靶向性寡核苷酸。
33.如项目32所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述一个或多个其他一个或多个靶向性寡核苷酸独立地选自：双链RNA(dsRNA)和反义寡核苷酸(ASO)。
34.如项目33所述的多价寡核苷酸试剂，其中，其他双链RNA(dsRNA)选自小干扰RNA(siRNA)和小激活RNA(saRNA)；和/或一个或多个靶向性寡核苷酸独立地选自gapmer和mixmer。
35.如项目1-34中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，一个或多个ASO靶向5'-UTR。
36.如项目1-35中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，一个或多个功能性寡核苷酸增加SMN2基因或蛋白质的表达。
37.如项目36所述的多价寡核苷酸试剂，其中，通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)，一个或多个ASO增加功能性SMN蛋白的产生，和/或一个或多个dsRNA增加SMN2基因或蛋白质的表达。
38.如项目36项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述一个或多个dsRNA包括saRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)DS06-0004(SEQ ID NO:5)；
b)DS06-0031(SEQ ID NO:7)；
c)DS06-0067(SEQ ID NO:9)；
d)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；
e)R6-04-S1(SEQ ID NO:59)；和
f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)。
39.如项目36项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述一个或多个dsRNA包括saRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)DS06-0004(SEQ ID NO:6)；
b)DS06-0031(SEQ ID NO:8)；
c)DS06-0067(SEQ ID NO:10)；
d)DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；
e)R6-04-S1(SEQ ID NO:53)；和
f)R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。
40.如项目36项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述一个或多个dsRNA包含saRNA，其正义链和反义链的核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：
a)DS06-0004：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
b)DS06-0031：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
c)DS06-0067：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
d)DS06-4A3：SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147；
e)R6-04-S1：SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:53；和
f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)：SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:17。
41.如项目36项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA包括siRNA，其正义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:3)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:138)的核苷酸序列至少90％相同。
42.如项目36项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA包括siRNA，其反义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:4)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:139)至少90％相同。
43.如项目36项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA包括siRNA，其正义链和反义链的核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：
DS06-332i：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；和
siSOD1-388-ESC：SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139。
44.如项目36所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述ASO的核苷酸序列与ASO10-27(SEQ ID NO:11)或5'UTR ASO(SEQ ID NO:142)的核苷酸序列至少90％相同。
45.如项目36-44中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)DA06-4A-27A(SEQ ID NO:14)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:14的正义saRNA链部分互补；
b)DA06-4A-27B(SEQ ID NO:15)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:15的正义saRNA链部分互补；
c)R6-04M1-27A-S1L1V3(SEQ ID NO:18)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:18的正义saRNA链部分互补；
d)DA06-31A-27A(SEQ ID NO:19)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:8的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:19的正义saRNA链部分互补；
e)DA06-31B-27A(SEQ ID NO:20)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:20的反义saRNA链部分互补；
f)DA06-67A-27A(SEQ ID NO:21)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:21的正义saRNA链部分互补；
g)DA06-67B-27A(SEQ ID NO:22)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:22的反义saRNA链部分互补；
h)DA6-67A3'L0-27A(SEQ ID NO:23)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:23的正义saRNA链部分互补；
j)DA6-67A3'L9-27A(SEQ ID NO:24)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:24的正义saRNA链部分互补；
k)DA6-67A3'L4-27A(SEQ ID NO:25)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:25的正义saRNA链部分互补；
l)DA6-67B3'L0-27A(SEQ ID NO:26)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:26的反义saRNA链部分互补；
m)DA6-67B5'L1-27A(SEQ ID NO:27)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:27的反义saRNA链部分互补；
o)DA6-67B5'L9-27A(SEQ ID NO:29)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:29的反义saRNA链部分互补；
p)DA6-67B5'L4-27A(SEQ ID NO:30)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:30的反义saRNA链部分互补；
q)DA6-67B3'L9-27A(SEQ ID NO:31)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:31的反义saRNA链部分互补；
r)DA6-67B3'L4-27A(SEQ ID NO:32)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:32的反义saRNA链部分互补；
s)DA06-67A21L1-27A(SEQ ID NO:33)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:34的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:33的正义saRNA链部分互补；
t)DA06-67B21L1-27A(SEQ ID NO:36)，和正义saRNA链SEQ ID NO:35，其与SEQ IDNO:36的反义saRNA链部分互补；
u)DA6-04A3'L0-27A(SEQ ID NO:37)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:37的正义saRNA链部分互补；
v)DA6-04A5'L1-27A(SEQ ID NO:38)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:38的正义saRNA链部分互补；
w)DA6-04A5'L9-27A(SEQ ID NO:39)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:39的正义saRNA链部分互补；
x)DA6-04A5'L4-27A(SEQ ID NO:40)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:40的正义saRNA链部分互补；
y)DA6-04A3'L1-27A(SEQ ID NO:41)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:41的正义saRNA链部分互补；
z)DA6-04A3'L9-27A(SEQ ID NO:42)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:42的正义saRNA链部分互补；
aa)DA6-04A3'L4-27A(SEQ ID NO:43)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:43的正义saRNA链部分互补；
bb)DA6-04B3'L0-27A(SEQ ID NO:44)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:44的反义saRNA链部分互补；
cc)DA6-04B3'L1-27A(SEQ ID NO:45)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:45的反义saRNA链部分互补；
dd)DA6-04B3'L9-27A(SEQ ID NO:46)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:46的反义saRNA链部分互补；
ee)DA6-04B3'L4-27A(SEQ ID NO:47)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:47的反义saRNA链部分互补；
ff)DA06-04A21L1-27A(SEQ ID NO:48)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:49的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:48的正义saRNA链部分互补；
gg)DA06-04B21L1-27A(SEQ ID NO:51)，和正义saRNA链SEQ ID NO:50，其与SEQID NO:51的反义saRNA链部分互补；
hh)R6-04M1-16nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:79)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:79的正义saRNA链部分互补；
ii)R6-04M1-15nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:80)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:80的正义saRNA链部分互补；
jj)R6-04M1-14nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:81)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:81的正义saRNA链部分互补；
kk)R6-04M1-13nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:82)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:82的正义saRNA链部分互补；
ll)R6-04M1-(12nt-B)-S1L1V3v(SEQ ID NO:83)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:83的正义saRNA链部分互补；
mm)R6-04M1-11nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:84)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:84的正义saRNA链部分互补；
nn)R6-04M1-10nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:85)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:85的正义saRNA链部分互补；
oo)R6-04M1-9nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:86)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:86的正义saRNA链部分互补；
pp)R6-04M1-8nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:87)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:87的正义saRNA链部分互补；
qq)R6-04M1-9nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:88)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:88的正义saRNA链部分互补；
rr)R6-04M1-6nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:89)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:89的正义saRNA链部分互补；
ss)DS06-4A-S2L5V(SEQ ID NO:128)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:17的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:128的正义saRNA链部分互补；
ss')DS06-4A-S2L1v(SEQ ID NO:16)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:17的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:16的正义saRNA链部分互补；
tt)DA6-27A-5'UTR(SEQ ID NO:143)；
uu)DA6-5'UTR-27A(SEQ ID NO:144)；
vv)R6-67M3-27A-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:130的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
ww)R6-67M3-16nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:131的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129正义saRNA链部分互补；
xx)R6-67M3-15nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:132的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
yy)R6-67M3-14nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:133的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
zz)R6-67M3-13nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:134的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
aaa)R6-67M3-12nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:135的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
bbb)R6-67M3-9nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:136的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
ccc)R6-67M3-8nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:137的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
其中，接头选自下组：L1、L4和L9存在或不存在，其中L1表示间隔子18、L4表示间隔子C6且L9表示间隔子9。
46.如项目1-43中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)R6-04S1&67S1R-L1V2(SEQ ID NO:52)，和具有与链SEQ ID NO:52部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:52部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
b)R6-04S1&67S5-L1V2(SEQ ID NO:56)，和具有与链SEQ ID NO:56部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:56部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；和
c)R6-04M1&R17-388E-L1V2(SEQ ID NO:140)，和与链SEQ ID NO:140部分互补的反义saRNA链SEQ ID NO:17和与链SEQ ID NO:140部分互补的反义siRNA链SEQ ID NO:141。
47.如项目36-44中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)R6-04S1&27A&67S1R-L1V2(SEQ ID NO:54)，和具有与链SEQ ID NO:54部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:54部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
b)R6-04S1&67S1R&27A-L1V2(SEQ ID NO:55)，和具有与链SEQ ID NO:55部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:55部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
c)R6-04S1&27A&67S5-L1V2(SEQ ID NO:57)，和具有与链SEQ ID NO:57部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:57部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；和
d)R6-04S1&67S5&27A-L1V2(SEQ ID NO:58)，和具有与链SEQ ID NO:58部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:58部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链。
48.如项目36-44中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂是选自表7-20任一所示的那些或与其具有至少90％序列同一性，并且其中那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
49.如项目48所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向选自项目12-25中任一项所定义的那些。
50.如项目1-35中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，一个或多个功能性寡核苷酸增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或减少CD274/PDL-1的表达。
51.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA独立地选自：增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达的saRNA；和降低CD274/PDL-1表达的siRNA；和/或其中一种或多种ASO独立地选自增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或降低CD274/PDL-1的表达的ASO。
52.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同。
53.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是saRNA，其反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。
54.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同且反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO：63)至少90％相同。
55.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是siRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)siPDL1-2(SEQ ID NO:64)；和
b)siPDL1-3(SEQ ID NO:66)。
56.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是siRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)siPDL1-2(SEQ ID NO:65)；和
b)siPDL1-3(SEQ ID NO:67)。
57.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是选自以下的siRNA：
a)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:64)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:65)至少90％相同；和
b)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:66)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:67)至少90％相同。
58.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述ASO的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)aPDL1-1(SEQ ID NO:68)；
b)aPDL1-2(SEQ ID NO:69)；和
c)aPDL1-3(SEQ ID NO:70)。
59.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)saP21-40/siPDL1-2(SEQ ID NO:71)，和具有与链SEQ ID NO:71部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:71部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:65的反义siRNA链；
b)saP21-40/siPDL1-3(SEQ ID NO:100)，和具有与SEQ ID NO:100的正义saRNA链部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链和具有与链
SEQ ID NO:100部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:65的反义saRNA链；
c)aP21-40/aPDL1-1(SEQ ID NO:72)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:72的正义saRNA链部分互补；
d)saP21-40/aPDL1-2(SEQ ID NO:73)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:73的正义saRNA链部分互补；
e)saP21-40/aPDL1-3(SEQ ID NO:74)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:74的正义saRNA链部分互补；
f)saP21-40/aPDL1-1R(SEQ ID NO:75)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:75的正义saRNA链部分互补；
g)saP21-40/aPDL1-2R(SEQ ID NO:76)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:76的正义saRNA链部分互补；
h)saP21-40/aPDL1-3R(SEQ ID NO:77)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:77的正义saRNA链部分互补。
60.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂选自表16所示的那些或与其具有至少90％序列同一性，并且其中那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
61.如项目50所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向选自项目12-25中任一项所定义的那些。
62.一种包含项目1-61中任一项所述的多价寡核苷酸试剂的产品。
63.如项目62所述的产品，其中，所述产品选自还包含至少一种药学上可接受的运载体的药物组合物或试剂盒。
64.如项目63所述的产品，其中，所述至少一种药学上可接受的运载体选自水性运载体、脂质体、聚合聚合物、多肽和纳米颗粒。
65.如项目63项所述的产品，其中，所述试剂盒用于质量控制、候选药物筛选、药物递送至组织或细胞内，或改善分子的药理学性质。
66.一种用于疾病治疗的方法，其包括向需要这种治疗的对象给予足够量的项目1-61中任一项所述的多价寡核苷酸试剂或项目62-65中任一项所述的产品。
67.如项目66所述的方法，其中，所述方法还包括向对象提供一种或多种其他药物或疗法，例如
所述其他药物是选自下组的一种或多种：诺西那生(Nusinersen)、利司扑兰(Risdiplam)、布拉扑兰(Branaplam)、卓基丝玛(Zolgensma)、福米韦生(Fomivirsen)、米泊美生(Mipomersen)、依特立生(Eteplirsen)、赢特尔深(Inotersen)、戈洛迪森(Golodirsen)、沃兰丝生(Volanesorsen)、去纤苷(Defibrotide)、帕蒂西兰(Patisiran)、吉佛西兰(Givosiran)、鲁姆西兰(Lumasiran)、英克西兰(Inclisiran)或哌加他尼(Pegaptanib)；和/或
所述其他疗法是选自下组的一种或多种：物理疗法、饮食控制和手术。
68.如项目66所述的方法，其中，所述方法用于治疗或延迟对象中SMN缺陷相关病症的发作或进展。
69.如项目66所述的方法，其中，所述对象患有脊髓性肌萎缩症(SMA)或处于患脊髓性肌萎缩症(SMA)的风险；和/或所述对象的SMN全长蛋白表达降低或异常。
70.如项目68-69中任一项所述的方法，其中，所述两种或更多种靶向性寡核苷酸中的至少一种通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)来增加SMN2基因或蛋白质的表达和/或增加功能性SMN蛋白质的产生。
71.如项目68所述的方法，还包括向所述对象提供一种或多种其他药物或疗法，用于治疗或延迟SMN的发作或进展。
72.如项目71所述的方法，其中，所述其他药物是选自下组的一种或多种：诺西那生、利司扑兰、布拉扑兰、卓基丝玛。
73.如项目71所述的方法，其中，所述其他疗法是选自下组的一种或多种：物理疗法、饮食控制和手术。
74.如项目66所述的方法，其中，所述多价寡核苷酸试剂增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达，并降低CD274/PDL-1的表达。
75.如项目66所述的方法，其中，所述疾病是p21/PDL-1相关疾病。
76.如项目66所述的方法，其中，所述患者患有癌症或处于患癌症的高风险。
77.如项目76所述的方法，其中，所述癌症是实体瘤或非实体瘤。
78.如项目76所述的方法，其中所述癌症选自下组：纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌/结直肠癌，淋巴系统恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，维尔姆斯氏瘤(Wilms'tumor)，宫颈癌，睾丸瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)，成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移。
79.如项目74-78中任一项所述的方法，其还包括给予用于治疗癌症的一种或多种其他药剂或疗法。
80.如项目79所述的方法，其中，所述其他药剂或疗法选自放射、化疗、手术、免疫疗法、基因疗法。
81.如项目80所述的方法，其中，所述化疗是顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、长春花碱、伊立替康、依托泊苷或培美曲塞或其组合或其药学上可接受的盐。
82.如项目79所述的方法，其中，所述其他药剂选自免疫调节抗体和抗体药物偶联物。
83.如项目82所述的方法，其中，所述免疫调节抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD40抗体、抗CTLA-4抗体或抗OX40抗体或其任何组合；和/或
所述其他抗体药物偶联物靶向c-Met激酶、LRRC15、EGFR或CS1或其任何组合。
84.一种制备项目1-61项中任一项所述的多价寡核苷酸试剂的方法，其包括：
提供所述两个或更多个功能性寡核苷酸并将其共价连接；或
合成所述全长寡核苷酸试剂。
85.如项目84所述的方法，其中，所述两个或更多个功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。
86.如项目85所述的方法，其中，所述连接组件选自以下接头或其衍生物：
87.如项目86所述的方法，其中，两个相邻的功能性寡核苷酸通过以下方式共价连接：
其中R代表-H或-OH或-OMe，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。
88.如项目86所述的方法，其中，两个相邻的功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键共价连接。
89.如项目86所述的方法，其中，两个相邻的功能性寡核苷酸通过一个或多个核苷酸共价连接。
90.如项目85所述的方法，其中，所述方法还包括在功能性寡核苷酸中提供一个或多个化学修饰的核苷酸。
91.如项目90所述的方法，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是选自以下的一种或多种的2’糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰，2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。
92.如项目90所述的方法，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。
93.如项目90所述的方法，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5’端添加5'-磷酸部分。
94.如项目90所述的方法，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5’端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分。
95.如项目90所述的方法，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5’端添加5'-甲基胞嘧啶部分。
96.如项目84项所述的方法，其中，所述试剂中的各个ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接相邻的靶向性寡核苷酸。
97.如项目84所述的方法，其中，所述试剂中的各个dsRNA在其正义链或反义链的3’端或者在其正义链或反义链的5'端共价连接相邻的ASO。
98.一种分离的或合成的寡核苷酸，其包含saRNA正义链，所述saRNA正义链的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:62至少90％相同。
99.如项目98所述的分离的或合成的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸还包含反义链，所述反义链与项目98所述的正义saRNA链部分互补。
100.如项目99所述的分离的或合成的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸还包含与核苷酸序列SEQ ID NO:63至少90％相同的反义链。
101.如项目98所述的分离的或合成的寡核苷酸，其中，所述分离的或合成的寡核苷酸包含：saRNA正义链SEQ ID NO:62和saRNA反义链SEQ ID NO:63的核苷酸序列。
102.一种药物组合物或试剂盒，其包含项目98-101中任一项所述的分离的或合成的寡核苷酸。
103.一种用于疾病治疗的方法，其包括向需要这种治疗的对象给予足够量的项目98-101中任一项所述的分离的或合成的寡核苷酸或项目102所述的药物组合物或试剂盒。
3.附图简要说明
所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述阐述了利用本发明原理的说明性实施方式和附图，其中：
图1显示了DAO结构对GM03813细胞中全长(SMN2FL)和外显子7跳跃型(SMN2Δ7)SMN2 mRNA表达的影响。GM03813细胞经指定浓度的saRNA、ASO、组合处理(saRNA+ASO)和DAO(DA06-4A-27A和DA06-4A-27B)处理72小时。模拟样品作为对照处理，在寡核苷酸不存在的情况下进行转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。DS06-332i是SMN2的siRNA并作为对照处理进行转染。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平在分开的PCR反应中使用两对引物通过RT-qPCR确定。
具体地，患者来源的SMA成纤维细胞(GM03813细胞)经20nM指定的寡核苷酸处理72小时。示例性saRNA双链体DS06-0004是人SMN2基因转录的既定激活剂。DS06-4A-S2L1A是基于DS06-0004序列的二价saRNA结构，其中相同组成的两个化学修饰的双链体共价连接在一起。ASO10-27是“mixmer”剪接调节剂，其通过包含外显子7来提高SMN2FL转录物的细胞水平。DS06-4A-S2L1v和ASO10-27的组合(DS06-4A-S2L1v+ASO10-27)以各自20nM处理。DAO构建体通过以常规(DA-06-4A27A)或反向(DA-06-4A27B)序列方向将ASO10-27序列与DS06-0004的saRNA变体共价连接来合成。模拟处理在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为非特异性对照双链体，而SMN2特异性siRNA(DS06-332i)作为转染对照(监测靶基因敲减)。在图1A中，SMN2的全长(SMN2FL)和Δ7(SMN2Δ7)剪接变体通过使用同种型特异性引物组的RT-qPCR进行定量。扩增TBP作为内部参照。所示为针对TBP参照水平进行标准化后SMN2FL和SMN2Δ7表达水平相对于模拟处理的变化。在图1B中，SMN2FL和SMN2Δ7水平通过半定量RT-PCR使用跨越外显子7的替代引物组在琼脂糖凝胶上显示。用DdeI酶进行消化，以区分源自SMN2或SMN1序列的扩增子。显示的是消化后的SMN2产品大小。随后对上述琼脂糖凝胶图像进行扫描光密度测定，以定量条带强度。图1C中显示了针对TBP参照水平进行标准化后，相对于模拟处理的SMN2FL和SMN2Δ7条带强度水平。
图2显示了DAO(DA06-4A-27A)对GM03813细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA和SMN蛋白表达的剂量依赖性研究。模拟和dsCon2如图1所述。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。蛋白质从经处理的细胞收获，并使用针对人SMN蛋白的抗体通过Western印迹试验进行免疫印迹。还用针对α/β-微管蛋白的抗体进行印迹分析，以用作蛋白质上样的对照。
具体地，显示了DAO(DA06-4A-27A)在体外对SMN2FL和SMN2Δ7转录本水平的剂量依赖性作用。GM03813细胞经指定浓度的DA06-4A-27A处理72小时。模拟处理在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为非特异性对照双链体。在图2A中，SMN2的全长(SMN2FL)和Δ7(SMN2Δ7)剪接变体通过使用同种型特异性引物组的RT-qPCR进行定量。扩增TBP作为内部参照。所示为针对TBP参照水平进行标准化后SMN2FL和SMN2Δ7表达水平相对于模拟处理的变化。在图2B中，SMN2FL和SMN2Δ7水平通过半定量RT-PCR使用跨越外显子7的替代引物组在琼脂糖凝胶上显示。用DdeI酶进行消化，以区分源自SMN2或SMN1序列的扩增子。显示的是消化后的SMN2产品大小。随后对上述琼脂糖凝胶图像进行扫描光密度测定，以定量条带强度。图2C中显示了针对TBP参照水平进行标准化后，相对于模拟处理的SMN2FL和SMN2Δ7条带强度水平。
图3显示了DAO(DA06-4A-27A)对GM03813细胞中SMN蛋白表达的剂量依赖性作用。模拟和dsCon2如图1所述。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。蛋白质从经处理的细胞收获，并使用针对人SMN蛋白的抗体通过Western印迹试验进行免疫印迹。还用针对α/β-微管蛋白的抗体进行印迹分析，以用作蛋白质上样的对照。
具体地，显示了DAO(DA06-4A-27A)在体外对总SMN蛋白水平的剂量依赖性作用。GM03813细胞经指定浓度的DA06-4A-27A处理72小时。模拟处理在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为非特异性对照双链体。收获全细胞蛋白质提取物，用于免疫印迹分析。在图3A中，使用识别SMN1和SMN2基因产物的无差别单克隆抗体来检测总SMN蛋白水平。α/β-微管蛋白的免疫检测用作蛋白质上样对照。扫描光密度测定法用于定量上述免疫印迹的蛋白质条带强度。图3B显示了针对α/β-微管蛋白进行标准化后，总SMN蛋白水平相对于模拟处理的变化。
图4显示了DAO(DA06-4A-27A)对SMA-Het小鼠脑中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的功效。RNA通过RNAVzol采用Qiagen RNeasy柱从SMA-Het小鼠脑中收集。PBS表示无处理对照。
具体地，该图中显示的是SMA杂合子(Het)小鼠(Smn1+/-，SMN2+/-)脑中的DAO(DA06-4A-27A)活性。将DA06-4A-27A在幼鼠出生后第1天(PND1)以指定的剂量通过ICV注射给予幼鼠。PBS处理包含Fast Green作为程序控制，以观察确认整个小鼠大脑和脊髓的生物分布。72小时后处死小鼠并收集全组织样品用于RNA分离。n值表示各处理组中的动物数量。图4A显示了通过半定量RT-PCR使用经DdeI酶消化的外显子7跨越引物组在琼脂糖凝胶上观察到的SMN2FL和SMN2Δ7mRNA水平。显示了相较于100bp DNA梯标的消化后SMN2FL(392bp)和SMN2Δ7(338bp)的扩增子大小。扩增TBP基因，作为上样对照。随后对琼脂糖凝胶图像进行扫描光密度测定，以定量条带强度。图4B中显示了针对TBP参照水平进行标准化后，相对于PBS处理的SMN2FL和SMN2Δ7条带强度水平的平均值±SD。
图5显示了DAO(DA06-4A-27A)对SMA-Het小鼠脊髓中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的功效。RNA通过RNAVzol采用Qiagen RNeasy柱从SMA-Het小鼠脊髓中收集。PBS表示无处理对照。
具体地，该图显示了DAO(DA06-4A-27A)在SMA-Het小鼠脊髓中的体内活性。如图4所述幼鼠在出生后第1天(PND1)处理。72小时后处死小鼠并收集脊髓样品用于RNA分离。n值表示各处理组中的动物数量。SMN2FL和SMN2Δ7剪接变体通过RT-qPCR使用同种型特异性引物组定量。扩增Gapdh和Tbp，作为内部参照对照。所示为针对两个参照基因水平的平均值进行标准化后，SMN2FL和SMN2Δ7表达水平相对于模拟处理的变化。
图6显示了DAO(DA06-4A-27A)对SMA-Het小鼠肌肉中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的功效。RNA通过RNAVzol采用Qiagen RNeasy柱从SMA-Het小鼠肌肉中收集。PBS表示无处理对照。
具体地，该图显示了SMA-Het小鼠肌肉中的DAO(DA06-4A-27A)活性。如图4所述在幼鼠出生后第1天(PND1)处理。72小时后处死小鼠并收集肌肉组织样品用于RNA分离。n值表示各处理组中的动物数量。图6A显示了通过半定量RT-PCR使用经DdeI酶消化的外显子7跨越引物组在琼脂糖凝胶上可视化的SMN2FL和SMN2Δ7mRNA水平。显示了相较于100bp DNA梯标的消化后SMN2FL(392bp)和SMN2Δ7(338bp)的扩增子大小。扩增TBP基因，作为上样对照。随后对琼脂糖凝胶图像进行扫描光密度测定，以定量条带强度。图6B中显示了针对TBP参照水平进行标准化后，相对于PBS处理的SMN2FL和SMN2Δ7条带强度水平的平均值±SD。
图7显示了不同DAO结构对GM03813和GM09677细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。模拟和dsCon2如图1所述。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。值(y轴)是在针对TBP条带强度进行标准化后，相对于模拟处理的SMN2条带强度。
具体地，该图显示了患者来源的SMA成纤维细胞中药物化学性质优化的DAO(R6-04M1-27A-S1L1V3)活性。GM03813和GM09677细胞经25nM指定的寡核苷酸处理72小时。DS06-4A-S2L5V是基于DS06-4A-S2L1V序列/支架的二价saRNA变体，其具有优化的药物化学性质。R6-04M1-27A-S1L1V3是基于DA-06-4A27A的新型DAO结构，具有相似的化学性质增强。模拟处理在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为非特异性对照。SMN2FL和SMN2Δ7剪接变体通过RT-qPCR使用同种型特异性引物组定量。扩增TBP作为内部参照。显示了分别在GM03813(图7A)和GM09677(图7B)细胞中针对TBP参照水平进行标准化后，SMN2FL和SMN2Δ7表达水平相对于模拟处理的变化。
图8显示了DAO结构对GM03813和GM09677细胞中SMN2蛋白表达的作用。
具体地，该图证实了DAO(R6-04M1-27A-S1L1V3)对患者来源的SMA成纤维细胞中总SMN的活性。GM03813和GM09677细胞经25nM指定的寡核苷酸处理72小时。R6-04(20)-S1V1v(CM-4)是药物化学性质优化的示例性saRNA，而R6-04-S1是其非化学修饰的变体双链体。模拟处理在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为非特异性对照双链体。收获全细胞蛋白质提取物，用于免疫印迹分析。总SMN蛋白水平使用识别GM03813(图8A)和GM09677(图8C)细胞中的SMN1和SMN2基因产物的无差别单克隆抗体检测。α/β-微管蛋白的免疫检测用作蛋白质上样对照。扫描光密度测定法用于定量上述免疫印迹的蛋白质条带强度。图8B和图8D显示了分别在GM03813和GM09677细胞中针对α/β-微管蛋白进行标准化后，总SMN蛋白水平相对于模拟处理的变化。
图9显示了不同DAO结构对GM03813细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。模拟和dsCon2如图1所述。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。使用新的DAO结构，在不同位置与ASO连接的其他saRNA(DS06-0031和DS06-0067)。
具体地，该图显示了DAO结构对GM03813细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。GM03813细胞经20nM指定的寡核苷酸处理72小时。DS06-0031和DS06-0067是优先增强SMN2Δ7同种型基因输出的saRNA双链体。DAO构建体通过将ASO10-27与两个双链体中的正义链(DS06-31A-27A和DS06-67A-27A)或反义链(DS06-31A-27B和DS06-67B-27B)的3'端共价连接而合成。模拟处理在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为非特异性对照双链体，而DS06-332i作为转染对照，用于监测SMN2敲减。SMN2FL和SMN2Δ7剪接变体通过RT-qPCR使用同种型特异性引物组定量。扩增TBP作为内部参照。所示为针对TBP参照水平进行标准化后SMN2FL和SMN2Δ7表达水平相对于模拟处理的变化。
图10显示了使用不同接头的DAO结构对GM03813细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。GM03813细胞经指定浓度的具有不同接头的DAO、saRNA和ASO处理72小时。模拟和dsCon2如图1所述。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。
具体地，该图显示了具有不同接头的DAO结构对GM03813细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。GM03813细胞经25nM指定的寡核苷酸(包括具有不同接头的DAO、saRNA和ASO10-27)处理72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR使用两对引物在分开的PCR反应中(图10A)和半定量RT-PCR后琼脂糖凝胶电泳(图10B)来确定。还扩增TBP基因，作为RNA上样的对照。图10A显示了通过RT-qPCR确定的SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平。图10B显示了源自定量琼脂糖凝胶上PCR产物条带强度的SMN2FL和SMN2Δ7水平。
图11显示了使用不同接头的DAO结构对GM00232细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。GM00232细胞经指定浓度的具有不同接头的DAO、saRNA和ASO处理72小时。模拟和dsCon2如图1所述。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。
具体地，该图显示了具有不同接头的DAO结构对GM00232细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。GM00232细胞经25nM指定的寡核苷酸(包括具有不同接头的DAO、saRNA和ASO10-27)处理72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。SMN2FL和SMN2Δ7的mRNA水平通过RT-qPCR使用两对引物在分开的PCR反应中(图11A)和半定量RT-PCR后琼脂糖凝胶电泳(图11B)来确定。还扩增TBP基因，作为RNA上样的对照。图11A显示了通过RT-qPCR确定的SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平。图11B显示了源自定量琼脂糖凝胶上PCR产物条带强度的SMN2FL和SMN2Δ7水平。
图12显示了不同DAO结构对GM03813和GM00232细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。指定浓度的saRNA、ASO10-27和DAO在GM03813和GM00232细胞中分别处理72小时。
具体地，该图显示了“saRNA-saRNA”DAO和三单元DAO(即具有或不具有ASO偶联的双功能二价saRNA(三功能DAO))对GM03813和GM00232细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。指定的寡核苷酸以25nM转染到GM03813和GM00232细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。图12A显示了GM03813细胞中通过RT-qPCR确定的SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平。图12B显示了GM00232细胞中通过RT-qPCR确定的SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平。
