KR101952966B1 - 질병의 치료를 위한 벡터 및 서열 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 질병의 치료를 위한, 특히 점액다당질증의 치료를 위한 새로운 서열, 유전자 구조물, 벡터 및 제약학적 조성물을 제공한다.

Description

질병의 치료를 위한 벡터 및 서열{VECTORS AND SEQUENCES FOR THE TREATMENT OF DISEASES}
본 발명의 분야
본 발명은 관심 단백질의 발현에 유용한 벡터 및 유전자 요법에서 이들의 활용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 점액다당질증(mucopolysaccharidoses (MPS))의 치료, 및 특히, 점액다당질증 제 IIIA형((mucopolysaccharidosis type IIIA) 또는 산필립포 증후군(Sanfilippo syndrome)의 치료에 도움이 되는 벡터 및 핵산 서열에 관한 것이다.
본 발명의 배경기술
리소좀은 진핵 세포의 세포질에서 발견되는 세포소기관이며, 이는 많은 가수분해성 효소에 대한 저장소로서 그리고 세포 성분을 분해 및 재활용하기 위한 중심으로서 제공한다. 이 세포소기관은 프로테아제(protease), 뉴클레아제(nuclease), 글리코시다아제(glycosidase), 리파아제(lipase), 포스포리파아제(phospholipase), 포스파타아제(phosphatase) 및 설파타아제(sulfatase)를 포함하는 여러 가지 유형의 가수분해성 효소를 함유한다. 모든 효소는 산성 가수분해효소이다.
리소좀 축적병(lysosomal storage disease (LSD))은 하나 이상의 리소좀 효소에 영향을 주는 유전적 결함에 의해 야기된다. 일반적으로 이들 유전적 질병은 리소좀 내에 존재하는 특정 효소 활성도의 결핍이 원인이다. 보다 적게는, 단백질 내 결핍 때문에 이들 질병은 리소좀성 생물발생에 관여하게 한다.
LSD는 그룹으로서 일반 인구에서 비교적 흔한 것임에도 불구하고, 이들 질환은 개별적으로는 드물다. LSD의 결합된 유병율은 대략적으로 5,000명 신생아 당 1명이다. Meikle P, et al, JAMA 1999; 281:249-254를 참고한다. 하지만, 일반 인구내의 몇몇 그룹은 LSD의 고발병율에 특히 시달린다. 예를 들어, 유대계 중앙 및 동 유럽인 (아슈케나지(Ashkenazi)) 개체로부터 내려오는 고셰(Gaucher)병 및 타이-샥스 병(Tay-Sachs disease)의 유병률은 각각 600명 출생 당 1명 및 3,900명 출생 당 1명이다. 또한 핀란드 인구는 드물게 높은 LSD 유병율에 시달린다.
산필립포 증후군으로서 집합적으로 알려진, 제 III형 점액다당질증 (MPSIII)은 헤파란 황산의 분해와 관련된 하나의 효소에서의 결핍에 의해 야기된 LSD이며, 이는 병적 축적을 초래한다. MPSIII는 효소 결핍에 따라서 4가지 아류형으로 분류된다. 설파미다아제(sulfamidase) 활성도의 손실은 아류형 IIIA를 야기하고 가장 빠른 질병 개시 및 가장 짧은 생존율로 가장 중증인 것으로 보고되었다. MPSIIIA의 증상은 태어나고 1년 안에 일어나고, 그리고 심각한 정신 지체, 공격성, 활동항진증, 및 수면 변경을 초래하는 중증 신경퇴화로 특징지어진다. 환자는 말하기, 삼키키, 기본적인 운동 협응의 능력을 점진적으로 잃는다. 신경 증상에 더하여, MPSIIIA 환자는 간종대(hepatomegaly) 및 비종대(splenomegaly), 뼈대 및 관절 기형, 그리고 잦은 설사 및 기도 감염을 포함하여, 비-신경성 변이로 고통받는다. 증상의 점진적인 악화는 청소년기 동안 환자의 죽음을 야기한다. Neufeld E, Muenzer J, "The mucopolysaccharidoses" in Scriver C, et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease" (McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452)를 참고한다.
현재 MPSIIIA를 위한 치유법이 없고 따라서, 존재하는 치료는 환자의 삶의 낮은 질을 개선하기 위해 질병의 증상을 조절하는 것을 목표로 한다. MPS 질환은 골수 이식 또는 효소 대체요법(ERT)으로 치료될 수 있다. 두가지 접근법은 세포외 배지에서 리소좀 효소의 세포내섭취(endocytosis) 및 세포막에 존재하는 만노오스-6-포스페이트 수용체 (M6PR)를 통하여 리소좀에 대한 이들의 표적에 의존한다. 그럼에도 불구하고, 골수 이식은 MPSIII 환자의 치료에 비효율적인 것으로 증명되었다. Sivakamur P, Wraith J, J. Inherit. Metab. Dis. 1999; 22:849-850을 참고한다. ERT는 MPSI, II 및 VI를 포함하여, 다른 리소좀 축적병에서 비-신경 축적에 대응하는데 효과적인 것으로 광범위하게 입증되었다. Harmatz P, et al., J. Mol. Genet. Metab. 2008; 94:469-475; Muenzer J, et al ., Genet. Med. 2006; 8:465-473 및 Wraith J, et al ., J. Pediatr. 2004; 144:581-588을 참고한다. 이들 치료의 고비용에 더하여, ERT는 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통하여 외인성으로 제공된 효소의 불충분한 송달 때문에 신경 기능의 교정 및 보존을 야기하지 않는다는 것을 나타내었다. Enns G, Huhn S, Neurosurg. Focus 2008; 24:E12를 참고한다. 더욱 최근에, 고-용량 ERT는 아마도, 순환에서 단백질의 더 긴 반감기를 야기하는 M6PR 및 만노오스 수용체의 포화 때문에, MPS VII에서 CNS 축적의 클리어링(clearing)에 부분적으로 성공적이라는 것이 증명되었다. Vogler C, et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; 102:14777-14782를 참고한다. 이 연구는 장시간 동안 순환에서 고수준의 효소는 병상(pathology)의 더 나은 교정과 관련이 있다는 것을 증명하였다. 또한 효소의 대뇌내 및 CSF-내(intra-CSF) 송달은 MPS IIIA 쥐에서 CNS 병상을 감소시키는데 효과적인 것으로 입증하였다. Hemsley K, et al ., Genes Brain Behav. 2008; 53(2):161-8 및 Savas P, et al ., Mol. Genet. Metab. 2004; 82:273-285를 참고한다. 하지만 이 접근법은 다수의 반복 주사에 대한 필요성 때문에 매우 침습적이고 뇌에서 손상 및/또는 감염의 위험을 증가시킬 수 있다.
MPSIII에 대한 현재 치료학적 선택의 제한을 고려해볼 때, 대안적인 접근법이 필요하다. 유전자 전달(Gene transfer)은 단일 중재로부터 없어진 효소의 영구적인 생성을 성취하기 위한 수단을 제공할 수 있다. 아데노-연관 벡터 (AAV)는 이들의 높은 형질도입 효율성과 이들의 병원성의 결핍 때문에, 많은 유전자 요법 적용을 위한 선택의 벡터로서 빠르게 생겨난다. AAV 벡터는 유사분열-후 세포를 유효하게 형질도입하고 여러 가지 사전-임상 및 임상 연구는 여러 가지 질병에 대한 치료학적 도입유전자(transgene)의 지속적인 발현을 유효하게 유도하기 위한 AAV 벡터-매개 유전자 전달의 잠재성을 증명하였다. Daya S, Berns K, Clin. Microbiol. Rev. 2008; 21:583-593을 참고한다.
갓 태어난 MPSIIIA 쥐의 측뇌실에서 설파미다아제 및 설파타아제 활성제 SUMF1을 공동-발현하는 AAV5 벡터의 투여는 많은 신경 및 행동 변이를 교정할 수 있다는 것을 나타내었다. Fraldi A, et al ., Hum. Mol. Genet. 2007; 16:2693-2702를 참고한다. 하지만, 이 제안된 방책은 여러 가지 단점이 있다. 첫째, 활용된 CMV 프로모터(promoter)는 침묵(silence)인 것으로 보고되었다. 둘째, 설파미다아제 및 SUMF1의 공동-발현의 장시간 효과는 아직 평가되지 않았다. SUMF의 공동-발현이 심지어 필요한지에 대해서 그리고 설파미다아제만 가지고 한 치료와 비교할 때 임의의 추가적인 영구한 혜택을 제공하는지에 대해서는 명확하지 않다. 셋째, AAV5는 유조직내에 적은 분포로 있으며, 더욱 중요하게는, 이들 벡터를 사용하여 뇌 내로 설파미다아제의 송달은 뇌 조직의 임의의 형질도입을 야기하지 않고, 따라서, 이 접근법에 따라서 체세포 표현형의 교정이 성취되지 않는다. Fraldi, 2007, supra는 단지 갓 태어난 MPSIIIA 쥐에서 유전자 전달의 효능을 증명하였다. 나이가 더 많은 쥐에서의 실험은 보고되지 않았다. MPSIIIA는 3-4년 시기 후 주로 진단되므로, 갓 태어난 동물 모델은 인간에서의 이 치료의 효과를 예측하는데 적절하지 않다.
태어났을 때 MPSIIIA 진단에 대한 어려움을 고려하여, 성인 초기에 시작하는 치료학적 중재의 발달이 제안되었다. 성체 쥐에서 설파미다아제를 발현하는 렌티바이러스성 벡터의 정맥내 송달은 아마도 생체내 이들 벡터의 상대적으로 불량한 형질도입 수행 때문에, CNS 표현형의 개선이 거의 없는 것으로 야기된다는 것이 보고되었다. Mclntyre C, et al ., Mol. Genet. Metab. 2008; 93:41 1-418을 참고한다. 따라서, AAV 벡터와 같이, 생체내 더 높은 형질도입 효능을 갖는 바이러스성 벡터의 용도는 설파미다아제의 더 높은 순환 수준을 제공할 수 있으며, 이는 신경 병상을 잠재적으로 개선 또는 교정할 수 있다.
유전자 요법을 통한 MPSIIIA의 치료는 더욱 효과적인 벡터 및 설파미다아제 코딩(coding) 서열을 요구한다. 따라서, 오랫동안 MPSIIIA의 효과적인 치료에 대한 필요성을 느꼈다. 또한 이 질병의 치료에 대해 신규한 접근법에 대한 필요성이 있으며 이는 강화된 보안 특성을 갖는다. MPSIIIA는 드문 질병이고 따라서 희귀한 질병(orphan disease)이다. 이러한 드문 질병을 치료하기 위해 특이적으로 개발된 제약학적 약물은 희귀 의약품(orphan drug)일 것이다.
본 발명의 요약
본 발명은 본 발명은 질병의 치료를 위한, 바람직하게는 점액다당질증 (MPS)의 치료를 위한 새로운 서열, 새로운 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 따라서, 본 발명의 첫번째 측면은 더욱 안정한 mRNA의 전사를 허용하는 인간 설파미다아제의 코돈 최적화 서열인 뉴클레오티드 서열과 관련있다. 이 서열은 더 높은 속도에서 전사되고, 따라서, 설파미다아제 효소의 더 높은 산출량을 생성한다. 서열은 더 나은 발현 프로파일(profile)을 가지며 설파미다아제 뉴클레오티드 서열을 코돈 최적화하려는 다른 시도보다 치료학적으로 더 효과적이다. 효소 발현에서 이들의 증가된 수준에 이어 혈청 설파미다아제 활성도가 증가하고, 이는 질병을 일으키는 글리코사미노글리칸 (glyocosaminoglycan (GAG)) 축적의 감소를 허용한다. 상기 서열은 서열번호: 1이거나 단백질 서열번호: 2에 대해 암호화(codify)한 서열번호: 1에 대해 최소 85% 서열 동일성을 갖는 서열이다.
두번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 첫번째 측면의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조물과 관련된다.
또한 본 발명은 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로질러 통과할 수 있는 혈청형 9를 갖는 새로운 AAV 벡터를 제공하고 상이한 뇌 구조에 대해 더욱 향성(tropism)임을 나타낸다. 이는 설파미다아제 활성도가 뇌에서 특이적으로 향상되도록 허용하고, 이는 GAG 축적을 감소시키고 따라서 MPS의 신경 증상을 개선한다. 또한 AAV 혈청형 9는 심장, 췌장 및 근육 조직에 대한 예상외 높은 향성을 나타내고, 따라서 본 발명의 전체적인 치료학적 혜택을 가능하게 한다.
