TW202033768A - 腺相關病毒對cln6聚核苷酸的遞送 - Google Patents

Abstract

本揭示案係關於重組腺相關病毒（rAAV）對蠟樣脂褐質沈積症神經元6（CLN6）聚核苷酸的遞送。本揭示案提供了rAAV及使用所述rAAV對神經元蠟樣脂褐質沈積症或CLN6型巴藤病進行CLN6基因療法的方法。

Description

腺相關病毒對CLN6聚核苷酸的遞送

本揭示案係關於重組腺相關病毒（rAAV）對蠟樣脂褐質沈積症神經元6（CLN6）聚核苷酸的遞送。本揭示案提供了rAAV及使用rAAV對神經元蠟樣脂褐質沈積症（NCL）或CLN6型巴藤病（CLN6-Batten Disease）進行CLN6基因療法的方法。

神經元蠟樣脂褐質沈積症（NCL）係一組嚴重的神經退行性疾病，其被統稱為巴藤病。此等疾病影響神經系統並且通常導致例如運動及思考能力的惡化問題。不同的NCL以其遺傳原因為特徵。

CLN6型巴藤病可以以兩種不同的形式出現：變異的晚期嬰兒（vLINCL），更常見的形式，及成人發作的NCL（亦稱為A型庫夫斯病）（Cannelii等人，《生物化學與生物物理學研究通訊（Biochem Biophys Res Commun.）》2009；379(4):892-7，Arsov等人，《美國人類遺傳學期刊（Am J Hum Genet.）》2011；88(5):566-73）。對於vLINCL（此處稱為CLN6型巴藤病），發病年齡為18個月至六歲，並且死亡通常發生在12歲至15歲。CLN6型巴藤病最初表現為兒童早期語言受損及運動/認知發育遲緩，大多數患者在疾病發作後四年內只能坐在輪椅上（Canafoglia等人，《神經病學（Neurology）》2015；85(4):316-24）。疾病進展包含視力喪失、嚴重運動缺陷、復發性癲癇發作、癡呆及其他神經退行性症狀。

CLN6係311個胺基酸的蛋白質，具有七個已預測的跨膜域，並且主要定位於內質網。與其他CLN蛋白一樣，其確切功能仍不清楚；然而，其涉及細胞內運輸及溶酶體功能。目前在CLN6 中存在超過70種特徵性致病突變（Warrier等人，《生物化學與生物物理學報（Biochimica et Biophysica Acta.）》2013；1832(11):1827-30），此等突變中的大多數導致CLN6蛋白的完全喪失或產生被認為高度不穩定及/或無功能的經截斷之CLN6蛋白產物。已描述幾種天然存在之CLN6型巴藤病動物模型；此等模型包含綿羊、犬及小鼠模型。在Cln6^nclf 小鼠模型中發現的自發突變（在本文中稱為「Cln6^nclf 小鼠」）概括了所述疾病的許多病理及行為方面（Morgan等人，《公共科學圖書館期刊（PLoS One）》2013；8(11):e78694）。Cln6^nclf 小鼠含有額外的胞嘧啶插入（c.307insC，P102後的移碼），使得提前終止密碼子與CLN6型巴藤病患者中常見的突變同源（Gao等人，《美國人類遺傳學期刊》2002；70(2):324-35，Wheeler等人，《美國人類遺傳學期刊》2002；70(2):537-42）。

目前，沒有可以逆轉CLN6型巴藤病症狀的療法。因此，本領域中有治療CLN6型巴藤病的需求。

本文提供了使用重組AAV進行CLN6基因療法的方法及產品。

本文提供了編碼CLN6多肽的重組腺相關病毒9（rAAV9），其包括rAAV9基因組，所述rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：雜交雞β-肌動蛋白（CB）啟動子及編碼所述CLN6多肽的聚核苷酸。在一些情況下，所述rAAV9基因組包括自身互補型基因組。可替代地，所述rAAV9基因組包括單股基因組。

提供了自身互補型重組腺相關病毒9（scAAV9），其編碼SEQ ID NO: 1中所示的CLN6多肽，其中所述scAAV9的基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之序列的雜交雞β-肌動蛋白（CB）啟動子；編碼SEQ ID NO: 2中所示之CLN6多肽的聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複。編碼所述CLN6多肽的所述聚核苷酸可以與SEQ ID NO: 2至少90%一致。

亦提供了具有以5'至3'的順序包括以下之基因組的scAAV9：第一AAV末端反向重複；CMV增強子；雜交雞β-肌動蛋白啟動子（cb）；SV40內含子；編碼SEQ ID NO: 1之CLN6多肽的聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複；具有以5'至3'的順序包括以下之基因組的scAAV9：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之序列的CB啟動子；編碼SEQ ID NO: 1之CLN6多肽的聚核苷酸；牛生長激素聚腺苷酸化poly A序列；以及第二AAV末端反向重複；以及具有包括SEQ ID NO: 4之核酸序列中示出之基因匣之基因組的scAAV9。

亦提供具有以5'至3'的順序包括以下之基因組的ssAAV9：第一AAV末端反向重複；CMV增強子；雜交雞β-肌動蛋白啟動子（CB）；SV40內含子；編碼SEQ ID NO: 1之CLN6多肽的聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複；具有以5'至3'的順序包括以下之基因組的ssAAV9：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之序列的CB啟動子；編碼SEQ ID NO: 1之CLN6多肽的聚核苷酸；牛生長激素聚腺苷酸化poly A序列；以及第二AAV末端反向重複；或具有包括SEQ ID NO: 4之核酸序列中示出之基因匣之基因組的ssAAV9。

SEQ ID NO: 4所示的核酸序列係圖1A中提供的基因匣。提供包括scAAV9基因組或ssAAV9基因組的rAAV9，其包括與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少90%一致、與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少95%一致、或與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少98%一致的核酸序列。

進一步提供了核酸分子，其包括：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之核酸序列的CB啟動子；編碼SEQ ID NO: 1之CLN6多肽的核酸序列；以及第二AAV末端反向重複。在一些實施例中，編碼所述CLN6多肽的所述聚核苷酸可以與SEQ ID NO: 2之所述核酸序列至少90%一致。

亦提供了包括以下的核酸分子：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列的CB啟動子；SV40內含子；編碼SEQ ID NO: 1之所述CLN6多肽的核酸序列；以及第二AAV末端反向重複。另外，進一步提供了核酸分子，其包括：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列的CB啟動子；編碼SEQ ID NO: 1之所述CLN6多肽的核酸；BGH poly-A序列；以及第二AAV末端反向重複。在提供的任何聚核苷酸中，CLN6多肽可以由與SEQ ID NO: 2的核酸序列至少90%一致的核酸序列編碼。

提供具有scAAV基因組或ssAAV基因組的rAAV，其中所述基因組包括與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少90%一致、或與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少95%一致、或與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少98%一致的核酸序列。

提供的rAAV可以包括本文揭示的任何聚核苷酸。另外，提供包括任何所揭示核酸的病毒顆粒。亦提供具有自身互補型或單股基因組的rAAV。

亦提供編碼CLN6多肽的重組腺相關病毒9（rAAV9）病毒顆粒，其包括rAAV9基因組，所述rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：包括與SEQ ID NO: 6至少90%一致之核酸序列的CMV增強子；包括與SEQ ID NO: 3至少90%一致之核酸序列的CB啟動子；以及編碼與SEQ ID NO: 1胺基酸序列至少90%一致之CLN6多肽的聚核苷酸。在一些實施例中，提供的rAAV9病毒顆粒包括自身互補型基因組。可替代地，提供的rAAV9病毒顆粒包括單股基因組。

進一步提供了rAAV9病毒顆粒，其中rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；包括與SEQ ID NO: 6至少90%一致之核酸序列的所述CMV增強子；包括與SEQ ID NO: 3至少90%一致之核酸序列的所述CB啟動子；編碼與SEQ ID NO: 1胺基酸序列至少90%一致之CLN6多肽的聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複。提供的rAAV9顆粒包括編碼CLN6多肽的聚核苷酸，其包括與SEQ ID NO: 1至少90%一致的胺基酸序列。任何rAAV9病毒顆粒可以視情況進一步包括SV40內含子及/或BGH poly-A序列。

在另外的實施例中，rAAV9病毒顆粒包括AAV9基因組，所述AAV9基因組包括與SEQ ID NO: 4的序列至少90%一致、與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少95%一致、或與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少98%一致的核酸序列。

在所提供的任何rAAV、ssAAV或scAAV中，AAV末端反向重複可為AAV2末端反向重複。

亦提供了核酸分子，其包括rAAV9基因組，所述rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；包括與SEQ ID NO: 6至少90%一致之核酸序列的CMV增強子；包括與SEQ ID NO: 3至少90%一致之核酸序列的CB啟動子；以及編碼與SEQ ID NO: 1胺基酸序列至少90%一致之CLN6多肽的聚核苷酸。所提供的核酸分子包括自身互補型基因組及/或單股基因組。

進一步提供了核酸分子，其包括rAAV9基因組，所述rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；包括與SEQ ID NO: 6至少90%一致之核酸序列的所述CMV增強子；包括與SEQ ID NO: 3至少90%一致之核酸序列的所述CB啟動子；編碼與SEQ ID NO: 1胺基酸序列至少90%一致之CLN6多肽的聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複。所提供的核酸分子可以包括編碼CLN6多肽的聚核苷酸，其包括與SEQ ID NO: 1胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。另外，所述核酸分子可以包括AAV9基因組，所述AAV9基因組包括與SEQ ID NO: 4的序列至少90%一致、與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少95%一致、或與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少98%一致的核酸序列。提供的任何核酸分子視情況進一步包括SV40內含子及/或BGH poly-A序列。

進一步提供了包括以下的組合物：本文所描述的scAAV9、本文所描述的核酸分子或本文所描述的rAAV病毒顆粒以及至少一種藥學上可接受之賦形劑。在一些情況下，所述藥學上可接受之賦形劑包括非離子低滲透化合物、緩衝液、聚合物、鹽或其組合。在一些實施例中，所述聚合物係共聚物。在一些實施例中，所述共聚物係泊洛沙姆（poloxamer）。例如，所述組合物可以至少包括藥學上可接受之賦形劑，其包括非離子低滲透化合物。例如，藥學上可接受之賦形劑可以包括約20%至40%的非離子的、低滲化合物或約25%至約35% 非離子低滲透化合物。一種示例性組合物包括調配於20 mM的Tris（pH為8.0）、1 mM MgCl₂ 、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188及約25%至約35%非離子低滲透化合物中的scAAV。另一種示例性組合物包括：在包括0.001%普郎尼克F68（Pluronic F68）之1× PBS中調配的scAAV。

仍進一步提供了治療受試者的CLN6型巴藤病的方法，所述方法包括：向受試者投與包括治療有效量之以下各項的組合物：本文揭示的任何rAAV9、本文揭示的任何scAAV9、本文揭示的任何ssAAV、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何組合物。

本發明還提供了治療有效量的本文所揭示的任何rAAV9、本文所揭示的任何scAAV9、本文所揭示的任何ssAAV、本文所述的任何核酸分子或本文所述的任何組合物，用於製備治療CLN6型巴藤病的藥物。

還提供了包括治療有效量的本文所揭示的任何rAAV9、本文所揭示的任何scAAV9、本文所揭示的任何ssAAV、本文所述的任何核酸分子或本文所述的任何組合物的組合物，用於治療CLN6型巴藤病。

在所提供的用於治療CLN6型巴藤病的任何方法、用途或組合物中，所述組合物、rAAV9、scAAV9或ssAAV及/或核酸分子藉由選自由以下組成之群的途徑投與：鞘內、腦室內、腦實質內、靜脈內及其組合。

藉由鞘內途徑投與的scAAV9、ssAAV或rAAV9的示例性劑量係約1×10¹¹ vg的所述scAAV、ssAAV或rAAV9病毒顆粒至約1×10¹⁵ vg的所述scAAV或AAV9病毒顆粒；或約1×10¹² vg的所述scAAV、ssAAV或rAAV9病毒顆粒至約1×10¹⁴ vg的所述scAAV、ssAAV或AAV9病毒顆粒。例如，可以將約1×10¹³ vg的所述scAAV、ssAAV或rAAV9病毒顆粒投與受試者；或者可以將約1.5×10¹³ 的所述scAAV、ssAAV或rAAV9病毒顆粒投與受試者；或者可以將約6×10¹³ vg的所述scAAV、ssAAV或rAAV9病毒顆粒投與受試者。