图13显示了不同DAO结构对GM03813和GM00232细胞中SMN蛋白表达的作用。指定浓度的saRNA、ASO和DAO在GM03813和GM00232细胞中分别处理72小时。
具体地，该图显示了“saRNA-saRNA”DAO和三单元DAO(即具有或不具有ASO偶联的双功能二价saRNA(三功能DAO))对GM03813和GM00232细胞中SMN蛋白表达的作用。指定的寡核苷酸以25nM转染到GM03813和GM00232细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。收获全细胞蛋白质提取物，用于免疫印迹分析。总SMN蛋白水平使用识别GM03813(图13A)和GM09677(图13C)细胞中的SMN1和SMN2基因产物的无差别单克隆抗体检测。α/β-微管蛋白的免疫检测用作蛋白质上样对照。扫描光密度测定法用于定量上述免疫印迹的蛋白质条带强度。图13B和图13D显示了分别在GM03813和GM09677细胞中针对α/β-微管蛋白进行标准化后，总SMN蛋白水平相对于模拟处理的变化。
图14显示了具有不同碱基数量的ASO10-27的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的影响。DAO以25nM转染到GM03813和GM09677细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。转染R6-04M1-AC2(8～18nt)-S1L1V3v，作为对应R6-04M1-(8～18nt)-S1L1V3v的对照。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。TBP还作为内部参照扩增。图14A显示了GM03813细胞中通过RT-qPCR确定的SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平。图14B显示了GM09677细胞中通过RT-qPCR确定的SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平。
具体地，该图显示了具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN2Δ7mRNA表达的作用。DAO以25nM转染到GM03813和GM09677细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。ASO10-27和系列对照DAO(R6-04M1-AC2(8～18nt)-S1L1V3v)作为对照转染。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。TBP还作为内部参照扩增。图14A显示了GM03813细胞中通过RT-qPCR确定的SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平。图14B显示了GM09677细胞中通过RT-qPCR确定的SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平。
图15显示了具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN蛋白表达的作用。GM03813和GM09677细胞经25nM指定的寡核苷酸处理72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。ASO10-27作为对照转染。
具体地，该图显示了具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN蛋白水平的作用。GM03813和GM09677细胞经25nM指定的寡核苷酸处理72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。ASO10-27作为阳性对照转染。蛋白质从经处理的细胞收获，并使用针对人SMN蛋白的抗体通过Western印迹试验进行免疫印迹。还用针对α/β-微管蛋白的抗体进行印迹分析，以用作蛋白质上样的对照。图15A和15C显示了western印迹膜，带有SMN蛋白和α/β-微管蛋白的条带。图5B和15D显示源自图15A和15C条带强度定量的SMN蛋白水平的相对倍数变化。图15B和图15D中的值(y轴)是针对α/β-微管蛋白条带强度进行标准化后，SMN蛋白的相对条带强度。
图16显示了具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。DAO以25nM转染到GM03813和GM09677细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。ASO10-27作为对照转染。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。TBP还作为内部参照扩增。
具体地，该图显示了具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的DAO对GM03813(图16A)和GM09677(图16B)细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。DAO以25nM转染到GM03813和GM09677细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。ASO10-27作为阳性对照转染。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。TBP还作为内部参照扩增。
图17显示了具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN蛋白表达的作用。GM03813和GM09677细胞经25nM指定的寡核苷酸处理72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。ASO10-27作为对照转染。蛋白质从经处理的细胞收获，并使用针对人SMN蛋白的抗体通过Western印迹试验进行免疫印迹。还用针对α/β-微管蛋白的抗体进行印迹分析，以用作蛋白质上样的对照。
具体地，该图显示了具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN蛋白水平的作用。GM03813和GM09677细胞经25nM指定的寡核苷酸处理72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。ASO10-27作为阳性对照转染。蛋白质从经处理的细胞收获，并使用针对人SMN蛋白的抗体通过Western印迹试验进行免疫印迹。还用针对α/β-微管蛋白的抗体进行印迹分析，以用作蛋白质上样的对照。图17A和17C显示了western印迹膜，带有SMN蛋白和α/β-微管蛋白的条带。图17B和17D显示源自图17A和17C条带强度定量的SMN蛋白水平的相对倍数变化。图17B和图17D中的值(y轴)是针对α/β-微管蛋白条带强度进行标准化后，SMN蛋白的相对条带强度。
图18显示了具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的DAO对PMH细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。DAO以25nM转染到PMH细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。ASO10-27作为阳性对照转染。SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。TBP还作为内部参照扩增。
图19显示了“saRNA-siRNA”DAO对293A(图19A)和GM03813(图19B)细胞中SMN2FL、SMN2Δ7和SOD1 mRNA的影响。指定的寡核苷酸以25nM转染到293A或GM03813细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。SMN2FL、SMNΔ7和SOD1的mRNA水平通过RT-qPCR确定。TBP还作为内部参照扩增。
图20显示了不同DAO结构对PC3(图20A)和Ku-7(图20B)细胞中p21和PDL1 mRNA表达的作用。分别在PC3和Ku-7细胞中用10nM saRNA、siRNA和DAO处理48小时。模拟和dsCon2如图1所述，p21和PDL1的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。
具体地，该图显示了靶向两种不同基因的DAO对p21和PD-L1 mRNA表达的作用。用10nM指定的寡核苷酸转染PC3和KU-7细胞48小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。p21和PD-L1的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用基因特异性引物确定。GAPDH还作为内部参照扩增。图20A显示了PC3细胞中通过RT-qPCR确定的p21和PD-L1的mRNA水平。图20B显示了KU-7细胞中通过RT-qPCR确定的p21和PD-L1的mRNA水平。
图21显示了“ASO-ASO”DAO对GM03813细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。指定的寡核苷酸以25nM转染到GM03813细胞中72小时。模拟在没有寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。
SMN2FL和SMNΔ7的mRNA水平通过RT-qPCR在分开的PCR反应中使用两对引物确定。TBP还作为内部参照扩增。
图22显示了"ASO-ASO"DAO对GM03813细胞中SMN蛋白的作用。指定的寡核苷酸以25nM转染到GM03813细胞中72小时。模拟在不存在寡核苷酸的情况下转染。dsCon2作为不相关的寡核苷酸对照转染。蛋白质从经处理的细胞收获，并使用针对人SMN蛋白的抗体通过Western印迹试验进行免疫印迹。在图22A中，使用识别SMN1和SMN2基因产物的无差别单克隆抗体来检测总SMN蛋白水平。α/β-微管蛋白的免疫检测用作蛋白质上样对照。扫描光密度测定法用于定量上述免疫印迹的蛋白质条带强度。图22B显示了针对α/β-微管蛋白进行标准化后，总SMN蛋白水平相对于模拟处理的变化。值(y轴)是针对α/β-微管蛋白条带强度进行标准化后，SMN蛋白的相对条带强度。
图23显示了“二价”DAO siRNA对C57BL/6幼鼠(PND4)脑和脊髓中Htt mRNA表达的体内敲减活性。siRNA以40mg/kg的剂量通过ICV给药进行注射。盐水用作阴性对照注射。siHtt-S1V1缺少DAO设计并作为siHtt-S1L1活性的比较。小鼠在3天(图23A)或14天(图23B)被处死。收集脑和脊髓组织样品用于通过RT-qPCR进行分析。Htt mRNA水平是针对Tbp参考水平进行标准化后，相对于盐水处理的两只动物/组(n＝2)的平均值。
图24显示了siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5通过SC注射在幼鼠器官中的生物分布和体内敲减活性。图24A：Qu5标记的“二价”DAO siRNA(siSOD1M2-S1V1v-Qu5，siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5)以200mg/kg的剂量通过SC注射给予C57BL/6幼鼠(PND4)。注射Qu5标记的siRNA变体siSOD1M2-S1V1v-Qu5，将其用作比较对照。在处理后3天处死小鼠，并使用520nm激发和570nm发射滤光片在IVIS成像系统上对全器官荧光进行定量。显示了示例IVIS图像，其描述了相较于SC注射后的siSOD1M2-S1V1v-Qu5，siSOD1M2-S1L1V1v-Qu5在所有主要器官中的生物分布(基于Qu5信号)。图24B：绘制了相同大小的ROI内各指定的器官的荧光信号强度。图24C：使用基因特异性引物组通过RT-qPCR在指定的器官组织中定量Sod1mRNA敲减。扩增Tbp作为内部参照。表达数据显示为针对Tbp进行标准化后，相对于来自未处理动物的器官中的mRNA水平。敲减相对于盐水对照。
图25显示了siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5通过ICV注射在幼鼠器官中的生物分布和体内敲减活性。图25A：Qu5标记的“二价”DAO siRNA(siSOD1M2-S1V1v-Qu5，siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5)以40mg/kg的剂量通过ICV注射给予C57BL/6幼鼠(PND4)。注射Qu5标记的siRNA变体siSOD1M2-S1V1v-Qu5，将其用作比较对照。在处理后3天处死小鼠，并使用520nm激发和570nm发射滤光片在IVIS成像系统上对全器官荧光进行定量。显示的示例IVIS图像，其描述了相较于ICV注射后的siSOD1M2-S1V1v-Qu5，siSOD1M2-S1L1V1v-Qu5在所有主要器官中的生物分布(基于Qu5信号)。图25B：绘制了相同大小的ROI内各指定的器官的荧光信号强度。图25C：使用基因特异性引物组通过RT-qPCR定量指定的器官组织中的Sod1 mRNA敲减。扩增Tbp作为内部参照。表达数据显示为针对Tbp进行标准化后，相对于来自未处理动物的器官中的mRNA水平。敲减相对于盐水对照。
4.具体实施方式
本公开的内容包括共价组合多于一个分子以提供有效靶向与疾病或病症相关的一个或多个基因方面的改进，以及能够降低制造成本的用于基因疗法的化学、制造和控制(CMC)的改进。本发明人惊奇地发现，通过相同或不同的作用机制将靶向一个或多个序列的寡核苷酸共价连接到单个核苷酸分子中产生了一类新型多价寡核苷酸(MVO)试剂。
在一些方面，本发明基于这样的研究，该研究涉及激活/上调基因表达和/或增加全长基因或蛋白质表达量以改善遗传疾病治疗效果的寡核苷酸试剂、组合物和方法。
本申请还进一步表明，用SMN2 saRNA和SMN2 mRNA调节剂(例如ASO，诸如诺西那生或小哒嗪衍生物(包括但不限于利司扑兰和布拉扑兰))联合处理SMA患者细胞能够实现相比单独使用任一所述化合物所能达到的水平显著更高的全长SMN2 mRNA和SMN蛋白水平。该联合治疗策略相较于单一疗法能够提供增强的治疗益处，例如，改善诊断患有SMN缺陷相关病症的患者的临床症状，或减少与单一疗法相关联的不良副作用，并因此使患者例如SMA患者的治疗转归最大化。
除非另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。
在本申请中，单数形式，例如“一个/种”和“该”包括复数对象，除非在上下文中另行明确说明。
如本文所用，术语“大约”、“约”、“基本上”和类似术语旨在具有与本公开主题所涉及的领域中的普通技术人员通常可接受的用法相一致的广泛含义。
4.1.定义
如本文所用，术语“多价寡核苷酸试剂”、“MVO试剂”和“具有多个功能性寡核苷酸单元的寡核苷酸试剂”等可互换使用，并在更广泛的意义上包括本发明的包含共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸的任何寡核苷酸试剂。相较于任何所述功能性寡核苷酸的单独使用，MVO试剂的功能或效果得到改善，或者甚至能产生累加效应或优选协同效应。如本文所用，术语“功能性寡核苷酸”也称为“寡核苷酸单元”或“功能性寡核苷酸单元”，是指多价寡核苷酸试剂中的寡核苷酸单元，其可以选自单链反义寡核苷酸(ASO，例如gapmer和mixmer)和双链(双链的)RNA(dsRNA，例如siRNA和saRNA)，它们共价连接以形成整合的分子。在一些方面，多价寡核苷酸试剂中的功能性寡核苷酸单元属于相同类型或不同类型，是相同的或不同的，具有不同靶标或相同靶标(例如靶向相同基因或不同基因)，和/或直接相连或通过接头相连。多价寡核苷酸试剂可以是多靶向试剂，其具有两个或更多个作用靶标并且活性提高。
如本文所用，术语“gapmer”指在中央DNA结构两侧具有经修饰的RNA区段的短DNA反义寡核苷酸(ASO)结构。在一些实施方式中，至少一个经修饰的RNA区段包含选自锁核酸(LNA)和经2'-OMe或2'-F修饰的核苷酸的一种或多种经修饰核苷酸，以增加对靶标的亲和力，增加核酸酶抗性，减少免疫原性，和/或降低毒性。在一些实施方式中，gapmer包含至少一个经硫代磷酸酯(PS)基团修饰的核苷酸。在一些实施方式中，gapmer被设计成与RNA的靶片段杂交，并通过诱导RNA酶H切割而使基因沉默。例如，ASO药物“Toferson”是gapmer，其敲减SOD1mRNA，用于治疗ALS。在本申请中公开的具有gapmerASO的DAO的可能示例可以是“siSOD1-Toferson”。
如本文所用，术语“mixmer”是反义寡核苷酸(ASO)，其特征在于，其结构上是DNA和经化学修饰的核酸类似物的mixmer。任选地，mixmer由完全修饰的核苷酸或核酸类似物组成。在一些实施方式中，mixmer被设计成结合和掩蔽互补RNA序列，以空间阻断蛋白质、因子或其他RNA与靶向RNA相互作用。在一些实施方式中，mixmer被设计成通过置换剪接体来改变前体mRNA剪接。在一些实施方式中，mixmer被设计成结合和隔离微小RNA(miRNA)，该miRNA还有另一个名称“安塔够妙(antagomir)”或“抗miR”。在一些实施方式中，本申请中描述了组合saRNA和mixmer的DAO示例。
术语“gapmer”和“mixmer”可用于举例说明两个不同亚类的单链反义寡核苷酸(ASO)分子。在一些实施方式中，ASO是执行不同分子功能的“gapmer”或“mixmer”。在一些实施方式中，术语“gapmer”和“mixmer”指它们的化学设计。
关于gapmer和mixmer的详细描述可见于例如Peter H.Hagedorn等,锁核酸：形态、多样性和药物发现(Locked nucleic acid:modality,diversity,and drug discovery),Drug Discovery Today,卷23,第1号,2018年1月；Piotr J.Kamola等，外显子和内含子脱靶效应的计算机和体外评估构成了治疗性ASO gapmer优化的关键要素(In silico and invitro evaluation of exonic and intronic off-target effects form a criticalelement of therapeutic ASO gapmer optimization),Nucleic Acids Research,卷43,第18期,2015年10月15日,第8638–8650页；Birte Vester等,LNA(锁核酸)：互补RNA和DNA的高亲和力靶向(LNA(locked nucleic acid):high-affinity targeting ofcomplementary RNA and DNA),Biochemistry 2004,43,42,13233–13241。
如本文所用，术语“SMN缺陷相关病症”指由任何原因所致SMN全长蛋白缺陷所引起的疾病。“SMN缺陷相关病症”包括但不限于脊髓性肌萎缩症(SMA)、神经源性多发性先天性关节挛缩症(先天性AMC)和肌萎缩侧索硬化症(ALS)。对于SMN1(人)，GenBank基因参考是GeneID:6606。
术语“脊髓性肌萎缩症”或“SMA”包括但不限于1型至4型脊髓性肌萎缩症(SMA)；近端脊髓性肌萎缩症；儿童期初发型I型SMA(沃德尼格霍夫曼病(Werdnig-Hoffmanndisease))；II型(中间、慢性型)、III型(库格尔伯格病(Kugelberg-Welander disease)或青少年脊髓性肌萎缩症)和相对较新分类的成人发作型形式——IV型。会议报告：国际SMA联盟会议(International SMAConsortiummeeting).Neuromuscul Disord.；2:423–428。该术语SMA还包括迟发性SMA(也称为3型和4型SMA、轻度SMA、成人发作型SMA和库格尔伯格病)。该术语SMA还包括其他形式的SMA，包括X连锁疾病、伴有呼吸窘迫的脊髓性肌萎缩症(SMARD)、脊髓性和延髓性肌萎缩症(肯尼迪病或球状脊髓性肌萎缩症)和远端脊髓性肌萎缩症。该术语SMA包括如下文献中描述的所有形式SMA：Arnold,W.D.,Kassar,D.和Kissel,J.T.脊髓性肌萎缩症：新治疗时代的诊断和管控(Spinal muscular atrophy:Diagnosisand management in a new therapeutic era).Muscle and Nerve(2015)；Butchbach,M.E.R.存活运动神经元基因中的拷贝数变异：对脊髓性肌萎缩症和其他神经退行性疾病的影响(Copy Number Variations in the Survival Motor Neuron Genes:Implicationsfor Spinal Muscular Atrophy and OtherNeurodegenerative Diseases).Front.Mol.Biosci.(2016)。
当SMA症状在出生时或6月龄时出现时，该疾病称为1型SMA(也称为婴儿期初发型或沃德尼格霍夫曼病病)。通常，婴儿全身肌肉无力、哭声微弱并呼吸困难。他们通常难以吞咽和吸吮，并且达不到能够独立坐起的发育里程碑。这些婴儿呼吸和发育不良的风险增加。通常，这些婴儿有两个或三个SMN2基因拷贝(Butchbach,M.E.R.动神经元存活基因中的拷贝数变异：对脊髓性肌萎缩症和其他神经退行性疾病的影响(Copy Number Variations inthe Survival Motor Neuron Genes:Implications for Spinal Muscular Atrophy andOther Neurodegenerative Diseases).Front.Mol.Biosci.(2016)，将其通过引用其全文纳入本文)。
当SMA在3-15个月龄之间且在儿童可以独立站立或行走之前发作时，称为2型SMA或中间型SMA或杜博维茨病(Dubowitz disease)。患有2型SMA的儿童通常具有三拷贝SMN2基因(Arnold,W.D.,Kassar,D.和Kissel,J.T.脊髓性肌萎缩症：新治疗时代的诊断和管控(Spinal muscular atrophy:Diagnosis and management in a new therapeutic era).Muscle and Nerve(2015)，其通过引用其全文方式纳入本文)。肌肉无力主要发生在近端(靠近身体中心)并涉及下肢多于上肢。通常，面部和眼部肌肉不受影响(Butchbach,M.E.R.动神经元存活基因中的拷贝数变异：对脊髓性肌萎缩症和其他神经退行性疾病的影响(Copy Number Variations in the Survival Motor Neuron Genes:Implications forSpinal Muscular Atrophy and Other Neurodegenerative Diseases).Front.Mol.Biosci.(2016)，将其通过引用其全文方式纳入本文)。
迟发性SMA(也称为3型和4型SMA、轻度SMA、成人发作型SMA和库格尔伯格病)会导致不同程度的无力。患有3型SMA的患者有3到4个SMN2基因拷贝。3型SMA(青年发作)占SMA病例总数的30％(Arnold,W.D.,Kassar,D.和Kissel,J.T.脊髓性肌萎缩症：新治疗时代的诊断和管理(Spinal muscular atrophy:Diagnosis and management in a newtherapeutic era).Muscle and Nerve(2015))。症状通常在18个月到成年之间出现。受影响的个人实现独立行动。然而，这些患者的近端无力可能导致跌倒和爬楼困难。随着时间推移，许多人会丧失站立和行走能力，因此只能使用轮椅四处移动。这些患者中的大多数会发展至足部畸形、脊柱侧弯和呼吸肌无力。
4型SMA是迟发性的，占SMA病例总数不到5％。这些患者有四到八个SMN2基因拷贝(Butchbach,M.E.R.动神经元存活基因中的拷贝数变异：对脊髓性肌萎缩症和其他神经退行性疾病的影响(Copy Number Variations in the Survival Motor Neuron Genes:Implications for Spinal Muscular Atrophy and Other NeurodegenerativeDiseases).Front.Mol.Biosci.(2016))。发病年龄尚未确定，但通常在30岁后。4型是轻微形式的SMA，因此寿命保持正常。患者可以实现运动里程碑并在一生中保持活动能力。
如本文所用，术语“对象”和“个体”在本文中可互换使用并意指可用本公开的化合物处理/治疗的任何活生物体。术语“患者”意指人对象或个体，包括婴儿、儿童和成人。
组合物的“治疗有效量”是足以实现所需治疗效果的量，因此并不需要治愈或完全缓解。在本公开的实施方式中，治疗功效是任何疾病指标的改善，并且治疗有效量足以在经处理/治疗的个体中导致临床意义上的病症/症状的改善。本文所用短语“治疗有效量”和“有效量”意指足以使接受治疗/处理的个体在活动、功能和反应方面的临床意义上的缺陷减少至少约15％、优选至少50％、更优选至少90％、最优选预防上述缺陷的量。
有效量可根据例如对象的大小和体重、疾病的类型或本发明的特定化合物的因素而变化。例如，本发明化合物的选择会影响“有效量”的构成形式。本领域普通技术人员能够研究本文所包含的因素，且无需过度实验即可确定有关本发明化合物的有效量。
给药方案可影响有效量的构成形式。本发明的化合物可在疾病诊断或病症之前或之后给予对象。此外，可每天或依次给予数个分开的剂量，以及交错剂量，或者该剂量可连续输注，或可推注。此外，本发明化合物的剂量可根据治疗或预防情形的迫切程度相应地增加或减少。
本文使用的术语“治疗”、“处理”、“治疗方法”或“疗法”具有医学领域通常理解的含义，因此不要求治愈或完全缓解，并且包括任何有益或期望的临床结果。这类有益或期望的临床结果的非限制性示例是相较于未经治疗的预期生存期的生存期延长，减轻的症状包括下述一种或多种：近端骨骼肌无力和萎缩，无法独立坐或走，吞咽困难，呼吸困难等。
如本文所用，“预防”或“延缓”疾病指抑制疾病的完全发展。
术语“生物样品”指源自生物体(例如，人对象)的任何组织、细胞、体液或其他材料。在某些实施方式中，生物样品是血清或血液。
在寡核苷酸序列的情况中，本文所用术语“序列相同性/同一性”或“％相同性/同一性”是指当序列在指定的比较窗口对齐时，比较的序列中相同的残基的百分比。例如，在saRNA的情况中，术语“序列相同性/同一性”或“序列同源性”意指saRNA的一条寡核苷酸链(正义或反义)与靶基因启动子序列的模板链或编码链上的区域具有至少80％的相似性。在一些方面，相同性/同一性百分比使用序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可用的其他算法)之一或通过观察来度量。
“靶基因启动子序列”指靶基因的非编码序列，在本公开的上下文中，“与靶基因启动子序列互补”指该序列的编码链，也指非模板链，即与基因编码序列相同的核酸序列。
如本文所用，术语“正义链”和“正义寡核苷酸链”可互换使用。dsRNA分子的正义寡核苷酸链可包括例如第一核酸链，其包含saRNA双链体中靶基因启动子序列的编码链。
如本文所用，术语“反义链”和“反义寡核苷酸链”可互换使用。dsRNA分子的反义寡核苷酸链可以包括例如saRNA双链体中与正义寡核苷酸链互补的第二核酸链。
如本文所用，术语“第一寡核苷酸链”可以是正义链或反义链。saRNA的正义链指saRNA双链体中与靶基因启动子DNA序列的编码链具有同源性的寡核苷酸链。反义链指saRNA双链体中与正义链互补的寡核苷酸链。
如本文所用，术语“第二寡核苷酸链”也可以是正义链或反义链。如果第一寡核苷酸链是正义链，那么第二寡核苷酸链是反义链；如果第一寡核苷酸链是反义链，那么第二寡核苷酸链是正义链。
本文所用术语“启动子”指这样的核酸序列，其不编码蛋白质并且通过在空间上与蛋白质编码或RNA编码核酸序列相关联来对蛋白质编码或RNA编码核酸序列的转录起调节作用。通常，真核启动子包含100-5,000个碱基对，但该长度范围并不旨在限制本文所用的术语“启动子”。虽然启动子序列通常位于蛋白质编码序列或RNA编码序列的5’端，但其也存在于外显子和内含子序列中。
如本文所用，术语“编码链”指靶基因中无法被转录的DNA链，其核苷酸序列与转录产生的RNA序列相同(在RNA中，DNA中的T被U代替)。本公开中所述的靶基因启动子的双链DNA序列的编码链指与靶基因DNA编码链位于同一DNA链的启动子序列。
如本文所用，术语“模板链”指靶基因双链DNA链的另一条，其与编码链互补并且可以作为模板转录成与转录的RNA碱基互补的RNA(A-U，G-C)。转录过程中，RNA聚合酶结合模板链并沿模板链3'→5'方向移动，以5'→3'方向催化RNA合成。本公开中所述的靶基因启动子的双链DNA序列的模板链指与靶基因DNA模板链位于同一DNA链的启动子序列。
如本文所用，术语“转录起始位点”或TSS指标记基因模板链上转录起始的核苷酸。转录起始位点可以存在于启动子区域的模板链上。基因可以有多个转录起始位点。
如本文所用，术语“突出端”指具有一个或多个非碱基配对核苷酸的寡核苷酸链末端(5'或3')，其由双链寡核苷酸中一条链延伸超过另一条链而产生。延伸超过双链体3'和/或5'端的单链区域称为突出端。在某些实施方式中，突出端的长度为0-6个核苷酸。应当理解的是，0个核苷酸的突出端意味着没有突出端。
如本文所用，术语“基因激活”、“激活基因表达”、“基因上调”和“上调基因表达”可互换使用，并意指特定核酸序列转录、翻译、表达或活性的增加或上调，如通过测量基因的转录水平、mRNA水平、蛋白质水平、酶活性、甲基化状态、染色质状态或构型、翻译水平或细胞或生物系统中的活性或状态所确定的。可以直接或间接确定这些活性或状态。此外，“基因激活”或“激活基因表达”指与核酸序列相关的活性增加，无论这类激活的机制如何。例如，基因激活发生在转录水平，从而增加转录得到的RNA，而将RNA翻译成蛋白质，又进而增加了蛋白质的表达。
如本文所用，术语“小激活RNA”、“saRNA”和“小激活核糖核酸”可互换使用，并指可以上调靶基因表达的核糖核酸分子。其可以是由第一核酸链和第二核酸链构成的双链核酸分子，所述第一核酸链含有与靶基因非编码核酸序列(如启动子和增强子)具有序列同源性的核糖核苷酸序列，所述第二核链含有与第一链互补的核苷酸序列。saRNA还可包含合成的或载体表达的单链RNA分子，其可以通过分子内两个互补区域形成发夹结构，其中第一区域包含与基因的启动子的靶序列具有序列同源性的核糖核苷酸序列，并且包含在第二区域中的核糖核苷酸序列与第一区域互补。saRNA分子的双链体区域的长度通常为约10至约60、约10至约50、约12至约48、约14至约46、约16至约44、约18至约42、约20至约40、约22至约38、约24至约36、约26至约34和约28至约32个碱基对，并且通常为约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55或约60个碱基对。此外，术语“小激活RNA”、“saRNA”和“小激活核糖核酸”还包含核糖核苷酸以外的核酸，包括但不限于修饰的核苷酸或类似物。
如本文所用，术语“小干扰RNA”、“siRNA”和“小干扰核糖核酸”可互换使用，并指可以下调甚至沉默靶基因表达的核糖核酸分子。其可以是由第一核酸链和第二核酸链构成的双链核酸分子，所述第一核酸链含有与靶基因非编码核酸序列具有序列同源性的核糖核苷酸序列，所述第二核链含有与第一链互补的核苷酸序列。siRNA还可以包含合成的或载体表达的单链RNA分子，其可以通过分子内两个互补区域形成发夹结构，其中第一区域包含与基因的启动子的靶序列具有序列同源性的核糖核苷酸序列，并且包含在第二区域中的核糖核苷酸序列与第一区域互补。siRNA分子的双链体区域的长度通常为约10至约60、约10至约50、约12至约48、约14至约46、约16至约44、约18至约42、约20至约40、约20至约25个碱基对，并且通常为约10、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约35、约40、约45、约50个碱基对。此外，该术语还包括核糖核苷酸以外的核酸，包括但不限于经修饰的核苷酸或类似物。
如本文所用，“共价接头”是指用于共价连接两个分子例如两个dsRNA的分子。如下文更详细描述的，该术语可以包括例如核酸接头、肽接头等，并且包括二硫键接头。
如本文所用，术语“合成的”指合成寡核苷酸的方式，包括能够合成或化学修饰RNA的任何方式，例如化学合成、体外转录、载体表达等。
4.2.多价寡核苷酸(MVO)试剂的结构和构建
4.2.1多价寡核苷酸试剂中的功能性寡核苷酸
本公开的方面包括多价寡核苷酸试剂，其包括共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸。在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸独立地选自双链RNA(dsRNA)和反义寡核苷酸(ASO)。双链RNA独立地选自小干扰RNA(siRNA)和小激活RNA(saRNA)。ASO独立地选自gapmer和mixmer。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或七个或更多个寡核苷酸单元。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含2～10个功能性寡核苷酸。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂是双重作用寡核苷酸(DAO)或甚至多重作用寡核苷酸试剂。
一些实施方式中，MVO试剂可包含：a)第一双链RNA(dsRNA)和第一反义寡核苷酸(ASO)；b)第一双链RNA(dsRNA)和第二dsRNA；c)第一反义寡核苷酸(ASO)和第二ASO；d)第一双链RNA(dsRNA)、第二dsRNA和第三dsRNA；e)第一双链RNA(dsRNA)、第二dsRNA和第一反义寡核苷酸(ASO)；f)第一双链RNA(dsRNA)、第一反义寡核苷酸(ASO)和第二ASO；或g)第一反义寡核苷酸(ASO)、第二ASO和第三ASO；并且在a)～g)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。
在一些实施方式中，dsRNA是小干扰RNA(siRNA)。siRNA主要在细胞质中与靶mRNA结合，以通过RNA干扰(RNAi)机制在转录后下调基因表达。siRNA可以设计成靶向基因的mRNA序列，以通过RNAi机制(例如PDL-1)沉默其表达，用于使(例如癌症患者的)治疗转归最大化。
siRNA分子可以具有内源性RNA碱基或化学修饰的核苷酸。所述修饰不消除其细胞活性，而是增加稳定性和/或增加其细胞效力。化学修饰的示例包括硫代磷酸酯基团、2'-脱氧核苷酸、含2'-OCH3的核糖核苷酸、2'-F-核糖核苷酸、2'-甲氧乙基核糖核苷酸及其组合等。siRNA可以具有不同的长度(例如，10-200bp)和结构(例如，发夹、单链/双链、凸起、切口/缺口、错配)并在细胞中加工以提供活性基因沉默。双链siRNA(dsRNA)在各链(平末端)或不对称末端(突出端)可以具有相同数量的核苷酸。例如，1-2个核苷酸的突出端可以存在于正义链和/或反义链，并且存在于给定链的5'端和/或3'端。
在一些实施方式中，dsRNA是小激活RNA(saRNA)。saRNA靶向细胞核中的调控序列，例如基因启动子，以通过RNAa(RNA激活)机制在转录水平上调基因表达。
在一些实施方式中，至少一种寡核苷酸是ASO。ASO可以设计为靶向基因的mRNA，以通过RNA酶H活性下调其表达，例如，用于使癌症的治疗效率最大化。
在一些实施方式中，至少一种寡核苷酸是ASO。ASO可以设计为靶向基因的前体mRNA，以通过空间阻断而改变其剪接，例如，用于最大化基因的功能性蛋白质表达。
在一些实施方式中，两种或更多种功能性寡核苷酸各自通过结合至mRNA序列或非编码调节核酸序列来调节一个或多个基因、蛋白质的表达。在某些实施方式中，目标非编码调节核酸序列是启动子序列。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包括含有正义链和反义链的dsRNA。在某些实施方式中，dsRNA的反义链与正义dsRNA链部分互补。如本文所用，术语“部分互补”可以包括这样的dsRNA的反义链，其与dsRNA正义链的1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个或60个或更多个连续核苷酸互补。在某些实施方式中，dsRNA包含具有至少15个连续核苷酸的反义链，其与dsRNA正义链的至少15个连续核苷酸互补。在某些实施方式中，dsRNA包含具有至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或至少60个连续核苷酸的反义链，其与dsRNA正义链的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55或至少60个连续核苷酸互补。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：a)siRNA-siRNA；b)siRNA-saRNA；c)saRNA-saRNA；d)siRNA-gapmer；e)siRNA-mixmer；f)saRNA-gapmer；g)saRNA-mixmer；h)gapmer-gapmer；i)gapmer-mixmer；j)mixmer-mixmer；k)siRNA-siRNA-siRNA；l)siRNA-siRNA-saRNA；m)siRNA-saRNA-saRNA；n)saRNA-saRNA-saRNA；o)siRNA-siRNA-gapmer；p)siRNA-siRNA-mixmer；q)siRNA-saRNA-gapmer；r)siRNA-saRNA-mixmer；s)saRNA-saRNA-gapmer；t)saRNA-saRNA-mixmer；u)siRNA-gapmer-gapmer；v)saRNA-gapmer-gapmer；w)siRNA-gapmer-mixmer；x)saRNA-gapmer-mixmer；y)siRNA-mixmer-mixmer；z)saRNA-mixmer-mixmer；aa)gapmer-gapmer-gapmer；ab)gapmer-gapmer-mixmer；ac)gapmer-mixmer-mixmer；和ad)mixmer-mixmer-mixmer；并且其中，在a)～ad)的任一项中，功能性寡核苷酸以任何顺序排列并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。
在一些实施方式中，三个或更多个寡核苷酸包含三个dsRNA(例如，第一dsRNA、第二dsRNA和第三dsRNA)。在一些实施方式中，三个或更多个寡核苷酸包含两个dsRNA和ASO(例如，第一dsRNA、第二dsRNA和ASO)。
在一些实施方式中，dsRNA包含至少15个连续核苷酸的正义链和至少15个连续核苷酸的反义链。
在一些实施方式中，正义链的长度为约10个核苷酸或更多、约15个核苷酸或更多、约20个核苷酸或更多、约25个核苷酸或更多、约30个核苷酸或更多、约35个核苷酸或更多、约40个核苷酸或更多、约45个核苷酸或更多、约50个核苷酸或更多、约55个核苷酸或更多或约60个核苷酸或更多)。在一些实施方式中，正义链的长度为10-100个核苷酸(例如，10-20个核苷酸、10-50个核苷酸、10-90个核苷酸、20-95个核苷酸、30-70个核苷酸、40-80个核苷酸、50-100个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸)。在一些实施方式中，正义链的长度为10-60个核苷酸(例如，10-20个核苷酸、10-50个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸)。
在一些实施方式中，正义链的长度为约10个核苷酸或更多、约15个核苷酸或更多、约20个核苷酸或更多、约25个核苷酸或更多、约30个核苷酸或更多、约35个核苷酸或更多、约40个核苷酸或更多、约45个核苷酸或更多、约50个核苷酸或更多、约55个核苷酸或更多、约60个核苷酸或更多、约65个核苷酸或更多、约70个核苷酸或更多、约75个核苷酸或更多、约80个核苷酸或更多、约85个核苷酸或更多、约90个核苷酸或更多、约95个核苷酸或更多或约100个核苷酸或更多)。在一些实施方式中，正义链的长度为10-60个核苷酸(例如，10-20个核苷酸、10-50个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸)。
在一些实施方式中，反义链的长度为约10个核苷酸或更多、约15个核苷酸或更多、约20个核苷酸或更多、约25个核苷酸或更多、约30个核苷酸或更多、约35个核苷酸或更多、约40个核苷酸或更多、约45个核苷酸或更多、约50个核苷酸或更多、约55个核苷酸或更多或约60个核苷酸或更多)。在一些实施方式中，反义链的长度为10-100个核苷酸(例如，10-20个核苷酸、10-50个核苷酸、10-90个核苷酸、20-95个核苷酸、30-70个核苷酸、40-80个核苷酸、50-100个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸)。在一些实施方式中，反义链的长度为10-60个核苷酸(例如，10-20个核苷酸、10-50个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸)。
在一些实施方式中，反义链的长度为约10个核苷酸或更多、约15个核苷酸或更多、约20个核苷酸或更多、约25个核苷酸或更多、约30个核苷酸或更多、约35个核苷酸或更多、约40个核苷酸或更多、约45个核苷酸或更多、约50个核苷酸或更多、约55个核苷酸或更多、约60个核苷酸或更多、约65个核苷酸或更多、约70个核苷酸或更多、约75个核苷酸或更多、约80个核苷酸或更多、约85个核苷酸或更多、约90个核苷酸或更多、约95个核苷酸或更多或约100个核苷酸或更多)。在一些实施方式中，反义链的长度为10-60个核苷酸(例如，10-20个核苷酸、10-50个核苷酸、10-40个核苷酸、10-30个核苷酸)。
在一些实施方式中，共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸的总核苷酸的长度为10个核苷酸至500个核苷酸(例如，10个核苷酸至100个核苷酸、50个核苷酸至100个核苷酸、50个核苷酸至200个核苷酸、20个核苷酸到100个核苷酸、20个核苷酸到200个核苷酸、20个核苷酸到300个核苷酸、50个核苷酸到300个核苷酸、20个核苷酸到80个核苷酸、100个核苷酸到300个核苷酸、300个核苷酸到500个核苷酸)。
4.2.2核苷酸修饰
本文所述的寡核苷酸的所有核苷酸可以是天然的，即非化学修饰的核苷酸，或至少一个核苷酸可以经化学修饰。化学修饰的非限制性示例可以包括以下一项或多项的组合：
(1)对功能性寡核苷酸核苷酸序列中(例如SMN2 saRNA中)核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
(2)对功能性寡核苷酸的核苷酸序列中核糖的2'-OH的修饰；
(3)对功能性寡核苷酸的核苷酸序列中的碱基的修饰。
本公开中的核苷酸或寡核苷酸的化学修饰为本领域技术人员所熟知，并且对磷酸二酯键的修饰指磷酸二酯键中氧的修饰，包括硫代磷酸酯修饰和硼烷化磷酸盐修饰。两种修饰都能稳定寡核苷酸结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
核糖修饰指核苷酸戊糖中的2'-OH的修饰，即在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如2'-氟代修饰、2'-氧甲基修饰、2'-氧亚乙基甲氧基修饰、2,4'-二硝基苯酚修饰、锁核酸(LNA)、2'-氨基修饰、2'-脱氧修饰。
碱基修饰意指对核苷酸碱基的修饰，例如5'-溴尿嘧啶修饰、5'-碘尿嘧啶修饰、N-甲基尿嘧啶修饰、2,6-二氨基嘌呤修饰。
这些修饰可能会增加寡核苷酸的生物利用度，增加对靶序列的亲和力，并增强对细胞中核酸酶水解的抗性。
此外，为了促进寡核苷酸进入细胞，可以在上述修饰的基础上将亲脂基团如胆固醇引入寡核苷酸正义链或反义链的末端，以促进通过由脂质双层构成的细胞膜并在核膜和细胞核内的基因启动子区域发挥作用。
本公开的寡核苷酸试剂在与细胞接触后将有效激活或上调细胞中一个或多个基因的表达，优选至少10％(例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)。
本公开的一个方面提供了包含本公开的两个或更多个功能性寡核苷酸或编码本公开的两个或更多个功能性寡核苷酸的核酸的细胞。在一个实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。这类细胞可以是离体的，例如细胞系等，或者可以存在于哺乳动物体内，例如人，包括婴儿、儿童或成人。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂的至少两个寡核苷酸中的至少一个寡核苷酸可以包括至少一个修饰的核苷酸，例如，2'-O-甲基修饰的核苷酸，包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸，与胆甾醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸，2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸，2'-脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸，脱碱基核苷酸，2'-氨基修饰的核苷酸，2'-烷基修饰的核苷酸，吗啉代核苷酸，氨基磷酸酯和包含核苷酸的非天然碱基。在一些实施方式中，第一和第二dsRNA包括具有2′-O-甲基修饰的核苷酸和含5′-硫代磷酸基团的核苷酸的“内轻(endo-light)”修饰。
在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5’端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分。
在一些实施方式中，多价试剂的至少一个寡核苷酸经化学修饰，以增强稳定性或其他有益特征。具有本公开特征的核酸可通过常规方法合成和/或修饰，例如下述文献中描述的那些：《现代核酸化学方案》(Current protocols in nucleic acid chemistry)，Beaucage,S.L.等(编)，约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.)，美国纽约州纽约，其通过引用方式纳入本文。修饰包括，例如，(a)末端修饰，例如，5′末端修饰(磷酸化，偶联，反向连接等)，3′末端修饰(偶联，DNA核苷酸，反向连接等)，(b)碱基修饰，例如，用稳定化碱基，去稳化碱基或与扩展的伴侣库碱基配对的碱基进行替代，去除碱基(无碱基核苷酸)或偶联的碱基，(c)糖修饰(例如，在2'位置或4'位置)，或糖的替代，以及(d)骨架修饰，包括磷酸二酯连接的修饰或替代。可用于本公开的RNA化合物的具体示例包括但不限于含有经修饰骨架或无天然核苷键的RNA。在一些实施方式中，具有经修饰骨架的RNA包括在骨架中没有磷原子的那些RNA等。在一些实施方式中，核苷间骨架中没有磷原子的经修饰RNA也可以被认为是寡核苷。在某些实施方式中，修饰的寡核苷酸在其核苷间主链中将具有磷原子。
修饰的寡核苷酸主链包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯，包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、亚磷酰胺类，包括3′-氨基亚磷酰胺和氨基烷基磷酰胺酸酯、硫代磷酰胺、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和硼磷酸酯(具有正常的3′-5′键，它们的2′-5′类似物等)，具有相反极性的那些，其中相邻的核苷单元对连接3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。
制备含磷连接的非限制性示例包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利RE39464，其通过引用其全文方式纳入本文。
4.2.3共价连接
本公开的方面包括多价寡核苷酸试剂，其包含通过连接组件或通过磷酸二酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸。
在一些实施方式中，MVO试剂中的功能性寡核苷酸单元与共价接头连接。在一些实施方式中，接头是二硫接头。可以连接各种链组合，例如，第一和第二dsRNA正义链共价连接，或者例如，第一和第二dsRNA反义链共价连接。在一些实施方式中，本公开的任何多价寡核苷酸试剂包括配体。
在一些实施方式中，连接组件可以包括但不限于：
--间隔子亚磷酰胺18(亚磷酰胺酸(Phosphoramidous acid)，N,N-双(1-甲基乙基)-,19,19-双(4-甲氧基苯基)-19-苯基-3,6,9,12,15,18-六氧杂十九-1-基2-氰乙基酯)；
--间隔子-9(3-[2-[2-[2-[双(4-甲氧基苯基)-苯基甲氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基-[二(丙-2-基)氨基]磷烷基]氧基丙腈)；间隔子亚磷酰胺C3(6-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)己基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)；
--间隔子-C6亚磷酰胺(6-(4,4'-甲氧基三苯甲基)己基-1-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺)。
在一些实施方式中，连接组件包含表1中所示的化合物结构。
表1.MVO试剂中使用的接头
在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键共价连接。在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸由硫代磷酸酯键共价连接。
在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸通过一个或多个核苷酸共价连接。
共价接头的非限制性示例可以在美国专利申请公开号20200332292中找到，其全部内容通过引用纳入本文。共价接头可以连接两个或更多个功能性寡核苷酸。在一些实施方式中，共价接头可以连接两条正义链、两条反义链、一条正义链和一条反义链、两条正义链和一条反义链、两条反义链和一条正义链、两条正义链和两条反义链、一条反义链和ASO、正义链和ASO等。
在某些实施方式中，共价接头可以包括RNA和/或DNA和/或肽。接头可以是单链、双链、部分单链或部分双链。在一些实施方式中，接头包括二硫键。接头可以是可切割的或不可切割的。
在某些实施方式中，共价接头可以包括，例如，dTsdTuu＝(5'-2'脱氧胸苷-3'-硫代磷酸-5'-2'脱氧胸苷-3'-磷酸-5'-尿苷-3'-磷酸-5'-尿苷-3'-磷酸)；rUsrU(硫代磷酸接头：5'-尿苷-3'-硫代磷酸-5'-尿苷-3'-磷酸)；rUrU接头；dTsdTaa(aadTsdT,5'-2'脱氧胸苷-3'-硫代磷酸-5'-2'脱氧胸苷-3'-磷酸-5'-腺苷-3'-磷酸-5'-腺苷-3'-磷酸)；dTsdT(5'-2'脱氧胸苷-3'-硫代磷酸-5'-2'脱氧胸苷-3'-磷酸)；dTsdTuu＝uudTsdT＝5'-2'脱氧胸苷-3'-硫代磷酸-5'-2'脱氧胸苷-3'-磷酸-5'-尿苷-3'-磷酸-5'-尿苷-3'-磷酸。
在一些实施方式中，共价接头可包括多聚RNA，例如聚(5'-腺苷-3'-磷酸-AAAAAAAA)或聚(5'-胞苷-3'-磷酸-5'-尿苷-3'-磷酸-CUCUCUCU))，例如，Xn单链多聚RNA接头，其中n是2-50的整数，优选4-15(包括端值)，最优选7-8(包括端值)。经修饰的核苷酸或核苷酸的混合物也可以存在于所述多聚RNA接头中。共价接头可以是多聚DNA，例如多聚(5'-2'脱氧胸苷-3'-磷酸-TTTTTTTT)，例如，其中n是2-50的整数，优选4-15(包括端值)，最优选7-8(包括端值)。经修饰的核苷酸或核苷酸的混合物也可以存在于所述多聚DNA接头中。单链多聚DNA接头中n是2-50的整数，优选4-15(包括端值)，最优选7-8(包括端值)。经修饰的核苷酸或核苷酸的混合物也可以存在于所述多聚DNA接头中。
在一些实施方式中，共价接头可以包括二硫键，任选地，双-己基-二硫接头。在一个实施方式中，二硫箭头如下所示：
C12H26O4PS2(精确质量：329.1010；分子量：329.4362)。
在一些实施方式中，共价接头可以包括肽键，例如，包括氨基酸。在一个实施方式中，共价接头是1-10个氨基酸的长接头，优选包含4-5个氨基酸，任选地，X-Gly-Phe-Gly-Y，其中X和Y代表任何氨基酸。
在一些实施方式中，共价接头可以包括HEG，即六乙二醇接头。
4.2.4共价连接的取向
本公开的方面包括共价连接两个或更多个功能性寡核苷酸以形成多价寡核苷酸试剂。本发明人惊奇地发现，两个或更多个功能性寡核苷酸的连接方向和定位可以影响多价寡核苷酸试剂在诱导或沉默或调节靶基因表达方面的活性。在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸和接头的方向可以增强稳定性、寡核苷酸活性或其他有益特征，例如最大化靶基因输出，增加或减少一个或多个靶基因的活性或表达(例如，mRNA表达、蛋白质表达等)。
在一些实施方式中，两个相邻的功能性寡核苷酸与第一功能性寡核苷酸的5'端共价连接至第二功能性寡核苷酸的3'端，其间有或没有接头。在一些实施方式中，两个相邻的功能性寡核苷酸与第一功能性寡核苷酸的3'端共价连接至第二功能性寡核苷酸的5'端，其间有或没有接头。
例如，在一些实施方式中，第一ASO共价连接第一dsRNA的正义链或反义链的3'端；或者b)第一ASO共价连接第一dsRNA的正义或反义链的5'端。又如，在某些实施方式中，第一或第二ASO的5'端与连接组件偶联。在一些实施方式中，第一或第二ASO寡核苷酸的3'与连接组件偶联。
4.2.5多价寡核苷酸试剂中ASO的大小
