ES2388620A1 - Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades. - Google Patents
Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2388620A1 ES2388620A1 ES201130978A ES201130978A ES2388620A1 ES 2388620 A1 ES2388620 A1 ES 2388620A1 ES 201130978 A ES201130978 A ES 201130978A ES 201130978 A ES201130978 A ES 201130978A ES 2388620 A1 ES2388620 A1 ES 2388620A1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- vector
- expression vector
- nucleotide sequence
- gene
- gene construct
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 110
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title abstract description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 30
- 102100027661 N-sulphoglucosamine sulphohydrolase Human genes 0.000 claims description 88
- 108010006140 N-sulfoglucosamine sulfohydrolase Proteins 0.000 claims description 87
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 50
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 43
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 208000011045 mucopolysaccharidosis type 3 Diseases 0.000 claims description 8
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims description 6
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 6
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 claims description 4
- 208000005340 mucopolysaccharidosis III Diseases 0.000 claims description 4
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 64
- 208000025816 Sanfilippo syndrome type A Diseases 0.000 description 58
- 208000036710 mucopolysaccharidosis type 3A Diseases 0.000 description 58
- 208000012226 mucopolysaccharidosis type IIIA Diseases 0.000 description 58
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 50
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 39
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 16
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 230000035508 accumulation Effects 0.000 description 14
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 14
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 14
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 14
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 13
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 12
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 10
- 208000015439 Lysosomal storage disease Diseases 0.000 description 9
- 210000001638 cerebellum Anatomy 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 7
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 6
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 description 5
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 description 5
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 5
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 description 5
- 210000000133 brain stem Anatomy 0.000 description 5
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 210000000449 purkinje cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 4
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 108010031792 IGF Type 2 Receptor Proteins 0.000 description 3
- 108010009254 Lysosomal-Associated Membrane Protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100035133 Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 Human genes 0.000 description 3
- 102000019218 Mannose-6-phosphate receptors Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 3
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001767 medulla oblongata Anatomy 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 3
- 210000003314 quadriceps muscle Anatomy 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 4-methylumbelliferone Chemical compound C1=C(O)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C HSHNITRMYYLLCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical class CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028875 Formylglycine-generating enzyme Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000648611 Homo sapiens Formylglycine-generating enzyme Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000010824 Kaplan-Meier survival analysis Methods 0.000 description 2
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000035977 Rare disease Diseases 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 2
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 2
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000014823 calbindin Human genes 0.000 description 2
- 108060001061 calbindin Proteins 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 2
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 210000005153 frontal cortex Anatomy 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000007346 lysosomal pathology Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 2
- 210000000956 olfactory bulb Anatomy 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000649044 Adeno-associated virus 9 Species 0.000 description 1
- 206010001488 Aggression Diseases 0.000 description 1
- 101710095339 Apolipoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 102100029470 Apolipoprotein E Human genes 0.000 description 1
- 102100022548 Beta-hexosaminidase subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101150077194 CAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 206010062337 Congenital joint malformation Diseases 0.000 description 1
- 206010062344 Congenital musculoskeletal anomaly Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 206010018341 Gliosis Diseases 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 206010019842 Hepatomegaly Diseases 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 101000823116 Homo sapiens Alpha-1-antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101001045440 Homo sapiens Beta-hexosaminidase subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000651201 Homo sapiens N-sulphoglucosamine sulphohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMTCKNXTTXDPJX-REOHCLBHSA-N L-3-oxoalanine Chemical compound O=C[C@H](N)C(O)=O XMTCKNXTTXDPJX-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 208000035752 Live birth Diseases 0.000 description 1