예를 들어, 간을 표적하기 위한 정맥내(iv) 주사로 또는 골격근을 표적하기 위한 근육내 (im) 주사로, 또는 중추신경계를 표적하기 위한 조내(ic) 주사로 성체 MPSIIIA 쥐에게, AAV 혈청형 8 및 9 (AAV8 및 AAV9) 벡터를 투여한 후, im-벡터 송달로 성취된 설파미다아제 발현의 수준은 치료적이지 않았다. 조내 (intracisternal) 투여는 설파미다아제 순환의 수준을 증가시킬 뿐만 아니라, 뇌조직을 포함하여, 여러 가지 유형의 조직에서 MPSIIIA의 체세포 표현형을 복귀시킬 수 있었다. 또한 간-지향성 접근법은 고수준의 순환 설파미다아제 활성도를 야기할 수 있었으며, 이는 전부 및 유의미하게 질병과 관련된 신경 병상에서 MPSIIIA의 체세포 축적 표현형을 놀랍게도 교정하였다. 이들 결과는 인간 임상적 설정과 밀접하게 유사한 질병 모델인 성체 MPSIIIA 쥐에서 설파미다아제의 AAV-매개 유전자 전달의 효능의 증거를 제공한다. 본 발명자는 MPSIIIA의 체세포성 및 신경성 변이 둘 모두를 완전하게 교정할 수 있었다.
본 발명의 유전자 구조물은 설파미다아제의 발현을 조절하고 및 강화시키기 위해, CAG 또는 hAAT 프로모터와 같은 적절한 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, CAG 프로모터는 CMV 프로모터보다 더욱 안정하고, 따라서 장시간 동안 설파미다아제의 발현을 더욱 유발할 수 있다. 다른 한편으로는, hAAT 프로모터의 안정성 및 효능으로 설파미다아제의 송달 이행 또는 지속 용량을 위한 이상적인 비히클(vehicle)이 만들어진다. CAG 또는 hAAT프로모터에 의한 서열번호: 1의 발현 조절은 이의 치료학적 효과를 유의적으로 강화시켰다.
또한 본 발명의 AAV 벡터는 설파미다아제 활성도를 증가시키며, 이는 GAG 축적을 감소시키고 MPS를 앓는 개체의 임상적 결과를 향상시킨다. 역위 말단 반복 (inverted terminal repeat(ITR)) 사이에 위치한, 설파미다아제의 프로모터 및 뉴클레오티드 서열은 개체의 세포의 유전자 내로 편입되기 때문에 단지 1회의 투여만으로도 충분할 수 있다. 따라서, 단일 비경구 투여는 장기 효과를 얻어내는데 충분하다.
세번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 첫번째 측면의 뉴클레오티드 서열, 본 발명의 유전자 구조물 또는 발현 벡터를 포함한 제약학적 조성물과 관련된다.
네번째 측면에서, 본 발명은 약으로서 사용하기 위한 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 발현 벡터 또는 제약학적 조성물과 관련된다. 약은 신체내 설파미다아제 활성도를 증가시키기 위해, 효소 대체요법을 위해, 유전자 요법을 위해 또는 MPS의 치료를 위해 사용될 수 있다.
다섯번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 첫번째 및 두번째 측면의 발현 벡터의 생성을 위한 방법과 관련된다.
여섯번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 세번째 측면의 제약학적 조성물을 제조하기 위한 방법과 관련된다.
일곱번째 측면에서, 본 발명은 본 발명의 첫번째, 두번째, 세번째 측면을 갖는 점액성 다당류증 유형 IIIA를 앓는 피험체를 치료하기 위한 방법과 관련된다.
또한 본 발명은 신체내 설파미다아제 활성도를 증가시키기 위한, 효소 대체요법을 위한, 유전자 요법을 위한 또는 점액다당질증 또는 점액다당질증 제 IIIA형의 치료를 위한 약의 제조에서 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 발현 벡터 또는 제약학적 조성물의 용도와 관련된다.
미생물의 기탁 ( DEPOSIT OF MICROORGANISM )
플라스미드 pAAV-CAG-co-hu-SFMD는 독일 연방공화국, DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraße 7 B, D-38124 Braunschweig에서 수탁번호 DSM 24817 하에, 2011년 5월 16일에 기탁되었다.
플라스미드 pAAV-CAG-mu-SFMD는 독일 연방공화국, DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraße 7 B, D-38124 Braunschweig에서, 수탁번호 DSM 24818 하에, 2011년 5월 16일에 기탁되었다.
플라스미드 pGG2-hAAT-mu-SFMD는 독일 연방공화국, DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstraße 7 B, D-38124 Braunschweig에서 수탁번호 DSM 24819 하에, 2011년 5월 16일에 기탁되었다.
정의
용어 "뉴클레오티드 서열"은 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 함유한 DNA 또는 RNA인 핵산 분자를 나타낸다. 핵산은 이중 가닥, 단일 가닥일 수 있거나, 또는 이중 가닥 서열 또는 단일 가닥 서열 둘 모두의 부분을 함유할 수 있다.
용어 "% 서열 동일성"은 최대 % 서열 동일성을 얻기 위해 서열을 배열한 후, 서열번호: 1내 뉴클레오티드와 동일한 후보자 서열의 뉴클레오티드 백분율을 나타낸다. % 서열 동일성은 해당 분야에서 확립된 ALIGN, BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘과 같은 임의의 방법 또는 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. Altschul S, et al ., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402 및 Altschul S, et al., J. Mol. Biol. 1990; 215:403-410을 참고한다.
여기서, % 서열 동일성은 서열번호: 1과 후보자 서열을 배열한 후 동일한 뉴클레오티드의 수를 서열번호: 1내 뉴클레오티드의 전체 수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 산출된다.
용어 "암호화"는 어떻게 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는지 확인하는 유전적 암호를 나타낸다. 서열내 뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 또는 단백질을 따라 아미노산의 순서를 결정한다.
용어 "단백질"은 구형으로 접히는 아미노산 또는 폴리펩티드의 선형 사슬을 나타낸다. 단백질은 시스테인 잔기가 3-옥소알라닌으로 전환, 글리코실화 또는 금속 결합과 같은, 번역-후 개질을 겪을 수 있다. 단백질의 글리코실화는 공유결합으로 아미노산 사슬에 결합되는 상이한 탄수화물의 첨가이다.
용어 "유효량"은 의도한 목적을 성취하는데 충분한 기질의 양을 나타낸다. 예를 들어, 설파미다아제 활성도를 증가시키는 발현 벡터의 유효량은 글리코사미노글리칸 축적을 감소시키는데 충분한 양이다. 질병 또는 질환을 치료하기 위한 발현 벡터의 "치료학적 유효량"은 질병 또는 질환의 증상을 감소시키거나 제거하는데 충분한 발현 벡터의 양이다. 특정 기질의 유효량은 기질의 성질, 투여의 경로, 기질을 받기 위한 동물의 크기 및 종 그리고 주어진 기질의 목적과 같은 요인에 따라 다양할 수 있다. 각각의 개별 경우에 있어서 유효량은 해당 분야에서 확립된 방법에 따라서 숙련자에 의해 경험적으로 측정될 수 있다.
용어 "개체"는 임의적인 동물, 바람직하게는 인간 또는 비-인간 포유류, 더욱 바람직하게는 쥐, 래트, 기타 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 또는 영장류, 추가로 더욱 바람직하게는 인간을 나타낸다.
용어 "작용가능하게 연결된(operably linked)"은 관심 유전자에 대하여 기능적 관계 및 프로모터 서열의 위치를 나타낸다 (가령, 프로모터 및 인핸서(enhancer)는 서열의 전사에 영향을 준다면 코딩 서열과 작용가능하게 연결된다). 일반적으로, 작용가능하게 연결된 프로모터는 관심 서열과 근접한다. 하지만, 인핸서는 이의 발현을 조절하기 위해 관심 서열과 근접할 필요가 없다.
용어 "향성"은 상이한 바이러스가 이들 종 내에서 특이적 숙주 종, 또는 특이적 세포 유형을 우선적으로 표적하기 위해 진화되는 방식이다.
용어 "유전자 요법"는 유전적 또는 후천적 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하기 위해 관심 유전적 물질 (가령, DNA 또는 RNA)을 숙주 내로 전달을 나타낸다. 관심 유전적 물질은 생체내 생성이 바람직한 생성물 (가령, 단백질 폴리펩티드, 펩티드 또는 기능적 RNA)을 암호화한다. 예를 들어, 관심의 유전적 물질은 치료적 가치의 효소, 호르몬, 수용체, 또는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.
용어 "CAG 프로모터"는 거대세포바이러스(cytomegalovirus) 초기 인핸서 요소 및 닭 β-액틴 프로모터 (즉 서열번호: 3)를 나타낸다. Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11을 참고한다.
용어 "hATT 프로모터"는 인간 알파1-항트립신 프로모터 (즉 서열번호: 4)를 나타낸다. Hafenrichter H, et al ., Blood 1994; 84: 3394-3404를 참고한다.
용어 "바이러스성 벡터 입자"는 유전자를 유기체 내로 송달하기 위해 사용된 유전적으로 변형된 바이러스를 나타낸다. 바이러스성 벡터 입자는 바이러스성 게놈을 포함한다. 바이러스성 게놈은 바이러스성 벡터 입자의 생성을 위해 사용되는 발현 벡터내 ITR 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 아데노-연관 바이러스성 벡터 입자는 AAV라고 불린다. 용어 "AAV 벡터"는 아데노-연관 바이러스성 벡터 입자를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 첫번째 측면의 서열은 단백질 서열번호: 2에 대해 암호화한 서열번호: 1과 최소 85% 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 서열 동일성은 최소 87%이다. 더욱 바람직하게는, 서열 동일성은 최소 90%이다. 더욱더 바람직하게는, 서열 동일성은 최소 95%이다. 훨씬 더 바람직하게는 서열 동일성은 최소 98%이다. 가장 바람직하게는, 서열 동일성은 최소 99%이다. 더 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 첫번째 측면의 서열은 뉴클레오티드 서열 서열번호: 1이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 뉴클레오티드 서열 서열번호: 1 또는 이 서열의 생물학적으로 활성인 변이체와 관련된다. 생물학적으로 활성인 변이체는 서열번호: 1 및 최소 85% 서열 동일성으로서 동일한 생물학적 활성도를 갖는 분자를 포함한다. 생물학적 활성도는 증가된 안정성을 가지며 따라서 고 번역율을 나타내는 전령 RNA 내로 뉴클레오티드 서열 서열번호: 1이 전사될 수 있다는 사실을 나타내고, 따라서 이는 고수준의 활성 인간 설파미다아제의 발현을 허용한다.
두번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 유전자 구조물은 서열번호: 1과 최소 85%, 바람직하게는 87%, 90%, 95%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 유전자 구조물은 뉴클레오티드 서열 서열번호: 1을 포함한다. 유전자 구조물은 상이한 요소가 특이적 및 바람직한 방식으로 조작이 일어나는 핵산 분자이다. 이들 요소는 그 중에서도, 복제 서열, 조절 서열, 암호화 서열, 다클로닝(multicloning) 서열 또는 재조합 서열일 것이다. 바람직한 실시양태에서, 유전자 구조물은 벡터이다. 벡터는 유전적 물질을 세포 내로 전달하는데 사용된 핵산 분자이다. 상기 유전적 물질 외에도, 벡터는 프로모터 또는 작동유전자(operator), 전사 인자 결합 영역 또는 인핸서와 같은, 전사를 위한 조절 요소, 및 번역의 개시 또는 종결을 위한 조절 요소를 포함하는 상이한 기능적 요소를 또한 함유한다. 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 재조합 발현 카세트(recombinant expression cassettes) 및 전이인자(transposon)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 아데노-연관 벡터 (AAV)는 바이러스성 벡터 입자이며, 따라서 이들은 핵산 분자가 아니지만 유전자를 유기체 내로 송달하기 위해 사용된 유전적으로 변형된 바이러스이다.
