JP2023526310A - 導入遺伝子発現のｄｒｇ特異的低減のための組成物 - Google Patents

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Abstract

後根神経節（ＤＲＧ）における遺伝子産物の発現を特異的に抑制する遺伝子産物を、それを必要とする患者に送達するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が提供される。ｒＡＡＶは、中にベクターゲノムがパッケージングされたＡＡＶカプシドを含み、ベクターゲノムは、（ａ）ベクターゲノムを含む細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、遺伝子産物のコード配列と、（ｂ）少なくとも８つのｍｉＲ標的配列であって、各標的配列が、ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的であり、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列と、を含む。遺伝子産物を、それを必要とする患者に送達するための、記載のｒＡＡＶの方法及び使用も提供される。【選択図】

Description

インビボ遺伝子療法のために選択されるベクタープラットフォームは、霊長類由来のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。１９６０年代、遺伝子療法産物は、アデノウイルスの調製物から単離されたＡＡＶに由来した（Ｈｏｇｇａｎ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ５５：１４６７－１４７４，１９６６）。これらのベクターは安全であったが、不十分な形質導入のために、臨床では、多くのプログラムが失敗した。２１世紀への変わり目に、研究者らは、内因性ＡＡＶのファミリーを発見し、これは、ベクターとして好ましい安全プロファイルを保持しながら、はるかに高い形質導入効率を達成した（Ｇａｏ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７８：６３８１－６３８８，２００４）。
ＡＡＶベクターに対する宿主の有害な応答は、最小限であった。激しい急性炎症応答を引き起こす非ウイルスベクター及びアデノウイルスベクターとは対照的に（Ｒａｐｅｒ，Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ ８０：１４８－１５８，２００３、Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３：６９７－７０７，２００１）、ＡＡＶベクターは炎症促進性ではない。ＡＡＶベクターの投与後、細胞傷害性Ｔ細胞などのベクター形質導入細胞に対する破壊的な適応免疫応答は、最小限であった。動物及びヒトにおいて、ＡＡＶが、血清型、用量、投与経路、及び免疫抑制レジメンに応じて、特定の状況下では、カプシド又は導入遺伝子産物に対する耐性を誘導し得るという証拠がある（Ｇｅｒｎｏｕｘ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２８：３３８－３４９，２０１７、Ｍａｙｓ，Ｌ．Ｅ．＆Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ
１９：１６－２７，２０１１、Ｍａｎｎｏ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １２：３４２－３４７，２００６、Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１０：２３３４－２３４１，２００７）。しかしながら、ＡＡＶ遺伝子療法の臨床応用の最近の拡大を考慮すると、この技術の臨床的な影響を制限し得る毒性が見え始める。
最も重度の毒性は、ＣＮＳ及び筋骨格系を標的とする高用量ＡＡＶの静脈内投与後に発生した。非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における研究は、血小板減少症及び高トランスアミナーゼ血症の急性発症を示し、これは、場合によっては、出血及びショックの致死的症候群に発展した（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２６：６６４－６６８，２０１８、Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８）。また、ほとんどの高用量ＡＡＶ臨床試験において、肝臓酵素の急性上昇及び／又は血小板の低減も観察されている（ＡｖｅＸｉｓ，Ｉ．ＺＯＬＧＥＮＳＭＡ Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，２０１９、Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ ＳＧＴ－００１ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｕｐｄａｔｅ，２０１９、Ｐｆｉｚｅｒ，Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｒｅｓｅｎｔｓ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄａｔａ ｏｎ Ｐｈａｓｅ １ｂ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｔｕｄｙ ｆｏｒ Ｄｕｃｈｅｎｎｅ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ（ＤＭＤ），２０１９、Ｆｌａｎｉｇａｎ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １２６：Ｓ５４，２０１９）。稀ではあるが、重度の毒性は、貧血、腎不全、及び補体活性化によって特徴付けられた（Ｓｏｌｉｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１９、Ｐｆｉｚｅｒ，２０１９）。
より最近では、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に、又は高用量で血液中に、のいずれかでＡＡＶベクターを受けたＮＨＰ及びブタでは、後根神経節（ＤＲＧ）のニューロンが変性する問題が観察されている（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍ
ｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）。この神経毒性は、末梢神経における末梢軸索と、脊髄の後柱を通って上行する中枢軸索との両方の変性に関連する。
当該技術分野では、毒性に対してより感受性の高い細胞において遺伝子産物の発現を最小限に抑える遺伝子療法のための組成物及び方法が必要である。
一態様では、後根神経節（ＤＲＧ）における遺伝子産物の発現を特異的に抑制する遺伝子産物を、それを必要とする患者に送達するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が本明細書に提供される。ｒＡＡＶは、中にベクターゲノムがパッケージングされたＡＡＶカプシドを含み、ベクターゲノムは、（ａ）ベクターゲノムを含む細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、遺伝子産物のコード配列と、（ｂ）少なくとも８つのｍｉＲ標的配列であって、各標的配列が、ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的であり、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列と、を含む。特定の実施形態では、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ－１８３に特異的な、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの標的配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ－１８２に特異的な、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの標的配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ－１８３に特異的な少なくとも４つの標的配列、及び／又はｍｉＲ－１８２に特異的な少なくとも４つの標的配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ－１８３に特異的な４つの標的配列、及びｍｉＲ－１８２に特異的な４つの標的配列を含む。
一態様では、遺伝子産物の発現を後根神経節（ＤＲＧ）において特異的に抑制する遺伝子送達のための組成物であって、（ａ）ベクターゲノムを含む細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、遺伝子産物のコード配列と、（ｂ）少なくとも８つのｍｉＲ標的配列であって、各標的配列が、ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的であり、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列と、を含む核酸配列である発現カセットを含む、組成物が本明細書に提供される。特定の実施形態では、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ－１８２に特異的な、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの標的配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ－１８３に特異的な少なくとも４つの標的配列、及び／又はｍｉＲ－１８２に特異的な少なくとも４つの標的配列を含む。特定の実施形態では、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列は、ｍｉＲ－１８３に特異的な４つの標的配列、及びｍｉＲ－１８２に特異的な４つの標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えアデノウイルスであるウイルスベクターによって担持される。他の実施形態では、発現カセットは、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、又はキトサンベースの製剤である非ウイルスベクターによって担持される。
一態様では、ｒＡＡＶ又は発現カセットと、脳室内、髄腔内、大槽内、又は静脈内注入を介した送達に好適な製剤緩衝液とを含む、医薬組成物が、本明細書に提供される。
一態様では、患者におけるＤＲＧニューロンにおける遺伝子産物の発現を抑制するための方法が本明細書に提供され、方法は、ｒＡＡＶ、発現カセットを含む組成物、又は本明細書に記載の医薬組成物を送達することを含む。
一態様では、髄腔内又は全身性の遺伝子療法投与後の神経変性を調節し、かつ／又は二次的な背側脊髄軸索変性を減少させるための方法が本明細書に提供され、方法は、ｒＡＡＶ、発現カセットを含む組成物、又は本明細書に記載の医薬組成物を送達することを含む。
一態様では、ｒＡＡＶ、発現カセットを含む組成物、又は遺伝子送達で使用するための医薬組成物が本明細書に提供され、送達された遺伝子産物の発現は、患者のＤＲＧニューロンにおいて抑制される。
一態様では、ｒＡＡＶ、発現カセットを含む組成物、又は患者に導入遺伝子を送達するための医薬組成物の使用が提供され、送達された導入遺伝子の発現は、患者のＤＲＧニューロンにおいて抑制される。
本発明の他の態様及び利点は、以下の本発明の詳細な説明から、容易に明らかとなるであろう。
ＡＡＶのＩＣＭ投与後の、ＤＲＧ毒性及び二次軸索障害を示す。（図１Ａ）ＤＲＧは、感覚偽単極ニューロンの細胞体を含有し、これらは、末梢神経に位置する末梢軸索と、脊髄の上行性背側白質路に位置する中枢軸索とを通じて、感覚メッセージを末梢からＣＮＳに中継する。（図１Ｂ）軸索障害及びＤＲＧ神経変性。軸索障害（左上）は、空であるか（欠損軸索）、又はミエリンを消化するマクロファージ及び細胞デブリ（矢印）で満たされているかのいずれかである明らかな空胞として現れる。ＤＲＧ病変（右上及び左下）は、単核細胞の浸潤（丸）を伴うニューロン細胞体の変性（矢印）からなる。ニッスル小体の溶解（中心性色質融解）に起因する好酸球性（ピンク）細胞質は、変性ニューロンを特徴付ける。細胞型の増加は、衛星細胞の増殖（衛星病変）及び炎症性細胞浸潤に起因する。一部の単核細胞は、浸潤し、神経細胞体を貪食する（神経貪食）。右下の写真は、ＡＡＶ（この場合、ＧＦＰ）によってコードされる導入遺伝子の免疫染色を示す。変性変化及び単核細胞浸潤を示すニューロンは、最も強いタンパク質発現を示すニューロンである（ＩＨＣの濃褐色染色によって証明される）。（図１Ｃ）グレード１～グレード５のＤＲＧ病変及びグレード１～グレード４の背側脊髄軸索障害の例。重症度グレードは、以下のように定義される。１最小（１０％未満）、２軽度（１０～２５％）、３中等度（２５～５０％）、４顕著（５０～９５％）、及び５重度（９５％を超える）。グレード５は、脊髄では全く観察されなかった。矢印及び丸印は、ＤＲＧへの単核細胞の浸潤を伴う神経変性（左列）及び軸索障害（右列）を描写する。 ＤＲＧ特異的サイレンシングのための例示的なＡＡＶ発現カセット設計を示す。ｍｉＲＮＡ逆相補配列（ｍｉＲ標的又は標的配列）の４つの短いタンデムリピートを、終止コドンとポリ－Ａとの間に導入する。ＤＲＧニューロンにおいて、ｍｉＲ－１８３は、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を動員し、次いでｍＲＮＡ切断を通じたサイレンシングをもたらす。ｍｉＲ－１８３を発現しない他の細胞型では、３’ＵＴＲ領域からの影響なしに、翻訳及びタンパク質合成が起こる。 インビトロ及びマウスのＤＲＧニューロンにおける導入遺伝子の発現を特異的にサイレンシングするｍｉＲ－１８３標的配列を示す。（図３Ａ）ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１４５の標的を保有するＧＦＰ発現ＡＡＶプラスミド、並びに対照又はｍｉＲ－１８３の発現ベクターにより、２９３細胞を一過的に共トランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後にＧＦＰタンパク質レベルを検出し、ウェスタンブロッティングでそのレベルを定量化した。実験は、３重で実施した。エラーバーは、標準偏差を示す。（図３Ｂ）４×１０１２ｇｃの用量で、Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスＩＶにＡＡＶ９．ＣＢ７．ＧＦＰ対照ベクター又はＡＡＶ９．ＣＢ７．ＧＦＰ－ｍｉＲベクターを注入した。本発明者らは、ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１４５、及びｍｉＲ－１８２の３つのＤＲＧ濃縮ｍｉＲをスクリーニングした。注入から２週間後にＤＲＧを採取し、ＩＨＣを使用してＧＦＰについて染色した。ＩｍａｇｅＪ細胞計数ツールを使用して、総ＤＲＧニューロンに対するＧＦＰ発現ニューロンのパーセンテージをカウントした。ウィルコクソン検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（図３Ｃ）ここでは、パネル図３Ｂで定量化されたＤＲＧ由来のＧＦＰ免疫染色の代表的な写真を示す。（図３Ｄ）Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、ＩＶでＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＧＦＰ対照ベクター又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＧＦＰ－ｍｉＲ（ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－１８２）を注入した。注入の３週間後、蛍光顕微鏡を使用して直接ＧＦＰ観察のために、ＣＮＳ及び肝臓を回収した。ここでは、小脳、皮質、及び肝臓の代表的な写真を示す。 ＮＨＰへのＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰのＩＣＭ投与後、ＤＲＧにおけるＧＦＰ発現を特異的にサイレンシングし、毒性を減少させるｍｉＲ－１８３標的を示す。本発明者らは、成体アカゲザルにＩＣＭを、３．５×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＧＦＰ対照ベクター（ｎ＝２；それぞれ１匹の雄、１匹の雌、５～８歳）又はＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３（ｎ＝４、４匹の雌、５～６歳）で注入した。注入の２週間後、半数の動物を、ＧＦＰ発現分析のために犠牲にし、注入の２ヶ月後、残りの半数を、ＧＦＰ発現及び組織病理のために犠牲にした。（図４Ａ）ベクター投与の２週間後の、ＤＲＧ、脊髄運動ニューロン、小脳、皮質、心臓、及び肝臓のＧＦＰ免疫染色切片の代表的な写真。（図４Ｂ）ＮＨＰのＤＲＧ（感覚ニューロン）、脊髄（下位運動ニューロン）、小脳、及び皮質におけるＧＦＰ陽性細胞の定量化（ｎ＝２：ＡＡＶ．ＧＦＰ、ｎ＝４：ＡＡＶ．ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３）。ＤＲＧについて、動物当たり少なくとも２つの腰部ＤＲＧ切片を定量化し、動物当たり少なくとも３００個のニューロンを表した。各データポイントは、１つの異なる切片を表す。小脳及び皮質については、ＩｍａｇｅＪ細胞計数ツールを使用して、領域及び動物当たり最小５箇所の２０倍の倍率視野を定量化した。平均値として示されるデータ；エラーバーは、標準偏差を示す。ウィルコクソン検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（図４Ｃ）注入の２ヶ月後の組織病理では、背側脊髄軸索障害、末梢神経軸索障害（正中神経、腓骨神経及び橈骨神経）、並びにＤＲＧ神経変性及び単核浸潤の重症度グレードを示す。ベクター群に対して盲検化された委員会認定の獣医病理学者が、以下のように定義された重症度グレードを確立した：１最小（１０％未満）、２軽度（１０～２５％）、３中等度（２５～５０％）、４顕著（５０～９５％）、及び５重度（９５％超、観察されなかった）。各バーは、１匹の動物を表す。０は、病変の不在を表す。 ＮＨＰへのＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡのＩＣＭ投与後の、ＤＲＧにおけるｈＩＤＵＡの発現を特異的にサイレンシングするｍｉＲ－１８３標的を示す。本発明者らは、成体アカゲザルにＩＣＭを、１）１×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３、２匹の雌、１匹の雄、年齢２．５歳）、２）予防的ステロイド処置を伴う、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（－７日目～３０日目まで１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロン、続いて漸進的な漸減、ｎ＝３、３匹の雄、年齢２．５～３．５歳）、又は３）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ－－１８３（ｍｉＲ－１８３標的を含む）（ｎ＝３、２匹の雄、１匹の雌、年齢２．２５～５歳）のいずれかで注入した。動物は、注入の３ヶ月後、導入遺伝子の発現及び組織病理を分析するために犠牲にされた。代表的な写真は、抗ｈＩＤＵＡ抗体免疫蛍光（ＤＲＧ、最初の行）、抗ｈＩＤＵＡのＩＨＣ（下位運動ニューロン、小脳、皮質）、及び抗ＩＤＵＡのＩＳＨ（ＤＲＧ、最後の行）によるｈＩＤＵＡ発現の分析を示す。ｈＩＤＵＡのＩＳＨ：曝露時間は、ステロイドの有無にかかわらず、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡに対して２００ｍｓである。感覚ニューロンは、大量の導入遺伝子ｍＲＮＡの発現を示す。ＡＡＶ．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ－１８３に対する曝露時間は、１秒である。感覚ニューロンは、核及び細胞質において、低いＩＳＨシグナル（ｍＲＮＡ）を有する。ｍＲＮＡは、このより長い曝露時間で、ニューロンを取り囲む衛星細胞において見ることができる。 ｍｉＲ－１８３媒介性サイレンシングがＤＲＧニューロンに特異的であり、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡによりＩＣＭで処置されたＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性を、完全に阻止することを示す。（図６Ａ）ＮＨＰのＤＲＧ（感覚ニューロン）、脊髄（下位運動ニューロン）、小脳、及び皮質における、ｈＩＤＵＡ陽性細胞の定量化（群当たりｎ＝３）。動物ごとに、領域当たり最小５箇所の２０倍の倍率視野を定量化した。エラーバーは、標準偏差を表す。ウィルコクソン検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（図６Ｂ）注入３ヶ月後の組織病理スコアリング：背側軸索障害累積スコア（頸部、胸部、及び腰部セグメントからの重症度グレードの合計－最大可能スコアは１５）、ＤＲＧ累積スコア（頸部、胸部、及び腰部セグメントからの重症度グレードの合計－最大可能スコアは１５）、並びに中央値神経スコア（軸索障害及び線維症の重症度グレードの合計－最大可能スコアは１０）。ベクター群に対して盲検化された委員会認定の獣医病理学者が、以下のように定義された重症度グレードを確立した：１最小（１０％未満）、２軽度（１０～２５％）、３中等度（２５～５０％）、４顕著（５０～９５％）、及び５重度（９５％超、観察されなかった）。０は、病変の不在を表す。エラーバーは、標準偏差を表す。（図６Ｃ）ｈＩＤＵＡ導入遺伝子特異的プローブ、高倍率のＤＲＧ感覚ニューロン及び衛星細胞を使用するＩＳＨ、青色ＤＡＰＩでの核の対比染色による１秒の曝露時間。矢印：ＤＲＧ感覚ニューロン；矢じり：衛星細胞。 ＮＨＰのｈＩＤＵＡに対するＴ細胞及び抗体応答を示す。成体アカゲザルに、ＩＣＭで、１）１×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、２）予防的ステロイド処置（－７日目～３０日目まで１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロン、続いて漸進的な漸減）を伴う、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、又は３）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ－１８３（ｎ＝３）のいずれかを注入した。（図７Ａ～図７Ｃ）注射の９０日後に、ＰＢＭＣ、脾臓、肝臓、及び深部頸部リンパ節から単離されたリンパ球におけるインターフェロンガンマＥＬＩＳＰＯＴ応答。各動物は、異なるペプチドプールを表す３つの値を有する（ｈＩＤＵＡ配列全体をカバーする３つの重複ペプチドプール）。赤色は、陽性ＥＬＩＳＰＯＴ応答を示し、スポット形成単位が１０６個のリンパ球当たり５５超、及び未刺激時の培地陰性対照の３倍として定義される。（図７Ｄ）抗ｈＩＤＵＡ抗体のＥＬＩＳＡアッセイ、血清希釈は１：１，０００。 ＣＳＦにおけるサイトカイン／ケモカインの濃度を示す。試料は、ベクターの投与時点（０日目）、並びにベクターの投与後２４時間（ｈｏｕｒ）（２４時間（ｈ））、２１日（２１日目）及び３５日（３５日目）に回収された。ｓＣＤ１３７、エオタキシン、ｓＦａｓＬ、ＦＧＦ－２、フラクタルカイン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｅ／ＩＬ－２５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３α、パーフォリン、及びＴＮＦβといった分析物を含有するＭｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキットからの濃度を示すヒートマップ。 ＮＨＰの脳、脊髄、及びＤＲＧにおけるベクターの生体分布を示す。成体アカゲザルに、ＩＣＭで、１）１×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、２）予防的ステロイド処置（－７日目～３０日目まで１ｍｇ／ｋｇ／日のプレドニゾロン、続いて漸進的な漸減）を伴う、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ対照ベクター（ｎ＝３）、又は３）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ－１８３（ｎ＝３）のいずれかを注入した。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＭｉｎｉキットでＮＨＰ組織ＤＮＡを抽出した。Ｔａｑｍａｎ試薬及びベクターのｒＢＧポリアデニル化配列を標的とするプライマー／プローブを使用した、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって、ベクターゲノムを定量化した。結果は、二倍体ゲノム当たりのゲノムコピーで表現される。エラーバーは、標準偏差を表す。 ＡＡＶ－ＩＤＵＡ又はＡＡＶ－ＩＤＵＡ－４ＸｍｉＲ－１８３の送達後のＮＨＰにおけるｍｉＲ－１８３クラスター調節遺伝子発現の分析を伴うスポンジ効果に関する研究の結果を示す。図１０Ａは、後根神経節（ＤＲＧ）におけるｍｉＲ－１８３クラスター調節遺伝子ｍＲＮＡ定量化を提供する。図１０Ｂは、皮質の解析からの結果を提供する。ｍｉＲ－１８３クラスター調節遺伝子（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１又はＣＡＣＮＡ２Ｄ２）の発現の増加はなく、ＤＲＧ（高ｍｉＲ－１８３存在量）又は前頭皮質（低ｍｉＲ－１８３存在量）のいずれかにおけるＡＡＶ－ＩＤＵＡ又はＡＡＶ－ＩＤＵＡ－ｍｉＲ－１８３処置動物を比較する。 低用量（５×１０５）又は高用量（２．５×１０８）での、ｍｉＲ－１８３脱標的化配列の４つのコピーを伴うか、又は伴わない、ｅＧＦＰ導入遺伝子を担持するＡＡＶ９ベクターによる形質導入の結果を示す。ｍｉＲ－１８３を伴わない低用量及び高用量を、１００（低用量ＡＡＶ９－ｅＧＦＰの場合）又は１０（高用量ＡＡＶ９－ｅＧＦＰの場合）の感染多重度（ＭＯＩ）で、アデノウイルス５型（Ａｄ５）ヘルパー共トランスフェクションを行うか、又は行わずに試験した。全てのＤＲＧニューロンが形質導入され、毒性の目に見える徴候は観察されなかった。ＤＲＧニューロンにおいて、ＧＦＰ発現は観察されなかったが、線維芽細胞様細胞において、ある程度の発現が観察された。この所見は、４×ｍｉＲ－１８３標的発現カセットによるＧＦＰ転写の抑制を確認した。 ラットＤＲＧ細胞における「スポンジ効果」研究からの結果を示す。これらのデータは、細胞がＡＡＶ９－ｅＧＦＰ－１８３ベクターで形質導入されると、ラットＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ－１８３レベルが減少することを示す。ＡＡＶ９－ｅＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３は、ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３ ｍＲＮＡに対するターゲットエンゲージメントを示す。 ３つの既知のｍｉＲ－１８３調節転写産物の発現が決定された、ラットＤＲＧ細胞における「スポンジ効果」研究からの結果を示す。図１３Ａは、ＡＡＶ－ＧＦＰ又はＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３ベクター（又はモックベクター対照）の投与後のラットＤＲＧ細胞におけるＣＡＣＡＮＡ２Ｄ１の相対発現を示す。図１３Ｂは、ＡＡＶ－ＧＦＰ又はＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３ベクター（又はモックベクター対照）の投与後のラットＤＲＧ細胞におけるＣＡＣＡＮＡ２Ｄ２の相対発現を示す。図１３Ｃは、ＡＡＶ－ＧＦＰ又はＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３ベクター（又はモックベクター対照）の投与後のラットＤＲＧ細胞におけるＡＴＦ３の相対発現を示す。これらの３つのｍｉＲ－１８３調節転写産物のｍＲＮＡレベルに変化は観察されなかった。 神経解剖学的所見及び顕微鏡的所見を示す。ＤＲＧの神経細胞体（Ａ）は、脊髄の上行性（感覚）背側白質路（Ｃ）及び末梢神経系（Ｄ）の中に軸索を中心に向かって突出させる。（Ａ１～Ｄ１）ＤＲＧ病的状態に関連する顕微鏡的病変の神経解剖学的関係。ＤＲＧにおける神経細胞体変性（丸印、Ａ１）は、神経根の中心及び末梢の両方に延びる軸索周囲線維症（水平の矢印、Ｂ１）を伴うか、又は伴わない軸索変性（垂直の矢印、Ｂ１）を引き起こす。ＤＲＧ神経根における軸索変性は、軸索周囲線維症（水平の矢印、Ｄ１）を伴うか、又は伴わない、脊髄の上行性背側白質路（垂直の矢印、Ｃ１）及び末梢神経（垂直の矢印、Ｄ１）の中に中心に向かって延びる。（Ａ２～Ｄ２）正常なＤＲＧ、ＤＲＧ神経根、脊髄の背側白質及び末梢神経。（ヘマトキシリン及びエオシン；２０倍、スケールバー＝１００μｍ）。（Ｅ～Ｈ）ＤＲＧ病的状態の様々な段階の高倍率画像。（Ｅ）変性プロセスの初期に、神経細胞体は、ミクログリア細胞及び浸潤する単核細胞（神経貪食）とともに、増殖する衛星細胞のみを含み、比較的正常であるように見える（丸印）。（Ｆ）病変が進行するにつれて、神経細胞体は、消えかけている核を有するか、又は核が存在せず、細胞質高酸素血症を有する、小さな不規則形状若しくは鋭角を有する形状の細胞によって特徴付けられる、変性の証拠（垂直の矢印）を示す。（Ｇ）神経細胞体変性（丸印）は、衛星細胞、ミクログリア細胞及び単核細胞による完全な消失を引き起こす場合があり（星形）、これは、末期の変性と考えられる。（Ｈ）正常なＤＲＧ。（ヘマトキシリン及びエオシン；４０倍、スケールバー＝５０μｍ。） ＤＲＧ病的状態の重症度に対する研究の特徴の効果を示す。異なる（図１５Ａ）投与経路、（図１５Ｂ）ベクター用量、（図１５Ｃ）組織収集のための注射後の時間、及び（図１５Ｄ）ＧＬＰガイドラインに準拠した研究実施による、ＤＲＧ（黒色）及び背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）における平均病的状態スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。群間の比較は、各ＤＲＧ並びに脊髄領域（すなわち、頸部、胸部、腰部）内のウィルコクソンの順位和検定を使用して行われ、組み合わせたｐ値は、０．０５レベルで評価された統計学的有意性を有するフィッシャー法を使用して、全体的なＤＲＧ又は脊髄群間比較について算出された。＊は、群間比較の有意性を示し、＃は、ビヒクル対照群との比較のための有意性を示し（図１５Ａ）、又は（図１５Ｃ）１８０＋日時点との比較のための有意性を示す。＊、＃ｐ＜０．０５；＊＊、＃＃ｐ＜０．０１；＊＊＊、＃＃＃ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１。統計記号の色コード：ＤＲＧは黒、ＳＣは灰色。 ＤＲＧ病的状態の重症度に対する動物の特徴の効果を示す。（図１６Ａ）注射時の動物の年齢が異なる、及び（図１６Ｂ）動物の性別が異なる（アカゲザルのみ）、ＤＲＧ（黒色）及び背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）における平均病的状態スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。群間の比較は、各ＤＲＧ並びに脊髄領域（すなわち、頸部、胸部、腰部）内のウィルコクソンの順位和検定を使用して行われ、組み合わせたｐ値は、０．０５レベルで評価された統計学的有意性を有するフィッシャー法を使用して、全体的なＤＲＧ又は脊髄群間比較について算出された。図１６Ａについて、＊は、群間比較のための有意性を示し、＃は、乳幼児群との比較のための有意性を示す。＊、＃ｐ＜０．０５；＊＊、＃＃ｐ＜０．０１；＊＊＊、＃＃＃ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、＃＃＃＃ｐ＜０．０００１。統計記号の色コード：ＤＲＧは黒、ＳＣは灰色。 ＤＲＧ病的状態の重症度に対するベクターの特徴の効果を示す。異なる（図１７Ａ）カプシド、（図１７Ｂ）プロモーター、及び（図１７Ｃ）導入遺伝子、並びに非分泌型導入遺伝子に対する分泌型導入遺伝子（図１７Ｄ）による、ＤＲＧ（黒色）及び背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）における平均的状態スコア。導入遺伝子は、ＳＣ病的状態の重症度に基づいて、１～２０に並べられた。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。（図１７Ａ、図１７Ｂ、及び図１７Ｄ）群間の比較は、各ＤＲＧ並びに脊髄領域（すなわち、頸部、胸部、腰部）内のウィルコクソンの順位和検定を使用して行われ、組み合わせたｐ値は、０．０５レベルで評価された統計学的有意性を有するフィッシャー法を使用して、全体的なＤＲＧ又は脊髄群間比較について算出された。＊は、群間比較のための有意性を示す：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。統計記号の色コード：ＤＲＧは黒、ＳＣは灰色。一部の群では小さなｎのため、導入遺伝子比較のための統計分析は実施されなかった。 重症度グレードの分布を伴う領域的病的状態スコアを示す。平均の標準誤差（赤色の点及び棒）並びに領域ごとの重症度グレードの分布（積み上げ棒グラフ（ｓｔａｃｋｅｄ ｃｏｌｕｍｎ））を伴う、病的状態スコアの平均パーセンテージの割合。表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。平均値間の比較は、ＴＲＧとＤＲＧ、並びにＤＲＧとＳＣのそれぞれの領域（すなわち、頸部、胸部、腰部）間のウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。統計学的有意性は、０．０５レベルで評価した。＊は、三叉神経の神経節（ＴＲＧ）とＤＲＧとの比較の有意性を示し、＃は、ＤＲＧとＳＣの領域ごとの比較のための有意性を示す。＊＊ｐ＜０．０１；＃＃＃＃ｐ＜０．０００１。 末梢神経の病的状態を示す。平均の標準誤差（赤色の点、及び棒）並びに末梢神経ごとの重症度グレードの分布（積み上げ棒グラフ）を伴う、病的状態スコアの平均パーセンテージの割合。表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。一部の末梢神経は大部分の研究で収集されなかったため、統計分析は実施されなかった。 脊髄領域ごとに分けられた、ＤＲＧ病的状態の重症度に対する研究の特徴の効果を示す。異なる（図２０Ａ）投与経路、（図２０Ｂ）ベクター用量、（図２０Ｃ）組織収集のための注射後の時間、及び（図２０Ｄ）ＧＬＰガイドラインに準拠した研究実施による、ＤＲＧ（黒色）及び背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）領域における平均病的状態スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果；表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。Ｃ＝頸部、Ｔ＝胸部、Ｌ＝腰部領域。 脊髄領域ごとに分けられた、ＤＲＧ病的状態の重症度に対する動物の特徴の効果を示す。（図２１Ａ）注射時の動物の年齢が異なる、及び（図２１Ｂ）動物の性別が異なる（アカゲザルのみ）、ＤＲＧ（黒色）及び背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）領域における平均病的状態スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果；表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。Ｃ＝頸部、Ｔ＝胸部、Ｌ＝腰部領域。 脊髄領域ごとに分けられた、ＤＲＧ病的状態の重症度に対するベクターの特徴の効果を示す。異なる（図２２Ａ）カプシド、（図２２Ｂ）プロモーター、及び（図２２Ｃ）導入遺伝子による、ＤＲＧ（黒色）及び背側脊髄（ＳＣ）軸索（灰色）領域における平均病的状態スコア。導入遺伝子は、ＳＣ病的状態の重症度に基づいて、１～２０に並べられた。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。Ｃ＝頸部、Ｔ＝胸部、Ｌ＝腰部領域。 脊髄領域ごとのＤＲＧ病的状態の重症度に対する、分泌型対非分泌型導入遺伝子の効果を示す。分泌型又は非分泌型導入遺伝子を有するＤＲＧ（黒色）及び背側脊髄軸索（灰色）領域における平均病的状態スコア。平均の標準誤差を伴う平均結果、表は、各群における動物の数（ｎ）及びスコアリングされた組織学的切片の数（カウント）を示す。Ｃ＝頸部、Ｔ＝胸部、Ｌ＝腰部領域。 脳皮質におけるＧＦＰ発現を示す。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、１×１０１２ＧＣの用量、群当たりｎ＝４で、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＧＦＰ対照ベクター又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＧＦＰ－ｍｉＲ標的ベクターをＩＶ注射した。 ｍｉＲ－１８３、ｍｉＲ－１８２、又はｍｉＲ－１４５標的配列を有するＡＡＶ９．ＧＦＰベクターの投与後のＧＦＰ発現を示す。Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに、４×１０１２ＧＣのＧＦＰをコードするベクターを、群当たりｎ＝３～４で、ｍｉＲ－１８３標的のタンデムリピート（４回リピート）（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３．ｒＢＧ）、ｍｉＲ－１８２標的（４回リピート）（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１４５．ｒＢＧ）、ｍｉＲ－１４５標的（４回リピート）（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８２．ｒＢＧ）、又はｍｉＲ標的対照なし（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｒＢＧ）をＩＶ注射した。ｍｉＲ－１４５標的で修飾されたベクターは、ｍｉＲ標的配列を有しない対照ベクターと比較して、心臓組織におけるＧＦＰ発現の減少を示した。４×ｍｉＲ－１８３標的配列で修飾されたベクターは、ｍｉＲ標的及びｍｉＲ－１４５標的ベクターを有しないベクターと比較して、心臓組織におけるＧＦＰ発現の増加を示した。ｍｉＲ－１８３標的配列を有するベクターは、ｍｉＲ－１４５標的配列を有するベクター及びｍｉＲ標的配列を有しないベクターと比較して、脳皮質及び脳幹におけるＧＦＰ発現の増加を示した。 図２５Ａ～図２５Ｃに示す結果からのＧＦＰ直接蛍光強度の定量化を示す。一元配置分散分析、次いで、テューキーの多重比較検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。 ＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－１８２、及びｍｉＲ－１８３の発現を示す。発現は、ｍｉＲ－９６に対して示される。 Ｎｅｕｒｏ２ａ（Ｎ２Ａ）細胞における発現レベルと比較して、ＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－１８２及びｍｉＲ－１８３の発現を示す。 ＨＣＴ１１６、ラットＤＲＧ、アカゲザル（ＲＨ）－ＤＲＧ、及びヒト（ＨＵ）－ＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－１８２、及びｍｉＲ－１８３の相対的発現レベルを示す。発現レベルは、ＨＣＴ１１６細胞におけるｍｉＲ－９６と比較して示される。 ＡＡ９．ＧＦＰベクターでの形質導入後のＨＣＴ１１６細胞におけるＧＦＰ発現の評価を示し、ｍｉＲ－１８３標的配列（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８２（１×～８×）．ｒＢＧ）、４×ｍｉＲ－１８２標的配列（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８２（４×）．ｒＢＧ）、又は４×ｍｉＲ－１８２標的配列＋４×ｍｉＲ－１８３標的配列（ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８２（４×）．ｍｉＲ－１８３（４×）．ｒＢＧ）の増加した数を有する（１×～８×）。図２７Ａは蛍光顕微鏡法を示し、図２７Ｂは形質導入された細胞のフローサイトメトリー分析を示す。図２７Ｃ及び図２７Ｄは、図２７Ｂに提供されるように、フローサイトメトリー分析からの結果の定量化を示す。 導入遺伝子図発現に対するｍｉＲ標的配列の効果を評価するためのマウス研究の結果を示す。ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ（ｍｉＲ標的配列なし）、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３（４×）、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８２（４×）、及びＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８２－ｍｉＲ－１８３（４×＋４×）ベクターに、ＩＶ（４×１０１２ＧＣ）又はＩＣＶ（１×１０１１ＧＣ）を投与した。投与の４週間後に、マウスを犠牲にした。（図２８Ａ及び図２８Ｂ）ＤＲＧにおける導入遺伝子（ＧＦＰ）発現のためのＩＨＣ及び所見の定量化。（図２８Ｃ～図２８Ｅ）脳及び脊髄における導入遺伝子（ＧＦＰ）発現のためのＩＨＣ及び所見の定量化。（図２８Ｆ～図２８Ｊ）肝臓、腎臓、心臓、及び大腿四頭筋における導入遺伝子（ＧＦＰ）発現のためのＩＨＣ、並びに所見の定量化。 導入遺伝子発現のｍｉＲ標的配列の効果を評価するためのＮＨＰ研究の結果を示す。ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ（ｍｉＲ標的配列なし）、ＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８２（４×）、及びＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８２－ｍｉＲ－１８３（４×＋４×）ベクターに、ＩＣＭ（３ｘ１０１３ＧＣ）を投与した。投与の５週間後に、動物を犠牲にした。（図２９Ａ）頸部、胸部、及び腰部領域からのＤＲＧ（図２９Ａ）及び脊髄（図２９Ｂ）における導入遺伝子（ＧＦＰ）発現のためのＩＨＣ。（図２９Ｃ及び図２９Ｄ）ＤＲＧ毒性／二次軸索障害のスコアリング。ｍｉＲ標的配列を有するベクターは、ＧＦＰ発現の同様のサイレンシング及び病的状態の低減を示した。 複数の研究にわたる、対照動物（ナイーブ及びＩＣＭビヒクル投与）におけるバックグラウンドＤＲＧ／ＴＲＧ（図３０Ａ）、脊髄（図３０Ｂ）、及び末梢神経（図３０Ｃ）所見の発生率及び重症度を示す。 複数の研究にわたって、既存対照動物（ナイーブ及びＩＣＭビヒクル投与）におけるバックグラウンドＤＲＧ毒性の発生率及び重症度を示す。