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 101100438378 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) fac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 240000007817 Olea europaea Species 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000001675 Parvalbumin Human genes 0.000 description 1
- 108060005874 Parvalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 208000032991 Profound mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101100273112 Pseudomonas aeruginosa cap8 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000114141 Rhinocephalus Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 101100194343 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) rep2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 102000005262 Sulfatase Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 208000022292 Tay-Sachs disease Diseases 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000037875 astrocytosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007341 astrogliosis Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- 230000008436 biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H bis[[2-(5-hydroxy-4,7-dioxo-1,3,2$l^{2}-dioxaplumbepan-5-yl)acetyl]oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HOQPTLCRWVZIQZ-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229940094517 chondroitin 4-sulfate Drugs 0.000 description 1
- KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N chondroitin sulfate Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(O)=O)O1 KXKPYJOVDUMHGS-OSRGNVMNSA-N 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000051631 human SERPINA1 Human genes 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 230000002267 hypothalamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000007388 microgliosis Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004973 motor coordination Effects 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 1
- 208000025919 mucopolysaccharidosis type 7 Diseases 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 1
- 208000011851 neurological alteration Diseases 0.000 description 1
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 1
- 230000007823 neuropathy Effects 0.000 description 1
- 201000001119 neuropathy Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 208000038009 orphan disease Diseases 0.000 description 1
- 229940000673 orphan drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002859 orphan drug Substances 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000007331 pathological accumulation Effects 0.000 description 1
- 208000033808 peripheral neuropathy Diseases 0.000 description 1
- VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N phenylbutazonum Chemical compound O=C1C(CCCC)C(=O)N(C=2C=CC=CC=2)N1C1=CC=CC=C1 VYMDGNCVAMGZFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001609 raphe nuclei Anatomy 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 101150117297 rep2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 208000020029 respiratory tract infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000010825 rotarod performance test Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 208000019116 sleep disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022925 sleep disturbance Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 235000000891 standard diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 108060007951 sulfatase Proteins 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
- A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/864—Parvoviral vectors, e.g. parvovirus, densovirus
- C12N15/8645—Adeno-associated virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/48—Vector systems having a special element relevant for transcription regulating transport or export of RNA, e.g. RRE, PRE, WPRE, CTE
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/10—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation
- C12N2840/105—Vectors comprising a special translation-regulating system regulates levels of translation enhancing translation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades.La presente invención proporciona nuevas secuencias, construcciones génicas, vectores y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades y en especial, para el tratamiento de la mucopolisacaridosis.
Description
VECTORES Y SECUENCIAS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES
La presente invención se refiere a vectores útiles para la expresión de proteínas de interés y a su uso en terapia génica. La presente invención también se refiere a vectores y secuencias de ácidos nucleicos útiles para el tratamiento de la mucopolisacaridosis (MPS) y, en particular, para el tratamiento de la mucopolisacaridosis de tipo III o síndrome de Sanfilippo.
El lisosoma es un orgánulo que se encuentra en el citoplasma de células eucariotas, que sirve como almacenamiento para muchas enzimas hidrolíticas y como centro para degradar y reciclar componentes celulares. Este orgánulo contiene varios tipos de enzimas hidrolíticas, incluyendo proteasas, nucleasas, glicosidasas, lipasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas. Todas las enzimas son hidrolasas ácidas.
Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD) son causadas por defectos genéticos que afectan a una o más enzimas lisosómicas. Estas enfermedades genéticas en general son resultado de una deficiencia de una actividad enzimática particular presente en el lisosoma. En menor medida, estas enfermedades pueden deberse a deficiencias en proteínas implicadas en la biogénesis lisosómica.
Las LSD son raras individualmente, aunque como grupo, estos trastornos son relativamente comunes en la población general. La prevalencia combinada de LSD es aproximadamente 1 por 5.000 nacidos vivos. Véase Meikle P, et al., JAMA 1999; 281 :249-254. Sin embargo, algunos grupos dentro de la población general están particularmente afectados por una alta incidencia de LSD. Por ejemplo, las tasas de prevalencia de las enfermedades de Gaucher y Tay-Sachs en descendientes de personas judías originarias de Europa central y oriental (asquenazíes) es de 1 por 600 y 1 por 3.900 nacimientos, respectivamente. La población finesa también está afectada por una tasa de prevalencia de LSD anormalmente alta.