與治療前的受試者或未治療的CLN6型巴藤病患者相比，本文揭示的用於治療CLN6型巴藤病的方法、用途或組合物使受試者出現以下中的一者或多者：（a）自發螢光儲存材料的溶酶體聚集減少或減緩，（b）ATP合成酶亞單位C的溶酶體聚集減少或減緩，（c）膠質細胞活化（星形膠質細胞及/或小膠質細胞）活化減少或減緩，（d）星形細胞增生減少或減緩，（e）藉由MRI測量的腦量損失減少或減緩，（f）癲癇發作減少或減緩，以及（g）用於評估CLN6型巴藤病進展及/或改善的量表（例如統一巴藤病評定系統（UBDRS）評估量表、漢堡運動及語言量表（Hamburg Motor and Language Scale）或馬倫早期學習量表（Mullen Scales of Early Learning，MSEL））中之一項或多項穩定、進展減少或改善。在投與本文揭示的rAAV9、ssAAV9病毒顆粒、scAAV或核酸分子後，受試者可以保持在特倫德倫伯格位置。

仍進一步提供治療有需要之患者之CLN6疾病的方法，所述方法包括：將包括以下的組合物遞送至有需要之患者的腦或脊髓：本文提供的任何一種rAAV病毒顆粒、本文揭示的任何scAAV9、本文揭示的任何ssAAV9、本文所描述的任何核酸分子或本文所描述的任何組合物。

此外，本發明提供了本文所揭示的任何rAAV病毒顆粒、本文所揭示的任何scAAV9、本文所揭示的任何ssAAV9、本文所述的任何核酸分子或本文所述的任何組合物的用途，用於製備用於將所述ssAAV9、核酸分子或組合物遞送至有需要的患者的大腦或脊髓的藥物。

還提供了包括本文所揭示的任何rAAV病毒顆粒、本文所揭示的任何scAAV9、本文所揭示的任何ssAAV9、本文所述的任何核酸分子或本文所述的任何組合物的組合物，用於將所述ssAAV9、核酸分子或組合物遞送至有需要的患者的大腦或脊髓。

在所提供的任何方法、用途或組合物中，組合物可以藉由鞘內、腦室內、腦實質內或靜脈內注射或其組合來遞送。所提供的任何方法進一步包括在鞘內注射本文揭示的組合物、rAAV9、ssAAV9或scAAV或核酸分子後將患者置於特倫德倫伯格位置。

在所提供的任何方法、用途或組合物中，所述組合物可以包括非離子低滲透造影劑。例如，所述組合物可以包括非離子低滲透造影劑，其中所述非離子低滲透造影劑選自由以下組成之群：碘比醇（iobitridol）、碘海醇（iohexol）、碘美普爾（iomeprol）、碘帕醇（iopamidol）、碘噴托（iopentol）、碘普胺（opromide）、碘佛醇（ioversol）、碘昔蘭（ioxilan）及其組合。

投與的所述組合物或藥物可以包括藥學上可接受之賦形劑。例如，所述藥學上可接受之賦形劑可以包括約20%至40%的非離子低滲透化合物或約25%至約35%的非離子低滲透化合物。一種示例性組合物包括調配於20 mM Tris（pH為8.0）、1 mM MgCl2、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188及約25%至約35%非離子低滲透化合物中的scAAV。另一種示例性組合物包括調配於1X PBS及0.001%普郎尼克F68中的scAAV。

在所提供的任何方法、用途或組合物中，可以將組合物或藥物遞送至腦或脊髓，可以將組合物或藥物遞送至腦幹、或可以將其遞送至小腦、可以將其遞送至視覺皮質、或可以將其遞送至運動皮質。另外，在所提供的任何方法中，可以將所述組合物或藥物遞送至腦或脊髓，可以將所述組合物遞送至神經細胞、神經膠質細胞或兩者。例如，其中所述遞送至所述腦或脊髓包括遞送至神經系統的細胞，如神經元、下運動神經元、小神經膠質細胞、少突膠質細胞、星形膠質細胞、許旺氏細胞（Schwann cell）或其組合。

與治療前的受試者相比或與未治療的CLN6型巴藤病受試者相比，本文揭示的方法、用途及組合物使受試者出現以下中的一種或多種：（a）自發螢光儲存材料的溶酶體聚集減少或減緩，（b）ATP合成酶亞單位C的溶酶體聚集減少或減緩，（c）膠質細胞活化（星形膠質細胞及/或小膠質細胞）活化減少或減緩，（d）星形細胞增生減少或減緩，（e）藉由MRI測量的腦量損失減少或減緩，（f）癲癇發作減少或減緩，以及（g）用於評估CLN6型巴藤病進展及/或改善的量表（例如統一巴藤病評定系統（UBDRS）評估量表、漢堡運動及語言量表或馬倫早期學習量表（MSEL））中之一項或多項穩定、進展減少或改善。

在本文所描述的任何方法、組合物及用途中，所述治療、組合物或藥物穩定或減緩CLN6型巴藤病的進展。詳言之，使用UBDRS量表、漢堡運動及語言量表、使用小兒生活品質（PEDSQOL）量表所測量的治療對生活品質的影響、馬倫早期學習量表（MSEL）、延長存活期的可能性或其組合來評估疾病進展。

在本文所描述的任何方法、用途或組合物中，所述治療、組合物或藥物減少或減緩CLN-6巴藤病的選自以下的一種或多種症狀：（a）腦量損失；（b）認知功能喪失；以及（c）語言發展遲緩；此係與未治療的CLN6-巴藤病患者相比而言的。詳言之，所述治療穩定或減緩CLN6型巴藤病的疾病進展。舉例而言，使用UBDRS量表、漢堡運動及語言量表、使用小兒生活品質（PEDSQOL）量表所測量的治療對生活品質的影響、馬倫早期學習量表（MSEL）、延長存活期的可能性或其組合來評估疾病進展。

在本文所描述的任何方法、用途或組合物中，受試者的年齡為80個月或以下、75個月或以下、70個月或以下、65個月或以下、62個月或以下、60個月或以下、55個月或以下、50個月或以下或40個月或以下。

鑒於CLN6型巴藤病沒有有效的治癒方法，因此Cln6^nclf 小鼠模型用於測試藉由腺相關病毒（AAV）介導基因療法引入功能性人類CLN6 的功效。本文提供的臨床前結果表明，使用AAV-血清型9允許在整個CNS中有效表現人類CLN6蛋白，其中最受影響的細胞位於CNS中。為了評估在較大動物模型中治療的安全性，藉由鞘內腰椎CSF注射給三隻四歲的食蟹猴（Cynomolgus Macaques）投與scAAV9.CB.CLN6並且在注射後監測長達六個月。沒有觀察到不良反應或病理學，而在所有動物的整個腦及脊髓中發現高水準的轉殖基因表現。將scAAV9.CB.CLN6單次出生後腦室內（ICV）注射到小鼠的CSF中，在Cln6^nclf 小鼠活體內誘導轉殖基因的持續表現。投與scAAV9.CB.CLN6降低了所述疾病的典型標誌，包含自發螢光存儲材料及ATP合酶亞單位C的聚集、反應性膠質細胞增生及樹突棘的喪失。重要的是，此基因療法治療可以帶來廣泛的功能益處，因為其可以防止Cln6^nclf 小鼠的許多運動、記憶及學習以及生存缺陷。此等結果強烈強調了CSF遞送的scAAV9.CB.CLN6用於治療CLN6型巴藤病的治療潛力。

本文的標題係為了方便讀者而非限制性的。

本文中「可能/可以（may）」及「能夠（can）」的使用係描述申請專利範圍中包含的各種實施例，而非指申請專利範圍範圍的不確定性。

本申請案主張2019年2月4日提交的美國臨時專利申請案第62/800,915號、2019年7月20日提交的美國臨時專利申請案第62/880,641號、2019年7月31日提交的美國臨時專利申請案第62/881,151號、2019年10月9日提交的美國臨時專利申請案第62/912,977號及2019年10月18日提交的美國臨時專利申請案第62/923,125號的優先權，此等申請案均以全文引用的方式併入本文。序列表以引用的方式併入

本申請案含有電腦可讀形式的序列表（檔案名：53894_SeqListing.txt；24,923個位元組-於2020年1月31日建立的ASCII文本檔案）作為揭示案的單獨部分，所述序列表以全文引用的方式併入本文。

本揭示案提供了用於治療CLN6型巴藤病的方法及產品。所述方法涉及使用rAAV作為基因遞送載體將CLN6聚核苷酸遞送至受試者。

腺相關病毒（AAV）係複製缺陷型細小病毒，其單股DNA基因組長度約為4.7 kb，包含兩個145個核苷酸的末端反向重複（ITR）並且可用於指病毒本身或其衍生物。所述術語涵蓋所有亞型以及天然存在及重組的形式，除非另有說明。存在多種血清型AAV。AAV的血清型各自與特定進化枝相關，其成員具有血清學及功能相似性。因此，進化枝亦可以指AAV。例如，AAV9序列稱為「進化枝F」序列（Gao等人，《病毒學期刊（J. Virol.）》，78: 6381-6388（2004）。本揭示案設想在特定進化枝內使用任何序列，例如進化枝F。AAV血清型的基因組的核苷酸序列係已知的。例如，AAV-1的完整基因組在GenBank寄存號NC_002077中提供；AAV-2的完整基因組在GenBank寄存號NC_001401及Srivastava等人，《病毒學期刊》，45: 555-564（1983）中提供；AAV-3的完整基因組在GenBank寄存號NC_1829中提供；AAV-4的完整基因組在GenBank寄存號NC_001829中提供；AAV-5基因組在GenBank寄存號AF085716中提供；AAV-6的完整基因組在GenBank寄存號NC_00 1862中提供；至少部分AAV-7及AAV-8基因組分別在GenBank寄存號AX753246及AX753249中提供；AAV-9基因組在Gao等人，《病毒學期刊》，78: 6381-6388 （2004）中提供；AAV-10基因組在《分子療法（Mol. Ther. ）》，13 (1): 67-76（2006）中提供；AAV-11基因組在《病毒學（Virology ）》，330 (2): 375-383（2004）中提供；AAV-12基因組的部分在Genbank寄存號DQ813647中提供；AAV-13基因組的部分在Genbank寄存號EU285562中提供。參見美國專利9,434,928中提供了AAV rh.74基因組的序列，其以引用的方式併入本文。AAV-B1基因組的序列在Choudhury等人 ，《分子療法》，24 (7): 1247-1257（2016）中提供。引導病毒DNA複製（rep）、衣殼化/包裝及宿主細胞染色體整合的順式 作用序列包含在ITR中。三個AAV啟動子（其相對圖譜位置命名為p5、p19及p40）驅動編碼rep及cap基因的兩個AAV內部開放閱讀框的表現。兩個rep啟動子（p5及p19）與單個AAV內含子的差異剪接（在核苷酸2107及2227處）結合導致從rep基因產生四種rep蛋白（rep 78、rep 68、rep 52及rep 40）。Rep蛋白具有多種酶特性，所述酶特性最終負責複製病毒基因組。cap基因由p40啟動子表現，並且其編碼三種衣殼蛋白VP1、VP2及VP3。替代性剪接及非共有轉譯起始位點負責產生三種相關的衣殼蛋白。單一共有聚腺苷酸化位點位於AAV基因組的圖譜位置95處。AAV的生命週期及遺傳學在Muzyczka,《當前微生物學及免疫學的話題（Current Topics in Microbiology and Immunology）》,158 : 97-129（1992）中評論。

AAV具有獨特的特徵，此使其作為例如在基因治療中將外源DNA遞送至細胞的載體具有吸引力。培養中細胞的AAV感染係非細胞病變的，並且人類及其他動物的自然感染係沉默的及無症狀的。而且，AAV感染許多哺乳動物細胞，允許活體內靶向許多不同組織的可能性。而且，AAV轉導緩慢分裂及非分裂細胞，並且可以作為轉錄活性核游離基因體（染色體外元件）在彼等細胞的壽命期間基本上持久存在。原生AAV前病毒基因組作為質體中的所選殖DNA具有感染性，此使得重組基因組的構建成為可能。此外，由於引導AAV複製、基因組衣殼化及整合的信號包含在AAV基因組的ITR中，因此部分或全部內部約4.3 kb的基因組（編碼複製及結構衣殼蛋白，rep-cap）可以用如含有啟動子、感興趣的DNA及聚腺苷酸化信號的基因匣等外源DNA置換。在一些情況下，rep及cap蛋白以反式 提供。AAV的另一個顯著特徵係其為極其穩定且強健的病毒。它易於承受用於滅活腺病毒的條件（56℃至65℃，持續數小時），使AAV的冷保存不太重要。甚至可以將AAV凍乾。最後，AAV感染的細胞不耐受重複感染。