本明細書に提供される組成物及び方法は、ｍｉＲＮＡ標的配列の使用を通じてＤＲＧニューロンにおける導入遺伝子の発現を抑制するための遺伝子送達の療法に有用である。本明細書で使用される場合、「抑制」という用語は、導入遺伝子発現の部分的な低減、又は完全な消滅、又はサイレンシングを含む。導入遺伝子発現は、選択された導入遺伝子に好適なアッセイを使用して評価されてもよい。提供される組成物及び方法は、神経変性、二次背側脊髄軸索変性、及び／又は単核細胞浸潤によって特徴付けられるＤＲＧの毒性を減少させる。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、遺伝子産物コード配列の３’側の非翻訳領域（ＵＴＲ）に、ｍｉＲＮＡ標的配列を含む。本明細書に提供されるように、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、各標的配列は、独立して選択され、ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的である。特定の実施形態では、発現カセットは、４つの独立して選択されたｍｉＲ－１８３標的配列と、４つの独立して選択されたｍｉＲ－１８２標的配列とを含み、ｍｉＲ標的配列は、コード配列の３’末端に作動可能に連結される。他の実施形態では、発現カセットは、８つのｍｉＲ－１８３標的配列又は８つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。本明細書に記載されるように、ｍｉＲ配列の他の組み合わせを選択してもよい
。好適には、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。特定の実施形態では、３つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。特定の実施形態では、８個のｍｉＲＮＡ配列がタンデムで提供され、任意選択的に、スペーサー配列によって分離される。様々な送達システムは、対象（例えば、ヒト患者）に発現カセットを送達するために使用され得る。かかる送達系は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、又は非ベクターベースの系（例えば、リポソーム、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡなど）であってもよい。これらの送達系は、中枢神経系（ＣＮＳ）、末梢神経系（ＰＮＳ）、又は静脈内若しくは代替の送達経路に直接送達するために使用され得る。他の実施形態では、これらの組成物及び方法は、遺伝子療法ベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の全身送達のために使用される。特定の実施形態では、これらの組成物及び方法は、高用量のベクター（例えば、ｒＡＡＶ）が送達される場合に有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物及び方法は、低減された用量、低減された長さ、及び／又は低減された数の免疫調節物質が、遺伝子療法ベクター（例えば、ｒＡＡＶ媒介性遺伝子療法）と同時投与されることを可能にする。特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物及び方法は、ウイルスベクター（例えば、ｒＡＡＶ）の投与前、投与時、及び／又は投与後に、免疫抑制剤又は免疫調節療法を同時投与する必要性を排除する。
「５’ＵＴＲ」は、遺伝子産物のコード配列の開始コドンの上流にある。５’ＵＴＲは、一般に、３’ＵＴＲよりも短い。一般に、５’ＵＴＲは、約３ヌクレオチド長～約２００ヌクレオチド長であるが、任意選択的に、より長くてもよい。
「３’ＵＴＲ」は、遺伝子産物のコード配列の下流にあり、一般に、５’ＵＴＲよりも長い。特定の実施形態では、３’ＵＴＲは、約２００ヌクレオチド長～約８００ヌクレオチド長であるが、任意選択的に、より長くても、又はより短くてもよい。
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ」又は「ｍｉＲ」は、マイクロＲＮＡを指し、それは、ｍＲＮＡを調節し、タンパク質へのその翻訳を低減する小さな非コードＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ヌクレオチドの領域である「シード配列」を含み、相補的な塩基対形成によってｍＲＮＡに特異的に結合し、ｍＲＮＡの破壊又はサイレンシングをもたらす。特定の実施形態では、シード配列は、成熟ｍｉＲＮＡに位置し（５’から３’へ）、一般に、ｍｉＲＮＡの２～７位又は２～８位（センス（＋）鎖の５’末端から）に位置するが、鎖長よりも長くてもよい。特定の実施形態では、シード配列の長さは、ｍｉＲＮＡ配列の長さの約３０％以上であり、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド長、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド～２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、又は約２６ヌクレオチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」又は「ｍｉＲ標的配列」は、ＤＮＡプラス鎖上に位置する配列（５’から３’へ）であり、ｍｉＲＮＡシード配列を含むｍｉＲＮＡ配列に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡ標的配列は、コードされた導入遺伝子産物の非翻訳領域に対して外因性であり、導入遺伝子発現の抑制が所望される細胞で、ｍｉＲＮＡによって特異的に標的化されるように設計される。「ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列」という用語は、ｍｉＲ－１８３、－９６及び－１８２（Ｄａｍｂａｌ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３：７１７３－７１８８，２０１５によって記載されている、参照により本明細書に援用されるもの）を含む、ｍｉＲ－１８３クラスター（代替的にファミリーと称される）のうちの１つ以上のメンバーに応答する標的配列を指す。理論に束縛されることを意図するものではないが、導入遺伝子（遺伝子産物をコードする）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡを含
有する発現カセットが送達される細胞型に存在し、その結果、３’ＵＴＲ ｍｉＲＮＡの標的配列に対するｍｉＲＮＡの特異的結合が、ｍＲＮＡのサイレンシング及び切断を引き起こし、それによって、ｍｉＲＮＡを発現する細胞においてのみ、導入遺伝子の発現が低減又は排除される。
典型的には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長、７ヌクレオチド～２８ヌクレオチド、８ヌクレオチド～１８ヌクレオチド長、約１２～約２８ヌクレオチド長、約２０～約２６ヌクレオチド、約２２ヌクレオチド、約２４ヌクレオチド、又は約２６ヌクレオチドであり、ｍｉＲＮＡシード配列に相補的である少なくとも１つの連続領域（例えば、７又は８ヌクレオチド）を含有する。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と正確な相補性（１００％）を有する配列、又はｍｉＲＮＡシード配列といくつかのミスマッチを含む部分的な相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である少なくとも７～８のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲＮＡシード配列と１００％相補的である配列からなる。特定の実施形態では、標的配列は、シード配列と１００％相補的である配列の複数コピー（例えば、２又は３コピー）を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、標的配列の残部は、ｍｉＲＮＡに対して少なくとも約８０％～約９９％の相補性を有する。特定の実施形態では、ＤＮＡプラス鎖を含む発現カセットでは、ｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡの逆相補である。
特定の実施形態では、操作された発現カセット又はベクターゲノムが、本明細書に提供され、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を抑制するために、並びに／又はＤＲＧ毒性及び／若しくは軸索障害を低減若しくは排除するために、導入遺伝子に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３ファミリー又はクラスターのうちの１つ以上のメンバーを対象とする少なくとも１つのコピーのｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、操作された発現カセット又はベクターゲノムは、複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含み、ｍｉＲＮＡ標的配列の数が、ＤＲＧ毒性及び／又は軸索障害を低減及び／又は排除するために、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を低減又は最小化するのに十分であるようにする。発現カセット又はベクターゲノムは、任意の好適な担体系、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターを介して、任意の経路を介して送達され得るが、髄腔内投与に特に有用である。
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への、より詳細には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔空間内への注入を介した、投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺の手段によって、クモ膜下腔全体に拡散させるために導入され得る。別の例では、大槽内への注射であってもよい。
本明細書で使用される場合、「槽内送達」又は「槽内投与」という用語は、大槽小脳延髄（ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ ｃｅｒｅｂｅｌｌｏｍｅｄｕｌａｒｉｓ）の脳脊髄液内への直接的な投与経路、より詳細には、後頭下穿刺を介した、又は大槽内への直接的な注入による、又は永久的に配置されたチューブを介した、投与経路を指す。
意外にも、ＤＲＧにおける発現を抑制するための本明細書に記載のｍｉＲ－１８３標的配列を含む組成物は、これらに限定されないが、ニューロン（例えば、錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘細胞、及び介在神経細胞を含む）、又はグリア細胞（例えば、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、及び上衣細胞を含む）を含む、中枢神経系内の１つ以上の異なる細胞型（ＤＲＧ以外）において増強された導入遺伝子発
現を提供することが観察されている。この観察は、当初、髄腔内送達経路に従って行われたが、この発現増強効果は、ＣＮＳ送達経路に限定されない。発現の増強は、静脈内送達後にも観察されており、他の経路、例えば、静脈内（例えば、特に高用量送達）、筋肉内（特に高用量送達）、又は他の全身送達経路を使用して達成されてもよい。特定の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ－１８３標的配列を含む組成物は、心臓組織における導入遺伝子発現の増強を提供する（図２４Ａを参照）。例えば、本発明者らは、対照ベクターと比較して、ｍｉｒ－１８３標的含有ベクターを用いたＤＲＧにおけるＧＦＰ発現の統計学的に有意な低減を観察したが、一方で、発現は、腰部運動ニューロン及び小脳で増強された。この強化された発現はまた、ＤＲＧ並びに８つの他の領域にわたる病的状態の著しい低減、すなわち、頸部、胸部、及び腰部脊椎における背側脊髄軸索障害、並びに正中神経、腓骨神経及び橈骨神経の軸索障害と関連付けられた。
特定の実施形態では、導入遺伝子のＣＮＳ発現の増強を回避するために（ＤＲＧ発現を抑制しながら）、ＣＮＳを標的としない導入遺伝子を含む発現カセット用のｍｉＲ－１８２標的配列及び／又はｍｉＲ－９６標的配列を選択したい場合がある。例えば、骨格筋又は肝臓への送達のための導入遺伝子を含む発現カセットは、ＣＮＳ発現のいかなる増強も避けたいが、必要とされ得る高用量と関連し得るＤＲＧ毒性及び／又は軸索障害を防止し得る。
特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、
Figure 2023526310000001
（配列番号１）を含むｍｉＲ－１８３標的配列を含む（ｍｉＲ－１８３シード配列に相補的な配列には、下線が引かれている）。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８３シード配列に１００％相補的な配列の２コピー以上（例えば、２又は３コピー）を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８３シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１に部分的に相補的な配列を含有し、したがって、配列番号１にアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号１にアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、１００％相補性の領域を含み、また、ｍｉＲ－１８３標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８３シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８３と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３標的配列を含み、切断された配列番号１、すなわち、配列番号１の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオチドを欠く配列を含む。発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、各標的配列は、独立して選択され、ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的である。特定の実施形態では、発現カセットは、４つの独立して選択されたｍｉＲ－１８３標的配列と、４つの独立して選択されたｍｉＲ－１８２標的配列とを含み、ｍｉＲ標的配列は、コード配列の３’末端に作動可能に連結される。他の実施形態では、発現カセットは、８つのｍｉＲ－１８３標的配列又は８つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。本明細書に記載されるように、ｍｉＲ配列の他の組み合わせを選択してもよい。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子及び１つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。なお他の
実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、又は少なくとも７つのｍｉＲ－１８３若しくはｍｉＲ－１８２標的配列を含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、８つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。
導入遺伝子及びｍｉＲ－１８２を含む組成物は、後根神経節毒性を最小化又は排除し、及び／又は軸索障害を防止することが観察されている。しかしながら、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む発現カセット又はベクターゲノムは、この目的には有効であるが、意外にもｍｉＲ－１８３標的配列を有した複合体で見出されたように、ＣＮＳ発現を増強することが観察されていない。したがって、これらの組成物は、遺伝子がＣＮＳ以外を標的とすることが望ましい場合がある。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムが、本明細書に提供され、１つ以上のｍｉＲ－１８３ファミリーの標的配列を含み、導入遺伝子を欠く（すなわち、ｍｉＲ－１８３ファミリーの標的配列（複数可）が、異種遺伝子産物をコードする配列に作動可能に連結されていない）。
本明細書に提供されるように、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列を含む。特定の実施形態では、各標的配列は、独立して選択され、ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的である。特定の実施形態では、発現カセットは、４つの独立して選択されたｍｉＲ－１８３標的配列と、４つの独立して選択されたｍｉＲ－１８２標的配列とを含み、ｍｉＲ標的配列は、コード配列の３’末端に作動可能に連結される。他の実施形態では、発現カセットは、８つのｍｉＲ－１８３標的配列又は８つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。本明細書に記載されるように、ｍｉＲ配列の他の組み合わせを選択してもよい。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２の標的配列である少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含む。特定の実施形態では、ベクターゲノム又は発現カセットは、ｍｉＲ－１８２シード配列に１００％相補的である配列の２コピー以上（例えば、２又は３コピー）を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、約７ヌクレオチド～約２８ヌクレオチド長であり、ｍｉＲ－１８２シード配列に少なくとも１００％相補的である少なくとも１つの領域を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、配列番号３に部分的に相補的な配列を含有し、したがって、配列番号３とアラインメントさせた場合、１つ以上のミスマッチがある。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３標的配列は、配列番号３とアラインメントさせた場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のミスマッチを有する配列を含み、ミスマッチは非連続であり得る。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列は、１００％相補的な領域を含み、また、ｍｉＲ－１８２標的配列の長さの少なくとも３０％を含む。特定の実施形態では、１００％相補性の領域は、ｍｉＲ－１８２シード配列と１００％相補性を有する配列を含む。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８２標的配列の残部は、ｍｉＲ－１８２と少なくとも約８０％～約９９％相補性を有する。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８２標的配列を含み、切断された配列番号３すなわち、配列番号３の５’末端若しくは３’末端のいずれか又は両方で、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオチドを欠く配列を含む。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８２標的配列とを含む。更に他の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列を含む。
特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列を有し、連続的であり、スペーサーによって分離されていない。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上は、スペーサーによって分離されている。特定の実施形態では、スペーサーは、約１～約１２ヌクレオチド、又は約２～約１０ヌ
クレオチド長、又は約３～約１０ヌクレオチド、約４～約６ヌクレオチド長、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１ヌクレオチド長の非コード配列である。任意選択的に、単一の発現カセットは、３つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含んでもよく、任意選択的に、それらの間に異なるスペーサー配列を有する。特定の実施形態では、１つ以上のスペーサーは、独立して、（ｉ）ＧＧＡＴ（配列番号５）、（ｉｉ）ＣＡＣＧＴＧ（配列番号６）、又は（ｉｉｉ）ＧＣＡＴＧＣ（配列番号７）から選択される。特定の実施形態では、スペーサーは、第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’及び／又は最後のｍｉＲＮＡ標的配列の５’に位置する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列間のスペーサーは同じである。
特定の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子と、１つのｍｉＲ－１８３標的配列と、１つ以上の異なるｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。特定の実施形態では、発現カセットは、ｍｉＲ－９６標的配列：ｍＲＮＡ及びＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）ＡＧＣＡＡＡＡＡＴＧＴＧＣＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号２）、ｍｉＲ－１８２標的配列：ｍＲＮＡ及びＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）：及び／又はＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含む。
ｍｉＲ－１４５は、文献では、脳に関連しているが、これまでの研究では、ｍｉＲ－１４５標的配列は、後根神経節における導入遺伝子の発現の低減には効果がないことが示されている。ｍｉＲ－１４５標的配列：ｍＲＮＡ及びＤＮＡプラス鎖（５’から３’へ）：ＡＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号４）。
本明細書に提供されるように、発現カセット及びベクターゲノムは、導入遺伝子を含み、標的細胞における導入遺伝子産物の発現を導く調節配列に作動可能に連結されるか、又はその制御下にある。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、導入遺伝子を含み、本明細書に提供される１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、複数のｍｉＲＮＡ標的配列を含むように設計される。ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子のＵＴＲに組み込まれる（すなわち、遺伝子のオープンリーディングフレームの３’又は下流）。
「導入遺伝子」という用語は、標的細胞に挿入される外因性供給源からのＤＮＡ配列を指すように本明細書で使用される。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、又は他の産物をコードする導入遺伝子に隣接するベクター配列に対して異種のヌクレオチド配列である。核酸コード配列は、標的細胞中で産生される遺伝子の導入遺伝子転写、翻訳、及び／又は発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に連結される。異種核酸配列（導入遺伝子）は、任意の生物に由来し得る。ｒＡＡＶは、１つ以上の導入遺伝子を含み得る。特定の実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子編集酵素（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ酵素又はメガヌクレアーゼ）である。更なる実施形態では、導入遺伝子は、標的細胞ゲノムに導入される（「ノックインされる」）ヌクレオチド配列である。発現カセット又はベクターゲノムは、そのような導入遺伝子を単独で、又は遺伝子編集酵素をコードする配列と組み合わせて含有し得る。
「タンデムリピート」という用語は、２つ以上の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の存在を指すように本明細書で使用される。これらのｍｉＲＮＡ標的配列は、連続的であり得、すなわち、一方の３’末端が、介在配列なしで、次の配列の５’末端のすぐ上流にあるように、又はその逆で、互いの後に直接的に配置され得る。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの２つ以上が、短いスペーサー配列によって分離されている。
本明細書で使用される場合、「スペーサー」としては、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチド長の任意の選択された核酸配列であり、２つ以上
の連続するｍｉＲＮＡ標的配列の間に位置する。特定の実施形態では、スペーサーは、１～８ヌクレオチド長、２～７ヌクレオチド長、３～６ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、４～９ヌクレオチド、３～７ヌクレオチド、又はより長い数値である。好適には、スペーサーは、非コード配列である。特定の実施形態では、スペーサーは、４つの（４）ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＡＴである。特定の実施形態では、スペーサーは、６つの（６）ヌクレオチドである。特定の実施形態では、スペーサーは、ＣＡＣＧＴＧ又はＧＣＡＴＧＣである。
特定の実施形態では、タンデムリピートは、同じｍｉＲＮＡ標的配列の少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又はそれ以上を含有する。特定の実施形態では、タンデムリピートは、異なるものについて同じであり得る最大８個のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。特定の実施形態では、発現カセットは、８つのｍｉＲ－１８３標的配列、例えば、配列番号２７のベクターゲノムで提供されるように、スペーサー配列によって分離された７つの同一の標的配列、又は配列番号２８のベクターゲノムで提供されるように、スペーサー配列によって分離された８つの同一の標的配列を含有する。特定の実施形態では、タンデムリピートは、少なくとも２つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、少なくとも３つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列、又は少なくとも４つの異なるｍｉＲＮＡ標的配列などを含有する。特定の実施形態では、タンデムリピートは、２つ又は３つの同じｍｉＲＮＡ標的配列、及び異なる第４のｍｉＲＮＡ標的配列を含有してもよい。
特定の実施形態では、発現カセットには、少なくとも２つの異なるセットのタンデムリピートが存在し得る。例えば、３’ＵＴＲは、導入遺伝子のすぐ下流のタンデム反復と、ＵＴＲ配列と、ＵＴＲの３’末端に近接する２つ以上のタンデム反復と、を含み得る。別の例では、５’ＵＴＲは、１つ、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含み得る。別の例では、３’は、タンデム反復を含有し得、５’ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的配列を含有し得る。
特定の実施形態では、発現カセットは、２つ、３つ、４つ、又はそれより多いタンデムリピートを含有し、導入遺伝子の終止コドンの約０～２０ヌクレオチド以内に開始する。他の実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子の終止コドンから少なくとも１００～約４０００のヌクレオチドでｍｉＲＮＡタンデム反復を含む。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、他の構成要素又は方法ステップを含むことを意味する用語である。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、関連する実施形態は、他の構成要素又は方法ステップを除外する「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ
ｏｆ）」という用語、及び実施形態又は発明の性質を実質的に変化させる任意の構成要素又は方法ステップを除外する「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を使用する記述を含むことを理解されたい。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、様々な状況下では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を使用して記載されることも理解されるべきである。
「ａ」又は「ａｎ」という用語は、１つ以上を指し、例えば、「ベクター（ａ ｖｅｃｔｏｒ）」は、１つ以上のベクターを表すことを留意されたい。したがって、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、及び「少なくとも１つ（ａｔ
ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、別途指定されない限
り、与えられた参照からプラス又はマイナス１０％の可変性を意味する。
１．発現カセット
本明細書に記載される「発現カセット」は、標的細胞におけるその発現を誘導する調節配列及びＵＴＲのｍｉＲＮＡ標的配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列を含む。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくない及び／又は導入遺伝子の発現レベルの低減が所望される細胞に存在するｍｉＲＮＡによって、特異的に認識されるように設計される。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、後根神経節における導入遺伝子の発現を特異的に低減する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ標的配列は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、及び／又は３’ＵＴＲ及び５’ＵＴＲの両方に位置する。本明細書に見出されるｍｉＲＮＡ標的配列の考察は、参照により本明細書に援用される。
一実施形態では、発現カセットは、導入遺伝子産物のＤＲＧ発現を低減又は排除しながら、ヒト対象における発現のために設計される。一実施形態では、発現カセットは、脳脊髄液及び脳を含む中枢神経系（ＣＮＳ）における発現のために設計される。特定の実施形態では、発現カセット又はベクターゲノムは、神経細胞（錐体細胞、プルキンエ細胞、顆粒細胞、紡錘細胞、及び介在神経細胞など）並びにグリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、及び上衣細胞など）を含む、ＣＮＳに存在する１つ以上の細胞型（後根神経節を除く）における導入遺伝子の発現又は増強された発現のために設計される。特定の実施形態では、導入遺伝子の発現の増強は、１つ以上の細胞型で達成され、ＣＮＳの別の細胞型における導入遺伝子の発現がほとんど又は全くない。特定の実施形態では、発現カセットは、ＣＮＳの細胞以外の細胞での発現に有用である。
本明細書で使用される場合、「発現」又は「遺伝子発現」という用語は、遺伝子からの情報が、機能的な遺伝子産物の合成に使用されるプロセスを指す。遺伝子産物は、タンパク質、ペプチド、又は核酸ポリマー（ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＰＮＡなど）であり得る。
本明細書で使用される場合、「調節配列」又は「発現制御配列」という用語は、イニシエーター配列、エンハンサー配列、及びプロモーター配列などの核酸配列を指し、それらが操作可能に連結されるタンパク質コード核酸配列の転写を誘導するか、抑制するか、さもなければ制御する。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸配列に連続している発現制御配列、及び／又はその転写及び発現をトランスで若しくは離れて作用する両方の発現制御配列を指す。
核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される「外因性」という用語は、核酸又はタンパク質が、染色体又は宿主細胞に存在する位置では、天然に発生しないことを意味する。外因性核酸配列はまた、同じ宿主細胞又は対象に由来し、それらに挿入されるが、非天然状態（例えば、異なるコピー数、又は異なる調節エレメントの制御下）で存在する配列を指す。
核酸配列又はタンパク質を説明するために使用される場合、「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、それが発現される宿主細胞若しくは対象とは異なる生物又は同じ生物の異なる種に由来したことを意味する。「異種」という用語は、タンパク質、又はプラスミド、発現カセット、若しくはベクターにおける核酸と関連して使用される場合、タンパク質又は核酸は、当該タンパク質又は核酸が天然には互いに同じ関係で認められない別の配列若しくはサブ配列で存在することを示す。
一実施形態では、調節配列は、プロモーターを含む。一実施形態では、プロモーターは、ニワトリβ－アクチンプロモーターである。更なる実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー及びニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＢ７プロモーター）のハイブリッドである。別の実施形態では、好適なプロモーターとしては、限定されないが、伸長因子１アルファ（ＥＦ１アルファ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ ＤＷ ｅｔ ａｌ，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １ ａｌｐｈａ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ａｓ ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ．１９９０ Ｊｕｌ １６；９１（２）：２１７－２３を参照されたい）、シナプシン１プロモーター（例えば、Ｋｕｇｌｅｒ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ ｓｙｎａｐｓｉｎ １ ｇｅｎｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｃｏｎｆｅｒｓ ｈｉｇｈｌｙ ｎｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ａｎ
ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ａｒｅａ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｆｅｂ；１０（４）：３３７－４７を参照されたい）、神経特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、Ｋｉｍ Ｊ ｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ｒｉｃｈ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－６－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＮＣａＰ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００４ Ｆｅｂ；１４５（２）：６１３－９．Ｅｐｕｂ ２００３ Ｏｃｔ １６を参照されたい）、又はＣＢ６プロモーター（例えば、Ｌａｒｇｅ－Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ－９ Ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｅ
Ｈｕｍａｎ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｍｏｔｏｒ Ｎｅｕｒｏｎ Ｇｅｎｅ，Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ｊａｎ；５８（１）：３０－６．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１２０３３－０１５－９８９９－５を参照されたい）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
好適なプロモーターを選択することができ、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は誘導性／調節性プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。構成的プロモーターの例は、ニワトリベータ－アクチンプロモーターである。様々なニワトリベータ－アクチンプロモーターが単独で、又は様々なエンハンサーエレメント（例えば、ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリベータ－アクチンプロモーターであるＣＡＧプロモーターであり、プロモーターと、ニワトリベータアクチンの第１のエキソン及び第１のイントロンと、ウサギベータ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターとを含む、ＣＢｈプロモーターと組み合わせて記載されている、ＳＪ Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１１ Ｓｅｐ；２２（９）：１１４３－１１５３）。組織特異的であるプロモーターの例は、肝臓（アルブミン、Ｍｉｙａｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５１２４－３２；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９；アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）：Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４）、ニューロン（ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５；ニューロフィラメント軽鎖遺伝子、Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５；及びニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子：Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４）、並びに他の組織について周知である。代替的には、調節可能なプロモーターが選択されてもよい。例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８Ｂ２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