通常，ASO的长度可能为15-25个核苷酸。本发明人惊奇地发现，多价寡核苷酸试剂中单链ASO的大小可影响多价寡核苷酸试剂诱导或沉默靶基因表达的活性。例如，在某些情况下，当ASO的大小从约20nt减少到12nt甚至6nt时，整个试剂的活性可增加。
在一些实施方式中，包含特定大小的ASO的多价寡核苷酸试剂可以增强稳定性、寡核苷酸活性或其他有益特性，例如最大化靶基因输出，增加或减少一个或多个靶基因的活性或表达(例如，mRNA表达、蛋白质表达等)。
在一些实施方式中，MVO试剂中的一个或多个ASO具有至少5个连续核苷酸长度的核苷酸序列，例如5-30个核苷酸长度，例如，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个核苷酸长度。
ASO的大小可以通过测试和比较包含所述一个或多个ASO的MVO试剂的作用或活性来选择。
4.2.5多价寡核苷酸试剂的亚型
本文公开了多种多价寡核苷酸试剂，其包含共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸，其中两个或更多个功能性寡核苷酸独立地选自：a)双链RNA(dsRNA)；和b)反义寡核苷酸(ASO)。
以下是关于包含各种功能性寡核苷酸的二价和三价寡核苷酸试剂的一些描述。这类实施方式不必然代表本发明的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。
4.2.5.1包含dsRNA和ASO的二价寡核苷酸试剂
在一些方面，本文公开了包含两个功能性寡核苷酸的二价寡核苷酸试剂，所述两个功能性寡核苷酸为：第一双链RNA(dsRNA)和第一反义寡核苷酸(ASO)。在这类二价寡核苷酸试剂中，dsRNA和ASO可以任意顺序排列，例如dsRNA-ASO或ASO-dsRNA。
在一些实施方式中，dsRNA选自小干扰RNA(siRNA)或小激活RNA(saRNA)，ASO是gapmer或mixmer。在一些实施方式中，两个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列(例如启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子)。
在一些实施方式中，dsRNA包含至少10个连续核苷酸的正义链和至少10个连续核苷酸的反义链。在一些实施方式中，dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的正义链和/或长度为10-60个核苷酸的反义链。在一些实施方式中，ASO具有长度为至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，ASO具有长度为5-30个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，二价寡核苷酸试剂的总长度为15至100个核苷酸。
在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。连接组件可以选自间隔子-9、间隔子-18、间隔子-C3和间隔子-C6或其衍生物，或本说明书中公开的或本领域已知的任何合适的连接组件。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过共价连接，其中R代表-H或-OH或-OMe，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接。
在一些实施方式中，功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。对化学修饰的核苷酸的修饰可以是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方式中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分在一些实施方式中，至少一种经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分、(E)-乙烯基膦酸酯部分或5'-甲基胞嘧啶部分。在一些实施方式中，功能性寡核苷酸在一个或多个核苷酸中包含一种或多种上述修饰(例如一个到多达全部的核苷酸修饰)。
在一些实施方式中，试剂中的ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接相邻的dsRNA。在一些实施方式中，试剂中的dsRNA在其正义链或反义链的3’端或者在其正义链或反义链的5’端共价连接ASO。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA或saRNA，并且ASO是gapmer和mixmer。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：(a)siRNA-gapmer；(b)siRNA-mixmer；(c)saRNA-gapmer；和(d)saRNA-mixmer，其中在(a)～(d)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列并通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。在一些实施方式中，ASO靶向5'-UTR。
在一些方面，dsRNA和/或ASO增加SMN2基因或蛋白质的表达。在一些实施方式中，通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)，ASO增加功能性SMN蛋白的产生，和/或dsRNA增加SMN2基因或蛋白质的表达。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:5)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:7)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:9)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:59)；和f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:6)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:8)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:10)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:53)；和f)R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链和反义链的核苷酸序列对的saRNA，该核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：a)DS06-0004：SEQ ID NO:5和SEQID NO:6；b)DS06-0031：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；c)DS06-0067：SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10；d)DS06-4A3：SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147；e)R6-04-S1：SEQ ID NO:59和SEQ IDNO:53；和f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)：SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:17。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链的核苷酸序列的siRNA，该正义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:3)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:138)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有反义链的核苷酸序列的siRNA，该反义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:4)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:139)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链和反义链的核苷酸序列对的siRNA，该核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：DS06-332i：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；siSOD1-388-ESC：SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：
a)DA06-4A-27A(SEQ ID NO:14)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:14的正义saRNA链部分互补；
b)DA06-4A-27B(SEQ ID NO:15)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:15的正义saRNA链部分互补；
c)R6-04M1-27A-S1L1V3(SEQ ID NO:18)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:18的正义saRNA链部分互补；
d)DA06-31A-27A(SEQ ID NO:19)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:8的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:19的正义saRNA链部分互补；
e)DA06-31B-27A(SEQ ID NO:20)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:20的反义saRNA链部分互补；
f)DA06-67A-27A(SEQ ID NO:21)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:21的正义saRNA链部分互补；
g)DA06-67B-27A(SEQ ID NO:22)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:22的反义saRNA链部分互补；
h)DA6-67A3'L0-27A(SEQ ID NO:23)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:23的正义saRNA链部分互补；
j)DA6-67A3'L9-27A(SEQ ID NO:24)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:24的正义saRNA链部分互补；
k)DA6-67A3'L4-27A(SEQ ID NO:25)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:25的正义saRNA链部分互补；
l)DA6-67B3'L0-27A(SEQ ID NO:26)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:26的反义saRNA链部分互补；
m)DA6-67B5'L1-27A(SEQ ID NO:27)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:27的反义saRNA链部分互补；
o)DA6-67B5'L9-27A(SEQ ID NO:29)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:29的反义saRNA链部分互补；
p)DA6-67B5'L4-27A(SEQ ID NO:30)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:30的反义saRNA链部分互补；
q)DA6-67B3'L9-27A(SEQ ID NO:31)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:31的反义saRNA链部分互补；
r)DA6-67B3'L4-27A(SEQ ID NO:32)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:32的反义saRNA链部分互补；
s)DA06-67A21L1-27A(SEQ ID NO:33)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:34的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:33的正义saRNA链部分互补；
t)DA06-67B21L1-27A(SEQ ID NO:36)，和正义saRNA链SEQ ID NO:35，其与SEQ IDNO:36的反义saRNA链部分互补；
u)DA6-04A3'L0-27A(SEQ ID NO:37)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:37的正义saRNA链部分互补；
v)DA6-04A5'L1-27A(SEQ ID NO:38)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:38的正义saRNA链部分互补；
w)DA6-04A5'L9-27A(SEQ ID NO:39)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:39的正义saRNA链部分互补；
x)DA6-04A5'L4-27A(SEQ ID NO:40)和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:40的正义saRNA链部分互补；
y)DA6-04A3'L1-27A(SEQ ID NO:41)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:41的正义saRNA链部分互补；
z)DA6-04A3'L9-27A(SEQ ID NO:42)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:42的正义saRNA链部分互补；
aa)DA6-04A3'L4-27A(SEQ ID NO:43)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:43的正义saRNA链部分互补；
bb)DA6-04B3'L0-27A(SEQ ID NO:44)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:44的反义saRNA链部分互补；
cc)DA6-04B3'L1-27A(SEQ ID NO:45)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:45的反义saRNA链部分互补；
dd)DA6-04B3'L9-27A(SEQ ID NO:46)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:46的反义saRNA链部分互补；
ee)DA6-04B3'L4-27A(SEQ ID NO:47)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:47的反义saRNA链部分互补；
ff)DA06-04A21L1-27A(SEQ ID NO:48)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:49的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:48的正义saRNA链部分互补；
gg)DA06-04B21L1-27A(SEQ ID NO:51)，和正义saRNA链SEQ ID NO:50，其与SEQID NO:51的反义saRNA链部分互补；
hh)R6-04M1-16nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:79)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:79的正义saRNA链部分互补；
ii)R6-04M1-15nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:80)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:80的正义saRNA链部分互补；
jj)R6-04M1-14nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:81)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:81的正义saRNA链部分互补；
kk)R6-04M1-13nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:82)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:82的正义saRNA链部分互补；
ll)R6-04M1-(12nt-B)-S1L1V3v(SEQ ID NO:83)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:83的正义saRNA链部分互补；
mm)R6-04M1-11nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:84)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:84的正义saRNA链部分互补；
nn)R6-04M1-10nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:85)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:85的正义saRNA链部分互补；
oo)R6-04M1-9nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:86)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:86的正义saRNA链部分互补；
pp)R6-04M1-8nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:87)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:87的正义saRNA链部分互补；
qq)R6-04M1-9nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:88)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:88的正义saRNA链部分互补；
rr)R6-04M1-6nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:89)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:89的正义saRNA链部分互补；
ss)DS06-4A-S2L5V(SEQ ID NO:128)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:17的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:128的正义saRNA链部分互补；
ss')DS06-4A-S2L1v(SEQ ID NO:16)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:17的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:16的正义saRNA链部分互补；
tt)DA6-27A-5'UTR(SE
tt)DA6-27A-5'UTR(SEQ ID NO:143)；
uu)DA6-5'UTR-27A(SEQ ID NO:144)；
vv)R6-67M3-27A-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:130的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
ww)R6-67M3-16nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:131的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
xx)R6-67M3-15nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:132的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
yy)R6-67M3-14nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:133的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA部分互补；
zz)R6-67M3-13nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:134的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
aaa)R6-67M3-12nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:135的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
bbb)R6-67M3-9nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:136的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
ccc)R6-67M3-8nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:137的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
其中，接头选自下组：L1、L4和L9，存在或不存在，其中L1表示间隔子18；L4表示间隔子C6；且L9表示间隔子9。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂如表7-11和13-14中所列。在一些实施方式中，上述多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
在一些方面，一个或多个功能性寡核苷酸增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或降低CD274/PDL-1表达。在一些实施方式中，dsRNA是增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达的saRNA；和/或降低CD274/PDL-1表达的siRNA。在一些实施方式中，ASO是增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达和/或降低CD274/PDL-1表达的ASO。
在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同且反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO：63)至少90％相同。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:64)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:66)。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:65)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:67)。在一些实施方式中，dsRNA是选自以下的siRNA：a)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:64)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:65)至少90％相同；和b)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:66)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:67)至少90％相同。
在一些实施方式中，ASO具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：a)aPDL1-1(SEQ ID NO:68)；b)aPDL1-2(SEQ ID NO:69)；和c)aPDL1-3(SEQ ID NO:70)。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：
a)aP21-40/aPDL1-1(SEQ ID NO:72)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:72的正义saRNA链部分互补；
b)saP21-40/aPDL1-2(SEQ ID NO:73)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:73的正义saRNA链部分互补；
c)aP21-40/aPDL1-3(SEQ ID NO:74)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:74的正义saRNA链部分互补；
d)saP21-40/aPDL1-1R(SEQ ID NO:75)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:75的正义saRNA链部分互补；
e)saP21-40/aPDL1-2R(SEQ ID NO:76)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:76的正义saRNA链部分互补；
f)saP21-40/aPDL1-3R(SEQ ID NO:77)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:77的正义saRNA链部分互补；
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂选自表16中所示的那些或与表16中所示的那些具有至少90％的序列相同性/同一性。在一些实施方式中，那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
4.2.5.2包含dsRNA和dsRNA的二价寡核苷酸试剂
在一些方面，本文公开了包含两个功能性寡核苷酸的二价寡核苷酸试剂，所述两个功能性寡核苷酸为：第一双链RNA(dsRNA)和第二双链RNA(dsRNA)。在这类寡核苷酸试剂中，dsRNA可以按任意顺序排列，例如dsRNA1-dsRNA2或dsRNA2-dsRNA1；两个功能性寡核苷酸可以通过接头或键共价连接。
在一些实施方式中，dsRNA选自小干扰RNA(siRNA)或小激活RNA(saRNA)，并且两个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列(例如启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子)。
在一些实施方式中，dsRNA包含至少10个连续核苷酸的正义链和至少10个连续核苷酸的反义链。在一些实施方式中，dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的正义链和/或长度为10-60个核苷酸的反义链。在一些实施方式中，二价寡核苷酸试剂的总长度为20至200个核苷酸。
在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。连接链接组件可以选自间隔子-9、间隔子-18、间隔子-C3和间隔子-C6或其衍生物，或本说明书中公开的或本领域已知的任何合适的连接组件。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过共价连接，其中R代表-H或-OH或-O Me，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接。
在一些实施方式中，功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。对化学修饰的核苷酸的修饰可以是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方式中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分在一些实施方式中，至少一种经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分、(E)-乙烯基膦酸酯部分或5'-甲基胞嘧啶部分。在一些实施方式中，功能性寡核苷酸在一个或多个核苷酸中包含一种或多种上述修饰(例如一个到多达全部核苷酸的修饰)。
在一些实施方式中，试剂中的dsRNA以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接。在一些实施方式中，试剂中的第一dsRNA在其正义链或反义链的3’端或者在其正义链或反义链的5’端共价连接第二dsRNA。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA或saRNA。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：(a)siRNA-siRNA；(b)siRNA-saRNA；(c)saRNA-saRNA，其中，在(a)～(c)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。在一些实施方式中，同一试剂中的功能性寡核苷酸可以相同或不同。
在一些方面，一个或多个dsRNA增加/抑制SMN2基因或蛋白质的表达。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:5)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:7)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:9)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:59)；和f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:6)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:8)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:10)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:53)；和f)R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链和反义链的核苷酸序列对的saRNA，其与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：a)DS06-0004：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；b)DS06-0031：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；c)DS06-0067：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；d)DS06-4A3：SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147；e)R6-04-S1：SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:53；和f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)：SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:17。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链的核苷酸序列的siRNA，该正义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:3)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:138)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有反义链的核苷酸序列的siRNA，该反义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:4)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:139)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链和反义链的核苷酸序列对的siRNA，该核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：DS06-332i：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；siSOD1-388-ESC：SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：
a)R6-04S1&67S1R-L1V2(SEQ ID NO:52)，和具有与链SEQ ID NO:52部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:52部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
b)R6-04S1&67S5-L1V2(SEQ ID NO:56)，和具有与链SEQ ID NO:56部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:56部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
c)R6-04M1&R17-388E-L1V2(SEQ ID NO:140)，和与链SEQ ID NO:99部分互补的反义saRNA链SEQ ID NO:17和与链SEQ ID NO:99部分互补的反义siRNA链SEQ ID NO:141；
d)DS06-4A-S2L1v(SEQ ID NO:16)，和与链SEQ ID NO:16部分互补的反义saRNA链SEQ ID NO:17；和
e)DS06-4A-S2L5V(SEQ ID NO:128)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:17的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:128的正义saRNA链部分互补。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂如表12和15中所列。在一些实施方式中，上述多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
在一些方面，一个或多个功能性寡核苷酸增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或降低CD274/PDL-1表达。在一些实施方式中，dsRNA是增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达的saRNA；和/或降低CD274/PDL-1表达的siRNA。
在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同且反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:64)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:66)。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:65)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:67)。在一些实施方式中，dsRNA是选自以下的siRNA：a)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:64)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:65)至少90％相同；和b)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:66)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:67)至少90％相同。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：
a)saP21-40/siPDL1-2(SEQ ID NO:71)，和具有与链SEQ ID NO:71部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:71部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:65的反义siRNA链；
b)saP21-40/siPDL1-3(SEQ ID NO:100)，和具有与SEQ ID NO:100的正义saRNA链部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:100部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:65的反义saRNA链。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂选自表16中所示的那些或与表16中所示的那些具有至少90％的序列相同性/同一性。在一些实施方式中，那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
4.2.5.3包含ASO和ASO的二价寡核苷酸试剂
在一些方面，本文公开了包含两个功能性寡核苷酸的二价寡核苷酸试剂，所述两个功能性寡核苷酸为：第一反义寡核苷酸(ASO1)和第二反义寡核苷酸(ASO2)。在这类二价寡核苷酸试剂中，dsRNA和ASO可以任何顺序排列，例如ASO1-ASO2或ASO2-ASO1。两个ASO可以相同或不同。
在一些实施方式中，ASO独立地选自gapmer或mixmer。在一些实施方式中，两个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列(例如启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子)。
在一些实施方式中，ASO具有长度为至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，ASO具有长度为5-30个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，二价寡核苷酸试剂的总长度为10至100个核苷酸。
在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。连接链接组件可以选自间隔子-9、间隔子-18、间隔子-C3和间隔子-C6或其衍生物，或本说明书中公开的或本领域已知的任何合适的连接组件。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过共价连接，其中R代表-H或-OH或-O Me，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接。
在一些实施方式中，功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。对化学修饰的核苷酸的修饰可以是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方式中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分在一些实施方式中，至少一种经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分、(E)-乙烯基膦酸酯部分或5'-甲基胞嘧啶部分。在一些实施方式中，功能性寡核苷酸在一个或多个核苷酸中包含一种或多种上述修饰(例如一个到多达全部核苷酸修饰)。
在一些实施方式中，试剂中的第一ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接第二ASO。在一些实施方式中，试剂中的第一ASO在其3’端或其5’端共价连接第二ASO。
在一些实施方式中，ASO选自gapmer或mixmer。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：(a)mixer-mixer；(b)gapmer-mixmer；(c)gapmer-gapmer，其中，在(a)～(c)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。在一些实施方式中，ASO靶向5'-UTR。
在一些方面，ASO增加SMN2基因或蛋白质的表达。在一些实施方式中，ASO通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)来增加功能性SMN蛋白产生。
在一些实施方式中，ASO的核苷酸序列与ASO10-27(SEQ ID NO:11)或5'UTR ASO(SEQ ID NO:142)的核苷酸序列至少90％相同。
在一些实施方式中，多价核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：
a)DA6-27A-5'UTR(SEQ ID NO:143)；和
b)DA6-5'UTR-27A(SEQ ID NO:144)。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂选自表17中所示的那些或与表17中所示的那些具有至少90％的序列相同性/同一性。在一些实施方式中，那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
4.2.5.4包含2个dsRNA和1个ASO的三价寡核苷酸试剂
在一些方面，本文公开了包含三个功能性寡核苷酸的三价寡核苷酸试剂，所述三个功能性寡核苷酸为：第一双链RNA(dsRNA)、第二dsRNA和第一反义寡核苷酸(ASO)。在这类三价寡核苷酸试剂中，dsRNA和ASO可以任意顺序排列，例如dsRNA1-dsRNA2-ASO、dsRNA2-dsRNA1-ASO、dsRNA1-ASO-dsRNA2、dsRNA2-ASO-dsRNA1、ASO-dsRNA1-dsRNA2、ASO-dsRNA2-dsRNA1。
在一些实施方式中，dsRNA选自小干扰RNA(siRNA)或小激活RNA(saRNA)，ASO是gapmer或mixmer。在一些实施方式中，两个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列(例如启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子)。
在一些实施方式中，dsRNA包含至少10个连续核苷酸的正义链和至少10个连续核苷酸的反义链。在一些实施方式中，dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的正义链和/或长度为10-60个核苷酸的反义链。在一些实施方式中，ASO具有长度为至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，ASO具有长度为5-30个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，三价寡核苷酸试剂的总长度为15至100个核苷酸。
在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。连接链接组件可以选自间隔子-9、间隔子-18、间隔子-C3和间隔子-C6或其衍生物，或本说明书中公开的或本领域已知的任何合适的连接组件。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过共价连接，其中R代表-H或-OH或-OMe，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接。
在一些实施方式中，功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。对化学修饰的核苷酸的修饰可以是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方式中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分在一些实施方式中，至少一种经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分、(E)-乙烯基膦酸酯部分或5'-甲基胞嘧啶部分。在一些实施方式中，功能性寡核苷酸在一个或多个核苷酸中包含一种或多种上述修饰(例如一个到多达全部核苷酸修饰)。
在一些实施方式中，试剂中的ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接相邻的dsRNA。在一些实施方式中，试剂中的dsRNA在其正义链或反义链的3’端或者在其正义链或反义链的5’端共价连接ASO。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA或saRNA，并且ASO是gapmer和mixmer。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：a)siRNA-siRNA-gapmer；b)siRNA-siRNA-mixmer；c)siRNA-saRNA-gapmer；d)siRNA-saRNA-mixmer；e)saRNA-saRNA-gapmer；f)saRNA-saRNA-mixmer，其中在a)～f)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。在一些实施方式中，ASO靶向5'-UTR。
在一些方面，一个或多个dsRNA和/或ASO增加SMN2基因或蛋白质的表达。在一些实施方式中，通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)，ASO增加功能性SMN蛋白的产生，和/或一个或多个dsRNA增加SMN2基因或蛋白质的表达。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:5)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:7)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:9)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:59)；和f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:6)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:8)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:10)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:53)；和f)R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链和反义链的核苷酸序列对的saRNA，该核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：a)DS06-0004:SEQ ID NO:5和SEQID NO:6；b)DS06-0031:SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；c)DS06-0067:SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10；d)DS06-4A3:SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147；e)R6-04-S1:SEQ ID NO:59和SEQ IDNO:53；f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4):SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:17。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链的核苷酸序列的siRNA，该正义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:3)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:138)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有反义链的核苷酸序列的siRNA，该反义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:4)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:139)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链和反义链的核苷酸序列对的siRNA，该核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：DS06-332i：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；siSOD1-388-ESC：SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：
a)R6-04S1&27A&67S1R-L1V2(SEQ ID NO:54)，和具有与链SEQ ID NO:54部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:54部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
b)R6-04S1&67S1R&27A-L1V2(SEQ ID NO:55)，和具有与链SEQ ID NO:55部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:55部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
c)R6-04S1&27A&67S5-L1V2(SEQ ID NO:57)，和具有与链SEQ ID NO:57部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:57部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；和
d)R6-04S1&67S5&27A-L1V2(SEQ ID NO:58)，和具有与链SEQ ID NO:58部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:58部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链，
其中L1表示间隔子-18；L4表示间隔子-C6；L9表示间隔子-9。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂如表12中所列。在一些实施方式中，上述多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
在一些方面，一个或多个功能性寡核苷酸增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或降低CD274/PDL-1表达。在一些实施方式中，dsRNA是增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达的saRNA；和/或降低CD274/PDL-1表达的siRNA。在一些实施方式中，ASO是增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达和/或降低CD274/PDL-1表达的ASO。