如本文所使用的術語「AAV」係指野生型AAV病毒或病毒顆粒。術語「AAV」、「AAV病毒」及「AAV病毒顆粒」在本文中可互換使用。術語「rAAV」係指重組AAV病毒或重組感染性包封的病毒顆粒。術語「rAAV」、「rAAV病毒」及「rAAV病毒顆粒」在本文中可互換使用。

術語「rAAV基因組」係指衍生自已經修飾的天然AAV基因組的聚核苷酸序列。在一些實施例中，已經修飾rAAV基因組以移除天然cap及rep基因。在一些實施例中，rAAV基因組包括內源性5'及3'末端反向重複（ITR）。在一些實施例中，rAAV基因組包括來自AAV血清型的ITR，所述AAV血清型不同於衍生AAV基因組的AAV血清型。在一些實施例中，rAAV基因組包括感興趣的轉殖基因（例如，編碼CLN6的聚核苷酸），其藉由末端反向重複（ITR）側接在5'及3'末端。在一些實施例中，rAAV基因組包括「基因匣」。示例性基因匣在圖1A中及SEQ ID NO: 4的核酸序列中示出。rAAV基因組可為自身互補型（sc）基因組，其在本文中稱為「scAAV基因組」。可替代地，rAAV基因組可為單股（ss）基因組，其在本文中稱為「ssAAV基因組」。

術語「scAAV」係指包括自身互補型基因組的rAAV病毒或rAAV病毒顆粒。術語「ssAAV」係指包括單股基因組的rAAV病毒或rAAV病毒顆粒。

本文提供的rAAV基因組可以包括編碼CLN6多肽的聚核苷酸。CLN6多肽包括SEQ ID NO: 1中所示的胺基酸序列，或具有與SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之胺基酸序列的多肽，並且其編碼具有CLN6活性的多肽（例如，與例如治療前的患者相比，治療時，溶酶體自發螢光存儲材料的清除率增加、ATP合酶亞單位C的溶酶體聚集減少、以及患者中星形膠質細胞及小膠質細胞的活化減少中的至少一種）。

在一些情況下，本文提供的rAAV基因組包括編碼CLN6多肽的聚核苷酸，其中所述聚核苷酸具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列，或與SEQ ID NO: 2所闡述的核苷酸序列至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的聚核苷酸，並且編碼具有CLN6活性的多肽（例如，與例如治療前的患者相比，治療時，溶酶體自發螢光存儲材料的清除率增加、ATP合酶亞單位C的溶酶體聚集減少、以及患者中星形膠質細胞及小膠質細胞的活化減少中的至少一種）。

在一些實施例中，本文提供的rAAV基因組包括編碼具有CLN6活性的多肽，並且在嚴格條件下與SEQ ID NO: 2的核酸序列或其互補序列雜交的聚核苷酸序列。術語「嚴格」用於指本領域通常理解為嚴格的條件。雜交的嚴格性主要由溫度、離子強度、以及如甲醯胺等變性劑的濃度確定。用於雜交及洗滌的嚴格條件的實例包含但不限於0.015 M氯化鈉、65℃至68℃下0.0015 M檸檬酸鈉，或0.015 M氯化鈉、0.0015 M檸檬酸鈉及42℃下50%甲醯胺。參見例如Sambrook等人，《分子選殖：實驗室手冊（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）》，第2版，冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory），（紐約冷泉港（Cold Spring Harbor, N.Y.），1989）。

在一些實施例中，本文提供的rAAV基因組包括側接編碼CLN6多肽的聚核苷酸的一個或多個AAV ITR。CLN6聚核苷酸可操作地連接到轉錄控制元件（包含但不限於啟動子、增強子及/或聚腺苷酸化信號序列），所述轉錄控制元件在靶細胞中起作用以形成基因匣。啟動子的實例係雞β肌動蛋白啟動子及P546啟動子。本文設想了其他啟動子，包含但不限於猿猴病毒40（SV40）早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）、人類免疫缺乏病毒（HIV）長末端重複（LTR）啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barr virus）立即早期啟動子、勞氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus）啟動子、以及人類基因啟動子，如但不限於肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、延伸因子-1a啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。本文另外提供的係SEQ ID NO: 3中示出的CB啟動子序列，及  與SEQ ID NO: 3中所闡述的核苷酸序列至少65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的啟動子序列，其係具有CB轉錄促進活性的啟動子。轉錄控制元件的其他實例係組織特異性控制元件，例如，允許在神經元內特異性表現或在星形膠質細胞內特異性表現的啟動子。實例包含神經元特異性烯醇酶及膠質原纖維酸性蛋白啟動子。亦設想了誘導型啟動子。誘導型啟動子的非限制性實例包含但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素調節的啟動子。基因匣亦可以包含內含子序列，以便在哺乳動物細胞中表現時促進CLN6 RNA轉錄物的加工。此內含子的一個實例係SV40內含子。

「包裝」係指一系列細胞內事件，其引起AAV顆粒的組裝及衣殼化。術語「生產」係指藉由包裝細胞生產rAAV（感染性的、包封的rAAV顆粒）的過程。

AAV「rep」及「cap」基因分別係指編碼腺相關病毒的複製及衣殼化蛋白的聚核苷酸序列。AAV rep及cap在本文中稱為AAV「包裝基因」。

AAV的「輔助病毒」係指允許AAV（例如野生型AAV）被哺乳動物細胞複製及包裝的病毒。用於AAV的多種此類輔助病毒係本領域已知的，包含腺病毒、疱疹病毒及如牛痘病毒等痘病毒。腺病毒可以涵蓋許多不同的亞組，儘管最常用的係亞組C的5型腺病毒。許多人類、非人類哺乳動物及禽類的腺病毒係已知的並且可從如ATCC等寄存處獲得。疱疹病毒家族的病毒包含例如單純疱疹病毒（HSV）及愛潑斯坦-巴爾病毒（EBV），以及巨細胞病毒（CMV）及偽狂犬病病毒（PRV）；此等亦可以從如ATCC等寄存處獲得。

「一種或多種輔助病毒功能」係指在輔助病毒基因組中編碼的一種或多種功能，其允許AAV複製及包裝（結合本文所描述的複製及包裝的其他要求）。如本文所描述，「輔助病毒功能」可以以多種方式提供，包含藉由提供輔助病毒或向反式生產細胞提供例如編碼一種或多種必需功能的聚核苷酸序列。

本文提供的rAAV基因組缺乏AAV rep及cap DNA。本文設想的rAAV基因組（例如ITR）中的AAV DNA可以來自適於衍生重組病毒的任何AAV血清型，包含但不限於AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13、AAV rh.74及AAV-B1。如上文所述，各種AAV血清型的基因組的核苷酸序列係本領域已知的。亦設想了具有衣殼突變的rAAV。參見例如Marsic等人 ,《分子療法（Molecular Therapy）》,22 (11): 1900-1909（2014）。本文亦設想了修飾的衣殼，並且包含具有各種轉譯後修飾的衣殼，如糖基化及脫醯胺。天冬醯胺或麩醯胺酸側鏈的脫醯胺作用導致天冬醯胺殘基轉化為天冬胺酸或異天冬胺酸殘基，並且本文提供的rAAV衣殼中設想了麩醯胺酸向麩胺酸或異麩胺酸的轉化。參見例如，Giles等人，《分子療法》，26(12): 2848-2862（2018）。本文亦設想了修飾的衣殼包括將rAAV導向受影響的組織及需要治療的器官的靶向序列。

本文提供的DNA質體包括本文所描述的rAAV基因組。可以將DNA質體轉移至允許用AAV的輔助病毒（例如腺病毒、E1缺失的腺病毒或疱疹病毒）感染的細胞中，以將rAAV基因組裝配到具有AAV9衣殼蛋白的感染性病毒顆粒中。產生rAAV的技術係本領域的標準，其中將待包裝的rAAV基因組、rep及cap基因以及輔助病毒功能提供給細胞。rAAV顆粒的產生需要以下組分存在於單個細胞內（在本文中表示為包裝細胞）：rAAV基因組、與rAAV基因組分開（亦即不在其中）的AAV rep及cap基因，以及輔助病毒功能。AAV rep及cap基因可以來自任何可以衍生重組病毒的AAV血清型，並且可以來自與rAAV基因組ITR不同的AAV血清型。假型rAAV的產生在例如WO 01/83692中揭示，其以全文引用的方式併入本文。在各種實施例中，可以修飾AAV衣殼蛋白以增強重組rAAV的遞送。對衣殼蛋白的修飾通常係本領域已知的。參見例如US 2005/0053922及US 2009/0202490，其揭示內容以全文引用的方式併入本文。

產生包裝細胞的方法係建立穩定表現rAAV產生之所有必需組分的細胞系。例如，包括缺乏AAV rep及cap基因的rAAV基因組的質體（或多個質體）、與rAAV基因組分開的AAV rep及cap基因、以及如新黴素抗性基因等可選擇的標記可以整合至細胞的基因組中。可以藉由如GC拖尾等程序將rAAV基因組引入細菌質體中（Samulski等人，1982，《美國國家科學院院刊（Proc. Natl. Acad. S6. USA）》，79:2077-2081），添加含有限制性核酸內切酶裂解位點的合成連接子（Laughlin等人，1983，《基因（Gene）》，23:65-73）或藉由直接鈍端連接（Senapathy及Carter，1984，《生物化學期刊（J. Biol. Chem.）》，259:4661-4666）。接著可以用如腺病毒等輔助病毒感染包裝細胞系。此方法的優點係細胞為可選擇的並且適合於大規模生產rAAV。合適方法的其他非限制性實例採用腺病毒或桿狀病毒而非質體將rAAV基因組及/或rep及cap基因引入包裝細胞。

rAAV顆粒產生的一般原理在例如Carter，1992，《生物技術當前述評（Current Opinions in Biotechnology）》，1533-539；及Muzyczka，1992，《微生物學及免疫學的當前課題（Curr. Topics in Microbial. and Immunol.）》，158:97-129）中評論。各種方法描述於Ratschin等人，《分子與細胞生物學（Mol. Cell. Biol.）》4:2072（1984）；Hermonat等人，《美國國家科學院院刊》，81:6466（1984）；Tratschin等人，《分子與Cell.學》5:3251（1985）；McLaughlin等人,《病毒學期刊》,62:1963（1988）；以及Lebkowski等人，1988《分子與細胞生物學》，7:349（1988）。Samulski等人，（1989，《病毒學期刊》，63:3822-3828）；美國專利號5,173,414；WO 95/13365及對應美國專利號5,658.776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441（PCT/US96/14423）；WO 97/08298（PCT/US96/13872）；WO 97/21825（PCT/US96/20777）；WO 97/06243（PCT/FR96/01064）；WO 99/11764；Perrin等人（1995）《疫苗（Vaccine）》13:1244-1250；Paul等人（1993）《人類基因療法（Human Gene Therapy）》4:609-615；Clark等人（1996）《基因療法（Gene Therapy）》3:1124-1132；美國專利號5,786,211；美國專利號5,871,982；以及美國專利號6,258,595中。前述文獻在此以全文引用的方式併入本文，特別強調與rAAV顆粒產生有關的文獻的彼等部分。

本文進一步提供了產生感染性rAAV顆粒的包裝細胞。在一個實施例中，包裝細胞可為穩定轉型的癌細胞，如HeLa細胞、293細胞及PerC.6細胞（同源293系）。在另一個實施例中，包裝細胞可為未轉型之癌細胞的細胞，如低繼代293細胞（用腺病毒E1轉型的人類胚腎細胞）、MRC-5細胞（人類胚胎成纖維細胞）、WI-38細胞（人類胚胎成纖維細胞）、Vero細胞（猴腎細胞）及FRhL-2細胞（恆河猴胚肺細胞）。

本文亦提供了包括本揭示案之rAAV基因組的rAAV（例如感染性衣殼化的rAAV顆粒）。rAAV的基因組缺乏AAV rep及cap DNA，亦即，在rAAV的基因組的ITR之間不存在AAV rep或cap DNA。rAAV基因組可為自身互補型（sc）基因組。具有sc基因組的rAAV在本文中稱為scAAV。rAAV基因組可為單股（ss）基因組。具有單股基因組的rAAV在本文中稱為ssAAV。