La mucopolisacaridosis de tipo III (MPSIII), conocida colectivamente como síndrome de Sanfilippo, son LSD causadas por una deficiencia en una de las enzimas implicadas en la degradación del heparán sulfato, que conduce a su acumulación patológica. La MPSIII se clasifica en 4 subtipos dependiendo de la deficiencia de la enzima. La pérdida de actividad de la sulfamidasa produce el subtipo lilA y se ha descrito que es la más grave, con la aparición más temprana de la enfermedad y la supervivencia más corta. Los síntomas de la MPSIIIA aparecen en los primeros años de vida, y se caracterizan por la neurodegeneración grave que conduce al retardo mental profundo, agresividad, hiperactividad y alteraciones del sueño. Los pacientes pierden progresivamente la capacidad del lenguaje, de tragar y la coordinación motora básica. Además de los síntomas neurológicos, los pacientes con MPSIIIA padecen alteraciones no neurológicas, incluyendo hepato y esplenomegalia, malformaciones esqueléticas y de las articulaciones, así como diarrea frecuente e infecciones del tracto respiratorio. El empeoramiento progresivo de los síntomas tiene como resultado la muerte del paciente durante la adolescencia. Véase Neufeld E, Muenzer J., "The mucopolysaccharidoses" en Scriver C., et al., Eds., "The metabolic and molecular basis of inherited disease", (Mc Graw-Hill Publishing Co., New York, NY, EE.UU., 2001, pág. 3.421-3.452).
Actualmente no hay cura para la MPSIIIA y, por lo tanto, los tratamientos que existen están orientados a paliar los síntomas de la enfermedad con el fin de mejorar la calidad de vida de los pacientes. Los trastornos de MPS se pueden tratar mediante trasplante de médula ósea o terapia de sustitución enzimática (TSE). Ambos procedimientos están basados en la endocitosis de las enzimas lisosómicas desde medio extracelular y su traslado a los lisosomas por el receptor de manosa-6-fosfato (M6PR) presente en la membrana celular. Sin embargo, el trasplante de médula ósea ha demostrado ser ineficaz en el tratamiento de los pacientes con MPSIII. Véase Sivakamur P, Wraith J, J. Inherít. Metab. Oís. 1999; 22:849-850. Se ha probado ampliamente que la TSE es eficaz para contrarrestar la acumulación no neurológica en otras enfermedades de almacenamiento lisosómico, incluyendo la MPSI, II y VI. Véase Harmatz P, et al., J. Mol. Genet. Metab. 2008; 94:469-475; Muenzer J, et al., Genet. Med. 2006; 8:465-473; Y Wraith J, et al., J. Pedíatr. 2004; 144:581
588. Además del alto coste de estos tratamientos, se ha mostrado que la TSE no produce la corrección o la conservación de la función neuronal debido al insuficiente suministro de la enzima proporcionada de forma exógena a través de la barrera hematoencefálica (BHE). Véase Enns G., Huhn S., Ne uros urg. Focus 2008; 24:E12. Más recientemente, se ha demostrado que la TSE de dosis alta es parcialmente satisfactoria para eliminar el almacenamiento en el SNC en la MPS VII, posiblemente debido a la saturación del M6PR y de los receptores de manosa, que conduce a una vida media más larga de la proteína circulante. Véase Vogler C., et al., Proc. Nat!. Acad. Scí. USA 2005; 102:1477714782. Este estudio demuestra que los niveles altos de la enzima en sangre durante periodos de tiempo largos se correlacionan con una mejor corrección de la patología. El suministro intracerebral e intra-LCR (líquido cefalorraquídeo) de la enzima se ha demostrado que también es eficaz para reducir la patología del SNC en ratones con MPS lilA. Véase Hemsley K., et al., Genes Braín Behav. 2008; 53(2):161-8, y Savas P., et al., Mol. Genet. Metab. 2004; 82:273
285. Sin embargo, este procedimiento es muy invasivo debido a la necesidad de múltiples inyecciones repetidas y podría aumentar el riesgo de daño y/o de infecciones en el cerebro.
Dadas las limitadas opciones terapéuticas actuales para la MPSIII, se necesitan procedimientos alternativos. La transferencia de genes podría proporcionar los medios para lograr una producción permanente de la enzima que falta a partir de una sola intervención. Los vectores adenoasociados (AAV) están surgiendo rápidamente como el vector de elección para muchas aplicaciones de terapia génica, debido a su alta eficacia de transducción y a su falta de patogenicidad. Los vectores AA V transducen de forma eficaz células postmitóticas y varios estudios preclínicos y clínicos han demostrado el potencial de la transferencia de genes mediada por vectores AA V para dirigir de forma eficaz la expresión sostenida de transgenes terapéuticos para una variedad de enfermedades. Véase Daya S, Berns K, Clín. Microbiol. Rev. 2008;
21: 583-593.