一実施形態では、調節配列は、エンハンサーを更に含む。一実施形態では、調節配列は、１つのエンハンサーを含む。別の実施形態では、調節配列は、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは、同じであり得るか、又は異なり得る。例えば、エンハンサーは、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、又はＣＭＶエンハンサーを含んでもよい。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピー中に存在し得る。代替的に、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列によって分離される。
一実施形態では、調節配列は、イントロンを更に含む。更なる実施形態では、イントロンは、ニワトリベータ－アクチンイントロンである。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、ヒトβ－グロブリンイントロン、及び／又は市販のＰｒｏｍｅｇａ（登録商標）イントロン、並びにＷＯ２０１１／１２６８０８に記載のものであり得る。
一実施形態では、調節配列は、ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）を更に含む。更なる実施形態では、ポリＡは、ウサギグロビンポリＡである。例えば、ＷＯ２０１４／１５１３４１を参照されたい。代替的には、別のポリＡ、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化配列、ＳＶ４０ポリＡ、又は合成ポリＡが、発現カセットに含まれ得る。
発現カセットは、任意の好適な非ウイルスベクター送達系を介して、又は好適なウイルスベクターによって送達され得る。好適な非ウイルスベクター送達系は、当該技術分野において既知であり（例えば、Ｒａｍａｍｏｏｒｔｈ ａｎｄ Ｎａｒｖｅｋａｒ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｒｅｓ．２０１５ Ｊａｎ；９（１）：ＧＥ０１－ＧＥ０６、参照により本明細書に援用される）、当業者によって容易に選択され得、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、デンドリマー、ＰＬＧＡ、ポリメタクリレート、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、又はキトサンベースの製剤を含み得る。
発現カセットの記載が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。
２．ベクター
本明細書で使用される「ベクター」は、核酸配列を含む生物学的又は化学的部分であり、核酸配列の複製又は発現のために適切な標的細胞に導入され得る。ベクターの例としては、限定されないが、組換えウイルス、プラスミド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）コンジュゲート、磁性粒子、又はナノ粒子が挙げられる。一実施形態では、ベクターは、核酸分子であり、機能的な遺伝子産物をコードする外因性核酸若しくは異種核酸又は操作された核酸を含み、その後、適切な標的細胞に導入され得る。かかるベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡが挿入され得る１つ以上の部位とを有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞を、有しない細胞から選択することができる手段を有しており、例えば、それらは薬剤耐性遺伝子をコードしている。一般的なベクターには、プラスミド、ウイルスゲノム、及び「人工染色体」が含まれる。ベクターの生成、産生、特徴付け、又は定量化の従来の方法は、当業者に利用可能である。
特定の実施形態では、ベクターは、非ウイルスプラスミドであり、その記載される発現カセット（例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）を含み、様々な組成物及びナノ粒子（例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質－核酸組成物、ポリグリカン組成物、及び他のポリマー、脂質及び／又はコレステロール系－核酸コンジュゲート、並びに本明細書に記載されるような他の構築物を含む）と結合される。例えば、Ｘ．Ｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１
，８（３），ｐｐ７７４－７８７；ｗｅｂ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ：Ｍａｒｃｈ ２１，２０１１、ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及びＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたい（これらの全ては、参照により本明細書に援用される）。
特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、「複製欠陥ウイルス」又は「ウイルスベクター」は、合成又は人工のウイルス粒子を指し、機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、ＤＲＧ脱標的化（ｄｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ｍｉＲＮＡ標的配列とを含む発現カセットが、ウイルスのカプシド若しくはエンベロープにパッケージングされ、同様に、ウイルスのカプシド若しくはエンベロープ内にパッケージングされるいずれのウイルスゲノム配列も、複製欠陥である（つまり、標的細胞に感染する能力を保持するが、子孫ビリオンを生成することはできない）。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに隣接してコードされる核酸配列のみを含有する「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作されることができる）が、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、後代ビリオンによる複製及び感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
本明細書で使用される場合、組換えウイルスベクターは、任意の好適なウイルスベクターである。実施例は、例示的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。他の好適なウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス、ボカウイルス、ハイブリッドＡＡＶ／ボカウイルス、単純ヘルペスウイルス、又はレンチウイルスが挙げられ得る。好ましい実施形態では、これらの組換えウイルスは、複製不能である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、ベクター（例えば、組換えＡＡＶ）が産生されるパッケージング細胞株を指し得る。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞（例えば、ヒト、昆虫、又は酵母）であり得、任意の手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合によって細胞に導入される、外因性ＤＮＡ又は異種ＤＮＡを含有する。宿主細胞の例としては、限定されないが、単離された細胞、細胞培養物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳類細胞、非哺乳類細胞、昆虫細胞、ＨＥＫ－２９３細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、又は幹細胞が挙げられ得る。
本明細書で使用される場合、「標的細胞」という用語は、機能的な遺伝子産物の発現が所望される任意の標的細胞を指す。標的細胞の例としては、限定されないが、肝臓細胞、腎臓細胞、中枢神経系の細胞、ニューロン、グリア細胞、及び幹細胞が挙げられる。特定の実施形態では、ベクターは、エクスビボで標的細胞に送達される。特定の実施形態では、ベクターは、インビボで標的細胞に送達される。
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルスベクター内にパッケージングされる核酸配列を指す。一実施例では、「ベクターゲノム」は、少なくとも、５’から３’へ、ベクター特異的配列と、標的細胞でその発現を導く調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、非翻訳領域（複数可）のｍｉＲＮＡ標的配列と、ベクター特異的配列と、を含む。例えば、ＡＡＶベクターゲノムは、逆位末端反復配列と、発現カセットとを含有し、発現カセットは、例えば、標的細胞において発現を指示する調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする
核酸配列と、非翻訳領域のｍｉＲＮＡ標的配列とを含む。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくない（例えば、後根神経節）及び／又は導入遺伝子の発現レベルの低減が所望される細胞において、ｍｉＲＮＡ配列によって特異的に認識されるように設計される。
ベクターの記載が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。
３．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
一態様では、ＡＡＶカプシドと、その中にパッケージングされたベクターゲノムとを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）が本明細書に提供される。
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶの５’逆位末端反復（ＩＴＲ）、本明細書に記載の発現カセット、及びＡＡＶの３’ＩＴＲを含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、ｒＡＡＶベクターを形成するｒＡＡＶカプシド内にパッケージングされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、発現カセットに隣接するＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含有する。一実施例では、「ベクターゲノム」は、少なくとも、５’から３’へ、ＡＡＶの５’ＩＴＲと、標的細胞でその発現を導く調節制御配列に作動可能に連結された機能的な遺伝子産物をコードする核酸配列と、非翻訳領域（複数可）のｍｉＲＮＡ標的配列と、ＡＡＶの３’ＩＴＲと、を含む。特定の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ２由来であり、カプシドは、異なるＡＡＶ由来である。あるいは、他のＩＴＲが使用され得る。本明細書に記載されるように、ｍｉＲＮＡ標的配列は、導入遺伝子の発現が望ましくない、及び／又は導入遺伝子の発現レベルの低減が所望される細胞のｍｉＲＮＡ配列によって、特異的に認識されるように設計される。
ＩＴＲは、ベクター生成の際にゲノムの複製及びパッケージングに関与する遺伝子要素であり、ｒＡＡＶを生成するために必要とされる唯一のウイルスシス要素である。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するのとは異なるＡＡＶ由来である。好ましい実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列、又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）が、利便性のため、及び規制当局の承認を加速させるために使用され得る。しかしながら、他のＡＡＶ供給源に由来するＩＴＲが選択され得る。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２由来であり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源由来である場合、得られるベクターは、擬似型と称され得る。典型的には、ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶの５’ＩＴＲ、コード配列及び任意の調節配列、並びにＡＡＶの３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらのエレメントの他の構成も好適であり得る。Ｄ配列及び末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’ＩＴＲ及びＡＡＶ３’ＩＴＲが使用される。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、１３０塩基対の短縮５’及び／又は３’ＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、ここで、外部「ａ」要素は欠失される。短縮されたＩＴＲは、内部Ａエレメントを鋳型として使用して、ベクターＤＮＡ増幅中に１４５塩基対の野生型長さに戻される。
本明細書で使用される「ＡＡＶ」という用語は、天然に存在するアデノ随伴ウイルス、当業者に、かつ／又は本明細書に記載の組成物及び方法の観点において利用可能であるアデノ随伴ウイルス、並びに人工ＡＡＶを指す。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターは、ＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ ＤＮａｓｅ耐性粒子であり、その中にパッケージングされる発現カセットは、標的細胞に送達するためのＡＡＶの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶカプシドは、６０カプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３からなり、選択されるＡＡＶに応じて、およそ１：１：１０～１：１：２０の比で二十面体対称に配置される。上述のＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として、様々なＡＡＶが選択されてもよい。例えば、米
国特許出願公開第２００７／００３６７６０－Ａ１号、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８－Ａ１号、ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８６１、及び２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４も参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１及び米国特許第７，９０６，１１１号（ＡＡＶ９）、並びにＷＯ２００６／１１０６８９及びＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）も参照されたい。これらの文献は、ＡＡＶを生成するために選択され得る他のＡＡＶも記載し、参照により援用される。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離又は操作され、十分に特徴付けられたＡＡＶのうち、ヒトＡＡＶ２は、遺伝子導入ベクターとして開発された最初のＡＡＶであり、異なる標的組織及び動物モデルにおける効率的な遺伝子導入実験に広く使用されている。別途指定されない限り、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び他の選択されるＡＡＶ成分は、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｈｕ３７、ＡＡＶ７Ｍ８、及びＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶｒｈ９０（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴＵＳ２０／３０２７３）、ＡＡＶｒｈ９１（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴＵＳ２０／３０２６６）、並びにＡＡＶｒｈ９２、ｒｈ９３、及びｒｈ９１．９３（２０２０年４月２８日に出願されたＰＣＴＵＳ２０／３０２８１）として一般に特定されているＡＡＶ、既知の若しくは言及されたＡＡＶのうちのいずれかのバリアント、又はまだ発見されていないＡＡＶ若しくはそのバリアント、あるいはそれらの混合物を含む、任意のＡＡＶの中から容易に選択され得る。例えば、参照により本明細書に援用される、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ９カプシド又はそのバリアントである。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ｒＡＡＶベクターの名称で「ＡＡＶ」という用語の後の数値又は数値及び文字の組み合わせによって指定される。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶに関して「バリアント」という用語は、既知のＡＡＶ配列に由来する任意のＡＡＶ配列を意味し、保存的アミノ酸置換を有するＡＡＶ配列、及びアミノ酸配列又は核酸配列にわたって、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％以上の配列同一性を共有するＡＡＶ配列を含む。別の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、任意の記載又は既知のＡＡＶカプシド配列から最大約１０％のバリエーションを含み得るバリアントを含む。すなわち、ＡＡＶカプシドは、本明細書に提供され、かつ／又は当該技術分野で既知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性～約９９．９％の同一性、約９５％～約９９％の同一性、又は約９７％～約９８％の同一性を共有する。一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドのパーセント同一性を決定する場合、比較は、可変タンパク質（例えば、ｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３）のうちのいずれかにわたって行われ得る。
ＩＴＲ又は他のＡＡＶ成分は、当業者に利用可能な技術を使用して、ＡＡＶから容易に単離又は操作され得る。かかるＡＡＶは、学術的、商業的、又は公的供給源（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離、操作、又は入手することができる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献又は例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースで利用可能であるような公開された配列を参照することによって、合成又は他の好適な手段を通して操作され得る。ＡＡＶウイルスは、従来の分子生物学的な技術によって操作することができ、これらの粒子を、核酸配列の細胞特異的送達のため、免疫原性を最小限に抑えるため、安定性及び粒子寿命を調整するため、効率的な分解のため、核への正確な送達のためなどに最適化することを可能にする。
本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ」及び「人工ＡＡＶ」という用語は、限定されないが、カプシドタンパク質と、その中にパッケージングされるベクターゲノムとを含むＡＡＶを意味し、ベクターゲノムは、ＡＡＶとは異種の核酸を含む。一実施形態では、カプシドタンパク質は、天然に存在しないカプシドである。かかる人工カプシドは、選択されたＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、同じＡＡＶの非隣接部分である異なる選択されたＡＡＶからか、非ＡＡＶウイルス供給源からか、又は非ウイルス供給源から得ることができる異種配列と組み合わせて使用して、任意の好適な技術によって生成され得る。人工ＡＡＶは、限定されないが、擬似型ＡＡＶカプシド、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、又は「ヒト化」ＡＡＶカプシドであり得る。１つのＡＡＶのカプシドが異種カプシドタンパク質に置き換えられている擬似型ベクターは、本発明に有用である。一実施形態では、ＡＡＶ２／５及びＡＡＶ２／８は、例示的な擬似型ベクターである。選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及びプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によって送達され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における当業者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び合成技法を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、（ａ）参照により本明細書に組み込まれるＧｅｎＢａｎｋ登録：ＡＡＳ９９２６４（参照により本明細書に援用される）（ＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質は、配列番号１７に再現される）のアミノ酸配列、及び／又は（ｂ）ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＹ５３０５７９．１：（ｎｔ１．．．２２１１）（配列番号１６に再現される）のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するＡＡＶ９を指す。このコード配列からのいくつかの変化は、本発明によって包含され、ＧｅｎＢａｎｋ登録：ＡＡＳ９９２６４及びＵＳ７９０６１１１（同様に、ＷＯ２００５／０３３３２１）における参照アミノ酸配列と約９９％同一性を有する配列を含み得る（すなわち、参照配列からの約１％未満の変化）。かかるＡＡＶは、例えば、天然単離物（例えば、ｈｕ６８、ｈｕ３１若しくはｈｕ３２）、又はアミノ酸置換、欠失、若しくは付加を有するＡＡＶ９のバリアントを含み得る（例えば、ＡＡＶ９カプシドと整列される任意の他のＡＡＶカプシド、例えば、ＵＳ９，１０２，９４９、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／３４９９１１、ＷＯ２０１６／０４９２３０Ａ１ｌ、ＵＳ９，６２３，１２０、ＵＳ９，５８５，９７１に記載されているものなどの、対応する位置から「動員される（ｒｅｃｒｕｉｔｅｄ）」代替的な残基から選択されたアミノ酸置換を含むが、これらに限定されない）。しかし、他の実施形態では、ＡＡＶ９の他のバリアント、又は上記の参照配列に少なくとも約９５％同一性を有するＡＡＶ９カプシドが選択され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７９０３８号を参照されたい。カプシド、したがってコーディング配列を生成する方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの産生のための方法が報告されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
ＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１（配列番号９）の６７位及び１５７位の２つのコードされたアミノ酸により、別の系統群ＦのウイルスであるＡＡＶ９とは異なる。対照的に、他の系統群ＦのＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３１）は、６７位にＡｌａ及び１５７位にＡｌａを有する。配列番号９の番号付けに基づいて、１５７位にバリン（Ｖａｌ又はＶ）を有し、任意選択的に、６７位にグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）を有する、新規のＡＡＶｈｕ６８カプシド及び／又は操作されたＡＡＶカプシドが提供される。また、ＷＯ２０１８／１６０５８２も参照されたい（配列表を含めて）、その全体が参照により本明細書に援
用される）。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて、（少なくとも１０００複製物のうちの）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ）アルゴリズムを使用して決定されるような、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指す。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実装するために使用することができるコンピュータプログラムが利用可能である。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正されたＮｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術及びコンピュータプログラム、並びにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定されるクレードのうちの１つに含まれるか、別の系統群に含まれるか、又はこれらのクレード外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０：６３８１－６３８８（これは、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを同定し、かつ新規ＡＡＶの核酸配列、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９を提供する）を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、更に、以下のうちの１つ以上によって特徴付けられる。ＡＡＶ ｈｕ６８カプシドタンパク質は、配列番号９の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号８から産生されるｖｐ１タンパク質、又は配列番号９の１～７３６の予測アミノ酸配列をコードする配列番号８に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号９の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号８の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、又は配列番号９の少なくとも約１３８～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする配列番号８の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、並びに／あるいは配列番号９の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、又は配列番号９の少なくとも約２０３～７３６のアミノ酸の予測アミノ酸配列をコードする配列番号８の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１に対して少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。
ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、典型的には、配列番号９の全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質を発現させるために単独で使用される。代替的に、この配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／又はｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列、又はそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ（配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、又は配列番号９のａａ２０３～７３６をコードする配列番号８に対して少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％）同一の配列のうちの
１つ以上と共発現され得る。追加的に、又は代替的に、ｖｐ１コード配列及び／又はｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号８のｎｔ４１２～２２１２１）、又は配列番号９の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号８と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。
本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号９のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列、及び任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１及び／又はｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）由来のカプシドを発現する産生システムで産生されたｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より具体的には、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に部分集合体を含有し、配列番号９の予測アミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、最低限、脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン－グリシン対におけるアスパラギンは、高度に脱アミド化される。
一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号８の配列、又はそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２及び／又はｖｐ３タンパク質は、追加的又は代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比率を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）及び／又はｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）若しくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ（配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を含まない配列番号９のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）又はそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡ若しくはｔＲＮＡ（配列番号８のｎｔ４１２～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。
しかしながら、配列番号９のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号８の核酸配列、又は配列番号８に対して少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号８の核酸配列、又は配列番号８の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１に対して少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号８の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１の核酸配列、又は配列番号８のｎｔと少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号９のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号８の核酸配列、又は本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を含む配列番号９のｖｐ１アミノ酸配列
をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号９に再現される。
本明細書で使用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語又はその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、又はｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号９は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質（代替的にアイソフォームと称される）に関連して使用される「異種」という用語は、カプシド内のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質のアミノ酸配列の違いを指す。ＡＡＶカプシドは、予測されたアミノ酸残基の修飾を有する、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は、アスパラギン－グリシン対における少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。参照により本明細書に援用される「Ｎｏｖｅｌ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｃａｐｓｉｄ Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題する２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８６１、及び２０１９年２月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／１９８０４を参照されたい。
本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから、参照群の全てのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。
例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、少なくとも１つのｖｐ１タンパク質であり、全てのｖｐ１タンパク質よりも少ない。ｖｐ３の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、１つのｖｐ３タンパク質から、全てのｖｐ３タンパク質よりも少なくてもよい。例えば、組み立てられたＡＡＶカプシドにおいて、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３はなお、ｖｐタンパク質の更なる亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有する亜集団を含み得る。
別途指定されない限り、高度脱アミド化は、参照アミノ酸位置での予測アミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸位置での少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号９［ＡＡＶｈｕ６８］の番号付けに基づくアミノ酸５７のアスパラギンの少なくとも８０％が、ｖｐ１タンパク質の合計に基づいて脱アミド化され得るか、又は合計ｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３タンパク質の合計に基づいて脱アミド化され得る）。かかるパーセンテージは、２Ｄゲル、質量分析技術、又は他の好適な技術を使用して決定され得る。
ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質において、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、７０％を超える脱アミド化レベルを日常的に示し、様々なロットにわたって、ほとんどの場合９０％を超える。更なるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、及びＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミド化レベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、及びｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、配列番号９の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、最低限、特定の脱アミド化アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の部分集合体は、配列番号９のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つの高度脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸を更に含み、脱アミド化は、アミノ酸の変化及び他の任意選択的な修飾をもたらす。
他の実施形態では、方法は、ｒＡＡＶの収率を増加させること、したがって、細胞溶解の前に、又は細胞溶解を必要とせずに、上清中に存在するｒＡＡＶの量を増加させることを伴う。この方法は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸番号を有する整列に基づいて、ＡＡＶ ＶＰ１カプシド遺伝子を操作して、６７位にＧｌｕ、１５７位にＶａｌ、又は両方を有するカプシドタンパク質を発現させることを伴う。他の実施形態では、方法は、ＶＰ２カプシド遺伝子を操作して、１５７位にＶａｌを有するカプシドタンパク質を発現することを伴う。更に他の実施形態では、ｒＡＡＶは、修飾カプシドを有し、６７位にＧｌｕ及び１５７位にＶａｌの、ｖｐ１及びｖｐ２のカプシドタンパク質の両方を含む。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、自己相補性ＡＡＶである。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補性の片割れが会合して、即時の複製及び転写に備えのある１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成するであろう。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ １２４８－１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、及び同第７，４５６，６８３号に記載されており、その各々は参照によりその全体が本明細書に援用される。
特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶは、ヌクレアーゼ耐性である。かかるヌクレアーゼは、単一のヌクレアーゼ、又はヌクレアーゼの混合物であり得、エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼであり得る。ヌクレアーゼ耐性ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドが完全に組み立てられたことを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するために設計されたヌクレアーゼインキュベーションステップ中の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。多くの場合、本明細書に記載のｒＡＡＶは、ＤＮａｓｅ耐性である。
本明細書に記載される組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技術を使用して生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、Ａ
ＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接する本明細書に記載の発現カセットと、発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするように機能する適切なヘルパーと、を含有する宿主細胞を培養することを含む。また、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列と、機能的ｒｅｐ遺伝子と、記載のベクターゲノムと、ベクターゲノムをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングすることを可能にするように機能する適切なヘルパーと、を含有する宿主細胞も本明細書に提供される。一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。これらの方法は、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１７／１６０３６０Ａ２に更に詳細に記載されている。