본 발명의 두번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 유전자 구조물은 관심 유전자의 번역 및 전사를 위해 사용되는 벡터이며, 주로 프로모터에 의해 조절된다. 프로모터는 관심 유전자의 번역을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 관심 유전자와 작용가능하게 연결된다.
또 다른 바람직한 벡터는 아데노-연관 벡터이다. 바람직한 실시양태에서, 아데노-연관 벡터는 혈청형이 1, 2, 5, 7, 8 또는 9인 아데노-연관 입자를 생성하는데 사용된다. 더욱 바람직한 실시양태에서, 혈청형은 9이다. 아데노-연관 벡터는 파르보비리다에(Parvoviridae) 과의 아데노-연관 바이러스 (AAV)의 게놈으로부터 파생된 벡터이다. AAV 게놈은 단일-가닥 디옥시리보핵산 (ssDNA)으로 만들어졌다. AAV는 인간을 감염시키지만 비-병원성이다 (즉, 질병을 야기하지 않는다). 이들은 분열 세포(dividing cell) 및 비-분열 세포(non-dividing cell)을 감염시킬 수 있고, 이들의 향성은 혈청형에 따라서 변화한다. 혈청형은 바이러스의 캡시드 항원에 따른, 그룹내 바이러스의 분류이다. AAV 캡시드 단백질에 의해 확인된, AAV의 혈청형은 바이러스 향성을 규정하고 특이적 세포 유형 내로 이의 진입을 허용한다. 아데노-연관 벡터 입자의 생성은 하기 설명된다.
두번째 측면의 첫번째 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 CAG 프로모터를 포함한다.
바람직한 벡터는 CAG 프로모터를 포함하는 발현 벡터로서 프로모터 서열은 서열번호: 3이다. 따라서, 본 발명의 두번째 측면의 한 가지 실시양태는 CAG 프로모터를 포함하는 발현 벡터로서, 프로모터 서열은 MPS를 치료하는데 적합한 서열번호: 3이다.
두번째 측면의 두번째 바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 간-특이적 hAAT 프로모터를 포함한다.
바람직한 벡터는 간-특이적 hAAT 프로모터를 포함하는 발현 벡터로서, 프로모터 서열은 서열번호: 4이다. 따라서, 본 발명의 두번째 측면의 한 가지 실시양태는 간-특이적 hAAT 프로모터를 포함하는 발현 벡터로서, 프로모터 서열은 MPS를 치료하는데 적합한 서열번호: 4이다.
본 발명의 또 다른 측면은 발현 벡터라고도 또한 불리는, 바이러스성 벡터 입자를 나타내며, 이는 본 발명의 첫번째 측면의 뉴클레오티드 서열, 또는 본 발명의 두번째 측면의 유전자 구조물 또는 발현 벡터를 포함한다.
바람직한 발현 벡터는 혈청형 1, 2, 5, 7, 8 또는 9를 갖는다. 더욱 바람직한 바이러스성 벡터 입자는 혈청형 9를 갖는다.
바람직한 발현 벡터는 혈청형 9를 갖고 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 바이러스성 게놈을 포함한다.
바람직한 발현 벡터는 혈청형 8 또는 9를 갖고 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 hAAT 프로모터를 포함하는 바이러스성 게놈을 포함한다.
바람직한 발현 벡터는 혈청형 9를 갖고 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 hAAT 프로모터를 포함하는 바이러스성 게놈을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 발현 벡터는 AAV-CAG-co-hu-SFMD이고 더욱 바람직하게는, AAV9-CAG-co-hu-SFMD이다.
또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 AAV-hAAT-co-hu-SFMD이고, 더욱 바람직하게는, AAV8-hAAT-co-hu-SFMD 또는 pAAV9-hAAT-co-hu-SFMD이다. hAAT 프로모터가 사용될 때 활용되는 가장 바람직한 벡터는 AAV9-hAAT-co-hu-SFMD이다.
세번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 제약학적 조성물은 비경구 투여에 의해 투여된다. 비경구 투여는 주사제(injection) 또는 주입제(infusion)로서 제약학적 조성물의 투여 경로를 나타낸다. 비경구 투여의 예시는 정맥내, 피하, 조내 및 근육내 주사이다. 바람직하게는, 제약학적 조성물은 정맥내 또는 조내 투여에 의해 투여된다.
또 다른 실시양태에서, 제약학적 조성물은 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 바이러스성 벡터 입자 또는 발현 벡터의 치료학적 유효량을 포함한다.
네번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 발현 벡터, 바이러스성 벡터 입자 또는 제약학적 조성물은 약으로서 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 이들은 신체내 설파미다아제 활성도를 증가시키기 위해 사용된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 발현 벡터, 바이러스성 벡터 입자 또는 제약학적 조성물은 효소 대체요법 또는 유전자 요법, 바람직하게는 유전자 요법을 위한 약으로서 사용된다. 발명자는 해당 업계에서 다른 것보다 더 효과적인 것으로 알려진 MPSIIIA 치료제의 처리를 위한 새로운 유전자 요법 접근법을 제안한다. 이 접근법은 설파미다아제를 발현하는 AAV 벡터에 기초한다. 효소 대체요법 (ERT)은 특정 효소가 결핍 또는 부재하는 환자에서 효소를 대체하는 것으로 이루어지는 의학적 치료이다. 주로 효소는 재조합 단백질로서 생성되고 환자에게 투여된다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 발현 벡터, 바이러스성 벡터 입자 또는 제약학적 조성물은 점액다당질증의, 더욱 바람직하게는 점액다당질증 제 IIIA형 또는 산필립포 증후군의, 바람직하게는 유전자 요법을 통한 치료를 위해 바람직하게 사용된다. 점액성 다당류증 유형 III 증후군 내의 아류형 A는 특히 본 발명의 치료에 대해 차도를 보일 수 있다.
다섯번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터의 생성을 위한 방법이 청구된다. 방법은 다음의 단계를 포함한다:
i) 제1 AAV 말단 반복 및 제2 AAV 말단 반복 사이에 끼어들어간 서열번호: 1, 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 CAG 또는 hAAT 프로모터를 포함하는 제1 벡터; AAV rep 유전자 및 AAV cap 유전자를 포함하는 제2 벡터; 및 아데노바이러스 보조 기능을 포함하는 제3 벡터를 제공하는 단계;
ii) 단계 i)의 벡터로 컴피턴트 세포(competent cell)를 공동-형질감염시키는 단계;
iii) 단계 ii)의 형질감염된 세포를 배양하는 단계; 및
iv) 단계 iii)의 배양으로부터 발현 벡터를 정제하는 단계.
바람직한 실시양태에서, 제1 벡터의 AAV 제 1 및 제 2 말단 반복은 AAV 혈청형 2로부터 유래한 ITR이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제2 벡터의 AAV rep 유전자는 AAV 혈청형 2로부터 유래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 제2 벡터의 AAV cap 유전자는 AAV 혈청형 1, 2, 5, 7, 8 또는 9로부터 유래한다. 더욱 바람직하게는, 제2 벡터의 AAV cap 유전자는 AAV 혈청형 9로부터 유래한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 컴피턴트 세포는 HEK293 세포이다.
바이러스성 벡터는 지나친 부작용 없이, 또는 의학적으로 허용되는 생리학적 효과와 함께 치료적 혜택을 제공하기 위해 세포를 형질감염시키는데 및 유전자 전달 및 발현의 충분한 수준을 제공하는데 충분한 유효량으로 투여되며, 이는 의학 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다.
여섯번째 측면에서 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 제약학적 조성물을 제조하기 위한 방법이 청구된다. 이 방법은 본 발명의 제약학적 조성물을 수득하기 위해 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 바이러스성 벡터 입자 또는 발현 벡터 중 어느 하나를 투여를 촉진시키기 위해 제약학적으로 허용되는 비히클 또는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 담체는 보존제(preservative)를 가진 또는 보존제가 없는, 물, 또는 완충 식염수이다. 제약학적 조성물은 투여 시간에 또는 용해시 재-부유를 위해 동결건조될 수 있다.
일곱번째 측면의 바람직한 실시양태에서, 점액성 다당류증 유형 IIIA 를 앓는 피험체를 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 바이러스성 벡터 입자, 발현 벡터 또는 제약학적 조성물로 치료하기 위한 방법이 청구된다. 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 벡터, 발현 벡터 또는 제약학적 조성물의 투여를 위한 일정 및 복용량이 해당 분야에 알려진 복용량 프로토콜에 따라서 결정될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 유전자 구조물, 바이러스성 벡터 입자, 발현 벡터 또는 제약학적 조성물은 1회 투여된다.
한가지 추가적인 실시양태에서, MPS의 유전자 요법 치료를 위한 제약학적 조성물은 서열번호: 1과 90% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터의 비경구 투여로 이루어진다.
또 다른 추가적인 실시양태에서, CAG 프로모터 및 서열번호: 1과 95% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스성 벡터는 근육내 주사로 리소좀 축적병 (LSD)의 치료를 위한 유전자 요법을 위해 사용된다.
또 다른 추가적인 실시양태에서, CAG 프로모터 및 서열번호: 1과 87% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 혈청형 1을 갖는 AAV벡터는 MPS를 치료하는 위한 약으로서 사용되고 정맥 내로 투여된다.
또 다른 추가적인 실시양태에서, 서열번호: 1과 98% 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열 및 편재 프로모터(ubiquitous promote)을 포함하는 제약학적 조성물은 질병을 치료하기 위해 비경구로 투여된다.
일반적인 용어에서 본 발명이 설명되었으므로, 설명으로서 존재하고 본 발명에 한정되지 않는 것으로 의도되는 다음 실시예에 대해 참조로서 더욱 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
일반적인 절차
1. 재조합 AAV 벡터
본 명세서에서 설명된 AAV 벡터는 3회 형질감염으로 만들어졌다. 벡터를 만들기 위해 요구된 물질은 다음과 같다: HEK293 세포 (E1 유전자를 발현), 아데노바이러스 기능을 제공하는 보조 플라스미드, 혈청형 2로부터의 AAV rep 유전자를 제공하는 보조 플라스미드 및 바람직한 혈청형 (즉, AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9)로부터의 cap 유전자 및, 최종적으로 ITR 및 관심 구성체를 갖는 백본(backbone) 플라스미드.
설파미다아제-발현 AAV 벡터를 발생시키기 위해, 쥣과 설파미다아제의 cDNA가 편재 하이브리드(hybrid) CAG 프로모터 또는 간-특이적 hAAT 프로모터의 조절 하에 AAV 백본 플라스미드 내로 클로닝(cloning)되었다.
벡터 (바이러스성 벡터 입자)는 개질을 겪은 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 보조 바이러스-유리 형질감염(helper virus-free transfection)에 의해 발생되었다. Matsushita T, et al ., Gene Ther. 1998; 5:938-945 및 Wright J, et al ., Mol. Ther. 2005; 12:171-178을 참고한다. 세포는 10% FBS (소태아혈청(Foetal Bovine Serum))로 보충된 DMEM (Dulbeccos's Modified Eagle Medium)내 회전 병(roller bottle (RB)) (Corning, Corning, NY, US)에서 70% 합류(confluence)될 때까지 배양되었고 그리고 이후 1) 바이러스성 ITR (상기 설명된)과 측면에서 접하는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드; 2) AAV rep 2 및 상응 cap (cap 1 및 cap 9) 유전자를 포함하는 보조 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 보조 기능을 포함하는 플라스미드로 공동-형질감염되었다. 벡터는 앞서 설명된 바와 같은 표준 프로토콜 또는 최적화 프로토콜 중 하나를 이용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제되었다. Ayuso E, et al ., Gene Ther. 2010; 17:503-510을 참고한다. 벡터는 PBS에 대해 투석되었고, qPCR (정량적 중합효소 연쇄 반응(quantitative Polymerase Chain Reaction))에 의해 여과되었고, 적정되었고 그리고 사용할 때까지 -80℃에서 저장되었다.
a. pAAV - CAG - mu - SFMD - WPRE 의 구성
쥣과 설파미다아제 cDNA가 개시 물질 (클론 ID: D330015N16; Riken, Saitama, JP)로서 활용되었다. 플라스미드 pFLCI-Sgsh 내부로 cDNA가 제공되었다. 양쪽 말단에서 Mlul 제한 부위가 포함된 프라이머를 사용하여 고-충실 PCR(High-fidelity PCR)을 수행하여 설파미다아제 암호화 영역을 증폭시켰다. 각각의 센스 및 안티센스 프라이머의 서열은 다음과 같다: 서열번호: 5 (Fw) CTTACTTATGACGCGTATGCACTGCCCGGGACTG 및 서열번호: 6 (Rv) TATCCTATCGACGCGTTCAGAGTTCATTGTGAAGCGGTC.