Se ha demostrado que la administración de un vector AAV5 que expresa simultáneamente sulfamidasa y el activador de sulfatasa SUMF1 en los ventrículos laterales de ratones recién nacidos con MPSIIIA es capaz de corregir muchas alteraciones neurológicas y del comportamiento. Véase Fraldi A, et al., Hum. Mol. Genet. 2007; 16:2693-2702. Sin embargo, esta propuesta de actuación tiene varios inconvenientes. Primero, se ha descrito que el promotor eMV utilizado se silencia. Segundo, los efectos a largo plazo de la coexpresión de la sulfamidasa y SUMF1 no se han probado aún. No está claro que la co-expresión de SUMF sea ni siquiera necesaria ni que proporcione algún beneficio adicional permanente en comparación con el tratamiento con la sulfamidasa sola. Tercero, los vectores AAV5 tienen una baja distribución en el parénquima, y lo que es más importante, la distribución de la sulfamidasa en el cerebro usando estos vectores no resulta en una transducción del tejido cerebral, y por tanto, no se consigue la corrección del fenotipo somático usando esta aproximación. Finalmente, Fraldi, 2007, supra, demostró la eficacia de la transferencia génica solamente en ratones neonatos con MPSIIIA. No se han descrito experimentos en ratones de más edad. Dado que la MPSIIIA se diagnostica normalmente a los 3-4 años de edad, el modelo animal en ratones neonatos no es apropiado para predecir los efectos de este tratamiento en seres humanos.
En vista de las dificultades para diagnosticar MPSIIIA al nacer, se ha propuesto el desarrollo de intervenciones terapéuticas que empiecen al comienzo de la edad adulta. Se ha descrito que la administración intravenosa de un vector lentiviral que expresa la sulfamidasa en el ratón adulto, dio como resultado una pequeña mejora del fenotipo del SNe, probablemente debido al rendimiento relativamente pobre de la transducción de estos vectores in vivo. Véase Mclntyre e, et al., Mol. Genet. Metab. 2008; 93:411-418. Por lo tanto, el uso de vectores virales con una mayor eficacia de transducción in vivo, tales como los vectores AAV, puede proporcionar niveles más altos de la sulfamidasa en sangre, lo cual podría mejorar o corregir potencialmente la patología neurológica.
El tratamiento de la MPSIIIA mediante terapia génica requiere vectores y secuencias que codifiquen para la sulfamidasa más eficaces. Por tanto, hay una necesidad experimentada desde hace tiempo de un tratamiento eficaz de la MPSIIIA. También son necesarios nuevos procedimientos para el tratamiento de esta enfermedad que tengan unas características de seguridad mejoradas. MPSIIIA es una enfermedad rara y es por tanto una enfermedad huérfana. Los fármacos desarrollados específicamente para tratar esta rara condición médica serán medicamentos huérfanos.
La presente invención proporciona una nueva secuencia de nucleótidos para el tratamiento de enfermedades, preferiblemente para el tratamiento de la mucopolisacaridosis (MPS). Por lo tanto, el primer aspecto de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que es una secuencia de codones optimizados de la sulfamidasa humana que permite la transcripción de un ARNm más estable. Además, esta secuencia se transcribe a mayor velocidad y por lo tanto produce mayores cantidades de la enzima sulfamidasa. La secuencia tiene un perfil de expresión mejor y es más efectiva terapéuticamente que otros intentos de optimización de codones de la secuencia de nucleótidos de la sulfamidasa. Estos mayores niveles de expresión de la enzima son seguidos por un aumento de la actividad de la sulfamidasa en el suero, lo que permite la reducción de la acumulación de glicosaminoglicanos (GAG) que produce la enfermedad. Dicha secuencia es SEO ID NO: 1 o una secuencia que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con el SEO ID NO: 1 que codifica para la proteína del SEO ID NO:
2.