当業者に利用可能なｒＡＡＶの他の産生方法も利用することができる。好適な方法としては、バキュロウイルス発現系又は酵母を介した生成が挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｏｂｅｒｔ Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－Ｒ６．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１１ Ａｐｒ ２９．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１、Ａｕｃｏｉｎ ＭＧ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ．２００６ Ｄｅｃ ２０；９５（６）：１０８１－９２、ＳＡＭＩ Ｓ．ＴＨＡＫＵＲ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｔｈｅｓｉｓ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｆｌｏｒｉｄａ，２０１２、Ｋｏｎｄｒａｔｏｖ Ｏ ｅｔ ａｌ．Ｄｉｒｅｃｔ Ｈｅａｄ－ｔｏ－Ｈｅａｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｈｕｍａｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｕｇ １０．ｐｉｉ：Ｓ１５２５－００１６（１７）３０３６２－３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１７．０８．００３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］、Ｍｉｅｔｚｓｃｈ Ｍ ｅｔ ａｌ，ＯｎｅＢａｃ ２．０：Ｓｆ９ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ
ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ１，ＡＡＶ２，ａｎｄ ＡＡＶ８ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７ Ｆｅｂ；２８（１）：１５－２２．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１６．１６４．、Ｌｉ
Ｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ－ｆｏｒｍ ｇｅｎｏｍｅｓ：ａ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ａｕｇ １；８（８）：ｅ６９８７９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００６９８７９．Ｐｒｉｎｔ ２０１３、Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ ｅｔ ａｌ，Ｌａｔｅｓｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ Ｐａｔｈｏｌ．２０１１ Ｊｕｌ；１０７ Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８０－９３．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｉｐ．２０１１．０５．００８、及びＫｏｔｉｎ ＲＭ，Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ａｐ
ｒ １５；２０（Ｒ１）：Ｒ２－６．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｒ１４１．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ ２９を参照されたい。
２ステップの高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィー精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィーを使用して、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ＡＡＶ９」と題するＷＯ２０１７／１６０３６０により詳細が記載されており、参照により本明細書に援用される。簡潔には、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶ９粒子を、ゲノム欠損ＡＡＶ９中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９カプシド中間体を含む懸濁液を、高性能液体クロマトグラフィーに供することを伴い、ＡＡＶ９ウイルス粒子及びＡＡＶ９中間体を、１０．２のｐＨで平衡化された強アニオン交換樹脂に結合させ、約２６０及び約２８０での紫外吸光度について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供する。ｒＡＡＶ９には最適未満であるが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であってもよい。この方法では、ＡＡＶ９全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に達するときに溶離される画分から収集される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィーステップのために、ダイアフィルトレーションされた産物を、ＡＡＶ２／９血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン性条件下、残留細胞ＤＮＡ及びタンパク質の顕著なパーセンテージは、カラムを通って流れ、ＡＡＶ粒子は、効率的に捕捉される。
ｒＡＡＶの特徴付け又は定量化のための従来の方法は、当業者に利用可能である。空及び充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬ当たりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割り算し、ゲノムコピーに対する粒子の比率（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割り、１００を掛け算することによって、空粒子のパーセンテージを得る。一般に、空のカプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８．変性カプシドについて試験するために、方法は、処理されたＡＡＶストックを、３つのカプシドタンパク質を分離することが可能な任意のゲルからなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えば、緩衝液中に３～８％のトリス酢酸塩を含有する勾配ゲル）に供することと、次いで、試料材料が分離されるまでゲルを試行することと、ナイロン又はニトロセルロース膜、好ましくはナイロンの上でゲルをブロッティングすることと、を含む。次いで、抗－ＡＡＶカプシド抗体は、変性したカプシドタンパク質、好ましくは、抗－ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗－ＡＡＶ－２モノクローナル抗体に結合する一次抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、又は比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラム画分からの試料を採取し、還元剤（例
えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥローディングバッファー中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って、又は他の好適な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビー若しくはクマシー色素を用いて、銀染色を実施してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）によって測定することができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（又は別の好適なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活性化後、試料は、更に希釈され、プライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを用いて、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）の値を使用して、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することによって、ベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用可能である。
一態様では、広域スペクトル血清プロテアーゼ、例えば、プロテアーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから購入可能）を利用する最適化ｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より特定的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、標準アッセイと同様であるが、但し、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理した後、熱不活性化させる。好適には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテイナーゼＫバッファーで希釈される。プロテイナーゼＫバッファーは、２倍以上に濃縮されてもよい。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度（例えば、約３７℃～約５０℃）でより長時間（例えば、約２０分間～約３０分間）、又はより高い温度（例えば、最高約６０℃）でより短時間（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準アッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
追加的に、又は代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用され得る。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価を決定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５． ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
また、カプシドタンパク質のｖｐ１、ｖｐ２、及びｖｐ３の比を決定する方法も利用可能である。例えば、Ｖａｍｓｅｅｄｈａｒ Ｒａｙａｐｒｏｌｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｃａｐｓｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１３ Ｄｅｃ；８７（２４）：１３１５０－１３１６０、Ｂｕｌｌｅｒ ＲＭ，Ｒｏｓｅ ＪＡ．１９７８．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ
ｉｎ ＫＢ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２５：３３１－３３８、及びＲｏｓｅ ＪＡ，Ｍａｉｚｅｌ ＪＶ，Ｉｎｍａｎ ＪＫ，Ｓｈａｔｋｉｎ ＡＪ．１９７１．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．８：７６６－７７０．
ｒＡＡＶの記載が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。
４．医薬組成物
導入遺伝子及びｍｉＲＮＡ標的配列を含む発現カセットを含む医薬組成物は、液体懸濁液、凍結乾燥又は凍結組成物、又は別の好適な製剤であってもよい。特定の実施形態では、組成物は、発現カセットと、懸濁液を形成する生理学的に適合する液体（例えば、溶液、希釈剤、担体）とを含む。かかる液体は、好ましくは水性であり、緩衝剤（複数可）、界面活性剤（複数可）、ｐＨ調整剤（複数可）、防腐剤（複数可）、又は他の好適な賦形剤（複数可）を１つ以上含み得る。好適な成分が以下でより詳細に考察される。医薬組成物は、水性懸濁液及び任意の選択された賦形剤、並びに発現カセットを含む。
導入遺伝子及びｍｉＲＮＡ標的配列を含む発現カセットは、本明細書全体に記載されている通りである。例えば、発現カセットは、（ａ）組換えウイルスを含む細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある遺伝子産物のコード配列と、（ｂ）細胞において遺伝子産物の発現を導く調節配列と、（ｃ）コード配列の５’にある５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列と、（ｄ）コード配列の３’にある３’ＵＴＲ配列と、ｅ）少なくとも２つのタンデム後根神経節（ＤＲＧ）特異的ｍｉＲＮＡ標的配列とを含み、少なくとも２つのｍｉＲＮＡ標的配列は、少なくとも１つの第１のｍｉＲＮＡ標的配列と、同じか又は異なり得る少なくとも１つの第２のｍｉＲＮＡ標的配列と、を含む核酸配列であり得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、発現カセットを含み、発現カセットは、導入遺伝子、及びｍｉＲＮＡ標的配列、並びに非ウイルス送達系を含む。これには、例えば、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質又は脂質様粒子、キトサンベースの製剤、並びに当該技術分野で既知で、記載されている他のもの（例えば、上に引用されたＲａｍａｍｏｏｒｔｈ及びＮａｒｖｅｋａｒに例示される）が含まれ得る。
他の実施形態では、医薬組成物は、発現カセット（導入遺伝子及びｍｉＲＮＡ標的配列を含む）を含む懸濁液であり、非ウイルスベクター系又はウイルスベクター系において操作されている。かかる非ウイルスベクター系は、例えば、プラスミド若しくは非ウイルス遺伝要素、又はタンパク質ベースのベクターを含み得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、非複製ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターには、例えば、組換えアデノウイルス、組換えレンチウイルス、組換えボカウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又は別の組換えパルボウイルスなどの任意の好適な送達ベクターが含まれ得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、それを必要とする患者に遺伝子産物を送達するための組換えＡＡＶである。
一実施形態では、医薬組成物は、発現カセットを含み、導入遺伝子及びｍｉＲＮＡ標的配列、並びに脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、大槽内、又は静脈内（ＩＶ）注入を介した送達に好適な製剤緩衝液を含む。一実施形態では、導入遺伝子及びｍｉＲＮＡ標的配列を含む発現カセットは、組換えＡＡＶにパッケージングされる。
一実施形態では、本明細書に提供される組成物は、水性懸濁液中に溶解される界面活性剤、防腐剤、賦形剤、及び／又は緩衝剤を含む。一実施形態では、緩衝液は、ＰＢＳである。別の実施形態では、緩衝液は、人工脳脊髄液（ＣＳＦ）、例えば、エリオット製剤緩衝液、又はハーバード装置灌流液（最終イオン濃度（ｍＭ単位で）：Ｎａ １５０、Ｋ ３．０、Ｃａ １．４、Ｍｇ ０．８、Ｐ １．０、Ｃｌ １５５）である。様々な好適な溶液が既知であり、緩衝化生理食塩水、界面活性剤、約１００ｍＭの塩化ナトリウム（
ＮａＣｌ）～約２５０ｍＭの塩化ナトリウムに相当にイオン強度に調整された生理学的に適合する塩若しくは塩の混合物、又は同等のイオン濃度に調整された生理学的に適合する塩のうちの１つ以上を含むものが含まれる。
好適には、配合物は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～８、又はｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、又はｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるため、髄腔内送達では、この範囲内のｐＨが望ましいものであり得、一方、静脈内送達のためには、６．８～約７．２のｐＨが望ましいものであり得る。しかし、最も広い範囲内の他のｐＨ、及びこれらの部分範囲が、他の送達経路用に選択されてもよい。
好適な界面活性剤、又は界面活性剤の組み合わせは、非毒性である非イオン性界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、８４００の平均分子量を有する、ポロキサマー１８８としても知られている、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二官能性ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ １５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアラート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリン酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及びポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般的に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字で命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子質量を与え、最後の１桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与える。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最大約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。
一実施例では、製剤は、例えば、水中に塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、及びそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝化食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達では、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）であり、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達では、商業的に入手可能な希釈剤が懸濁化剤として、又は別の懸濁化剤及び他の任意選択的な賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。
他の実施形態では、製剤は、１つ以上の浸透促進剤を含有し得る。好適な浸透促進剤の例には、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、又はＥＤＴＡが含まれ得る。
更に、薬学的に許容される担体と、本明細書に記載される核酸配列を含むベクターと、を含む医薬組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足活性成分を組成
物中に組み込むこともできる。リポソーム、ナノカプセル、ミクロ粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などのような送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクターは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、又はナノ粒子などのいずれかに封入された送達のために配合され得る。一実施形態では、治療有効量の当該ベクターが、医薬組成物に含まれる。担体の選択は、本発明の制限ではない。防腐剤又は化学的安定剤などの他の従来の薬学的に許容される担体。好適な例示的な防腐剤には、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及びパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学的安定剤には、ゼラチン及びアルブミンが含まれる。
「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギー又は類似の有害反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「投薬量」又は「量」という用語は、対象に治療の過程で送達される総投薬量若しくは総量、あるいは単一単位（又は複数単位若しくは分割投薬量）投与で送達される投薬量若しくは量を指し得る。
本明細書に記載の水性懸濁液又は医薬組成物は、それを必要とする対象に、任意の好適な経路又は異なる経路の組み合わせによって送達されるように設計される。
一実施形態では、医薬組成物は、脳室内（ＩＣＶ）、髄腔内（ＩＴ）、又は大槽内注入を介した送達のために配合される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、それを必要とする対象に、静脈内注入によって送達するために設計される。代替的に、他の投与経路（例えば、経口、吸入、鼻腔内、気管内、動脈内、眼内、筋肉内、及び他の非経口経路）を選択してもよい。
本明細書で使用される場合、「髄腔内送達」又は「髄腔内投与」という用語は、脊柱管への注入、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔内への注入を介した、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰部穿刺、脳室内穿刺、後頭下／大槽内穿刺、及び／又はＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺の手段によって、クモ膜下腔全体に拡散させるために導入され得る。別の例では、大槽内への注射であってもよい。鼻腔内送達は、ベクター拡散を増加させ、かつ／又は投与によって引き起こされる毒性及び炎症を低減し得る。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｈｉｎｄｅｒｅｒ ｅｔ
ａｌ，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＡＡＶ９ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｃｉｓｔｅｒｎａ ｍａｇｎａ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１４；１：１４０５１．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１４ Ｄｅｃ １０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．５１を参照されたい。
本明細書で使用される場合、「大槽内送達」又は「大槽内投与」という用語は、脳室の脳脊髄液への、又は小脳延髄槽内への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺を介した、又は大槽内への直接的な注入若しくは永久的に配置されたチューブを介した薬物の投与経路を指す。
一態様では、本明細書に記載されるベクターを製剤緩衝液中に含む医薬組成物が、本明細書に提供される。特定の実施形態では、複製欠陥ウイルス組成物は、ヒト患者にとって、範囲内の全ての整数又は分数量を含む約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣ（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０
×１０１４ＧＣの範囲にある一定量の複製欠陥ウイルスを含むように投薬量単位で製剤化され得る。一実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、又は９×１０９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、又は９×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、又は９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、又は９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、又は９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内の全ての整数又は小数を含む、用量当たり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、又は９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内の全ての整数又は少数を含む、用量当たり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲で当り得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶを製剤緩衝液中に含む医薬組成物が提供される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｍＬ～約１×１０１４ＧＣ／ｍＬで製剤化される。更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約３×１０９ＧＣ／ｍＬ～約３×１０１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。なお更なる実施形態では、ｒＡＡＶは、約１×１０９ＧＣ／ｍＬ～約１×１０１３ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、ｒＡＡＶは、少なくとも約１×１０１１ＧＣ／ｍＬで製剤化される。一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む医薬組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０１４ＧＣの用量で投与される。
特定の実施形態では、組成物は、任意の好適な経路による送達のために、好適な水性懸濁媒体（例えば、緩衝生理食塩水）中に製剤化され得る。本明細書に提供される組成物は、高用量のウイルスベクターの全身送達に有用である。ｒＡＡＶの場合、高用量は、少なくとも１×１０１３ＧＣ、又は少なくとも１×１０１４ＧＣであり得る。しかしながら、改善された安全性のために、本明細書に提供されるｍｉＲＮＡ配列は、他のより低い用量で送達される発現カセット及び／又はベクターゲノムに含まれ得る。
特定の実施形態では、組成物は、本質的に同時に２つの異なる経路によって送達される。
医薬組成物の記載が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態、及び方法に適用されるよう意図されることを理解されたい。
５．治療方法
特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、所望の導入遺伝子産物を、患者に送達するのに有用であり、一方で、後根神経節ニューロンにおける導入遺伝子発現を抑
制するのに有用である。方法は、導入遺伝子及びｍｉＲＮＡ標的配列を含む発現カセットを含む組成物を、患者に送達することを伴う。有用な導入遺伝子としては、欠損又は欠損遺伝子を置き換え、不活性化又は「ノックアウト」、又は「ノックダウン」又は望ましくない高レベルで発現している遺伝子の発現を低減させる、又は所望の治療効果を有する遺伝子産物を送達する様々な遺伝子産物をコードする遺伝子産物が含まれる。
好適には、治療方法は、本明細書に記載の導入遺伝子を含む発現カセット又はベクターゲノムを含むベクターを、本明細書に記載の複数のｍｉＲ標的配列と組み合わせて患者に投与することを含む。好適には、これらの発現カセット及びベクターゲノムは、好適なウイルス（例えば、ＡＡＶ）キャプシドにパッケージングされる。特定の実施形態では、発現カセットは、８つのｍｉＲ標的化配列（例えば、４×ｍｉＲ－１８２標的化配列＋４×ｍｉＲ－１８３標的化配列、又は他の組み合わせ）を含んでもよい。他の実施形態では、ｍｉＲ標的化配列の様々な組み合わせが生成され得る。
好適な導入遺伝子の例は、１つ以上の神経変性障害の治療に有用である。かかる障害としては、限定されないが、伝染性海綿状脳症（例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病）、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、筋細管ミオパチー及び他のミオパチー、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、アルツハイマー病、ハンチントン病、カナバン病、外傷性脳損傷、脊髄損傷（ＡＴＩ３３５、Ｎｏｖａｒｔｉｓによる抗ｎｏｇｏ１）、片頭痛（Ａｌｄｅｒ ＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓによるＡＬＤ４０３、ＥｌｉによるＬＹ２９５１７４２、Ｌａｂｒｙｓ ＢｉｏｌｏｇｉｃｓによるＲＮ３０７）、リソソーム蓄積症、脳卒中、中枢神経系に影響を及ぼす感染症が含まれ得る。リソソーム蓄積症の例としては、例えば、ゴーシェ病、ファブリー病、ニーマン・ピック病、ハンター症候群、糖原病ＩＩ（ポンペ病）、又はテイ・サックス病が挙げられる。これらの病態（例えば、ＤＭＤ及びミオパチー）のいくつかに対して、本明細書に提供される組成物は、骨格筋及び心筋の形質導入又は発明のための高用量の発現カセット（例えば、ウイルスベクターによって運ばれる）に関連する軸索障害を低減又は排除するのに有用である。
更に他の核酸は、Ｎｏｇｏ受容体の機能成分であり、多発性硬化症、パーキンソン病又は本態性振戦を有する患者における本態性振戦に関連する、ロイシンリッチリピート及び免疫グロブリン様ドメイン含有タンパク質１（ＬＩＮＧＯ－１）を対象とする免疫グロブリンをコードし得る。かかる市販の抗体の１つは、オクレリズマブ（Ｂｉｏｇｅｎ，ＢＩＩＢ０３３）である。例えば、米国特許第８，４２５，９１０号を参照されたい。一実施形態では、核酸構築物は、ＡＬＳを有する患者に有用な免疫グロブリン構築物をコードする。好適な抗体の例としては、ＡＬＳ酵素スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）及びそのバリアントに対する抗体（例えば、ＡＬＳバリアントＧ９３Ａ、Ｃ４Ｆ６ ＳＯＤ１抗体）、ＭＳ７８５（ダーリン－１結合領域を対象とする）、神経突起伸長インヒビター（ＮＯＧＯ－Ａ又はレチキュロン４）に対する抗体（例えば、ＧＳＫ１２２３２４９、オザネズマブ（ヒト化、ＧＳＫ、多発性硬化症に有用とも記載されている）が挙げられる。核酸配列は、アルツハイマー病を有する患者において有用な免疫グロブリンをコードするように設計又は選択され得る。かかる抗体構築物は、例えば、アデュマヌカブ（Ｂｉｏｇｅｎ）、バピニューズマブ（Ｅｌａｎ、Ａβのアミノ末端を対象とするヒト化ｍＡｂ）、ソラネズマブ（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ、可溶性Ａβの中央部分に対するヒト化ｍＡｂ）、ガンテネルマブ（Ｃｈｕｇａｉ及びＨｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ、Ａβのアミノ末端及び中央部分の両方を対象とする完全ヒトｍＡｂである）、クレネズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、単量体エピトープ及び構造エピトープに作用するヒト化ｍＡｂ、Ａβのオリゴマー形態及びプロトフィブリル形態を含む）、ＢＡＮ２４０１（Ｅｓａｉ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、Ａβプロトフィブリルに選択的に結合するヒト化免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）ｍＡｂ、Ａβプロトフィブリルのクリアランスを促進する、及び／又は脳のニューロン
に対するそれらの毒性効果を中和すると考えられている）、ＧＳＫ９３３７７６（Ａβのアミノ末端を対象とするヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体）、ＡＡＢ－００１，ＡＡＢ－００２，ＡＡＢ－００３（Ｆｃ操作バピニューズマブ）、ＳＡＲ２２８８１０（プロトフィブリル及び低分子量Ａβを対象とするヒト化ｍＡｂ）、ＢＩＩＢ０３７／ＢＡＲＴ（不溶性線維ヒトＡβに対する完全ヒトＩｇＧ１、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、ｍ２６６、ｔｇ２５７６などの抗Ａβ抗体（Ａβオリゴマーに対して相対的特異性）［Ｂｒｏｄｙ ａｎｄ Ｈｏｌｔｚｍａｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００８；３１：１７５－１９３］を含む。他の抗体は、ベータ－アミロイドタンパク質、Ａβ、ベータセクレターゼ、及び／又はｔａｕタンパク質を標的としてもよい。更に他の実施形態では、抗β－アミロイド抗体は、エフェクター機能を最小限に抑えるためにβ－アミロイドを標的とするＩｇＧ４モノクローナル抗体に由来するか、又はアミロイド関連造影異常（ＡＲＩＡ）及び炎症応答を回避するためにＦｃ領域を欠くｓｃＦｖ以外の構築物が選択される。これらの実施形態のいくつかにおいて、ｓｃＦｖ構築物の１つ以上の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域は、本明細書に提供される別の好適な免疫グロブリン構築物において使用される。これらのｓｃＦＶ及び他の操作された免疫グロブリンは、Ｆｃ領域を含む免疫グロブリンと比較して、血清中の免疫グロブリンの半減期を減少させ得る。抗アミロイド分子の血清中濃度を減少させることは、血清中の非常に高いレベルの抗アミロイド抗体が、高負荷のアミロイドプラークを伴う脳血管を不安定化させ、血管透過性を引き起こす可能性があるため、ＡＲＩＡのリスクを更に減少させ得る。パーキンソン病を有する患者の治療のための他の免疫グロブリン構築物をコードする核酸は、例えば、ロイシンリッチリピートキナーゼ２、ダーダリン（ｄａｒｄａｒｉｎ）（ＬＲＲＫ２）抗体、抗シヌクレイン抗体及びアルファ－シヌクレイン抗体、並びにＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）抗体を含む構築物を発現するように操作又は設計され得る。他の抗体としては、ＰＲＸ００２（Ｐｒｏｔｈｅｎａ及びＲｏｃｈｅ）パーキンソン病並びに関連するシヌクレイン病が含まれ得る。これらの抗体、具体的には、抗シヌクレイン抗体は、１つ以上のリソソーム蓄積症の治療にも有用であり得る。
ｄｒｇ毒性を低減又は防止するために、本明細書に提供されるｍｉＲ－１８２標的及び／又はｍｉＲ－１８３標的配列を含有する発現カセットに操作される、中枢神経系（ＣＮＳ）障害又は疾患（例えば、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ又は様々ながんを含む）に関連する状態を治療するための免疫グロブリン構築物をコードする核酸構築物を操作又は選択することができる。かかる免疫グロブリンとしては、ナタリズマブ（ヒト化抗ａ４－インテグリン、ｉＮＡＴＡ、タイサブリ、Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ及びＥｌａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、２００６年に承認）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）－１Ｈ、ヒト化抗ＣＤ５２）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｎ（登録商標）、キメラ抗ＣＤ２０）、ダクリズマブ（ゼナパックス、ヒト化抗ＣＤ２５）、オクレリズマブ（ヒト化、抗ＣＤ２０、Ｒｏｃｈｅ）、ウステキヌマブ（ＣＮＴＯ－１２７５、ヒト抗ＩＬ１２ｐ４０＋ＩＬ２３ｐ４０）、抗ＬＩＮＧＯ－１、抗ＣＤ３０抗体（例えば、ブレンツキシマブ－ベドチン（Ａｄｃｅｎｔｒｉｓ（登録商標））、及びｃｈ５Ｄ１２（キメラ抗ＣＤ４０）、並びにｒＨＩｇＭ２２（再ミエリン化モノクローナル抗体、Ａｃｏｒｄａ及びＭａｙｏ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などを含み得るか、又はそれに由来し得る。更に他の抗ａ４－インテグリン抗体、抗ＣＤ２０抗体（例えば、ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）、Ｇａｚｔｖａｒｏ（登録商標）、Ｇａｚｖｖａ／オビヌツズマブ（ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ））、Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）、抗ＣＤ５２抗体、抗ＶＥＧＦ又は抗ＶＥＧＦ２抗体（例えば、Ｃｙｒａｍｚａ（登録商標）（ラムシルマブ））、抗ＣＤ３８抗体（例えば、Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標）（ダラツムマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）又はＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ））、抗Ｈｅｒ２抗体、例えば、トラスツズマブ又はペルツズマブ、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ）、抗ＲＡＮＫＬ（例えば、デ
ノスマブ）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、パニツムマブ）、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピムマブ）、抗ＩＬ１７抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＳＥＭＤ４抗体、及びＣＤ４０抗体は、本明細書に記載のＡＡＶベクターを介して送達され得る。更に他の免疫グロブリン構築物又はモノクローナル抗体は、本発明での使用のために選択され得る。例えば、ＵＳ２０１８／０３３９０６５を参照されたく、参照により本明細書に援用される。抗体は、ＣＮＳ標的化され得るか、又は他の経路を介して送達され得る。
中枢神経系の様々な感染症に対する抗体も、本発明によって企図される。かかる感染性疾患としては、真菌性疾患（例えば、クリプトコッカス髄膜炎、脳膿瘍、脊髄硬膜外感染症、例えば、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ目、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、及びＣａｎｄｉｄａ種によって引き起こされる）、原虫性疾患（トキソプラズマ症、マラリア、及び原発性アメーバ性髄膜脳炎、例えば、病原体Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｓ、Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ ｍａｎｓｏｎｏｉｄｅｓ（孤虫症）、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ種（神経包虫症の病因）によって引き起こされる、並びに脳アメーバ症など）、細菌性疾患（例えば、結核、ハンセン病、神経梅毒、細菌性髄膜炎、ライム病（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ロッキー山紅斑熱（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ＣＮＳノカルジア症（Ｎｏｃａｒｄｉａ種）、ＣＮＳ結核（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ＣＮＳリステリア症（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、脳膿瘍、及び神経ボレリア症）、ウイルス感染（例えば、ウイルス性髄膜炎、東部ウマ脳炎（ＥＥＥ）、セントルイス脳炎、ウエストナイルウイルス及び／又は脳炎、狂犬病、カリフォルニア脳炎ウイルス、ラクロス脳炎、麻疹脳炎、灰白髄炎など、これらは、例えば、ヘルペスファミリーウイルス（ＨＳＶ）、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２（新生児単純ヘルペス脳炎）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ビッカースタッフ脳炎、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ、ＴＣＮ－２０２などがＴｈｅｒａｃｌｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって開発中）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、Ｂウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓｉｍｉａｅ）、フラビウイルス脳炎、日本脳炎、マレーバレー熱、ＪＣウイルス（進行性多巣性白質脳症）、ニパウイルス（ＮｉＶ）、麻疹ウイルス（亜急性硬化性全脳炎）によって引き起こされ得る）、及び他の感染症（例えば、亜急性硬化性全脳炎、進行性多巣性白質脳症、ヒト免疫不全ウイルス（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ））、化膿性連鎖球菌、及び他のβ溶血性連鎖球菌（例えば、小児自己免疫性連鎖球菌感染関連精神神経障害（ＰＡＮＤＡＳ））及び／又はシデナム舞踏病、並びにギラン・バレー症候群、並びにプリオン）が挙げられ得る。