在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同且反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO：63)至少90％相同。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:64)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:66)。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:65)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:67)。在一些实施方式中，dsRNA是选自以下的siRNA：a)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:64)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:65)至少90％相同；和b)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:66)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:67)至少90％相同。
在一些实施方式中，ASO具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：a)aPDL1-1(SEQ ID NO:68)；b)aPDL1-2(SEQ ID NO:69)；和c)aPDL1-3(SEQ ID NO:70)。
在一些实施方式中，那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
在一些实施方式中，三价寡核苷酸试剂可以通过向二价寡核苷酸试剂(例如4.2.5.1或4.2.5.2中公开的二价寡核苷酸试剂)添加一个dsRNA或ASO而产生。
4.2.5.5包含1个dsRNA和2个ASO的三价寡核苷酸试剂
在一些方面，本文公开了包含三个功能性寡核苷酸的三价寡核苷酸试剂，所述三个功能性寡核苷酸为：第一双链RNA(dsRNA)、第一反义寡核苷酸(ASO)和第二ASO。在这类三价寡核苷酸试剂中，dsRNA和ASO可以任意顺序排列，例如dsRNA-ASO1-ASO2、dsRNA-ASO2-ASO1、ASO1-dsRNA-ASO2、ASO1-ASO2-dsRNA、ASO2-dsRNA-ASO1、ASO2-ASO1-dsRNA。
在一些实施方式中，dsRNA选自小干扰RNA(siRNA)或小激活RNA(saRNA)，ASO是gapmer或mixmer。在一些实施方式中，两个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列(例如启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子)。
在一些实施方式中，dsRNA包含至少10个连续核苷酸的正义链和至少10个连续核苷酸的反义链。在一些实施方式中，dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的正义链和/或长度为10-60个核苷酸的反义链。在一些实施方式中，ASO具有长度为至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，ASO具有长度为5-30个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，三价寡核苷酸试剂的总长度为15至100个核苷酸。
在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。连接链接组件可以选自间隔子-9、间隔子-18、间隔子-C3和间隔子-C6或其衍生物，或本说明书中公开的或本领域已知的任何合适的连接组件。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过共价连接，其中R代表-H或-OH或-OMe，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接。
在一些实施方式中，功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。对化学修饰的核苷酸的修饰可以是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方式中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分在一些实施方式中，至少一种经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分、(E)-乙烯基膦酸酯部分或5'-甲基胞嘧啶部分。在一些实施方式中，功能性寡核苷酸在一个或多个核苷酸中包含一种或多种上述修饰(例如一个到多达全部核苷酸修饰)。
在一些实施方式中，试剂中的ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接相邻的dsRNA或ASO。在一些实施方式中，试剂中的dsRNA在其正义链或反义链的3’端或者在其正义链或反义链的5’端共价连接ASO或dsRNA。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA或saRNA，并且ASO是gapmer和mixmer。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：a)siRNA-gapmer-gapmer；b)saRNA-gapmer-gapmer；c)siRNA-gapmer-mixmer；d)saRNA-gapmer-mixmer；e)siRNA-mixmer-mixmer；f)saRNA-mixmer-mixmer，其中在a)～f)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。在一些实施方式中，ASO靶向5'-UTR。
在一些方面，dsRNA和/或一个或多个ASO增加SMN2基因或蛋白质的表达。在一些实施方式中，通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)，一个或多个ASO增加功能性SMN蛋白的产生，和/或，一个或多个dsRNA增加SMN2基因或蛋白质的表达。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:5)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:7)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:9)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:59)；和f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:6)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:8)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:10)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:53)；和f)R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有一对正义链和反义链的核苷酸序列的saRNA，其与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004:SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；b)DS06-0031:SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；c)DS06-0067:SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；d)DS06-4A3:SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147；e)R6-04-S1:SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:53；f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4):SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:17。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链的核苷酸序列的siRNA，该正义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:3)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:138)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有反义链的核苷酸序列的siRNA，该反义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:4)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:139)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链和反义链的核苷酸序列对的siRNA，该核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：DS06-332i：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；siSOD1-388-ESC：SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139。
在一些实施方式中，上述多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
在一些方面，一个或多个功能性寡核苷酸增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或降低CD274/PDL-1表达。在一些实施方式中，dsRNA是增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达的saRNA；和/或降低CD274/PDL-1表达的siRNA。在一些实施方式中，ASO是增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达和/或降低CD274/PDL-1表达的ASO。
在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同且反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO：63)至少90％相同。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:64)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:66)。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:65)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:67)。在一些实施方式中，dsRNA是选自以下的siRNA：a)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:64)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:65)至少90％相同；和b)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:66)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:67)至少90％相同。
在一些实施方式中，ASO具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：a)aPDL1-1(SEQ ID NO:68)；b)aPDL1-2(SEQ ID NO:69)；和c)aPDL1-3(SEQ ID NO:70)。
在一些实施方式中，那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
在一些实施方式中，三价寡核苷酸试剂可以通过向二价寡核苷酸试剂(例如4.2.5.1或4.2.5.3中公开的二价寡核苷酸试剂)添加一个dsRNA或ASO而产生。
4.2.5.6包含3个dsRNA的三价寡核苷酸试剂
在一些方面，本文公开了包含三个功能性寡核苷酸的三价寡核苷酸试剂，所述三个功能性寡核苷酸为：第一双链RNA(dsRNA)、第二dsRNA和第三dsRNA。在这类三价寡核苷酸试剂中，dsRNA可以任意顺序排列，例如dsRNA1-dsRNA2-dsRNA3、dsRNA1-dsRNA3-dsRNA2、dsRNA2-dsRNA1-dsRNA3、dsRNA2-dsRNA3-dsRNA1、dsRNA3-dsRNA1-dsRNA2、dsRNA3-dsRNA2-dsRNA1。在一些实施方式中，三个功能性寡核苷酸可以通过接头或键共价连接。
在一些实施方式中，dsRNA选自小干扰RNA(siRNA)或小激活RNA(saRNA)，并且三个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列(例如启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子)。
在一些实施方式中，各dsRNA包含至少10个连续核苷酸的正义链和至少10个连续核苷酸的反义链。在一些实施方式中，各dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的正义链和/或长度为10-60个核苷酸的反义链。在一些实施方式中，三价寡核苷酸试剂的总长度为30至250个核苷酸。
在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。连接链接组件可以选自间隔子-9、间隔子-18、间隔子-C3和间隔子-C6或其衍生物，或本说明书中公开的或本领域已知的任何合适的连接组件。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过共价连接，其中R代表-H或-OH或-OMe，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接。
在一些实施方式中，功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。对化学修饰的核苷酸的修饰可以是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方式中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分在一些实施方式中，至少一种经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分、(E)-乙烯基膦酸酯部分或5'-甲基胞嘧啶部分。在一些实施方式中，功能性寡核苷酸在一个或多个核苷酸中包含一种或多种上述修饰(例如一个到多达全部核苷酸修饰)。
在一些实施方式中，试剂中的dsRNA以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接。在一些实施方式中，试剂中的一个dsRNA在其正义链或反义链的3’端或者在其正义链或反义链的5’端共价连接其他dsRNA。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA或saRNA。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：(a)siRNA-siRNA-siRNA；b)siRNA-siRNA-saRNA；c)siRNA-saRNA-saRNA；d)saRNA-saRNA-saRNA，其中，在(a)～(d)的任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。在一些实施方式中，同一试剂中的两个或更多个功能性寡核苷酸可以相同或不同。
在一些方面，一个或多个dsRNA增加/抑制SMN2基因或蛋白质的表达。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:5)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:7)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:9)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:59)；和f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)。
在一些实施方式中，dsRNA包含saRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004(SEQ ID NO:6)；b)DS06-0031(SEQ ID NO:8)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:10)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；e)R6-04-S1(SEQ ID NO:53)；和f)R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有一对正义链和反义链的核苷酸序列的saRNA，其与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)DS06-0004:SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；b)DS06-0031:SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；c)DS06-0067:SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；d)DS06-4A3:SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147；e)R6-04-S1:SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:53；f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4):SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:17。
在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链的核苷酸序列的siRNA，该正义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:3)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:138)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有反义链的核苷酸序列的siRNA，该反义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:4)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:139)的核苷酸序列至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA包含具有正义链和反义链的核苷酸序列对的siRNA，其与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：DS06-332i：SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4；siSOD1-388-ESC：SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139。
在一些方面，一个或多个功能性寡核苷酸增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或降低CD274/PDL-1表达。在一些实施方式中，dsRNA是增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达的saRNA；和/或降低CD274/PDL-1表达的siRNA。
在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。在一些实施方式中，dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同且反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:64)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:66)。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：a)siPDL1-2(SEQ ID NO:65)；和b)siPDL1-3(SEQ ID NO:67)。在一些实施方式中，dsRNA是选自以下的siRNA：a)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:64)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:65)至少90％相同；和b)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:66)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:67)至少90％相同。
在一些实施方式中，那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。在一些实施方式中，三价寡核苷酸试剂可以通过向二价寡核苷酸试剂(例如4.2.5.2中公开的二价寡核苷酸试剂)添加一个dsRNA而产生。
4.2.5.7包含3个ASO的三价寡核苷酸试剂
在一些方面，本文公开了包含三个功能性寡核苷酸的三价寡核苷酸试剂，所述三个功能性寡核苷酸为：第一反义寡核苷酸(ASO)、第二ASO和第三ASO。在这类三价寡核苷酸试剂中，ASO可以任意顺序排列，例如ASO1-ASO2-ASO3、ASO1-ASO3-ASO2、ASO2-ASO1-ASO3、ASO2-ASO3-ASO1、ASO3-ASO1-ASO2、ASO3-ASO2-ASO1。两个或三个ASO可以相同或不同。
在一些实施方式中，ASO独立地选自gapmer或mixmer。在一些实施方式中，三个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列(例如启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子)。
在一些实施方式中，各ASO具有长度为至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，ASO具有长度为5-30个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，三价寡核苷酸试剂的总长度为15至150个核苷酸。
在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。连接链接组件可以选自间隔子-9、间隔子-18、间隔子-C3和间隔子-C6或其衍生物，或本说明书中公开的或本领域已知的任何合适的连接组件。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过共价连接，其中R代表-H或-OH或-OMe，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接。
在一些实施方式中，功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。对化学修饰的核苷酸的修饰可以是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方式中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分在一些实施方式中，至少一种经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分、(E)-乙烯基膦酸酯部分或5'-甲基胞嘧啶部分。在一些实施方式中，功能性寡核苷酸在一个或多个核苷酸中包含一种或多种上述修饰(例如一个到多达全部核苷酸修饰)。
在一些实施方式中，试剂中的一个ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接另一ASO。在一些实施方式中，试剂中的一个ASO在其3’端或其5’端共价连接另一ASO。
在一些实施方式中，ASO选自gapmer或mixmer。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：a)gapmer-gapmer-gapmer；b)gapmer-gapmer-mixmer；c)gapmer-mixmer-mixmer；d)mixmer-mixmer-mixmer，其中在(a)～(d)中任一项中，功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。在一些实施方式中，ASO靶向5'-UTR。
在一些方面，ASO增加SMN2基因或蛋白质的表达。在一些实施方式中，ASO通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)来增加功能性SMN蛋白产生。
在一些实施方式中，ASO的核苷酸序列与ASO10-27(SEQ ID NO:11)或5'UTR ASO(SEQ ID NO:142)的核苷酸序列至少90％相同。
在一些实施方式中，那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。在一些实施方式中，三价寡核苷酸试剂可以通过向二价寡核苷酸试剂(例如4.2.5.3中公开的二价寡核苷酸试剂)添加一个dsRNA而产生。
4.2.5.8包含超过3个功能性寡核苷酸的多价寡核苷酸试剂
在一些方面，本文公开了多价寡核苷酸试剂，其包含超过3个共价连接的功能性寡核苷酸，其中四个或更多个功能性寡核苷酸独立地选自：a)双链RNA(dsRNA)；和b)反义寡核苷酸(ASO)。在这类多价寡核苷酸试剂中，一个或多个dsRNA和一个或多个ASO可以任何顺序排列。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂中包含的功能性寡核苷酸的数量为4至X，其中X为5至10的整数。在一些实施方式中，试剂中包含的dsRNA的数量为0到X，并且其余的功能性寡核苷酸是一个或多个ASO。
在一些实施方式中，dsRNA选自小干扰RNA(siRNA)或小激活RNA(saRNA)，ASO是gapmer或mixmer。在一些实施方式中，两个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列(例如启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子)。
在一些实施方式中，各dsRNA包含至少10个连续核苷酸的正义链和至少10个连续核苷酸的反义链。在一些实施方式中，各dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的正义链和/或长度为10-60个核苷酸的反义链。在一些实施方式中，各ASO具有长度为至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，各ASO具有长度为5-30个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂的总长度为20至200个核苷酸。
在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。连接链接组件可以选自间隔子-9、间隔子-18、间隔子-C3和间隔子-C6或其衍生物，或本说明书中公开的或本领域已知的任何合适的连接组件。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过共价连接，其中R代表-H或-OH或-O Me，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰。在一些实施方式中，两个相邻功能性寡核苷酸通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或通过一个或多个核苷酸共价连接。
在一些实施方式中，功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。对化学修饰的核苷酸的修饰可以是选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰。在一些实施方式中，至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰。在一些实施方式中，至少一个经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分在一些实施方式中，至少一种经化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分、(E)-乙烯基膦酸酯部分或5'-甲基胞嘧啶部分。在一些实施方式中，功能性寡核苷酸在一或多个核苷酸中包含一种或多种上述修饰(例如一个到多达全部核苷酸修饰)。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂中的两个或更多个功能性寡核苷酸的序列相同或不同；和/或两个或更多个功能性寡核苷酸的功能相同或不同。
在一些实施方式中，那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂可以通过向二价寡核苷酸试剂(例如4.2.5.1～4.2.5.3中公开的二价寡核苷酸试剂)或向三价寡核苷酸试剂(例如4.2.5.4～4.2.5.7中公开的三价寡核苷酸试剂)添加一个或多个dsRNA和/或ASO(例如本文公开的一个或多个)而产生。
4.3多价寡核苷酸试剂的示例性功能
本文还公开了具有多种功能的多价寡核苷酸试剂。在一些实施方式中，取决于多价寡核苷酸试剂中的功能性寡核苷酸，该试剂可用于靶向与特定疾病相关的一个或多个所需基因以产生治疗效果。因此，还提供了使用多价寡核苷酸试剂治疗疾病的方法和包含用于疾病治疗的多价寡核苷酸试剂的产品。
多价寡核苷酸试剂可用于调控和/或调节感兴趣靶标(其可能与某些疾病相关)的表达和/或活性。根据本公开内容和精神，可以设计合适的多价寡核苷酸试剂，其特异性结合、调控和/或调节一个或多个感兴趣靶标的表达和/或活性，并且可以通过常规实验评估多价寡核苷酸试剂的作用。
以下是本发明的一些示例性方面和实施方式。这类方面不必然代表本发明的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。
4.3.1增加SMN2基因或蛋白表达的多价寡核苷酸试剂
在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸增加SMN2基因或蛋白质的表达。向患者给予多价寡核苷酸试剂以治疗或延迟SMN缺陷相关病症(例如脊髓性肌萎缩症)的发作。在某些实施方式中，所述多价寡核苷酸试剂增加全长SMN蛋白的量，其通过例如激活/上调SMN2转录结合调节剪接外显子7包含来增加全长SMN2 mRNA的量。在某些实施方式中，全长SMN蛋白增加足以减少与SMN缺陷相关病症相关的症状的量。在某些实施方式中，全长SMN蛋白增加至少10％(例如，至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％)。
在某些实施方式中，增加SMN2基因或蛋白表达的多价寡核苷酸试剂的两个或更多个功能性寡核苷酸中的至少一个是saRNA。SMN2 saRNA激活或上调SMN2基因在其中SMN2基因正常表达的细胞中的表达。
在典型的实施方式中，SMN2 saRNA的第一链包含与SMN2基因启动子区域16-35个核苷酸片段具有至少75％序列同一性或序列互补性的区段，从而实现激活或上调基因的表达。
具体而言，SMN2 saRNA的第一链与SMN2基因启动子的区域具有同源性或互补性，并且所具有的同源性或互补性为至少75％，例如至少约79％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％，上述SMN2基因启动子的区域为从SMN2基因启动子的从-1639至-1481的区域(SEQ ID NO:124)、SMN2基因启动子的从-1090至-1008的区域(SEQ ID NO:125)、SMN2基因启动子的从-994至-180的区域(SEQ ID NO:126)或SMN2基因启动子的从-144至-37的区域(SEQ ID NO:127)。更具体地，SMN2 saRNA的一条链与选自SEQ ID NO:315-471的任何核苷酸序列具有至少75％，例如至少约79％或约99％的同源性或互补性。
在本公开中，SMN2 saRNA包含正义核酸片段和反义核酸片段。正义核酸片段和反义核酸片段包含能够形成双链核酸结构的互补区域，该双链核酸结构通过RNA激活机制促进SMN2基因在细胞中的表达。saRNA的正义核酸片段和反义核酸片段可以存在于两条不同的核酸链上或可以存在于相同的核酸链上。当正义和反义核酸片段存在于两条链上时，saRNA的至少一条链具有长度为0-6个核苷酸的3'突出端，优选两条链具有长度为2或3个核苷酸的3'突出端，并且优选地，突出端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。当saRNA的正义核酸片段和反义核酸片段存在于同一核酸链上时，优选地，saRNA是单链带发夹结构的核酸分子，其中正义核酸片段的互补区域和反义核酸片段形成双链核酸结构。在这类saRNA中，正义核酸片段和反义核酸片段的长度为10-60个核苷酸并且可以是16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个核苷酸。
在本公开的某些实施方式中，SMN2 saRNA包含正义核酸链和反义核酸链，所述正义核酸链包含与反义核酸上至少一个区域互补以形成能够激活细胞中SMN2基因表达的双链核酸结构的至少一个区域。
在本公开的某些实施方式中，正义核酸链和反义核酸链位于两条不同的核酸链上。
在本公开的某些实施方式中，正义核酸片段和反义核酸片段位于同一核酸链上，形成发夹单链核酸分子，其中反义核酸片段和正义核酸的互补区域片段形成双链核酸结构。
在本公开的某些实施方式中，至少一条核酸链具有长度为0至6个核苷酸的3'突出端。在本公开的某些实施方式中，两条核酸链都具有长度为2-3个核苷酸的3'突出端。在本公开的某些实施方式中，正义和反义核酸链的长度分别为16至35个核苷酸。
在一些实施方式中，通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2mRNA调节剂)，ASO增加功能性SMN蛋白的产生；第一、第二和/或第三dsRNA增加SMN2基因或蛋白质的表达。
如本文所用，术语“SMN2 mRNA调节剂”指增加功能性SMN2 mRNA和功能性SMN蛋白产生的SMN2 mRNA剪接或稳定性调节剂。术语“SMN2 mRNA调节剂”包括这样的试剂，其改变SMN2前体mRNA剪接方式，以使其包含制备功能性全长SMN蛋白所需的所有信息，例如，通过阻断SMN2基因的内含子7的内含子抑制性剪接区域的作用。SMN2 mRNA调节剂包括那些通过稳定剪接体和SMN2前体mRNA之间的相互作用来增加所需剪接和后续蛋白质生产的试剂(JMed Chem,2018年12月27日；61(24):11021-11036)，以及增强SMN2前体mRNA和U1小核糖核酸蛋白(snRNP)复合物形成的瞬时双链RNA结构稳定性的试剂(Nat Chem Biol,2015Jul；11(7):511-7)。在某些示例中，SMN2 mRNA调节剂将调节SMN2前体mRNA的剪接以在加工的转录物中包括外显子7。或者，本公开的SMN2 mRNA调节剂包括具有通过防止外显子7在剪接过程中被从成熟SMN mRNA剪接掉而增加功能性SMN蛋白水平的能力的试剂。根据本公开的SMN2mRNA调节剂还包括美国专利10,436,802和美国专利10,420,753中描述的那些，其各自的全部内容通过引用纳入本文。
根据本公开的SMN2 mRNA调节剂的示例包括哒嗪衍生物，例如WO2014028459A1中描述的那些，其全部内容通过引用纳入本文。SMN2 mRNA调节剂的具体示例包括布拉扑兰(也称为LMI070)和利司扑兰(也称为RG7916或RO7034067)。
根据本公开的SMN2 mRNA调节剂的其他示例包括反义寡核苷酸，例如能够反义靶向、置换和/或破坏SMN2基因中的内含子序列以增强剪接过程中SMN2全长(SMN2FL)转录物(包含外显子7的转录物)产生的反义寡核苷酸。在某些实施方式中，诺西那生(以销售)适合根据所公开的组合使用。
在一些实施方式中，dsRNA是小激活RNA(saRNA)。saRNA靶向细胞核中的调控序列，例如基因启动子，以通过RNAa(RNA激活)机制在转录水平上调基因表达。例如，激活或上调细胞中SMN2基因表达的小激活核糖核酸(saRNA)(本文也称为“SMN2 saRNA”)可以共价连接增加功能性SMN2 mRNA产生的一种或多种SMN2 mRNA剪接或稳定性调节剂(在本文中也称为“SMN2mRNA调节剂”)，以显著增加全长SMN2 mRNA和全长SMN蛋白水平。本文提供的共价连接多价寡核苷酸相较于单一疗法可增强治疗益处，并可因此使治疗转归最大化，例如，对于SMA患者。
在一些方面，本公开提供了分离的SMN2基因saRNA靶向位点，其在SMN2基因(NCBI基因编号：6607)启动子区域(UCSC基因组显示器坐标：chr5:70,044,612-70,049,522)具有任何连续的16-35个核苷酸序列。
在一些实施方式中，saRNA可以包括与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列：DS06-0004(SEQ ID NO:5)；b)DS06-0031(SEQID NO:7)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:9)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；e)R6-04-S1(SEQ IDNO:59)；和f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)。在一些实施方式中，saRNA可以包括与DS06-0004的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列。在一些实施方式中，saRNA可以包括与DS06-0031的核苷酸序列(SEQ ID NO:7)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列。在一些实施方式中，saRNA可以包括与DS06-0067的核苷酸序列(SEQ ID NO:9)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列。在一些实施方式中，saRNA可以包括与DS06-4A3的核苷酸序列(SEQID NO:12)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列。在一些实施方式中，saRNA可以包括与R6-04-S1的核苷酸序列(SEQ ID NO:59)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列。在一些实施方式中，saRNA可以包括与R6-04(20)-S1V1v(CM-4)的核苷酸序列(SEQ ID NO:60)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列。
在一些实施方式中，saRNA可以包括与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列：a)DS06-0004(SEQ ID NO:6)；b)DS06-0031(SEQID NO:8)；c)DS06-0067(SEQ ID NO:10)；d)DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；e)R6-04-S1(SEQID NO:53)；和f)R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。在某些实施方式中，saRNA可以包括与a)DS06-0004的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列。在某些实施方式中，saRNA可以包括与DS06-0031的核苷酸序列(SEQ ID NO:8)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列。在某些实施方式中，saRNA可以包括与DS06-0067的核苷酸序列(SEQ ID NO:10)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列。在某些实施方式中，saRNA可以包括与DS06-4A3的核苷酸序列(SEQ ID NO:147)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列。在某些实施方式中，saRNA可以包括与R6-04-S1的核苷酸序列(SEQ ID NO:53)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列。在某些实施方式中，saRNA可以包括与R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA。siRNA可以包括与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列：DS06-332i(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方式中，siRNA可以包括与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列：DS06-332i(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方式中，至少一种寡核苷酸是ASO。ASO可以设计为靶向基因的mRNA，以通过RNA酶H活性下调其表达，例如，用于使癌症的治疗效率最大化。
在一些实施方式中，ASO可以包括与ASO10-27的核苷酸序列(SEQ ID NO:11)至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸包含第一dsRNA和第二dsRNA。在某些实施方式中，第一和第二dsRNA各自是siRNA。
在一些实施方式中，第一和第二dsRNA各自是saRNA。可以设计saRNA以靶向基因的启动子序列，从而通过RNAa机制诱导其转录，例如，用于治疗各种癌症。
在一些实施方式中，第一dsRNA是saRNA，第二dsRNA是siRNA。在某些实施方式中，第二dsRNA是siRNA，第二dsRNA是saRNA。
在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸包含第一ASO和第二ASO。
在一些实施方式中，第一dsRNA是siRNA，第二寡核苷酸是ASO。
在一些实施方式中，第一dsRNA是saRNA，第二寡核苷酸是ASO。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-4A-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:14的正义saRNA链部分互补。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-4A-27B的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:15的正义saRNA链部分互补。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-27A-S1L1V3的核苷酸序列(SEQ IDNO:18)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:18的正义saRNA链部分互补。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-31A-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:19)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:8的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:19的正义saRNA链部分互补。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-31B-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:20)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:20的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-67A-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:21)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:21的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-67B-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:22)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:22的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67A3'L0-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:23)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:23的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67A3'L9-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:24)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:24的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67A3'L4-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:25的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67B3'L0-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:26的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67B5'L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:27)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:27的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67B3'L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:28)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:28的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67B5'L9-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:29)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:29的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67B5'L4-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:30)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:30的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67B3'L9-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:31)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:31的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-67B3'L4-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:32的部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-67A21L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:33)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:34的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:33的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-67B21L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:36)，以及正义saRNA链SEQ ID NO:35，其与SEQ ID NO:36的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04A3'L0-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:37)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:37的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04A5'L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:38)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:38的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04A5'L9-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:39)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:39的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04A5'L4-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:40)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:40的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04A3'L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:41)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:41的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04A3'L9-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:42)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:42的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04A3'L4-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:43)以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:43的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04B3'L0-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:44)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:44的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04B3'L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:45)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:45的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04B3'L9-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:46)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:46的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA6-04B3'L4-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:47)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:47的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列；DA06-04A21L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:48)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:49的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:48的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：DA06-04B21L1-27A的核苷酸序列(SEQ ID NO:51)，以及正义saRNA链SEQ ID NO:50，其与SEQ ID NO:51的反义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-27A-S1L1V3的核苷酸序列(CM-26)(SEQ ID NO:61)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:61的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-16nt-S1L1V3v的核苷酸序列(CM-27)(SEQ ID NO:79)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:79的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-15nt-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:80)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:80的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-14nt-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:81)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:81的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-13nt-S1L1V3的核苷酸序列(SEQ ID NO:82)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:82的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-(12nt-B)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:83)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:83的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-11nt-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:84)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:84的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-10nt-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:85)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:85的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-9nt-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:86)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:86的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-8nt-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:87)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:87的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-7nt-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:88)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:88的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-6nt-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:89)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:89的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列；R6-04M1-AC2(18)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:90)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:90的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(16)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:91)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:91的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(15)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:92)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:92的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(14)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:93)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:93的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(13)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:94)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:94的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(12)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:95)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:95的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(11)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:96)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:96的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(10)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:97)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:97的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(9)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:98)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:98的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04M1-AC2(8)-S1L1V3v的核苷酸序列(SEQ ID NO:99)，以及反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:99的正义saRNA链部分互补。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含第三寡核苷酸。在某些实施方式中，第三寡核苷酸选自siRNA、saRNA和ASO。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04S1&27A&67S1R-L1V2的核苷酸序列(SEQ ID NO:54)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:54的DS06-0004正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04S1&67S1R&27A-L1V2的核苷酸序列(SEQ ID NO:55)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:55的DS06-0004正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04S1&27A&67S5-L1V2的核苷酸序列(SEQ ID NO:57)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:57的DS06-0004正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：R6-04S1&67S5&27A-L1V2的核苷酸序列(SEQ ID NO:58)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:58的DS06-0004正义saRNA链部分互补。
4.3.2增加p21基因或蛋白表达并降低PDL-1基因或蛋白表达的试剂
本公开的方面包括增加p21基因或蛋白表达并减少PDL-1基因或蛋白表达的多价寡核苷酸试剂。
CDKN1A(p21)和CD274(PD-L1，程序性死亡配体1)是与肿瘤发生有关的两个重要基因。p21是负细胞周期调节剂和推定的肿瘤抑制因子，其saRNA激活可导致肿瘤抑制。PD-L1是癌症治疗的重要靶点，并且阻断PD-L1可以促进T细胞介导的针对癌症的免疫监视并已在癌症患者中显示出巨大的临床益处。
在一方面，本公开的多价寡核苷酸试剂包括共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸，以将PD-L1阻断和p21激活的肿瘤抑制作用组合在单一试剂上。
在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸包含第一dsRNA和第二dsRNA。在某些实施方式中，第一dsRNA是增加CDKN1A/p21基因或蛋白表达的saRNA。
在某些实施方式中，第二dsRNA包含降低CD274/PDL-1表达的siRNA。在其他实施方式中，第二dsRNA包含降低CD274/PDL-1表达的siRNA。
在一些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸包含第一dsRNA和第一ASO。在某些实施方式中，第二dsRNA包含降低CD274/PDL-1表达的第一ASO。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA。在某些实施方式中，siRNA可以包括与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列：siPDL1-2(SEQ IDNO:64)和siPDL1-3(SEQ ID NO:66)。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA。在某些实施方式中，siRNA可以包括与siPDL1-2的核苷酸序列(SEQ ID NO:64)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA。在某些实施方式中，siRNA可以包括与siPDL1-3的核苷酸序列(SEQ ID NO:66)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的正义链核苷酸序列。
在一些实施方式中，dsRNA是siRNA。在某些实施方式中，siRNA可以包括与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列：siPDL1-2(SEQ IDNO:65)和siPDL1-3(SEQ ID NO:67)。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA。在某些实施方式中，siRNA可以包括与siPDL1-2的核苷酸序列(SEQ ID NO:65)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列。在一些实施方式中，dsRNA是siRNA。在某些实施方式中，siRNA可以包括与siPDL1-3的核苷酸序列(SEQ ID NO:67)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的反义链核苷酸序列。
在一些实施方式中，至少两个寡核苷酸中的第二寡核苷酸包含ASO。在某些实施方式中，ASO具有与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：a)aPDL1-1(SEQ ID NO:72)；b)aPDL1-2(SEQ ID NO:73)；和c)aPDL1-3(SEQ ID NO:74)。在某些实施方式中，ASO具有与aPDL1-1的核苷酸序列(SEQ ID NO:72)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列。在某些实施方式中，ASO具有与aPDL1-2的核苷酸序列(SEQ IDNO:73)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列。在某些实施方式中，ASO具有与aPDL1-3的核苷酸序列(SEQ ID NO:74)至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含saRNA和siRNA。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：a)saP21-40/siPDL1-2(SEQ ID NO:71)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:71的正义saRNA链部分互补；和b)saP21-40/siPDL1-3(SEQ IDNO:100)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:100的正义saRNA链部分互补。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂包含saRNA和ASO。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：a)saP21-40/aPDL1-1(SEQ ID NO:72)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:72的正义saRNA链部分互补；b)saP21-40/siPDL1-3(SEQ ID NO:73)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:73的正义saRNA链部分互补；c)saP21-40/aPDL1-3(SEQ ID NO:74)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:74的正义saRNA链部分互补；d)saP21-40/aPDL1-1R(SEQ IDNO:75)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:75的正义saRNA链部分互补；e)saP21-40/aPDL1-2R(SEQ ID NO:76)，以及具有核苷酸序列SEQ IDNO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:76的正义saRNA链部分互补的；和f)saP21-40/aPDL1-3R(SEQ ID NO:77)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ IDNO:77的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：saP21-40/aPDL1-1的核苷酸序列(SEQ ID NO:72)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:72的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述序列至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：saP21-40/aPDL1-2的核苷酸序列(SEQ ID NO:73)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:73的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：saP21-40/aPDL1-3的核苷酸序列(SEQ ID NO:74)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:74的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：saP21-40/aPDL1-1R的核苷酸序列(SEQ ID NO:75)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:75的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：saP21-40/aPDL1-2R的核苷酸序列(SEQ ID NO:76)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:76的正义saRNA链部分互补。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂具有与下述至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的核苷酸序列：saP21-40/aPDL1-3R的核苷酸序列(SEQ ID NO:77)，以及具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:77的正义saRNA链部分互补。
4.4多价寡核苷酸试剂的组合物
本公开的另一方面提供包含一种或多种多价寡核苷酸试剂的药物组合物，所述多价寡核苷酸试剂包含如本公开中所述的一个或多个功能性寡核苷酸。
在一些实施方式中，药物组合物还包含至少一种药学上可接受的运载体。
在一个实施方式中，药学上可接受的运载体包括一种或多种水性运载体、脂质体、高分子聚合物和多肽。在一个实施方式中，药学上可接受的运载体包括一种或多种水性运载体、脂质体、高分子聚合物或多肽。在一个实施方式中，水性运载体可以是例如无RNA酶水或无RNA酶缓冲液。该组合物可以含有1-150nM，例如1-100nM，例如1-50nM、例如1-20nM、例如10-100nM、10-50nM、20-50nM、20-100nM、例如50nM的前述寡核苷酸，或编码根据本发明的寡核苷酸的核酸。
在一些实施方式中，组合物包含1-150nM含第一siRNA的第一dsRNA以及1-150nM含第二siRNA的第二dsRNA。在一些实施方式中，组合物包含1-150nM含第一saRNA的第一dsRNA以及1-150nM含第二saRNA的第二dsRNA。在一些实施方式中，组合物包含1-150nM含siRNA的第一dsRNA以及1-150nM含所述saRNA的第二dsRNA。在一些实施方式中，组合物包含1-150nM含saRNA的第一dsRNA以及1-150nM第一ASO。在一些实施方式中，组合物包含1-150nM含siRNA的第一dsRNA以及1-150nM第一ASO。在一些实施方式中，组合物包含1-150nM第一ASO以及1-150nM第二ASO。在一些实施方式中，组合物包含1-150nM含第一saRNA的第一dsRNA，1-150nM含第二saRNA的第二dsRNA，和1-150nM第三ASO。
本公开的另一方面涉及如本文所述的两个或更多个功能性寡核苷酸、编码如本文所述的两个或更多个功能性寡核苷酸的核酸、或包含此类两个或更多个功能性寡核苷酸或编码本文所述的两个或更多个功能性寡核苷酸的核酸的组合物的用途，其中两个或更多个功能性寡核苷酸共价连接，用于制备调节细胞表达的一个或多个基因或蛋白质的表达的一种或多种组合物。
另一实施方式提供了包含本公开的化合物和治疗惰性运载体、稀释剂或药学上可接受的赋形剂的药物组合物或药物，以及使用本公开的化合物制备此类组合物和药物的方法。在某些实施方式中，本公开的两个或更多个功能性寡核苷酸在相同的药物组合物中，因为两个或更多个功能性寡核苷酸共价连接。
本公开的组合物以符合良好医疗实践的方式配制、给药和给予。就此而言的考量因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体临床状况、病因、试剂递送部位、给药方法、给药安排，以及医务人员所知的其它因素。
包含本文所述的任何小分子化合物(例如，利司扑兰或布拉扑兰)的组合物可以通过任何合适的方式与多价寡核苷酸组合物组合物分开给予，包括口服、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道、经皮、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、皮内、鞘内和硬膜外和鼻内，以及如果需要，局部治疗、病灶内给药。对于多价寡核苷酸组合物，递送可以通过肠胃外输注，包括鞘内、肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。
本文所述的小分子化合物，例如，利司扑兰和布拉扑兰，可以以任何方便的给药形式给予，例如片剂、粉末、胶囊、溶液、分散剂、混悬剂、糖浆、喷雾、栓剂、凝胶、乳液、贴剂等。这类组合物可以包含药物制剂中的常规组分，例如稀释剂、运载体、pH调节剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂、抗氧化剂和其他活性剂。这类组合物还可以包含其他有治疗价值的物质。
典型的制剂通过将本发明的化合物与运载体或赋形剂混合来制备。合适的运载体和赋形剂为本领域技术人员所周知并且详述于例如Ansel H.C.等,《安塞尔药物剂型和药物输送系统(2004)》((Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(2004))LWW出版社(Lippincott,Williams&Wilkins),费城；Gennaro A.R.等,《雷明顿：科学与药学实践(2000)》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2000))LWW出版社,费城；和Rowe R.C,《药学赋形剂手册(2005)》(Handbook ofPharmaceutical Excipients(2005))医药出版社(Pharmaceutical Press),芝加哥中。制剂还可以包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂、稀释剂和其他已知的添加剂，以提供药物(即，本发明的化合物或其药物组合物)的精良呈递或有助于药物产品(即，药剂)的制造。
另一方面，本发明提供了根据本文所述任一实施方式的组合或根据本文所述任一实施方式的组合物在制备用于在个体中治疗基因或蛋白质相关病症的药物中的用途，所述组合是共价连接的多价寡核苷酸试剂的两个或更多个功能性寡核苷酸。根据某些实施方式的用途，病症可以包括SMN缺陷相关病症，其包括遗传性神经肌肉疾病，优选脊髓性肌萎缩症。在其他实施方式中，病症可以包括免疫相关病症，例如癌症。还提供了根据某些实施方式的用途，其中个体是哺乳动物，优选人。
4.5包含多价寡核苷酸试剂的试剂盒
在另一个方面，可以在一个或多个试剂盒中提供本文所述的任何多价寡核苷酸试剂或组合物，任选地包括试剂或组合物的使用说明。也就是说，试剂盒可以包括对多价寡核苷酸试剂或组合物在本文所述的任何方法中的用途的描述。本文所用“试剂盒”通常定义包括本发明实施方式的一种或多种组分(组件)和/或与本反相关联的(例如，先前所述的)其它组分(组件)的包装件、组装件或容器(例如隔热容器)。试剂盒的任何试剂或组分可以以液体形式(例如，溶液)或固体形式(例如，干燥的粉末、冷冻剂等)提供。
在一些情况下，试剂盒包括一种或多种组分，它们可以在相同或两个或更多个容器中，和/或其任何组合。容器能够容纳液体，并且非限制性示例包括瓶、小瓶、广口瓶、管、烧瓶、烧杯等。在某些情况下，容器是防溢的(当关闭时，无论容器如何颠倒，液体都无法从容器中流出)。
与本文所述的试剂、组合物和方法相关联的其它组合物或组分的示例包括但不限于：稀释剂、盐、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、干燥剂、抗菌剂、针头、注射器、包装材料、管、瓶、培养瓶、杯等，例如，用于使用、调整、组装、储存、包装、制备、混合、稀释和/或保存供特定用途所用的组分。在其中使用任何所述组分的液体形式的实施方式中，该液体形式可以是浓缩的或即用式的。
在其它实现方式中，试剂盒可包括由网站或任何形式的其它来源提供的用于使用试剂盒以及本文所述的组分和/或方法的指令或说明书。例如，说明书可包括有关使用、修改、混合、稀释、保存、组装、储存、包装和/或制备与试剂盒相关的组分和/或其它组分的说明。在某些情况下，说明书还可包括用于递送组分的说明，例如，用于在室温、零下温度、低温等进行运输或储存。说明书可以对试剂盒用户有用的任何形式提供，例如书面或口头(例如电话形式)、数字、光学、视觉(例如录像带、DVD等)和/或电子通信(包括互联网或网络类通信)，以任何方式提供。
4.5多价寡核苷酸试剂的用途/使用方法
本公开的多价寡核苷酸试剂可用于治疗与试剂的靶标相关的疾病的治疗方法。
本文提供了用于治疗疾病的方法，包括向需要治疗的对象给予本公开的一种或多种多价寡核苷酸试剂、组合物或试剂盒，其中多价寡核苷酸的一个或多个靶标与疾病相关。
以下是本发明的一些示例性方面和实施方式。这类方面不必然代表本发明的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。
4.5.1调节剪接和基因表达的方法
本公开的多价寡核苷酸能够用于治疗诸如脊髓性肌萎缩症(SMA)的疾病的治疗方法，所述SMA是一种常染色体隐性遗传病，其影响大约1/6000-8000名新生儿，并且是婴儿死亡的主要遗传原因。SMA由存活运动神经元(survival motor neuron，SMN)蛋白水平降低引起，该降低是由于染色体5q13.4上存活运动神经元基因(SMN1)端粒拷贝的纯合缺失或突变所致。
SMN蛋白由两个SMN基因(SMN1和SMN2)编码，两者的本质区别在于其编码序列的外显子7中的一个核苷酸的差异，其中SMN2基因中的胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)(Coovert,D.D.等，脊髓性肌萎缩症中的存活运动神经元蛋白(The survival motor neuron proteinin spinal muscular atrophy).Human Mol Genet(1997))。这一关键差异产生了隐匿剪接位点并导致约90％转录自SMN2基因的成熟SMN mRNA中的外显子7跳跃。缺少外显子7的SMN2mRNA(SMN2Δ7)产生截短的SMN蛋白，该蛋白质不稳定并且会迅速降解。在SMA患者中，SMN1基因不再产生任何SMN蛋白，并且SMN2所产生的全长SMN蛋白的数量不足以弥补SMN1的丢失，这导致骨髓前角中运动神经元的细胞凋亡性死亡、骨骼肌萎缩以及随之而来的虚弱(Monani,U.R.等，人着丝粒存活运动神经元基因(SMN2)挽救Smn(-/-)小鼠的胚胎致死率并在小鼠中导致脊髓性肌萎缩症(The human centromeric survival motor neuron gene(SMN2)rescues embryonic lethality in Smn(-/-)mice and results in a mouse withspinal muscular atrophy).Human Mol Genet(2000))。SMA患者症状的严重程度取决于患者细胞中SMN2基因的拷贝数——拷贝数越多，严重症状越轻(Harada,Y.等，SMN2拷贝数与脊髓性肌萎缩症临床表型之间的相关性：三个SMN2拷贝无法使一些患者免受疾病严重程度的影响(Correlation between SMN2 copy number and clinical phenotype of spinalmuscular atrophy:three SMN2 copies fail to rescue some patients from thedisease severity).J Neurol(2002))。
为了开发SMA的治疗方法，一种策略是使用剪接调节剂(SM)在剪接过程中刺激外显子7包含。就此而言，反义寡核苷酸(ASO)药物已获美国食品和药物管理局(FDA)批准上市(Hua,Y.和A.R.Krainer.反义介导的外显子包含.Methods Mol Biol(2012)和Stein,C.A.和D.Castanotto.2017年FDA批准的寡核苷酸疗法(FDA-ApprovedOligonucleotide Therapies in 2017).Mol Thera(2017))。另一种药物利司扑兰(RG7916)是一种在研口服小分子药物，其正在向FDA提交新药申请(NDA)(Ramdas,S.和L.Servais.脊髓性肌萎缩症的新治疗：当前可用数据综述(New treatments in spinalmuscular atrophy:an overview of currently availabledata).Expert Opin Pharmaco(2020))。这两种药物通过显著延长患者的生存期并改善运动里程碑改变了SMA的治疗。尽管存在这些改善，但是接受治疗的患者，特别是儿童，仍远未过上正常生活。几个似乎合理的原因可以解释SM的功效不足。一个是天花板效应，其限制了通过治疗恢复的全长SMN蛋白可达到的最大水平。SM对SMN2转录没有影响，因此不会增加可用SMN2前体mRNA的数量。为了使SMN蛋白恢复至其正常生理水平，SM在将SMN2Δ7mRNA转化为全长mRNA的体内效率最好达到100％，这是现实中不太可能发生的理想效果。因此，SM可为患者提供的最大功效受到SMN2前体mRNA可用性的限制。
治疗SMA的另一种治疗方法涉及刺激SMN2转录以增加全长SMN蛋白的水平。此前，已在体外和小鼠SMA模型中测试了各种表观遗传修饰剂，诸如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(例如丁酸钠、丙戊酸)和非HDAC抑制剂(例如羟基脲、塞来昔布、沙丁胺醇等)，但它们都未能证明显著的临床疗效(Lunke,S.和A.El-Osta.表观遗传修饰和染色质重塑在脊髓性肌萎缩症中的新兴作用(The emerging role of epigenetic modifications andchromatin remodeling in spinal muscular atrophy).JNeurochem(2009))。对于失败的一个解释是表观遗传修饰剂缺少靶标特异性。需要改进的方法和组合物来治疗SMN缺陷相关病症，例如脊髓性肌萎缩症。
本公开的另一个方面涉及治疗个体中SMN缺陷相关病症或延缓其发作的方法，该方法包括给予个体治疗有效量的如本文所述的多价寡核苷酸，编码如本文所述的多价寡核苷酸的核酸，或包含本发明的多价寡核苷酸或编码如本文所述的多价寡核苷酸的核酸的组合物。对象可以是哺乳动物，例如人。对象可以是婴儿、儿童或成人。在一个实施方式中，因SMN全长蛋白表达不足或SMN1基因突变所致疾病可以包括例如SMA。在一个实施方式中，因SMN全长蛋白表达不足、SMN1基因突变或缺失和/或全长SMN蛋白表达不足所致疾病为SMA。在一个实施方式中，本发明的SMA包括I型SMA、II型SMA、III型SMA和IV型SMA。
在一些方面，本公开的方法包括在有需要的对象中增加SMN2基因或蛋白表达同时还增加功能性SMN蛋白水平的方法，包括向对象给予包含多本公开的多价试剂和药学上可接受的运载体的药物组合物。
在某些实施方式中，功能性SMN蛋白的产生通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)来实现。
在一些实施方式中，本公开的方法还包括给予选自下组的至少一种或多种SMN2mRNA调节剂：诺西那生、利司扑兰和布拉扑兰。
本发明的另一个方面涉及本公开的多价寡核苷酸试剂编码本公开的多价寡核苷酸试剂的两个或更多个功能性寡核苷酸的核酸、或包含本公开的多价寡核苷酸试剂或编码本公开的多价寡核苷酸试剂的两个或更多个功能性寡核苷酸的核酸用于制备用于治疗SMN缺陷相关病症或延迟其发作的药物的用途。对象可以是哺乳动物，例如人。对象可以是婴儿、儿童或成人。在一个实施方式中，SMN缺陷相关病症可以包括例如SMA。在一个实施方式中，本发明的SMA包括I型SMA、II型SMA、III型SMA和IV型SMA。
还提供了根据本文所述的SMN2 dsRNA和SMN2 mRNA调节剂的任何一种组合或根据本文所述的SMN2 dsRNA和SMN2 mRNA调节剂的任何一种组合的组合物在制备用于增加细胞中全长SMN蛋白的量的制剂中的用途。在某些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。在某些实施方式中，细胞存在于人体内。在某些实施方式中，人是患有因SMN缺陷相关病症所致症状的患者。在某些实施方式中，组合或其组合物以有效治疗SMN缺陷相关病症的量给予。在某些实施方式中，因SMN缺陷相关病症引起的症状是与遗传性神经肌肉疾病(优选脊髓性肌萎缩症)相关的症状。
在某些实施方式中，共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸实现了全长SMN蛋白的增加，其大于通过单独使用相同量的任意物质的给予所实现的量，且毒性降低或不需要的副作用减少。在某些实施方式中，两个或更多个功能性寡核苷酸实现了全长SMN蛋白的增加，其大于单独使用相同量的任意寡核苷酸的治疗的累加效应。在某些实施方式中，当用于本文所述共价连接的组合的实施方式中时，以小于常规治疗所用量的量给予各寡核苷酸。在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂任选地包含SMN2 mRNA调节剂。
在某些实施方式中，相较于单独使用相同量的任意物质的作用，两个或更多个功能性寡核苷酸的组合的作用实现更大的临床改善。在某些实施方式中，相较于单独使用相同量的任意物质的作用，两个或更多个功能性寡核苷酸的组合的作用实现大于累加作用的临床改善。。
本公开还涉及增加细胞中全长SMN蛋白的量的方法，包括向细胞给予多价寡核苷酸，所述多价寡核苷酸包含两个或更多个如本文所述的功能性寡核苷酸，编码两个或更多个如本文所述的功能性寡核苷酸的核酸，或包含两个或更多个功能性寡核苷酸或两个或更多个如本文所述的功能性寡核苷酸的核酸的组合物。
在本文提供的任何实施方式中，可以将这类多价试剂、编码本公开的多价试剂的核酸、或包含这类多价试剂或编码本公开的多价试剂的核酸的组合物直接引入细胞中，或者可以在将编码多价试剂的核苷酸序列引入细胞后在细胞内产生，所述细胞优选哺乳动物细胞，更优选人细胞。这类细胞可以是离体的，例如细胞系等，或者可以存在于哺乳动物中，例如人。在一些实施方式中，人是患有SMN缺陷相关病症的患者或个体。在某些实施方式中，本发明编码多价试剂的核酸或包含上述多价试剂的组合物或编码多价试剂的核酸各自的量足以影响SMN缺陷相关病症的治疗。在一个实施方式中，SMN缺陷相关病症是SMA。在一个实施方式中，本公开的SMA包括I型SMA、II型SMA、III型SMA和IV型SMA。
在某些实施方式中，SMN2 dsRNA和SMN2 mRNA的组合在共价连接之时实现了全长SMN蛋白的增加，其大于通过单独使用相同量的任意物质的给药所实现的量。在某些实施方式中，相较于单一疗法的治疗，多价试剂的两个或更多个功能性寡核苷酸的组合降低毒性和/或降低不需要的副作用。在某些实施方式中，多价试剂的两个或更多个功能性寡核苷酸实现了全长SMN蛋白的增加，其大于单独使用相同量的任意物质的治疗的累加效应。在某些实施方式中，当共价连接时，各寡核苷酸以小于常规单一疗法治疗所有量的量给予。
在某些实施方式中，相较于单独使用相同量的任意物质的作用，多价试剂的两个或更多个功能性寡核苷酸实现更大的临床改善。在某些实施方式中，相较于单独使用相同量的任意物质的作用，多价试剂的两个或更多个功能性寡核苷酸实现大于累加作用的临床改善。
在某些实施方式中，基线测量值获自如本文定义的生物样品，获自给予本文所述疗法之前的个体。在某些实施方式中，生物样品是外周血单核细胞、血浆、血清、皮肤组织、脑脊液(CSF)。在某些实施方式中，外周血单核细胞和皮肤中SMN蛋白水平的增加与其在中枢神经系统(CNS)神经元中的水平相关，表明血液或皮肤中的这些水平的变化可以用作非侵入性替代物来确定CNS中SMN蛋白水平的变化。在其他实施方式中，相较于基线测量值，本文提供的组合使全长SMN蛋白的量增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少115％、至少120％、至少125％、至少130％、至少135％、至少140％、至少145％、至少150％、至少155％、至少160％、至少165％、至少170％、至少175％、至少180％、至少185％、至少190％、至少195％、至少200％、至少210％、至少215％、至少220％、至少225％、至少230％、至少235％、至少240％、至少245％、至少250％、至少255％、至少260％、至少265％、至少270％、至少275％、至少280％、至少285％、至少290％、至少295％、至少300％、至少310％、至少315％、至少320％、至少325％、至少330％、至少335％、至少340％、至少345％、至少350％、至少355％、至少360％、至少365％、至少370％、至少375％、至少380％、至少385％、至少390％、至少395％、至少400％。
本公开的组合物可以给予的剂量可以在宽范围内变化并且当然将适合各种情况下的个体需求。
在特定实施方式中，多价试剂在治疗、预防、延缓进展和/或改善因SMN1基因中失活突变或缺失所致疾病和/或与SMN1基因功能丧失或缺陷相关的疾病方面表现出大于累加作用或表现出协同作用，并且还用于保护与疾病的病理生理学有关的细胞，特别是用于脊髓性肌萎缩症(SMA)的治疗、预防、延缓进展和/或改善。
在某些实施方式中，在对象小于1周龄、小于1月龄、小于3月龄、小于6月龄、小于1岁、小于2岁、小于15岁或大于15岁时给予根据本公开的药物组合物的第一剂。
在某些实施方式中，包含多价试剂的至少一种药物组合物包含两个或更多个功能性寡核苷酸。多价剂的单剂量可以是单个0.1-15毫克剂量、单个1毫克剂量、单个2毫克剂量、单个3毫克剂量、单个4毫克剂量、单个5毫克剂量、单个6毫克剂量、single 7毫克剂量、单个8毫克剂量、单个9毫克剂量、单个10毫克剂量、单个11毫克剂量、单个12毫克剂量、单个13毫克剂量、单个14毫克剂量、单个15毫克剂量、单个16毫克剂量、单个17毫克剂量、单个18毫克剂量、单个19毫克剂量、单个20毫克剂量、单个21毫克剂量、单个22毫克剂量、单个23毫克剂量、单个24毫克剂量、单个25毫克剂量、单个26毫克剂量、单个27毫克剂量、单个28毫克剂量、单个29毫克剂量、单个30毫克剂量、单个35毫克剂量、单个40毫克剂量、单个45毫克剂量、or单个50毫克剂量。本文所述的剂量可以含有两种或更多种本公开的多价寡核苷酸试剂。
在某些实施方式中，多价寡核苷酸试剂以鞘内注射给药，例如通过腰椎穿刺、皮下或静脉内注射。
在某些实施方式中，当通过腰椎穿刺以鞘内注射给予一剂多价寡核苷酸试剂时，使用较小规格的针可以减少或改善与腰椎穿刺手术相关的一种或多种症状。在某些实施方式中，与腰椎穿刺相关的症状包括但不限于腰椎穿刺后综合征、头痛、背痛、发热、便秘、恶心、呕吐和穿刺部位疼痛。在某些实施方式中，使用24号或25号针头进行腰椎穿刺可减少或改善一种或多种腰椎穿刺后症状。在某些实施方式中，使用21、22、23、24或25号针头进行腰椎穿刺可减少或改善腰椎穿刺后综合症、头痛、背痛、发热、便秘、恶心、呕吐和/或穿刺部位疼痛。
建议的剂量频率是近似的，例如，在某些实施方式中，如果建议的剂量频率是第1天一剂和第29天第二剂，那么SMA患者可以在接受第一剂后的25、26、27、28、29、30、31、32、33或34天接受第二剂。在某些实施方式中，如果建议的剂量频率是第1天一剂和第15天第二剂，那么SMA患者可以在接受第一剂后的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天后接受第二剂。在某些实施方式中，如果建议的剂量频率是第1天一剂和第85天第二剂，那么SMA患者可以在接受第一剂后的80、81、82、83、84、85、86、87、88、89或90天后接受第二剂。
在某些实施方式中，将根据患者的年龄、患者的CSF体积或患者的年龄和/或估计的CSF体积来调整注射的剂量和/或体积(例如，参见Matsuzawa J,Matsui M,Konishi T,Noguchi K,Gur R C,Bilker W,Miyawaki T.健康婴儿和儿童大脑灰质和白质的年龄相关体积变化(Age-related volumetric changes of brain gray and white matter inhealthy infants and children).Cereb Cortex 2001年4月；11(4):335-342，其通过引用其全文内容方式纳入本文)。
在一些实施方式中，多价寡核苷酸试剂可通过载体递送或给予。可以使用可用于基因递送的任何载体。在一些变化中，可以使用病毒载体(例如AAV、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒)。可用于本公开的载体的非限制性示例包括但不限于人免疫缺陷病毒；HSV，单纯疱疹病毒；MMSV，莫洛尼鼠肉瘤病毒；MSCV，鼠干细胞病毒；SFV，塞姆利基森林病毒；SIN，辛德比斯病毒；VEE，委内瑞拉马脑炎病毒；VSV，水疱性口炎病毒；VV，牛痘病毒。
在一些实施方式中，载体是重组AAV载体。AAV载体是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性的方式整合至它们感染的细胞的基因组中。它们能够感染广泛的细胞，而不会对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎不参与人类病理学。AAV基因组已被克隆，测序和表征。它包含约4700个碱基，并在每端包含约145个碱基的倒置末端重复(ITR)区域，其作为病毒复制的起点。基因组的其余部分分为携带衣壳功能的两个基本区域：基因组的左侧部分，其包含参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因；以及基因组的右侧部分，其包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因。
AAV载体可使用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒都是合适的(参见例如，Blacklow，“细小病毒和人类疾病”("Parvoviruses and Human Disease")第165-174页，J.R.Pattison编.(1988)；Rose,Comprehensive Virology 3:1,1974；P.Tattersall，“细小病毒分类学的进化”("The Evolution of Parvovirus Taxonomy")刊于“细小病毒”("Parvoviruses")(J R Kerr,S F Cotmore.M EBloom,R M Linden,C RParrish编)第5-14页，Hudder Arnold，英国伦敦(2006)；和D E Bowles,J E Rabinowitz,RJ Samulski“依赖性细小病毒属”("The Genus Dependovirus")(J R Kerr,S F Cotmore.ME Bloom,R M Linden,C R Parrish编)第15-23页,Hudder Arnold，英国伦敦(2006)，其公开内容通过引用其全文方式纳入本文)。载体纯化方法可见于，例如美国专利号6,566,118、6,989,264和6,995,006以及WO/1999/011764题为“生成重组AAV载体的高滴度无辅助制备方法(Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of RecombinantAAV Vectors)”，其公开内容以引用其全文方式纳入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请号PCT/US2005/027091中进行了描述，其公开内容通过引用其全文方式纳入本文。衍生自AAV的载体在体外和体内转移基因的用途已经描述(参见例如，国际专利申请公开号91/18088和WO 93/09239；美国专利号4,797,368，6,596,535和5,139,941；以及欧洲专利号0488528，其均通过引用其全文方式纳入本文)。这些公开文本描述了其中rep和/或cap基因被去除并被目的基因替换的各种AAV衍生的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养细胞)或体内(直接进入生物体)转移目的基因的用途。根据本发明的复制缺陷重组AAV可通过将含有侧接两个AAV倒置末端重复序列(ITR)区域的目的核酸序列的质粒和携带AAV封装基因(rep和cap基因)的质粒共同转染到感染了人辅助病毒(例如腺病毒)的细胞系中来制备。然后，通过标准技术纯化产生的AAV重组体。
在一些实施方式中，用于本发明方法的一个或多个载体封装于病毒颗粒中(例如，AAV病毒颗粒，包括但不限于AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9，AAV10，AAV11，AAV12，AAV13，AAV14，AAV15和AAV16)。因此，发明可包括包含本文描述的任何载体的重组病毒颗粒(重组，因为它含有重组多核苷酸)。生产这种颗粒的方法在本领域是已知的，并且在美国专利号6,596,535中描述。
4.5.2调节免疫反应的方法
本公开的方面包括调节免疫应答的方法，包括向对象给予包含任何如本公开所述的多价寡核苷酸的药物组合物。
在一些实施方式中，调节免疫反应包括增加CDKN1A/p21基因或蛋白表达并降低CD274/PDL-1表达。
在一些实施方式中，药物组合物包含增加CDKN1A/p21基因或蛋白表达的第一dsRNA以及降低CD274/PDL-1表达的第二寡核苷酸。
该方法的某些方面还包括在有需要的对象中增加p21表达并降低PDL-1基因或蛋白表达的方法，包括：向对象给予本公开的药物组合物，其包括任何多价寡核苷酸试剂。
4.5.3治疗癌症的方法
该方法的某些方面方面包括治疗对象中实体瘤、癌症或恶性肿瘤的方法，包括向对象给予药物组合物，所述药物组合物包含本公开的多价寡核苷酸试剂和药学上可接受的运载体。
在一些实施方式中，治疗实体瘤包括抑制肿瘤和相关生长效应物。
在一些实施方式中，对象患有癌症。在某些实施方式中，对象患有恶性肿瘤。
如本文所用，术语“癌症”定义为特征在于异常细胞的快速和不受控制生长的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的示例包括但不限于：乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等
可以治疗的癌症包括未血管化或尚未基本上血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。待用本文所述的重组树突状细胞治疗的癌症类型包括但不限于癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤，以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症也包括在内。
实体瘤是异常组织团块，通常不包含囊肿或液体区域。实体瘤可以是良性的或恶性的。不同类型的实体瘤用形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤(例如肉瘤和癌)的示例包括：纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴系统恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，维尔姆斯氏瘤，宫颈癌，睾丸瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)，成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移。
在一些实施方式中，对象患有选自下组的癌症：结肠癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌，纤维肉瘤，黏液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨原性肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，内皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管内皮肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏肉瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，囊性腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，滋养细胞癌，精原细胞瘤，胚胎性癌，维尔姆斯氏瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，上皮细胞癌，胶质瘤，星形细胞瘤，髓母细胞瘤，默克尔细胞癌，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突胶质细胞瘤，脑膜瘤，黑色素瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，急性淋巴细胞白血病，急性髓系白血病，慢性白血病，红细胞增多症，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)，重链病，及其组合。
在其他实施方式中，癌症是选自下组的实体瘤：纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴系统恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，维尔姆斯氏瘤，宫颈癌，睾丸瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)，成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移。