백본 플라스미드 pAAV-CAG-WPRE를 미리 생성되었으며 AAV2 게놈의 양쪽 ITR, CAG 프로모터, WPRE 요소 및 토끼 β-글로빈의 폴리A 신호를 함유하였다. CAG 프로모터는 CMV 초기/중간 인핸서 및 닭 β-액틴 프로모터로 구성된 하이브리드 프로모터이다. 이 프로모터는 편재하여 강한 발현을 유도할 수 있다. 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사-후 조절 요소 (WPRE)는 여러 가지 유형의 플라스미드 또는 바이러스 유전자 벡터의 cis-활성 조절 모듈로서 널리 사용되는 헤파드나바이러스(hepadnavirus) 서열이다. 유전자 전달 카세트의 3' 비번역 영역에 위치될 때, WPRE는 핵 및 세포질 mRNA 둘 모두의 수준을 증가시킴으로써 도입유전자의 생성을 향상시킨다. Zanta-Boussif M, et al., Gene Ther. 2009; 16:605-619를 참고한다.
PCR-증폭 설파미다아제 코딩 영역을 AAV 백본 플라스미드 pAAV-CAG-WPRE의 Mlul 제한 부위 내로 클로닝하였으며, 그 결과 생성된 플라스미드는 pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE로 명명되었다.
b. pAAV - CAG - mu - SFMD 의 구성.
pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE 플라스미드내 WPRE 요소는 2개의 EcoRI 제한 부위와 측면에서 접한다. pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE 플라스미드를 EcoRI로 분해한 후, 재결찰시켜 WPRE 서열을 제거하여 pAAV-CAG-mu-SFMD 플라스미드 (수탁 번호 DSM 24818)를 생성하였다.
c. pAAV - CAG - co - hu - SFMD 의 구성
pAAV-CAG-mu-SFMD 플라스미드를 Mlul 및 EcoRI로 분해하여 쥣과 설파미다아제 암호화 영역을 제거하였다. 그 후, 코돈 최적화 인간 설파미다아제 (co-hu-SFMD)의 cDNA를 동일한 제한 부위에서 분해 및 클로닝하여 pAAV-CAG-co-hu-SFMD 플라스미드 (수탁 번호 DSM 24817)를 생성하였다.
d. AAV9-CAG-co-hu-SFMD의 구성
AAV9-CAG-co-hu-SFMD 벡터는 pAAV-CAG-co-hu-SFMD 플라스미드, 아데노바이러스 보조 기능을 인코딩(encoding)하는 플라스미드 및 AAV2 rep 과 AAV9 cap 유전자를 인코딩하는 플라스미드로 293HEK 세포를 공동-형질감염시킴으로써 얻어졌다.
e. pGG2 - hAAT - mu - SFMD 의 구성
pAAV-CAG-mu-SFMD-WPRE 플라스미드로부터 Mlul로 분해함으로써 쥣과 설파미다아제 암호화 영역을 절단하였다. 이후 AAV 백본 플라스미드 pGG2-hAAT내 Mlul 부위 내로 이 영역을 클로닝하여 pGG2-hAAT-mu-SFMD 플라스미드 (수탁 번호 DSM 24819)를 수득하였다.
f. pGG2 - hAAT - co - hu - SFMD 의 구성
pAAV-CAG-co-hu-SFMD 플라스미드 (수탁 번호 DSM 24817)로부터 Mlul-EcoRI로 분해함으로써 코돈 최적화 인간 설파미다아제 암호화 영역을 절단하였다. pGG2-hAAT-mu-SFMD 플라스미드 (수탁 번호 DSM 24819)를 Mlul로 분해하여 mu-SFMD 유전자를 제거한 다음, 평활-말단 결찰에 의해 이 부위에서 코돈 최적화 인간 설파미다아제 암호화 영역을 클로닝하였다. 그 결과 생성된 플라스미드는 pGG2-hAAT-co-hu-SFMD로서 명명되었다. 서열번호: 11을 참고한다.
pGG2-hAAT-co-hu-SFMD 플라스미드는 AAV2-ITR인 hAAT 프로모터 및 SV40-유래된 폴리-아데닐화 신호를 둘다 함유하였다.
g. AAV9-hAAT-co-hu-SFMD 및 AAV8-hAAT-co-hu-SFMD의 구성.
벡터는 개질을 겪은 3개의 플라스미드를 사용하여 HEK293 세포의 보조 바이러스-유리 형질감염에 의해 발생되었다. Matsushita, 1998, supra 및 Wright, 2005, supra를 참고한다. 세포는 10% FBS로 보충된 DMEM내 회전 병 (RB) (Corning, Corning, NY, US)에서 70% 합류될 때까지 배양되었고 그리고 이후 1) 바이러스성 ITR (pGG2-hAAT-co-hu-SFMD)과 측면에서 접하는 발현 카세트를 포함하는 플라스미드; 2) AAV rep 2 및 상응 cap 유전자 (cap 8 또는 9)를 포함하는 보조 플라스미드; 및 3) 아데노바이러스 보조 기능을 포함하는 플라스미드로 공동-형질감염되었다. 벡터는 앞서 설명된 바와 같은 표준 프로토콜 또는 최적화 프로토콜 중 하나를 이용하여 2개의 연속적인 세슘 클로라이드 구배에 의해 정제되었다. Ayuso, 2010, supra를 참고한다. 벡터는 PBS에 대해 투석되었고, qPCR에 의해 여과되었고, 적정되었고 그리고 사용할 때까지 -80℃에서 저장되었다.
pGG2-hAAT-mu-SFMD 플라스미드는 AAV2-ITR인 hAAT 프로모터 및 SV40-유래된 폴리-아데닐화 신호를 둘다 함유하였다. hAAT 프로모터는 아폴리포단백질 E및 인간 α-항-트립신 프로모터로부터의 간세포 조절 영역 (HCR) 인핸서의 4개의 직렬 반복으로 구성된 하이브리드 프로모터이다. 이의 발현은 간세포에 제한된다. Mingozzi F, et al ., J. Clin. Invest. 2003; 111:1347-1356을 참고한다.
본 발명의 벡터는 해당 업계에서 잘 알려진 분자 생물학 기술에 따라서 만들어졌다. Brown T, "Gene Cloning" (Chapman & Hall, London, GB, 1995); Watson R, et al ., "Recombinant DNA", 2nd Ed. (Scientific American Books, New York, NY, US, 1992); Alberts B, et al ., "Molecular Biology of the Cell" (Garland Publishing Inc., New York, NY, US, 2008); Innis M, et al ., Eds., "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications" (Academic Press Inc., San Diego, CA, US, 1990); Erlich H, Ed., "PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification" (Stockton Press, New York, NY, US, 1989); Sambrook J, et al ., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, US, 1989); Bishop T, et al ., "Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, GB, 1987); Reznikoff W, Ed., "Maximizing Gene Expression" (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, US, 1987); Davis L, et al ., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier Science Publishing Co., New York, NY, US, 1986), Schleef M, Ed., "Plasmid for Therapy and Vaccination" (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, DE, 2001)을 참고한다.
2. 동물
유사유전자 C57BI/6 설파미다아제-결핍 쥐 콜로니 (MPSIIIA)가 사용되었다. Crawley A, et al ., Brain Res. 2006; 1 104:1-17을 참고한다. MPSIIIA를 앓는 쥐 및 건강한 대조군 쥐는 헤테로성 파운더(founder)로부터 교배되었다. 앞서 설명된 바와 같이, 유전자형은 돌연변이를 포함하는 서열을 증폭시키는 말단-클립된(tail-clipped) 샘플로부터의 게놈 DNA에 대한 PCR 분석에 의해, 그리고 이어지는 MspA1I 제한 효소를 이용한 상기 샘플의 분해에 의해 결정되었다. Bhattacharyya R, et al ., Glycobiology 2001; 11:99-103을 참고한다. 쥐에게 표준 식단 (Panlab, Barcelona, ES)이 자유롭게(ad libitum) 제공되었고 12시간의 명암 주기 하에 유지되었다 (9:00 A.M.에 조명을 킨다).
3. 벡터 투여 및 샘플 수집
AAV 벡터의 정맥내 송달을 위해, 적절한 AAV 벡터의 1012 벡터 게놈 전체 용량이 꼬리 정맥을 통하여 2개월령 MPSIIIA 동물 내로 주사되었다. 근육내 주사를 위해, 2-개월령 MPSIIIA 동물이 케타민 (100 mg/kg) 및 크실라진(10 mg/kg)의 혼합물로 마취되었고, 그리고 적절한 AAV 벡터의 1012 벡터 게놈 전체 용량이 뒷다리의 6개 근육(양쪽 다리의 사두근(quadriceps), 비복근(gastrocnemius) 및 전경골근(tibialis anterior)) 내로 주사되었다. 10개월령 때, 쥐가 마취되었고, 이후 조직으로부터 혈액을 완전히 맑게 하기 위해 10ml의 PBS로 경심관류시켰다. 뇌 전체 및 다수의 체조직 (간, 비장, 췌장, 신장, 폐, 심장, 골격근 및 고환을 포함하여)이 수집되었고 그리고 액체 질소에서 냉동 및 -80℃에서 저장되거나 또는 차후 조직학적 분석을 위해 포르말린에 침지되었다.
4. RNA 분석
전체 RNA는 TriPure Isolation Reagent (Roche Diagnostics, Barcelona, ES)를 사용함으로써 골격근 및 간 샘플로부터 얻어졌고 노던 블롯(Northern blot)으로 분석되었다. 블롯은 Ready-to-Go DNA Labelling Beads (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US)를 이용한 랜덤 프라이밍(random priming)에 의해 32P-dCTP로 표지된, 쥣과 설파미다아제 프로브와 하이브리드화되었다.
5. 설파미다아제 활성도 및 글리코사미노글리칸 정량화
간, 골격근 및 뇌 샘플이 물에서 초음파 처리되었고 설파미다아제 활성도가 상기 설명된 바와 같이 4-메틸움벨리페론-유래된 형광발생 기질 (Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL)을 가진 상청액에서 분석되었다. Karpova E, et al., J. Inherit. Metab. Dis. 1996; 19:278-285를 참고한다. 설파미다아제 활성도 수준은 Bradford 단백질 분석 (Bio-Rad, Hercules, CA, US)을 이용하여 정량화하여, 단백질의 전체량에 대하여 정규화되었다.
글리코사미노글리칸 (GAG) 정량화를 위해, 조직 샘플이 칭량되었고 이후 프로테이나아제 K(proteinase K)로 분해되었고 그리고 추출물은 원심분리 및 여과에 의해 정화되었다. 조직 추출물 및 소변내 GAG 수준은 표준으로서 콘드로이딘 4-황산(chondroitin 4-sulfate)을 갖는 Blyscan 황산화 글리코사미노글리칸 키트 (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB)를 사용하여 측정되었다. GAG 수준은 특정 키트 (Horiba ABX, Irvine, CA, US)로 측정하여, 조직에서는 습윤 조직 중량에 대해, 소변에서는 크레아틴 농도에 대하여 정규화되었다.