好適な抗体構築物の例としては、例えば、ＷＯ２００７／０１２９２４Ａ２（２０１５年１月２９日）に記載されているものが挙げられ得る（参照により本明細書に援用される）。
例えば、本明細書に提供されるｄｒｇ標的化配列を含む他の核酸配列は、抗プリオン免疫グロブリン構築物をコードする配列に作動可能に連結され得る。かかる免疫グロブリンは、ＣＤ２３０（表面抗原分類２３０）としても知られている、主要なプリオンタンパク質（ＰｒＰ、プリオンタンパク質又はプロテアーゼ耐性タンパク質に関して）を対象とし得る。ＰｒＰのアミノ酸配列は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／ＮＰ＿０００３０２に提供されている（参照により本明細書に援用される）。タンパク質は、複数のアイソフォーム（正常なＰｒＰＣ、疾患を引き起こすＰｒＰＳｃ、及びミトコンドリアに位置するアイソフォーム）で存在し得る。ミスフォールドしたバージョンのＰｒＰＳｃは、様々な認知障害及び神経変性疾患（例えば
、クロイツフェルト・ヤコブ病、ウシ海綿状脳症、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群、致死性家族性不眠症、及びクールー病）に関連している。
好適な遺伝子産物の例としては、家族性高コレステロール血症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、及び希少疾患又は孤児疾患の治療に有用な治療遺伝子（複数可）のコード配列に作動可能に連結される本明細書に提供されるｍｉＲ－１８２／ｍｉＲ－１８３標的配列を含むベクターゲノムから発現されたものが含まれ得る。かかる希少疾患の例としては、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病、レット症候群（例えば、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ５１６０８）、アンジェルマン病（例えば、Ｅ６ＡＰとしても知られるユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フリードライヒ運動失調症（例えば、フラタキシン）、プログラニュリン（ＰＲＧＮ）（前頭部認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語症（ＰＮＦＡ）、及び意味認知症を含む非アルツハイマー性脳変性に関連する）などが挙げられる。他の有用な遺伝子産物としては、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルギノコハク酸リアーゼ欠乏症の治療のためのアルギノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマル酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、アカゲザルアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオンベータ－シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィン遺伝子産物［例えば、ミニ－又はマイクロ－ジストロフィン］が挙げられる。更に他の有用な遺伝子産物は、酵素補充療法に有用であり得るような酵素を含み、これは酵素の不十分な活性に起因する様々な状態において有用である。例えば、マンノース－６－リン酸を含む酵素は、リソソーム蓄積症の治療に利用され得る（例えば、好適な遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子を含む）。
本明細書に提供されるｍｉＲ標的化配列を有するｒＡＡＶ含有ベクターゲノムを介して送達され得る更なる例示的な遺伝子としては、限定されないが、グルコース－６－ホスファターゼ（糖原病又は１Ａ型欠損症（ＧＳＤ１）に関連する）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ、ＰＥＰＣＫ欠損症に関連する、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５、発作及び重度神経発達障害に関連するセリン／スレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られる、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ガラクトース血症に関連する）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連する）、分岐鎖αケト酸脱水素酵素（メープルシロップ尿症に関連する）、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（チロシン血症１型に関連する）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（メチルマロン酸血症に関連する）、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症に関連する）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連する）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１、シトルリン血症に関連する）、レシチン・コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ、欠乏症）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ニーマン・ピック病、Ｃ１型）、プロピオン酸血症（ＰＡ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質（家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する）、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ（クリグラー・ナジャー病に関連する）、アデノシンデアミナーゼ（重症複合免疫不全症に関連する）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（痛風及びレッシュ・ナイハン症候群に関連する）、ビ
オチミダーゼ（ビオチミダーゼ欠損症に関連する）、アルファ－ガラクトシダーゼＡ（ａ－Ｇａｌ Ａ、ファブリー病に関連する）、ＡＴＰ７Ｂ（ウィルソン病に関連する）、ベータ－グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病２型及び３型に関連する）、ペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ（ツェルウェーガー症候群に関連する）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ、異染性白質ジストロフィーに関連する）、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ、クラッベ病に関連する酵素）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に関連する）、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１、ニーマン・ピック病Ａ型に関連する遺伝子）、アルギニノコハク酸シンターゼ（成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ２）に関連する）、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１、尿素サイクル異常症に関連する）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質（脊髄性筋萎縮症に関連する）、セラミダーゼ（ファーバー脂肪肉芽腫症に関連する）、ｂ－ヘキソサミニダーゼ（ＧＭ２ガングリオシドーシス及びテイ・サックス病及びサンドホフ病に関連する）、アスパルチルグルコサミニダーゼ（アスパルチルグルコサミン尿症に関連する）、ａ－フコシダーゼ（フコシドーシスに関連する）、α－マンノシダーゼ（アルファ－マンノシドーシスに関連する）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連する）、アルファ－１アンチトリプシン（アルファ－１アンチトリプシン欠損症（肺気腫）の治療用）、エリスロポエチン（サラセミア又は腎不全による貧血の治療用）、血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、及び線維芽細胞増殖因子（虚血性疾患の治療用）、トロンボモジュリン及び組織因子経路阻害因子（例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は塞栓症で見られる閉塞した血管の治療用）、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（パーキンソン病の治療用）、ベータアドレナリン受容体、ホスホランバンに対するアンチセンス若しくはその変異体、筋（小胞体）アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、及び心臓アデニル酸シクラーゼ（うっ血性心不全の治療用）、腫瘍抑制因子遺伝子（ｐ５３など、様々ながんの治療用）、サイトカイン（様々なインターロイキンのうちの炎症性及び免疫障害及びがんの治療用のものなど）、ジストロフィン若しくはミニジストロフィン及びユートロフィン若しくはミニユートロフィン（筋ジストロフィーの治療用）、並びにインスリン又はＧＬＰ－１（糖尿病の治療用）から選択される遺伝子と作動可能に連結される。更なる目的の遺伝子及び疾患としては、例えば、遺伝性感覚及び自律神経失調症ＶＩ型などのジストニン遺伝子関連疾患（ＤＳＴ遺伝子はジストニンをコードする、タンパク質のサイズ（約７５７０ａａ）により必要とされ得るデュアルＡＡＶベクター、痛みを感じることができなくなる機能変異体の欠失、及び肢端紅痛症などの痛み状態を引き起こす機能変異体の獲得などのＳＣＮ９Ａ関連疾患を含む。別の状態は、ＮＥＦＬ遺伝子（ニューロフィラメント軽鎖）における変異によるＣｈａｒｃｏｔ－Ｍａｒｉｅ－Ｔｏｏｔｈ １Ｆ型及び２Ｅ型であり、可変性の臨床的及び電気生理学的発現を伴う進行性末梢運動及び感覚性ニューロパシーによって特徴付けられる。特定の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、ムコ多糖症（ＭＰＳ）障害の治療において使用され得る。かかるベクターは、ＭＰＳ
Ｉ（ハーラー、ハーラー・シャイエ及びシャイエ症候群）を治療するためのα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）を治療するためのイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）をコードする核酸配列、ＭＰＳＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ（サンフィリッポ症候群）を治療するためのスルファミダーゼ（ｓｕｌｆａｍｉｄａｓｅ）（ＳＧＳＨ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＩＶ Ａ及びＢ（モルキオ症候群）を治療するためのＮ－アセチルガラクトサミン－６－硫酸スルファターゼ（ＧＡＬＮＳ）をコードする核酸配列、ＭＰＳ ＶＩ（マロトー・ラミー症候群）を治療するためのアリールスルファターゼＢ（ＡＲＳＢ）をコードする核酸配列、ＭＰＳＩ ＩＸ（ヒアルロニダーゼ欠損症）を治療するためのヒアルロニダーゼをコードする核酸配列、並びにＭＰＳ ＶＩＩ（スライ症候群）を治療するためのベータグルクロニダーゼをコードする核酸配列を運ぶことを含み得る。例えば、ｗｗｗ．ｏｒｐｈａ．ｎｅｔ／ｃｏｎｓｏｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｓｅａｒｃｈ＿Ｌｉｓｔ．ｐｈｐ；
ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓを参照され
たい。
ｍｉＲ標的化配列に作動可能に連結され得る発現カセット又はベクターゲノム中の他の好適な遺伝子の例としては、例えば、ホルモン並びに増殖因子及び分化因子を挙げることができ、限定されないが、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ１）、成長ホルモン（ＧＨ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アンジオポエチン、アンジオスタチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）（例えば、ヒト、イヌ、又はネコｅｐｏを含む）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、神経栄養因子、例えば、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、トランスフォーミング増殖因子αスーパーファミリーのうちのいずれか１つ（ＴＧＦα、アクチビン、インヒビンを含む）、又は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ １～１５のうちのいずれか、成長因子のヘレグリン／ニューレグリン／ＡＲＩＡ／ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）ファミリーの増殖因子のうちのいずれか１つ、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィンＮＴ－３及びＮＴ－４／５、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、アグリン、セマフォリン／コラプシンのファミリーのうちのいずれか１つ、ネトリン１及びネトリン２、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、エフリン、ノギン、ソニックヘッジホッグ、及びチロシンヒドロキシラーゼが挙げられ得る。
他の有用な導入遺伝子産物としては、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ－１～ＩＬ－３６（例えば、ヒトインターロイキンＩＬ－１、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１８、ＩＬ－３１、ＩＬ－３５）、単球走化性タンパク質、白血病阻害因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｆａｓリガンド、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β、及びγ、幹細胞因子、ｆｌｋ－２／ｆｌｔ３リガンドなどのサイトカイン並びにリンホカインを含むがこれらに限定されない免疫系を制御するタンパク質が含まれる。免疫系によって産生される遺伝子産物も本発明において有用である。これらには、免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、一本鎖Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びクラスＩＩ ＭＨＣ分子、並びに操作された免疫グロブリン及びＭＨＣ分子が含まれるがこれらに限定されない。例えば、特定の実施形態では、ｒＡＡＶ抗体は、例えば、抗ＩｇＥ、抗ＩＬ３１、抗ＣＤ２０、抗ＮＧＦ、抗ＧｎＲＨなどのイヌ又はネコ抗体を送達するように設計され得る。有用な遺伝子産物としては、補体調節タンパク質、膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、ＣＲ１、ＣＦ２、ＣＤ５９、及びＣ１エステラーゼ阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）などの補体制御性タンパク質も含まれる。更に他の有用な遺伝子産物としては、ホルモン、成長因子、サイトカイン、リンホカイン、制御性タンパク質、及び免疫系タンパク質の受容体のうちのいずれか１つが含まれる。本発明は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）受容体、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）受容体、及びスカベンジャー受容体を含む、コレステロール制御及び／又は脂質調節のための受容体を包含する。本発明はまた、糖質コルチコイド受容体及びエストロゲン受容体、ビタミンＤ受容体及び他の核受容体を含むステロイドホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーなどの遺伝子産物を包含する。加えて、有用な遺伝子産物としては、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍａｘ、ｍａｄ、血清応答因子（ＳＲＦ）、ＡＰ－１、ＡＰ２、ｍｙｂ、ＭｙｏＤ及びミオゲニンなどの転写因子、タンパク質を含むＥＴＳボックス、ＴＦＥ３、Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＺＦ５、ＮＦＡＴ、ＣＲＥＢ、ＨＮＦ－４、Ｃ／ＥＢＰ、ＳＰ１、ＣＣＡＡＴボックス結合タンパク質、インターフェロン制御因子（ＩＲＦ－
１）、ウィルムス腫瘍タンパク質、ＥＴＳ結合タンパク質、ＳＴＡＴ、ＧＡＴＡボックス結合タンパク質、例えばＧＡＴＡ－３、並びに翼状螺旋タンパク質のフォークヘッドファミリーが含まれる。
ｄｒｇ－脱標的化配列は、遺伝子編集のための送達ベクターにおいて使用され得る。ｄｒｇ－脱標的化配列は、ヌクレアーゼの下流に送達され得る。一実施形態では、コード配列は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びクラスター化された規則的な間隔の短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）／エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１など）から選択されるヌクレアーゼをコードする。好適なメガヌクレアーゼの例は、例えば、米国特許８，４４５，２５１号、同第９，３４０，７７７号、同第９，４３４，９３１号、同第９，６８３，２５７号、及びＷＯ２０１８／１９５４４９に記載されている。他の好適な酵素としては、核酸プログラム様式でＲＮＡに結合することができるヌクレアーゼ不活性Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（Ｎｅｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｉｎ Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９，Ｃｅｌｌ，１６５（２）：Ｐ４８８－９６（Ａｐｒｉｌ ２０１６））、及び塩基エディター（例えば、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ
ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ，ｌｉｖｅｒ，ｒｅｔｉｎａ，ｈｅａｒｔ ａｎｄ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｍｉｃｅ ｖｉａ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４，９７－１１０（Ｊａｎ ２０２０））が挙げられる。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼではない。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼではない。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮではない。一実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼではない。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２４）ファミリーのメンバーである。特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、２２塩基対認識配列配列番号２５－ＣＡＡＡＡＣＧＴＣＧＴＧＡＧＡＣＡＧＴＴＴＧを認識し、切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＩ－ＣｒｅＩファミリーのメンバーである。例えば、ＷＯ２００９／０５９１９５を参照されたい。ＩＣｒｅＩ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計して、哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウイルスゲノムにおける部位を含む、広範に分散したＤＮＡ部位を標的とすることができる、モノ－ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計するための方法が記載された（ＷＯ２００７／０４７８５９）。
好適な遺伝子編集標的としては、例えば、限定されないが、肝臓発現遺伝子、例えば、プロプロテイン変換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）（コレステロール関連障害）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）（トランスサイレチンアミロイドーシス）、ＨＡＯ、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬｒ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）（リポタンパク質リパーゼ欠損症）、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、カルノシナーゼ（ＣＮ１）、スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ（ＳＭＰＤ１）（ニーマン・ピック病）、次亜酸グアニンホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）、分岐アルファ－ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤＣ）複合体（マップルシン病）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、カルバミルホスフェートシンテターゼ（ＣＰＳ１）、Ｎ－アセチルグルタミン酸シンテラーゼ（ＮＡＧＳ）、アルギニノコハク酸シンテラーゼ（シトルリン血症）、アルギノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）（アルギニノコハク酸尿症）、及びアルギナーゼ（ＡＧ）が挙げられる。
他の編集遺伝子標的としては、例えば、ヒドロキシメチルビランシンターゼ（ＨＭＢＳ）、カルバモイルシンセターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、アルギノコハク酸シンテターゼ、アルグノコハク酸リアーゼ（ａｒｇｕｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｌｙａｓｅ）欠乏症の治療のためのアルギノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、アルギナーゼ、フマル酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ－１アンチトリプシン、アカゲザルアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、アカゲザル絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、グルコース－６－ホスファターゼ、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ、シスタチオンベータ－シンターゼ、分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル－ｃｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ－グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシレート、肝ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ－タンパク質、Ｔ－タンパク質、嚢胞性線維症膜貫通制御因子（ＣＦＴＲ）配列、及びジストロフィン遺伝子産物［例えば、ミニ－又はマイクロ－ジストロフィン］が挙げられ得る。更に他の有用な遺伝子産物は、酵素補充療法に有用であり得るような酵素を含み、これは酵素の不十分な活性に起因する様々な状態において有用である。例えば、マンノース－６－リン酸を含む酵素は、リソソーム蓄積症の治療に利用され得る（例えば、好適な遺伝子は、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）をコードする遺伝子を含む）。別の例では、遺伝子産物は、ユビキチンタンパク質リガーゼ、グルコース－６－ホスファターゼ（糖原病又は１Ａ型欠損症（ＧＳＤ１）に関連する）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ、ＰＥＰＣＫ欠損症に関連する、サイクリン依存性キナーゼ様５（ＣＤＫＬ５、発作及び重度神経発達障害に関連するセリン／スレオニンキナーゼ９（ＳＴＫ９）としても知られる、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ（ガラクトース血症に関連する）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）（フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に関連する）、ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＧＯ／ＨＡＯ１）及びＡＧＸＴを含む１型原発性高酸素尿症に関連する遺伝子産物、ＢＣＫＤＨ、ＢＣＫＤＨ－Ｅ２、ＢＡＫＤＨ－Ｅ１ａ、及びＢＡＫＤＨ－Ｅ１ｂを含む分岐鎖αケト酸脱水素酵素（メープルシロップ尿症に関連する）、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ（チロシン血症１型に関連する）、メチルマロニルＣｏＡムターゼ（メチルマロン酸血症に関連する）、中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ（中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症に関連する）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症に関連する）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１、シトルリン血症に関連する）、レシチン－コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ、欠乏症）、メチルマロン酸血症（ＭＭＡ）、ＮＰＣ１ニーマン・ピック病、Ｃ１型に関連する）、プロピオン酸血症（ＰＡ）、ＴＴＲ（トランスチレチン（ＴＴＲ）関連遺伝性アミロイドーシスに関連する）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質（家族性高コレステロール血症（ＦＨ）に関連する）、ＬＤＬＲバリアント（例えばＷＯ２０１５／１６４７７８に記載）、ＰＣＳＫ９、ＡｐｏＥ及びＡｐｏＣタンパク質（認知症に関連する）、ＵＤＰ－グルクロノシルトランスフェラーゼ（クリグラー・ナジャー病に関連する）、アデノシンデアミナーゼ（重症複合免疫不全症に関連する）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（痛風及びレッシュ・ナイハン症候群に関連する）、ビオチミダーゼ（ビオチミダーゼ欠損症に関連する）、アルファ－ガラクトシダーゼＡ（ａ－Ｇａｌ Ａ、ファブリー病に関連する）、ベータ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）（ＧＭ１ガングリオシドーシスに関連する）、ＡＴＰ７Ｂ（ウィルソン病に関連する）、ベータ－グルコセレブロシダーゼ（ゴーシェ病２型及び３型に関連する）、ペルオキシソーム膜タンパク質７０ｋＤａ（ツェルウェーガー症候群に関連する）、アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ、異染性白質ジストロフィーに関連する）、ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ、クラッベ病に関連する酵素）、アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＡ、ポンペ病に関連する）、スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１、ニーマン・ピック病Ａ型、ニーマン・ピック病Ｂ型、ニーマン・ピック病Ｃ型に関連する遺伝子）、アルギニノコハク酸シンターゼ（成人発症ＩＩ型シトルリン血症（ＣＴＬＮ
２）に関連する）、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳ１、尿素サイクル異常症に関連する）、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質（脊髄性筋萎縮症に関連する）、セラミダーゼ（ファーバー脂肪肉芽腫症に関連する）、ｂ－ヘキソサミニダーゼ（ＧＭ２ガングリオシドーシス及びテイ・サックス病及びサンドホフ病に関連する）、アスパルチルグルコサミニダーゼ（アスパルチルグルコサミン尿症に関連する）、α－フコシダーゼ（フコシドーシスに関連する）、α－マンノシダーゼ（アルファ－マンノシドーシスに関連する）、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ（急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）に関連する）、アルファ－１アンチトリプシン（アルファ－１アンチトリプシン欠損症（肺気腫）の治療用）、エリスロポエチン（サラセミア又は腎不全による貧血の治療用）、血管内皮増殖因子、アンジオポエチン－１、及び線維芽細胞増殖因子（虚血性疾患の治療用）、トロンボモジュリン及び組織因子経路阻害因子（例えば、アテローム性動脈硬化症、血栓症、又は塞栓症で見られる閉塞した血管の治療用）、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）及びチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）（パーキンソン病の治療用）、パーキンソン病の治療用ＰＲＫＮ、ベータアドレナリン受容体、ホスホランバンに対するアンチセンス若しくはその変異体、筋（小胞体）アデノシントリホスファターゼ－２（ＳＥＲＣＡ２）、及び心臓アデニル酸シクラーゼ（うっ血性心不全の治療用）、腫瘍抑制因子遺伝子（ｐ５３など、様々ながんの治療用）、サイトカイン（様々なインターロイキンのうちの炎症性及び免疫障害及びがんの治療用のものなど）、ジストロフィン若しくはミニジストロフィン及びユートロフィン若しくはミニユートロフィン（筋ジストロフィーの治療用）、並びにインスリン又はＧＬＰ－１（糖尿病の治療用）から選択される遺伝子と作動可能に連結される。
タンパク質、ペプチド、又はポリペプチド（例えば、免疫グロブリンとして）の配列決定方法は、当業者に既知である。タンパク質の配列が分かると、ウェブベース及び市販のコンピュータプログラム、並びにアミノ酸配列を核酸コード配列に逆翻訳するサービスベースの企業が存在する。例えば、ＥＭＢＯＳＳ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｔ／で利用可能）、Ｇｅｎｅ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（ｇｅｎｅｉｎｆｉｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｓｍｓ／ｓｍｓ＿ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌで利用可能）、ＥｘＰａｓｙ（ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／で利用可能）による逆翻訳配列を参照されたい。一実施形態では、ＲＮＡ及び／又はｃＤＮＡコード配列は、ヒト細胞における最適な発現のために設計される。
特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、髄腔内又は全身的遺伝子療法投与後の神経変性を調節する、及び／又は二次的な背側脊髄軸索変性を減少させるための方法に有用である。したがって、本明細書に提供される組成物は、ＣＮＳへの遺伝子療法の送達に特に有用であるが、それらは、例えば、高用量の遺伝子療法がＤＲＧ形質導入及び毒性をもたらし得る全身ＩＶ送達を含む、他の送達経路にも有用であり得る。方法は、導入遺伝子及びｍｉＲＮＡ標的を含む発現カセット又はベクターゲノムを含む組成物を患者に送達することを伴う。
特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ＤＲＧにおける導入遺伝子発現を抑制する方法に有用である。特定の実施形態では、方法は、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現レベルを抑制するために、ｍｉＲ－１８３標的配列を含む発現カセット又はベクターゲノムを送達することを含む。特定の実施形態では、方法は、ＤＲＧにおける導入遺伝子発現を抑制するのに有用な発現カセット又はベクターゲノムを送達することを含み、発現カセット又はベクターゲノムは、少なくとも２個のｍｉＲ－１８３標的配列、少なくとも３個のｍｉＲ－１８３標的配列、少なくとも４個のｍｉＲ－１８３標的配列、少なくとも５個のｍｉＲ－１８３標的配列、少なくとも６個のｍｉＲ－１８３標的配列、又は少なくとも７個のｍｉＲ－１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、方法は、ＤＲＧにおける導入遺伝子発現を抑制するのに有用な発現カセット又はベクターゲノムを送達するこ
とを含み、発現カセット又はベクターゲノムは、８つのｍｉＲ－１８３標的配列を含む。特定の実施形態では、方法は、錐体ニューロン、プルキンエニューロン、顆粒細胞、紡錘ニューロン、介在神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、及び／又は上衣細胞のうちの１つ以上から選択される、ＣＮＳに存在する１つ以上の細胞における発現を増強する。
特定の実施形態では、網膜、内耳、及び嗅覚受容器の下位運動ニューロンにおける導入遺伝子の発現を送達及び／又は増強するのに有用な方法が提供され、１つ以上のｍｉＲ－１８３標的配列及び／又は複数のｍｉＲ－１８３標的配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含む発現カセット又はベクターゲノムを送達することを含む。特定の実施形態では、細胞又は組織は、肝臓又は心臓のうちの１つ以上であり得る。
更に別の実施形態では、ＣＮＳに存在する細胞に発現カセット又はベクターゲノムを送達することを含む方法が提供され、発現カセット又はベクターゲノムは、１つ以上のｍｉＲ－１８３標的配列を含み、トランス遺伝子（すなわち、異種遺伝子産物をコードする配列）を欠く。かかる実施形態では、ＣＮＳの細胞へのｍｉＲ－１８３の送達が達成される。特定の実施形態では、ｍｉＲ－１８３配列を含む発現カセット又はベクターゲノムの送達は、ＤＲＧ発現の抑制及びＣＮＳに存在する特定の他の細胞における遺伝子発現の増強をもたらす。
特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、ＣＮＳ以外の細胞における導入遺伝子の発現を増強するための方法に有用である。特定の実施形態では、ＣＮＳ以外の細胞における発現を増強する方法は、ｍｉＲ－１８２標的配列を含む発現カセット又はベクターゲノムを患者に送達することを含む。
一実施形態では、懸濁液は、約６．８～約７．３２のｐＨを有する。
これらの用量及び濃度の送達のために好適な体積は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人用に選択されてもよい。典型的には、新生児のために、好適な体積は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児のために、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択され得る。幼児のために、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの体積が選択され得る。小児のために、最大約３０ｍＬの体積が選択され得る。１０代前半及び１０代のために、最大約５０ｍＬの体積が選択され得る。更に他の実施形態では、患者は、約５ｍＬ～約１５ｍＬの体積での髄腔内投与を受けてもよく、これが選択されるか、又は約７．５ｍＬ～約１０ｍＬを受けてもよい。他の適切な体積及び投薬量が決定され得る。投薬量を調整して、任意の副作用に対する治療的利益のバランスをとり、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療適用に応じて変化し得る。
一実施形態では、本明細書に記載のｒＡＡＶを含む組成物は、脳質量１グラム当たり約１×１０９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０１４ＧＣの用量で投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、体重１ｋｇ当たり約１×１０９ＧＣ～体重１ｋｇ当たり約１×１０１３ＧＣの用量で全身に同時投与される。
一実施形態では、対象は、治療有効量の本明細書に記載の発現カセットを送達される。本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、標的細胞に送達し、標的細胞で発現させ、ＤＲＧ発現を特異的に脱標的化する遺伝子産物及びｍｉＲＮＡ標的配列をコードする核酸配列を含む発現カセットの量を指す。
様々な病態の治療のために送達するためのｒＡＡＶの使用は、以前に記載されている。
これらのｒＡＡＶの発現カセットは、例えば、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を低減する、並びに／又はＤＲＧ毒性及び／若しくは軸索障害を低減若しくは排除するように、本明細書に記載の８つのｍｉＲＮＡ標的配列（例えば、ｍｉＲ－１８３標的配列、ｍｉＲ－１８２標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）を含むように修飾され得る。ｍｉＲＮＡ標的配列を含むように修飾され得るｒＡＡＶベクターゲノムの例としては、ＷＯ２０１７／１３６５００（ＭＰＳＩ）、ＷＯ２０１７／１８１１１３（ＭＰＳＩＩ）、ＷＯ２０１９／１０８８５７（ＭＰＳＩＩＩＡ）、ＷＯ２０１９／１０８８５６（ＭＰＳＩＩＩＢ）、ＭＰＳＩＶ、ＭＰＳＶＩＩ、ＷＯ２０１７／１０６３５４（ＳＭＮ１）、ＷＯ２０１８／１６０５８５（ＳＭＮ１）に記載の遺伝子、ＣＬＮ１、ＣＬＮ２、ＣＬＮ３、ＣＬＮ４、ＣＬＮ５、ＣＬＮ６、ＣＬＮ８（例えば、ＷＯ２０１８／２０９２０５（バッテン病）、ＷＯ２０１５／１６４７２３（抗ＨＥＲ２抗体のＡＡＶ媒介性送達を参照されたい）によって引き起こされるバッテン病を含む。
他の好適な導入遺伝子としては、例えば、ＷＯ２０１５／１３８３４８（ＯＴＣ）、ＷＯ２０１５／１６４７７８（ＦＨのＬＤＬＲバリアント）、ＷＯ２０１７／１０６３４５（Ｃｒｉｇｌｅｒ－Ｎａｊｊａｒ）、ＷＯ２０１７／１０６３２６（抗ＰＣＳＫ９ Ａｂ）、ＷＯ２０１７／１８０８５７（血友病Ａ、第ＶＩＩＩ因子）、ＷＯ２０１７／１８０８６１（血友病Ｂ、第ＩＸ因子）、並びに筋細管ミオパチーの治療用の試験におけるベクター（ＡＴ１３２、ＡＡＶ８、Ａｕｄｅｎｔｅｓなど）が挙げられ得る。
本明細書に記載の導入遺伝子及び複数のｍｉＲ標的配列を含む発現カセット又はベクターゲノムは、本明細書に記載されるように生成され得る。特定の実施形態では、８つのｍｉＲ標的化配列（例えば、４×ｍｉＲ－１８２標的化配列＋４×ｍｉＲ－１８３標的化配列、又は他の組み合わせ）を含む発現カセットは生成され得る。他の実施形態では、ｍｉＲ標的化配列の様々な組み合わせが生成され得る。好適には、これらの発現カセット及びベクターゲノムは、好適なウイルス（例えば、ＡＡＶ）キャプシドにパッケージングされる。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ＡＡＶ．ＩＤＵＡ）遺伝子療法ベクターは、ＩＤＵＡ遺伝子のコード配列（例えば、配列番号１５のｎｔ１９３８～３９０８を参照されたい）に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の複数のコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．イズロン酸－２－スルファターゼ（ＡＡＶ．ＩＤＳ）遺
伝子療法ベクターは、ＩＤＳ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ（ＡＡＶ．ＳＧＳＨ）遺伝子療法ベクターは、ＳＧＳＨ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼ（ＡＡＶ．ＮＡＧＬＵ）遺伝子療法ベクターは、ＮＡＧＬＵ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する
追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．生存運動ニューロン１（ＡＡＶ．ＳＭＮ１）遺伝子療法ベクターは、ＳＭＮ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．トリペプチジルペプチダーゼ１（ＡＡＶ．ＴＰＰ１）遺伝子療法ベクターは、ＴＰＰ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の複数のコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．抗ヒト上皮増殖因子受容体２抗体（ＡＡＶ．抗ＨＥＲ２
）遺伝子療法ベクターは、抗ＨＥＲ２抗体のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．オルニチントランスカルバミラーゼ（ＡＡＶ．ＯＴＣ）遺伝子療法ベクターは、ＯＴＣ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．低密度リポタンパク質受容体（ＡＡＶ．ＬＤＬＲ）遺伝子療法ベクターは、ＬＤＬＲ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し
得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ウリジン二リン酸グルクロノシルトランスフェーゼ１Ａ１（ＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１）遺伝子療法ベクターは、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．抗プロタンパク質転換酵素サブチリシン．／ケキシン９型抗体（ＡＡＶ．抗ＰＣＳＫ９ Ａｂ）遺伝子療法ベクターは、抗ＰＣＳＫ９ Ａｂ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．因子ＶＩＩＩ（ＡＡＶ．ＦＶＩＩＩ）遺伝子療法ベクターは、ＦＶＩＩＩ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つの標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．因子ＩＸ（ＡＡＶ．ＩＸ）遺伝子療法ベクターは、ＦＩＸ遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つのｍｉＲ標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
特定の実施形態では、ＡＡＶ．ミオチューブラリン１（ＡＡＶ．ＭＴＭ１）遺伝子療法ベクターは、ＭＴＭ１遺伝子のコード配列に作動可能に連結されたｍｉＲＮＡ１８３クラスター（ｍｉＲ－１８２標的配列、及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせを含む）の８つの標的配列を含むベクターゲノムを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、同じｍｉＲ標的配列の複数のコピーを含み、各々は、スペーサー（同じであってもよく、又は互いに異なってもよい）によって分離されている。別の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列の３～６つのコピーを含み、任意選択的に、標的配列のうちの１つ以上は、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーに少なくとも約８０％～約９９％相補的である。別の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３標
的配列の１、２、３、又は４つのコピーを含む。かかるベクターゲノムは、任意選択的に、ｍｉＲ－１８３クラスターのメンバーに対応する追加の標的配列を含有し得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの単一のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの２つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも１つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ－１８３クラスターメンバーの３つのｍｉＲ標的配列、及び任意選択的に、少なくとも２つのスペーサーを含有する。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、互いに配列が異なるｍｉＲ－１８３クラスターの２つ以上のｍｉＲ標的配列を含有する。特定の実施形態では、本明細書に記載のベクターゲノムは、非ＡＡＶベクターによって担持される。
一実施形態では、発現カセットは、ベクターゲノム中、その範囲及びエンドポイント内の全ての整数又は分数量を含め、脳質量１グラム当たり約１×１０９ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ）の量で送達される。別の実施形態では、投薬量は、脳質量１グラム当たり１×１０１０ＧＣ～脳質量１グラム当たり約１×１０１３ＧＣである。特定の実施形態では、患者に投与されるベクターの用量は、少なくとも約１．０×１０９ＧＣ／ｇ、約１．５×１０９ＧＣ／ｇ、約２．０×１０９ＧＣ／ｇ、約２．５×１０９ＧＣ／ｇ、約３．０×１０９ＧＣ／ｇ、約３．５×１０９ＧＣ／ｇ、約４．０×１０９ＧＣ／ｇ、約４．５×１０９ＧＣ／ｇ、約５．０×１０９ＧＣ／ｇ、約５．５×１０９ＧＣ／ｇ、約６．０×１０９ＧＣ／ｇ、約６．５×１０９ＧＣ／ｇ、約７．０×１０９ＧＣ／ｇ、約７．５×１０９ＧＣ／ｇ、約８．０×１０９ＧＣ／ｇ、約８．５×１０９ＧＣ／ｇ、約９．０×１０９ＧＣ／ｇ、約９．５×１０９ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約２．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１０ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１０ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約２．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１１ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１１ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約２．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１２ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１２ＧＣ／ｇ、約１．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約１．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約２．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約２．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約３．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約３．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約４．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約４．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約５．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約５．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約６．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約６．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約７．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約７．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約８．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約８．５×１０１３ＧＣ／ｇ、約９．０×１０１３ＧＣ／ｇ、約９．５×１０１３ＧＣ／ｇ、又は約１．０×１０１４ＧＣ／ｇ脳質量である。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ標的配列含有組成物は、患者が必要
とする免疫抑制性併用療法の用量、持続時間、及び／又は量を最小限に抑える。現在、そのような併用療法のための免疫抑制剤としては、グルココルチコイド、ステロイド、代謝拮抗剤、Ｔ細胞阻害剤、マクロライド（例えば、ラパマイシン若しくはラパログ）、及び細胞分裂阻害剤（アルキル化剤を含む）、代謝拮抗剤、細胞傷害性抗生物質、抗体、イムノフィリンに対して活性のある物質が挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、白金化合物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ＩＬ－２受容体（ＣＤ２５）特異的抗体又はＣＤ３特異的抗体、抗ＩＬ－２抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、オピオイド、又はＴＮＦ－α（腫瘍壊死因子－アルファ）結合剤を含み得る。特定の実施形態では、免疫抑制療法は、遺伝子療法投与の０、１、２、７日前、又はそれ以前に開始され得る。かかる療法は、同じ日に２つ以上の薬剤、（例えば、プレドネリゾン、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／又はシロリムス（すなわち、ラパマイシン）の同時投与を含み得る。これらの薬物のうちの１つ以上が、遺伝子療法投与後に、同じ用量又は調整された用量で継続され得る。かかる療法は、約１週間（７日間）、約６０日間であり得る。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｍｉＲ標的配列含有組成物は、遺伝子療法（例えば、ｒＡＡＶ）ベクターの送達前、送達中、又は送達後の免疫抑制療法の必要性を排除する。
一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットを含む組成物は、必要とする対象に１回投与される。特定の実施形態では、発現カセットは、ｒＡＡＶを介して送達される。
方法の記載が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。
６．キット
特定の実施形態では、キットが提供され、製剤（任意選択的に、凍結される）中に懸濁された濃縮された発現カセット（例えば、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターで）を含み、任意選択的な希釈緩衝液、並びに髄腔内、脳室内、又は大槽内投与に必要とされるデバイス及び構成要素が提供される。別の実施形態では、キットは、追加的に又は代替的に、静脈内送達のための構成要素を含み得る。一実施形態では、キットは、注入を可能にするために、十分な緩衝液を提供する。そのような緩衝液は、濃縮されたベクターの約１：１～１：５希釈、又はそれ超の希釈を可能にし得る。他の実施形態では、より多量若しくはより少量の緩衝液又は滅菌水が含まれ、治療を行う医師により、用量滴定及び他の調整が可能になる。更に他の実施形態では、キットには、デバイスの１つ以上の構成要素が含まれる。好適な希釈緩衝液、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はグリセロール／ＰＢＳが利用可能である。
キットの記載が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。
７．デバイス
一態様では、本明細書に提供される組成物は、例えば、ＷＯ２０１７／１３６５００（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている方法及び／又はデバイスを介して髄腔内投与され得る。代替的に、他のデバイス及び方法が選択され得る。要約すると、方法は、脊椎針を患者の大槽内に前進するステップと、１本の可撓性チューブを脊椎針の近位ハブに連結し、バルブの出口ポートを可撓性チューブの近位端に連結するステップと、当該前進ステップ及び連結ステップ後、チューブを患者の脳脊髄液で自吸させた後で、一定量の等張溶液を含む第１の容器をバルブのフラッシュ入口ポートに連結するス
テップと、その後、一定量の医薬組成物を含む第２の容器をバルブのベクター入口ポートに連結するステップと、を含む。第１及び第２容器をバルブに連結した後、流体流れのための通路は、ベクター入口ポートとバルブの出口ポートとの間に開かれ、医薬組成物は脊椎針を通して患者に注入され、医薬組成物の注入後、流体流れのための通路は、フラッシュ入口ポートとバルブの出口ポートを通って開かれ、等張溶液は、医薬組成物を患者にフラッシュするために脊椎針中に注入される。この方法及びこのデバイスは、各々任意選択的に、本明細書に提供される組成物の髄腔内送達のために使用され得る。代替的には、他の方法及びデバイスが、かかる髄腔内送達のために使用され得る。
デバイスの記載が、本明細書にわたって記載される他の組成物、レジメン、態様、実施形態及び方法に適用されるように意図されることを理解されたい。
ここで、以下の実施例を参照しながら、本発明を説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明がこれらの実施例に限定されるものとして決して解釈されるべきではなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形例を包含すると解釈されるべきである。
実施例１：方法
動物
動物手順は全て、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ Ｍｕｌａｔｔａ）は、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ（Ａｌｉｃｅ，ＴＸ）及びＰｒｉｍｇｅｎ／Ｐｒｅｌａｂｓ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｈｉｎｅｓ，ＩＬ）から調達した。動物は、国際実験動物管理評価認証協会（ＡＡＡＬＡＣ）認定のペンシルベニア大学の非ヒト霊長類研究プログラム施設内に、ステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚及び聴覚刺激、操作、及び社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。
Ｃ５６ＢＬ／６Ｊマウス（ストック番号０００６６４）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。動物を、豊かさを伴う１ケージ当たり２～５匹の標準的なケージで、ペンシルベニア大学の遺伝子療法プログラムでＡＡＡＬＡＣ国際認定のマウス用バリアビバリウムに収容した（Ｎｅｓｔｌｅｔｓ巣材）。バリア施設のケージ、給水瓶、及び床敷は、オートクレーブ処理し、ケージは、週に１回交換された。自動制御された１２時間の明暗サイクルが維持された。各暗期は、１９：００時（±３０分）に開始した。放射線照射された実験用げっ歯類の餌は、自由摂食で提供された。
ベクター
ＡＡＶ９．ＰＨＰ．Ｂトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／ＰＨＰ．Ｂ）は、製造元のマニュアルに従って、ｐＡＡＶ２／９（Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ）を鋳型として使用して、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異導入キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡカタログ番号２１０５１５）で生成した。ｐＡＡＶ２／９及びｐＡＡＶ２／ｈｕ６８は、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって提供された。ＡＡＶベクターを作製し、Ｐｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって滴定した（Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１：１２５９－１２７１，２０１０に以前に記載されている）。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を収集して濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。精製したベクターを、以前に記載されているように、ウサギベータ－グロビンポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、デジタルドロップレ
ットＰＣＲで滴定した（Ｌｏｃｋ，Ｍ．，ｅ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５：１１５－１２５，２０１４）。ヒトアルファ－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）配列は、ｈＩＤＵＡアイソフォームの前駆タンパク質配列ＮＰ＿０００１９４．２の逆翻訳及びコドン最適化を通して取得し、ＣＢ７プロモーター下でクローニングした。後根神経節（ＤＲＧ）濃縮マイクロＲＮＡ配列を、ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ．において入手可能な公開データベースから選択した。ＤＲＧ濃縮ｍｉＲの標的の４つのタンデムリピートを、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｈＩＤＵＡシスプラスミドの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）にクローニングした。
インビボ試験
マウスは、ｍｉＲ標的の有無にかかわらず、０．１ｍＬ中、１×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ、５×１０１３ＧＣ／ｋｇ）のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、又は４×１０１２ＧＣ（２×１０１４ＧＣ／ｋｇ）の強化ＧＦＰをコードするＡＡＶ９ベクターを、外側尾静脈を介して受け、注入の２１日後、ＣＯ２の吸入によって安楽死させた。組織を、脳から始めて迅速に収集し、１０％の中性緩衝ホルマリンで約２４時間浸漬固定し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で短時間洗浄し、４℃でＰＢＳ中の１５％及び３０％スクロースで順次平衡化した。次いで、組織を最適な切断温度の包埋媒体で凍結し、直接ＧＦＰ可視化用に凍結切片を作製した（脳は、３０μｍで切片化し、他の組織は、８μｍ厚で切片化した）。画像は、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ－Ｅ蛍光顕微鏡を用いて取得した。ＤＲＧにおけるＧＦＰ発現を、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって分析した。ＤＲＧを含む脊柱をホルマリン中で２４時間固定し、軟質になるまで１０％のエチレンジアミン四酢酸（ｐＨ７．５）中で脱灰し、標準プロトコルに従ってパラフィン包埋した。切片を、エタノール及びキシレンシリーズを通して脱パラフィン化し、１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で６分間沸騰し、抗原賦活化を行い、２％のＨ２Ｏ２（１５分間）、アビジン／ビオチンブロッキング試薬（各１５分間；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）、及びブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中に１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎ、１０分間）で順次ブロッキングした後、ブロッキング緩衝液に希釈された一次抗体（３７℃で１時間）及びビオチン化二次抗体（１：５００希釈、４５分間；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）でインキュベーションした。ＧＦＰに対するウサギ抗体を一次抗体として使用した（ＮＢ６００－３０８，Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ，ＣＯ；１：５００希釈）。ＤＡＢを基質として用いるＶｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）は、結合した抗体を、褐色沈殿物として可視化することを可能にした。
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）は、透視ガイダンス下で、３．５×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＧＦＰベクター、又は１×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡベクターを受け、１ｍＬの総容量で大槽内に注入された（Ｋａｔｚ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９：２１２－２１９，２０１８によって、以前に記載されているように）。安全性の読み取りのために、定期的な採血及び脳脊髄液（ＣＳＦ）タップを行った。血清化学、血液学、凝固、及びＣＳＦの分析は、契約施設のＡｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＣ）によって行われた。動物を、静脈内ペントバルビタール過剰投与で安楽死させ、剖検した。次いで、網羅的な組織病理学的検査用に、組織を採取した。回収した組織を直ちにホルマリンに固定し、パラフィン包埋した。組織病理のために、組織切片を、標準プロトコルに従って、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ＧＦＰ発現のためのＩＨＣは、マウスの研究で記載されているように行ったが、ＧＦＰに対して異なる抗体を使用した（ヤギ抗体、ＮＢ１００－１７７０、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；１：５００希釈、４℃で一晩のインキュベーション）。ｈＩＤＵＡに対する免疫染色は、ＩＨＣに関する上記のプロトコルに従って、ｈＩＤＵＡに対するヒツジ抗体（ＡＦ４１１９，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎ
ｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；１：２００希釈）を使用して行った。加えて、切片を、同じ一次抗体を使用して、免疫蛍光（ＩＦ）によってｈＩＤＵＡに対して染色した。ＩＦの場合、切片を、上に記載のように脱パラフィン化し、抗原賦活化用に処理し、次いで、ＰＢＳ中１％のロバ血清＋０．２％のＴｒｉｔｏｎで１５分間ブロッキングした後、ブロッキング緩衝液に希釈された一次抗体（室温で２時間、１：５０希釈）及びＦＩＴＣ標識二次抗体（４５分間、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：１００希釈）を用いて、順次インキュベーションした。ＤＡＰＩを核の対比染色に用い、切片を、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ Ｇ中でマウントした。
インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、内因性サルＩＤＵＡのＲＮＡに結合しないベクターゲノムから転写されたコドン最適化ＲＮＡに特異的なプローブを使用して行った。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によってＺ字型プローブ対を合成し、製造元のプロトコルに従って、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＶｉｅｗＲＮＡ ＩＳＨ 組織アッセイキットを使用して、パラフィン切片上でＩＳＨを行った。陽性シグナルを示すＦａｓｔ Ｒｅｄ沈殿物の析出を、ローダミンフィルターセットを使用した蛍光顕微鏡によって画像化した。ＩＤＵＡのＩＨＣを用いた組織切片を、Ａｐｅｒｉｏ Ｖｅｒｓａスライドスキャナー（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して定量化の目的でスキャンした。
組織病理及び形態測定
ベクター群に対して盲検化された委員会認定の獣医病理学者が、重症度グレードを確立し、以下の定義がなされた：病変の不在として０、最小（１０％未満）として１、２軽度（１０～２５％）、３中等度（２５～５０％）、４顕著（５０～９５％）、及び５重度（９５％超）。背側軸索障害スコアは、各動物において、少なくとも３つの頸部切片、３つの胸部切片、及び３つの腰部切片から確立された。ＤＲＧ重症度グレードは、少なくとも３つの頸部セグメント、３つの胸部セグメント、及び３つの腰部セグメントから確立された。中央値神経スコアは、軸索障害及び線維症の重症度グレードの合計であり、最大可能スコアが１０で、左及び右の神経の遠位部及び近位部で確立された。導入遺伝子発現の定量化のために、委員会認定獣医病理学者は、未処置の動物から得られた対照スライドからのシグナルと比較することによって、抗ＧＦＰ抗体又は抗ｈＩＤＵＡ抗体で免疫染色された細胞をカウントした。２０倍の倍率視野当たりの陽性細胞の総数を、ＩｍａｇｅＪ細胞計数ツールを使用して、構造当たり及び動物当たりで、少なくとも５つの視野上でカウントした。
ベクター生体分布
ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ カタログ番号５１３０６）でＮＨＰ組織ＤＮＡを抽出し、ベクターゲノムを、Ｔａｑｍａｎ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）及びベクターのｒＢＧポリアデニル化配列を標的とするプライマー／プローブを使用して、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。
免疫学
ｈＩＤＵＡに対する末梢血Ｔ細胞応答を、ｈＩＤＵＡ導入遺伝子に特異的なペプチドライブラリを使用して、以前に公開された方法に従ってインターフェロンガンマ酵素結合免疫吸着スポットアッセイによって測定した（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）。陽性応答の基準は、１０６リンパ球当たり＞５５スポット形成単位、かつ未刺激時の培地陰性対照の３倍であった。加えて、Ｔ細胞応答を、試験９０日目に、剖検後、脾臓、肝臓、及び深部頸部リンパ節から抽出したリンパ球においてアッセイした。血清中のｈＩＤＵＡに対する抗体を測定した（１：１，０００試料希釈）（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３：１２９８－１３０７，２０１５によって以前に記載されてい
るように）。
サイトカイン／ケモカイン分析：ＣＳＦ試料を回収し、分析時まで－８０Ｃで貯蔵した。ＣＳＦ試料を、以下の分析物を含むＭｉｌｌｉｐｌｅｘ ＭＡＰキットを使用して分析した：ｓＣＤ１３７、エオタキシン、ｓＦａｓＬ、ＦＧＦ－２、フラクタルカイン、グランザイムＡ、グランザイムＢ、ＩＬ－１α、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｅ／ＩＬ－２５、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２８Ａ、ＩＬ－３１、ＩＬ－３３、ＩＰ－１０、ＭＩＰ－３α、パーフォリン、ＴＮＦβ。ＣＳＦ試料は、二重で評価し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＰＯＮＥＮＴ（登録商標）４．２、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ（商標）ソフトウェア６．１を使用して、ＦＬＥＸＭＡＰ ３Ｄ機器で分析した。分析には、２０％未満の％ＣＶを有する試料のみが含まれた。
インビトロ研究
ｍｉＲ－１８３ヒトマイクロＲＮＡ発現プラスミドは、ＯｒｉｇｅｎｅのＭＩ００００２７３ベクターから、ＧＦＰと部分的な内部リボソーム進入部位をコードするＫｐｎＩ－ＰｓｔＩ断片を欠失させることによって修飾された。我々は、一過性トランスフェクション及び抗ＧＦＰ免疫ブロットによって、修飾ベクターからのＧＦＰ発現が欠如していることを確認した。ＧＦＰ発現カセットの３’－ＵＴＲに位置するマイクロＲＮＡ結合部位を有するＧＦＰシスプラスミドを用いて、ＨＥＫ２９３細胞でポリエチレンイミン媒介性の一過性トランスフェクションを行った。トランスフェクションの７２時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で溶解した。合計１３μｇの細胞溶解物を、抗ＧＦＰ免疫ブロット、続いて電気化学発光に基づくシグナル検出及び定量化に使用した。統計解析用に三重で実験を行った。
統計分析
群間の統計学的差異を、ウィルコクソン順位和検定を使用して評価した。
実施例２：導入遺伝子発現のマイクロＲＮＡ媒介性阻害は、ＡＡＶによる後根神経節の毒性を低減する
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを血液又は脳脊髄液を介して非ヒト霊長類（ＮＨＰ）のＣＮＳに送達することは、後根神経節（ＤＲＧ）の毒性と関連する。これは、高効率の形質導入によって引き起こされる可能性があり、導入遺伝子産物の過剰産生から、小胞体ストレスが引き起こされ得る。本発明者らは、対応する導入遺伝子ｍＲＮＡの３’非翻訳領域内のベクターゲノムに、ｍｉＲＮＡ標的配列を導入することによって、ＣＮＳ特異的ＡＡＶ遺伝子療法に関連する毒性を排除するアプローチを開発した。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１４５（４コピー）．ウサギベータグロビン、３’ＩＴＲの発現カセットは、配列番号１０に提供される。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ－１８２（４コピー）．ウサギベータグロビン、３’ＩＴＲの発現カセットは、配列番号１１に提供される。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ－９６（４コピー）．ウサギベータグロビン、３’ＩＴＲは、配列番号１２に提供される。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３（４コピー）．ウサギベータグロビン、３’ＩＴＲは、配列番号１３に提供される。
ＡＡＶベクターは、ＮＨＰでＤＲＧ変性を引き起こす
ＮＨＰでのＤＲＧ毒性における経験に基づいて、毒性の重症度を定量化するシステムを開発した。本発明者らは、ＤＲＧの脊髄に沿って位置する細胞体、末梢神経内の軸索、及び背側白質路を上行する軸索を評価した（図１Ｂ）。原発性病変は、ＤＲＧに位置する感覚ニューロン細胞体の変性であると考えられる。病変は、組織学的に、好酸球増加症、不
規則な細胞形状、ニッスル物質の破壊（中心性色質融解）、及び単核細胞浸潤とともに核境界の喪失によって特徴付けられる（図１Ｂ）。高レベルの導入遺伝子タンパク質を発現している細胞は、変性を受ける可能性が高くなり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、図１Ｂ）を発現するＡＡＶベクターのＩＣＭ投与を受けた動物で、導入遺伝子産物を免疫染色することによって証明される。細胞体の死の二次的なものとして、軸索障害があり、それは、遠位軸索及び近位軸索の変性である。軸索障害は、軸索の欠損、細胞デブリを取り囲む膨張したミエリン鞘、及びマクロファージによって特徴付けられる（図１Ｂ）。図１Ｃは、異なるレベルのＤＲＧ毒性及び脊髄軸索障害の例を示す。グレードは、高倍率視野組織病理検査における罹患組織の割合に基づく。１最小（１０％未満）、２軽度（１０～２５％）、３中等度（２５～５０％）、４顕著（５０～９５％）、及び５重度（９５％を超える）。
本発明者らのこれまでの実績では、ＩＣＭ又は腰部穿刺（ＬＰ）経路を介してＣＳＦにＡＡＶベクターを投与された幼若／成体ＮＨＰは、２７件の研究にわたって総計で２１９匹のサルになり、これは、以前に公開された毒性試験（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）及び以下の実施例に記載されるＮＨＰ実験、並びにいくつかの未公開研究を包含している。この実績には、５つのカプシド、２０個の導入遺伝子、５つのプロモーター（ＣＡＧ、ＣＢ７、ＵＢＣ、ｈＳｙｎ、及びＭｅＰ４２６）、１×１０１２ＧＣ～３×１０１４ＧＣの用量、勾配又はカラムによって精製されたベクター、３つの製剤（リン酸緩衝食塩水及び２つの異なる人工ＣＳＦ）、並びに様々な発達段階のカニクイザル及びマカクザルが含まれる。全ての実験群において、ＤＲＧ毒性及び軸索障害が観察された。病的状態は、注入後約１ヶ月でピークに達し、最長６ヶ月間（成熟マカクで評価された最長期間である）進行しない。ほとんどの場合、病的状態は軽度から中等度である。しかしながら、ＧＦＰを発現するベクターを高用量でＩＣＭ注入すると、失調症に関連する重篤な病的状態を引き起こし得る。
ＤＲＧニューロンで特異的に発現されたｍｉＲＮＡは、ＡＡＶ導入遺伝子の発現を除去することができる
ＤＲＧ毒性を軽減する方法を検討する際、いくつかのメカニズムを評価した。以前の研究では、ヒトＩＤＵＡ又はヒトＩＤを発現するＡＡＶ９ベクターをＩＣＭ投与されたＮＨＰを免疫抑制することによって、形質導入されたＤＲＧに対する破壊的な適応免疫応答の役割を分析した。ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及びラパマイシンでの処置は、ベクター及び導入遺伝子産物に対する適応免疫応答を鈍化させたが、ＤＲＧ毒性及び軸索障害に顕著な影響を与えなかった（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）。
以前に調査されていない１つの可能性は、高度に形質導入されたＤＲＧにおける導入遺伝子産物の過剰発現が、細胞体及び関連する軸索の神経傷害及び変性、それに続く反応性炎症応答の原因であるかどうかである（図２Ａ）。したがって、ＤＲＧにおける導入遺伝子の発現を特異的に除去するために、ＤＲＧニューロンでのみ発現されるｍｉＲＮＡ標的を、導入遺伝子の３’非翻訳領域にクローニングした（図２Ｂ）。ベクターから発現される任意のｍＲＮＡは、内因的に発現されるｍｉＲＮＡによって破壊されるであろう。
ｍｉＲＮＡ戦略の活性及び特異性を評価するために、インビトロアッセイを使用した。発現カセットの３’非翻訳領域に標的ｍｉＲＮＡ配列の４反復（リピート）コンカテーマーを含むようにＡＡＶシスプラスミドを構築した（図２Ｂ）。ＡＡＶシスプラスミドを、
ｍｉＲ－１８３を発現するプラスミドとともに、ＨＥＫ２９３細胞にともトランスフェクションした。導入遺伝子であるＧＦＰの発現は、それが同種の認識配列を含む場合にのみ、ｍｉＲ－１８３の存在下で低減された（図３Ａ）。
ＡＡＶベクター内の潜在的なｍｉＲＮＡ標的のインビボ活性及び特異性を、Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスにおいてスクリーニングした。本発明者らは、ｍｉＲＮＡ－１８３複合体（ｍｉＲ－１８２及びｍｉＲ－１８３）並びにｍｉＲ－１４５のうちの２つのメンバー由来のｍｉＲＮＡ標的の有無で、ＧＦＰ発現ベクターを評価した。最初、ｍｉＲ－１８３複合体の別のメンバーであるｍｉＲ－９６を試験したが、マウス皮質で導入遺伝子の発現が減少することから、それを排除した（示さず）。動物は、標的ＤＲＧへのＡＡＶ９の高用量静脈内（ＩＶ）注入、及びＣＮＳを標的とする高用量のＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ（ＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂ．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｒＢＧ）注入を受けた。動物を２１日目に剖検し、免疫組織化学（ＩＨＣ）及び脳及び肝臓における直接蛍光顕微鏡法によって、ＤＲＧにおけるＧＦＰの発現について分析した。ＤＲＧニューロンにおけるＧＦＰの発現は、ｍｉＲ－１８３標的及びｍｉＲ－１８２標的を含むベクターにより実質的に低減したが、ｍｉＲ－１４５標的は効果を有しなかった（図３Ｂ及び図３Ｃ）。ｍｉＲ標的のいずれかを含むベクターによる肝臓又は他のＣＮＳ区画における発現の明らかな低減はなかった。発現は、ｍｉＲ－１８３ベクターによりＣＮＳでわずかに増強されたようであった（図３Ｄ）。このマウス実験では、ベクター誘発性のＤＲＧ毒性がＮＨＰでのみ観察されたため、病的状態におけるｍｉＲ－１８３導入遺伝子の抑制の影響を評価することができなかった。
ｍｉＲ－１８３による限定された導入遺伝子の発現は、ＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性を低減する
マウスにおける心強いデータに基づいて、ＮＨＰでＧＦＰ ｍｉＲ－１８３発現カセットを評価した。本発明者らは、アカゲザルのＣＢ７プロモーター（３．５×１０１３ＧＣ）から、ＧＦＰ（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｒＢＧ）（Ｎ＝２）又はＧＦＰ ｍｉＲ－１８３（ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３．ｒＢＧ）（Ｎ＝４）を発現するＡＡＶｈｕ６８ベクターをＩＣＭ注入した。１４日目に、動物の半数を、ＧＦＰ発現について剖検した（図４Ｂ－ＧＦＰ発現についての代表的なＩＨＣ；図４Ｂ－発現の定量化）。残りの動物は６０日目に剖検して、発現及びＤＲＧ毒性を評価した（図４Ｃ－ＤＲＧ変性、背側脊髄軸索障害、及び末梢神経の軸索障害）。動物は、臨床的続発症を伴うことなく、ＩＣＭ投与ベクターに耐性を示した。ｍｉＲ－１８３ベクターを用いたＤＲＧにおけるＧＦＰ発現の統計学的に有意な減少、並びに他の箇所（腰部運動ニューロン、小脳、皮質、心臓、及び肝臓を含む）での増強又は同様の発現があった（図４Ａ及び図４Ｂ、表１）。これは、９つの領域にわたる病的状態の著しい低減と関連した（頸部、胸部、及び腰部脊椎におけるＤＲＧ並びに背側脊髄軸索障害、並びに正中神経、腓骨神経及び橈骨神経の軸索障害、図４Ｃ）。ベクターにｍｉＲ－１８３標的がない場合、全ての領域で病的状態が存在し、グレード４、グレード２、及びグレード１の間で均等に分布した。ｍｉＲ－１８３ベクターの場合、最大の病的状態はグレード２であり、領域のわずか１１％に存在し、残りの領域はグレード１（７２％）又は病理なし（１６％）のいずれかであった。
これらの研究で、ｍｉＲ－１８３標的を含むベクターにより、ＤＲＧ感覚ニューロンにおけるＧＦＰの発現が選択的に抑制されることが実証された。他のＣＮＳニューロン及び末梢臓器は影響を受けなかった。したがって、ＤＲＧ毒性及び二次軸索障害は、高度免疫原性／毒性導入遺伝子（ＧＦＰ）の文脈で、顕著／重度レベルから最小レベルに低減された。
実施例３：ｍｉＲＮＡ標的配列を有するベクターゲノムを含むＡＡＶを介した送達後のＤＲＧにおける治療用タンパク質の発現の特異的抑制
本発明者らは、ヒトＩＤＵＡ（Ｉ型ムコ多糖症を有する患者において欠損している酵素）を発現するベクターを使用して、ＮＨＰにおいて、ｍｉＲ－１８３標的配列を更に評価した。このヒト導入遺伝子を用いた研究が、ＮＨＰにおけるＤＲＧ毒性に初めて光を当てた（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）。実験には、３つの群が含まれた（Ｎ＝３／群）：１）群１－ｍｉＲ－１８３標的を含まない対照ベクター単独（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｒＢＧ）、２）群２－ステロイドで処置（－７日目～３０日目までプレドニゾロン１ｍｇ／ｋｇ／日、続いて漸進的な漸減）された動物におけるｍｉＲ－１８３標的を含まない対照ベクター（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｒＢＧ）、及び３）群３－ｍｉＲ－１８３標的を有するベクター（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｍｉＲ－１８３．ｒＢＧ）。全てのベクターゲノムには、ニワトリβ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサーエレメント（ＣＢ７プロモーターと称する）の制御下のｈＩＤＵＡコード配列、ニワトリβ－アクチンスプライスドナーからなるキメライトロン（ＣＩ）（９７３ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）、及びウサギβ－グロビンスプライスアクセプターエレメント、並びにウサギβグロビンポリアデニル化シグナル（ｒＢＧ、１２７ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００８８２．１）．ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムは、配列番号１４で提供されている。ＩＴＲ．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＩＤＵＡｃｏＶ１．ｍｉＲ－１８３．ｒＢＧ．ＩＴＲのベクターゲノムは、配列番号１５提供されている。全ての動物は、構成的プロモーターであるＣＢ７からｈＩＤＵＡを発現するＡＡＶｈｕ６８ベクター（３．５×１０１３ＧＣ）のＩＣＭ注入を受けた。ＧＦＰ発現のために、半数の動物を１４日目に剖検した。９０日目に剖検を行い、導入遺伝子の発現（表１の個々のデータポイント）及びＤＲＧ関連の毒性（表２の個々のデータポイント）を評価した。