在其他实施方式中，癌症是选自下组的实体瘤：纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌/结直肠癌，淋巴系统恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，维尔姆斯氏瘤，宫颈癌，睾丸瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)，成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移。
在一些实施方式中，该方法还包括给予通常用作癌症治疗标准护理的一种或多种其他药剂。在某些实施方式中，其他药剂选自放射、化疗、抗体药物偶联物和免疫调节抗体。
在一些实施方式中，化疗采用顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、长春花碱、伊立替康、依托泊苷或培美曲塞或其组合或其药学上可接受的盐。
在一些实施方式中，述免疫调节抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD40抗体、抗CTLA-4抗体或抗OX40抗体或其任何组合。
在一些实施方式中，抗体药物偶联物靶向c-Met激酶、LRRC15、EGFR或CS1或其任何组合。
在其他实施方式中，该方法还包括向患者给予免疫检查点抑制剂，包括任何一种或两种检查点抑制剂的组合，所述检查点抑制剂包括PD-1或PD-L1(B7-H1)的抑制剂，例如抗PD-1抗体，包括纳武单抗(nivolumab)(来自百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb)的纳武单抗)，派姆单抗(pembrolizumab)/兰姆单抗(lambrolizumab)，也称为MK-3475(来自默克公司(Merck)的Keytruda)，匹利珠单抗(pidilizumab)(Curetech)，AMP-224(Amplimmune)，或者抗PD-L1抗体，包括MPDL3280A(罗氏公司(Roche))，MDX-1105(百时美施贵宝公司)，MEDI-4736(阿斯利康公司(AstraZeneca))和MSB-0010718C(默克公司)，CTLA-4拮抗剂，例如抗CTLA-4抗体，包括抗CTLA4抗体Yervoy.TM.(伊匹单抗(ipilimumab)，百时美施贵宝公司)，特姆单抗(tremelimumab)(辉瑞公司(Pfizer))，替西单抗(ticilimumab)(阿斯利康公司)或AMGP-224(葛兰素史克公司(Glaxo Smith Kline))，或肿瘤特异性抗体，针对乳腺癌的曲妥珠单抗(trastuzumab)(赫塞汀(Herceptin))，针对淋巴瘤的利妥昔单抗(rituximab)(Rituxan)，或西妥昔单抗(cetuximab)(Erbitux)。
在一些实施方式中，给药途径是通过瘤内、瘤周、皮内、皮下、肌内、腹膜内注射。给予组合物以刺激免疫反应，并且可以通过推注、连续输注、从植入物中持续释放或其他合适的技术来给予。
在一些方面，本文所述的任何治疗方法还可包括向个体给予一种或多种其他抗癌疗法。可以使用各种类型的抗癌剂。非限制性示例包括：放疗，烷化剂(例如顺铂、卡铂或奥沙利铂)，抗代谢物(例如咪唑硫嘌呤或巯嘌呤)，蒽环类药物，植物生物碱(包括例如长春花生物碱(例如长春新碱，长春花碱，长春瑞滨或长春地辛)和紫杉烷(例如紫杉醇，他克唑或多西他赛醇))，拓扑异构酶抑制剂(例如喜树碱，伊立替康，托泊替康，安吖啶，依托泊苷，磷酸依托泊苷或替尼泊苷)，足叶草毒素(及其衍生物，例如依托泊苷和替尼泊苷)，抗体(例如，单克隆抗体或多克隆抗体)，酪氨酸激酶抑制剂(例如，甲磺酸伊马替尼(Gleevec.RTM.或Glivec.RTM.))，激素治疗，可溶性受体和其他抗肿瘤药(例如更生霉素，多柔比星，表柔比星，博来霉素，氮芥，环磷酰胺，苯丁酸氮芥或异环磷酰胺)。
可与抗PD-1抗体辅助使用的药剂包括但不限于：烷基化剂，血管生成抑制剂，抗体，抗代谢物，抗有丝分裂剂，抗恶性细胞增生的药剂，抗病毒药，极化激酶抑制剂，凋亡促进剂(例如，Bcl-2家族抑制剂)，死亡受体途径激活剂，Bcr-Abl激酶抑制剂，BiTE(双特异性T细胞结合剂)抗体，抗体药物联合物，生物反应修饰剂，布氏酪氨酸激酶(BTK)抑制剂，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂，细胞周期抑制剂，环氧酶-2抑制剂，DVD，病毒致癌基因同源物(ErbB2)受体抑制剂，生长因子抑制剂，热休克蛋白(HSP)-90抑制剂，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，激素疗法，免疫药物，细胞凋亡蛋白(IAP)抑制剂的抑制剂，插入型抗生素，激酶抑制剂，驱动蛋白抑制剂，Jak2抑制剂，哺乳动物雷帕霉素(rapamycin)靶蛋白抑制剂，微小RNA，有丝分裂原活化的胞外信号调节激酶抑制剂，多价结合蛋白，非甾体类抗炎药(NSAID)，多聚ADP(腺苷二磷酸)核糖聚合酶(PARP)抑制剂，铂类化疗药物，polo样激酶(Plk)抑制剂，磷脂肌醇3激酶(PI3K)抑制剂，蛋白酶体抑制剂，嘌呤类似物，嘧啶类似物，受体酪氨酸激酶抑制剂，类维生素A/三环素(deltoid)植物生物碱，小干扰核糖核酸(siRNA)，拓扑异构酶抑制剂，泛素连接酶抑制剂，以及这些试剂中一种或多种的组合
BiTE抗体是双特异性抗体，其通过同时结合两个细胞来引导T细胞攻击癌细胞。然后，T细胞攻击目标癌细胞。BiTE抗体的示例包括阿德木单抗(adecatumumab)(MicrometMT201)、博纳吐单抗(Blinatumomab)(Micromet MT103)等。不受理论的限制，T细胞引起目标癌细胞细胞凋亡的机制之一是通过细胞溶解颗粒组分的胞吐作用，其包括穿孔素和颗粒酶B。
多价结合蛋白是包含两个或更多个抗原结合位点的结合蛋白。多价结合蛋白经工程改造具有三个或更多抗原结合位点，并且通常不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”是指能够结合两个或更多个相关或不相关靶标的结合蛋白。双可变结构域(DVD)结合蛋白是包含两个或更多个抗原结合位点的四价或多价结合蛋白。这类DVD可以是单特异性的(即能够结合一种抗原)或多特异性的(即能够结合两种或多种抗原)。包含两条重链DVD多肽和两条轻链DVD多肽的DVD结合蛋白称为DVD Ig。DVD Ig的每一半包含重链DVD多肽、轻链DVD多肽和两个抗原结合位点。各结合位点包含重链可变结构域和轻链可变结构域，各抗原结合位点共有6个CDR参与抗原结合。
烷化剂包括但不限于六甲蜜胺，AMD-473，AP-5280，阿帕喹酮(apaziquone)，苯达莫司汀，布罗他林(brostallicin)，白消安，卡博醌，卡莫司汀(BCNU)，苯丁酸氮芥，CLORETAZINE.RTM.(laromustine，VNP 40101M)，环磷酰胺，达卡巴嗪，雌莫司汀，福莫司汀，葡磷酰胺(glufosfamide)，异环磷酰胺，KW-2170，洛莫司汀(lomustine)(CCNU)，马磷酰胺，美法仑，二溴甘露醇，二溴卫矛醇，尼莫司汀，氮芥N-氧化物，雷诺氮芥，替莫唑胺，噻替派，TREANDA.RTM.(苯达莫司汀)，曲奥舒凡(treosulfan)和曲洛磷胺(trofosfamide)。
血管生成抑制剂包括但不限于内皮特异性受体酪氨酸激酶(Tie-2)抑制剂，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，血管内皮生长因子受体(VEGF)抑制剂，δ样配体4(DLL4)抑制剂，胰岛素生长因子2受体(IGFR-2)抑制剂，基质金属蛋白酶2(MMP-2)抑制剂，基质金属蛋白酶9(MMP-9)抑制剂，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂，血小板反应蛋白类似物和血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶(VEGFR)抑制剂。
抗体药物偶联物包括但不限于靶向c-Met激酶(例如，美国专利号7,615,529中所述ADC)、LRRC15、CD30(例如，ADCETRIS.RTM.(本妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin))、CS1(例如，美国公开号20160122430中所述ADC)、DLL3(例如，洛伐妥珠单抗特司林(rovalpituzumab tesirine)(ROVA-T))、HER2(例如，KADCYLA.RTM.曲妥珠单抗美坦(trastuzumab emtansine))、EGFR(例如，美国公开公布号20150337042中所述ADC)和催乳素受体(例如，美国公开号20140227294中所述ADC)的那些ADC。
抗代谢物包括但不限于ALIMTA.RTM.(培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)，LY231514，MTA)，5-阿扎胞苷，XELODA.RTM.(卡培他滨(capecitabine))，卡莫氟，LEUSTAT.RTM.(克拉屈滨)，氯法拉滨，阿糖胞苷，阿糖胞苷烷磷酯(ocfosfate)，阿糖胞苷，地西他滨，去铁胺，去氧氟尿苷，依洛尼塞，EICAR(5-乙炔基-1-.β.-D-核呋喃基咪唑(ribofuranosylimidazole)-4-甲酰胺)，依西他滨，乙炔基胞苷，氟达拉滨(fludarabine)，单独或与亚叶酸结合的5-氟尿嘧啶，GEMZAR.RTM.(吉西他滨)，羟基脲，ALKERAN.RTM.(美法仑)，巯基嘌呤，6-巯基嘌呤核糖核苷，甲氨蝶呤，麦考酚酸，奈拉滨，诺拉曲塞，十八烷基磷酸盐(ocfosfate)，培利曲索(pelitrexol)，喷司他丁，雷替曲塞，利巴韦林，M2亚基抑制剂(triapine)，三甲曲沙，S-1，噻唑呋林，替加氟，TS-1，阿糖腺苷和UFT。
抗病毒药包括但不限于利托那韦、阿昔洛韦、西多福韦、更昔洛韦、膦甲酸、齐多夫定、利巴韦林和羟化氯喹。
极光激酶抑制剂包括但不限于ABT-348、AZD-1152、MLN-8054、VX-680、极光A特异性激酶抑制剂、极光B特异性激酶抑制剂和泛极光激酶抑制剂。
Bcl-2蛋白抑制剂包括但不限于ABT-263(navitoclax)，AT-101((-)棉酚)、GENASENSE.RTM.(G3139或奥布利默森(oblimersen)(Bcl-2-靶向反义寡核苷酸))，IPI-194，IPI-565，N-(4-(4-((4'-氯(1,1'-联苯)-2-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)-4-(((1R)-3-(二甲基氨基)-1-((苯基硫基)甲基)丙基)氨基)-3-硝基苯磺酰胺)，N-(4-(4-((2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-环己-1-烯-1-基)甲基)哌嗪-1-基)苯甲酰基)-4-(((1R)-3-(吗啉-4-基)-1-((苯基硫基)甲基)丙基)氨基)-3-((三氟甲基)磺酰基)苯磺酰胺，维奈托克(venetoclax)和GX-070(obatoclax)。
Bcr-Abl激酶抑制剂包括但不限于DASATINIB.RTM.(BMS-354825)，GLEEVEC.RTM.(伊马替尼(imatinib))。
BTK抑制剂包括但不限于依鲁替尼(ibrutinib)和阿卡替尼(acalabrutinib)。
CDK抑制剂包括但不限于AZD-5438，BMI-1040，BMS-032，BMS-387，CVT-2584，弗拉平度(flavopyridol)，GPC-286199，MCS-5A，PD0332991，PHA-690509，塞利西利(seliciclib)(CYC-202，R-罗可维汀)，ZK-304709。
COX-2抑制剂包括但不限于ABT-963，ARCOXIA.RTM.(艾托考昔)，BEXTRA.RTM.(伐地考昔)，BMS347070，CELEBREX.RTM.(塞来考昔)，COX-189(罗美昔布)，CT-3，DERAMAXX.RTM.(地拉考昔)，JTE-522，4-甲基-2-(3,4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺酰苯基-1H-吡咯)，MK-663(艾托考昔)，NS-398，帕瑞考昔，RS-57067，SC-58125，SD-8381，SVT-2016，S-2474，T-614和VIOXX.RTM.(罗非昔布)。
EGFR抑制剂包括但不限于ABX-EGF，抗EGFR免疫脂质体，EGF-疫苗，EMD-7200，ERBITUX.RTM.(西妥昔单抗(cetuximab))，HR3，IgA抗体，IRESSA.RTM.(吉非替尼(gefitinib))，TARCEVA.RTM.(埃洛替尼或OSI-774)，AGRISSO.RTM.(奥希替尼(osimertinib))，TP-38，EGFR融合蛋白和TYKERB.RTM.(拉帕替尼(lapatinib))。
ErbB2受体抑制剂包括但不限于CP-724-714，CI-1033(卡奈替尼(canertinib))，HERCEPTIN.RTM.(曲妥珠单抗)，TYKERB.RTM.(拉帕替尼(lapatinib))，OMNITARG.RTM.(2C4，鹏珠单开(petuzumab))，TAK-165，GW-572016(ionafarnib)，GW-282974，EKB-569，PI-166，dHER2(HER2疫苗)，APC-8024(HER-2疫苗)，抗HER/2neu双特异性抗体，B7.her2IgG3，ASHER2三功能双特异性抗体，mABAR-209，mAB2B-1。
组蛋白脱乙酰基酶抑制剂包括但不限于缩酚酸肽，LAQ-824，MS-275，trapoxin，辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid)(SAHA)，TSA，丙戊酸。
SP-90抑制剂包括但不限于17-AAG-nab，17-AAG，CNF-101，CNF-1010，CNF-2024，17-DMAG，格尔德霉素(geldanamycin)，IPI-504，KOS-953，MYCOGRAB.RTM.(HSP-90的人重组体抗体)，NCS-683664，PU24FCl，PU-3，根赤壳菌素(radicicol)，SNX-2112，STA-9090VER49009。
细胞凋亡蛋白的抑制剂包括但不限于HGS1029、GDC-0145、GDC-0152、LCL-161和LBW-242。
死亡受体途径的激活剂包括但不限于TRAIL，靶向TRAIL或死亡受体的抗体(例如DR4和DR5)，例如，Apomab，可那木单抗(conatumumab)，ETR2-ST01，GDC0145(来沙木单抗(lexatumumab))，HGS-1029，LBY-135，PRO-1762和曲妥单抗(tratuzumab)。
驱动蛋白抑制剂包括但不限于Eg5抑制剂，例如AZD4877，ARRY-520；和CENPE抑制剂，例如GSK923295A。
JAK-2抑制剂包括但不限于CEP-701(来沙替尼(lesaurtinib))、XL019和INCB018424。
EK抑制剂包括但不限于ARRY-142886、ARRY-438162、PD-325901和PD-98059。
mTOR抑制剂包括但不限于AP-23573，CCI-779，依维莫司(everolimus)，RAD-001，雷帕霉素(rapamycin)，替西罗莫司(temsirolimus))，ATP竞争性TORC1/TORC2抑制剂，包括PI-103、PP242、PP30和Torin 1。
非类固醇抗炎药物包括但不限于AMIGESIC.RTM(双水杨酯)，DOLOBID.RTM.(二氟尼柳)，MOTRIN.RTM.(布洛芬)，ORUDIS.RTM.(酮洛芬)，RELAFEN.RTM.(萘丁美酮)，FELDENE.RTM.(吡罗昔康)，布洛芬乳膏，ALEVE.RTM.(萘普生)和NAPROSYN.RTM.(萘普生)，VOLTAREN.RTM.(双氯芬酸)，INDOCIN.RTM.(吲哚美辛)，CLINORIL.RTM.(舒林酸)，TOLECTIN.RTM.(托美丁)，LODINE.RTM.(依托度酸)，TORADOL.RTM.(酮咯酸)，DAYPRO.RTM.(奥沙普秦)。
PDGFR抑制剂包括但不限于C-451，CP-673，CP-868596。
铂化疗药物包括但不限于顺铂，ELOXATIN.RTM.(奥沙利铂)依他铂(eptaplatin)，洛铂(lobaplatin)，奈达铂，PARAPLATIN.RTM.(卡铂)，沙铂。
Polo样激酶抑制剂包括但不限于BI-2536。
磷酸肌醇-3激酶(PI3K抑制剂包括但不限于渥曼青霉素(wortmannin)、LY294002、XL-147、CAL-120、ONC-21、AEZS-127、ETP-45658、PX-866、GDC-0941、BGT226、BEZ235和XL765。
血小板反应蛋白类似物包括但不限于ABT-510、ABT-567、ABT-898和TSP-1。
VEGFR抑制剂包括但不限于ABT-869，AEE-788，ANGIOZY.TM.(抑制血管生成的核糖酶(RibozymePharmaceuticals(科罗拉多州波尔市)和Chiron(加州埃默里维尔市))，阿西替尼(AG-13736)，AZD-2171，CP-547,632，CYRAMZA.RTM.(雷莫芦单抗)，IM-862，MACUGEN.RTM.(pegaptamib)，NEXAVAR.RTM.(索拉非尼，BAY43-9006)，帕唑帕尼(GW-786034)，瓦他拉尼(vatalanib)(PTK-787，ZK-222584)，SUTENT.RTM.(舒尼替尼，SU-11248)，STIVARGA.RTM.(瑞格拉非尼)，VEGF阱，ZACTIMA.TM.(万德他尼，ZD-6474)。
抗生素包括但不限于插入抗生素阿柔比星，放线菌素D，氨柔比星，安那霉素(annamycin)，多柔比星，BLENOXANE.RTM.(争光霉素)，柔红霉素，CAELYX.RTM.或MYOCET.RTM.(多柔比星脂质体)，依沙芦星，表柔比星(epirbucin)，格拉比星(glarbuicin)，ZAVEDOS.RTM.(伊达比星)，丝裂霉素C，奈莫柔比星，新制癌菌素，培洛霉素，吡柔比星，蝴蝶霉素(rebeccamycin)，斯替马拉(stimalamer)，链脲菌素，VALSTAR.RTM.(戊柔比星)和净司他丁
局部异构酶抑制剂包括但不限于阿柔比星，9-氨基喜树碱，氨萘非特，安吖啶，贝卡特林(becatecarin)，贝洛替康(belotecan)，BN-80915，CAMPTOSAR.RTM.(伊立替康盐酸盐)，喜树碱，CARDIOXANE.RTM.(右旋丙亚胺)，二氟替康(diflomotecan)，伊多特林(edotecarin)，ELLENCE.RTM.或PHARMORUBICIN.RTM.(表柔比星)，依托泊苷，依沙替康，10-羟基喜树碱，吉马替康，勒托替康，米托蒽醌，Onivyde.TM.(伊立替康脂质体)，欧拉赛林(orathecin)，匹拉布星(pirarbucin)，匹克散创(pixantrone)，鲁比替康，索布佐生，SN-38，拓弗泊苷(tafluposide)和托泊替康。
抗体包括但不限于AVASTIN.RTM.(贝伐单抗)，CD40-特异性抗体，chTNT-1/B，地诺单抗(denosumab)，ERBITUX.RTM.(西妥昔单抗(cetuximab))，HUMAX-CD4.RTM.(zanolimumab)，IGF1R-特异性抗体，林妥珠单抗(lintuzumab)，OX-40特异性抗体，PANOREX.RTM.(依决洛单抗(edrecolomab))，RENCAREX.RTM.(WXG250)，RITUXAN.RTM.(利妥昔单抗(rituximab))，曲美木单抗(ticilimumab)，曲妥珠单抗(trastuzimab)，帕妥珠单抗VECTIBIX.RTM.(帕尼单抗)以及I型和II型CD20抗体。
激素疗法包括但不限于ARIMIDEX.RTM.(阿那曲唑)，AROMASIN.RTM.(依西美坦)，阿佐昔芬，CASODEX.RTM.(比卡鲁胺)，CETROTIDE.RTM.(西曲瑞克)，地加瑞克(degarelix)，地洛瑞林(deslorelin)，DESOPAN.RTM.(曲洛司坦)，地塞米松，DROGENIL.RTM.，(氟他胺)，EVISTA.RTM.(雷洛昔芬)，AFEMA.RTM.(法倔唑)，FARESTON.RTM.(托瑞米芬)，FASLODEX.RTM.(氟维司群)，FEMARA.RTM.(来曲唑)，福美坦，糖皮质激素，HECTOROL.RTM.(度骨化醇)，RENAGEL.RTM.(司维拉姆碳酸盐)，拉索昔芬，亮丙瑞林(leuprolide)乙酸盐，MEGACE.RTM.(甲地孕酮(megesterol))，MIFEPREX.RTM.(米非司酮)，NILANDRON.RTM.(尼鲁米特)，NOLVADEX.RTM.(枸橼酸它莫西芬)，PLENAXIS.RTM.(阿巴瑞克)，泼尼松，PROPECIA.RTM.(非那雄胺)，rilostane，SUPREFACT.RTM.(布舍瑞林)，TRELSTAR.RTM.(促黄体素释放激素(LHRH))，VANTAS.RTM.(Histrelin移植物)，VETORYL.RTM.(曲洛司坦或modrastane)和ZOLADEX.RTM.(fosrelin，戈舍瑞林)。
类迪特尔(Deltoid)和类维生素A(retinoid)包括但不限于西奥骨化醇(EB1089，CB1093)，来沙骨化醇(lexacalcitrol)(KH1060)，芬维A胺，PANRETIN.RTM.(aliretinoin)，ATRAGEN.RTM.(脂质体维A酸)，TARGRETIN.RTM.(贝沙罗汀)和LGD-1550。
PARP抑制剂包括但不限于ABT-888(维利帕尼(veliparib))，KU-59436，AZD-2281(奥拉帕尼)，AG-014699(卢卡帕尼)，MK4827(尼拉帕利)，BMN-673(talazoparib)，依尼帕尼(iniparib)，BSI-201，BGP-15，INO-1001和ONO-2231。
植物生物碱包括但不局限于长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨。
蛋白酶体(Proteasome)抑制剂包括VELCADE.RTM.(硼替佐米)、KYPROLIS.RTM.(卡非佐米)、MG132、NPI-0052和PR-171。
免疫制剂的非限制性示例包括但不限于干扰素、免疫检查点抑制剂、共刺激剂和其他免疫增强剂。干扰素包括干扰素α、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素β、干扰素γ-1a、ACTIMMUNE.RTM.(干扰素γ-1b)或干扰素γ-n1及其组合。免疫检查点抑制剂包括靶向PD-L1(例如，德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、MEDI4736、MSB0010718C和MPDL3280A)以及CTLA4(细胞毒性淋巴细胞抗原4；例如，伊匹单抗、特姆单抗)的抗体。共刺激剂包括但不限于针对下述的抗体：CD3，CD40，CD40L，CD27，CD28，CSF1R，CD137(例如，乌鲁单抗(urelumab))，B7H1，GITR，ICOS，CD80，CD86，OX40，OX40L，CD70，HLA-DR，LIGHT，LIGHT-R，TIM3，A2AR，NKG2A，KIR(例如，利鲁单抗(lirilumab))，TGF-β(e.g.，例如，弗瑞索单抗(fresolimumab))及其组合。
其他药剂包括ALFAFERONE.RTM.，(IFN-α)，BAM-002(氧化谷胱甘肽)，BEROMUN.RTM.(他索纳明)，BEXXAR.RTM.(托西莫单抗)，CAMPATH.RTM.(阿仑单抗(alemtuzumab))，达卡巴嗪，地尼白介素，依帕珠单抗，GRANOCYTE.RTM.(利诺格拉司)，香菇多糖，白血球α干扰素，咪喹莫特，黑色素瘤疫苗，米妥莫单抗，莫拉司亭，MYLOTARG.RTM.(吉姆单抗奥佐米星)，NEUPOGEN.RTM.(非格司亭)，OncoVAC-CL，OVAREX.RTM.(奥戈伏单抗(oregovomab))，喷突莫单抗(pemtumomab)(Y-muHMFG1)，PROVENGE.RTM.(sipuleucel-T)，sargaramostim，sizofilan，替西白介素，THERACYS.RTM.(卡介苗)，乌苯美司，VIRULIZIN.RTM.(免疫治疗，LorusPharmaceuticals)，Z-100(Maruyama的特异性物质(SSM))，WF-10(Tetrachlorodecaoxide(TCDO))，PROLEUKIN.RTM.(阿地白介素)，ZADAXIN.RTM.(胸腺法新)，ZINBRYTA.RTM.(达克利珠单抗(daclizumab)高产工艺)和ZEVALIN.RTM.(.sup.90Y-替伊莫单抗)。
生物响应调节剂是改变火生物机体防卫机制或生物响应(例如组织细胞的存活、生长或分化)以使其具有抗肿瘤活性的试剂，包括但不限于芝糖肽(krestin)、香菇多糖、西佐喃(sizofuran)、溶链菌(picibanil)PF-3512676(CpG-8954)和乌苯美司。
嘧啶类似物包括但不限于阿糖胞苷(araC或阿糖胞苷C)，阿糖胞苷，去氧氟尿苷，FLUDARA.RTM.(氟达拉滨)，5-FU(5-氟尿嘧啶)，氮尿苷，GEMZAR.RTM.(吉西他滨)，TOMUDEX.RTM.(ratitrexed)和TROXATYL.RTM.(三乙酰尿核甙曲沙他滨)。
嘌呤类似物包括但不限于LANVIS.RTM.(硫鸟嘌呤)和PURI-NETHOL.RTM.(巯嘌呤)。
抗有丝分裂剂包括布拓布林(batabulin)，埃博霉素D(epothilone D)(KOS-862)，N-(2-((4-羟苯基)氨基)吡啶-3-基)-4-甲氧基苯磺酰胺，伊沙匹隆(BMS247550)，TAXOTERE.RTM.(多西他赛)，PNU100940(109881)，帕土匹龙(patupilone)，XRP-9881(拉洛他赛(larotaxel))，长春氟宁和ZK-EPO(合成的埃博霉素)。
泛素连接酶抑制剂包括但不限于MDM2抑制剂，例如咪唑啉类似物(nutlins)，以及NEDD8抑制剂，例如MLN4924。
多价试剂和相关组合物也可用于增强放疗的功效。放射治疗的示例包括外照射放射治疗、内部放射治疗(即近距离放射治疗)和全身放射治疗。
多价试剂和相关组合物可以可以辅助或与其他化学治疗剂联合给予，例如，ABRAXANE.RTM.(ABI-007)，ABT-100(法尼基转移酶抑制剂)，ADVEXIN.RTM.(Ad5CMV-p53疫苗)，ALTOCOR.RTM.或MEVACOR.RTM.(洛伐他汀(lovastatin))，AMPLIGEN.RTM.(多聚I：多聚C12U，合成的RNA)，APTOSYN.RTM.(exisulind)，AREDIA.RTM.(帕米膦酸)，阿加来必(arglabin)，L-天冬酰胺酶，阿他美坦(1-甲基-3,17-二酮-雄(甾)烷-1,4-二烯)，AVAGE.RTM.(他扎罗汀)，AVE-8062(combreastatin衍生物)BEC2(米妥莫单抗(mitumomab))，恶病质素(cachectin)或cachexin(肿瘤坏死因子)，canvaxin(疫苗)，CEAVAC.RTM.(癌疫苗)，CELEUK.RTM.(西莫白介素)，CEPLENE.RTM.(二盐酸组胺)，CERVARIX.RTM.(人乳头瘤病毒疫苗)，CHOP.RTM.(C：CYTOXAN.RTM.(环磷酰胺)；H：ADRIAMYCIN.RTM.(羟基阿霉素)；O：长春新碱(ONCOVIN.RTM.)；P：泼尼松)，CYPAT.TM.(醋酸环丙氯地孕酮)，康博他汀(combrestatin)A4P，DAB(389)EGF(通过His-Ala接头融合人表皮生长因子的的白喉毒素的催化和易位域)或TransMID-107R.TM.(白喉毒素)，达卡巴嗪，放线菌素D，5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)，恩尿嘧啶，EVIZON.TM.(角鲨胺乳酸盐)，DIMERICINE.RTM.(T4N5脂质体洗剂)，圆皮海绵内酯，DX-8951f(依沙替康甲磺酸盐)，恩萨他林(enzastaurin)，EPO906(epithilone B)，GARDASIL.RTM.(四价人乳头瘤病毒(6、11、16、18型)重组疫苗)，GASTRIMMUNE.RTM.，GENASENSE.RTM.，GMK(神经节糖苷结合疫苗)，GVAX.RTM.(前列腺癌疫苗)，常山酮(halofuginone)，西斯特林(hi sterelin)，羟基脲(hydroxycarbamide)，伊班膦酸(ibandroni cacid)，IGN-101，IL-13-PE38，IL-13-PE38QQR(cintredekin besudotox)，IL-13-假单胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin)，干扰素-α，干扰素-γ，JUNOVAN.TM.或MEPACT.RTM.(米伐木肽)，洛那法尼(lonafarnib)，5,10-亚甲基四氢叶酸酯(methylenetetrahydrofolate)，米替福新(十六烷基磷酸胆碱)，NEOVASTAT.RTM.(AE-941)，NEUTREXIN.RTM.(三甲曲沙葡糖醛酸盐)，NIPENT.RTM.(喷司他丁)，ONCONASE.RTM.(核糖核酸酶)，ONCOPHAGE.RTM.(黑素瘤疫苗治疗)，ONCOVAX.RTM.(IL-2疫苗)，ORATHECIN.RTM.(卢比替康)，OSIDEM.RTM.(抗体型细胞药物)，OVAREX.RTM.MAb(鼠科单克隆抗体)，紫杉醇，PANDIMEX.TM.(来自高丽参的糖苷配基皂草苷，含20(S)原人参萜二醇(aPPD)和20(S)原人参萜三醇(aPPT))，帕尼单抗，PANVAC.RTM.-VF(试验癌疫苗)，培门冬酶(pegaspargase)，PEG干扰素A，苯妥帝尔(Phenoxodiol)，甲基苄肼，rebimastat，REMOVAB.RTM.(卡妥索单抗(catumaxomab))，REVLIMID.RTM.(来那度胺(lenalidomide))，RSR13(乙丙昔罗(efaproxiral))，SOMATULINE.RTM.LA(兰瑞肽)，SORIATANE.RTM.(阿昔曲丁(acitretin))，十字孢碱(staurosporine)(链霉菌属星状孢子)，talabostat(PT100)，TARGRETIN.RTM.(贝沙罗汀)，TAXOPREXIN.RTM.(DHA-紫杉醇)，TELCYTA.RTM.(canfosfamide，TLK286)，temilifene，TEMODAR.RTM.(替莫唑胺)，替米利芬(tesmilifene)，沙利度胺(thalidomide)，THERATOPE.RTM.(STn-KLH)，thymitaq(2-氨基-3,4-二氢-6-甲基-4-氧代-5-(4-吡啶基硫基)喹唑啉二盐酸盐)，TNFERADE.RTM.(腺载体：含肿瘤坏死因子-α的基因的DNA载体)，TRACLEER.RTM.或ZAVESCA.RTM.(波生坦)，维甲酸(Retin-A)，粉防己碱，TRISENOX.RTM.(三氧化二砷)，VIRULIZIN.RTM.，ukrain(来自白屈菜植物的生物碱的衍生物)，vitaxin(抗alphavbeta3抗体)，XCYTRIN.RTM.(莫特沙芬钆)，XINLAY.RTM.(阿曲生坦)，XYOTAX.RTM.(聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel poliglumex))，YONDELIS.RTM.(特拉贝替尼)，ZD-6126，ZINECARD.RTM.(右雷佐生)，ZOMETA.RTM.(唑来磷酸酸(zolendronic acid))，佐柔比星，以及这些试剂的组合。
4.6单寡核苷酸试剂及其用途
本公开包括单功能性寡核苷酸。本公开还包括包含单寡核苷酸试剂和药学上可接受的运载体的药物组合物。
在一些实施方式中，药物组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的saRNA正义链的核苷酸序列：a)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；b)R6-04-S1(SEQ ID NO:59)；d)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ IDNO:60)；和c)RAG1-40(SEQ ID NO:62)。在一些实施方式中，药物组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与DS06-4A3(SEQ ID NO:146)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的saRNA正义链的核苷酸序列。在一些实施方式中，药物组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与R6-04-S1(SEQ ID NO:59)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的saRNA正义链的核苷酸序列。在一些实施方式中，药物组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的saRNA正义链的核苷酸序列。在一些实施方式中，药物组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与RAG1-40(SEQ ID NO:62)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的saRNA正义链的核苷酸序列。
在一些实施方式中，药物组合物包含寡核苷酸，所述寡核苷酸具有与选自以下的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同的saRNA反义链的核苷酸序列：a)DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；b)R6-04-S1(SEQ ID NO:53)；c)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ IDNO:17)；d)RAG1-40(SEQ ID NO:63)；和e)R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。
在某些实施方式中，药物组合物还包含反义链的核苷酸序列，其与正义链互补，并且与DS06-4A3(SEQ ID NO:147)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同。
在某些实施方式中，药物组合物还包含反义链的核苷酸序列，其与正义链互补，并且与DS06-4A-S2L5V(SEQ ID NO:17)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同。
在某些实施方式中，药物组合物还包含反义链的核苷酸序列，其与正义链互补，并且与R6-04-S1(SEQ ID NO:53)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同。
在某些实施方式中，药物组合物还包含反义链的核苷酸序列，其与正义链互补，并且与R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:17)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同。
在某些实施方式中，药物组合物还包含反义链的核苷酸序列，其与正义链互补，并且与RAG1-40(SEQ ID NO:63)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同。
在某些实施方式中，药物组合物还包含反义链的核苷酸序列，其与正义链互补，并且与R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)的核苷酸序列至少60％(例如，至少至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％)相同。
在一些方面，本文提供了分离的或合成的寡核苷酸，其包含：与核苷酸序列SEQ IDNO：62至少90％相同的saRNA正义链核苷酸序列。在一些实施方式中，分离的或合成的寡核苷酸还包含与上述正义saRNA链部分互补的反义链。在一些实施方式中，分离的或合成的寡核苷酸还包含与核苷酸序列SEQ ID NO:63至少90％相同的反义链。
在一些实施方式中，分离的或合成的寡核苷酸包含：saRNA正义链SEQ ID NO:62和saRNA反义链SEQ ID NO：63的核苷酸序列。
在一些方面，本文提供了药物组合物或试剂盒，其包含本文公开的分离的或合成的寡核苷酸。
在一些方面，本文提供了用于疾病治疗的方法，其包括将足够量的一种或多种本文公开的分离的或合成的寡核苷酸或药物组合物或试剂盒给予需要这类治疗的对象。
5.实施例
以下实施例中进一步说明本发明。这些实施例仅用于说明目的，并不应解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
5.1.实施例1：多靶向性寡核苷酸试剂的设计。
5.1.1.二单元DAO(双重作用寡核苷酸)
通过共价连接具有不同作用机制(MOA)或靶向两个不同靶基因的两个功能性寡核苷酸单元来产生二单元DAO(例如，具有共价连接的两个寡核苷酸的多靶向性寡核苷酸试剂)。功能性寡核苷酸包括单链寡核苷酸(SSO)(例如，gapmer ASO和空间位阻型ASO)和双链寡核苷酸(DSO)(例如，siRNA和saRNA)(表3)。这两个单元通过以下任意接头共价连接：乙二醇链、烷基链、肽、RNA、DNA、磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、酰胺、氨基甲酸酯或无接头。表4列出了一些示例性接头。表5示意性地显示了8个DAO(DAO-1～DAO-8)的结构。
表3.在其分子内具有其功能性单元的二单元DAO的列表
| DAO种类 | 单元A | 单元B |
| siRNA-siRNA | siRNA | siRNA |
| saRNA-saRNA | saRNA | saRNA |
| saRNA-siRNA | saRNA | siRNA |
| siRNA-ASO | siRNA | ASO |
| saRNA-ASO | saRNA | ASO |
| ASO-ASO | ASO | ASO |
注：两个单元不同或相同，可按所需顺序排列，例如单元A-单元B或单
元B-单元A。
表4.DAO中使用的接头
表5.二单元DAO接头的示意图*
5.1.2.三单元DAO
类似于表5中列出的DAO结构，即三单元DAO(例如，具有共价连接的3个寡核苷酸的多靶向性寡核苷酸试剂)通过向二单元DAO添加第三个单元生成，产生6个DAO结构(DAO-9～DAO-14，表6)。这些DAO可能是以下组合之一：3个双链体单元，2个双链体单元和ASO，双链体和2个ASO单元，或3个ASO(表6)。
表6.三单元DAO接头的示意图*
5.2.实施例2：设计DAO以通过结合启动子靶向saRNA和前体mRNA靶向剪接调节性ASO来增加靶基因表达
脊髓性肌萎缩症(SMA)由存活运动神经元(survival motor neuron，SMN)蛋白水平降低引起，该降低是由于染色体5q13.4上存活运动神经元基因(SMN1)端粒拷贝的纯合缺失或突变所致。SMN蛋白也由SMN2基因编码，本质区别在于其编码序列的外显子7中的一个核苷酸的差异，其中SMN2基因中的胞嘧啶(C)变为胸腺嘧啶(T)(Coovert等1997)。这一关键差异产生了隐匿剪接位点并导致约90％转录自SMN2基因的成熟SMN mRNA中的外显子7跳跃。缺少外显子7的SMN2 mRNA(SMN2Δ7)产生截短的SMN蛋白，该蛋白质不稳定并且会迅速降解。
ASO药物已获批准用于治疗SMA患者(Hua,Y.和A.R.Krainer.反义介导的外显子包含(Antisense-mediated exon inclusion).Methods Mol Biol(2012)和Stein,C.A.和D.Castanotto.2017年FDA批准的寡核苷酸疗法(FDA-ApprovedOligonucleotide Therapies in 2017).Mol Thera(2017))。/>靶向并阻断SMN2前体mRNA内含子7中的内含子剪接沉默子N1(ISS-N1)以增加成熟mRNA中的外显子7包含，从而导致全长成熟mRNA增加，然后是全长SMN蛋白增加。然而，全长SMN2 mRNA的增加空间受到可用SMN2前体mRNA的限制，而所述SMN2前体mRNA未被ASO改变。/>
为了开发可以最大化全长SMN2表达的DAO，生成了一系列由可以激活SMN2转录的SMN2 saRNA和剪接调节性ASO组成的DAO分子。
5.3.实施例3.由saRNA和剪接调节性ASO构成的DAO增加SMA患者来源的成纤维细胞中的全长SMN2 mRNA水平。
为了确定包含SMN2 saRNA(DS06-0004)和SMN2剪接调节性ASO(ASO10-27)的两个DAO(DA06-4A-27A和DA06-4A-27B)的作用，将DA06-4A-27A和DA06-4A-27B分别以20nM转染72小时到源自SMA II型患者的GM03813细胞中。还转染DS06-0004和ASO10-27，DS06-0004联合ASO10-27。该实验中使用的寡核苷酸包括下述寡核苷酸并列于表7中。
DS06-0004是靶向SMN2基因启动子区域的双链体saRNA，以增加全长SMN2(SMN2FL)和SMN2Δ7的mRNA表达(表7)。
DS06-4A3是源自DS06-0004的双链体saRNA，经结构优化和化学修饰以增加其体内稳定性和活性(表7)。
ASO10-27是单链ASO，已知其通过转化SMN2Δ7来增加SMN2FL水平(表7)。
DA06-4A-27A是通过将ASO的5'端经由间隔子-18(S18)接头与DS06-4A3正义链的3'端连接而产生的DAO(表7)。
DA06-4A-27B是通过将ASO的3'端经由间隔子-18(S18)接头与DS06-4A3正义链的3'端连接而产生的DAO(表7)。
“GM03813细胞”指科利埃尔医学研究所(Coriell Institute for MedicalResearch)提供的成纤维细胞。该细胞系描述为脊髓性肌萎缩症，II型；SMA2运动神经元1存活，端粒化；SMN1。相关基因为SMN1；染色体位置是5q12.2-q13.3，等位基因变体描述为1外显子7和8缺失，脊髓性肌肉萎缩，I型；和，确定的突变是EX7-8DEL。源自下述对象皮肤(手臂)的成纤维细胞的表型数据表征为：临床上受影响；足月无并发症妊娠后出生；6月龄时翻身；9月龄时开始牙牙学语；到12月龄时，明显的肌肉萎缩和无力；无深腱反射；便秘；供体对象有3个拷贝的SMN2基因；PCR分析表明该供体对象是SMN1基因中外显子7和8缺失的纯合子；受同样影响的兄弟(不在库中)；母亲是GM03814(成纤维细胞)/GM24474(iPSC)；父亲是GM03815(成纤维细胞)；参见GM23240(iPSC-慢病毒)和GM24468(iPSC-游离型)；先前分类为SMAI，但先证者的发病特征和SMN2剂量等数据支持将其重新分类为SMAII。
72小时后，从经处理的细胞中分离总细胞RNA，并逆转录成cDNA。使用SMN2FL或SMN2Δ7特异性引物对通过RT-qPCR评估SMN2 mRNA表达。SMN2 mRNA表达还使用扩增SMN2FL和SMN2Δ7的引物对通过半定量RT-PCR评估，然后进行DdeI消化(RT-PCR/消化)。PCR产生了两个产物条带：507bp(SMN2FL)和453bp(SMN2Δ7)。消化后，两个条带均减少115bp，产生两种产物：392bp(SMN2FL)和338bp(SMN2Δ7)，如图1B的凝胶所示。
如图1A所示，用20nM的DS06-0004、DS06-4A-S2L1v和ASO10-27处理细胞分别诱导2.1、1.9和2.1倍SMN2FL，并分别诱导2.1、1.6倍和0.02倍的SMN2Δ7。在转染中结合DS06-0004和ASO-27A使SMN2FL mRNA增加3.5倍，并使SMN2Δ7减少97％。与组合处理的活性非常相似，DAO之一，即DA06-4A-27A，使SMN2FL mRNA增加3.2倍，并使SMN2Δ7减少了96％，这表明DAO结构成功地保留了其分子中两个寡核苷酸单元的活性，并证实了两个单元在诱导SMN2FL方面的累加效应。该结果进一步通过RT-PCR/Ddel消化实验证实(图1B和1C)。
有趣的是，相较于单独使用saRNA或ASO，其中ASO单元的方向与DA06-4A-27A相反的DAO DA06-4A-27B并未显著增加其诱导SMN2FL的活性，这表明DAO结构中ASO的方向可能会影响活性。
总之，这些结果表明：1)可以通过共价偶联不同MOA的两个寡核苷酸单元来产生新型DAO分子，以获得这两个单元的活性；2)当应用于包含针对相同基因的剪接调节性ASO和saRNA的DAO时，这种偶联方法能导致DAO使靶基因输出最大化；3)DAO中ASO单元的方向可能会影响ASO的活性，例如DA06-4A-27A与DA06-04-27B之间的比较表明，以5'→3'方向与双链体连接的ASO单元可能具有较高的活性。
5.4.实施例4：DAO(DA06-4A-27A)对GM03813细胞中SMN2 mRNA和SMN蛋白表达的剂量依赖性作用。
为了进一步评估DA06-4A-27A对SMN2表达的剂量依赖性作用，将DA06-4A-27A以0.1nM至50nM的浓度转染到GM03813细胞中72小时，并检测SMN2 mRNA和蛋白质水平。如图2A所示，0.1、1、5、10、25和50nM的DA06-4A-27A导致SMN2FL增加1.6、2.8、4.3、4.8、3.8和3.5倍，并同时减少SMN2Δ7(分别减少10％、90％、99％、99％、99％和99％)，其中SMN2FL诱导峰值(4.8倍)发生在10nM。结果通过RT-PCR/DdeI消化进一步验证(图2B和2C)。同样，SMN蛋白也以剂量依赖的方式被诱导。0.1、1、5、10、25和50nM的DA06-4A-27A分别导致SMN蛋白增加1.4、2.2、2.5、2.8、2.6和2.1倍，并且10nM导致峰值诱导(图3A和3B)。
5.5.实施例5：DAO(DA06-4A-27A)诱导体内SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达。
为了进一步验证DAO的活性，将DA06-4A-27A(10μg或40μg)在出生后第1天(P1)通过脑室内(ICV)注射注射到携带人SMN2基因的杂合SMA(Het-SMA)，并在72小时后收集大脑、脊髓和股四头肌，用于通过RT-PCR/Dde I消化进行mRNA表达分析。为了进行比较，包括接受ICV注射20μg ASO10-27和DS06-4A-S2L1v的小鼠。注意，计算的ASO10-27、DS06-4A-S2L1v和DA06-4A-27A分子量分别为7500、12749和20249(1:1.7:2.7)，因此，10μg和40μg的DA06-4A-27A相当于0.49nM和2.0nM的摩尔质量，20μg的ASO10-27和DS06-4A-S2L1v的摩尔质量分别为2.7nM和1.6nM。
如图4A和4B所示，DS06-4A-S2L1v(20μg)、DS06-4A-27A(10μg，低剂量)和DS06-4A-27A(40μg，高剂量)处理相比PBS对照导致SMN2FL分别增加1.1、1.4、1.6倍。当评估SMN2mRNA的总量(SMN2FL+SMN2Δ7)时，相较于20μg剂量水平的DS06-4A-S2L1v所导致的2倍增加，10μg和40μg的DS06-4A-27A导致增加2.3倍和2.3倍。
同样，在Het-SMA小鼠的脊髓中，DS06-4A-S2L1v(20μg)、DS06-4A-27A(10μg，低剂量)和DS06-4A-27A(40μg，高剂量)处理分别导致SMN2FL增加1.2、2.5、3.5倍(图5)。相较于单独使用DS06-4A-S2L1v导致的2.2倍增加，DS06-4A-27A(40μg，高剂量)导致SMN2FL增加4.1倍。
在肌肉中，相较于PBS对照，ASO10-27(20μg)和DS06-4A-S2L1v(20μg)在诱导SMN2mRNA(SMN2FL或SMN2Δ7)方面并未表现出任何活性。相反，DAO DA06-4A-27A(10μg，低剂量)处理导致SMN2FL和SMN2Δ7mRNA分别增加1.9倍和1.2倍，导致总SMN2 mRNA相较于PBS对照增加3.2倍(图6A和6B)。
总之，这些结果表明DAO寡核苷酸DS06-4A-27A在CNS和外周组织中，特别是在肌肉中，在增强SMN2 mRNA水平方面比单独使用其分子内任何功能单元具有更高的活性。虽然在一些实例中，DAO的益处更多地通过SMN2Δ7的增加而不是SMN2FL所体现，但是这种益处对于临床疗效可能很重要，因为据报道，SMN2Δ7蛋白通过与SMN2FL蛋白结合形成稳定的寡聚SMN蛋白在改善SMA表型和延长SMA小鼠存活中也起着重要作用(Le等2005)。DAO的另一个明显的益处是DAO药物的制造成本比两种寡核苷酸药物的联合制造成本更低。
5.6.实施例6：DAO对SMA GM03813和GM09677细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。
为了进一步优化DA06-4A-27A的结构，生成新型DAO结构R6-04M1-27A-S1L1V3(表8)，并在SMA GM03813(II型)和SMA GM09677(I型)细胞中进行测试。
R6-04M1-27A-S1L1V3包含SMN2 saRNA R6-04(20)-S1V1v(CM-4)和与S18接头偶联的ASO10-27。
R6-04(20)-S1V1v(CM-4)源自经化学修饰的R6-04-S1。R6-04-S1是经结构优化的DS06-0004 saRNA。
测试中还包括SMN2 saRNA(DS06-4A-S2L5V)，其源自经结构优化和化学修饰的DS06-0004。DS06-4A-S2L5V与DS06-4A-S2L1v相同，除了从5'端开始计数的反义链第一核苷酸上的膦酸酯修饰被5'-(E)-乙烯基膦酸酯(5'(E)Vp)修饰替代。
如图7A所示，用25nM的ASO10-27、DS06-4A-S2L5V和R6-04M1-27A-S1L1V3处理GM03813细胞分别诱导1.7、2.8和4.4倍的总SMN2 mRNA。当评估总SMN2(SMN2FL+SMN2Δ7)的水平时，DAO R6-04M1-27A-S1L1V3引起的增加最高(4.4倍)，而ASO10-27和DS06-4A-S2L5V分别引起的增加量为1.7倍和2.8倍。如图7B所示，用25nM的ASO10-27、DS06-4A-S2L5V和R6-04M1-27A-S1L1V3处理GM09677细胞分别诱导2.0、2.8和4.8倍的SMN2FL。与GM03813细胞中的结果一致，DAO R6-04M1-27A-S1L1V3具有比单独使用其分子内的任何寡核苷酸组分更高的活性。
5.7.实施例7：DAO对SMA GM03813和GM09677细胞中SMN蛋白表达的作用。
为了进一步验证DAO R6-04M1-27A-S1L1V3诱导的SMN蛋白水平，在经DAO、saRNAR6-04-S1、aRNA R6-04(20)-S1V1v(CM-4)或ASO10-27处理的GM03813和GM09677细胞中通过western印迹评估SMN蛋白。
如图8A和8B所示，用25nM的ASO10-27、R6-04-S1、R6-04(20)-S1V1v(CM-4)和R6-04M1-27A-S1L1V3处理GM03813细胞导致SMN蛋白分别增加1.7、2.1、1.8和2.7倍，其中DAOR6-04M1-27A-S1L1V3获得最高诱导(2.7倍)。同样，在GM09677细胞(图8C和8D)中，25nM的ASO10-27、R6-04-S1、RR6-04(20)-S1V1v(CM-4)和R6-04M1-27A-S1L1V导致SMN蛋白分别增加2.2、3.0、3.5和3.9倍。与GM03813细胞中的结果一致，DAO R6-04M1-27A-S1L1V3具有比单独使用其分子内的任何寡核苷酸组分更高的活性。
5.8.实施例8：不同DAO结构对GM03813细胞SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。
为了充分证明DAO结构的优势，选择了另两个SMN2 saRNA(DS06-0031和DS06-0067)纳入DAO设计。选择这两个saRNA是因为它们在诱导SMN2转录方面具有强大的活性，然而，这主要表现为增加SMN2Δ7，而不是由DS06-0004所导致的SMN2FL(图9)。通过将ASO10-27连接到DS06-0031和DS06-0067生成了两个DAO(A形式和B形式)，从而为它们各自生成了两个DAO。两个DAO的不同之处在于DAO结构中与ASO偶联的双链体链。在A形式(DA06-31A-27A和DA06-67A-27A)中，ASO的5'端通过接头连接双链体的正义链3'端，而在B形式(DA06-31B-27A和DA06-67B-27A)中，ASO的5'端通过接头连接双链体的反义链3'端(表9)。
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如图9所示，DS06-0031和DS06-0067以20nM处理GM03813细胞使SMN2Δ7分别显著增加4.0倍和2.7倍，不过SMN2FL的水平要么没有改变(通过DS06-0031)要么被较小幅度诱导(DS06-0067导致2.3倍)。该结果表明这两种saRNA具有很强的RNAa活性，虽然该活性主要表现为SMN2Δ7增加。实际上，相较于单独利用saRNA或ASO的活性，将ASO10-27与DS06-0031或DS06-0067中任一个相连接导致了相似或大多数情况增加的诱导SMN2FL的活性，包含DS06-0067的DAO尤为如此。如图9所示，DA06-31A-27A和DA06-31B-27A使SMN2FL增加2.1和1.8倍，而DA06-67A-27A和DA06-67B-27A分别使SMN2FL增加3.0和2.3倍。
5.9.实施例9：具有不同偶联位置和接头的DAO对SMA GM03813细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。
基于saRNA DS06-0004和DS06-0067，通过使用不同的接头使它们连接ASO10-27来生成其它DAO，接头形式包括：在两个功能性寡核苷酸单元之间没有接头(L0)，间隔子18(L1)，间隔子C6(L4)，间隔子9(L9)。将这些DAO以25nM转染到GM03813细胞，并通过RT-qPCR和RT-PCR评估SMN2表达，然后进行DdeI消化。这些DAO在表10和表11中列出。