本文提供的示例性rAAV係名為「scAAV9.CB.CLN6」的scAAV。scAAV9.CB.CLN6 scAAV含有scAAV基因組，其包括受雜交雞β-肌動蛋白（CB）啟動子（SEQ ID NO: 3）控制的人類CLN6 cDNA。scAAV基因組亦包括SV40內含子（人類CLN6 cDNA的上游）及牛生長激素聚腺苷酸化（BGH Poly A）終止子序列（人類CLN6 cDNA的下游）。此scAAV9.CB.CLN6基因匣的序列如SEQ ID NO: 4所示。scAAV基因組包裝在AAV9衣殼中，並且包含AAV2 ITR（CB啟動子上游的一個ITR及BGH Poly A終止子序列下游的另一個ITR）。

rAAV可以藉由本領域標準方法純化，如藉由管柱層析法或氯化銫梯度。從輔助病毒中純化rAAV的方法係本領域已知的，並且可以包含在例如Clark等人 ，《人類基因療法》，10(6): 1031-1039（1999）；Schenpp及Clark，《分子醫學方法（Methods Mol. Med. ）》，69: 427-443（2002）；美國專利號6,566,118及WO 98/09657。

亦提供了包括rAAV的組合物。組合物包括編碼CLN6多肽的rAAV。組合物可以包含編碼不同感興趣的多肽的兩種或更多種rAAV。在一些實施例中，rAAV係scAAV或ssAAV。

本文提供的組合物包括rAAV及藥學上可接受之一種或多種賦形劑。可接受之賦形劑對受體無毒，並且較佳為在所採用的劑量及濃度下係惰性的，並且包含但不限於緩衝液，如磷酸鹽[例如磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）]、檸檬酸鹽或其他有機酸；抗氧化劑，如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、精胺酸或賴胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離子，如鈉；及/或非離子界面活性劑，如吐溫、共聚物如泊洛沙姆（poloxamer）188，普郎尼克（pluronics）（如Pluronic F68）或聚乙二醇（PEG）。本文提供的組合物可以包括藥學上可接受之含水賦形劑，其含有非離子低滲透化合物，如碘比醇、碘海醇、碘美普爾、碘帕醇、碘噴托、碘普胺、碘佛醇、碘昔蘭，其中含有非離子的低滲透化合物的水性賦形劑可以具有下列特性中的一者或多者：約180 mgI/mL，蒸氣壓滲透法測定的滲透壓約為322 mOsm/kg水，滲透壓約為273 mOsm/L，在20℃下絕對黏度為約2.3 cp並且在37℃下為約1.5 cp，並且在37℃下的比重為約1.164。示例性組合物包括約20%至40%的非離子低滲透化合物或約25%至約35%的非離子低滲透化合物。一種示例性組合物包括調配於20 mM Tris（pH為8.0）、1 mM MgCl₂ 、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188及約25%至約35%非離子低滲透化合物中的scAAV或rAAV病毒顆粒。另一種示例性組合物包括調配於1X PBS及0.001% 普郎尼克F68中的scAAV。

在本揭示案的方法中待投與的rAAV的劑量將根據例如特定rAAV、投藥方式、投藥時間、治療目標、個體及靶向的一種或多種細胞類型而變化，並且可以藉由本領域標準的方法確定。劑量可以病毒基因組（vg）單位表示。本文設想的劑量包括約1×10¹¹ 、約1×10¹² 、約1×10¹³ 、約1.1×10¹³ 、約1.2×10¹³ 、約1.3×10¹³ 、約1.5×10¹³ 、約2×10¹³ 、約2.5×10¹³ 、約3×10¹³ 、約3.5×10¹³ 、約4×10¹³ 、約4.5×10¹³ 、約5×10¹³ 、約6×10¹³ 、約1×10¹⁴ 、約2×10¹⁴ 、約3×10¹⁴ 、約4×10¹⁴ 、約5×10¹⁴ 、約1×10¹⁵ 至約1×10¹⁶ 或更多個總病毒基因組。約1×10¹¹ 至約1×10¹⁵ vg、約1×10¹² 至約1×10¹⁵ vg、約1×10¹² 至約1×10¹⁴ vg、約1×10¹³ 至約6×10¹⁴ vg及約6×10¹³ 至約1.0×10¹⁴ vg的劑量亦是可以設想的。本文舉例說明的一種劑量係6×10¹³ vg。本文舉例說明的另一劑量係1.5×10¹³ 。

提供用rAAV轉導靶細胞（包含但不限於神經系統、神經或神經膠質細胞的細胞）的方法。神經系統的細胞包含下運動神經元、小神經膠質細胞、少突膠質細胞、星形膠質細胞、許旺氏細胞或其組合。

術語「轉導」用於指藉由本揭示案的複製缺陷型rAAV在活體內或在試管內向靶細胞投與/遞送CLN6聚核苷酸，從而使受體細胞表現功能性多肽。用本揭示案的rAAV轉導細胞引起由rAAV編碼的多肽或RNA的持續表現。因此，本揭示案提供藉由鞘內，腦室內，腦實質內或靜脈內途徑或其任何組合向受試者投與/遞送編碼CLN6多肽之rAAV的方法。鞘內遞送係指遞送至腦或脊髓之蛛網膜下的空間。在一些實施例中，鞘內投與係藉由腦池內投與。

鞘內投與在本文中舉例說明。此等方法包含用本文所描述的一種或多種rAAV轉導靶細胞（包含但不限於神經及/或神經膠質細胞）。在一些實施例中，將包括編碼CLN6多肽的聚核苷酸的rAAV病毒顆粒投與或遞送至患者的腦及/或脊髓。在一些實施例中，將聚核苷酸遞送至腦。設想用於遞送的腦區包含但不限於運動皮質、視覺皮質、小腦及腦幹。在一些實施例中，將聚核苷酸遞送至脊髓。在一些實施例中，將聚核苷酸遞送至下運動神經元。多核苷酸聚核苷酸可以遞送至神經及神經膠質細胞。神經膠質細胞係小膠質細胞、少突膠質細胞或星形膠質細胞。在一些實施例中，將聚核苷酸遞送至許旺氏細胞。

在本文提供的方法的一些實施例中，在投與rAAV後（例如約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘或約20分鐘）將患者保持在特倫德倫伯格位置（頭向下位置）。例如，患者可以在頭部向下位置傾斜約1度至約30度、約15度至約30度、約30度至約60度、約60度至約90度或約90度至約180度。

本文提供的方法包括將包括本文提供的rAAV的組合物的有效劑量或有效多劑量投與有需要之受試者（例如，包含但不限於人類患者的動物）的步驟。若在CLN6型巴藤病發展之前投與劑量，則投與係預防性的。若在CLN6型巴藤病發展之後投與劑量，則投與係治療性的。有效劑量係減輕（消除、穩定或減少）與疾病相關之至少一種症狀的劑量，其減緩或阻止疾病之進展、減少疾病的程度、引起疾病緩解（部分或全部）及/或延長生存期。與治療前的受試者相比或與未治療的受試者相比，本文提供的方法使用於評估CLN6巴藤病之進展及/或改善之量表（例如統一的巴藤病評估系統（UBDRS）、漢堡運動及語言量表或the Mullen Scales of Early Learning (MSEL)）中的一項或多項穩定、進展減少或改善。UBDRS評估量表（如Marshall等人，《神經病學（Neurology）》，2005 65(2):275-279中所描述）[包含UBDRS物理評估量表、UBDRS癲癇發作評估量表、UBDRS行為評估量表、UBDRS能力評估量表、UBDRS症狀發作序列及UBDRS臨床總體印象（CGI）]；小兒生活品質量表（PEDSQOL）量表、運動功能、語言功能、認知功能及生存。與治療前的受試者相比或與未治療的受試者相比，本文提供的方法可以引起以下中的一者或多者：自發螢光存儲材料的溶酶體聚集減少或減緩、ATP合成酶亞單位C的溶酶體聚集減少或減緩、減少或減緩膠質細胞活化（星形膠質細胞及/或小膠質細胞）活化；減少或減緩星形細胞增生，並且示出了藉由MRI測量的腦量損失減少或延遲。

亦提供了組合療法。如本文所使用的組合包含同時治療或順序治療。本文所描述的方法與標準醫學治療的組合係特別設想的。另外，根據本發明用於同時治療或連續治療的組合物的組合（例如scAAV9.P546.CLN6與本文揭示的造影劑的組合）係特別設想的。

雖然設想了在出生後向有需要之受試者遞送，但亦設想了胎兒宮內分娩。 實例

雖然以下實例描述了具體的實施例，但應理解，本領域中熟習此項技術者將想到變化及修改。因此，只有申請專利範圍中出現的此等限制才能適用於本發明。

在實例中，產生受雜交雞β-肌動蛋白（CB）啟動子控制的攜帶CLN6 cDNA的自身互補型AAV（命名為scAAV9.CB.CLN6）。IVC注射（6×10¹³ vg/動物）至出生後第1天小鼠的CSF足以在整個CNS中誘導穩定、穩健的表現CLN6蛋白長達18個月。CLN6型巴藤病的進展與ASM的聚集、ATP合酶亞單位C的聚集、突觸脊柱密度降低、星形膠質細胞中GFAP反應性增加及小膠質細胞中CD68染色增加有關。Cln6^nclf 小鼠在兩個月時顯示ASM及ATP合酶亞單位C增加及樹突棘減少，並且在六月齡時顯示GFAP及CD68反應性增加。在Cln6^nclf 小鼠中注射scAAV9.CB.CLN6減少了ASM及ATP合酶亞單位C的聚集並且增加了樹突棘密度，並且降低了CD68+小膠質細胞及GFAP+星形膠質細胞反應性水準。實例 1 產生 scAAV9.CB.CLN6

人類CLN6 cDNA純系獲自Origene, Rockville, MD。將hCLN6 cDNA進一步次選殖至雜交雞β-肌動蛋白啟動子（CB）下的AAV9基因組中，並且在試管內及活體內進行測試。產生自身互補型腺相關病毒（scAAV）血清型9病毒基因組，所述病毒基因組包括受雞-β-肌動蛋白（CB）雜交啟動子控制的人類CLN6（hCLN6）基因。圖 1A 中提供了質體構建體的示意圖，其顯示插入AAV2 ITR之間的CLN6 cDNA。質體構建體亦包含CP啟動子、猿猴病毒40（SV40）嵌合內含子及牛生長激素（BGH）聚腺苷酸化信號（BGH PolyA）。

scAAV9.CB.CLN6在cGMP條件下藉由使用基於雙股AAV2-ITR之CB-CLN6載體的瞬時三重質體轉染程序產生，其中質體編碼如前所述的Rep2Cap9序列（Gao等人 ，《病毒學期刊》，78: 6381-6388（2004）），以及在HEK293細胞（36）中的腺病毒輔助質體pHelper（Stratagene, Santa Clara, CA）。藉由4%至12%十二烷基硫酸鈉-丙烯醯胺凝膠電泳及銀染色及qPCR分析評估載體的純度及效價。選殖後，試管內驗證HEK293細胞中的轉殖基因表現，並且在胚胎第15.5天，活體內藉由子宮內ICV電穿孔驗證轉殖基因表現（參見圖 1B 及圖 1C ）。此分析證實了人類CLN6蛋白在活體內靶向神經元及表現。實例 2 分析 CSF 遞送的 scAAV9.CB.CLN6 在 CLN6 ^nclf 小鼠中的表現 細胞靶向及表現

為了證實病毒引入的人類CLN6在小鼠中的表現及生物分佈，scAAV9.CB.CLN6在出生後24小時內藉由單次腦室內（ICV）注射投與CLN6^nclf 小鼠，並且在兩個月期間內的不同時間點監測表現。注射等體積PBS的野生型及CLN6^nclf 小鼠作為對照。使用NCH病毒載體核心效價，有效投與劑量為5×10¹⁰ vg/小鼠。將scAAV9.CB.CLN6調配於1× PBS及0.001%普朗尼克F68中，或調配於20 mM Tris（pH8.0）、1 mM MgCl2、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188中。

在注射後2個月、6個月及18個月藉由RT-PCR偵測hCLN6 表現證明，與注射PBS的對照相比，hCLN6 在注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 小鼠之皮質中的表現持續、穩健（圖 2A ，圖 3A ）。此等結果與先前報導的scAAV9-CB-GFP表現量相似（參見例如Foust等人，《分子療法》2013；21(12):2148-59；Foust等人，《自然生物技術（Nat Biotechnol.）》2010；28(3):271-4，Meyer等人，《分子療法》2015；23(3):477-87）。在圖 2A 中，頂部凝膠及圖表係代表性的RT-PCR凝膠及光密度測定法（相對於GAPDH 歸一化）。此等資料證明，與注射PBS的Cln6^nclf 小鼠相比，scAAV9.CB.CLN6遞送後的基因表現增加。底部凝膠及圖表示出了藉由蛋白質墨點測量的CLN6蛋白質表現。scAAV9.CB.CLN6載體的ICV遞送示出了Cln6^nclf 小鼠的大腦皮質中hCLN6蛋白表現顯著增加。