En un segundo aspecto, la invención se refiere a una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos del primer aspecto de la invención.
La presente invención también proporciona nuevos vectores AAV con serotipo 9 que es capaz de pasar a través de la barrera hematoencefálica (BHE) y presenta más tropismo para diferentes estructuras cerebrales. Esto permite aumentar la actividad de la sulfamidasa específicamente en el cerebro, reduciendo la acumulación de GAG y por lo tanto mejorando los síntomas neurológicos del MPS. El serotipo 9 de AAV también muestra un tropismo inesperadamente elevado para el tejido de corazón, páncreas y músculo, potenciando así los beneficios globales de la invención.
Por ejemplo, después de administrar vectores AA V de los serotipos 8 y 9 (AAV8 y AAV9) a ratones adultos con MPSIIIA por inyección intravenosa (iv), para dirigirlos al hígado, o por inyección intramuscular (im), para dirigirlos al músculo esquelético, o por vía intracisternal (ic), para dirigirlos al sistema nervioso central, los niveles de expresión de la sulfamidasa alcanzados con el suministro del vector por vía im no fueron terapéuticos. La administración intracisternal consiguió no solo aumentar el nivel de sulfamidasa circulante, sino también revertir el fenotipo somático de la MPSIIIA en distintos tipos de tejido, incluyendo el tejido cerebral. El enfoque dirigido al hígado también fue capaz de producir niveles altos de actividad de la sulfamidasa en sangre, que sorprendentemente corrigieron completamente el fenotipo somático de acumulación de la MPSIIIA y corrigieron significativamente la neuropatía asociada con la enfermedad. Estos resultados proporcionan pruebas de la eficacia de la transferencia de genes mediada por AA V de la sulfamidasa en ratones adultos con MPSIIIA, un modelo de enfermedad que se parece mucho al cuadro clínico humano. Los inventores de la presente invención fueron capaces de corregir completamente tanto las alteraciones somáticas como las neurológicas de la MPSIIIA.
Las construcciones génicas de la presente invención pueden además comprender promotores adecuados, tales como los promotores GAG o hAAT, para controlar y potenciar la expresión de la sulfamidasa. Por ejemplo, el promotor GAG es más estable que el promotor GMV y es, por tanto, más apropiado para inducir la expresión de la sulfamidasa a largo plazo. Por otro lado, la seguridad y eficacia del promotor hAAT lo convierten en el vehículo ideal para la administración de dosis de seguimiento o mantenimiento de la sulfamidasa. El control de la expresión de SEQ ID NO: 1 por los promotores ha potenciado significativamente sus efectos terapéuticos.
Además, los vectores AA V de la presente invención aumentan la actividad de la sulfamidasa, que reduce la acumulación de GAG y mejora el resultado clínico de individuos que padecen MPS. Una única administración puede ser suficiente porque el promotor y la secuencia de nucleótidos de la sulfamidasa, situados entre las repeticiones terminales invertidas (ITR), se incorporan en el genoma de las células de los individuos. Por lo tanto, una sola administración parenteral es suficiente para lograr un efecto a largo plazo.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende la secuencia de nucleótidos del primer aspecto de la invención, la construcción génica o el vector de expresión de la invención.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento. El medicamento se puede usar para aumentar la actividad de la sulfamidasa en el cuerpo, para la terapia de sustitución enzimática, para la terapia génica, o para el tratamiento de la MPS.
En un quinto aspecto, la invención se refiere a un método para la producción de los vectores de expresión del primer y el segundo aspecto de la invención.
En un sexto aspecto, la invención se refiere a un método de fabricación de las composiciones farmacéuticas del tercer aspecto de la invención.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a un método de tratamiento de un sujeto que tiene mucopolisacaridosis tipo lilA con el primer, el segundo o el tercer aspecto de la invención.
La presente invención también se refiere al uso de la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención para la manufactura de un medicamento para aumentar la actividad de la sulfamidasa en el cuerpo, para la terapia de sustitución enzimática, para la terapia génica, para el tratamiento de las mucopolisacaridosis o para el tratamiento de la mucopolisacaridosis tipo lilA.