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如图10A所示，ASO10-27、DS06-0067和DS06-0004诱导SMN2FL mRNA增加1.9、1.6和2.8倍，SMN2Δ7mRNA增加0.0、3.1和2.3倍。相较于DS06-0067，所有13个含有DS06-0067的DAO在诱导SMN2FL方面的活性均高于单独使用的ASO10-27或DS06-0067，并且DA6-67A-27A表现出最高的活性(3.5倍)，其中ASO通过间隔子18接头与saRNA双链体正义链的3'端偶联。在13个含有DS06-0004的DAO中，3个(DA6-04A3'-L1-27A、DA6-04A3'-L9-27A和DA6-04A3'-L4-27A)在诱导SMN2FL方面表现出更高的活性，其中，ASO分别通过间隔子18、间隔子9和间隔子C6与saRNA双链体的正义链偶联。
图10A中显示的RT-qPCR结果通过半定RT-qPCR进一步验证，然后于图10B中通过Dde I消化。与RT-qPCR结果一致，大多数DAO使SMNFL增加了2.0倍以上。
总之，该实验的结果表明，双链体中的偶联位置能影响所得DAO的活性。一般而言，将ASO与双链体中正义链的3'端偶联能产生具有良好活性的DAO，而偶联中的接头的类型对活性的影响较小。
5.10.实施例10：具有不同偶联位置和接头的DAO对SMA GM00232细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。
还在SMA GM00232细胞中测试了实施例9中评估的DAO在诱导SMN2mRNA表达中的活性。如图11所示，ASO10-27、DS06-0067和DS06-0004分别诱导SMN2FL mRNA增加2.3、1.9和2.4倍。相较于DS06-0067，所有13个含有DS06-0067的DAO在诱导SMN2FL方面的活性均高于单独使用的ASO10-27或DS06-0067，其中DA06-67A-27A表现出的活性最高(4.5倍)。在13个含有DS06-0004的DAO中，除了一个(DA6-04A5'-L9-27A)外，所有的DAO在诱导SMN2FL方面均表现出比单独使用DS06-0004或ASO10-27更高的活性，其中DA6-04A3'L1-27A具有最高活性(3.7倍)。与RT-qPCR结果一致，大多数的DAO使SMN2FL增加了2.0倍以上。图10和图11中显示的来自两个SMA细胞系的数据共同表明，具有不同偶联位置和接头的DAO是功能性的，并且具有由其分子内两个寡核苷酸组分贡献的活性。
“GM00232细胞”指科利埃尔医学研究所(Coriell Institute for MedicalResearch)提供的成纤维细胞。该细胞系描述为脊髓性肌萎缩症I；SMA1。该供体对象有2个SMN2基因拷贝(数据来自多个来源，包括Stabley等，2015,PMID 26247043)并且是SMN1基因外显子7和8缺失的纯合子。相关基因为SMN1；染色体位置是5q12.2-q13.3，等位基因变体描述为外显子7和8缺失，脊髓性肌肉萎缩，I型；和确定的突变是EX7-8DEL。源自下述对象皮肤(手臂)的成纤维细胞的表型数据表征为：进行性肌肉萎缩；无深腱反射；异常EMG；供体对象有2个SMN2基因拷贝(数据来自多个来源，包括包括Stabley等，2015,PMID 26247043)并且是SMN1基因外显子7和8缺失的纯合子。
5.11.实施例11：“saRNA-saRNA”DAO和三单元DAO对GM03813和GM00232细胞中SMN2mRNA和蛋白质表达的作用。
其他DAO(“saRNA-saRNA”DAO)通过连接两个saRNA并通过进一步将ASO单元添加到“saRNA-saRNA”DAO来生成，以产生三单元DAO。这些DAO在GM03813和GM00232细胞中测试了它们诱导SMN2 mRNA和蛋白质表达的活性。
R6-04S1&67S1R-L1V2和R6-04S1&67S5R-L1V2是具有通过间隔子18接头连接的2个saRNA“saRNA-saRNA”DAO(表12)。
R6-04S1&27A&67S1R-L1V2和R6-04S1&27A&67S5-L1V2是三单元DAO，其中ASO与“saRNA-saRNA”DAO连接并位于两个saRNA之间(表12)。
R6-04S1&67S1R&27A-L1V2和R6-04S1&67S5&27A-L1V2是三单元DAO，其中ASO与“saRNA-saRNA”DAO连接并位于两个saRNA一侧(表12)。
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如图12A所示，ASO10-27和DAO以25nM转染到GM03813细胞中。ASO10-27诱导SMN2FLmRNA增加1.9倍，而两个“saRNA-saRNA”，即DAO R6-04S1&67S1R-L1V2和R6-04S1&67S5-L1V2分别诱导SMN2FL mRNA增加2.6倍和2.6倍，且诱导SMN2Δ7mRNA增加1.9倍和2.0倍，并且总SMN2 mRNA分别达到4.5倍和4.6倍，这表明两个连接的saRNA具有累加活性。
与ASO10-27或“saRNA-saRNA”DAO相比，所有三单元DAO，即R6-04S1&27A&67S1R-L1V2、R6-04S1&67S1R&27A-L1V2、R6-04S1&27A&67S5-L1V2和R6-04S1&67S5&27A-L1V2在诱导SMN2FL mRNA方面表现出更高的活性并导致SMN2FL mRNA分别增加3.7、4.3、3.8和4.4倍，同时SMN2Δ7消失，这表明saRNA和ASO贡献的活性。
与ASO位于两个saRNA之间的DAO(即R6-04S1&27A&67S1R-L1V2和R6-04S1&27A&67S5-L1V2)相比，ASO位于两个saRNA一侧的DAO(即R6-04S1&67S1R&27A-L1V2和R6-04S1&67S5&27A-L1V2)在诱导SMN2FL mRNA方面表现出更强的活性(图12A)。从在GM00232细胞中重复相同的实验获得了非常一致的结果，如图12B所示。
此外，在用图12中测试的ASO10-27或DAO转染的GM03813和GM00232细胞中通过western印迹检测SMN蛋白水平。如图13A和13B所示，ASO10-27、R6-04S1&67S1R-L1V2和R6-04S1&67S5-L1V2在GM03813细胞中诱导SMN蛋白增加5.8、6.9和4.8倍。R6-04S1&27A&67S1R-L1V2、R6-04S1&67S1R&27A-L1V2、R6-04S1&27A&67S5-L1V2和R6-04S1&67S5&27A-L1V2分别诱导SNM蛋白增加8.2、9.8-、6.7和6.8倍。三单元DAO在诱导SMN蛋白的活性远高于ASO10-27或“saRNA-saRNA”DAO。
在GM00232细胞中，ASO10-27、R6-04S1&67S1R-L1V2和R6-04S1&67S5-L1V2诱导SMN蛋白增加4.4、4.6和4.7倍(图13C和13D)。三单元DAO R6-04S1&27A&67S1R-L1V2、R6-04S1&67S1R&27A-L1V2、R6-04S1&27A&67S5-L1V2和R6-04S1&67S5&27A-L1V2分别诱导SMN蛋白增加7.8、10.7、3.7和7.5倍，其中R6-04S1&67S1R&27A-L1V2和R6-04S1&67S5&27A-L1V2使SMN蛋白增加7倍以上。
这些结果进一步证明，由相同MOA的寡核苷酸单元组成的DAO可以具有累加效应，并且相较于简单组合两种寡核苷酸药物，可以保证在疾病治疗中使用此类DAO将使基因输出最大化并降低药物制造成本。
此外，这些结果证明了新型三单元DAO的可行性和活性。如表6中所列，三单元DAO可以由具有不同MOA的不同寡核苷酸单元组成，以通过同时操纵2个或更多靶基因的表达来实现广泛的潜力。
5.12.实施例12：具有不同大小ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。
为了进一步优化SMN2 DAO的结构，通过将源自RAG06-0004并经化学修饰的R6-04(20)-S1V1v(CM-4)与不同大小的SMN2剪接调节性ASO偶联生成一系列新DAO。这些新ASO基于18-nt的ASO10-27，大小范围为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15到16nt。这些ASO通过S18接头与R6-04M1偶联，产生R6-04M1-6nt-S1L1V3v，R6-04M1-7nt-S1L1V3v，R6-04M1-8nt-S1L1V3v，R6-04M1-9nt-S1L1V3v，R6-04M1-10nt-S1L1V3v，R6-04M1-11nt-S1L1V3v，R6-04M1-12nt-S1L1V3v，R6-04M1-13nt-S1L1V3v，R6-04M1-14nt-S1L1V3v，R6-04M1-15nt-S1L1V3v，R6-04M1-16nt-S1L1V3v(表13)。
还生成了一系列对照，它们包含通过S18接头与8至18nt的对照ASO序列(AC2)连接的saRNA双链体R6-04(20)-S1V1v(CM-4)。它们是R6-04M1-AC2(8)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(9)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(10)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(11)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(12)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(13)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(14)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(15)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(16)-S1L1V3v，R6-04M1-AC2(18)-S1L1V3v。这些对照与其相应大小的DAO的区别仅在于单链ASO部分(表13)。
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将这些DAO及其对照以25nM转染到GM03813和GM09677细胞中72小时。作为附加对照，还转染了ASO ASO10-27和saRNA R6-04(20)-S1V1v(CM-4)。
如图14A所示，在GM03813细胞中，相较于ASO10-27和R6-04(20)-S1V1v(CM-4)仅增加2.0倍和2.6倍，所有DAO均导致更高的SMN2FL mRNA增加(至少增加4.2倍)，其中最高诱导(7.3倍)发生在经R6-04M1-7nt-S1L1V3v处理的细胞中。相反，对照DAO仅表现出与saRNA双链体R6-04(20)-S1V1v(CM-4)相当的诱导SMN2FL和SMN2Δ7的活性，这表明它们的活性来自saRNA单元。
此外，SMN2Δ7水平的同时降低是明显的，这表明DAO在诱导SMN2FL中的活性增加是由saRNA和剪接调节性ASO组件共同促成的。此外，当ASO的大小从18nt减小到13nt时，DAO的活性逐渐增加，但当ASO的大小进一步从12nt减小到11nt时，DAO的活性降低，并在ASO进一步减小到6nt时恢复。
当这些DAO被转染到GM09677细胞中时，获得了非常一致的结果(图14B)。
数据表明，DAO中ASO单元可以通过改变其长度来独立地优化，并且可以通过使用比其结构中典型大小(18nt)的ASO更短的(12nt至15nt，6nt至9nt)ASO来实现更高的诱导SMN2FL表达活性。
5.13.实施例13：具有不同大小ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN蛋白表达的作用。
为了进一步验证实施例12中所述的这些DAO(表13)的蛋白质水平诱导，通过western印迹评估SMN蛋白。所有DAO均以25nM分别转染到GM03813和GM09677细胞中72小时。作为附加对照，还转染了ASO10-27和saRNA R6-04(20)-S1V1v(CM-4)。
如图15A和15B所示，相较于ASO10-27和R6-04(20)-S1V1v(CM-4)仅分别增加2.9倍和2.4倍的情形，GM03813细胞中的所有DAO均导致更高的SMN蛋白增加(至少增加3.5倍)，其中最高诱导(6.0倍)发生在经R6-04M1-15nt-S1L1V3v处理的细胞中。当ASO的大小从18nt减小到15nt时，DAO的活性逐渐增加，但当ASO的大小进一步从14nt减小到11nt时，DAO的活性降低，并在ASO进一步从10nt减小到8nt时保持不变。与GM03813细胞结果一致，相较于ASO10-27和R6-04(20)-S1V1v(CM-4)分别仅增加1.6倍和1.1倍的情形，所有DAO均导致更高的SMN蛋白增加(至少2.4倍)，其中最高诱导(4.6倍)发生在经R6-04M1-(12nt-B)-S1L1V3v处理的GM09677细胞中(图15C和15D)。当ASO的大小从18nt减小到12nt时，DAO的活性逐渐增加，但当ASO的大小进一步减小到11nt时，DAO的活性急剧降低，而当ASO的大小进一步从10nt减小到8nt时保持不变。
SMN蛋白诱导的结果还表明，DAO中的ASO单元可以通过改变其长度来独立地优化，并且可以通过使用比DAO结构中典型大小(18nt)的ASO更短的(12nt～15nt)ASO来实现更高的诱导SMN蛋白表达活性。
5.14.实施例14：具有不同大小ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。
为了进一步优化具有不同大小的ASO的SMN2 DAO的结构，生成了其它DAO，它们源自具有不同大小的SMN2剪接调节性ASO的化学修饰的RAG06-0067。这些新ASO基于18-nt的ASO10-27，大小范围为8、9、12、13、14、15和16nt。这些ASO通过S18接头与R6-67M3偶联，产生R6-67M3-8nt-S1L1V3、R6-67M3-9nt-S1L1V3、R6-67M3-(12nt)-S1L1V3、R6-67M3-13nt-S1L1V3、R6-67M3-14nt-S1L1V3、R6-67M3-15nt-S1L1V3、R6-67M3-16nt-S1L1V3(表14)。
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如图16A所示，所有DAO均以25nM转染到GM03813细胞中，相较于单独使用ASO10-27仅增加1.9倍的情形，其导致更高的SMN2FL mRNA增加(至少2.6倍)，其中最高诱导(3.5倍)发生在经R6-67M3-15nt-S1L1V3处理的细胞中。此外，当ASO的大小从18nt减小到15nt时，DAO的活性逐渐增加，但当ASO的大小进一步减小(14nt至12nt，9nt至8nt)时降低且保持不变。类似地，相较于单独使用ASO10-27仅增加1.9倍的情形，GM09677细胞中的所有DAO导致更高的SMN2FL mRNA增加(至少2.5倍)，其中最高诱导(3.7倍)发生在经R6-67M3-8nt-S1L1V3处理的细胞(图16B)。当ASO的大小从18nt减小到13nt时，DAO的活性逐渐增加，但当ASO的大小进一步从12nt减小到9nt时，DAO的活性降低，并在ASO减小到8nt时恢复。此外，SMN2Δ7水平的同时降低是明显的，这表明DAO在诱导SMN2FL中的活性增加是由剪接调节性ASO组件促成的(图16B)。
该数据表明，DAO中ASO单元可以通过改变其长度来独立地优化，并且可以通过使用比其结构中典型大小(18nt)的ASO更短的(13nt、15nt和8nt)ASO来实现更高的诱导SMN2FL表达活性。
5.15.实施例15：具有不同大小ASO的DAO对GM03813和GM09677细胞中SMN蛋白表达的作用。
为了进一步验证实施例14中所述的这些DAO(表14)的蛋白质水平诱导，通过western印迹评估SMN蛋白。所有DAO以25nM分别转染到GM03813和GM09677细胞中72小时。ASO10-27也作为阳性对照转染。
如图17A和17B所示，在GM03813细胞中，相较于单独使用ASO10-27仅增加1.6倍的情形，所有DAO均导致更高的SMN蛋白增加(至少2.0倍)，其中最高诱导(3.6倍)发生在经R6-67M3-15nt-S1L1V3处理的细胞中。与GM03813细胞结果一致，相较于单独使用ASO10-27仅增加2.2倍的情形，所有DAO在GM09677细胞中均导致更高的SMN蛋白增加(至少3.4倍)，其中最高诱导(4.6倍)发生在经R6-67M3-15nt-S1L1V3处理的细胞中(图17C和17D)。
此外，当ASO的大小从18nt减小到15nt时，DAO的活性逐渐增加，但当ASO的大小进一步从14nt减小到9nt时，DAO的活性降低，并在ASO进一步减小到8nt时保持不变。
该数据表明，DAO中ASO单元可以通过改变其长度来独立地优化，并且可以通过使用比其结构中典型大小(18nt)的ASO更短的(例如15nt)ASO来实现更高的诱导SMN蛋白表达的活性。
5.16.实施例16：具有不同大小ASO的DAO对PMH细胞中SMN2FL和SMN2Δ7mRNA表达的作用。
为了进一步验证DAO在分离自携带两拷贝人SMN2基因的III型SMA小鼠的原代小鼠肝细胞(PMH)中的功能，实施例12中测试的DAO(表13)以25nM在PMH细胞中转染72小时。作为附加对照，还转染了ASO10-27和saRNA R6-04(20)-S1V1v(CM-4)。
如图18所示，相较于ASO10-27和R6-04(20)-S1V1v(CM-4)分别增加2.7倍和2.2倍的情形，所有DAO均导致更高的SMN2FL mRNA增加(至少增加3.4倍)，其中最高诱导(4.3倍)发生在经R6-04M1-13nt-S1L1V3v和R6-04M1-14nt-S1L1V3v处理的细胞中。当ASO的大小从18nt减小到12nt时，DAO的活性逐渐增加，但当ASO的大小进一步减小到12nt时，DAO的活性略有降低，而当ASO的大小减小到10nt至8nt时恢复。此外，所有DAO在SMA患者细胞和PMH细胞中均有效，这支持在动物模型和人患者中进行进一步测试。
5.17.实施例17：“saRNA-siRNA”DAO两个不同基因对293A和GM03813细胞中SMN2FL、SMN2Δ7和SOD1 mRNA表达的作用。
基于“saRNA-saRNA”DAO，通过S18接头共价连接saRNA和siRNA生成了DAO(“saRNA-siRNA”DAO)。在该DAO结构(R6-04M1&R17-388E-L1V2)中，设计saRNA以激活SMN2基因，并设计siRNA单元以敲减超氧化物歧化酶1(SOD1)基因(表15)。
肌萎缩侧索硬化症(ALS)和SMA分别是成年期和婴儿期最常见的运动神经元疾病。两种疾病具有共同的病理生理模式，并且可以在家族中同时发生(Corcia P等，ALS-SMA家族中ALS病例的表型和基因型研究(Phenotypic and genotypic studies of ALS casesin ALS-SMA families).Amyotroph Lateral Scler Frontotemporal Degener 2018年8月；19(5-6):432-437)。SOD1基因突变占家族性ALS的20％，据信突变的SOD1蛋白对运动神经元发挥毒性作用，可破坏SMN蛋白复合物。据报道，SMN蛋白的缺乏也是ALS发展的恶化因素(Kariya S等，突变超氧化物歧化酶1(SOD1)是肌萎缩性侧索硬化症的原因，破坏SMN的募集，脊髓性肌萎缩症蛋白转移到核Cajal小体(Mutant superoxide dismutase 1(SOD1),acause of amyotrophic lateral sclerosis,disrupts the recruitment of SMN,thespinal muscular atrophy protein to nuclear Cajal bodies).Hum Mol Genet.2012年8月1日；21(15):3421-34)。因此，同时激活SMN蛋白和敲减突变型SOD1可能对治疗有益。
将这些DAO转染到HEK293A或GM03813细胞中。将saRNA单元R6-04(20)-S1V1v(CM-4)和siRNA单元siSOD1-388-ESC单独或组合转染。72小时后收获转染细胞用于mRNA表达分析。
如图19A所示，R6-04(20)-S1V1v(CM-4)和siSOD1-388-ESC分别诱导SMN2FL表达(3.18倍)并降低SOD1表达(0.01倍)。它们的联合处理导致SMN2FL增加3.19倍且SOD1下调0.025倍，而DAO R6-04M1&R17-388E-L1V2诱导SMN2FL增加1.95倍且SOD1降低0.01倍。相较于联合处理，DAO实际上表现出更高的SOD1敲减效率。
与293A细胞中的结果一致，在GM03813细胞中(图19B)，R6-04(20)-S1V1v(CM-4)和siSOD1-388-ESC分别诱导SMN2FL表达(1.85倍)并降低SOD1表达(0.01倍)。它们的联合处理导致SMN2FL增加1.71倍且SOD1下调0.02倍，而DAO R6-04M1&R17-388E-L1V2诱导SMN2FL增加1.57倍且SOD1降低0.01倍。相较于联合处理，DAO表现出更高的SOD1敲减效率。
通过测试DAO R6-04M1&R17-388E-L1V2，表明将saRNA与siRNA组合成DAO可以在很大程度上保留各单元的活性并且有时会提高siRNA单元的活性。
5.18.实施例18：靶向两个不同基因的DAO对p21和PD-L1 mRNA表达的作用。
CDKN1A(p21)和CD274(PD-L1，程序性死亡配体1)是与肿瘤发生有关的两个重要基因。p21是负细胞周期调节剂和推定的肿瘤抑制因子，其saRNA激活可导致肿瘤抑制(Kang等，2017)。PD-L1是癌症治疗的重要靶点，并且阻断PD-L1可以促进T细胞介导的针对癌症的免疫监视并已在癌症患者中显示出巨大的临床益处。
为了将p21激活和PD-L1阻断的肿瘤抑制作用结合到单个寡核苷酸分子中，通过连接p21 saRNA(RAG1-40)和PD-L1 siRNA(siPDL1-2，siPDL1-3)或gapmer ASO(aPDL1-1、aPDL1-2、aPDL1-3)来设计DAO(表16)。设计RAG1-40靶向p21基因启动子序列，以通过RNAa机制诱导其转录；设计siPDL1-2和siPDL1-3靶向PD-L1基因的mRNA序列，以通过RNAi机制沉默其表达，aPDL1-1、aPDL1-2和aPDL1-3是gapmerASO，将其设计成靶向PD-L1 mRNA以通过RNA酶H活性下调其表达。
saP21-40/siPDL1-2和saP21-40/siPDL1-3是由通过接头偶联的两个双链体RAG1-40和siPDL1-2或siPDL1-3构成的DAO。
saP21-40/aPDL1-1、saP21-40/aPDL1-2和saP21-40/aPDL1-3是这样的DAO，其由通过接头偶联的双链体RAG1-40和aPDL1-1，aPDL1-2，aPDL1-3gapmerASO构成，其中ASO的5'端与接头偶联。
saP21-40/aPDL1-1R、saP21-40/aPDL1-2R和saP21-40/aPDL1-3R是这样的DAO，其分别由通过接头偶联的双链体RAG1-40和aPDL1-1，aPDL1-2，aPDL1-3gapmerASO构成，其中ASO的3'端与接头偶联。
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如图20A所示，p21 saRNA(RAG1-40)、PD-L1 siRNA(siPDL1-3)、PD-L1 ASO(aPLD1-1、aPLD1-2、aPLD1-3)和DAO以10nM转染到PC3细胞72小时。RAG1-40诱导10.5倍的p21表达，并且出人意料地还使PD-L1的表达增加13.2倍。仅siPDL1-3使PD-L1表达降低62％，但也使p21 mRNA降低33％。aPDL1-1、aPDL1-2和aPDL1-3导致PD-L1 mRNA减少14％、25％和28％。
与模拟处理相比，DAO saP21-40/siPDL1-3、saP21-40/aPDL1-1、saP21-40/aPDL1-2、saP21-40/aPDL1-3、saP21-40/aPDL1-1R、saP21-40/aPDL1-2R和saP21-40/aPDL1-3R导致p21 mRNA增加3.3、4.0、5.8、8.4、10.3、11.0和8.2倍。与RAG1-40处理相比，DAO saP21-40/siPDL1-3、saP21-40/aPDL1-1、saP21-40/aPDL1-2、saP21-40/aPDL1-3、saP21-40/aPDL1-1R、saP21-40/aPDL1-2R和saP21-40/aPDL1-3R导致PD-L1 mRNA降低84％、93％、91％、86％、27％、36％和60％(图20A)。减去p21上调对PD-L1表达的激活作用和PD-L1下调对p21表达的抑制作用，除了3个DAO(saP21-40/aPDL1-1R、saP21-40/aPDL1-2R和saP21-40/aPDL1-3R)所有ASO的3'端偶联接头的DAO表现出诱导p21的RNAa活性以及gapmer ASO抑制PD-L1的活性。
如图20B所示，在类似处理的KU-7细胞中，RAG1-40诱导8.3倍的p21mRNA，并且出乎意料地还诱导20.8倍的PD-L1表达。siPDL1-2导致PDL1 mRNA降低45％。与模拟对照相比，DAO saP21-40/siPDL1-2、saP21-40/aPDL1-1、saP21-40/aPDL1-2、saP21-40/aPDL1-3、saP21-40/aPDL1-1R、saP21-40/aPDL1-2R和saP21-40/aPDL1-3R导致p21 mRNA增加7.4、2.8、3.1、4.1、5.4、5.5和5.3倍。与RAG1-40处理相比，saP21-40/siPDL1-2、saP21-40/aPDL1-1、saP21-40/aPDL1-2、saP21-40/aPDL1-3、saP21-40/aPDL1-1R、saP21-40/aPDL1-2R和saP21-40/aPDL1-3R导致PD-L1 mRNA降低78％、95％、96％、94％、37％、58％和55％。减去p21上调对PD-L1表达的激活作用，所有DAO都表现出诱导p21的RNAa活性以及gapmerASO抑制PD-L1的活性。
5.19.实施例19：“ASO-ASO”DAO对GM03813细胞中SMN2FL和SMN2Δ7表达的作用。
据报道，与SMN2基因5'端互补的ASO通过ASO抑制SMN2 mRNA衰变的机制增加SMNmRNA和蛋白质水平，将5'UTR ASO与剪接调节性ASO组合使用使SMN水平增加至高于单独使用后者所达到的水平[PMID:33575118，PMCID:PMC7851419]。DAO通过将间隔子18接头以不同顺序共价连接5'UTR ASO和ASO10-27生成，以产生两个DAO，其中一个(DA6-27A-5'UTR)的方向为5'-ASO10-27-接头-5'UTR ASO-3'，而另一个(DA6-5'UTR-27A)的方向为5'-5'UTRASO-接头-ASO10-27-3'。这两个DAO称为“ASO-ASO”DAO(表17)。
将这些DAO转染到GM03813细胞中，以评估它们在诱导SMN2 mRNA表达方面的活性。如图21所示，25nM的ASO10-27和5'UTR ASO分别导致SMN2FL增加1.6倍和1.1倍，同时降低SMN2Δ7(97％、32％)。相较于仅ASO10-27(1.6倍)或5'UTR ASO(1.1倍)，DA6-5'UTR-27ADAO在诱导SMN2FL mRNA表达方面表现出更高的效力(1.8倍)，这表明ASO-ASODAO具有来自其组件ASO的附加活性。DA6-27A-5'UTR在诱导SMN2Δ7表达方面表现出更高的效力，从而增加SMN2FL+SMN2Δ7的总表达。该研究进一步表明，连接两个ASO也能够生成具有附加活性的DAO，并且两个ASO的连接方式决定了所得DAO的活性。
5.20.实施例20：“ASO-ASO”DAO对GM03813细胞中SMN蛋白的影响。
为了进一步验证诱导“ASO-ASO”DAO的蛋白质水平，通过western印迹评估SMN蛋白。所有DAO以25nM转染到GM03813细胞中72小时。如图22A和22B所示，25nM的ASO10-27和5'UTR ASO导致SMN蛋白增加2.1倍和2.0倍。与RT-qPCR结果一致，相较于仅ASO10-27(2.1倍)或5'UTR ASO(2.0倍)的情形，DA6-5'UTR-27A DAO在诱导SMN蛋白方面表现出更高的效力(3.0倍)，这表明ASO-ASODAO具有来自其组件ASO的附加活性。然而，DA6-27A-5'UTR未能显示附加活性(2.0倍)。该研究进一步表明，连接两个ASO也能够生成对SMN蛋白水平具有附加活性的DAO，并且两个ASO的连接方式决定了所得DAO的活性。
5.21.实施例21：“二价”DAO对幼鼠CNS组织中Htt基因表达的影响。
作为DAO设计的特例，“二价”DAO是共价连接共享相同序列的两个双链体。通过“二价”DAO设计，在“二价”DAO分子中引入的其他硫代磷酸酯主链修饰增加体内生物分布和细胞摄取。为了验证“二价”DAO设计的寡核苷酸siHtt-S1L1的传递效率增强，siHtt双链体的“二价”DAO变体(siHtt-S1V1)通过共价连接两个siHtt-S1V1生成。在将寡核苷酸ICV注射到幼鼠中后，通过RT-qPCR评估Htt基因表达敲减水平。
如图23A所示，“二价”DAO变体siHtt-S1L1在ICV给药后3天导致Htt mRNA表达敲减的水平在脑中为30％且在脊髓中为20％，而没有“二价”DAO设计的siHtt-S1V1导致HttmRNA敲减的水平在脑中为2％且脊髓为12％。如图23B所示，在ICV给药后14天，“二价”DAO变体siHtt-S1L1导致Htt mRNA表达敲减47％(脑中)和39％(脊髓)，这优于siHtt-S1V1导致的40％(脑中)和29％。该数据提供证据表明，DAO设计的双链体通过局部注射在CNS中具有更好的体内活性。
5.22.实施例22：二价“”DAO通过皮下给药对幼鼠主要组织中Sod1基因表达的作用。
为了进一步验证“二价”DAO设计的寡核苷酸的递送效率增强，通过共价连接两个siSOD1M2-S1V1v-Qu5合成“二价”DAO设计的靶向Sod1基因的siRNA(siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5)。在幼鼠皮下(SC)注射寡核苷酸后，Qu5信号的生物分布显示siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5在几乎所有外周组织中富集，特别是在肌肉、肝脏和肾脏中(图24A和24B)。Sod1基因表达敲减水平通过RT-qPCR评估。如图24C所示，“二价”DAO变体siSOD1-S1L1V2v-Qu5导致Sod1 mRNA表达敲减的水平在肝脏中为84％，而没有“二价”DAO设计的siSOD1M2-S1V1v-Qu5导致Sod1mRNA敲减的水平为65％。该数据提供证据表明，DAO设计的双链体通过全身注射在肝脏中具有更好的体内活性。
5.23.实施例23：“二价”DAO对幼鼠CNS组织中Sod1基因表达的作用。
为了进一步验证siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5在CNS组织中的递送效率增强，通过ICV注射给予幼鼠siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5和siSOD1M2-S1V1v-Qu5。ICV注射后三天，Qu5信号的生物分布表明siSOD1M2-S1L1V2v-Qu5在CNS组织中富集(图25A和25B)。Sod1基因表达敲减水平通过RT-qPCR评估。如图25C所示，“二价”DAO变体siSOD1-S1L1V2v-Qu5导致Sod1 mRNA表达敲减的水平在肝脏中为75％且在脊髓中为88％，而没有“二价”DAO设计的siSOD1M2-S1V1v-Qu5导致Sod1 mRNA敲减的水平在脑中为61％且在脊髓中为54％。该数据提供证据表明，DAO设计的双链体通过局部注射在CNS组织中具有更好的体内活性。
5.24.材料和方法
寡核苷酸设计与合成
亚磷酰胺2'-OMEO-N6-Bz-A(HR-00207001)、2'-O-MOE-N2-ibu-G(HR-00207003)、2'-O-MOE-N4-Bz-5-Me-C(HR-00207006)、2'-O-MOE-5-Me-U(HR-00207005)、Bz-rA(HR-00202001)、Ac-rC(HR-00202002)、ibu-rG(HR-00202003)、rU(HR-00202003)、2'-F-Bz-dA(HR-00204001)、2'-F-Ac-dC(HR-00204004)、2'-F-dU(HR-00204005)、2'-F-ibu-dG(HR-00204003)、dT(HR-00201004)、间隔子-18(HR-00214005)、间隔子-9(HR-00214009)和间隔子-C6(HR-00214019)购自芜湖华仁科技有限公司(Wuhu Huaren Science andTechnology)(中国安徽省芜湖市)。
寡核苷酸通过使用固相技术在K&A DNA合成仪(K&A Laborgeraete GbR，德国沙夫海姆市)上合成。简言之，在固相合成过程中，亚磷酰胺单体(包括各种接头和偶联物)依次添加到固体支持物上以生成所需的全长寡核苷酸。各碱基添加循环由四个化学反应组成：脱三苯甲基化、偶联、氧化/硫醇化和封端。合成后，C&D(切割和脱保护)步骤从固体支持物释放寡核苷酸，并从碱基和磷酸酯中去除保护基团。合成后，将固体支持物转移到螺旋盖微量离心管中。对于1μM合成规模，添加33％甲胺的乙醇溶液和1ml氢氧化铵的混合物。然后将含有固体支持物的试管在60℃至65℃的烘箱中加热2小时，然后冷却至室温。收集裂解溶液并在speedvac中蒸发至干燥。将仍带有2'-TBDMS基团的粗制RNA寡核苷酸溶解在0.1ml的DMSO中。添加1ml三乙胺3HF后，盖上试管盖，剧烈摇动混合物以确保完全溶解。将瓶子在60℃至65℃的烘箱中加热3至3.5小时。将试管从烘箱中取出并冷却至室温。将含有完全去甲硅烷基化的寡核苷酸的溶液在干冰上冷却。以每份0.5ml将2ml冰冷的正丁醇(-20℃)小心地添加，以沉淀寡核苷酸。过滤沉淀物并用1ml冰冷的正丁醇洗涤，然后将沉淀物溶解在1MTEAA(乙酸三乙铵)中。然后使用source 15Q柱通过交换(IEX)HPLC将粗制寡核苷酸纯化。级分的纯度通过离子交换(IEX)HPLC使用DNA PacTMPA100柱分析。在生成脱盐的纯化单链溶液后，通过使两条互补的单链寡核苷酸退火来制备双链体，并冻干成粉末。
ASO合成
包括ASO-27-27(也称为诺西那生)的反义寡核苷酸(ASO)使用与上述相同的技术合成，只是省略了最后的退火步骤。ASO10-27是单链和2'-O-2-甲氧乙基(MOE)修饰的ASO，并通过靶向SMN2基因内含子7处的内含子剪接沉默子(ISS)诱导外显子7包含(Hua等2008)ASO10-27的序列为meU*meC*meA*meC*meU*meU*meU*meC*meA*meU*meA*meA*meU*meG*meC*meU*meG*meG(SEQ ID NO:11)，其中me＝2'-MOE，*＝硫代磷酸酯(PS)主链修饰，所有胞嘧啶(C)是5'甲基胞嘧啶，所有尿嘧啶(U)是5'甲基尿嘧啶。将冻干的寡核苷酸悬浮在不含RNA酶的水中用于细胞转染或用生理盐水稀释至体内注射合适的浓度。
细胞培养和处理
SMA患者来源的成纤维细胞获自利埃尔研究所(Coriell Institute)(美国新泽西州卡姆登)，包括GM00232(I型SMA，具有2个SMN2基因拷贝)、GM09677(I型SMA，具有3个SMN2基因拷贝)和GM03813(II型SMA，具有3个SMN2基因拷贝)。这些细胞在补充有15％小牛血清(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、1％NEAA(吉布可公司(Gibco))和1％青霉素/链霉素(吉布可公司)的改良型MEM培养基(吉布可公司，赛默飞世尔科学公司(Thermo FisherScientific)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中以5％CO2和37℃培养。
人前列腺癌细胞系PC3细胞在补充有10％小牛血清(西格玛奥德里奇公司)和1％青霉素/链霉素(吉布可公司)的RPMI-1640(吉布可公司)培养基中培养。人膀胱癌细胞系KU-7在补充有10％小牛血清(西格玛奥德里奇公司)和1％青霉素/链霉素(吉布可公司)的McCoy's 5A(改良型)培养基中培养。这些细胞在5％CO2和37℃培养箱中培养。
原代小鼠肝细胞(PMH)分离自Ш型SMA小鼠(smn1-/-，SMN2+/+)的肝脏，并在补充有10％小牛血清(西格玛奥德里奇公司)和1％青霉素/链霉素(吉布可公司)的改良型DMEM培养基(吉布可公司，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中以5％CO2和37℃下培养。
为了转染包括saRNA、siRNA、ASO和DAO在内的寡核苷酸，将细胞以1～2×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中，并根据生产商提供的反向转染方案使用RNAiMax(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)以不同浓度的寡核苷酸转染72小时(除非另有说明)。表7列出了saRNA、SMN2 siRNA(DS06-332i)、对照dsRNA(dsCon2)、ASO和不同DAO的序列。
PBMC细胞(PB004F，ALLCELLS，美国)在补充有10％小牛血清(西伽马奥里奇公司)和1％青霉素/链霉素(吉布可公司)的RPMI-1640(吉布可公司，赛默飞世尔科学公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中以5％CO2和37℃培养。RNA分离和逆转录-定量聚合酶链反应(RT- qPCR)
为了从培养的细胞中分离RNA，使用RNeasy Plus Mini试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，德国希尔登)根据其手册从经处理的细胞中分离总细胞RNA。为了从动物组织分离RNA，收集组织并将其储存在RNA later中(AM7021，赛默飞世尔公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。然后使用MagPure Total RNA Micro LQ试剂盒(Magen公司，R6621，中国广东省广州市)通过自动化-pure96机器(ALLSHENG公司，中国广东省广州市)分离总RNA。使用包含gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒(宝生物公司(Takara)，日本志贺)将所得RNA(1μg)逆转录成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq II(宝生物公司，日本志贺)试剂和特异性扩展感兴趣的基因的引物在ABI 7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司(AppliedBiosystems)，加利福尼亚州福斯特城)中扩增所得cDNA(图1)。反应条件为：95℃下3秒(1个循环)和60℃下30秒(40个循环)。TBP、Tbp和Gapdh基因的扩增用作内部对照。所有引物序列列于表19中。RT和RT-qPCR反应在表20和表21中显示。
表19：用于RT-qPCR检测的引物序列
表20：RT反应
42℃下5分钟，储存在4℃
表21：RT-qPCR反应
| 试剂(宝生物公司，RR820A) | 体积(μl) |
| SYBR Premix Ex Taq II(2×) | 5 |
| PCR引物(正向+反向)5μM | 1 |
| cDNA(RT产物) | 4 |
| 总计 | 10 |
半定量RT-PCR/DdeI消化试验
为了在一个反应中同时扩增全长SMN2(SMN2FL)和缺少外显子7的SMN2(SMN2Δ7)，使用跨过SMN2外显子7的引物通过半定量RT-PCR扩增cDNA(表22)。PCR反应条件为：94℃下2分钟(1个循环)，98℃下10秒，60℃下15秒，72℃下32秒，循环30次，最后5分钟在72℃下延伸。PCR反应列于表23。为了进一步区分SMN1 mRNA和SMN2，将SMN的PCR产物用DdeI限制酶(R0175L，新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，美国马塞诸塞州伊普斯维奇)消化，然后用2％琼脂糖凝胶分离。由于SMN2外显子8上的核苷酸变异(扩增自SMN2基因而非SMN1基因的PCR产物中存在DdeI识别位点)，DdeI消化从SMN2FL和SMN2Δ7释放115bp的片段，得到3个片段：507(SMN1FL)、338(SMN2Δ7)、392(SMN2FL)和115bp。还扩增TBP基因，作为RNA上样对照。DdeI消化反应条件为：37℃下60分钟，65℃下20分钟，1个循环。DdeI消化反应列于表24中。
表22：用于半定量RT-qPCR检测的引物序列
表23：半定量RT-PCR反应
| 试剂(宝生物公司，R010A) | 体积(μl) |
| 5×Prime STAR缓冲液 | 5 |
| dNTP混合物 | 2 |
| e引物F+R(5μM) | 1 |
| 模板 | 2 |
| PrimeSTAR HSDNA聚合酶 | 0.25 |
| DD-水 | 14.75 |
| 总计 | 25 |
表24：DdeI消化反应
| 试剂(NEB，R0175L) | 体积(μl) |
| 限制酶 | 1 |
| 10×NEB缓冲液 | 1 |
| cDNA | 6 |
| DD-水 | 2 |
| 总计 | 10 |
Western印迹
使用包含蛋白酶抑制剂的1×RIPA缓冲液从转染的细胞中收获蛋白质，并通过BCA蛋白质测定试剂盒(碧云天公司(Beyotime)，P0010，中国上海)检测蛋白质浓度。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶进行蛋白质电泳(10μg蛋白质/孔)，然后将其转移到聚偏二氟乙烯(0.45μm PVDF)膜。用一抗抗SMN(CST公司，19276，美国)或抗α/β-微管蛋白(CST公司，2148s，美国)抗体在4℃下对膜进行印迹过夜。在用TBST缓冲液洗涤三次后，将膜与抗IgG、辣根过氧化物酶偶联的二抗(CST公司，7074s和7076s，美国)在室温(RT)下孵育1小时。然后用TBST缓冲液将膜洗涤3次，每次10分钟，并通过Image Lab(伯乐公司(BIO-RAD)，Chemistry Doctm MP成像系统)进行分析。使用ImageJ软件量化SMN蛋白和α/β-微管蛋白的条带密度。
ELISA试验
为了定量人IFN-α蛋白表达水平，收集培养的PBMC细胞的上清液并使用ELISA试剂盒(70-EK199-96，MULTI SCIENCES，中国)通过OD值检测。测试根据ELISA试剂盒说明及详细程序进行。
a)准备所有需要试剂和工作浓度标准。
b)去除不需要的板条(slat)，将它们放回装有干燥剂的铝箔袋中，并重新密封。
c)浸泡ELISA板：添加300μl 1×乳液，并让其静置浸泡30秒。为了获得理想的实验结果，浸泡是必要的。舍弃乳液后，将微孔板在吸水纸上拍干。洗涤板后，请立即使用微孔板，并不要让微孔板变干。
d)添加标准品：在标准品孔中添加100μl稀释2倍的标准品。向空白孔中添加100μl标准稀释液或培养基。
e)添加样品：血清/血浆：向样品孔添加50μl 1×检测缓冲液和50μl样品。细胞培养物上清液：向样品孔中添加100μl细胞培养物上清液。
f)添加检测抗体：向各孔添加50μl稀释的检测抗体(1:100稀释)。确保步骤d)、e)和f)不间断地继续添加样品。样品添加过程在15分钟内完成。
g)孵育：用封膜封板。以300rpm摇动并在室温下孵育3小时。
h)洗涤：弃去液体，向各孔添加300μl洗涤液洗板，并洗涤6次。每次洗涤板时，将它们放在吸水纸上拍干。为了获得理想的实验性能，必须彻底去除残留液体。
i)添加显色底物：向各孔添加100μl显色底物TMB，避光，室温下孵育5-30分钟。
j)添加终止液：向各孔添加100μL终止液。颜色从蓝色变成了黄色。如果颜色为绿色或颜色变化明显不均匀，请轻轻敲击框以混合均匀。
k)检测读数：在30分钟内，用酶标仪进行双波长检测，并在450nm最大吸收波长处测定OD值。
动物操作
所有动物程序均由经过认证的实验室人员使用符合当地和州法规并经机构动物护理和使用委员会批准的协议进行。如前Hsieh-Li等(Hsieh-Li等2000)所述通过用人SMN2(Smn1-/-SMN2+/-)的转基因纯合敲除小鼠Smn1(也称为Smn)外显子7生成的SMA样小鼠获自杰克逊实验室(美国缅因州巴尔港)。在出生后第0天(P0)收集尾巴剪尾，通过爪子纹身识别各幼崽并使用下述3个特异性引物的组通过PCR分析进行基因分型：S1，5′-ATAACACCACCACTCTTACTC-3′(SEQ ID NO:119)；S2，5′-GTAGCCGTGATGCCATTGTCA-3′(SEQ IDNO:120)(野生型等位基因为1,150bp条带)；和S1和H1，5′-AGCCTGAAGAACGAGATCAGC-3′(SEQID NO:121)(突变等位基因为950bp条带)。PCR产物通过1％琼脂糖凝胶检测。生成严重型SMA小鼠(Smn1-/-，SMN2+/-)。将Smn小鼠的同窝杂合子(Het)(Smn1+/-，SMN2+/-)用作对照。
脑室内(ICV)注射
出生后第1天(P1)的幼鼠中进行ICV注射。使用带有33号可拆卸针头的5μl微型注射器将溶解在0.9％盐水中的两微升寡核苷酸注射到两个大脑侧脑室中的任一个。将不透明示踪剂(Fast Green，0.1％，W/V)添加到试剂中，以在注射后显示侧脑室的边界。
表25.SMN2启动子上saRNA热点区域的DNA序列
6.等同形式和通过引用纳入
本文引用的所有参考文献均通过引用纳入，如同各单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利都具体且单独地表明，通过引用其全文纳入用于所有目的。根据37CFR§1.57(b)(1)之规定，申请人的该通过引用纳入声明旨在关联各个单独的出版物、数据库条目(例如Genbank序列或GeneID条目)、专利申请或专利，其各自都根据37CFR§1.57(b)(2)进行了明确标识，即使这类引用没有紧邻专用的通过引用纳入声明。说明书中包括通过引用纳入的专用声明，如果有的话，则完全不削弱该通过引用并入的一般性声明。本文对参考文献的引用并旨在承认该参考文献是相关的现有技术，也不构成对这些出版物或文件内容或日期的任何承认。
虽然已参照优选实施方式和各种替代实施方式具体示出和描述了本发明，但相关领域的技术人员应当理解，可在不脱离本发明精神和范围的情况下在形式和细节上进行各种改变。
7.参考文献
Coovert,D.D.,T.T.Le,等(1997)."脊髓性肌萎缩的存活运动神经元蛋白(Thesurvival motor neuron protein in spinal muscular atrophy)."Human molecular genetics6(8):1205-1214.
Crooke,S.T.(1991)."反义技术(Antisense technology)."Current opinion in biotechnology 2(2):282-287.
Crooke,S.T.,J.L.Witztum,等(2018)."RNA靶向治疗(RNA-TargetedTherapeutics)."Cell metabolism 27(4):714-739.
Fire,A.,S.Xu,等(1998)."双链RNA对秀丽隐杆线虫的强效和特异性遗传干扰(Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans)."Nature 391(6669):806-811.
Horrobin,D.F.(2001)."药物发现中的现实主义——Cassandra正确吗？(Realismin drug discovery-could Cassandra be right？)"Nature biotechnology 19(12):1099-1100.
Hsieh-Li,H.M.,J.G.Chang,等(2000)."脊髓性肌萎缩症的小鼠模型(A mousemodel for spinal muscular atrophy)."Nature genetics 24(1):66-70.
Hua,Y.,T.A.Vickers,等(2007)."通过靶向外显子的反义寡核苷酸增强SMN2外显子7包含(Enhancement of SMN2 exon 7inclusion by antisense oligonucleotidestargeting the exon)."PLoS biology 5(4):e73.
Hua,Y.,T.A.Vickers,等(2008)."hnRNP A1/A2内含子剪接沉默子的反义掩蔽纠正转基因小鼠中的SMN2剪接(Antisense masking of an hnRNP A1/A2 intronicsplicing silencer corrects SMN2 splicing in transgenic mice)."American journal of human genetics 82(4):834-848.
Janowski,B.A.,S.T.Younger,等(2007)."用启动子靶向的双链体RNA激活哺乳动物细胞中的基因表达(Activating gene expression in mammalian cells withpromoter-targeted duplex RNAs)."Nature chemical biology 3(3):166-173.
Kang,M.R.,G.Li,等(2017)."开发用于癌症治疗的治疗性dsP21-322(Development of Therapeutic dsP21-322 for Cancer Treatment)."Advances in experimental medicine and biology 983:217-229.
Le,T.T.,L.T.Pham,等(2005)."SMNδ7是着丝粒存活运动神经元(SMN2)基因的主要产物，延长脊髓性肌萎缩症小鼠的存活，并与全长SMN相关(SMNDelta7,the majorproduct of the centromeric survival motor neuron(SMN2)gene,extends survivalin mice with spinal muscular atrophy and associates with full-length SMN)."Human molecular genetics 14(6):845-857.
Levin,A.A.(2017)."靶向治疗性寡核苷酸(Targeting TherapeuticOligonucleotides)."The New England journal of medicine 376(1):86-88.
Li,L.C.(2017)."哺乳动物细胞中的小RNA引导的转录基因激活(RNAa)(SmallRNA-Guided Transcriptional Gene Activation(RNAa)in Mammalian Cells)."Advances in experimental medicine and biology 983:1-20.
Li,L.C.,S.T.Okino,等(2006)."小dsRNA在人细胞中诱导转录激活(SmalldsRNAs induce transcriptional activation in human cells)."Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103(46):17337-17342.
Liang,X.H.,H.Sun,等(2017)."RNA酶H1依赖性反义寡核苷酸在指导细胞质和细胞核中RNA切割方面具有很强的活性(RNase H1-Dependent Antisense OligonucleotidesAre Robustly Active in Directing RNA Cleavage in Both the Cytoplasm and theNucleus)."Molecular therapy:the journal of the American Society of Gene Therapy 25(9):2075-2092.
Setten,R.L.,J.J.Rossi,等(2019)."基于RNAi的疗法的现状和未来方向(Thecurrent state and future directions of RNAi-based therapeutics)."Nature reviews.Drug discovery 18(6):421-446.
Zamore,P.D.,T.Tuschl,等(2000)."RNAi：双链RNA以21-23个核苷酸间隔指导mRNA的ATP依赖性切割(RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependentcleavage of mRNA at 21to 23nucleotide intervals)."Cell 101(1):25-33.
Pagliarini,V.,M.Guerra,V.Di Rosa,C.Compagnucci和C.Sette.2020.'与组蛋白脱乙酰酶抑制剂LBH589和剪接开关反义寡核苷酸联合治疗增强脊髓性肌萎缩症细胞中的SMN2剪接和SMN表达(Combined treatment with the histone deacetylase inhibitorLBH589 and a splice-switch antisense oligonucleotide enhances SMN2 splicingand SMN expression in Spinal Muscular Atrophy cells)',Journal ofneurochemistry,153:264-75.