為了檢查轉殖基因表現的區域分佈，使用稱為RNAScope©修飾的原位 雜交方法來可視化hCLN6 轉錄物。注射scAAV9.CB.CLN6的Cln6^nclf 小鼠在2個月、6個月及18個月時在腦的所有區域中維持廣泛的hCLN6 轉導，包含丘腦的體覺皮質及VPM/VPL細胞核，兩個區域已經示出在Cln6^nclf 小鼠的疾病進展中最早受影響（圖 2B ，左圖；圖 3B ；頂圖，圖 4A ）。

為了檢查CNS內的hCLN6蛋白表現，使用抗hCLN6抗體對自注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 及注射PBS之對照中採集的腦皮質溶解物進行免疫墨點分析。與經由RNA表現所見者相同，在2個月、6個月及18個月時在整個CNS中發現穩健的hCLN6蛋白表現（圖 2B ，右圖，圖 3B ，下圖 ）。此外，使用抗hCLN6抗體對腦組織進行的免疫標記分析證實了scAAV9.CB.CLN6治療之Cln6^nclf 小鼠之整個腦中的表現（圖 4B ）。總之，此等發現證明藉由ICV注射之scAAV9.CB.CLN6的CSF遞送能夠在CNS的疾病相關區域中穩定地產生hCLN6 轉錄物及蛋白質。 scAAV9.CB.CLN6 遞送後的病理學改善 自發螢光存儲材料（ ASM ）的聚集

自發螢光存儲材料（ASM）的聚集係巴藤病進展的標誌性組織學標記（Mole等人，《生物化學與生物物理學報-疾病分子基礎（Biochim Biophys Acta - Mol Basis Dis.）》2015；1852(10):2237-2241；Cotman等人，《臨床血脂學期刊（Clin Lipidol.）》2012年2月；7(1):79-91；Seehafer等人，《衰老神經生物學（Neurobiol Aging.）》2006；27:576-588）。ASM的聚集係許多形式的巴藤病的疾病進展的強有力指標（Bosch等人，《神經科學期刊（J Neurosci.）》2016；36(37):9669-9682；Morgan等人，《公共科學圖書館綜合（PLoS One.）》2013；8(11):e78694）。本文設想了ASM的減少用作成功治療的指標。

在治療後2個月、6個月及18個月，與注射PBS的小鼠相比，注射scAAV9.CB.CLN6的Cln6^nclf 小鼠在丘腦的VPM/VPL細胞核及體覺皮質中ASM聚集減少（圖 5 ，圖 3C ）。因為PBS治療的Cln6nclf 小鼠在15月齡時死亡（圖 9D ），所以使用12月齡至14月齡之經PBS治療的Cln6^nclf 小鼠與18月齡之經scAAV9.CB.CLN6治療的Cln6^nclf 小鼠比較。值得注意的是，此等18月齡之注射scAAV9.CB.CLN6的Cln6^nclf 小鼠中ASM聚集的量與年齡匹配的未治療野生型小鼠相當。圖 9E 證明，經scAAV9.CB.CLN6治療的雄性（左圖）及雌性（右圖）小鼠隨著年齡的增長具有與野生型小鼠相似的體重，而未治療的Cln6^nclf 小鼠在研究過程中體重下降。注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）在10月齡至11月齡（雄性）及13月齡至14月齡（雌性）開始體重減輕。粒線體蛋白 ATP 合成酶亞單位 C 的聚集

分析ATP合酶亞單位C在來自野生型、注射PBS之CLN6^nlcf 小鼠或注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 小鼠之腦組織中的聚集。在健康個體中，此蛋白質係粒線體膜中呼吸鏈的一部分，但是在患有巴藤病的患者中，蛋白質異常地在溶酶體中聚集（Palmer等人，《美國醫學遺傳學期刊（Am J Med Genet.）》1992；42(4):561-567）。在Cln6^nclf 小鼠中，與野生型動物相比，截至2月齡時，丘腦腹側後內側核及腹側後外側核（VPM/VPL區域]（在NCL小鼠模型中早期時常受到影響的一個腦區域）中的亞單位C聚集明顯（Morgan等人，《公共科學圖書館綜合》2013；8(11):e78694；Pontikis等人，《疾病神經生物學（Neurobiol Dis.）》2005；20(3):823-836）。與注射PBS的對照Cln6^nclf 小鼠相比，在2月齡、6月齡及18月齡時，用scAAV9.CB.CLN6治療之Cln6^nclf 小鼠的VPM/VPL及腦體覺皮質內ATP合酶亞單位C聚集量顯著降低（圖 6 ；圖 3C ；下圖 ）。膠質細胞及星形膠質細胞活化

除了存儲材料的異常聚集及ATP合酶sub C的聚集之外，人類患者及動物模型中疾病進展的其他組織學標誌物包含星形膠質細胞及小膠質細胞的活化（Cotman等人，《人類分子遺傳學》2002；11(22):2709-2721；Morgan等人，《公共科學圖書館綜合（PLoS One.）》2013；8(11):e78694；Pontikis等人，《疾病神經生物學（Neurobiol Dis.）》2005；20(3):823-836；Palmer等人，《美國醫學遺傳學期刊》1992；42(4):561-567）。詳言之，反應性小膠質細胞被預致敏而釋放如IL1-β26等促炎介質，此可能是CLN6型巴藤病晚期神經元細胞死亡的關鍵原因。在6個月及18個月時，與垂死的經PBS治療之Cln6^nclf 小鼠相比，注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 小鼠在VPM/VPL及體覺皮質中的星形膠質細胞活化（GFAP）及小膠質細胞增生（CD68）顯著降低（分別為圖 7 及圖 8 ； ）

圖 7 證明藉由在6個月及18個月時間點染色膠質原纖維酸性蛋白（GFAP），在VPM/VPL丘腦及體覺皮質切片中鑑定活化的星形膠質細胞。圖表示出了總GFAP+免疫反應性。

亦使用抗CD68染色作為活化的小膠質細胞的標記，在VPM/VPL及體覺皮質切片中確定膠質細胞活化。CD68係溶酶體蛋白，其在針對如吞噬作用等促炎功能而預致敏的細胞中上調（Seehafer等人，《神經免疫學期刊（J Neuroimmunol.）》2011；230:169-172）。圖 8 證明scAAV9.CB.CLN6注射減少了6MCln6^nclf 小鼠的體覺皮質中，以及18MCln6^nclf 小鼠的VPM/VPL及體覺皮質中的小膠質細胞增生（CD68反應性）。圖表示出了總CD68+免疫反應性。圖 8 中的入口示出了小膠質細胞的形態。值得注意的是，在此等研究中分析的未治療Cln6^nclf 小鼠係垂死的，並且許多小膠質細胞可能即將死亡或已死亡，導致其不尋常的形態。總之，此等結果指示，在出生後第1天將scAAV9.CB.CLN6遞送至CSF中的單次注射可以減少或延遲Cln6^nclf 小鼠腦中的許多典型CLN6型巴藤病病理。 遞送 scAAV9.CB.CLN6 後的行為改善

在scAAV9.CB.CLN6的療效研究中，自2月齡開始，並且以2個月的間隔持續，對小鼠進行一系列行為測試範例，包含：加速旋轉棒測定，及爬桿以測試運動功能及協調，以及莫里斯水迷宮來評估學習及記憶。動物在注射後被跟蹤24個月，並且正在進行研究。旋轉棒分析

先前的工作證明CLN6型巴藤病的Cln6^nclf 小鼠模型概括了人類中發現的許多運動、認知及存活缺陷（Morgan等人，《公共科學圖書館綜合》2013；8(11):e78694）。在功效研究中，使用旋轉棒作為運動協調的經典測量，與野生型相比，注射PBS的Cln6^nclf 小鼠在8月齡時開始示出旋轉棒效能下降。然而，用scAAV9.CB.CLN6注射Cln6^nclf 小鼠阻止了此下降，此作用持續整個研究期（24個月）（圖 9A ）。為了進一步詳細研究運動協調的影響，動物在12個月、18個月及24個月時接受各種運動任務（後肢扣緊、從壁架上降低自己的能力，以及步態評估），並且使用評分矩陣進行評估，評分最高，預後最差（Guyenet等人，《可視化實驗期刊：JoVE.（Journal of visualized experiments: JoVE.）》201039）。與PBS治療的Cln6^nclf 小鼠相比，用scAAV9.CB.CLN6治療的小鼠在所有時間點示出了顯著更低的組合評分，僅在24月齡時其分數略微增加（圖 9B ）。莫里斯水迷宮測試

在莫里斯水迷宮測試中，將動物置放在含有隱藏平台之充滿水的池中。在訓練之後，測量動物使用環境線索來定位隱藏平台的時間作為學習及記憶能力的標誌加以測量。

PBS治療的Cln6^nclf 小鼠在九月齡起始的任務中效能不佳，表明其找到隱藏平台的能力降低（圖 9C ）。由於PBS治療之Cln6^nclf 小鼠的游泳速度在11月齡及12月齡時顯著降低，因此吾等無法在此等後期時間點得出關於其記憶及學習能力的任何結論（圖 10A ）。用scAAV9.CB.CLN6治療Cln6^nclf 小鼠在注射後12個月校正了此記憶及學習缺陷（圖 9C ）。當將野生型小鼠與scAAV9.CB.CLN6治療的動物僅在莫里斯水迷宮測試的後期時間點進行比較時，吾等發現即使是治療的小鼠在18個月及24個月時需要更多的時間來找到平台，而所有測試組之間的游泳速度相同（圖 9C ，圖 10 ）。為了在稍後的時間點評估記憶及學習，在12月齡、18月齡及24月齡時對小鼠進行水迷宮逆轉測試，其中平台被移動到新的位置。在此測試中，與野生型小鼠相比，用scAAV9.CB.CLN6治療的Cln6^nclf 小鼠花費顯著更長時間以找到新的平台位置（圖 10 ）。總之，此等結果指示scAAV9.CB.CLN6的單次治療阻止了在此等動物中所發現的許多運動衰退，但是當在稍後的時間點測試小鼠時不能完全抵禦記憶及學習缺陷。 遞送 scAAV9.CB.CLN6 後的存活率改善

已知Cln6^nclf 小鼠與野生型小鼠相比存活率降低（Guyenet等人，《可視化實驗期刊：JoVE.》201039）。將scAAV9.CB.CLN6及PBS注射之Cln6^nclf 小鼠的存活率與注射PBS的野生型小鼠進行比較。與注射PBS的Cln6^nclf 小鼠相比，單次ICV注射scAAV9.CB.CLN6至Cln6^nclf 小鼠的CSF中顯著增加了其存活率（圖 9D ）。雖然PBS治療小鼠的中位存活期為14個月，但scAAV9.CB.CLN6治療之Cln6^nclf 小鼠的中位存活期為21.5個月。存活率增加65%係非常顯著的。而且，scAAV9.CB.CLN6治療的Cln6^nclf 小鼠的存活曲線與野生型動物沒有顯著差異。

另外，作為總體健康的量度，每月記錄體重。scAAV9.CB.CLN6治療的小鼠維持其體重的能力亦強調了健康及存活的改善，因為與野生型動物相比沒有觀察到差異，而PBS治療的Cln6^nclf 在10個月到12個月左右開始體重減輕（圖 9E ）。

對PBS治療的172隻野生型小鼠及5×10¹⁰ vg/動物治療的223隻野生型小鼠進行安全性研究。此研究證明scAAV9.CB.CLN6在24週內耐受良好，沒有可歸因於病毒的副作用（資料未顯示）。總之，此為Cln6^nclf 小鼠模型迄今為止最長的存活期延長，並且指示scAAV9.CB.CLN6單次治療可修復CLN6型巴藤病細胞及功能缺陷的效用。實例 3 scAAV9.CB.CLN6 在非人類靈長類動物中的安全性研究

為了在與人類患者更相關的大型動物模型中測試此治療的安全性，給3隻四歲雄性食蟹猴投與調配於1× PBS及0.001%普朗尼克F68中的scAAV9.CB.CLN6。

在注射後1個月、3個月或6個月處死動物。每個個體接受單次腰部鞘內注射，以每隻動物6×10¹³ 個病毒顆粒的劑量將病毒載體直接遞送至CSF中。注射後，將動物保持在特倫德倫伯格位置15分鐘，頭部以45度角朝下，以促進腦及上脊髓區域的靶向。