Figura 1. Administración intramuscular de AAV1-CAG-mu-SFMO-WPRE.
- (A)
- Actividad de la sulfamidasa en el músculo esquelético de ratones control, con MPS y tratados. (B) Actividad de la sulfamidasa en el suero de ratones control, con MPS y tratados. (C) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medias ± error estándar de la media (EEM) de 4 a 8 ratones por grupo. )f. P<0,05 frente a control, #P<0,05 frente a machos, *P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado.
Figura 2. Administración intramuscular de AAV8-CAG-mu-SFMO-WPRE.
- (A)
- Actividad de la sulfamidasa en el músculo esquelético de ratones control, con MPS y tratados. (B) Actividad de la sulfamidasa en el suero de ratones control, con MPS y tratados. (C) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medias ± EEM de 4 a 8 ratones por grupo. )f. P<0,05 frente a control, #P<0,05 frente a machos, *P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado.
Figura 3. Administración intravenosa de AAV8-CAG-mu-SFMO-WPRE.
- (A)
- Actividad de la sulfamidasa en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. (B) Actividad de la sulfamidasa en el suero de ratones control, con MPS y tratados. (C) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medias ± EEM de 4 a 8 ratones por grupo. )f. P<0,05 frente a control, #P<0,05 frente a machos, *P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado.
Figura 4. Administración intravenosa de AAV8-hAAT-mu-SFMO. (A) Actividad de la sulfamidasa en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. (B) Actividad de la sulfamidasa en el suero de ratones control, con MPS y tratados. (C) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en el hígado de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medias ± EEM de 4 a 8 ratones por grupo. )f. P<0,05 frente a control, #P<0,05 frente a machos, *P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado.
Figura 5. Mejora de la patología neurológica de ratones con MPSIIIA después de la administración intravenosa de AAV8-hAAT-mu-SFMO. (A) Actividad de la sulfamidasa en diferentes partes del cerebro (representadas en el diagrama) de machos control, con MPS y tratados. (B) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en las mismas partes del cerebro. Los valores son medias ± EEM de 4 a 8 ratones por grupo. )f. P<0,05 frente a control, * P<0,05 frente a MPS no tratada. NO: no detectado. (C) Microscopía electrónica de transmisión de células de Purkinje en el cerebelo. Los somas de neuronas de Purkinje de ratones con MPSIIIA no tratados se llenaron con inclusiones electrodensas muy grandes (flechas blancas), mientras que en los machos tratados con iv-AAV8-hAAT se encontraron menos inclusiones y más pequeñas (flechas negras).
Figura 6. AAV9-CAG-mu-SFMO intravenoso. (A) Actividad de la sulfamidasa en diferentes partes del cerebro (representadas en el diagrama) de ratones control, con MPS y tratados. (B) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en las mismas partes del cerebro. (C) Evaluación de la función motora mediante el ensayo de RotaRod de aceleración. Los valores son medias ± EEM de 4 a 8 ratones por grupo. )f. P<0,05 frente a control, *P<0,05 frente a MPS no tratada.
Figura 7. Transducción en el cerebro tras la administración intracisternal de vectores de virus adenoasociados GFP, de serotipos 1, 2, 5, 7, 8 Y 9. Se administró por vía intracisternal una dosis de 5x1 010 genomas del vector adecuado a animales de 2 meses de edad, que se sacrificaron y analizaron 2 semanas después. El virus adenoasociado de serotipo 9 demostró la mayor eficacia de transducción en todas las zonas analizadas. La jeringa indica la ruta de suministro del vector, la cisterna magna. P: puente troncoencefálico, Cb: cerebelo, OB: bulbo olfatorio, Ht: hipotálamo, Cx: corteza cerebral.
Figura 8. Administración intracisternal de vectores AAV9-CAG-muSFMO. Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en diferentes partes del cerebro (representadas en el diagrama) de ratones control, con MPS y tratados. Los valores son medias ± EEM de 3 ratones por grupo. )f. P<0,05 frente a control, *P<0,05 frente a MPS no tratada.