6. 조직학적 분석
조직은 포르말린에서 12-24시간 동안 고정되었고, 파라핀 내에 매입되었고 및 절단되었고 그 다음 열-유발 에피토프 복구 (시트레이트 완충액, pH 6)되었다. LAMP1의 면역조직화학적 검출을 위해, 파라핀 절편은 1:100으로 희석된 래트 항-LAMP1 항체 (1D4B; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, US)와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었고 그리고 차후에 1:300으로 비오틴화 토끼 항-래트 항체 (Dako, Glostrup, DK)와 함께 배양되었다. LAMP1 신호는 1:100으로 ABC-퍼옥시다아제 염색 키트 (Thermo Scientific, Waltham, MA, US)를 사용하여 절편을 배양함으로써 증폭되었고 발색체(chromogen)로서 3,3-다이아미노벤지딘 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)을 사용하여 시각화되었다. 명시 야상 (Brightfield image)은 광학현미경(Eclipse E800; Nikon, Tokyo, JP)으로 얻어졌다. 파브알부민(parvalbumin) 및 칼빈딘(calbindin) 면역염색을 위해, 파라핀 절편은 1:2000으로 희석된 토끼-항-칼빈딘 D28k (Swant, Marly, CH)과 함께 또는 1:100으로 희석된 토끼 항-파브알부민 (Swant, Marly, CH)과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 그 다음에, 샘플은 비오틴화 염소 항-토끼 IgG (Vector Labs., Burlingame, CA, US)와 함께, 그리고 이후 스트레타비딘-알렉사(Alexa) 488 (1:100, Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, US)과 함께 배양되었고, 핵은 TOPRO-3으로 염색되었다. 이미지는 공초점 현미경으로 얻어졌다 (Leica Microsystems, Heidelberg, DE).
LAMP1 및 Mac2의 이중 면역염색을 위해, 절편은 1:100으로 토끼 항-LAMP1와 함께 4℃에서 하룻밤 동안 첫번째 배양되었고, 이후 1:300으로 비오틴화 토끼 항-래트 항체와 함께, 그 다음 스트레타비딘-알렉사 488 (1:300)과 함께 배양되었다. 그 다음에, 절편은 1:50으로 토끼 항-Mac2와 함께 배양되었고, 이후 1:300으로 비오틴화 염소 항-토끼 IgG와 함께 그 다음 스트레타비딘-알렉사 568 (1:300; Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, US)과 함께 배양되었다. 최종적으로, 핵산은 훽스트(Hoechst) (1:100; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)로 염색되었다.
7. 웨스턴 블롯 분석
소뇌의 절반이 단백질 용해 완충액에서 균질화되었다. 10 마이크로그램의 단백질은 10% (wt/vol) SDS-PAGE 상에서 진행되었고, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막으로 이동되었고 그리고 칼빈딘 (Swant, Marly, CH) 및 α-튜블린 (Abeam, Cambridge, MA, US)에 대하여 1차 항체로 4℃에서 하룻밤 동안 프로빙(probing) 되었다. 호스래디시 퍼록시다아제(horseradish peroxidase)-표지된 돼지 항-토끼 항체 (Dako, Glostrup, DK) 및 ECL 플러스 웨스턴 블롯팅(ECL Plus Western blotting) 검출 시약 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US)을 사용하여 검출이 수행되었다.
8. 투과 전자 현미경 분석
쥐는 과량의 이소플루오란 (Isofluo, Labs. Esteve, Barcelona, ES) 에 의해 희생되었고 그리고 1ml의 2.5% 글루타르알데하이드 및 2% 파라포름알데하이드로 하대정맥을 통하여 관류시켰다. 간 측엽의 및 소뇌 정상(culmen)의 작은 부분(대략 1mm3)이 절단되었고 동일한 고정액에서 4℃에서 2시간 동안 배양되었다. 차가운 카코딜레이트 완충액으로 세척 후, 표본이 1% 오스뮴 테트록사이드에서 포스트픽스(postfix)되었고, 수성 우라닐 아세테이트에서 염색되었고, 그리고 이후 단계별 에탄올 시리즈를 통해 탈수되었고 에폭시 수지에 매입되었다. 수지 블록으로부터의 초박 절편 (600-800Å)은 납 시트레이트를 사용하여 염색되었고 투과 전자 현미경 (H-7000; Hitachi, Tokyo, JP)으로 검사되었다.
9. 통계적 분석
모든 결과는 평균 ± SEM으로서 표현된다. 통계적 비교는 t-테스트 또는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA) 중 하나를 이용하여 이루어졌다. P < 0.05였다면 통계적 유의도가 고려되었다.
도면의 간단한 설명
도 1. AAV1-CAG-mu-SFMD-WPRE의 근육내 송달. (A) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 골격근내 설파미다아제 활성도. (B) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 혈청내 설파미다아제 활성도. (C) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 간내 글리코사미노글리칸 (GAG) 정량화. 값은 그룹 당 4 내지 8마리 쥐의 평균 ± SEM이다. ￥ P<0.05 대 대조군, #P<0.05 대 수컷, * P <0.05 대 비처리된 MPS. ND: 검출되지 않음.
도 2. AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE의 근육내 송달. (A) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 골격근내 설파미다아제 활성도. (B) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 혈청내 설파미다아제 활성도. (C) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 간내 글리코사미노글리칸 (GAG) 정량화. 값은 그룹 당 4 내지 8마리 쥐의 평균 ± SEM이다. ￥ P<0.05 대 대조군, #P<0.05 대 수컷, * P <0.05 대 비처리된 MPS. ND: 검출되지 않음.
도 3. AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE의 정맥내 송달. (A) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 간내 설파미다아제 활성도. (B) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 혈청내 설파미다아제 활성도. (C) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 간내 글리코사미노글리칸 (GAG) 정량화. 값은 그룹 당 4 내지 8마리 쥐의 평균 ± SEM이다. ￥ P<0.05 대 대조군, #P<0.05 대 수컷, * P <0.05 대 비처리된 MPS. ND: 검출되지 않음.
도 4. AAV8-hAAT-mu-SFMD의 정맥내 송달. (A) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 간내 설파미다아제 활성도. (B) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 혈청내 설파미다아제 활성도. (C) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 간내 글리코사미노글리칸 (GAG) 정량화. 값은 그룹 당 4 내지 8마리 쥐의 평균 ± SEM이다. ￥ P<0.05 대 대조군, #P<0.05 대 수컷, * P <0.05 대 비처리된 MPS. ND: 검출되지 않음.
도 5. AAV8-hAAT-mu-SFMD의 정맥내 송달 후 MPSIIIA 쥐의 신경 병상의 개선. (A) 대조군, MPS 및 처리된 수컷의 뇌 (도표에서 도시된)의 상이한 부분에서 설파미다아제 활성도. (B) 뇌의 동일한 부분에서 글리코사미노글리칸 (GAG) 정량화. 값은 그룹 당 4 내지 8마리 쥐의 평균 ± SEM이다. ￥ P<0.05 대 대조군, * P <0.05 대 비처리된 MPS. ND: 검출되지 않음. (C) 소뇌에서 푸르키네 세포(Purkinje cell)의 투과 전자 현미경. 비-처리된 MPSIIIA 쥐의 푸르키네 뉴런의 세포체는 많은 거대 전자-밀도 봉입체(inclusion) (흰색 화살표)로 채워져 있었고, 반면에 iv-AAV8-hAAT 처리된 수컷에서는 더 적은 및 더 작은 봉입체가 발견되었다 (검은색 화살표).
도 6. 정맥내 AAV9-CAG-mu-SFMD. (A) 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 뇌 (도표에서 도시된)의 상이한 부분에서 설파미다아제 활성도. (B) 뇌의 동일한 부분에서 글리코사미노글리칸 (GAG) 정량화. (C) 로타로드 검사(Rotarod test)를 가속화함으로써 운동 기능의 평가. 값은 그룹 당 4 내지 8마리 쥐의 평균 ± SEM이다. ￥ P<0.05 대 대조군, * P <0.05 대 비처리된 MPS.
도 7. 아데노-연관 바이러스 혈청형 1, 2, 5, 7, 8 및 9 GFP 벡터의 조내 송달 후 뇌 형질도입. 적합한 벡터의 5 x 1010 벡터 게놈 용량이 2개월령 동물에게 조내 로 투여되었으며, 상기 동물은 2주 후 희생 및 분석되었다. 아데노-연관 바이러스 혈청형 9는 모든 분석된 부위에서 형질도입의 최대 효능을 증명하였다. 주사기(syringe)는 벡터 송달의 경로인, 대조(cisterna magna)를 지시한다. P: 뇌교(pons), Cb: 소뇌(cerebellum), OB: 후각 신경구(olfactory bulb), Ht: 시상하부(hypothalamus), Cx: 대뇌피질(cerebral cortex).
도 8. AAV9-CAG-mu-SFMD 벡터의 조내 송달. 대조군, MPS 및 처리된 쥐의 뇌 (도표에서 도시된)의 상이한 부분에서 글리코사미노글리칸 (GAG) 정량화. 값은 그룹 당 3마리 쥐의 평균 ± SEM이다. ￥ P<0.05 대 대조군, * P <0.05 대 비처리된 MPS.
도 9. AAV9-CAG-hu-co-SFMD의 정맥내 송달. 대조군 쥐, MPS 쥐 및 AAV9-CAG-mu-SFMD (비-최적화 유전자) 또는 AAV9-CAG-hu-co-SFMD (최적화 유전자) 중 하나로 처리된 쥐의 간내 설파미다아제 활성도.
도 10. 후두 피질의 뉴런 주변 신경교 세포(glial cell)에서 리소좀 병상의 감소. 후두 피질의 피층 뉴런 및 이들의 연관된 신경교 세포를 도시하는 투과 전자 현미경. MPSIIIA 리소좀 병상은 뉴런에서보다 뉴런 주변 신경교 세포에서 훨씬 더 분명하였다. WT 샘플 (상부 왼쪽 패널)에서가 아닌, MPSIIIA 비처리된 수컷 샘플 (흰색 화살표, 상부 우측 패널)에서의 신경교 세포에서 거대 전자-투명 공포(electro-lucent vacuole)의 존재가 나타난다. 리소좀 구획의 이 확장은 iv-AAV8hAAT-처리된 쥐에서 크게 감소하였고, 이들 샘플에서 뉴런 주변 신경교 세포의 대부분이 WT의 뉴런주변 신경교 세포 (하부 패널)와 유사한 측면으로 존재하였다. (1) 뉴런, (2) 뉴런 주변 신경교 세포.
도 11. 정맥내 AAV8-hAAT-SFMD 처리된 수컷 및 암컷에서의 생존율. (A) WT, MPSIIIA 및 정맥내 AAV8-hAAT-SFMD 처리된 수컷에서의 카플란 마이어(Kaplan-Meier) 생존율 분석. AAV-매개 간-지향성 유전자 요법으로의 처리는 MPSIIIA 동물의 수명을 상당히 연장시켰다 (p<0.001). (B) WT, MPSIIIA 및 iv-AAV8-hAAT-SFMD 처리된 암컷에서의 카플란 마이어 생존율 분석. AAV-매개 간-지향성 유전자 요법으로의 처리는 MPSIIIA 암컷의 수명을 연장시키지 않았다 (p= 0.467).
도 12. 조내 및 정맥내 AAV9-CAG-mu-SFMD 처리된 수컷 및 암컷에서의 생존율. WT, MPSIIIA 및 AAV9-처리된 수컷 (A) 및 암컷 (B)에서의 카플란-마이어 생존율 분석. AAV-매개 유전자 요법으로 조내 및 정맥내 처리 둘 모두가 MPSIIIA 동물의 수명을 연장시켰다.
도 13. 개에게 AAV9 벡터의 조내 투여는 광범위한 CNS 부위 및 간의 형질도입을 야기한다. 대조(cisterna magna)를 통해 AAV9-GFP가 주사된 개의 CNS 및 간 절편 (section)에서 GFP의 면역조직화학적 검출. 이미지는 다음과 일치한다: (a) 척수(spinal cord), (b) 연수의 올리브체(olivary body of the medulla oblongata), (c) 뇌교의 솔기핵(raphe nuclei of the pons), (d) 시상하부 핵(hypothalamic nuclei) (e) 후뇌(rhinencephalon) (f) 후두 피질(occipital cortex), (h) 전두 피질(frontal cortex), (i) 소뇌(cerebellum), (j) 해마의 치상회(dentate gyrus of the hippocampus). 스케일 바(Scale bar): (a)에 대해 1mm, (b)-(h)에 대해 500μm, (i)-(j)에 대해 100μm.
도 14. 건강한 비글견(Beagle dog)에서의 AAV9-GFP 벡터의 조내 송달 후 간 형질도입. 헤마톡실린으로 대비염색된 간 절편에서 GFP의 면역조직화학적 검출. 개 1 (A) 및 개 2 (B)의 대표 이미지가 나타난다. 기본 배율 200X.
도 15. 정맥내 AAV9-co-hu-SFMD 주사된 동물에서의 혈청 설파미다아제 활성도 및 간 GAG 함량. (A) 형광발생 기질(fluorogenic substrate)로 측정된 혈청내 설파미다아제 활성도. (B) 벡터 투여 후 2개월에 간내 GAG 저장.