所有受試者自注射中恢復良好並且未示出任何異常行為。在研究期間（基線、1個月、2個月、3個月及6個月），血液學及血清化學在最多5個時間點進行，並且未顯示出重大異常。詳言之，沒有發現天冬胺酸胺基轉移酶（AST）或鹼性磷酸酶含量升高的證據，而一隻動物在注射後1個月出現丙胺酸胺基轉移酶（ALT）略微增加（低於200個單位/升）（圖 11C ）。

總蛋白含量、肌酸酐、甘油三酯、葡萄糖或如磷、鈣、鎂或鈉等離子含量沒有變化。每隻動物在處死其時對其進行廣泛的組織病理學以及轉殖基因表現分析。除了一隻動物在屍體剖檢時顯示膀胱感染外，在所分析的任何組織中均未發現異常，包含各種腦及脊髓區域、心臟、肺、肝、脾、腎、小腸、骨骼肌（膈肌，肱三頭肌，TA，腓腸肌）、性腺。

如螢光蛋白質墨點所示，單次腰部鞘內注射將scAAV9.CB.CLN6遞送至腦脊髓液中誘導轉殖基因在非人類靈長類動物之整個腦及脊髓中的高度表現。圖 11A 中的墨點示出了CLN6在皮質、胼胝體、室周白質、海馬、小腦、丘腦、頸椎脊髓、胸椎脊髓、腰椎脊髓中的表現，發現轉殖基因在所有三隻動物之整個腦及脊髓中的高度表現（圖 11A 至圖 11B ）。總之，此等資料指示scAAV9.CB.CLN6治療在所有三個測試個體中皆具有良好的耐受性及安全性。實例 4 scAAV9.CB.CLN6 基因療法的臨床試驗

scAAV9.CB.CLN6係藉由鞘內遞送給患有CLN6型巴藤病的人類患者。

用於臨床試驗的scAAV由全國兒童醫院臨床製造設施（Nationwide Children's Hospital Clinical Manufacturing Facility）利用HEK293細胞的三重轉染方法在如實例1中所描述的GMP條件下產生。

選擇參與的患者年齡為一歲或更大，診斷有CLN6疾病，如根據基因型所確定。第一組（n = 12）接受每位患者一次性基因轉移劑量為1.5×10¹³ vg總scAAV。scAAV9.CB.CLN6於20 mM Tris（pH8.0）、1 mM MgCl₂ 、200 mM NaCl、0.001%泊洛沙姆188及約20%至約40%非離子低滲透化合物中調配，並且藉由腰椎穿刺插入的鞘內導管一次性遞送至腰椎間隙囊的蛛網膜下腔內。安全性係根據臨床情況進行評估，並且藉由檢查安全標記進行評估。每個受試者的登記之間至少有四週的時間，以允許審查基因轉移後第30天的安全性資料。

本文提供的初步資料報告了十名接受治療的患者，並且平均隨訪時間為12個月（治療後1個月至24個月）。初步資料證明，scAAV9.CB.CLN6的投與通常具有良好的耐受性。大多數不良事件係輕微的，並且與治療無關。觀察到的任何T細胞反應及抗體升高均與臨床表現無關，並且不需要治療的變化。

圖12提供藉由漢堡運動及語言量表測量之兩名成對研究同胞之疾病進展的初步資料。此等成對同胞具有相同的gCLN6突變基因型。24 個月階段的功效研究

本文提供了經治療的患者中的8名患者在正在進行的臨床研究中的資料。對本文描述的8名患者投與且暴露於scAAV9.CB.CLN6至少17個月。以下提供這8名患者的基線資訊。

來自正在進行的24個月的臨床研究的資料表明，單次鞘內投與scAAV9.CB.CLN6通常係被良好耐受的。報導了137起不良事件。大部分不良事件（AE）係溫和的且與治療無關。在4名患者中報導了9起3級（嚴重）不良事件（記錄為SAE）。9起SAE中有3起被認為可能與治療相關。相關事件包括嘔吐（2）、上腹疼痛（1）及發燒（1），且所有四名患者均恢復。沒有報導4級（威脅生命）或5級（死亡）不良事件。沒有不良事件的模式與抗AAV9衣殼或抗CLN6免疫原性相關。

圖15提供了功效資料，其顯示對於運動及語言功能的積極影響。在用scAAV9.CB.CLN6治療的8名患者中有7名患者的漢堡評分得以維持或起初具有變化（+1至-1點），隨後保持穩定。此項研究中最年長的患者（在79個月時治療）下降了兩個點。自然病史資料表明，在症狀發生後的24個月，漢堡運動及語言下降了2-3點。

圖16A-C提供了同胞比較資料，他們都患有CLN6疾病。相對於在相同的時期內經歷運動及語言能力的大幅下降或死亡的未治療的同胞，經治療的患者展示出穩定。此等資料作為隨時間變化的漢堡評分：運動+語言來提供。圖16A提供了累積評分，而圖16B提供了漢堡運動子評分，且圖16C提供了漢堡語言子評分。

圖12A-C提供了均用scAAV9.CB.CLN6治療的成對研究同胞的研究同胞比較資料。此等資料表明，與起初具有變化且隨後保持穩定的較年長同胞相比，較年幼同胞展示了漢堡運動及語言評分的增加或穩定。圖12A提供了累積評分，而圖12B提供了漢堡運動子評分，且圖12C提供了漢堡語言子評分。

圖17比較了用scAAV9.CB.CLN6治療的前8名患者的資料與全國兒童醫院對CLN6患者（n=14）進行的自然病史研究的資料。顯示了直至漢堡運動及語言功能的組合評分自基線不可逆地降低≥2點或更多時的時間的卡普蘭-邁耶曲線。使用生存概率估計及其標準誤差計算置信帶。該圖比較了在2年時期內治療組與自然病史組的組合漢堡運動及語言評分下降≥2點的患者，且傳達了支持本發明的治療功效的結果，包括：（i）與所有14名自然病史未治療患者相比，只有1名經治療的患者在該時期內實現≥2點的下降；及（ii）大體上分離經治療的患者與未治療的患者。

總而言之，24個月的功效資料證實：i）與運動及語言能力快速下降的未治療的同胞相比，疾病得以穩定；ii）較年幼的患者顯示評分的增加或穩定；及iii）大部分較年長的患者起初顯示變化，隨後保持穩定。此外，治療通常被良好耐受。劑量增加研究

若不存在安全問題，在注射後一個月評估第一組後，將登記另外的受試者。組2中的每個受試者（n = 4）接受遞增劑量的病毒載體。在組1完成與組2開始之間至少有六週的時間窗口，以允許從五個時間點（第1天、第2天、第7天、第14天及第21天）以及DSMB審查安全性分析在給予下一個受試者之前進行審查。

使用UBDRS量表或漢堡運動及語言量表（在上文的詳細描述中參考）並且使用小兒生活品質（PEDSQOL）量表的治療對生活品質的影響以及延長存活的潛力來測量疾病進展。

當所有患者完成為期三年的研究時，評估療效的主要分析。確定療效的基礎係基於專門針對CLN6型巴藤病或漢堡運動及語言量表而開發的完善的統一巴藤病評定量表（UBDRS）來穩定或減少疾病的進展。完成三年研究期後，根據FDA規則每年監測患者，持續5年。實例 5 自然病史研究證實 scAAV9.CB.CLN6 基因療法改善運動及語言評分

為了幫助在隨時間變化的臨床過程方面比較研究受試者（CLN6基因轉移研究中的前面的患者（n=8））與自然病史受試者，將來自基因轉移患者的組合漢堡量表運動（M）及語言（L）評分與對回顧性CLN6自然病史研究（PI: Emily de los Reyes, MD; ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03285425）中的患者收集的組合漢堡量表運動及語言評分資料進行匹配。基於基線漢堡運動及語言評分及比較時的年齡將基因轉移患者與自然病史患者進行匹配（在12個月內）。

漢堡運動及語言評分（n=8）的組合資料及單獨資料顯示，CLN6基因療法停止或大體上減緩疾病進展，對8名患者中的7名患者的運動及語言功能產生積極影響（圖18）。積極影響係指患者維持組合漢堡評分或起初具有變化（+1至-1點），隨後保持穩定。單獨的運動及語言評分與各自的組合評分係一致的。

自然病史匹配比較的資料顯示了漢堡運動及語言評分的改善（圖19）。經由多對一匹配方法，比較時期（與對應的基因轉移患者比較）的最後時間點的匹配自然病史患者的平均漢堡運動及語言評分以紅色繪製，對比最後時間點的基因轉移患者的對應漢堡運動及語言值（以綠色繪製）（圖19）。在每張圖中提供了每個比較中的自然病史患者的數量以及最後時間點的漢堡運動及語言評分之間（基因轉移患者與NH患者的平均值之間）的差異。在全國兒童醫院及Emily de los Reyes博士的研究中針對CLN6型巴藤病患者（n=11）收集的自然病史資料指示自年齡2至7，漢堡運動+語言評分每年有完全線性且幾乎持續不變的1點下降（圖20）。

總之，來自此等研究的資料表明，與匹配的自然病史患者相比，大部分CLN6基因轉移患者顯示了運動及語言評分的改善。實例 6 馬倫早期學習量表研究

使用馬倫早期學習量表（MSEL）評估scAAV.CB.CLN6基因療法是否改善歷經12至24個月的患者學習能力。MSEL被單獨地給予，這是被設計用於自出生時至68個月的兒童中的認知功能的標準化量度。MSEL的子量表係粗大運動、精細運動、感受性語言、表達性語言及早期學習綜合（參見Mullen EM. (1995). Mullen Scales of Early Learning (AGS ed.). Circle Pines, MN: American Guidance Service Inc）。

分析8名患者的以下4個領域：視覺接收、精細運動、感受性語言及表達性語言。圖21A及21B提供了這4個領域的原始評分。更高的評分指示更高的功能。總結

臨時安全性及功效資料表明AAV9-CLN6基因療法具有穩定變種嬰兒晚期發作性CLN6型巴藤病的可能性。功效結果證實了運動及語言功能中的有意義的治療效果。經AAV9-CLN6治療的患者顯示了與未治療的同胞相比的漢堡運動及語言評分的改善，及針對年齡及漢堡運動及語言基線評分匹配的自然病史患者的平均值。經治療的較年幼及較年長同胞的比較支持了使用AAV9-CLN6的基因療法的早期干預的潛在益處。經治療的較年幼患者顯示了認知技能的改善或穩定，如MSEL量表所示。

雖然已經在本文示出並且描述了本發明的較佳實施例，但是對本領域中熟習此項技術者而言顯而易見的是此類實施例僅為了舉例而提供。在不背離本發明的情況下，本領域中熟習此項技術者現將想到許多變化、改變及替代。應理解，可以採用本文所述實施例的各種替代方案。希望以下申請專利範圍書限定本發明的範圍以及由此覆蓋此等申請專利範圍及其等效物範圍內的方法及結構。

本申請案中提及的所有文獻均以全文引用的方式併入本文。

圖 1A 到 1C 證明了活體內神經元靶向及人類CLN6蛋白的表現。圖1A提供了scAAV.CB.CLN6之scAAV基因組的示意圖。圖1B中的圖表提供了用scAAV.CB.CLN6質體瞬時轉染HEK293細胞後的CNL6 mRNA及人類CLN6（hCLN6）蛋白表現水準。圖1C中的影像提供了scAAV.CB.CLN6質體的子宮內電穿孔後GFP及hCLN6蛋白的免疫組織化學染色。

圖 2A 及圖 2B 提供了顯示注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 小鼠之CNS中人類CLN6轉錄物的廣泛表現的影像。圖2A中的影像及圖表提供了代表性的RT-PCR凝膠及在注射後6個月及18個月藉由光密度測定法（相對於GAPDH 歸一化）的定量。此分析證明，與野生型小鼠（WT或WT + PBS）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf + PBS）相比，scAAV9.CB.CLN6遞送（Cln6^nclf + scAAV9）後基因表現增加。圖2B的左圖提供了證明在注射後6個月及18個月，與野生型小鼠（WT + PBS）相比，注射scAAV9.CB.CLN6（Cln6^nclf + scAAV9）之Cln6^nclf 小鼠之CNS中人類CLN6轉錄物之廣泛表現的影像。圖2B的右圖提供了顯示免疫組織化學染色的影像，其證明在注射後6個月及18個月時，與野生型小鼠（WT + PBS）相比，注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 小鼠之各種腦區中的蛋白質表現。比例尺50 μm。平均值+/- SEM。N = 3-9隻小鼠/組。單因素方差分析（One-Way ANOVA），邦費羅尼校正（Bonferroni correction）。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001。