全ての群由来の動物が、ベクター関連の臨床所見又は臨床病理学的な異常を有さず、ＩＣＭベクターに耐容性を示した（表３及び表４）。ＣＳＦ中の髄液細胞増多は非常に低く、第２群で１匹、第３群で１匹に限定された（表５）。Ｔ細胞応答（ＥＬＩＳＰＯＴによる測定）及びｈＩＤＵＡに対する抗体の両方が、３つの群全てにおいて検出された（図７Ａ～図７Ｄ）。ＣＳＦサイトカインは、注入後２１日目及び３５日目、群１と比較して群３で減少したが、一方、群２（ステロイド）では、２４時間でレベルが減少した（図８）。２１～３５日目が導入遺伝子のピーク発現に対応し、過剰発現誘発性のストレスが予想される時点である。免疫蛍光及びインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を使用して、対照ベクター（ｍｉＲ－１８３標的を含まない、図５及び図６Ａ）を使用した群１及び群２において、ＤＲＧにおいて高発現のｈＩＤＵＡが観察された。他のＣＮＳ区画では（脊髄の下位運動ニューロン並びに小脳及び皮質のニューロンを含む）、低レベルから中程度のｈＩＤＵＡの発現が検出された（図５及び図６Ａ）。ｍｉＲ－１８３標的をベクターに組み込むと（すなわち、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ－ｍｉｒ－１８３／群３）、免疫蛍光及び免疫組織化学によって強調されるように、ＣＮＳ（すなわち、脊髄、小脳、及び皮質）における発現を減少させることなく、ＤＲＧニューロンにおけるｈＩＤＵＡ発現が除去された（図５及び図６Ａ）。ｍＲＮＡレベル（図５）では、形質導入ニューロンにおける細胞質ＩＳＨシグナルは、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡを投与された動物の面積の４２％から、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ－ｍｉＲ－１８３を投与された動物の７％まで減少させ（図６Ａ）、これは８３％の低減を表している。ＣＮＳ及びＤＲＧ全体にわたるベクターの生体分布が、全ての群にわたって本質的に同じであったことから、ｍｉＲ－１８３によるＤＲＧにおけるｈＩＤＵＡ発現の低減は、遺伝子導入が減少したためではなかった（図９）。ステロイドは、群１と比較して、ＤＲＧ（ｐ＝０．０００１）における発現を中程度に減少させ、下位運動ニューロンにおける発現を増加させた（図５及び図６Ａ）。予想通り、対照ベクター（群１）との投与は、ＧＦＰ発現ベクターと比較して比較的穏やかなＤＲＧ、後側柱、及び末梢神経の病的状態を引き起こした。しかしながら、病的状態は、ｍｉＲ－１８３標的含有ベクター（群３、図６Ｂ）で形質導入された動物のＤＲ
Ｇ（ｐ＝０．０５８３）、後側柱（ｐ＜０．０００１）、及び末梢（正中）神経（ｐ＝０．０１３７）において、全く存在しなかった。ステロイド（群２）との併用治療は、親ベクター（すなわち、ｍｉＲ－１８３標的を含有しない）の毒性を低減させなかった（図６Ｂ）が、代わりに、末梢神経（ｐ＝０．０２５６）及び背側柱（ｐ＝０．０６６）において毒性を悪化させる傾向と関連があった。
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ＮＨＰにおけるＡＡＶ誘発性ＤＲＧ毒性は、神経細胞アポトーシスを介して生じる。
ＤＲＧにおけるニューロン変性の機序を検討するために、細胞アポトーシス及び折り畳
み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）のマーカーについて免疫組織化学（ＩＨＣ）を行った。初期の研究は、アポトーシスの下流マーカーであるカスパーゼ－３の活性化に焦点を当てた。Ｈ＆Ｅ評価に基づいて神経変性を示した動物のＤＲＧは、細胞浸潤の増加とともに、活性化カスパーゼ－３について陽性のＩＨＣ染色を示した。ＡＡＶ６注射されていない動物由来のＤＲＧ及び脾臓由来のＤＲＧは、それぞれ、陰性対照及び陽性対照として機能した。ＮＲＧにおけるカスパーゼ－３陽性ニューロンは、ｈＩＤＵＡ群と比較して、ＧＦＰ群において高かった。それぞれの場合において、ｍｉＲ－１８３標的配列を含むことで、活性化カスパーゼ－３を有する細胞の数が減少した。ＩＨＣによるカスパーゼ－８の上方制御を評価することによって、外因性経路と称されるものにおいて、適応免疫又は先天性免疫によって誘導されるアポトーシスを評価した。全てのベクター群にわたる変性神経細胞体は、活性化カスパーゼ－８に対して陰性であったが、浸潤細胞は、内部陽性対照として機能するカスパーゼ－８に対して強く陽性であった。切片を、内因性アポトーシスの共通マーカーであるカスパーゼ９の活性化についても評価した。ＩＨＣは、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰを受けた動物において、ＤＲＧの複数の変性神経細胞体においてカスパース（ｃａｓｐａｃｅ）－９を示した。しかしながら、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲＮＡを受け、神経変性を示した動物において、カスパーゼ－９は観察されなかった。ｍｉＲ－１８３の有無にかかわらず、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡベクターを受けた動物からのニューロンにおけるカスパーゼ９の明確な増加はなかったが、このことは、単に、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰと比較して、これらのベクターで観察された病変の発生率の減少の関数であった可能性があり、これにより、組織学的切片上の変性の適切な段階でニューロンを見つける可能性を低減させる。アポトーシスの主要な機序と考えられるアポトーシスの内因性経路は、ミトコンドリアの膜透過性の増加及びカスパーゼ９の活性化に起因するシトクロムＣの放出を介して媒介される。折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）を介したアポトーシスは、内因性経路を通じて生じる。
高レベルの導入遺伝子産物からのタンパク質過剰発現に起因する毒性の提唱された機序を裏付けるために、活性化転写因子６（ＡＴＦ６）のためのＩＨＣを実施した。ＵＰＲは、ゴルジ体においてＡＴＦ６活性化の引き金となり、細胞質断片を生成し、核に移行して、ＥＲ関連結合エレメントの転写を活性化する。興味深いことに、ＡＴＦ６についてのＩＨＣは、ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ、ＡＡＶｈｕ．６８．ｈＩＤＵＡ、及びＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３を受けた動物のＤＲＧにおけるニューロン及び神経衛星細胞の細胞質において多焦点陽性であり、このことは、病変の重症度に対応していた。対照的に、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ．ｍｉＲ－１８３、及び未処理のＡＡＶ注射されていない対照ＮＨＰを受けた動物は、ＡＴＦ６に対して拡散した陰性であった。ＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰを注射した動物において、最高レベルのＡＴＦ６発現が観察され、続いて、ＡＡＶｈｕ６８．ｈＩＤＵＡ及びＡＡＶｈｕ６８．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３が観察された。全体的な研究所見と一致して、ｍｉＲ－１８３を有するベクターを受けた動物は、ＡＴＦ６陽性の低減を示し、このことは、細胞ストレスの低減を示している。
ＤＲＧの毒性は、高全身用量のベクター又はＣＳＦへのベクターの直接送達に依存する任意の療法によって生じる可能性が高い。この安全上の懸念は、霊長類に限定され、通常は無症候性であった。しかしながら、ＤＲＧ毒性は、自己受容の欠損（Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（３）：２８５－２９８，２０１８）又は難治性神経障害性疼痛に起因する失調症などの実質的な罹患を引き起こす可能性がある。米国食品医薬品局は最近、ＮＨＰでのＤＲＧ毒性のために、遅発性ＳＭＡに対する髄腔内ＡＡＶ９の臨床試験を一時停止したが、このリスクがＡＡＶ療法の開発をどのように制限し得るかを強調している（Ｎｏｖａｒｔｉｓ．Ｎｏｖａｒｔｉｓ ａｎｎｏｕｎｃｅｓ ＡＶＸＳ－１０１ ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｕｐｄａｔｅ，２０１９）。
もともと、この毒性は、外来カプシド又は導入遺伝子のエピトープを対象として、ＤＲＧ形質導入ニューロンに対する破壊的なＴ細胞免疫によって引き起こされると仮定された。しかしながら、ＭＭＦ及びラパマイシンなどの強力な免疫抑制レジメンは、毒性試験における毒性を防ぐことができず（Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：６８－７８，２０１８、Ｈｏｒｄｅａｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０：７９－８８，２０１８）、また、この研究でも、ステロイドで毒性を防ぐことはできなかった。進行性ではないが、遅発性のＤＲＧ変性の時間経過は、適応免疫が役割を果たしたという考えを支持しなかった。もし細胞傷害性Ｔ細胞が関与していたならば、ＤＲＧの変性及び単核細胞の浸潤が、早期に始まり、経時的に進行することが観察されていたであろう。
高レベルのＤＲＧ形質導入で、細胞ストレスが生み出され、これが高度に形質導入されたＤＲＧニューロンにおける変性をもたらす可能性がある。毒性は、導入遺伝子のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現を抑制することによって、防止され得るため、カプシド又はベクターＤＮＡが、細胞のストレッサーとはなり得ない。組織学的分析では、変性が、最高レベルの導入遺伝子タンパク質を発現するＤＲＧニューロンに限定されることが実証された。ニューロン変性は、カスパーゼ－３及びカスパーゼ－９の活性化にも関連しており、これは、Ｔ細胞媒介性細胞死とは対照的に、細胞内のストレス源によって引き起こされるアポトーシスを示唆している。ｍｉＲ－１８３を介した導入遺伝子発現の細胞特異的除去によるＤＲＧ変性の低減は、カプシド又はベクターＤＮＡではなく、導入遺伝子由来のｍＲＮＡ又はタンパク質の過剰発現が、このプロセスを駆動することを示唆している。ｍｉＲ標的又は未処理の動物を用いた対照と比較して、ｍｉＲ標的を含まないベクターを受けた動物のニューロン及び衛星細胞におけるＡＴＦ６染色の増加は、ＵＰＲを暗示するが、誘発する機序は、非分泌型（ＧＦＰ）導入遺伝子と分泌型（ＩＤＵＡ）導入遺伝子とで異なる場合がある。
自己限定的ではないが、遅延したＤＲＧ神経変性の時間経過は、非免疫毒性が、高度に形質導入されたサブセットの細胞に限定されるという考えと一致する。ＤＲＧ毒性及び軸索障害が可逆的であるかどうかは不明である。成体動物を６ヶ月追跡した結果、病的状態における一貫した低減は観察されなかった。ＩＣＭ注入後、ＮＨＰでＤＲＧ毒性が観察された唯一の実験は、ベクターが１ヶ月齢のマカクに投与され、４年後に剖検された場合であった（Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。乳児霊長類がＤＲＧ毒性に耐性を有するか、又はそのＤＲＧニューロンが再生能を有するか、又は病変がこの長期間にわたって退縮する可能性がある。
所見は、ＤＲＧ毒性が導入遺伝子の過剰発現によって引き起こされるという支持を示した。したがって、ＤＲＧ毒性の重症度は、用量、プロモーター強度、及び導入遺伝子の性質に影響されるはずである。霊長類において、感覚ニューロンが最も効率的に形質導入される細胞の１つである理由は、まだ理解されていない。ＤＲＧは、ＣＮＳの外側に存在し、多孔質で有窓の毛細血管を有するため、全身投与ベクターによって容易にアクセスされる。全身ベクターは、末梢軸索からの取り込まれた後、逆行性輸送を介してＤＲＧニューロンにアクセスすることもできる。髄腔内（クモ膜下腔内）空間に存在する感覚神経区画の解剖学的構造により、ＣＳＦに送達されるベクターの高い形質導入が促進され得る。後根のＤＲＧニューロンの軸索は、ＣＳＦに曝され、ＩＣＭ／ＬＰ投与後に、ベクターへの容易なアクセスが提供される。ＤＲＧの細胞外液へのクモ膜下腔の開放的なアクセスにより、ＤＲＧの神経細胞体及び他の細胞へのＩＣＭ／ＬＰベクターの直接接触が可能になるはずである。ｍｉＲ－１８３によるＤＲＧニューロン内の導入遺伝子発現の抑制は、このｍｉＲの影響を受けるはずがないＤＲＧの他の細胞における導入遺伝子発現の分析を容易にした。ＩＳＨで、周囲のグリア衛星細胞における導入遺伝子のｍＲＮＡが明らかになり
、直接的な形質導入を示唆し得る（図６Ｃ）。グリア細胞における導入遺伝子のｍＲＮＡの機能的意義は未知である。
ベクター導入遺伝子の発現を選択的に阻害すると、ＤＲＧ毒性が低減され、潜在的に排除されるはずである。これを達成するための鍵は、他の場所における発現に影響を与えることなく、ＤＲＧニューロンにおける発現を特異的に消滅させるための戦略である。現在、カプシド修飾又は組織特異的プロモーターを通じてこの特異性を達成する方法は存在しない。ｍｉＲ－１８３の標的をベクターに含めることで、ベクターの製造、効力、又は生体分布に影響を与えることなく、ＤＲＧ毒性を低減／排除する所望の結果が達成された。上記のｈＩＤＵＡのＮＨＰ研究では、併用ステロイドとともに非ｍｉＲ－１８３ベクターを受けた群が含まれた（ＡＡＶ試験における免疫介在性の毒性を緩和するための標準的なアプローチである）。ステロイド治療群では、ＤＲＧ毒性が低減されず、実際、毒性を悪化させる傾向があった。この実験は、ＡＡＶ遺伝子療法試験における予防的ステロイドの限界を実証する。
ＤＲＧ毒性を減少させるためのこのアプローチのモジュール性は、ＡＡＶ誘発性のＤＲＧ毒性を軽減することが望まれる場合に、ＣＮＳ遺伝子療法に関して考慮されるいずれのＡＡＶベクターにおけるその使用を示唆する。このアプローチは、治療用途で、幅広いＡＡＶベクターにわたって使用することができる。
実施例４：ｍｉＲ－１８３クラスター標的配列を有する発現構築物のインビトロ及びインビボ評価
インビトロアッセイを使用して、ｍｉＲＮＡ標的配列を有する構築物の活性及び特異性を評価した。上の実施例２に記載されるように、ＨＥＫ２９３細胞（又は別の好適な細胞株）を、ＧＦＰ導入遺伝子を有するシスプラスミド、並びにｍｉＲ－１８２及びｍｉＲ－１８３などの１つ以上のｍｉＲＮＡを発現するプラスミドで共トランスフェクトされ得る。シスプラスミドは、発現カセットの３’ＵＴＲ中の様々な数の対応する標的ｍｉＲＮＡ配列で設計され、代替的なスペーサー配列が導入される。トランスフェクションの７２時間後、ＧＦＰの発現を定量化して、相対的な発現レベルを決定する。ラット、アカゲザル、又はヒトＤＲＧ細胞も形質導入して、様々な構築物の有効性を評価することができる。加えて、ｍｉＲ－９６、ｍｉＲ－１８２、及びｍｉＲ－１８３を発現するＨＣＴ１１６細胞株を用いて、スクリーニングアッセイを開発した（図２６Ａ及び図２６Ｂ）。
インビトロ研究の結果に基づいて、ＧＦＰの発現を低減又は排除する配列（いくつかのリピートを含む）及びスペーサーの好適な組み合わせが特定される。例えば、図２４は、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ．ＧＦＰベクターでの形質導入後の脳皮質におけるＧＦＰの発現に対する、ｍｉＲ－１８３、ｍｉｒ－１８２、ｍｉＲ－９６、又はｍｉＲ－９６を含む効果を示す。例えば、ＤＲＧの脱標的化（すなわち、ＧＦＰ発現の低減）を含む、ＣＮＳでの発現レベルを評価するための例示的なインビボマウス研究が、実施例２にも提供されている。
ＨＣＴ細胞株は、ＮＨＰ及びヒトＤＲＧと比較して、同様の比率のｍｉＲ－１８３／ｍｉＲ－１８２を再現する好適なモデルである（図２６Ｃ）。図２７Ａ～図２７Ｄは、４つのｍｉＲ－１８２標的配列を有するベクター、並びにｍｉＲ－１８２及びｍｉＲ－１８３標的配列（４つのｍｉＲ－１８２標的配列及び４つのｍｉＲ－１８３標的配列）の組み合わせを有する構築物を用いてＨＣＴ１１６細胞を形質導入した結果を示す。ＧＦＰ発現の減少は、ｍｉＲ－１８３標的コピーの増加とともに、観察された。更に、４つのｍｉＲ－１８２標的配列を有するか、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列と４つのｍｉＲ－１８２標的配列の組み合わせのいずれかを有するベクターは、４つのｍｉＲ－１８３標的配列を有するベクターと比較して、より高いサイレンシング（ＧＦＰ発現の低減）をもたらす（
図２７Ｃ及び図２７Ｄ）。
インビトロで好ましい減少した発現レベルを示したｍｉＲ－１８２標的配列のみ、並びにｍｉＲ－１８２及びｍｉＲ－１８３標的配列の組み合わせを有する構築物もまた、インビボで評価した。ＡＡＶｈｕ６８ベクターの投与後、ＣＮＳ及びＤＲＧの細胞における毒性及び導入遺伝子発現のレベル（脱標的化の程度）を評価した。マウスは、ＧＦＰ導入遺伝子を有する発現カセット、ｍｉＲ標的配列なし、ｍｉＲ－１８３標的配列の４つのコピー、ｍｉＲ－１８２標的配列の４つのコピー、又はｍｉＲ－１８２標的配列の４つのコピー、及びｍｉＲ－１８３標的配列の４つのコピーを含むベクターの４×１０１２ＧＣ ＩＶ又は１×１０１１ＧＣ ＩＣＶを受け取った（配列番号２８も参照されたい）。図２８Ａ及び図２８Ｂに示される結果は、ｍｉＲ－１８２標的配列又はｍｉＲ－１８２標的配列＋ｍｉＲ－１８３標的配列を有する構築物が、ＤＲＧにおける導入遺伝子発現をサイレンシングしたことを実証する。しかしながら、脳及び脊髄（図２８Ｃ～図２８Ｅ）及び末梢組織（図２８Ｆ～図２８Ｊ）における導入遺伝子発現は、保存された。また、ＡＡＶｈｕ６８ベクターを用いたＮＨＰ研究（３×１０１３のＩＣＭ送達）は、ｍｉＲ－１８２標的配列の４つのコピーを有する構築物、又はＤＲＧにおけるｍｉＲ－１８２標的配列の４つのコピー及びｍｉＲ－１８３標的配列の４つのコピーを有する構築物が、導入遺伝子発現をサイレンシングしたことを実証した（図２９Ａ及び図２８Ｂ）。更に、両方の構築物は、減少したＤＲＧ毒性及び背側軸索障害に関連付けられた（図２９Ｃ及び図２９Ｄ）。
実施例５：ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ）の治療のためのヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（ｈＩＤＳ）導入遺伝子の脱標的化
ＭＰＳ ＩＩ（ハンター症候群）の治療のための１つの戦略は、ｒＡＡＶベースのＣＮＳ特異的遺伝子療法を介して、患者の欠陥イズロン酸－２－スルファターゼを機能的に置換することである（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７７７０号を参照されたい。参照により本明細書に援用される）。ＤＲＧ毒性を低減するために、ＭＰＳＩＩの治療のためのＡＡＶベクターゲノムは、ｍｉＲ標的配列を導入することによって修飾される。したがって、ｈＩＤＳコード配列を含むＡＡＶベクターゲノムは、１つ、２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８３標的配列を用いて設計される。インビボでのＤＲＧ脱標的化の有効性は、例えば、ｈＩＤＳをコードするＡＡＶベクターをＮＨＰに髄腔内投与した後で測定される。
実施例６：脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療のためのＳＭＮ１導入遺伝子の脱標的化
ＳＭＡは、ｈＳＭＮ１遺伝子の変異又は欠失によって引き起こされる常染色体劣性障害である。ｒＡＡＶベクターを介した機能的なＳＭＮタンパク質の送達は、ＳＭＡの治療に有効であるものの、ＤＲＧ毒性が観察されている。好適なベクターとしては、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１９９９６号（参照により本明細書に援用される）に記載されているもの、及びＡＡＶ９ベースの遺伝子療法であるＺｏｌｇｅｎｓｍａ（登録商標）が挙げられる。ヒトＳＭＮ１をコードするＡＡＶベクターの送達後のＤＲＧ毒性の低減又は排除は、ｍｉＲＮＡ標的配列（ｍｉＲ－１８２及びｍｉＲ－１８３によって認識されるものなど）をベクターゲノムに組み込むことによって達成される。したがって、ｈＳＭＮ１転写産物をコードする核酸配列を、１つ、２つ、３つ、又は４つのｍｉＲＮＡ標的配列と組み合わせて有する、ＡＡＶベクター（ＡＡＶ９又はＡＡＶｈｕ６８カプシドを有するものを含む）が生成される。標的配列は、例えば、ｍｉＲ－１８２及びｍｉＲ－１８３標的配列、又はそれらの組み合わせから選択される。ｈＳＭＮ１発現ＡＡＶベクターのＩＶ投与又は髄腔内投与後のＤＲＧ毒性は、ＮＨＰモデルで評価される。
実施例７：ｍｉＲＮＡ標的配列を有する肝臓特異的遺伝子療法ベクター
遺伝子療法に関して、肝臓組織における導入遺伝子の発現の改善が望まれる場合、ＡＡＶベクターゲノムは、ｍｉＲＮＡ標的配列を含むように修飾され得る。例えば、機能性低
密度リポタンパク質受容体（ｈＬＤＬＲ）遺伝子を発現し、ＡＡＶ８カプシドを有するように設計されたｒＡＡＶは、家族性高コレステロール血症（ＦＨ）の治療に好適である（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９８４号を参照されたい。参照により本明細書に援用される）。肝臓組織におけるｈＬＤＬＲ導入遺伝子の発現の増強は、ｈＬＤＬＲコード配列を、１つ、２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列と組み合わせて有するベクターゲノムを含むｒＡＡＶを使用して達成される。同様に、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）及び血友病Ｂ（第ＩＸ因子）の治療のための遺伝子療法としては、肝臓に対して指向性を有するベクターが挙げられる（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７３９６号及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２７４００号を参照されたい。参照により本明細書に援用される）。肝臓におけるヒト第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子のより効果的な送達及び発現は、導入遺伝子と組み合わせて、１つ、２つ、３つ、又は４つのｍｉＲ－１８２標的配列を有するベクターゲノムを含むｒＡＡＶを送達することによって達成される。
実施例８：ｍｉＲＮＡ標的配列の代替的コピーを有するベクターゲノムにおけるＤＲＧ脱標的化配列の評価
ＡＡＶ９ベクターを、前述のようにＣＢ７プロモーター下で緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするように設計した。発現カセットは、単一のｍｉＲ－１８３脱標的化配列、ｍｉＲ－１８３脱標的化配列の２つのコピー、ｍｉＲ－１８３脱標的化配列の３つのコピー、又はｅＧＦＰの３’ＵＴＲ中のｍｉＲ－１８３脱標的化配列の８つのコピーを含有するように設計された。これらのベクターは、記載されるように作製され、滴定される［Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，Ｏｃｔ ２０１０；２１（１０）：１２５９－１２７１］。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、細胞を溶解し、ベクターを回収し、濃縮し、前述のように精製する。精製したベクターを、以前に記載されているように、ウサギベータ－グロビンポリＡ配列を標的とするプライマーを使用して、ドロップレットデジタルＰＣＲで滴定する（Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ；２０１４年４月；２５（２）：１１５－１２５を参照されたい）。
ｅＧＦＰ導入遺伝子及びｍｉＲ－１８３の１つのコピーを含有するベクターゲノムの配列は、配列番号２０に提供される。ｅＧＦＰ導入遺伝子及びｍｉＲ－１８３脱標的化配列の２つのコピーを含有する例示的なベクターゲノムは、配列番号２１に提供される。ｅＧＦＰ導入遺伝子及びｍｉＲ－１８３の３つのコピーを含有するベクターゲノムの配列は、配列番号２２に提供される。ｅＧＦＰ導入遺伝子及びｍｉＲ－１８３脱標的化配列の４つのコピーを含有する例示的なベクターゲノムは、配列番号２３に提供される。ｅＧＦＰ導入遺伝子及びｍｉＲ－１８３脱標的化配列の７つのコピーを含有する例示的なベクターゲノムは、配列番号２６に提供される。ｅＧＦＰ導入遺伝子及びｍｉＲ－１８３脱標的化配列の８つのコピーを含有する例示的なベクターゲノムは、配列番号２７に提供される。代替的に、ベクターゲノムは、ｍｉＲ標的配列の組み合わせを有する。例えば、配列番号２８は、ｍｉＲ－１８２標的配列の４つのコピー及びｍｉＲ－１８３標的配列の４つのコピーを含むベクターゲノムを提供する。
ＡＡＶ９ベクター、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｒＢＧ、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３．ｒＢＧ、及びＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３．ｒＢＧを、実施例１に記載されるように構築した。ＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３．ｒＢＧ及びＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｅＧＦＰ．ｍｉＲ－１８３．ｒＢＧベクターゲノムは、ｅＧＦＰコード配列の３’ＵＴＲにおけるｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１４５脱標的化配列の４つのコピーを含み、ｄｒｇ及び他の組織並びに細胞型における発現レベルに対する効果を、前述の実施例に記載の方法を使用して評価した。図２４Ａは、ｍｉＲ－１４５標的を含むように修飾された標的が、対照のｎｏ－ｍ
ｉＲベクターと比較して、心臓における発現の減少を示したことを示す。４×ｍｉＲ－１８３標的を有するベクターは、ｎｏ－ｍｉＲ及びｍｉＲ－１４５標的ベクターと比較して、心臓におけるＧＦＰ形質導入の増加を示した。図２４Ｂは、４×ｍｉＲ－１８３標的を有するベクターが、ｎｏ－ｍｉＲ及びｍｉＲ－１４５ベクターと比較して、脳皮質及び脳幹におけるＧＦＰ形質導入の増加を示したことを示す。
実施例９：導入遺伝子に作動可能に連結されたｍｉＲ標的化配列を含むｒＡＡＶは、ｍｉｒ－１８３クラスター調節遺伝子の発現を増加させない。
ヒトＣＡＣＮＡ２Ｄ１及びＣＡＣＮＡ２Ｄ２遺伝子（メンバーは、電位依存性カルシウムチャネルをコードする）は、ｍｉＲ－１８３クラスター（ｍｉＲ－１８３／－９６／－１８２）の予測標的であり、以前の出版物は、ヒトドナー由来のＤＲＧにおける、３つ全てのｍｉＲＮＡと、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１及びＣＡＣＮＡ２Ｄ２発現との間に有意な逆相関を示唆する。例えば、Ｐｅｎｇ ａｔ ａｌ，“ｍｉｒＲ－１８３ ｃｌｕｓｔｅｒ ｓｃａｌｅｓ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ｂａｓａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ｇｅｎｅｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１７ Ｊｕｎ １６；３５６（６３４３）：１１６８－１１７１．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｍ７６７１．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｊｕｎ １を参照されたい。ｍｉＲ－１８３がＣＡＣＮＡ２Ｄ発現を下方制御することが報告されている。したがって、ＣＡＣＮＡ２Ｄの発現の増加は、おそらく、「スポンジ効果」から生じ、これは、疼痛及び圧力に対する感受性の増加をもたらすと予想される。
４×ｍｉＲ－１８３標的配列の有無にかかわらずｅＧＦＰ又はＩＤＵＡを含むベクターゲノムを含有するストックｒＡＡＶを、ラット－ＤＲＧ培地で２．５×１０１２／ｍＬに希釈し、古い培地を除去した後、０．２５ｍｌのベクターを２４ウェルプレートの各ＤＲＧ含有ウェルに添加した。２４時間後、培地を除去し、新鮮な培地と交換した。形質導入は、３個の複製物で行われた（すなわち、ＡＡＶ－ＧＦＰについて３個のウェル、ＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３については３個のウェル（モック対照について２個のウェル））。形質導入を増強するために、ＡＡＶベクターとともに、ＭＯＩ １０で、アデノウイルスＡＤ５（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）も添加した。ＲＮＡを各ウェルについて別々に単離し、ｑ－ＲＴ－ＰＣＲに（１つの反応／ウェル、２個の複製物で）使用した。形質導入の７２時間後に、ＤＲＧ培養物から総ＲＮＡを抽出した。
標的遺伝子、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１及びＣＡＣＮＡ２Ｄ２に対するｍｉＲ－１８３の発現レベル及び潜在的なスポンジ効果を、ラットＣＡＣＮＡ２Ｄ１（アッセイＩＤ Ｒｎ０１４４２５８０）及びＣＡＣＮＡ２Ｄ２（アッセイＩＤ：Ｒｎ００４５７８２５）に特異的なプライマーを使用して決定した。図１１は、低濃度（５×１０５）又は高濃度（２．５×１０８）での、ｍｉＲ－１８３脱標的化配列の４つのコピーを伴うか、又は伴わない、ｅＧＦＰ導入遺伝子を有する様々なＡＡＶ９ベクターによる形質導入の結果を示す。ｍｉＲ－１８３を伴わない低用量及び高用量を、１００（低用量ＡＡＶ９－ｅＧＦＰの場合）又は１０（高用量ＡＡＶ９－ｅＧＦＰの場合）の感染多重度（ＭＯＩ）で、アデノウイルス５型（Ａｄ５）ヘルパー共トランスフェクションを行うか、又は行わずに試験した。全てのＤＲＧニューロンが形質導入され、毒性の目に見える徴候は観察されなかった。ＤＲＧニューロンにおいて、ＧＦＰ発現は観察されなかったが、線維芽細胞様細胞において、ある程度の発現が観察された。この所見は、（×４）ｍｉＲ－１８３標的配列を有するベクターゲノムによるＧＦＰ転写の抑制を確認する。
ＮＨＰにおけるｍｉＲ－１８３スポンジ効果研究
動物にＡＡＶ－ＩＤＵＡ又はＡＡＶ－ＩＤＵＡ－４Ｘｍｉｒ－１８３ベクター（ｎ＝３／群）を投与した非ヒト霊長類（ＮＨＰ）アカゲザル研究（１９－０４）から、ＤＲＧ（
腰部）及び脳（前頭皮質）組織を得た。ｍｉＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを全ＲＮＡ単離に使用し（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）、次いで、抽出されたＲＮＡを、プロトコルの指示に従って、ＴａｑＭａｎ（商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で逆転写させた。定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を実施し、製造元の指示に従って、ｈｓａ－ｍｉＲ－１８３－５ｐ（アッセイＩＤ ００２２６９）及びＲＮＵ６Ｂ（アッセイＩＤ ００１９３）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）に特異的なプライマーを有するＴａｑＭａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ａｓｓａｙキットを使用して、異なる組織におけるｍｉＲ－１８３の存在量を決定した。同様に、ｍｉＲ－１８３の直接標的のうちの２つ、すなわち、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１及びＣＡＣＮＡ２Ｄ２の存在量を、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１（アッセイＩＤ
Ｈｓ００９８４８４０）及びＣＡＣＮＡ２Ｄ２（アッセイＩＤ：Ｈｓ０１０２１０４９）にそれぞれ特異的なプライマーを有するＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイキットを使用して測定した。各ｑＰＣＲアッセイは、生物学的複製物からの１００ｎｇの総ＲＮＡに由来するｃＤＮＡを用いて３個の複製物で実施され、比較閾値サイクル（Ｃｔ）法により分析した。ｍｉＲ－１８３の平均発現レベルを、内因性対照遺伝子としてＲＮＵ６Ｂで正規化し、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１及びＣＡＣＮＡ２Ｄ２の平均レベルを２－ΔΔＣｔ法を使用してＧＡＰＤＨで正規化した（Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ、Ｌｉｖａｋ ＫＪ．Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄａｔａ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｃ（Ｔ）ｍｅｔｈｏｄ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００８；３（６）：１１０１－８．）。
ＤＲＧ（高ｍｉＲ－１８３存在量）又は前頭皮質（低ｍｉＲ－１８３存在量）のいずれかにおけるＡＡＶ－ＩＤＵＡ又はＡＡＶ－ＩＤＵＡ－ｍｉＲ－１８３投与動物を比較するｍｉＲ－１８３クラスター調節遺伝子（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１又はＣＡＣＮＡ２Ｄ２）の発現の増加はなかった（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。
ラット新生児後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン細胞培養
ラットＤＲＧニューロン（ＬＯＮＺＡ ＷＡＬＫＥＲＳＶＩＬＬＥ ＩＮＣ）を解凍し、７ｍＬの推奨培地（ＰＮＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ：２ｍＭのＬ－グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン／３７ｎｇ／ｍｌのアムホテリシン、及び２％のＮＳＦ－１を含有するＰｒｉｍａｒｙ Ｎｅｕｒｏｎ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）に加えた。次いで、約５．０Ｅ５のＤＲＧニューロンを含有する８ｍｌの培地を、細胞を添加する直前に、ポリＤ－リジン（３０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）でコーティングした２４ウェル組織培養プレートの８ウェル間で分割した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で４時間インキュベートした後、培地を除去し、新鮮な予熱した培地と交換した。シュワン細胞増殖を阻害するために、最初の４時間のインキュベーションの後に、有糸分裂細胞阻害剤（１７．５ｕｇ／ｍｌのウリジンを５μｌ及び７．５μｇ／ｍＬの５－フルオロ－２－デオキシウリジン／培地ｍｌを５ｕｌ）を添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、５日目に培地を完全に変化させ、その後３日ごとに５０％培地を変化させた。初期の培養の６日後、上述のようにＡＡＶベクターを用いてＲＡＤ ＤＲＧニューロンを形質導入した。
図１２は、ラットＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ－１８３スポンジ効果研究の効果を示す。これらのデータは、細胞がＡＡＶ９－ｅＧＦＰ－ｍｉｒ－１８３ベクターで形質導入されると、ラットＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ－１８３レベルが減少したことを示す。所見は、発現されたＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３ ｍＲＮＡの標的配列の係合を示した。
図１３Ａ及び図１３Ｂは、３つの既知のｍｉＲ－１８３調節転写産物に対する、ラットＤＲＧ細胞におけるｍｉＲ－１８３スポンジ効果研究の効果を示す。図１３Ａは、モック
ベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、又はＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３ベクターによる形質導入後のラットＤＲＧ細胞における相対発現ＣＡＣＡＮＡ２Ｄ１を示す。図１３Ｂは、モックベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、又はＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３ベクターによる形質導入後のラットＤＲＧ細胞におけるＣＡＣＡＮＡ２Ｄ２の相対発現を示す。図１３Ｃは、モックベクター、ＡＡＶ－ＧＦＰ、又はＡＡＶ－ＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３ベクターによる形質導入後のラットＤＲＧ細胞におけるＡＴＦ３の相対発現を示す。これらの既知のｍｉＲ－１８３調節転写産物のｍＲＮＡレベルの相対発現に変化はない。形質導入されていないモックウェル及びＧＦＰ－ｍｉＲ－１８３形質導入されたウェルと比較して、差は観察されなかった。これらのデータは、これらの細胞におけるスポンジ効果の不存在を示す。ｍｉＲ－１８３の残りのレベルのいずれかが十分であるか、又はクラスターの他のメンバー（ｍｉＲ－９６及び／又はｍｉＲ－１８２）が、ｍｉＲ－１８３の利用可能性の減少を補うことができる可能性がある。
実施例１０：ＤＲＧ病的状態のメタアナリシス
血液又は脳脊髄液（ＣＳＦ）を介して非ヒト霊長類（ＮＨＰ）にアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを投与することで、後根神経節（ＤＲＧ）病的状態を引き起こす可能性がある。この病的状態は、ほとんどの場合、最小限から中程度であり、罹患した動物において臨床的に無症状であり、単核細胞浸潤、神経変性、及び中心軸索及び末梢軸索の二次軸索病変による組織病理学的分析によって特徴付けられる。２５６ ＮＨＰにおける３３の非臨床研究からデータを集計し、異なる投与経路、用量、時間経過、研究実施、動物の年齢、性別、カプシド、プロモーター、カプシド精製方法、及び導入遺伝子の間のＤＲＧ病的状態の重症度のメタアナリシスを行った。ＤＲＧ病的状態は、ＣＳＦにＡＡＶを投与したＮＨＰの８３％、及び静脈内（ＩＶ）経路を介したＮＨＰの３２％で観察された。本発明者らは、注射時の用量及び年齢が、重症度に顕著に影響を及ぼす一方で、性別は影響を及ぼさないことを示す。ＤＲＧ病的状態は、急性時点（すなわち、１４日以下）では存在せず、注射後１～５ヶ月までは類似しており、６ヶ月後にはそれほど重症ではなかった。ベクター精製方法は、影響を及ぼさず、本発明者らが試験した全てのカプシド及びプロモーターは、いくつかのＤＲＧ病的状態を引き起こした。５つの異なるカプシド、５つの異なるプロモーター、及び２０の異なる導入遺伝子からのここに提示されるデータは、ＮＨＰを使用した非臨床研究において、ＤＲＧ病的状態が、ＡＡＶ遺伝子療法後にほぼ普遍的であることを示唆する。治療用導入遺伝子を受けた動物のいずれも、なんら臨床的徴候を示さなかった。神経伝導速度などの感受性技術の組み込みは、少数の動物において、末梢神経軸索症の重症度と相関する修飾を示すことができる。ヒトＣＮＳ試験及び高用量ＩＶ研究における感覚神経障害のモニタリングは、臨床的に顕著なＤＲＧ病的状態が生じるかどうかを決定することは慎重であるように思われる。
導入
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用する遺伝子治療は、非ヒト霊長類（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，６８－７８，２０１８、Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，７９－８８，２０１８）及びブタ（Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１８）を使用する前臨床研究において、後根神経節（ＤＲＧ）の感覚ニューロンにおける組織病理所見と結びついている。病態は、背側脊髄路の中心軸索及び末梢神経の末梢軸索の両方に影響を与える二次軸索障害に加えて、ＤＲＧ内の単核細胞浸潤及び感覚ニューロン変性として現れる（図１４）。ＤＲＧ病的状態又は毒性は、脳脊髄液（ＣＳＦ）へのＡＡＶ投与（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，６８－７８，２０１８；Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，７９－８８，２０１８；Ｂ．Ａ．Ｐｅｒｅｚ，ｅｔ
ａｌ．Ｂｒａｉｎ Ｓｃｉ １０，２０２０）又は中枢神経系（ＣＮＳ）を標的とする