실시예
실시예 1:
AAV1 - CAG - mu - SFMD - WPRE 의 근육내 송달
AAV1-CAG-mu-SFMD-WPRE 벡터의 1012 벡터 게놈 전체 용량을 2개월령 수컷 및 암컷 MPSIIIA 쥐의 뒷다리의 6개 근육(양쪽 다리의 사두근, 비복근 및 전경골근) 내로 주사하였다.
투여 후 8개월에, 주사된 근육은 고수준의 벡터-유래된 설파미다아제 발현 및 활성도를 보여주었지만, 혈청에서 매우 저수준의 설파미다아제 활성도가 관찰되었으며 (6-7%의 대조군 쥐), 이는 골격근으로부터 낮은 분비 효율성을 제시한다. 도 1A 및 1B를 참고한다. 추가로, 매우 낮은 하지만 유의한 벡터-유래된 설파미다아제 발현이 이들 쥐의 간에서 관찰되었고, 이는 주사시, 그 벡터가 골격근에서부터 순환 내로 누출되고 그리고 간으로 형질도입된다는 것을 명시한다. 저수준의 순환 설파미다아제 활성도가 성취된다 하더라도, 간내 GAG 축적의 교정 및 일부 다른 체조직 (비장, 심장, 췌장)에서의 유의한 감소를 보였지만, 다른 체조직 (신장, 폐)에서는 보이지 않았다. 도 1C를 참고한다. GAG 저장의 감소는 뇌에서 성취되지 않았다.
실시예 2:
AAV8 - CAG - mu - SFMD - WPRE 의 근육내 송달
AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE 벡터의 1012 벡터 게놈 전체 용량을 2개월령 수컷 및 암컷 MPSIIIA 쥐의 뒷다리의 6개 근육(양쪽 다리의 사두근, 비복근 및 전경골근) 내로 주사하였다.
투여 후 8개월에, 주사된 근육은 건강한 대조군 동물의 설파미다아제 활성도 수준과 유사한 설파미다아제 활성도 수준을 보여주었다. 도 2A를 참고한다. 혈청에서 저수준의 설파미다아제 활성도가 관찰되었다 (10-15%의 대조군 쥐). 도 2B를 참고한다. 또한 벡터-유래된 설파미다아제 발현 및 활성도가 간에서 보인 이후로, 간으로의 벡터 누출이 심지어, 근육내 AAV1로 처리된 쥐에서보다 더 높은 수준으로 관찰되었다. 실시예 1을 참고한다. GAG 축적의 교정이 간 및 비장에서 보였고, 그리고 다른 체조직 (심장, 췌장, 방광)에서 더 큰 감소가 관찰되었지만, 신장 및 폐는 대체로 교정되지 않은 채 남아있었다. 도 2C를 참고한다. GAG 저장의 감소는 뇌에서 성취되지 않았다.
실시예 3:
AAV8 - CAG - mu - SFMD - WPRE 의 정맥내 송달
AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE 벡터의 1012 벡터 게놈 전체 용량을 2개월령 MPSIIIA 쥐 내로 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다.
투여 후 8개월에, 처리된 수컷은 대조군 쥐의 간내 설파미다아제 활성도와 유사한 수준으로 간내 설파미다아제 활성도를 보여주었지만, 암컷에서는 4배 낮은 수준이었다. 도 3A를 참고한다. 지속적으로, 순환 설파미다아제 활성도는 수컷 (대조군의 수준과 유사한 수준)에서는 높았고 암컷 (25%의 대조군 쥐)에서는 낮았다. 도 3B를 참고한다. 이들 고수준의 순환 설파미다아제는 간, 심장, 비장, 췌장 및 방광내 GAG 축적을 교정할 수 있었고, 폐에서는 이를 유의적으로 감소시키지만 신장에서는 그렇지 않았다. 간 GAG 정량화에 대하여 도 3C를 참고한다. GAG 저장의 감소는 뇌에서 관찰되지 않았다.
실시예 4:
AAV8 - hAAT - mu - SFMD 의 정맥내 송달
AAV8-hAAT-mu-SFMD 벡터의 1012 벡터 게놈 전체 용량을 2개월령 MPSIIIA 쥐 내로 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다.
투여 후 8개월에, 처리된 수컷은 대조군 동물에서보다 500% 더 높은 간내 설파미다아제 활성도를 보여주었다. 암컷 피험체에서는, 간 설파미다아제 수준이 대조군 피험체와 동일한 수준에 도달하였다. 도 4A를 참고한다. 순환 설파미다아제 활성도는 암컷에서보다 수컷에서 지속적으로 더 높았다 (수컷에서 500% 대 암컷에서 160%). 도 4B를 참고한다. 이들 순환 설파미다아제의 상기 생리학적 수준은 신장을 포함한 모든 체기관내 GAG 축적을 교정할 수 있었다. 간 GAG 정량화에 대하여 도 4C를 참고한다.
처리된 수컷은 저수준의 설파미다아제 활성도를 나타내었고, 그리고 뇌내 GAG 축적을 감소시켰다. 도 5A 및 B를 참고한다. 처리된 수컷의 소뇌의 푸르키네 세포는 전자 현미경으로 검사될 때 더 낮은 전자-밀도 봉입체를 보여주었다. 도 5C를 참고한다. AAV8-hAAT-mu-SFMD 벡터 ("iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD ")로의 정맥내 처리로 체세포 병상의 교정을 성취하였지만 단지 MPSIIIA 쥐의 신경퇴화 특징만을 개선하였다.
피질의 초미형태(ultrastructure)를 투과 전자 현미경으로 분석하였다. MPSIIIA 처리된 및 비처리된 피험체의 후두 피질 뉴런의 초미형태에서 구별할 수 있는 차이가 발견되지 않았다. 처리된 동물에서는 사실상 부재하는, 리소좀 구획의 분명한 확장이 MPSIIIA 비처리된 피험체의 뉴런 주변 신경교 세포에서 관찰되었다. 도 10을 참고한다. 이들 결과는 지속적인 고순환 설파미다아제 활성도가 MPSIIIA 피험체에서 신경퇴화를 예방한다는 것을 제시한다.
17개월령까지, 모든 비처리된 MPSIIIA 수컷은 죽었으며, 반면에, 100%의 iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD 처리된 수컷은 여전히 살아있었다 (중앙값 생존율 = MPSIIIA 비처리된 및 처리된 수컷에 대하여 각각 14.2 ± 0.5 대 18.8 ± 0.9 개월, p= 0.001). 이 향상은 처리된 및 비처리된 피험체 둘 모두에서 유사한 생존율을 보인, 암컷 그룹에서는 명백하지 않았다 (중앙값 생존율 = MPSIIIA 비처리된 및 처리된 암컷에 대하여, 각각 13.1 ± 0.5 대 13.9 ± 1.2 개월, p= 0.467). 이 결과는 혈청 및 뇌에서 측정된 저수준의 설파미다아제 활성도 및 암컷 동물에서 관찰된 낮은 정도의 GAG 감소와 일치한다. 도 11을 참고한다.
iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD 처리된 MPSIIIA의 더 큰 생존율은 간-지향성 유전자 전달을 통해 얻은 지속적인 상기 생리학적 수준의 순환 설파미다아제의 치료학적 잠재성을 추가적으로 증명하였다. iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD의 처리는 MPSIIIA 수컷 피험체의 수명을 연장시켰다. 도 11을 참고한다.
실시예 5:
AAV9 - CAG - mu - SFMD 의 정맥내 송달
AAV9-CAG-mu-SFMD 벡터의 1012 벡터 게놈 전체 용량을 2개월령 MPSIIIA 쥐 내로 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다.
처리된 수컷 및 암컷 둘 다 고수준의 순환 설파미다아제 (수컷에서 500%의 대조군 수준 및 암컷에서 150%의 대조군 수준)를 나타내었으며, 이는 두 성별에서 모든 체조직을 유효하게 교정하였다. 추가로, AAV 혈청형 9의 뇌 형질도입의 고효율을 고려해볼 때, 유의한 설파미다아제 활성도가 두 성별의 뇌에서 관찰되었으며, 이는 뇌의 모든 부위에서 GAG 저장을 유효하게 교정하였다. 도 6A및 6B를 참고한다. MPSIIIA의 특징인, 신경세포염증 (성상교세포증 및 미세아교세포증)을 AAV9-처리된 쥐에서 완전하게 정규화되었다. 추가로, AAV9-처리된 쥐는 비처리된 쥐보다 로타로드 검사에서 더 나은 수행을 하였다. 도 6C를 참고한다.
AAV9-CAG-mu-SFMD 벡터로 정맥내 처리 ("iv-AAV9-CAG-mu-SFMD")는 MPSIIIA 동물의 수명을 연장시켰다. 도 12를 참고한다. 17개월령까지, 모든 비처리된 MPSIIIA 수컷은 죽었으며, 반면에, 100%의 iv-AAV9-CAG-mu-SFMD 처리된 수컷은 20개월령 때도 여전히 살아있었다 (MPSIIIA 처리된 대 비처리된 수컷에 대하여, 각각 p< 0.001 및 p= 0.037). 도 12를 참고한다. 암컷 집단은 유사함을 보였지만 덜 인상적인 향상을 보였다 (MPSIIIA 처리된 대 비처리된 암컷에 대하여, 각각 p= 0.063 및 p= 0.057). 이 결과는 iv-AAV9-CAG-mu-SFMD 처리 후 암컷의 혈청에서 측정된 저수준의 설파미다아제 활성도와 일치한다.
실시예 6:
AAV9 - CAG - mu - SFMD 의 조내 송달
AAV9-CAG-mu-SFMD 벡터의 5x1010 벡터 게놈 전체 용량을 5μl의 전체 부피로 2개월령 마취된 MPSIIIA 동물의 대조(cisterna magna) 내로 주사하였다.
투여 후 3개월에, GAG 축적의 완전한 교정이 처리된 동물의 뇌 전반에 걸쳐 성취되었다. 도 8을 참고한다. 또한 벡터-유래된 설파미다아제 발현이 처리된 동물의 간에서 발견되었고, 이는 조내 송달 후 일부 벡터가 순환에 이르고 간에 흡수된다는 것을 제시하였다. 이 결과와 일치하여, 또한 GAG 축적은 간에서 정규화되었다.
AAV9-CAG-mu-SFMD 벡터의 조내 송달 ("ic-AAV9-CAG-mu-SFMD")은 MPSIIIA 동물의 수명을 연장시켰다. 도 12를 참고한다. 17개월령까지, 모든 비처리된 MPSIIIA 수컷은 죽었으며, 반면에, 100%의 ic-AAV9-CAG-mu-SFMD 처리된 수컷은 20개월령 때도 여전히 살아있었다 (MPSIIIA 처리된 대 비처리된 수컷에 대하여, 각각 p< 0.001 및 p= 0.037). 도 12를 참고한다. 암컷 집단은 유사함을 보였지만 덜 인상적인 향상을 보였다 (MPSIIIA 처리된 대 비처리된 암컷에 대하여, 각각 p= 0.063 및 p= 0.057). 이 결과는 ic-AAV9-CAG-mu-SFMD 처리 후 암컷의 혈청에서 측정된 저수준의 설파미다아제 활성도와 일치한다.
실시예 7:
AAV9 - CAG - co - hu - SFMD (코돈 최적화 인간 설파미다아제 )의 정맥내 송달
벡터 투여 용량을 감소시키기 위해 인간 설파미다아제의 코돈 사용을 최적화하였다. 이 접근법의 목적은 설파미다아제 mRNA를 안정화시키고 이의 번역을 증가시키고, 따라서 동일한 벡터 용량으로부터 설파미다아제의 더 높은 생성을 장려하기 위함이었다.
AAV9-CAG-hu-co-SFMD 벡터의 1012 바이러스성 게놈 (vg)을 2개월령 MPSIIIA 쥐에게 꼬리 정맥을 통하여 정맥 내로 투여하였다. 비-최적화 유전자와 비교하여 간내 설파미다아제 수준에서 최소 3배 증가를 얻었다. 도 9를 참고한다.