圖 3A 至圖 3C 證明了單次scAAV9.CB.CLN6注射在2月齡的動物中的作用。圖3A中的影像及圖表提供了代表性的RT-PCR凝膠及在注射後2個月藉由光密度測定法（歸一化為GAPDH ）的定量。此分析證明，與野生型小鼠（WT + PBS）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf + PBS）相比，scAAV9.CB.CLN6遞送（Cln6^nclf + scAAV9）後基因表現增加。圖3B中的上圖提供之影像證明在注射後2個月，與野生型小鼠（WT + PBS）相比，注射scAAV9.CB.CLN6（Cln6^nclf + scAAV9）之Cln6^nclf 小鼠之CNS中人類CLN6轉錄物的廣泛表現。圖3B的下圖提供了顯示免疫組織化學染色的影像，其證明在注射後2個月，與野生型小鼠（WT + PBS）相比，注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 小鼠之各種腦區中的蛋白質表現。比例尺200 μm。平均值+/- SEM。N = 39。單因素方差分析（One-Way ANOVA），邦費羅尼校正（Bonferroni correction）。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001。圖3C的影像及圖表證明在注射後2個月，與野生型小鼠（WT）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，在P1處單次ICV注射scAAV9.CB.CLN6減少了Cln6^nclf 小鼠的VPM/VPL及體覺皮質中自發螢光存儲材料（ASM；上圖）及ATP合酶亞單位C（SubC；下圖）的聚集。平均值+/- SEM，N = 3-10。（上圖）；平均值+/- SEM，N = 21-72，生物學N = 3-10（下圖）單因素方差分析，邦費羅尼校正。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001。比例尺200 μm（上圖）。比例尺50 μm（下圖）。

圖 4A 及圖 4B 證明CLN6 mRNA及hCLN6蛋白在整個腦中、在以下區域中的廣泛表現：A：運動皮質，B：體覺皮質；C：視覺皮質；D：丘腦；E：腦橋；F：小腦；G：在圖4A中提供的腦幹影像證明在注射後2個月、6個月及18個月之scAAV9.CB.CLN6治療之Cln6^nclf 小鼠之整個腦中的hCLN6 轉錄物表現。在圖4B中提供的影像證明在注射後2個月、6個月及18個月之scAAV9.CB.CLN6治療之Cln6^nclf 小鼠之整個腦中的hCLN6蛋白表現。比例尺50 μm。

圖 5 提供的影像及圖表證明注射後6個月及18個月，與野生型小鼠（WT）及PBS治療的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，scAAV9.CB.CLN6治療之Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf scAAV）的VPM/VPL及體覺皮質中自發螢光存儲材料（ASM）之聚集減少。圖表示出了2500 μm² 的ASM⁺ 細胞數目。平均值+/- SEM，基於時間點N = 3-10。單因素方差分析（One-Way ANOVA），邦費羅尼校正（Bonferroni correction）。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001。比例尺50 μm。

圖 6 提供的影像及圖表證明注射後6個月及18個月，與野生型小鼠（WT）及PBS治療之Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，scAAV9.CB.CLN6治療之Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf scAAV）的VPM/VPL及體覺皮質中粒線體ATP合成酶亞單位C（SubUnitC）的聚集減少。棕色染色代表亞單位C，而藍色染色代表甲基綠（核）。圖表示出了每個像場的總SubC⁺ 面積。平均值+/- SEM，N = 21-72，生物學N = 3-10。單因素方差分析（One-Way ANOVA），邦費羅尼校正（Bonferroni correction）。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001。比例尺50 μm。

圖 7 提供的影像及圖表證明與野生型小鼠（WT）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf scAAV）在6個月及18個月的VPM/VPL及體覺皮質中展現出較少的星形膠質細胞增生（GFAP反應性）。圖表示出了總GFAP+免疫反應性。平均值+/- SEM，N = 16-49個切片，生物學N = 3-10個小鼠/組。單因素方差分析（One-Way ANOVA），邦費羅尼校正（Bonferroni correction）。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001。比例尺50 μm。插入比例尺10 μm。

圖 8 提供的影像及圖表證明與野生型小鼠（WT）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，注射scAAV9.CB.CLN6之Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf scAAV9）在注射後6個月之小鼠的體覺皮質中，並且與野生型小鼠（WT）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，在注射後18個月的VPM/VPL及體覺皮質中展現出較小的小膠質細胞增生（CD68反應性）。圖表示出了總CD68+免疫反應性。平均值+/- SEM，N = 16-49個切片，生物學N = 3-10個小鼠/組。單因素方差分析（One-Way ANOVA），邦費羅尼校正（Bonferroni correction）。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001。比例尺50 μm。插入比例尺10 μm。

圖 9A 至圖 9E 提供了證明CLN6的持續表現拯救Cln6^nclf 小鼠中的運動、記憶、學習及存活缺陷的圖表。圖9A證明與野生型小鼠（WT）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，注射scAAV9.CB.CLN6的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf scAAV）在8月齡至24月齡時具有減少的旋轉棒缺陷。圖9B證明與野生型小鼠（WT）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，scAAV9.CB.CLN6注射在注射scAAV9.CB.CLN6的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf scAAV）中糾正12月齡及18月齡小鼠的後肢扣緊、步態及壁架降低缺陷。圖9C證明與野生型小鼠（WT）及注射PBS的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，scAAV9.CB.CLN6預防注射scAAV9.CB.CLN6的9月齡至12月齡Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf scAAV）在莫里斯水迷宮中的記憶及學習缺陷。圖9D證明scAAV9.CB.CLN6注射防止Cln6^nclf 動物的早期死亡，而注射PBS的Cln6^nclf 動物在15月齡時死亡。圖9E示出了與野生型動物（WT）及PBS注射的Cln6^nclf 小鼠（Cln6^nclf PBS）相比，在對scAAV9.CB.CLN6治療之小鼠（Cln6^nclf scAAV）的研究過程中雄性（左圖）及雌性（右圖）的體重發育。對於旋轉棒而言，平均值+/- SEM，N = 6-24；對於扣緊分數而言，N = 7-13；對於水迷宮而言，N = 5-15；對於存活曲線而言，N = 10-15。對於體重而言，N = 3-13。在適當的情況下使用邦費羅尼校正或非成對t檢定的單因素方差分析。對數秩Log-rank（Mantel-Cox）檢定用於生存曲線分析* p ＜ 0.05、** p ＜ 0.01、*** p ＜ 0.001、**** p ＜ 0.0001

圖 10 提供了12個月至24個月動物的其他行為資料。圖10A中提供的圖表證明，在莫里斯水迷宮測試中，未治療的Cln6^nclf 動物在11月齡及12月齡時具有顯著更慢的游泳速度。圖10B中的圖表證明在12月齡、18月齡及24月齡時，scAAV9.CB.CLN6在莫里斯水迷宮逆轉任務中不顯著改善Cln6^nclf 小鼠的記憶及學習缺陷。游泳速度作為對照顯示。對於水迷宮而言，N = 5-15；非成對t檢定，平均值+/- SEM。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001

圖 11A 至圖 11C 提供了證明scAAV9.CB.CLN6在非人類靈長類動物中高度表現及良好耐受的資料。圖11A提供了蛋白質墨點，證明了scAAV9.CB.CLN6治療之非人類靈長類動物之各種腦及脊髓區域中轉殖基因的高度表現。墨點代表3隻動物，「+」指示用scAAV9.CB.CLN6治療的動物。測試以下腦區域：皮質（Ctx）、胼胝體（C. Call）、室周白質（P.V.W.M.:)、海馬（Hipp）、小腦（Cere）、丘腦（Thal）、頸椎脊髓（頸椎）、胸椎脊髓（胸椎）、腰椎脊髓（腰椎）。圖11B中的圖表提供了圖1A中螢光蛋白質墨點的定量。平均值+/- SEM，N = 3。未成對的司徒登氏t檢定（student's t-test）。*p ＜ 0.05、**p ＜ 0.01、***p ＜ 0.001、****p ＜ 0.0001。圖11C中的圖表證明scAAV9.CB.CLN6的遞送在大多數scAAV9.CB.CLN6治療的非人類靈長類動物中不改變血小板濃度或提高肝酶。紅色資料點指示scAAV9.CB.CLN6治療的動物；藍色資料點指示PBS治療的動物。測試的酶如下：丙胺酸胺基轉移酶（ALT）、天冬胺酸胺基轉移酶（AST）、鹼性磷酸酶（Alk Phos）、γ-麩胺醯轉移酶（GGT）。

圖 12A-C 提供了藉由漢堡運動及語言量表測量的在兩名成對研究同胞中注射scAAV9.CB.CLN6後疾病進展的分析。

圖 13 提供了scAAV9.CB.CLN6基因匣的核酸序列（SEQ ID NO: 4）。AAV2 ITR核酸序列以斜體顯示（5' ITR如SEQ ID NO: 9所示；3' ITR如SEQ ID NO: 8所示）；CMV增強子核酸序列（SEQ ID NO: 6）用虛線標出下劃線；CB啟動子核酸序列（SEQ ID NO: 3）用單線標出下劃線；SV40內含子核酸序列（SEQ ID NO: 11）用雙線標出下劃線；人類CLN6 cDNA序列（SEQ ID NO: 2）的核酸序列以粗體顯示；BGH polyA終止子（SEQ ID NO: 10）的核酸序列用虛線標出下劃線。

圖 14 提供了完整AAV.CB.CLN6的核酸序列（SEQ ID NO: 8）。

圖 15 提供了藉由漢堡運動及語言量表量測的用scAAV9.CB.CLN6治療的患者中的8名患者的功效資料。

圖 16A-C 提供了經治療的同胞與未治療的同胞之間的比較。一名同胞用scAAV9.CB.CLN6治療，且將藉由漢堡運動及語言量表量測的進展與未治療的同胞的博物學相比較。此資料作為隨時間變化的漢堡評分：運動+語言提供。

圖 17 提供了直至漢堡運動及語言功能的組合評分自基線不可逆地降低2點或更多時的時間的卡普蘭-邁耶曲線（Kaplan-Meier curve）。此圖式比較了用scAAV9.CB.CLN6治療的前8名患者的資料與全國兒童醫院（Nationwide Children's Hospital）對CLN6患者（n=14）進行的自然病史研究的資料。使用生存概率估計及其標準誤差計算置信帶。

圖 18 提供了用scAAV9.CB.CLN6治療的患者（n=8）的組合及單獨漢堡運動及語言評分，其顯示CLN6基因療法停止或大體上減緩疾病進展，對8名患者中的7名患者的運動及語言功能產生積極影響。

圖 19 提供了用scAAV9.CB.CLN6治療的患者（n=8）與針對年齡及基線漢堡運動及語言累積評分匹配的自然病史患者之間的自然病史匹配比較。

圖 20 提供了CLN6型巴藤病患者（n=11）的自然病史資料。在圖例中，點線（----）指示語言減弱，且實心灰線指示運動減弱。藍線（最上面的線）係運動減弱及語言減弱的總和。在y軸上繪製平均漢堡運動+語言評分，且在x軸上繪製以月計的年齡。自年齡2至7每年有完全線性且幾乎持續不變的1點下降。

圖 21A-B 提供了馬倫早期學習量表的4個領域的原始評分。水平點線指示篩選時的評分。更高的分數指示更高的功能。

Claims (76)