全身性高用量投与（Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１８）を使用する非臨床研究において報告されている。病的状態が最小限から中程度であったほとんどの研究において、動物は無症状のままであった。進行性固有受容欠損症及び運動失調症を伴うより重度の病理学的及び明らかな毒性は、高用量静脈内（ＩＶ）ベクター注射の１４日以内のブタの研究において観察された（Ｃ．Ｈｉｎｄｅｒｅｒ，ｅｔ
ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１８）。ミコフェノール酸モフェチルとラパマイシンの組み合わせを使用した免疫抑制は、ＮＨＰにおける組織病理所見を排除しなかった（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，６８－７８，２０１８、Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，７９－８８，２０１８）。ヒト臨床試験におけるＤＲＧ病的状態の意義は未知である。ＮＨＰ研究のほとんどは、動物の数が少なく、統計学的分析の機会が限られているため、３３の研究からデータを集計し、合計２５６のマカクについてメタアナリシスを行い、投与経路、用量、時間経過、研究実施、動物の年齢、性別、カプシド、プロモーター、カプシド精製方法、及び導入遺伝子の効果を探した。
材料及び方法
データ入手可能性に関する声明
集計されたデータは、研究に資金を提供したスポンサーが権利を有する特定の導入遺伝子を除き、提供された実験の詳細とともに提示する。
動物
このメタアナリシスには、３３件の研究から２３７匹のアカゲザル及び１９匹のカニクイザルが含まれていた。動物手順は全て、ペンシルベニア大学の施設内動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）又はカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）は、Ｃｏｖａｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌｉｃｅ、ＴＸ）、Ｐｒｉｍｇｅｎ／Ｐｒｅｌａｂｓ Ｐｒｉｍａｔｅｓ（Ｈｉｎｅｓ、ＩＬ）、ＭＤ Ａｎｄｅｒｓｏｎ（Ｂａｓｔｒｏｐ、ＴＸ）から調達したか、又は寄贈された。動物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ又はＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａで、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ
Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ）のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ－ａｃｃｒｅｄｉｔｅｄ Ｎｏｎｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒａｍ施設のステンレス鋼製スクイーズバックケージ内に収容された。動物は、給餌、視覚及び聴覚刺激、操作、及び社会的相互作用などの様々な豊かさ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ）を享受した。
試験物又は対象物の投与
ＣＳＦ投与のために、ＮＨＰは、以前に記載されているように（Ｎ．Ｋａｔｚ，ｅｔ ｌａ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９，２１２－２１９，２０１８）、透視ガイダンス下で、大槽内に注射された滅菌人工ＣＳＦ（ビヒクル）中で希釈されたベクターを受けた。麻酔した動物において、透視ガイダンス下で腰部穿刺を行った。脊椎針をＬ４－５又はＬ５－６空間に挿入した後、ＣＳＦの戻りによって、及び／又は最大１ｍＬの造影剤（イオヘキソール１８０）を注射することによって、配置を確認した。静脈内投与のために、カテーテルを伏在静脈内に配置し、ベクターを滅菌１倍ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。
神経伝導速度検査
動物を、ケタミン／デクスメデトミジンの組み合わせで鎮静し、横臥位又は仰臥位で手
術台に配置し、ヒートパックで体温を維持した。カソードが記録部位に最も近くになるように、刺激装置のプローブを正中神経上に配置し、２つの針電極を、第ＩＩ指の末節骨のレベル（参照電極）及び基節骨のレベル（記録電極）で皮下に刺入し、一方、接地電極を刺激プローブ（カソード）の近位に配置した。小児刺激装置は、ピーク振幅応答に達するまで段階的に増加した刺激を伝えた。最大１０個の最大刺激を平均化し、正中神経について報告した。記録部位から刺激カソードまでの距離（ｃｍ）を測定し、伝導速度を算出するために使用した。伝導速度及び感覚神経活動電位（ＳＮＡＰ）振幅の平均を報告した。
ベクター
研究のために、ＡＡＶベクターを作製し、既に記載されているようにＰｅｎｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって滴定した（Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２１，１２５９－１２７１，２０１０、Ｍ．Ｌｏｃｋ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５，１１５－１２５，２０１４）。簡単に説明すると、ＨＥＫ２９３細胞を三重でトランスフェクトし、培養上清を収集して濃縮し、イオジキサノール勾配で精製した。Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＬＰ）準拠の毒性研究のために、ベクターもまた、ＨＥＫ２９３細胞のトリプルトランスフェクションによって産生され、既に記載されているように（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，７９－８８，２０１８）、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。
組織病理
大部分の研究では、委員会認定の獣医病理学者は、最初に試験物／治療群を盲検化し、確立された重症度スコアを、病変の不在について０、最小（１０％未満）について１、軽度（１０～２５％）について２、中等度（２５～５０％）について３、顕著（５０～９５％）について４、及び重度（９５％を超える）について５と定義した。これらのスコアは、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した組織の顕微鏡での評価に基づいており、％は、平均高倍率視野における病変によって影響を受けた組織の割合を表す。全てのＧＬＰ及び一部の非ＧＬＰ臨床研究では、査読は、外部の委員会認定の獣医病理学者によって完了した。ＤＲＧ変性及び脊髄の背側軸索障害からの重症度スコアは、頸部、胸部、及び腰部のセグメントから確立された。しかしながら、評価された切片数は、研究によって異なっていた。いくつかの研究において、所与のセグメントについて複数の組織切片がスライド上に存在する場合、スコアは、ＤＲＧ及び脊髄の個々の切片に割り当てられた。これらを、単一の代表的なスコアについて平均化した。本発明者らは、脊髄軸索障害を、全てのＤＲＧから来る軸索の照合を表すため、ＤＲＧ病的状態のより良い指標と考えている。本発明者らは、この書類全体で、ＤＲＧ病的状態を、ＤＲＧ細胞体及び脊髄、又は脊髄単独の組織病理学的所見と定義する。末梢神経軸索症のグレードは、正中（近位及び／又は遠位）、橈骨、尺骨、坐骨（近位及び／又は遠位）、腓骨、脛骨、及び／又は胸骨神経の評価に基づいて確立された。近位及び遠位の正中神経について評価が実施されたとき、近位セグメントは、腕神経叢から肘までの神経の部分に対応し、遠位セグメントは、肘から手のひらまでの神経の部分に対応していた。存在する場合、末梢神経における軸索周囲（すなわち、神経内膜）線維症について、重症度スコアを与えた。末梢神経が両側とも評価された場合の研究では、軸索障害及び軸索周囲スコアを、各神経について平均化した。
データ抽出
病的状態スコア及び全ての関連する研究情報を含む生データを研究ファイルから抽出し、単一のＥｘｃｅｌスプレッドシートに集計した。２名が独立して、事前に決定された検索条件に基づいてスコアを抽出し、ソートしてグラフを生成し、統計を実行した。抽出された出力の間に矛盾が生じた場合、平等に責任を有する品質管理について合意に達した。
統計
各々のパラメータ（すなわち、注射時の年齢、カプシド、投与経路、時間経過、プロモーター、性別、ベクター精製方法、及び用量）について、Ｒプログラム（バージョン３．５．０、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｒａｎ．ｒ－ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）内の関数「ｗｉｌｃｏｘ．ｔｅｓｔ」を有するウィルコクソンの順位和検定を使用して、各々のＤＲＧ又はＳＣセグメント（すなわち、頸部、胸部、腰部）についての各々の群の対間の病的状態スコアの比較を行った。次いで、Ｒの「ｍｅｔａｐ」パッケージ中の関数「ｓｕｍｌｏｇ」を有するフィッシャー法を使用して、全体的なＤＲＧ又はＳＣの群間比較のための３つの比較から、組み合わせたｐ値を算出した。統計学的有意性は、０．０５レベルの組み合わせたｐ値で評価した。
結果
ＤＲＧ病的状態評価
本発明者らは、ニューロン及びその対応する軸索の神経解剖学的評価及び全身評価に基づき、ＤＲＧニューロンに対する病変を正確に評価し、スコアリングする方法を開発した。一次感覚ニューロンの神経細胞体は、ＤＲＧ内に位置するクモ膜下腔空間内の各々の脊髄後根の基部にある卵形腫脹である。ＤＲＧニューロンは、偽単極性であり、１つの末梢分枝が末梢神経内に延び、１つの中央分枝は、脊髄白質路内で背側に上行する（図１４）。神経変性がＤＲＧに均一に影響を及ぼさないことは、代表的な試料を提供するために、頸部、胸部、及び腰部領域から複数のＤＲＧが収集される必要があることを意味するというのが、本発明者らの経験である。ＤＲＧにおける病的状態は、単核炎症性細胞及び増殖する常在衛星細胞を伴う単核細胞浸潤として現れ、神経変性は、その後の段階で見られるようになる（図１４、Ａ１の丸印）。神経細胞体損傷に続いて起こるのは、神経根（図１４、Ｂ１）、脊髄の上行性背側経路（図１４、Ｃ１）、及び末梢神経（図１４、Ｄ１）におけるＤＲＧ軸索突起に沿った軸索変性（すなわち、軸索障害）である。正常な対応物を伴う典型的な組織病理学的所見は、図１４のＡ１～Ｄ２に示されており、ＤＲＧ病的状態の様々な段階の高倍率画像も示されている。変性プロセスの初期に、神経細胞体は、ミクログリア細胞及び浸潤する単核細胞（神経貪食）とともに、増殖する衛星細胞のみを含み、比較的正常であるように見える（図１４のパネルＥ）。病変が進行するにつれて、神経細胞体は、消えかけている核を有するか、又は核が存在せず、細胞質高酸素血症を有する、小さな不規則形状若しくは鋭角を有する形状の細胞によって特徴付けられる、変性の証拠（図１４のパネルＦ、垂直の矢印）を示す。末期神経細胞体変性（図１４のパネルＧ、丸印）は、衛星細胞、ミクログリア細胞、及び単核細胞によるそれらの完全な消失（図１４のパネルＧ、星形）を伴う。ＤＲＧ及び対応する軸索における組織学的所見の重症度は、平均高倍率視野に対して影響を受けるニューロン又は軸索のパーセンテージに基づいてグレード分けされる。病変の不在について０、最小（１０％未満）について１、２ 軽度（１０～２５％）、３ 中等度（２５～５０％）、４ 顕著（５０～９５％）、及び５ 重度（９５％を超える）。ＤＲＧは、ニューロンの存在量が正常であり、少数のニューロンのみが所与の切片上で変性を示す、モザイクを表す。本発明者らは、脊髄軸索障害を、全てのＤＲＧから来る軸索の照合を表すため、ＤＲＧ病的状態のより良い指標と考えている。本発明者らは、この書類全体で、ＤＲＧ病的状態を、ＤＲＧ細胞体及び脊髄、又は脊髄単独の組織病理学的所見と定義する。
研究と集団の特徴
本発明者らは、２０１３～２０２０年のＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｇｒａｍ ａｔ Ｐｅｎｎにおいて、ＡＡＶベクター又はビヒクル対照を注射した２５６匹の動物を含む３３の研究からのデータを集計した。これらの研究のまとめを以下の表に示す。
Figure 2023526310000021
ＤＲＧ病的状態の重症度に対する研究の特徴の効果
ＤＲＧ病的状態は、ＡＡＶ ＩＣＭ又はＬＰを受けたＮＨＰの８３％（１７０／２０５匹）、ＩＶ経路のＮＨＰの３２％（８／２５匹）、併用ＩＣＭ＋ＩＶの１００％（４／４匹）、及び筋肉内の０％（ＩＭ、０／４匹）で観察された。病理学者は、ＤＲＧにおける重症度スコア、並びに脊髄及び末梢神経における対応する軸索に基づいてＤＲＧ病変をグレード分けした。ＤＲＧ並びに脊髄領域（頸部、胸部、及び腰部）ごとにスコアを得た。平均スコアは、図１５～１７に示され、領域別に分割されたデータは、図２０～２３に示される。ＤＲＧにおける重症度は、各脊髄領域がＤＲＧに由来する軸索の全体をグループ分けするために、脊髄における重症度よりも低かったため、いくつかのＤＲＧからの病的状態スコアを照合した（図１４）。病的状態の重症度に著しく影響した試験設計パラメータは、投与経路（ＲＯＡ）、用量、及び剖検時点であった（図１５Ａ～図１５Ｃ）。非臨床実験室試験のためのＧＬＰ実践の遵守（連邦規則集第５８条のタイトル２１に設定されている通り）は、病的状態の重症度に影響を与えなかった（図１５Ｄ）。ＩＭを除く全てのＲＯＡは、ビヒクル対照と比較した場合、ＤＲＧ及び脊髄の両方において有意な病的状態を引き起こした（ｐ＝０．０４ ＤＲＧ及び脊髄、ＩＶ対ビヒクル、ｐ＜０．００１ ＤＲＧ及びｐ＜０．０００１ 脊髄、他の全ての経路対ビヒクル）。ＩＣＭ、ＬＰ、及びＩＣＭ／ＩＶはいずれも、ＩＶよりも類似しており、かつ有意に悪かった（ＩＶ対ＩＣＭ
ｐ＜０．０００１、ＩＶ対ＬＰ ｐ＝０．０２、ＩＶ対ＩＣＭ／ＩＶ ｐ＝０．０００６－図１５Ｂ）。ＩＭ（図示せず）は、病的状態を引き起こさず（全てのスコアが０）、ビヒクル対照と同様であった。以下の全ての分析について、ＣＳＦ内投与（すなわち、Ｉ
ＣＭ又はＬＰ）を行った動物のみを検討した。２つの低い方の用量範囲（＜３Ｅ＋１２ ＧＣ及び３Ｅ＋１２～１Ｅ＋１３ ＧＣ）は、類似していたが、一方、最大用量範囲（＞１Ｅ＋１３ＧＣ）は、最低用量範囲（ｐ＝０．００９、脊髄）及び中間用量範囲（ｐ＝０．００１ ＤＲＧ、ｐ＝０．０５ 脊髄、図１５Ｂ）の両方よりも有意に悪い病的状態スコアが得られた。注射後の時点（すなわち、剖検を実施し、組織を分析したとき）は、２１～６０日、９０日、及び１２０～１６９日の間に同様の病的状態の重症度を示した。病的状態は、早期（すなわち、１４日目）の時点では見られず、１８０日以上の長期フォローアップは、他の全ての時点と比較して重症度の有意な低減を示した（ｐ＜０．０００１
脊髄、ｐ＜０．０００１ ＤＲＧ Ｄ９０、ｐ＜０．００１ ＤＲＧ 他の時点）。
ＤＲＧ病的状態の重症度に対する動物の特徴の効果
ベクター投与時の年齢は、病的状態の重症度に顕著な影響を及ぼした。幼若期動物は、成体と比較した場合、重症度の低いＤＲＧ変性を有していた（ｐ＝０．００３）が、同様の脊髄軸索障害を有していた（図１６Ａ）。乳幼児として治療された４匹の動物は、既に報告されているように（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３０，９５７－９６６，２０１９）、ＤＲＧ又は脊髄病的状態の徴候を有しなかった。この結果は、小さなｎ及び研究エンドポイント（注射から４年後）の考えられる影響に起因して、慎重に解釈する必要がある。図１５Ａ～図１５Ｄに示されるように、研究期間は、病的状態の重症度に影響を有しており、注射時の年齢及び／又は研究期間が、病的状態が存在しないことを裏付けているかどうかは不明である。追加的に、重要なことに、性別は、ＳＣ又はＤＲＧ病的状態に影響を及ぼさなかった（図１６Ｂ）。
ＤＲＧ病的状態の重症度に対するベクターの特徴の効果
ＤＲＧ神経変性は、全てのカプシドで存在したが、血清型間で重症度に若干の差があった（図１７Ａ）。このようなバリエーションは、ＤＲＧに限定され、脊髄スコアでは見られない場合、ＤＲＧが、脊髄断面よりもサンプリングアーチファクトに影響されやすいモザイクを表すため、意味がない場合がある。軸索障害及びＤＲＧスコアは、ＡＡＶｈｕ６８よりもＡＡＶ１で（ｐ＝０．０１脊髄、ｐ＝０．０００４ ＤＲＧ）、かつＡＡＶ９よりもＡＡＶ１で（ｐ＝０．００７脊髄及びＤＲＧ－図１７Ａ）、両方とも有意に悪かった。ユビキタスプロモーターＣＡＧ、ＣＢ７、及びＵｂＣは、いずれも互いに類似していたが、一方、ＣＡＧは、ｈＳｙｎ（ｐ＝０．０２８）よりも悪い軸索障害を引き起こし、ＣＢ７（ｐ＝０．００１）、ＵｂＣ（ｐ＝０．００２）及びｈＳｙｎ（ｐ＝０．０００３、図１７Ｂ）より悪いＭｅＰ４２６を引き起こした。２０個の異なる導入遺伝子を試験し、１つを除く全てがＤＲＧ病的状態を引き起こした（図１７Ｃ）。病的状態の重症度は、導入遺伝子間で大きく変動した（０．５～２．７の平均脊髄軸索障害スコア）。病的状態の重症度は、分泌型導入遺伝子と比較して非分泌型導入遺伝子で２０～２５％低かった（図１７Ｄ；ＤＲＧについては、分泌型平均＝０．６１、非分泌型平均＝０．４７、ｐ＝０．０５；ＳＣについては、分泌型平均＝１．１７、非分泌型平均＝０．９４、ｐ＝０．０２）。更に、精製方法（すなわち、非ＧＬＰ研究におけるイオジキサノール及びＧＬＰ研究におけるカラムクロマトグラフィー）は、ＤＲＧ病的状態の存在又は重症度に影響を与えなかった（図１５Ｄ）。
ＤＲＧ病的状態の領域的重症度及び臨床的症状
頸部、胸部、及び腰部脊椎に関する病的状態の領域的な差を評価した。また、三叉神経の神経節（ＴＲＧ）も、クモ膜下腔空間の内側の頭蓋底部に位置するＤＲＧと同様の特徴を有する感覚神経節を表すため、分析した。図１８は、各領域における実際の病的状態スコアの分布及び平均を示す。ＴＲＧ病的状態は、頸部及び腰部ＤＲＧと類似していた（有意ではない）が、胸部ＤＲＧは、重症度のスコアが低かった（ｐ＝０．００７）。ＳＣ領域スコアはいずれも、それらの対応するＤＲＧスコアよりも有意に悪く（ｐ＜０．０００１）、このことは、いくつかのＤＲＧからの一致したＳＣ照合軸索であり、それは、より
多くの病変を含むことを意味している。切片の大部分は、正常又は低い（グレード１）重症度スコアを有し、グレード４のスコアはほとんど報告されておらず、グレード５のスコアは非常に稀にしか報告されていない（グレード５は、平均高倍率視野における病変によって影響を受ける組織表面の９５％以上に相当する）（図１８）。精神状態、姿勢、及び歩行のケージ側評価、並びに脳神経、固有受容、運動強度、感覚機能、及び反射の拘束された評価を伴う神経学的検査を実施した。ＡＡＶ ＩＣＭ又はＬＰを投与された２０４匹の動物のうち、運動失調及び／又は振戦の臨床的徴候を有する明らかな病的状態が発現したのは３匹のみであった。全ての３つの受けたベクターは、１Ｅ＋１３ ＧＣを超える用量でＧＦＰをコードし、病的状態は、注射の２１日後に現れた。正中神経の神経伝導速度は、５６匹の動物で記録された。２つは、注射から２８日後で、顕著な両側感覚振幅低減を発現し、剖検まで持続した。これは、顕著な（グレード４の重症度の）軸索障害及び正中神経の神経内膜線維症と相関関係にあったが、明らかな臨床の後遺症はなかった。ほとんどの動物は、末梢神経における軸索障害及び線維症の重症度グレードが低かった（図１９）。
考察
ＤＲＧ病的状態及び二次軸索障害は、本発明者らのＮＨＰ研究の大部分では最小限であり、訓練されていない目で発見することは困難な可能性がある。ＩＣＭ ＡＡＶ投与を評価する本発明者らの最初のＧＬＰ毒性研究（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ
Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０，７９－８８，２０１８）では、初期病理評価を行ったＣＲＯは、神経病理で経験を積んだ査読病理学者によってのみ捕捉された病変を見逃した。神経変性はまばらであり、ＤＲＧは、ほとんど正常なニューロンと所与の切片上の数少ない変性事象とのモザイクであるため、堅牢な組織学的分析のために複数のＤＲＧを収集する必要があることを発見した（脊髄領域当たり少なくとも３つを推奨する）。ＤＲＧニューロン損傷を検出し、定量化する、より簡単な方法は、脊髄における軸索変性を評価することによって、細胞体内の病的状態の二次的な結果を評価することを伴う。このことは、検出が容易であり、複数のＤＲＧから来る上行線維の照合を表す。
正しい組織を収集し、慎重に分析したところ、本発明者らは、ＡＡＶ ＩＣＭを受けたＮＨＰの８３％、及びＡＡＶ ＩＶを受けたＮＨＰの３２％において、ＤＲＧ病的状態の証拠をいくつか発見した。病的状態を示すＩＶ用量は、１Ｅ＋１３ ＧＣ／ｋｇと低く、この用量は、いくつかの血友病試験のために診療所で現在評価されている（Ｂ．Ｓ．Ｄｏｓｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｒ．Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ ９，２７３－２９３，２０１８）。製造精製方法は、病的状態に影響を及ぼさなかった。本発明者らが試験した全てのカプシド及び全てのプロモーターは、あるレベルのＤＲＧ病的状態を示し、このことは、カプシド又はプロモーターを変更することが実行可能な解決策ではないことを示唆する。非臨床研究の設計と臨床翻訳に関連して、注射時の用量及び年齢が重症度に顕著に影響を及ぼす一方で、性別は影響を及ぼさないことが分かった。病的状態の重症度に最も大きな影響を及ぼす本発明者らの研究の態様は、導入遺伝子であり、これは、導入遺伝子の過剰発現が変性につながる初期の事象を駆動するという本発明者らの仮説と一致する。ほとんどの導入遺伝子について、最小有効用量（ＭＥＤ）を上回る無有害作用量（ＮＯＡＥＬ）を特定することはできなかった。
時間経過は、急性時点（すなわち、１４日以下）は組織病理を示さない一方で、より長い研究（すなわち、１８０日を超える）は、より重症度の低い病的状態を示す傾向があり、このことが、経時的な進行の欠如及び可能な部分寛解を示唆するため、研究設計のために考慮することが重要である。本発明者らの保健当局での経験には、２つの剖検時点を組み込むことを含んでおり、１つは、病的状態の発症後（すなわち、約１ヶ月）であり、もう１つは、病的状態が悪化していないことを示すためのものである（すなわち、４～６ヶ
月）。本発明者らのメタアナリシスに含まれる１ヶ月齢で投与された４匹のＮＨＰ乳幼児は、動物が注射のほぼ４年後に剖検されたときに良好な導入遺伝子発現レベルがあったにもかかわらず、ＤＲＧ及びＳＣ軸索病的状態が存在しないことが顕著であった（Ｊ．Ｈｏｒｄｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３０，９５７－９６６，２０１９）。この観察結果は、乳幼児への投与時のより良好な安全プロファイル、又は急性病的状態が進行せず、実際に解消することを示唆している可能性がある。この研究では、早期の時点での剖検はなかった。
治療用導入遺伝子（すなわち、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子ではない）を受けた動物のいずれも、臨床所見を示さなかった。後の研究で、本発明者らは、神経伝導速度測定の使用を通じた感覚ニューロン病的状態の日常的なモニタリングを組み込んだ。本発明者らは、臨床的後遺症の証拠はなく、より重度の末梢神経軸索障害及び線維症（すなわち、グレード４の重症度）に関連する２匹の動物においてＮＣＶ異常を発見した。
まとめると、本発明者らは、ＤＲＧにおける病的状態が、ＡＡＶベクターがクモ膜下腔空間に送達されるとき、及び多くの研究において、より高い用量が全身投与されるとき、ほぼ全てのＮＨＰ研究において一貫した所見であることを示す。本発明者らのメタアナリシスは、顕著な臨床的後遺症が存在しないことが驚くべきことである。他の種における他の非臨床研究の慎重な分析は、新生児ブタを除いてＤＲＧ病的状態の証拠を示すことができず、このことは、ＮＨＰがこの潜在的な病的状態を評価するための最良のモデルであることを示唆している。ヒトＣＮＳ試験及び高用量ＩＶ研究における感覚神経障害のモニタリングは、臨床的に顕著なＤＲＧ病的状態が生じるかどうかを決定することは慎重であるように思われる。
実施例１１：対照ＮＨＰの背景病的状態
以前の研究からの結果の分析を実施して、既存対照ＮＨＰ動物（ナイーブ対照及びビヒクル投与対照を含む）からの組織における病的状態のバックグラウンドレベルを決定した。合計で、７匹のナイーブ動物及び１７匹のビヒクル投与（ＩＣＭを介して）対照からデータを収集した。結果は、ＣＮＳ及びＰＮＳにおける病的状態の発生率が概して低かったことを示した。ＡＡＶ関連ＤＲＧ／ＴＲＧ毒性は、典型的には、浸潤の有無にかかわらず、ニューロン細胞体の変性に関連付けられる。対照動物では、この所見は、ビヒクル投与された動物１３匹のうちの４匹、及びナイーブな動物４匹のうちの１匹に存在した（図３０Ａ）。脊髄では、ビヒクル投与動物１７匹のうち０匹、及びナイーブ動物６匹のうち１匹で、背側感覚性白質路における軸索変性（軸索障害）が観察された（図３０Ｂ）。末梢神経において、神経感覚線維における軸索変性（軸索症）は、ビヒクル投与された１４匹の動物のうちの３匹、及び４匹のナイーブ動物のうちの１匹で観察された（図３０Ｃ）。
ＤＲＧ毒性が観察された場合、重症度は、１（最小）までスコア化された。ＡＡＶベクターの送達は、グレード１所見の発生率を増加させ、グレード２以上の所見と関連付けられた。ＡＡＶ処置動物対対照動物からのスコアの例を図３１Ａ及び図３１Ｂに示す。
所見は、ＤＲＧ毒性を評価するための可能性のある閾値を示唆する。例えば、高レベルの信頼性は、ＤＲＧ、背側脊髄、及び／又は末梢神経におけるグレード２の所見に割り当てられ得る。代替的に、又は追加的に、毒性は、グレード１所見の発現率の増加に関連付けられ得る。
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
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本明細書に引用される全ての刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。２０１９年１２月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２、２０１８年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／７８３，９５６号、２０１９年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９２４，９７０号、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９１５号、２０２０年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／９７２，４０４０号、２０２０年４月６日に出願された米国仮特許出願第６３／００５，８９４号、２０２０年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０２３，５９３号、２０２０年６月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，４８８号、２０２０年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０４３，５６２号、２０２０年９月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／０７９，２９９号、及び２０２１年２月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２，０４２号は、それらの全てが参照により本明細書に援用される。同様に、本明細書に参照され、添付の配列表（２１－９５９４ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ）に表示される配列番号は、参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に収まることが意図される。

Claims (40)

  1. 後根神経節（ＤＲＧ）における遺伝子産物の発現を特異的に抑制する前記遺伝子産物を、それを必要とする患者に送達するための組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶが、中にベクターゲノムがパッケージングされたＡＡＶカプシドを含み、前記ベクターゲノムが、
    （ａ）前記ベクターゲノムを含む細胞において前記遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、前記遺伝子産物のコード配列と、
    （ｂ）少なくとも８つのｍｉＲ標的配列であって、各標的配列が、ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的であり、前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、前記コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列と、を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）。
  2. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ－１８３に特異的な、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの標的配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  3. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ－１８２に特異的な、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの標的配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  4. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ－１８３に特異的な少なくとも４つの標的配列、及び／又はｍｉＲ－１８２に特異的な少なくとも４つの標的配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  5. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ－１８３に特異的な４つの標的配列、及びｍｉＲ－１８２に特異的な４つの標的配列を含む、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
  6. 発現カセットが、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列を有する３’ＵＴＲを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  7. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、２００～１２００ヌクレオチド長である３’ＵＴＲにある、請求項１～６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  8. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、連続的であるか、又は１～１０のヌクレオチドのスペーサーによって分離されており、前記スペーサーが、ｍｉＲＮＡ標的配列ではない、請求項１～７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  9. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列の第１のものの５’末端が、遺伝子コード配列の前記３’末端から２０ヌクレオチド以内である、請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  10. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列の第１のものの５’末端が、遺伝子コード配列の前記３’末端から少なくとも１００のヌクレオチドである、請求項１～８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  11. 前記ベクターゲノムが、５’ＵＴＲ中のｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的な少なくとも１つの標的配列を更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  12. 前記少なくとも８つの標的配列の各々が、
    （ａ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（配列番号１）、又は
    （ｂ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  13. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、連続的であり、スペーサーによって分離されていない、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  14. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列の各々が、スペーサーによって分離され、各スペーサーが、独立して、（ｉ）ＧＧＡＴ（配列番号５）、（ｉｉ）ＣＡＣＧＴＧ（配列番号６）、又は（ｉｉｉ）ＧＣＡＴＧＣ（配列番号７）のうちの１つ以上から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  15. スペーサーが、前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列の各々と、第１のｍｉＲＮＡ標的配列の３’及び／又は最後のｍｉＲ標的配列の５’との間に位置する、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  16. 前記ベクターゲノムが、組織特異的プロモーターを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  17. 前記ベクターゲノムが、中枢神経系特異的プロモーター、筋特異的プロモーター、心臓特異的プロモーター、又は肝臓特異的プロモーターを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  18. 前記ベクターゲノムが、構成的プロモーターを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  19. 後根神経節（ＤＲＧ）における遺伝子産物の発現を特異的に抑制する遺伝子送達のための組成物であって、核酸配列である発現カセットを含み、
    （ａ）前記発現カセットを含む細胞において前記遺伝子産物の発現を導く調節配列の制御下にある、前記遺伝子産物のコード配列と、
    （ｂ）少なくとも８つのｍｉＲ標的配列であって、各標的配列が、ｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的であり、前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、前記コード配列の３’末端に作動可能に連結されている、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列と、を含む核酸配列である前記発現カセットを含む、組成物。
  20. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ－１８３に特異的な、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの標的配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ－１８２に特異的な、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つの標的配列を含む、請求項１９に記載の組成物。
  22. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ－１８３に特異的な少なくとも４つの標的配列、及び／又はｍｉＲ－１８２に特異的な少なくとも４つの標的配列を含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、ｍｉＲ－１８３に特異的な４つの標的配列、及びｍｉＲ－１８２に特異的な４つの標的配列を含む、請求項１９～２２のいずれか一項に記
    載の組成物。
  24. 前記発現カセットが、少なくとも８つのｍｉＲ標的配列を有する３’ＵＴＲを含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 少なくとも８つのｍｉＲ標的配列を有する前記３’ＵＴＲが、２００～１２００ヌクレオチド長である、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、連続的であるか、又は１～１０のヌクレオチドのスペーサーによって分離されており、前記スペーサーが、ｍｉＲ標的配列ではない、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列の第１のものの５’末端が、遺伝子コード配列の前記３’末端から２０ヌクレオチド以内である、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列の第１のものの５’末端が、遺伝子コード配列の前記３’末端から少なくとも１００のヌクレオチドである、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記発現カセットが、５’ＵＴＲ中のｍｉＲ－１８３又はｍｉＲ－１８２に特異的な少なくとも１つの標的配列を更に含む、請求項１９～２８のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記少なくとも８つの標的配列の各々が、
    （ａ）ＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＴＧＣＣＡＴＡ（配列番号１）、又は
    （ｂ）ＡＧＴＧＴＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＡＴＴＧＣＣＡＡＡ（配列番号３）を含む、請求項１９～２９のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列が、連続的であり、スペーサーによって分離されていない、請求項１９～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記少なくとも８つのｍｉＲ標的配列の各々が、スペーサーによって分離され、各スペーサーが、独立して、（ｉ）ＧＧＡＴ（配列番号５）、（ｉｉ）ＣＡＣＧＴＧ（配列番号６）、又は（ｉｉｉ）ＧＣＡＴＧＣ（配列番号７）のうちの１つ以上から選択される、請求項１９～３０のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記少なくとも８つのｍｉＲＮＡ標的配列の各々の間の前記スペーサーが、同じである、請求項２６～３０又は３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記発現カセットが、組換えパルボウイルス、組換えレンチウイルス、組換えレトロウイルス、又は組換えアデノウイルスであるウイルスベクターによって担持される、請求項１９～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記発現カセットが、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、無機粒子、脂質粒子、ポリマーベースのベクター、又はキトサンベースの製剤である非ウイルスベクターによって担持される、請求項１９～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 請求項１～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、又は請求項１９～３５のいずれか一項に記載の発現カセット、及び脳室内、髄腔内、大槽内、又は静脈内注入を介した送達に好適な製剤緩衝液を含む、医薬組成物。
  37. 患者におけるＤＲＧニューロンにおける遺伝子産物の発現を抑制する方法であって、前記方法が、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１９～３５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３６に記載の医薬組成物を前記患者に送達することを含む、方法。
  38. 患者への髄腔内又は全身性の遺伝子療法投与後の神経変性を調節し、かつ／又は二次的な背側脊髄軸索変性を減少させるための方法であって、前記方法が、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１９～３５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３６に記載の医薬組成物を前記患者に送達することを含む、方法。
  39. 送達された遺伝子産物の発現が、前記患者のＤＲＧニューロンにおいて抑制される、遺伝子送達に使用するための請求項１～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ、請求項１９～３５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３６に記載の遺伝子送達に使用するための医薬組成物。
  40. 送達された導入遺伝子の発現が、前記患者のＤＲＧニューロンにおいて抑制される、患者に導入遺伝子を送達するための請求項１～１８のいずれか一項に記載の前記ｒＡＡＶ、請求項１９～３５のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項３６に記載の医薬組成物を使用する。
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