실시예 8:
AAV9 - hAAT - co - hu - SFMD 의 정맥내 송달
실시예 7에서 설명된 것과 동일한 절차에 따라서, 꼬리 정맥 내로 정맥내 투여함으로써 2개월령 MPSIIIA 쥐를 AAV9-hAAT-co-hu-SFMD 벡터의 1012 vg로 처리한다. 설파미다아제 수준을 실시예 7에 대해 동일한 방식으로 측정한다. 이 결과는 비 최적화 유전자에 대하여 실질적인 증가를 나타낸다.
실시예 9:
AAV - CAG - GFP - WPRE 의 상이한 혈청의 조내 송달
뇌척수액 내로 투여될 때 상이한 AAV 혈청형의 뇌내 향성을 평가하기 위해, GFP 리포터(reporter) 유전자 (CAG-GFP-WPRE 구성체)를 포함하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 및 AAV9 벡터의 5x1010 벡터 게놈을 MPSIIIA 쥐에게 조내로 투여하였다.
세포의 유의한 형질도입이 뇌교에서 모든 혈청형에 의해 성취되었고, 최대 및 최저 효능은 각각 AAV9 및 AAV1에 의해 성취되었다. 소뇌에서, 리포터 신호는 푸르키네 뉴런에서 형태학상으로는 태상 섬유로 식별되고, 특히 AAV1 및 AAV9를 가지나, 또한 AAV8을 제외한 다른 혈청형도 갖는 엑손에 주로 위치한다. 멀리있는 뇌 영역내 혈청형 중에서 유전자 전달 효능의 더 큰 차이가 관찰되었다. AAV9-주사된 그룹에서 대뇌 피질, 후각 신경구 및 해마 내로 많은 세포가, AAV7 그룹에서는 그보다 적게 형질도입되었던 반면, 이들 부위에서 AAV1, AAV2, AAV5 또는 AAV8 혈청형으로는 GFP-양성 세포체가 관찰되지 않았다. 시상하부에서는, AAV9 혈청형을 뉴런에 유효하게 형질도입하였고, AAV1 혈청형은 어느 정도 분산된 GFP+ 세포를 야기하였다. 산발적인 GFP-양성 액손이 모든 그룹의 뇌 전반에 걸쳐 관찰될 수 있는데, 이는 아마도 대조(cisterna magna) 근처에서 감염된 뉴런에서 뻗어나왔을 것이다. 상이한 혈청형 중에서 AAV9 벡터는 최대 형질도입 효능을 나타내었다. 도 7을 참고한다.
실시예 10:
임상적 용도를 위한 AAV9 - CAG - co - hu - SFMD 의 조내 송달의 확장성
AAV9 조내 송달의 잠재적 임상 적용에 대하여 첫번째 단계로서, 쥐에서 관찰된 형질도입의 패턴이 더욱 적절한 뇌 크기를 가진 동물에서 유지되는지 안되는지를 평가하였다. 이를 위해, 1.5x1012vg/kg의 AAV9-CAG-GFP-WPRE를 건강한 비글견의 대조(cisterna magna)에 송달하였다. 4마리 전체에 주사하였다; 두마리 동물 (개 제1 및 4)에서 CFS 형성 속도(1 ml/10 분)와 유사한 유동으로 바이러스성 벡터 용액을 주입하기 위해 펌프를 사용했고, 다른 두마리 (개 제2 및 3)에서 벡터를 몇 초 안에 주입하였다. 도 13은 개 1의 샘플에서 GFP의 면역학적 검출을 나타낸다. 강한 표지가 연수(medulla oblongata), 뇌교 및 시상하부와 같은 대조(cisterna magna)에 가까운 영역에서 관찰되었다. 도 13b, c 및 d를 참고한다. 소뇌에서는, 주사점에 가까움에도 불구하고, 단지 소수의 단리된 푸르기네 세포만 형질도입되었지만, 반면에 시상하부에서는 조(cisterna)에서 먼 영역에서 치상회(dentate gyrus)의 효과적인 형질도입이 발생하였다. 도 13i 및 j를 참고한다. CSF를 통해 바이러스의 분포는 후뇌 및 전두, 두정 및 후두 피질과 같이, 주사점에서 멀리 있는 부위의 형질도입을 허용하였으며, 여기서 더욱 피상적인 부위는 더 많은 형질도입을 나타내었다. 도 13e, h 및 f를 참고한다. 최종적으로, 벡터는 또한 척수에 도달하였고 GFP 신호가 신경절(ganglia) 부근으로부터 복부의 운동뉴런 및 성상세포에서 탐지되었다. 도 13a를 참고한다. 4마리의 모든 개에서 GFP 위치의 반정량적인 비교는 바이러스 용액의 주입 속도가 AAV9 벡터의 효능 또는 분포에 유의적으로 영향을 주지 않는다는 것을 제시하였다. 표 1을 참고한다.
최종적으로, AAV9의 조내 송달 후 쥐에서 이루어진 관찰과 유사하게, GFP가 비글견의 간에서 또한 검출되었고, 여기서 평균 3.7%의 간세포가 형질도입되었다. 도 14를 참고한다. 이들 결과는 조내 송달 후 AAV9 벡터의 전반적인 분포를 제시한다.
뇌 부위 개 1 개 2 개 3 개 4
전두 피질 +++ +++ ++ +++
두정 피질 ++++ +++ +++ +++
후두 피질 ++++ ++++ ++++ ++
해마 ++++ ++++ +++ +++
시상하부 ++++ N.D. ++++ +
소뇌 + ++ ++ N.D.
뇌간 +++ +++ +++ ++
연수 +++ ++++ +++ +++
척수 +++ ++ ++ N.D.
표.1 건강한 비글견에서 AAV9-GFP 벡터의 ic 송달 후 뇌 형질도입의 반-정량적 분석. 뇌 부위 각각의 여러 가지 사진이 3명의 독립적인 관찰자에 의해 카운트(count) 되었고 평균이 제시된다. 반-정량적 기준은 다음과 같다: (+) 10 미만의 GFP-양성 세포/1OX 현미경적 시야; (++) 10-30 GFP-양성 세포/1OX 현미경적 시야; (+++) 30-60 GFP-양성 세포/1OX 현미경적 시야 및 (++++) 60 이상의 GFP-양성 세포/1OX 현미경적 시야. N.D. 측정되지 않음.
실시예 11:
코돈-최적화 인간 설파미다아제 ( co - hu - SFMD )의 기능적 효능
인간 설파미다아제 cDNA 서열 (co-hu-SFMD)의 코돈 최적화 버전을 포함하는 발현 카세트를 설계하고 얻었다. 인간에서 SFMD 단백질 생성의 효능을 증가시키기 위해 종에 대해 가장 풍부한 tRNA를 활용함으로써 그리고 또한 이의 특정 번역 프로파일을 참작함으로써 코돈 최적화를 수행하였다. 인간과 쥐의 유사성 및 쥐 동물 모델의 예측력 때문에 실험적 목적을 위해 쥐를 활용하였다.
이 서열이 활성 설파미다아제의 생성을 야기한다는 것을 보장하기 위해, 수컷 MPSIIIA 쥐에게 co-hu-SFMD가 대조군의 편재 CAG 프로모터 하에 발현되는 1x1012vg의 AAV9 벡터를 정맥내 주사하였다. 이들 쥐의 혈청내 설파미다아제의 활성도는 건강한 야생형 동물의 활성도와 유사한 수준에 도달하였고 연구 기간 (2개월) 동안 유지되었다. 도 15a를 참고한다. AAV9-송달된 쥣과 도입유전자를 사용하여 관찰되었던 것과 유사하게, 이 지속적인 설파미다아제 활성도는 이들 동물의 간내 GAG 함량의 정규화를 야기하였다. 도 15b를 참고한다.
본 명세서에서 상기 언급된 모든 간행물은 이들의 전체에서 참조로서 본 명세서에 편입된다.
전술한 본 발명이 명확성 및 이해의 목적을 위해 상세히 설명되는 반면에, 형태 및 세부사항에서의 여러 가지 변화가 본 발명 및 첨부된 청구항의 진정한 범위에서 벗어남이 없이 이루어질 수 있다는 것으로 본 개시의 독해로부터 해당 업계의 숙련자에 의해 인식될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Laboratorios del Dr. Esteve, S.A. Universitat Aut?oma de Barcelona <120> Vectors and sequences for the treatment of diseases <130> PCT2212.2 <150> EP10382169 <151> 2010-06-10 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1515 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> codon-optimized sequence of human sulfamidase <400> 1 gccaccatga gctgccctgt gcccgcctgt tgtgccctgc tgctggtgct gggactgtgc 60 agagccagac cccggaacgc tctgctgctg ctggccgacg atggcggatt tgagagcggc 120 gcctacaaca acagcgccat tgccacccct catctggacg ccctggccag aagaagcctg 180 ctgttccgga acgccttcac cagcgtgtcc agctgcagcc ctagcagagc ttccctgctg 240 acaggcctgc cccagcatca gaatggcatg tacggcctgc accaggatgt gcatcacttc 300 aacagcttcg acaaagtgcg gagcctgcca ctgctcctgt cacaggctgg cgtgagaacc 360 ggcatcatcg gcaagaaaca cgtgggcccc gagacagtgt accccttcga cttcgcctac 420 accgaagaga acggcagcgt gctgcaggtc ggccggaaca tcacccggat caagctgctc 480 gtgcggaagt ttctccagac ccaggacgac cggcccttct tcctgtacgt ggccttccac 540 gaccctcaca gatgcggcca cagccagccc cagtacggca ccttctgcga gaagttcggc 600 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ctcccgacgg cgtgctggaa gagaagctgt ccccccagtg ccagccactg 1500 cacaacgagc tgtga 1515 <210> 2 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Cys Pro Val Pro Ala Cys Cys Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly 1 5 10 15 Leu Cys Arg Ala Arg Pro Arg Asn Ala Leu Leu Leu Leu Ala Asp Asp 20 25 30 Gly Gly Phe Glu Ser Gly Ala Tyr Asn Asn Ser Ala Ile Ala Thr Pro 35 40 45 His Leu Asp Ala Leu Ala Arg Arg Ser Leu Leu Phe Arg Asn Ala Phe 50 55 60 Thr Ser Val Ser Ser Cys Ser Pro Ser Arg Ala Ser Leu Leu Thr Gly 65 70 75 80 Leu Pro Gln His Gln Asn Gly Met Tyr Gly Leu His Gln Asp Val His 85 90 95 His Phe Asn Ser Phe Asp Lys Val Arg Ser Leu Pro Leu Leu Leu Ser 100 105 110 Gln Ala Gly Val Arg Thr Gly Ile Ile Gly Lys Lys His Val Gly Pro 115 120 125 Glu Thr Val Tyr Pro Phe Asp Phe Ala Tyr Thr Glu Glu Asn Gly Ser 130 135 140 Val Leu Gln Val Gly Arg Asn Ile Thr Arg Ile Lys Leu Leu Val Arg 145 150 155 160 Lys Phe Leu Gln Thr Gln Asp Asp Arg Pro Phe Phe Leu Tyr Val Ala 165 170 175 Phe His Asp Pro His Arg Cys Gly His Ser Gln Pro Gln Tyr Gly Thr 180 185 190 Phe Cys Glu Lys Phe Gly Asn Gly Glu Ser Gly Met Gly Arg Ile Pro 195 200 205 Asp Trp Thr Pro Gln Ala Tyr Asp Pro Leu Asp Val Leu Val Pro Tyr 210 215 220 Phe Val Pro Asn Thr Pro Ala Ala Arg Ala Asp Leu Ala Ala Gln Tyr 225 230 235 240 Thr Thr Val Gly Arg Met Asp Gln Gly Val Gly Leu Val Leu Gln Glu 245 250 255 Leu Arg Asp Ala Gly Val Leu Asn Asp Thr Leu Val Ile Phe Thr Ser 260 265 270 Asp Asn Gly Ile Pro Phe Pro Ser Gly Arg Thr Asn Leu Tyr Trp Pro 275 280 285 Gly Thr Ala Glu Pro Leu Leu Val Ser Ser Pro Glu His Pro Lys Arg 290 295 300 Trp Gly Gln Val Ser Glu Ala Tyr Val Ser Leu Leu Asp Leu Thr Pro 305 310 315 320 Thr Ile Leu Asp Trp Phe Ser Ile Pro Tyr Pro Ser Tyr Ala Ile Phe 325 330 335 Gly Ser Lys Thr Ile His Leu Thr Gly Arg Ser Leu Leu Pro Ala Leu 340 345 350 Glu Ala Glu Pro Leu Trp Ala Thr Val Phe Gly Ser Gln Ser His His 355 360 365 Glu Val Thr Met Ser Tyr Pro Met Arg Ser Val Gln His Arg His Phe 370 375 380 Arg Leu Val His Asn Leu Asn Phe Lys Met 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gctccgtacg gggcgtggcg 1200 cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc ggggcggggc 1260 cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc gccggcggct 1320 gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg 1380 gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct 1440 ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc 1500 ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc tgtccgcggg 1560 gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg 1620 gcggctctag agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg 1680 gcaacgtgct ggttattgtg ctgtctcatc attttggcaa agaatt 1726 <210> 4 <211> 981 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Liver-specific human alpha1-antitrypsin Promoter. <400> 4 cagagaggtc tctgacctct gccccagctc caaggtcagc aggcagggag ggctgtgtgt 60 ttgctgtttg ctgcttgcaa tgtttgccca ttttagggac atgagtaggc tgaagtttgt 120 tcagtgtgga cttcagaggc agcacacaaa cagcaagctt gcgaattcca gtctacagag 180 aggtctctga 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acgcgtatgc actgcccggg actg 34 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 tatcctatcg acgcgttcag agttcattgt gaagcggtc 39 <210> 11 <211> 7199 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pGG2-hAAT-co-hu-SFMD. <400> 11 cattaatgca gcagctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgcccgggca aagcccgggc 60 gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg 120 ccaactccat cactaggggt tccttgtagt taatgattaa cccgccatgc tacttatcta 180 cgtagccatg ctctagacat ggctcgacag atctgatatc atcgatgaat tcgagctcgg 240 tacccggccg cagatttagg tgacactata gaatatgcat cactagtaag cttgcgaatt 300 ccagtctaca gagaggtctc tgacctctgc cccagctcca aggtcagcag gcagggaggg 360 ctgtgtgttt gctgtttgct gcttgcaatg tttgcccatt ttagggacat gagtaggctg 420 aagtttgttc agtgtggact tcagaggcag cacacaaaca gcaagcttgc gaattccagt 480 ctacagagag gtctctgacc tctgccccag ctccaaggtc agcaggcagg gagggctgtg 540 tgtttgctgt ttgctgcttg caatgtttgc ccattttagg gacatgagta ggctgaagtt 600 tgttcagtgt ggacttcaga ggcagcacac aaacagcaag cttgcgaatt ccagtctaca 660 gagaggtctc tgacctctgc cccagctcca aggtcagcag gcagggaggg ctgtgtgttt 720 gctgtttgct gcttgcaatg tttgcccatt ttagggacat gagtaggctg aagtttgttc 780 agtgtggact tcagaggcag cacacaaaca gcaagctttg ctctagactg gaattcgtcg 840 acgagctccc tatagtgagt cgtattagag gccgactgac ccggtacccg gggatcttgc 900 taccagtgga acagccacta aggattctgc agtgagagca gagggccagc taagtggtac 960 tctcccagag actgtctgac tcacgccacc ccctccacct tggacacagg acgctgtggt 1020 ttctgagcca ggtacaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag 1080 gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct 1140 gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt 1200 gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca 1260 ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatg tccccctgat ctgcggccgt gactctctta 1320 aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa ggttacaaga 1380 caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc 1440 tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac aggtgtccac 1500 tcccagttca attacagctc ttaaggctag agtacttaat acgactcact ataggctagc 1560 ctcgacctcg agacgcgtgc caccatgagc tgccctgtgc ccgcctgttg tgccctgctg 1620 ctggtgctgg gactgtgcag agccagaccc cggaacgctc tgctgctgct ggccgacgat 1680 ggcggatttg agagcggcgc ctacaacaac agcgccattg ccacccctca tctggacgcc 1740 ctggccagaa gaagcctgct gttccggaac gccttcacca gcgtgtccag ctgcagccct 1800 agcagagctt ccctgctgac aggcctgccc cagcatcaga atggcatgta cggcctgcac 1860 caggatgtgc atcacttcaa cagcttcgac aaagtgcgga gcctgccact gctcctgtca 1920 caggctggcg tgagaaccgg catcatcggc aagaaacacg tgggccccga gacagtgtac 1980 cccttcgact tcgcctacac cgaagagaac ggcagcgtgc tgcaggtcgg ccggaacatc 2040 acccggatca agctgctcgt gcggaagttt ctccagaccc aggacgaccg gcccttcttc 2100 ctgtacgtgg ccttccacga ccctcacaga tgcggccaca gccagcccca gtacggcacc 2160 ttctgcgaga agttcggcaa cggcgagagc ggcatgggca gaatccccga ctggaccccc 2220 caggcatacg accctctgga cgtgctggtg ccctacttcg tgcccaacac ccctgccgcc 2280 agagctgatc tggccgccca gtacaccacc gtgggcagaa tggatcaggg cgtgggcctg 2340 gtgctgcagg aactgaggga cgctggcgtg ctgaacgaca ccctggtcat cttcacctcc 2400 gacaacggca tcccattccc cagcggccgg accaatctgt actggcccgg cacagccgaa 2460 cctctgctgg tgtccagccc cgagcaccct aagagatggg gccaggtgtc cgaggcctac 2520 gtgtccctgc tggacctgac ccccaccatc ctggactggt tcagcatccc ctaccccagc 2580 tacgccatct ttggaagcaa gaccatccac ctgaccggca gatctctgct gcctgccctg 2640 gaagctgagc ctctgtgggc caccgtgttc ggcagccaga gccaccacga agtgaccatg 2700 agctacccca tgcggagcgt gcagcaccgg cacttccggc tggtgcacaa cctgaacttc 2760 aagatgccct tcccaatcga ccaggacttt tacgtgtccc ccaccttcca ggacctgctg 2820 aacagaacca cagccggcca gcccaccggc tggtacaagg acctgcggca ctactactac 2880 cgggccagat gggagctgta cgacagaagc cgggaccccc acgagacaca gaacctggcc 2940 accgacccca gattcgccca gctcctggaa atgctgcggg accagctggc caagtggcag 3000 tgggagacac acgacccttg ggtctgcgct cccgacggcg tgctggaaga gaagctgtcc 3060 ccccagtgcc agccactgca caacgagctg tgaacgcgtg atatcggatc ccggccggcg 3120 gccgcttccc tttagtgagg gttaatgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag 3180 tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat 3240 gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc 3300 attcatttta tgtttcaggt tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac 3360 ctctacaaat gtggtaaaat ccgataaggg actagagcat ggctacgtag ataagtagca 3420 tggcgggtta atcattaact acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct 3480 gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc 3540 ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 3600 ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggaattcc agacgattga 3660 gcgtcaaaat gtaggtattt ccatgagcgt ttttccgttg caatggctgg cggtaatatt 3720 gttctggata ttaccagcaa ggccgatagt ttgagttctt ctactcaggc aagtgatgtt 3780 attactaatc aaagaagtat tgcgacaacg gttaatttgc gtgatggaca gactctttta 3840 ctcggtggcc tcactgatta taaaaacact tctcaggatt ctggcgtacc gttcctgtct 3900 aaaatccctt taatcggcct cctgtttagc tcccgctctg attctaacga ggaaagcacg 3960 ttatacgtgc tcgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 4020 gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 4080 tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 4140 tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 4200 tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 4260 gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 4320 ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 4380 aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtctac 4440 aatttaaata tttgcttata caatcttcct gtttttgggg cttttctgat tatcaaccgg 4500 ggtacatatg attgacatgc tagttttacg attaccgttc atcgattctc ttgtttgctc 4560 cagactctca ggcaatgacc tgatagcctt tgtagagacc tctcaaaaat agctaccctc 4620 tccggcatga atttatcagc tagaacggtt gaatatcata ttgatggtga tttgactgtc 4680 tccggccttt ctcacccgtt tgaatcttta cctacacatt actcaggcat tgcatttaaa 4740 atatatgagg gttctaaaaa tttttatcct tgcgttgaaa taaaggcttc tcccgcaaaa 4800 gtattacagg gtcataatgt ttttggtaca accgatttag ctttatgctc tgaggcttta 4860 ttgcttaatt ttgctaattc tttgccttgc ctgtatgatt tattggatgt tggaatcgcc 4920 tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc 4980 tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg 5040 ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 5100 tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa 5160 agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga 5220 cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 5280 tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 5340 gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 5400 cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 5460 atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 5520 agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg 5580 gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 5640 ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 5700 cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 5760 ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 5820 atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 5880 gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 5940 tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 6000 gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 6060 gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 6120 tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 6180 ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 6240 tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 6300 ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 6360 ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 6420 tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 6480 ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag 6540 tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 6600 tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 6660 actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 6720 cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 6780 gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 6840 tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 6900 ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 6960 ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 7020 cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 7080 cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 7140 gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgatt 7199

Claims (26)

  1. 단백질 서열번호: 2에 대해 암호화한 서열번호: 1의 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 구조물(gene construction).
  3. 청구항 2에 따른 유전자 구조물을 함유하는 벡터.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  6. 청구항 5에 있어서, 혈청형은 1, 2, 5, 7, 8 또는 9인 것을 특징으로 하는 벡터.
  7. 청구항 6에 있어서, 혈청형은 9인 것을 특징으로 하는 벡터.
  8. 청구항 5에 있어서, 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 CAG 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  9. 청구항 8에 있어서, 벡터는 CAG 프로모터에 작용가능하게 연결된 서열 번호 : 1의 코돈 최적화된 인간 설파미다아제 뉴클레오티드 서열을 포함하는 혈청형 9의 아데노-연관 바이러스 벡터로서, AAV9-CAG-co-hu-SFMD로 명명됨을 특징으로 하는 벡터.
  10. 청구항 1에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는, 수탁 번호 DSM 24817을 갖는 플라스미드.
  11. 청구항 4에 있어서, 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 hAAT 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  12. hAAT 프로모터에 작용가능하게 연결된 청구항 1에 따른 코돈 최적화된 인간 설파미다제 폴리뉴클레오티드를 함유하는 아데노-연관 바이러스 플라스미드로서, pAAV-hAAT-co-hu-SFMD로 명명되는 플라스미드.
  13. 청구항 1에 따른 폴리뉴클레티드의 치료적 유효량을 포함하는, 점액다당질증(mucopolysaccharidoses)의 치료를 위한 제약학적 조성물.
  14. 청구항 3 내지 청구항 9 및 청구항 11 중 어느 한 항에 따른 벡터의 치료적 유효량을 포함하는, 점액다당질증의 치료를 위한 제약학적 조성물.
  15. 청구항 13에 있어서, 비경구(parenteral) 투여를 위한 것임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  16. 청구항 13에 있어서, 조내 투여(intracisternal administraion)를 위해 청구항 7에 따른 혈청형 9의 아데노-연관 바이러스 벡터의 치료학적 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  17. 청구항 1에 있어서, 약으로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 청구항 3 내지 청구항 9 및 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 약으로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 벡터.
  19. 청구항 1에 있어서, 점액다당질증의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 청구항 3 내지 청구항 9 및 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 점액다당질증의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 벡터.
  21. 청구항 3 내지 청구항 9 및 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 점액다당질증 제IIIA형 또는 산필립포 증후군(Sanfilippo syndrome)의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 벡터.
  22. 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 5에 따른 발현 벡터를 생성하는 방법:
    i) 제1 AAV 말단 반복 및 제2 AAV 말단 반복 사이에 끼어들어간 서열번호: 1, 서열번호: 1과 작용가능하게 연결된 CAG 또는 hAAT 프로모터를 포함하는 제1 벡터; AAV rep 유전자 및 AAV cap 유전자를 포함하는 제2 벡터; 및 아데노바이러스 보조 기능을 포함하는 제3 벡터를 제공하는 단계;
    ii) 단계 i)의 벡터로 컴피턴트 세포(competent cell)를 공동-형질감염시키는 단계;
    iii) 단계 ii)의 형질감염된 세포를 배양하는 단계; 및
    iv) 단계 iii)의 배양물로부터 발현 벡터를 정제하는 단계.
  23. 청구항 2에 따른 유전자 구조물을 함유하는 단리된 세포.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
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