1. 一種編碼CLN6多肽的自身互補型重組腺相關病毒9（scAAV9），其包括scAAV9基因組，所述scAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列的CB啟動子；編碼SEQ ID NO: 1之所述CLN6多肽的聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複。
2. 如請求項1之scAAV9，其中所述scAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；CMV增強子；包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列的CB啟動子；SV40內含子；編碼SEQ ID NO: 1之所述CLN6多肽的聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複。
3. 如請求項1之scAAV9，其中所述scAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之序列的CB啟動子；編碼SEQ ID NO: 1之所述CLN6多肽的CB啟動子；牛生長激素聚腺苷酸化poly A序列；以及第二AAV末端反向重複。
4. 如請求項1至3中任一項之scAAV9，其中編碼所述CLN6多肽的所述聚核苷酸包括與SEQ ID NO: 2至少90%一致的序列。
5. 如請求項1至3中任一項之scAAV9，其中編碼所述CLN6多肽的所述聚核苷酸包括SEQ ID NO: 2的核酸序列。
6. 如請求項1至5中任一項之scAAV9，其中所述scAAV9基因組包括與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少90%一致的核酸序列。
7. 如請求項1至5中任一項之scAAV9，其中所述scAAV9基因組包括與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少95%一致的核酸序列。
8. 如請求項1至6中任一項之scAAV9，其中所述scAAV9基因組包括SEQ ID NO: 4的核酸序列。
9. 如請求項1至8中任一項之scAAV9，其中所述AAV末端反向重複係AAV2末端反向重複。
10. 如請求項1至10中任一項之scAAV9，其中所述rAAV9基因組包括單股基因組。
11. 一種核酸分子，其包括：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之序列的CB啟動子；編碼SEQ ID NO: 1之CLN6多肽的核酸序列；以及第二AAV末端反向重複。
12. 如請求項11之核酸分子，其包括：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列的CB啟動子；SV40內含子；編碼SEQ ID NO: 1之所述CLN6多肽的核酸序列；以及第二AAV末端反向重複。
13. 如請求項11之核酸分子，其包括：第一AAV末端反向重複；包括SEQ ID NO: 3之核苷酸序列的CB啟動子；編碼SEQ ID NO: 1之所述CLN6多肽的核酸；牛生長激素聚腺苷酸化poly A序列；以及第二AAV末端反向重複。
14. 如請求項11至13中任一項之核酸分子，其中編碼所述CLN6多肽的所述核酸包括與SEQ ID NO: 2的核酸序列至少90%一致的序列。
15. 如請求項11至13中任一項之核酸分子，其中編碼所述CLN6多肽的所述核酸包括SEQ ID NO: 2的核酸序列。
16. 如請求項11至15中任一項之核酸分子，其包括與SEQ ID NO: 4之核酸序列至少90%一致的核酸序列。
17. 如請求項11至15中任一項之核酸分子，其包括與SEQ ID NO: 4的核酸序列至少95%一致的核酸序列。
18. 如請求項11至15中任一項之核酸分子，其包括SEQ ID NO: 4的核酸序列。
19. 如請求項11至18中任一項之核酸分子，其中所述AAV末端反向重複係AAV2末端反向重複。
20. 一種自身互補型重組腺相關病毒9（scAAV9），其包括如請求項11至19中任一項之核酸分子。
21. 如請求項20之scAAV9，其中所述scAAV9包括單股基因組。
22. 一種rAAV顆粒，其包括如請求項11至19中任一項之聚核苷酸序列。
23. 如請求項22之rAAV顆粒，其中所述rAAV顆粒包括單股基因組。
24. 一種編碼CLN6多肽的重組腺相關病毒9（rAAV9）病毒顆粒，其包括rAAV9基因組，所述rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：包括與核酸序列SEQ ID NO: 6至少90%一致之核酸序列的CMV增強子；包括與核酸序列SEQ ID NO: 3至少90%一致之核酸序列的雞β-肌動蛋白啟動子；以及編碼與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少90%一致之CLN6多肽的聚核苷酸。
25. 如請求項24之rAAV9病毒顆粒，其中所述rAAV9基因組包括自身互補型基因組。
26. 如請求項24之rAAV9病毒顆粒，其中所述rAAV9基因組包括單股基因組。
27. 如請求項24至26中任一項之rAAV9病毒顆粒，其中所述rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；包括與核酸序列SEQ ID NO: 6至少90%一致之核酸序列的所述CMV增強子；包括與核酸序列SEQ ID NO: 3至少90%一致之核酸序列的所述雞β-肌動蛋白啟動子；編碼與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少90%一致之CLN6多肽的所述聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複。
28. 如請求項24至27中任一項之rAAV9病毒顆粒，其中編碼所述CLN6多肽的所述聚核苷酸包括與SEQ ID NO: 2之核酸序列至少90%一致的核酸序列。
29. 如請求項24至28中任一項之rAAV9病毒顆粒，其中所述rAAV9基因組包括與核酸序列SEQ ID NO: 4至少90%一致的核酸序列。
30. 如請求項24至28中任一項之rAAV9病毒顆粒，其中所述rAAV9基因組包括與核酸序列SEQ ID NO: 4至少95%一致的核酸序列。
31. 如請求項24至30中任一項之rAAV9病毒顆粒，其中所述AAV末端反向重複係AAV2末端反向重複。
32. 如請求項24至31中任一項之rAAV9病毒顆粒，其中所述rAAV9基因組進一步包括SV40內含子。
33. 如請求項24至32中任一項之rAAV9病毒顆粒，其中所述rAAV9基因組進一步包括BGH poly-A序列。
34. 一種核酸分子，其包括rAAV9基因組，所述rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；具有與核酸序列SEQ ID NO: 6至少90%一致之核酸序列的CMV增強子；具有與SEQ ID NO: 3之核酸序列至少90%一致之核酸序列的雞β-肌動蛋白啟動子；編碼與SEQ ID NO: 1之胺基酸序列至少90%一致之CLN6多肽的聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複。
35. 如請求項34之核酸分子，其中所述rAAV9基因組包括自身互補型基因組。
36. 如請求項34之核酸分子，其中所述rAAV9基因組包括單股基因組。
37. 如請求項34至36中任一項之核酸分子，其中所述rAAV9基因組以5'至3'的順序包括：第一AAV末端反向重複；具有與核酸序列SEQ ID NO: 6至少90%一致之核酸序列的所述CMV增強子；具有與SEQ ID NO: 3之核酸序列至少90%一致之核酸序列的所述雞β-肌動蛋白啟動子；編碼與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少90%一致之CLN6多肽的所述聚核苷酸；以及第二AAV末端反向重複。
38. 如請求項34至37中任一項之核酸分子，其中編碼所述CLN6多肽的所述聚核苷酸包括與SEQ ID NO: 2之核酸序列至少90%一致的胺基酸序列。
39. 如請求項34至38中任一項之核酸分子，其中所述rAAV9基因組包括與SEQ ID NO: 4至少90%一致的胺基酸序列。
40. 如請求項34至38中任一項之核酸分子，其中所述rAAV9基因組包括與SEQ ID NO: 4至少95%一致的序列。
41. 如請求項34至40中任一項之核酸分子，其中所述AAV末端反向重複係AAV2末端反向重複。
42. 如請求項34至41中任一項之核酸分子，其中所述rAAV9基因組進一步包括SV40內含子。
43. 如請求項34至42中任一項之核酸分子，其中所述rAAV9基因組進一步包括BGH poly-A序列。
44. 一種組合物，其包括：如請求項1至10中任一項之scAAV9；如請求項11至19、31或34至43中任一項之核酸分子；如請求項22至33中任一項之rAAV9病毒顆粒；以及藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑。
45. 如請求項44之組合物，其中所述賦形劑包括非離子低滲透化合物、緩衝液、聚合物、鹽或其組合。
46. 一種治療受試者之CLN6型巴藤病（CLN6-Batten Disease）的方法，其包括：向所述受試者投與組合物，所述組合物包括治療有效量之如請求項1至10中任一項之scAAV9；如請求項22至33中任一項之rAAV9病毒顆粒；如請求項11至19、31或34至43中任一項之核酸，或如請求項44或45之組合物。
47. 如請求項46之方法，其中所述組合物藉由選自由以下組成之群的途徑投與：鞘內、腦室內、腦實質內、靜脈內及其組合。
48. 如請求項47之方法，其中所述組合物係鞘內投與。
49. 如請求項47之方法，其中所述組合物係腦室內投與。
50. 如請求項47之方法，其中所述組合物藉由靜脈內投與。
51. 如請求項46至50中任一項之方法，其中投與約1×10¹¹ 至約1×10¹⁵ vg的所述rAAV9病毒顆粒。
52. 如請求項46至51中任一項之方法，其中投與約1×10¹² 至約1×10¹⁴ 的所述rAAV9病毒顆粒。
53. 如請求項46至52中任一項之方法，其中所述治療穩定或減緩CLN6型巴藤病的一種或多種症狀，所述症狀選自： （a）腦量損失； （b）認知功能喪失；以及 （c）語言發展遲緩； 此是與未治療的CLN6型巴藤病患者相比而言的。
54. 如請求項46至52中任一項之方法，其中所述治療穩定或減緩CLN6型巴藤病的疾病進展。
55. 如請求項54之方法，其中使用UBDRS量表、漢堡運動及語言量表、使用小兒生活品質（PEDSQOL）量表所測量的治療對生活品質的影響、馬倫早期學習量表（MSEL）、延長存活期的可能性或其組合來評估疾病進展。
56. 如請求項46至55中任一項之方法，其中所述受試者的年齡為80個月或以下、75個月或以下、70個月或以下、65個月或以下、62個月或以下、60個月或以下、55個月或以下、50個月或以下或40個月或以下。
57. 如請求項46至56中任一項之方法，其進一步包括在投與所述rAAV9病毒顆粒後將所述受試者置於特倫德倫伯格位置（Trendelenberg position）。
58. 一種治療有需要之患者之CLN6疾病的方法，其包括組合物遞送至有需要之患者的腦或脊髓，所述組合物包括：如請求項1至10中任一項之scAAV；如請求項22至33中任一項之rAAV9病毒顆粒；如請求項11至19、31或34至43中任一項之核酸；或如請求項44或45之組合物。
59. 如請求項55之方法，其中所述組合物藉由鞘內注射、腦室內注射、腦實質內注射或靜脈內注射或其組合遞送。
60. 如請求項56之方法，其進一步包括在鞘內注射所述組合物後將所述患者置於特倫德倫伯格位置。
61. 如請求項55至57中任一項之方法，其中所述組合物包括非離子低滲透造影劑。
62. 如請求項61之方法，其中所述非離子低滲透造影劑選自由以下組成之群：碘比醇（iobitridol）、碘海醇（iohexol）、碘美普爾（iomeprol）、碘帕醇（iopamidol）、碘噴托（iopentol）、碘普胺（iopromide）、碘佛醇（ioversol）、碘昔蘭（ioxilan）及其組合。
63. 如請求項55至59中任一項之方法，其中所述遞送至腦或脊髓包括遞送至腦幹。
64. 如請求項55至59中任一項之方法，其中所述遞送至腦或脊髓包括遞送至小腦。
65. 如請求項55至59中任一項之方法，其中所述遞送至腦或脊髓包括遞送至視覺皮質。
66. 如請求項55至59中任一項之方法，其中所述遞送至腦或脊髓包括遞送至運動皮質。
67. 如請求項55至63中任一項之方法，其中所述遞送至所述腦或所述脊髓包括遞送至神經細胞、神經膠質細胞或兩者。
68. 如請求項55至63中任一項之方法，其中所述遞送至腦或脊髓包括遞送至所述神經系統的細胞，其中所述神經系統的所述細胞係神經元、下運動神經元、小神經膠質細胞、少突膠質細胞、星形膠質細胞、許旺氏細胞（Schwann cell）或其組合。
69. 如請求項58至68中任一項之方法，其中所述治療穩定或減緩CLN6型巴藤病的一種或多種症狀，所述症狀選自： （a）腦量損失； （b）認知功能喪失；以及 （c）語言發展遲緩； 此是與未治療的CLN6型巴藤病患者相比而言的。
70. 如請求項58至68中任一項之方法，其中所述治療穩定或減緩CLN6型巴藤病的疾病進展。
71. 如請求項70之方法，其中使用UBDRS量表、漢堡運動及語言量表、使用小兒生活品質（PEDSQOL）量表所測量的治療對生活品質的影響、馬倫早期學習量表（MSEL）、延長存活期的可能性或其組合來評估疾病進展。
72. 如請求項58至71中任一項之方法，其中所述受試者的年齡為80個月或以下、75個月或以下、70個月或以下、65個月或以下、62個月或以下、60個月或以下、55個月或以下、50個月或以下或40個月或以下。
73. 一種治療有效量的如請求項1至10中任一項之scAAV9、如請求項22至33中任一項之rAAV9病毒顆粒、如請求項11至19、31或34至43中任一項之核酸或如請求項44或45之組合物的用途，用於製備治療個體的CLN6型巴藤病的藥物。
74. 一種包含治療有效量的如請求項1至10中任一項之scAAV9、如請求項22至33中任一項之rAAV9病毒顆粒、如請求項11至19、31或34至43中任一項之核酸或如請求項44或45之組合物的組合物，用於治療個體的CLN6型巴藤病。
75. 一種如請求項1至10中任一項之scAAV、如請求項22至33中任一項之rAAV9病毒顆粒、如請求項11至19、31或34至43中任一項之核酸或如請求項44或45之組合物的用途，用於製備將所述rAAV病毒顆粒、核酸或組合物遞送至有需要的患者的大腦或脊髓中的藥物。
76. 一種用於治療有需要的患者的CLN6型疾病的組合物，其中所述組合物包括如請求項1至10中任一項之scAAV、如請求項22至33中任一項之rAAV9病毒顆粒、如請求項11至19、31或34至43中任一項之核酸或如請求項44或45之組合物，用於有需要的患者的大腦或脊髓。

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