序列表
<110> 中美瑞康核酸技术（南通）研究院有限公司
<120> 多价寡核苷酸试剂及其使用方法
<130> RAG-ZL-202008-01
<150> PCT/CN2021/075958
<151> 2021-02-08
<160> 147
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 1
acuacugagu gacaguagat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 2
ucuacuguca cucaguagut t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggugacauuu gugaaacuut t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaguuucaca aaugucacct t 21
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<211> 21
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<213> 人工序列
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agacgaggcc uaagcaacat t 21
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uguugcuuag gccucgucut t 21
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uuguacacuu ggucaacaut t 21
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cacuggaguu cgagacgagt t 21
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<212> DNA/RNA
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cucgucucga acuccagugt t 21
<210> 11
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,8,15)
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<220>
<221> modified_base
<222> (1,5,6,7,10,13,16)
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<400> 11
ucacuuucau aaugcugg 18
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<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 12
uacuuuugug uaguacaaat t 21
<210> 13
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,13,14,15,16,17,18,19,20)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> 5'-磷酸
<400> 13
uguugcuuag gccucgucuc 20
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (17,19,23,30)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (16,20,21,22,25,28,31)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(16)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 14
gaggccuaag caacaucacu uucauaaugc ugg 33
<210> 15
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,26,30,32)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18,21,24,27,28,29,33)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(16)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 15
gaggccuaag caacaggucg uaauacuuuc acu 33
<210> 16
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,13,14,15,16,17,18,28,29,30)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15,16,18,20,22,24,26,28,30)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14,17,19,21,23,25,27,29)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (15)..(16)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 16
gaggccuaag caacagaggc cuaagcaaca 30
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,13,14,15,16,17,18,19,20)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> 5'-(E)-乙烯基膦酸酯
<400> 17
uguugcuuag gccucgucuc 20
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,22,26,33)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,23,24,25,28,31,34)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 18
gacgaggccu aagcaacauc acuuucauaa ugcugg 36
<210> 19
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 19
uuguacacuu ggucaacaut tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 20
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 20
auguugacca aguguacaat tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 21
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 21
cacuggaguu cgagacgagt tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 22
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 22
cucgucucga acuccagugt tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 23
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 23
cacuggaguu cgagacgagt tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 24
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L9, 间隔子-9 (S9接头)
<400> 24
cacuggaguu cgagacgagt tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 25
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L4, 间隔子-C6 (C6接头)
<400> 25
cacuggaguu cgagacgagt tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 26
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 26
cucgucucga acuccagugt tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 27
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,8,15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5,6,7,10,13,16)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 27
ucacuuucau aaugcuggcu cgucucgaac uccagugtt 39
<210> 28
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 28
uuuguacuacacaaaaguatt 21
<210> 29
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,8,15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5,6,7,10,13,16)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L9, 间隔子-9 (S9接头)
<400> 29
ucacuuucau aaugcuggcu cgucucgaac uccagugtt 39
<210> 30
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,8,15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5,6,7,10,13,16)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L4, 间隔子-C6 (C6接头)
<400> 30
ucacuuucau aaugcuggcu cgucucgaac uccagugtt 39
<210> 31
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L9, 间隔子-9 (S9接头)
<400> 31
cucgucucga acuccagugt tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 32
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L4, 间隔子-C6 (C6接头)
<400> 32
cucgucucga acuccagugt tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 33
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (25,27,31,38)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (24,28,29,30,33,36,39)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (23)..(24)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 33
cacuggaguu cgagacgagg cttucacuuu cauaaugcug g 41
<210> 34
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 34
gccucgucuc gaacuccagu gtt 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 35
cacuggaguu cgagacgagg ctt 23
<210> 36
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (25,27,31,38)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (24,28,29,30,33,36,39)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (23)..(24)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 36
gccucgucuc gaacuccagu gttucacuuu cauaaugcug g 41
<210> 37
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 37
agacgaggcc uaagcaacat tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 38
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,8,15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5,6,7,10,13,16)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 38
ucacuuucau aaugcuggag acgaggccua agcaacatt 39
<210> 39
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,8,15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5,6,7,10,13,16)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L9, 间隔子-9 (S9接头)
<400> 39
ucacuuucau aaugcuggag acgaggccua agcaacatt 39
<210> 40
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,8,15)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5,6,7,10,13,16)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L4, 间隔子-C6 (C6接头)
<400> 40
ucacuuucau aaugcuggag acgaggccua agcaacatt 39
<210> 41
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 41
agacgaggcc uaagcaacat tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 42
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L9, 间隔子-9 (S9接头)
<400> 42
agacgaggcc uaagcaacat tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 43
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L4, 间隔子-C6 (C6接头)
<400> 43
agacgaggcc uaagcaacat tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 44
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 44
uguugcuuag gccucgucut tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 45
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 45
uguugcuuag gccucgucut tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 46
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L9, 间隔子-9 (S9接头)
<400> 46
uguugcuuag gccucgucut tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 47
<211> 39
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,25,29,36)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,27,28,31,34,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)..(22)
<223> L4, 间隔子-C6 (C6接头)
<400> 47
uguugcuuag gccucgucut tucacuuuca uaaugcugg 39
<210> 48
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (25,27,31,38)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (24,28,29,30,33,36,39)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (23)..(24)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 48
cgagacgagg ccuaagcaac attucacuuu cauaaugcug g 41
<210> 49
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 49
uguugcuuag gccucgucuc gtt 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 50
cgagacgagg ccuaagcaac att 23
<210> 51
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (25,27,31,38)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (24,28,29,30,33,36,39)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (23)..(24)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 51
uguugcuuag gccucgucuc gttucacuuu cauaaugcug g 41
<210> 52
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 52
gacgaggccu aagcaacacg ucucgaacuc cagug 35
<210> 53
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 53
uguugcuuag gccucgucuc 20
<210> 54
<211> 53
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,22,26,33)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,23,24,25,28,31,34)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19) (36)..(37)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 54
gacgaggccu aagcaacauc acuuucauaa ugcuggcguc ucgaacucca gug 53
<210> 55
<211> 53
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (37,39,43,50)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (36,40,41,42,45,48,51)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19) (35)..(36)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 55
gacgaggccu aagcaacacg ucucgaacuc cagugucacu uucauaaugc ugg 53
<210> 56
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 56
gacgaggccu aagcaacacu cgucucgaac uccagug 37
<210> 57
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,22,26,33)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,23,24,25,28,31,34)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19) (36)..(37)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 57
gacgaggccu aagcaacauc acuuucauaa ugcuggcucg ucucgaacuc cagug 55
<210> 58
<211> 55
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (39,41,45,52)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (38,42,43,44,47,50,53)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19) (37)..(38)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 58
gacgaggccu aagcaacacu cgucucgaac uccaguguca cuuucauaau gcugg 55
<210> 60
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<400> 60
gacgaggccu aagcaaca 18
<210> 61
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,22,26,33)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,23,24,25,28,31,34)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 61
gacgaggccu aagcaacauc acuuucauaa ugcugg 36
<210> 62
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 62
ccaacucauu cuccaaguc 19
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 63
uacuuggaga augaguuggc a 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 64
ccuauaugug guagaguaut t 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 65
auacucuacc acauauaggt t 21
<210> 66
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 66
gccgaaguca ucuggacaat t 21
<210> 67
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<400> 67
uuguccagau gacuucggct t 21
<210> 68
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,16,17,18,19,20)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (1,19,20)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (3,5)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 68
cauauagguc cuugggaacc 20
<210> 69
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,16,17,18,19,20)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (3,17)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 69
cauacucuac cacauauagg 20
<210> 70
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,16,17,18,19,20)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (3,17)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 70
cauacucuac cacauauagg 20
<210> 71
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 71
ccaacucauu cuccaagucc cuauaugugg uagaguautt 40
<210> 72
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,38,39)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,24)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 72
ccaacucauu cuccaagucc auauaggucc uugggaacc 39
<210> 73
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,24)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (22,36)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 73
ccaacucauu cuccaagucc auacucuacc acauauagg 39
<210> 74
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,36,39)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,24,35)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 74
ccaacucauu cuccaagucc uuguccagau gacuucggc 39
<210> 75
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,39)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (35,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 75
ccaacucauu cuccaagucc caaggguucc uggauauac 39
<210> 76
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (35,39)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (23,37)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 76
ccaacucauu cuccaagucg gauauacacc aucucauac 39
<210> 77
<211> 39
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (20,21,22,23,24,35,36,37,38,39)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,23,39)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (24,35,37,38)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 77
ccaacucauu cuccaagucc ggcuucagua gaccuguuc 39
<210> 78
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 78
cacuggaguu cgagacgag 19
<210> 79
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,24,31)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,26,29,32)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 79
gacgaggccu aagcaacaac uuucauaaug cugg 34
<210> 80
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (22,29,33)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,24,27,30)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 80
gacgaggccu aagcaacauu ucauaaugcu ggc 33
<210> 81
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,28,32)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,23,26,29)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 81
gacgaggccu aagcaacauu cauaaugcug gc 32
<210> 82
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,27,31)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,22,25,28)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 82
gacgaggccu aagcaacauc auaaugcugg c 31
<210> 83
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (25,29)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20,23,26)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 83
gacgaggccu aagcaacaau aaugcuggca 30
<210> 84
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,27)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,24)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 84
gacgaggccu aagcaacaaa ugcuggcag 29
<210> 85
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,27)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,24)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 85
gacgaggccu aagcaacaaa ugcuggcag 29
<210> 86
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,25)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,22)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 86
gacgaggccu aagcaacaug cuggcag 27
<210> 87
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,24)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 87
gacgaggccu aagcaacagc uggcag 26
<210> 88
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,24)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 88
gacgaggccu aagcaacagc uggca 25
<210> 89
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (20,24)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 89
gacgaggccu aagcaacagc uggc 24
<210> 90
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,29)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24,28,31,33)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 90
gacgaggccu aagcaacaua gacuagauca uaugag 36
<210> 91
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,29)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24,28,31,33)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 91
gacgaggccu aagcaacaua gacuagauca uaug 34
<210> 92
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,29)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24,28,31,33)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 92
gacgaggccu aagcaacaua gacuagauca uau 33
<210> 93
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,29)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24,28,31)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 93
gacgaggccu aagcaacaua gacuagauca ua 32
<210> 94
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,29)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24,28,31)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 94
gacgaggccu aagcaacaua gacuagauca u 31
<210> 95
<211> 30
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,29)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24,28)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 95
gacgaggccu aagcaacaua gacuagauca 30
<210> 96
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,29)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24,28)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 96
gacgaggccu aagcaacaua gacuagauc 29
<210> 97
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27,28)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24,28)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 97
gacgaggccu aagcaacaua gacuagau 28
<210> 98
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26,27)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 98
gacgaggccu aagcaacaua gacuaga 27
<210> 99
<211> 26
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (19,20,21,22,23,24,25,26)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (19,24)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 99
gacgaggccu aagcaacaua gacuag 26
<210> 100
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (19)..(20)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 100
ccaacucauu cuccaagucg ccgaagucau cuggacaatt 40
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
tcatactggc tattatatgg gtttt 25
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
tgctctatgc cagcatttct c 21
<210> 103
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
gctattatat ggaaatgctg gcatag 26
<210> 104
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
ttccagatct gtctgatcgt ttct 24
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
cccccaccac ctcccatatg 20
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
cccttctcac agctcataaa attac 25
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
ggaagaccat gtggacctgt 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
ggattagggc ttcctcttgg 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
tgtgaccagc acactgagaa 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
tggaggatgt gccagaggta 20
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
tgctcaccca ccaacaattt ag 22
<210> 112
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
tctgctctga ctttagcacc tg 22
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
atcaccatct tccaggagcg a 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
ttctccatgg tggtgaagac g 21
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
gctctggaat tgtaccgcag 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
ctgcagcaaa tcgcttggga 20
<210> 117
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
tgaaggtcgg tgtgaacgg 19
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
ttgaggtcaa tgaaggggtc g 21
<210> 119
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
ataacaccac cactcttact c 21
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
gtagccgtga tgccattgtc a 21
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
agcctgaaga acgagatcag c 21
<210> 122
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
aagcattaaa ggactgactg aagg 24
<210> 123
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
caagtctcca acatgcctct c 21
<210> 124
<211> 159
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
agtcgcactc tgtcactcag gctggagtgc agtggcgtga tcttggctca ctgcaacctc 60
cgcctcccga gttcaagtga ttctcctggc tcagcctccc aagcagctgt cattacaggc 120
ctgcaccacc acacccggct gatttttgta tttttagga 159
<210> 125
<211> 82
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
aatactggag gcccggtgtg gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag 60
gcggtcggat tacgaggtca gg 82
<210> 126
<211> 815
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
ctggccaaca tggtgaaacc ccatctttac taaaaataca aaaattagcc gggtgtggtg 60
gtgggcgcct gtaatcccag ctactcgggg ggctgaggca gaattgcttg aacctgggag 120
gcagaggttg cagtgagctg agatcacgcc actgcattcc agcctgggtg acagagcaat 180
actctgtcgc aaaaaaaaaa aagaatactg gaggctgggc gaggtggctc acacctgtaa 240
tcccagcatt ttgggatgcc agaggcgggc ggaatatctt gagctcagga gttcgagacc 300
agcctacaca atatgctcca aacgccgcct ctacaaaaca tacagaaact agccgggtgt 360
ggtggcgtgc ccctgtggtc ctagctactt gggaggttga ggcgggagga tcgcttgagc 420
tcgggaggtc gaggctgcaa tgagccgaga tggtgccact gcactctgac gacagagcga 480
gactccgtct caaaacaaac aacaaataag gttgggggat caaatatctt ctagtgttta 540
aggatctgcc ttccttcctg cccccatgtt tgtctttcct tgtttgtctt tatatagatc 600
aagcaggttt taaattccta gtaggagctt acatttactt ttccaagggg gagggggaat 660
aaatatctac acacacacac acacacacac acacacacac acactggagt tcgagacgag 720
gcctaagcaa catgccgaaa ccccgtctct actaaataca aaaaatagct gagcttggtg 780
gcgcacgcct atagtcctag ctactgggga ggctg 815
<210> 127
<211> 108
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
ctgcagtgag ccgagatcgc gccgctgcac tccagcctga gcgacagggc gaggctctgt 60
ctcaaaacaa acaaacaaaa aaaaaaggaa aggaaatata acacagtg 108
<210> 128
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,13,14,15)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (15)
<223> L5, DIO接头
<400> 128
gaggccuaag caaca 15
<210> 129
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,15,16,17,18,19,20,21,22)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<400> 129
cacuggaguu cgagacgagg cc 22
<210> 130
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (22,24,28,35)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,25,26,27,30,33,36)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 130
ccucgucucg aacuccagug ucacuuucau aaugcugg 38
<210> 131
<211> 36
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26,33)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (23,24,25,28,31,34)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 131
ccucgucucg aacuccagug acuuucauaa ugcugg 36
<210> 132
<211> 35
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (24,31,35)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,26,29,32)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 132
ccucgucucg aacuccagug uuucauaaug cuggc 35
<210> 133
<211> 34
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,30,34)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,25,28,31)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 133
ccucgucucg aacuccagug uucauaaugc uggc 34
<210> 134
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (22,29,33)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,24,27,30)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 134
ccucgucucg aacuccagug ucauaaugcu ggc 33
<210> 135
<211> 32
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,28,32)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (23,26,29)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 135
ccucgucucg aacuccagug cauaaugcug gc 32
<210> 136
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,21,22,23,24,25,26,27,28,29)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,24,25,26,27,28,29)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (23,27)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (21,24)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 136
ccucgucucg aacuccagug ugcuggcag 29
<210> 137
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,21,22,23,24,25,26,27,28)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (21,22,23,24,25,26,27,28)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (22,26)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (23)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 137
ccucgucucg aacuccagug gcuggcag 28
<210> 138
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,10,11,13,15,17,19)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,12,14,16,18)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<400> 138
gguggaaaug aagaaagua 19
<210> 139
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,19,20,21)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<400> 139
uacuuucuuc auuuccaccu u 21
<210> 140
<211> 37
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,16,17,18,19,20,21,34,35,36,37)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,9,10,11,12,14,16,18,19,21,23,25,27,28,29,31,33,35,37)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,13,15,17,20,22,24,26,30,32,34,36)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 140
gacgaggccu aagcaacagg uggaaaugaa gaaagua 37
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,19,20,21)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15,17,19,21)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<220>
<221> modified_base
<222> (1)
<223> 5'-(E)-乙烯基膦酸酯
<400> 141
uacuuucuuc auuuccaccu u 21
<210> 142
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (6,8,9,10,12,13,14,16)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (2,3,5,11,18,19,20,22)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<400> 142
guuaucgccc ucccacauuu gugg 24
<210> 143
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,8,15,24,26,27,28,30,31,32,34)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (1,5,6,7,10,13,16,20,21,23,29,36,37,38,40)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (18)..(19)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 143
ucacuuucau aaugcugggu uaucgcccuc ccacauuugu gg 42
<210> 144
<211> 42
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42)
<223> 2'-O-甲氧基乙基 (2’MOE)
<220>
<221> modified_base
<222> (6,8,9,10,12,13,14,16,26,28,32,39)
<223> 5'-甲基胞嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (2,3,5,11,18,19,20,22,25,29,30,31,34,37,40)
<223> 5'-甲基尿嘧啶
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> L1, 间隔子-18 (S18接头)
<400> 144
guuaucgccc ucccacauuu guggucacuu ucauaaugcu gg 42
<210> 145
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 145
gacgaggccu aagcaaca 18
<210> 146
<211> 15
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,13,14,15)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<400> 146
gaggccuaag caaca 15
<210> 147
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<221> modified_base
<222> (1,2,3,13,14,15,16,17,18,19,20)
<223> 硫代磷酸酯主链修饰
<220>
<221> modified_base
<222> (2,4,6,8,10,12,14,16,18,20)
<223> 2'-氟代
<220>
<221> modified_base
<222> (1,3,5,7,9,11,13,15,17,19)
<223> 2'-O-甲基 (2'-OMe)
<400> 147
uguugcuuag gccucgucuc 20
Claims (75)
1.一种包含共价连接的两个或更多个功能性寡核苷酸的多价寡核苷酸试剂，其中，所述两个或更多个功能性寡核苷酸独立地选自：
a)双链RNA(dsRNA)；和
b)反义寡核苷酸(ASO)。
2.如权利要求1所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂中包含的功能性寡核苷酸的数量为2-X，其中X为3-10的整数。
3.如权利要求2所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述试剂中包含的dsRNA的数量为0-X，并且其余功能性寡核苷酸为一种或多种ASO。
4.如权利要求1所述的多价寡核苷酸试剂，其中
所述一种或多种dsRNA独立地选自小干扰RNA(siRNA)和小激活RNA(saRNA)；和/或
所述一种或多种ASO独立地选自gapmer和mixmer。
5.如权利要求1所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述两个或更多个功能性寡核苷酸独立地调节一个或多个基因的表达，调节一种或多种蛋白质的表达(例如通过结合mRNA序列)，或调节非编码调节核酸序列。
6.如权利要求5所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述非编码调节核酸序列是启动子序列、增强子、沉默子和/或转录因子。
7.如权利要求1所述的多价寡核苷酸试剂，其中，各dsRNA包含至少10个连续核苷酸的正义链和至少10个连续核苷酸的反义链。
8.如权利要求1所述的多价寡核苷酸试剂，其中，各dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的正义链和/或各dsRNA包含长度为10-60个核苷酸的反义链。
9.如权利要求1所述的多价寡核苷酸试剂，其中，各ASO具有长度为至少5个连续核苷酸的核苷酸序列。
10.如权利要求1所述的多价寡核苷酸试剂，其中，各ASO具有长度为5-30个核苷酸的核苷酸序列。
11.如权利要求1所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述两个或更多个功能性寡核苷酸的总长度为12-200个核苷酸。
12.如权利要求1-10中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述两个或更多个功能性寡核苷酸中任意两个相邻的功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。
13.如权利要求12所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述连接组件选自以下接头或其衍生物：
14.如权利要求12所述的多价寡核苷酸试剂，其中，两个相邻的功能性寡核苷酸通过以下方式共价连接：
其中R表示-H或-OH或-OMe或-MOE或-F或其他2'化学修饰；和/或通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；和/或一个或多个核苷酸。
15.如权利要求1-10中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，一个或多个功能性寡核苷酸包含至少一个化学修饰的核苷酸。
16.如权利要求17所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰独立地选自下组：
选自以下一种或多种的2'糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰、2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰；和/或
硫代磷酸酯(PS)主链修饰；和/或
在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分；和/或
在核苷酸序列的5'端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分；和/或
在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分。
17.如权利要求1-10中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述试剂中的各个ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接相邻的靶向性寡核苷酸。
18.如权利要求1-10中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述试剂中的各个dsRNA在其正义链或反义链的3’端或者在其正义链或反义链的5'端共价连接相邻的ASO。
19.如权利要求1-10中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，两个或更多个功能性寡核苷酸的序列相同或不同；和/或两个或更多个功能性寡核苷酸的功能相同或不同。
20.如权利要求1-10中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂包含：
a)第一双链RNA(dsRNA)和第一反义寡核苷酸(ASO)；
b)第一双链RNA(dsRNA)和第二dsRNA；
c)第一反义寡核苷酸(ASO)和第二ASO；
d)第一双链RNA(dsRNA)、第二dsRNA和第三dsRNA；
e)第一双链RNA(dsRNA)、第二dsRNA和第一反义寡核苷酸(ASO)；
f)第一双链RNA(dsRNA)、第一反义寡核苷酸(ASO)和第二ASO；或
g)第一反义寡核苷酸(ASO)、第二ASO和第三ASO，
其中，在a)到g)的任一项中，所述功能性寡核苷酸以任意顺序排列，并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。
21.如权利要求20所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述第一dsRNA、第二dsRNA和第三dsRNA在存在时独立地选自siRNA和saRNA；和/或
其中，所述第一ASO、第二ASO和第三ASO在存在时独立地选自gapmer和mixmer。
22.如权利要求21所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂包含选自以下的功能性寡核苷酸：
a)siRNA-siRNA；b)siRNA-saRNA；c)saRNA-saRNA；d)siRNA-gapmer；e)siRNA-mixmer；f)saRNA-gapmer；g)saRNA-mixmer；h)gapmer-gapmer；I)gapmer-mixmer；j)mixmer-mixmer；k)siRNA-siRNA-siRNA；l)
siRNA-siRNA-saRNA；m)siRNA-saRNA-saRNA；n)saRNA-saRNA-saRNA；o)siRNA-siRNA-gapmer；p)siRNA-siRNA-mixmer；q)siRNA-saRNA-gapmer；r)
siRNA-saRNA-mixmer；s)saRNA-saRNA-gapmer；t)saRNA-saRNA-mixmer；u)siRNA-gapmer-gapmer；v)saRNA-gapmer-gapmer；w)siRNA-gapmer-mixmer；x)saRNA-gapmer-mixmer；y)siRNA-mixmer-mixmer；z)saRNA-mixmer-mixmer；
aa)gapmer-gapmer-gapmer；ab)gapmer-gapmer-mixmer；ac)gapmer-mixmer-mixmer；和ad)mixmer-mixmer-mixmer，
其中，在a)到ad)中的任一项中，所述功能性寡核苷酸以任意顺序排列,并且通过或不通过一个或多个连接组件共价连接。
23.如权利要求20-22中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中：
a)ASO与第一dsRNA的正义链或反义链的3’端共价连接；或者
b)ASO与第一dsRNA的正义链或反义链的5'端共价连接。
24.如权利要求20所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述ASO的5’端与连接组件偶联；或者所述ASO的3’端与连接组件偶联。
25.如权利要求1-24中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其包含一个或多个其他靶向性寡核苷酸。
26.如权利要求25所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述一个或多个其他靶向性寡核苷酸独立地选自：双链RNA(dsRNA)和反义寡核苷酸(ASO)。
27.如权利要求26所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述其他双链RNA(dsRNA)选自小干扰RNA(siRNA)和小激活RNA(saRNA)；和/或所述一个或多个靶向性寡核苷酸独立地选自gapmer和mixmer。
28.如权利要求1-24中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，一个或多个ASO靶向5'-UTR。
29.如权利要求1-24中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，一个或多个功能性寡核苷酸增加SMN2基因或蛋白质的表达。
30.如权利要求29所述的多价寡核苷酸试剂，其中，通过调节SMN2 mRNA剪接或稳定性(SMN2 mRNA调节剂)，所述一个或多个ASO增加功能性SMN蛋白的产生；和/或所述一个或多个dsRNA增加SMN2基因或蛋白质的表达。
31.如权利要求29所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述一个或多个dsRNA包括saRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)DS06-0004(SEQ ID NO:5)；
b)DS06-0031(SEQ ID NO:7)；
c)DS06-0067(SEQ ID NO:9)；
d)DS06-4A3(SEQ ID NO:146)；
e)R6-04-S1(SEQ ID NO:59)；和
f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)(SEQ ID NO:60)；和/或
其中，所述一个或多个dsRNA包含saRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a')DS06-0004(SEQ ID NO:6)；
b')DS06-0031(SEQ ID NO:8)；
c')DS06-0067(SEQ ID NO:10)；
d')DS06-4A3(SEQ ID NO:147)；
e')R6-04-S1(SEQ ID NO:53)；和
f')R6-04M1-27A-S1L1V3(CM-26)(SEQ ID NO:17)。
32.如权利要求29项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述一个或多个dsRNA包含saRNA，其正义链和反义链的核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：
a)DS06-0004：SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6；
b)DS06-0031：SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；
c)DS06-0067：SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10；
d)DS06-4A3：SEQ ID NO:146和SEQ ID NO:147；
e)R6-04-S1：SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:53；和
f)R6-04(20)-S1V1v(CM-4)：SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:17。
33.如权利要求29项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA包括siRNA，其正义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:3)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:138)的核苷酸序列至少90％相同；和/或
其中，所述dsRNA包含siRNA，其反义链的核苷酸序列与DS06-332i(SEQ ID NO:4)或siSOD1-388-ESC(SEQ ID NO:139)的核苷酸序列至少90％相同。
34.如权利要求29项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA包括siRNA，其正义链和反义链的核苷酸序列对与选自以下的核苷酸序列对至少90％相同：
DS06-332i：SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；和
siSOD1-388-ESC：SEQ ID NO:138和SEQ ID NO:139。
35.如权利要求29所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述ASO的核苷酸序列与ASO10-27(SEQ ID NO:11)或5'UTR ASO(SEQ ID NO:142)的核苷酸序列至少90％相同。
36.如权利要求29-35中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)DA06-4A-27A(SEQ ID NO:14)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:14的正义saRNA链部分互补；
b)DA06-4A-27B(SEQ ID NO:15)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:15的正义saRNA链部分互补；
c)R6-04M1-27A-S1L1V3(SEQ ID NO:18)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:13的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:18的正义saRNA链部分互补；
d)DA06-31A-27A(SEQ ID NO:19)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:8的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:19的正义saRNA链部分互补；
e)DA06-31B-27A(SEQ ID NO:20)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:7的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:20的反义saRNA链部分互补；
f)DA06-67A-27A(SEQ ID NO:21)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:21的正义saRNA链部分互补；
g)DA06-67B-27A(SEQ ID NO:22)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:22的反义saRNA链部分互补；
h)DA6-67A3'L0-27A(SEQ ID NO:23)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:23的正义saRNA链部分互补；
j)DA6-67A3'L9-27A(SEQ ID NO:24)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:24的正义saRNA链部分互补；
k)DA6-67A3'L4-27A(SEQ ID NO:25)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:10的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:25的正义saRNA链部分互补；
l)DA6-67B3'L0-27A(SEQ ID NO:26)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:26的反义saRNA链部分互补；
m)DA6-67B5'L1-27A(SEQ ID NO:27)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:27的反义saRNA链部分互补；
o)DA6-67B5'L9-27A(SEQ ID NO:29)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:29的反义saRNA链部分互补；
p)DA6-67B5'L4-27A(SEQ ID NO:30)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:30的反义saRNA链部分互补；
q)DA6-67B3'L9-27A(SEQ ID NO:31)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:31的反义saRNA链部分互补；
r)DA6-67B3'L4-27A(SEQ ID NO:32)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:9的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:32的反义saRNA链部分互补；
s)DA06-67A21L1-27A(SEQ ID NO:33)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:34的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:33的正义saRNA链部分互补；
t)DA06-67B21L1-27A(SEQ ID NO:36)，和正义saRNA链SEQ ID NO:35，其与SEQ ID NO:36的反义saRNA链部分互补；
u)DA6-04A3'L0-27A(SEQ ID NO:37)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:37的正义saRNA链部分互补；
v)DA6-04A5'L1-27A(SEQ ID NO:38)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:38的正义saRNA链部分互补；
w)DA6-04A5'L9-27A(SEQ ID NO:39)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:39的正义saRNA链部分互补；
x)DA6-04A5'L4-27A(SEQ ID NO:40)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:40的正义saRNA链部分互补；
y)DA6-04A3'L1-27A(SEQ ID NO:41)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:41的正义saRNA链部分互补；
z)DA6-04A3'L9-27A(SEQ ID NO:42)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:42的正义saRNA链部分互补；
aa)DA6-04A3'L4-27A(SEQ ID NO:43)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:6的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:43的正义saRNA链部分互补；
bb)DA6-04B3'L0-27A(SEQ ID NO:44)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:44的反义saRNA链部分互补；
cc)DA6-04B3'L1-27A(SEQ ID NO:45)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:45的反义saRNA链部分互补；
dd)DA6-04B3'L9-27A(SEQ ID NO:46)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:46的反义saRNA链部分互补；
ee)DA6-04B3'L4-27A(SEQ ID NO:47)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:5的正义saRNA链，其与SEQ ID NO:47的反义saRNA链部分互补；
ff)DA06-04A21L1-27A(SEQ ID NO:48)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:49的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:48的正义saRNA链部分互补；
gg)DA06-04B21L1-27A(SEQ ID NO:51)，和正义saRNA链SEQ ID NO:50，其与SEQ IDNO:51的反义saRNA链部分互补；
hh)R6-04M1-16nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:79)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQID NO:79的正义saRNA链部分互补；
ii)R6-04M1-15nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:80)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQID NO:80的正义saRNA链部分互补；
jj)R6-04M1-14nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:81)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQID NO:81的正义saRNA链部分互补；
kk)R6-04M1-13nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:82)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQID NO:82的正义saRNA链部分互补；
ll)R6-04M1-(12nt-B)-S1L1V3v(SEQ ID NO:83)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ ID NO:83的正义saRNA链部分互补；
mm)R6-04M1-11nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:84)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQID NO:84的正义saRNA链部分互补；
nn)R6-04M1-10nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:85)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与正义saRNA链SEQ ID NO:85至少部分互补；
oo)R6-04M1-9nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:86)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ IDNO:86的正义saRNA链部分互补；
pp)R6-04M1-8nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:87)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ IDNO:87的正义saRNA链部分互补；
qq)R6-04M1-9nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:88)，和反义saRNA链SEQ ID
NO:17，其与SEQ ID NO:88的正义saRNA链部分互补；
rr)R6-04M1-6nt-S1L1V3v(SEQ ID NO:89)，和反义saRNA链SEQ ID NO:17，其与SEQ IDNO:89的正义saRNA链部分互补；
ss)DS06-4A-S2L5V(SEQ ID NO:128)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:17的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:128的正义saRNA链部分互补；
ss')DS06-4A-S2L1v(SEQ ID NO:16)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:17的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:16的正义saRNA链部分互补；
tt)DA6-27A-5'UTR(SEQ ID NO:143)；
uu)DA6-5'UTR-27A(SEQ ID NO:144)；
vv)R6-67M3-27A-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:130的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
ww)R6-67M3-16nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:131的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
xx)R6-67M3-15nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:132的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
yy)R6-67M3-14nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:133的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA部分互补；
zz)R6-67M3-13nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:134的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
aaa)R6-67M3-12nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:135的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
bbb)R6-67M3-9nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:136的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
ccc)R6-67M3-8nt-S1L1V3(SEQ ID NO:129)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:137的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:129的正义saRNA链部分互补；
其中，接头选自下组：L1、L4和L9存在或不存在，其中L1表示间隔子18、L4表示间隔子C6且L9表示间隔子9。
37.如权利要求29-35中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)R6-04S1&67S1R-L1V2(SEQ ID NO:52)，和具有与链SEQ ID NO:52部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:52部分互补的核苷酸序列SEQ IDNO:78的反义saRNA链；
b)R6-04S1&67S5-L1V2(SEQ ID NO:56)，和具有与链SEQ ID NO:56部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:56部分互补的核苷酸序列SEQ IDNO:78的反义saRNA链；和
c)R6-04M1&R17-388E-L1V2(SEQ ID NO:140)，和与链SEQ ID NO:140部分互补的反义saRNA链SEQ ID NO:17和与链SEQ ID NO:140部分互补的反义siRNA链SEQ ID NO:141；和/或
其中，所述多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核
苷酸序列：
a')R6-04S1&27A&67S1R-L1V2(SEQ ID NO:54)，和具有与链SEQ ID NO:54部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:54部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
b')R6-04S1&67S1R&27A-L1V2(SEQ ID NO:55)，和具有与链SEQ ID NO:55部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:55部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；
c')R6-04S1&27A&67S5-L1V2(SEQ ID NO:57)，和具有与链SEQ ID NO:57部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:57部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链；和
d')R6-04S1&67S5&27A-L1V2(SEQ ID NO:58)，和具有与链SEQ ID NO:58部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:53的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:58部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:78的反义saRNA链。
38.如权利要求29-35中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂选自表7-20任一所示的那些或与其具有至少90％序列同一性，并且其中那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
39.如权利要求1-38中任一项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，一个或多个功能性寡核苷酸增加CDKN1A/p21基因或蛋白质的表达和/或减少CD274/PDL-1的表达。
40.如权利要求39所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述一个或多个dsRNA独立地选自：增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达的saRNA；和降低CD274/PDL-1表达的siRNA；和/或
其中，所述一个或多个ASO独立地选自增加CDKN1A/p21基因或蛋白质表达和/或降低CD274/PDL-1表达的ASO。
41.如权利要求39所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同；和/或
其中，所述dsRNA是saRNA，其反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:63)至少90％相同。
42.如权利要求39所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是saRNA，其正义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同，且反义链的核苷酸序列与核苷酸序列RAG1-40(SEQ ID NO:62)至少90％相同。
43.如权利要求39项所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是siRNA，其正义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)siPDL1-2(SEQ ID NO:64)；和
b)siPDL1-3(SEQ ID NO:66)；和/或
其中，所述dsRNA是siRNA，其反义链的核苷酸序列与选自以下的核苷酸序列至少90％相同：
a)siPDL1-2(SEQ ID NO:65)；和
b)siPDL1-3(SEQ ID NO:67)。
44.如权利要求39所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述dsRNA是选自以下的siRNA：
a)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:64)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:65)至少90％相同；和
b)具有正义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列的siRNA，所述正义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:66)至少90％相同，所述反义链核苷酸序列与核苷酸序列siPDL1-2(SEQ ID NO:67)至少90％相同；和/或
其中，所述ASO具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：
a")aPDL1-1(SEQ ID NO:68)；
b")aPDL1-2(SEQ ID NO:69)；和
c")aPDL1-3(SEQ ID NO:70)；和/或
其中，所述多价寡核苷酸试剂具有与选自以下的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列：
a')saP21-40/siPDL1-2(SEQ ID NO:71)，和具有与链SEQ ID NO:71部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:71部分互补的核苷酸序列SEQ IDNO:65的反义siRNA链；和
b')saP21-40/siPDL1-3(SEQ ID NO:100)，和具有与SEQ ID NO:100的正义saRNA链部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链和具有与链SEQ ID NO:100部分互补的核苷酸序列SEQ ID NO:65的反义saRNA链；
c')aP21-40/aPDL1-1(SEQ ID NO:72)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:72的正义saRNA链部分互补；
d')saP21-40/aPDL1-2(SEQ ID NO:73)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:73的正义saRNA链部分互补；
e')saP21-40/aPDL1-3(SEQ ID NO:74)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:74的正义saRNA链部分互补；
f')saP21-40/aPDL1-1R(SEQ ID NO:75)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:75的正义saRNA链部分互补；
g')saP21-40/aPDL1-2R(SEQ ID NO:76)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:76的正义saRNA链部分互补；和
h')saP21-40/aPDL1-3R(SEQ ID NO:77)，和具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的反义saRNA链，其与SEQ ID NO:77的正义saRNA链部分互补。
45.如权利要求39所述的多价寡核苷酸试剂，其中，所述多价寡核苷酸试剂选自表16所示的那些或与其具有至少90％序列同一性，并且其中那些多价寡核苷酸试剂的连接组件和/或连接键和/或方向是可变的。
46.一种包含权利要求1-45中任一项所述的多价寡核苷酸试剂的产品。
47.如权利要求46所述的产品，其中，所述产品选自还包含至少一种药学上可接受的运载体的药物组合物或试剂盒。
48.如权利要求47所述的产品，其中，所述至少一种药学上可接受的运载体选自水性运载体、脂质体、聚合聚合物、多肽和纳米颗粒。
49.如权利要求47项所述的产品，其中，所述试剂盒用于质量控制、候选药物筛选、药物递送至组织或细胞内，或改善分子的药理学性质。
50.一种用于疾病治疗的方法，其包括向需要这种治疗的对象给予足够量的权利要求1-45中任一项所述的多价寡核苷酸试剂或权利要求46-49中任一项所述的产品。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述方法还包括向对象提供一种或多种其他药物或疗法，例如
所述其他药物是选自下组的一种或多种：诺西那生、利司扑兰、布拉扑兰、卓基丝玛、福米韦生、米泊美生、依特立生、赢特尔深、戈洛迪森、沃兰丝生、去纤苷、帕蒂西兰、吉佛西兰、鲁姆西兰、英克西兰或哌加他尼；和/或
所述其他疗法是选自下组的一种或多种：物理疗法、饮食控制和手术。
52.如权利要求50所述的方法，其中，所述方法用于治疗或延迟对象中SMN缺陷相关病症的发作或进展。
53.如权利要求52所述的方法，还包括向所述对象提供一种或多种其他药物或疗法，用于治疗或延迟SMN的发作或进展。
54.如权利要求53所述的方法，其中，所述其他药物是选自下组的一种或多种：诺西那生、利司扑兰、布拉扑兰、卓基丝玛；
其中，所述其他疗法是选自以下的一种或多种：物理疗法、饮食控制和手术。
55.如权利要求50所述的方法，其中，所述疾病是p21/PDL-1相关疾病。
56.如权利要求50所述的方法，其中，所述患者患有癌症或处于患癌症的高风险；和/或
其中所述癌症是实体瘤或非实体瘤。
57.如权利要求56所述的方法，其中，所述癌症选自下组：纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤文氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌/结直肠癌，淋巴系统恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，维尔姆斯氏瘤，宫颈癌，睾丸瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和CNS肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干胶质瘤和混合性胶质瘤)，成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，成神经管细胞瘤，神经鞘瘤颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，成血管细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移。
58.如权利要求56所述的方法，其还包括给予用于治疗癌症的一种或多种其他药剂或疗法。
59.如权利要求58所述的方法，其中，所述其他药剂或疗法选自放射、化疗、手术、免疫疗法、基因疗法。
60.如权利要求59所述的方法，其中，所述化疗是顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、长春花碱、伊立替康、依托泊苷或培美曲塞或其组合或其药学上可接受的盐；和/或
其中，所述其他药剂选自免疫调节抗体和抗体药物偶联物。
61.如权利要求60所述的方法，其中，所述免疫调节抗体选自抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD40抗体、抗CTLA-4抗体或抗OX40抗体或其任何组合；和/或
其中，所述其他抗体药物偶联物靶向c-Met激酶、LRRC15、EGFR或CS1或其任何组合。
62.一种制备权利要求1-45中任一项所述的多价寡核苷酸试剂的方法，其包括：
提供所述两个或更多个功能性寡核苷酸并将其共价连接；或
合成所述全长寡核苷酸试剂。
63.如权利要求62所述的方法，其中，所述两个或更多个功能性寡核苷酸通过或不通过连接组件共价连接。
64.如权利要求63所述的方法，其中，所述连接组件选自以下接头或其衍生物：
65.如权利要求62所述的方法，其中，两个相邻的功能性寡核苷酸通过以下方式共价连接：
其中R代表-H或-OH或-OMe，或-MOE，或-F，或其他2'化学修饰；和/或
通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；和/或
通过一个或多个核苷酸。
66.如权利要求62所述的方法，其中，所述方法还包括在所述功能性寡核苷酸中提供一个或多个化学修饰的核苷酸。
67.如权利要求66所述的方法，其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是选自以下的一种或多种的2’糖修饰：2'-氟-2'-脱氧核苷(2'-F)修饰，2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰和2'-O-(2-甲氧乙基)(2'-O-MOE)修饰；和/或
其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是硫代磷酸酯(PS)主链修饰；和/或
其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-磷酸部分；和/或
其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加(E)-乙烯基膦酸酯部分；和/或
其中，所述至少一个化学修饰的核苷酸的化学修饰是在核苷酸序列的5'端添加5'-甲基胞嘧啶部分。
68.如权利要求62所述的方法，其中，所述试剂中的各个ASO以3'到5'方向或以5'到3'方向共价连接相邻的靶向性寡核苷酸；和/或。
69.如权利要求62所述的方法，其中，所述试剂中的各个dsRNA在其正义链或反义链的3'端或者在其正义链或反义链的5'端共价连接相邻的ASO。
70.一种分离的或合成的寡核苷酸，其包含saRNA正义链，所述saRNA正义链的核苷酸序列与核苷酸序列SEQ ID NO:62至少90％相同。
71.如权利要求70所述的分离的或合成的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸还包含反义链，所述反义链与所述正义saRNA链部分互补。
72.如权利要求70所述的分离的或合成的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸还包含与核苷酸序列SEQ ID NO:63至少90％相同的反义链。
73.如权利要求70所述的分离的或合成的寡核苷酸，其中，所述分离的或合成的寡核苷酸包含：saRNA正义链SEQ ID NO:62和saRNA反义链SEQ ID NO:63的核苷酸序列。
74.一种药物组合物或试剂盒，其包含权利要求70-73中任一项所述的分离的或合成的寡核苷酸。
75.一种用于疾病治疗的方法，其包括向需要这种治疗的对象给予足够量的权利要求70-73中任一项所述的分离的或合成的寡核苷酸或权利要求74所述的药物组合物或试剂盒。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118045206A (zh) * | 2024-04-12 | 2024-05-17 | 四川至善唯新生物科技有限公司 | 一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140298496A1 (en) * | 2011-06-23 | 2014-10-02 | Cold Spring Harbor Laboratory | Phenocopy model of disease |
| US20140323552A1 (en) * | 2011-12-06 | 2014-10-30 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Non-ionic, low osmolar contrast agents for delivery of antisense oligonucleotides and treatment of disease |
| WO2016145608A1 (zh) * | 2015-03-17 | 2016-09-22 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种小激活rna及其制备方法和应用 |
| US20170312367A1 (en) * | 2016-01-31 | 2017-11-02 | University Of Massachusetts | Branched oligonucleotides |
| US20180185497A1 (en) * | 2015-07-02 | 2018-07-05 | City Of Hope | Compounds and compositions including phosphorothioated oligodeoxynucleotide, and methods of use thereof |
| WO2019196887A1 (zh) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种新型小激活rna |
| CN110678549A (zh) * | 2018-04-10 | 2020-01-10 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种激活p21基因表达的方法 |
| WO2020135677A1 (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-02 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856464A (en) * | 1995-06-07 | 1999-01-05 | Lajolla Pharmaceutical Company | Selective capping solution phase oligonucleotide synthesis |
| EP2438168B1 (en) * | 2009-06-01 | 2020-02-12 | Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. | Polynucleotides for multivalent rna interference, compositions and methods of use thereof |
| EP4385568A2 (en) * | 2010-04-06 | 2024-06-19 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting expression of cd274/pd-l1 gene |
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140298496A1 (en) * | 2011-06-23 | 2014-10-02 | Cold Spring Harbor Laboratory | Phenocopy model of disease |
| US20140323552A1 (en) * | 2011-12-06 | 2014-10-30 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Non-ionic, low osmolar contrast agents for delivery of antisense oligonucleotides and treatment of disease |
| WO2016145608A1 (zh) * | 2015-03-17 | 2016-09-22 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种小激活rna及其制备方法和应用 |
| US20180185497A1 (en) * | 2015-07-02 | 2018-07-05 | City Of Hope | Compounds and compositions including phosphorothioated oligodeoxynucleotide, and methods of use thereof |
| US20170312367A1 (en) * | 2016-01-31 | 2017-11-02 | University Of Massachusetts | Branched oligonucleotides |
| WO2019196887A1 (zh) * | 2018-04-10 | 2019-10-17 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种新型小激活rna |
| CN110678549A (zh) * | 2018-04-10 | 2020-01-10 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 一种激活p21基因表达的方法 |
| WO2020135677A1 (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-02 | 中美瑞康核酸技术(南通)研究院有限公司 | 寡聚核酸分子及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JULIA F. ALTERMAN等: "A divalent siRNA chemical scaffold for potent and sustained modulation of gene expression throughout the central nervous system", NAT BIOTECHNOL., vol. 37, no. 8, 31 August 2019 (2019-08-31), pages 884 - 894, XP093011247, DOI: 10.1038/s41587-019-0205-0 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN118045206A (zh) * | 2024-04-12 | 2024-05-17 | 四川至善唯新生物科技有限公司 | 一种治疗脊髓型肌肉萎缩的药物组合物及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022166849A1 (en) | 2022-08-11 |
| EP4288542A1 (en) | 2023-12-13 |
| JP2024506042A (ja) | 2024-02-08 |
| KR20230154026A (ko) | 2023-11-07 |
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