Figura 9. Administración intravenosa de AAV9-CAG-hu-co-SFMD. Actividad de la sulfamidasa en el hígado de ratones control, ratones con MPS y ratones tratados con AAV9-CAG-mu-SFMD (gen no optimizado) o con AAV9CAG-hu-co-SFMD (gen optimizado).
Figura 10. Reducción de la patología lisosómica en células gliales perineuronales de la corteza occipital. Microscopía electrónica de transmisión que representa las neuronas corticales de la corteza occipital y sus células gliales asociadas. La patología lisosómica de la MPSIIIA es mucho más evidente en células gliales perineuronales que en neuronas. Se muestra la presencia de vacuolas electrolúcidas en las células gliales de de individuos macho con MPSIIIA sin tratar (flechas blancas, panel superior derecho) y no en las muestras de los individuos control (panel superior izquierdo). Este agrandamiento de los compartimentos lisosómicos se reduce mucho en los ratones tratados con iv-AAV8-hAAT, y la mayoría de las células gliales perineuronales en estas muestras presentaron un aspecto similar a los controles (paneles inferiores). 1) neurona, 2) célula glial perineuronal.
Figura 11. Supervivencia en machos y hembras tratados con AAV8hAAT-SFMD intravenoso. (A) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en machos control, con MPSIIIA y tratados con AAV8-hAAT-SFMD intravenoso. El tratamiento con terapia génica dirigida al hígado mediada por AVV prolongó considerablemente el tiempo de vida de los animales con MPSIIIA (p< 0,001).
(B) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en hembras control, con MPSIIIA y tratadas con AAV8-hAAT-SFMD intravenoso. El tratamiento con terapia génica dirigida al hígado mediada por AA V no prolongó el tiempo de vida de las hembras con MPSIIIA (p= 0,467).
Figura 12. Supervivencia en machos y hembras tratadas con AAV9CAG-mu-SFMD intracisternal e intravenoso. Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en machos (A) y hembras (B) control, con MPSIIIA y tratados con AAV9. Tanto el tratamiento intracisternal como el intravenoso con terapia génica mediada por AA V prolongaron el tiempo de vida de los animales con MPSIIIA.
Figura 13. La administración intracisternal de vectores AAV9 a perros conduce a la transducción de extensas zonas del SNC e hígado. Detección inmunohistoquímica de GFP en secciones de SNC y de hígado de un perro al que se inyectó AAV9-GFP a través de la cisterna magna. Las imágenes corresponden a: (a) médula espinal, (b) oliva bulbar de la médula oblonga, (c) núcleos del rafe del puente troncoencefálico, (d) núcleos hipotalámicos, (e) rinencéfalo, (f) corteza occipital, (h) corteza frontal, (i) cerebelo, (j) giro dentado del hipocampo. Barra de escala 1 mm para (a), 500 /-lm para (b)-(h), 100 /-lm para (i)-(j).
Figura 14. Transducción en el hígado después de administración intracisternal del vector AAV9-GFP en perros Beagle sanos. Detección inmunohistoquímica de GFP en secciones del hígado contrateñidas con hematoxilina. Se muestran las imágenes representativas del Perro 1 (A) Y Perro 2 (B). Aumento del original 200X.
Figura 15. Actividad de la sulfamidasa en suero y contenido de GAG en el hígado en animales a los que se ha inyectado por vía intravenosa AAV9-cohu-SFMD. (A) Actividad de sulfamidasa en suero medida con un sustrato fluorógeno. (B) Acumulación de GAG en el hígado 2 meses después de la administración del vector.
El plásmido pAAV-CAG-co-hu-SFMD se depositó el 16 de mayo de 2011, con el número de acceso DSM 24817 en DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, InhoffenstraBe 7 B, 0-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.
El plásmido pAAV-CAG-mu-SFMD se depositó el 16 de mayo de 2011, con el número de acceso DSM 24818 en DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, InhoffenstraBe 7 B, 0-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.
El plásmido pGG2-hAAT-mu-SFMD se depositó el 16 de mayo de 2011, con el número de acceso DSM 24819 en DSMZ -Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, InhoffenstraBe 7 B, 0-38124 Braunschweig,
República Federal de Alemania.
- 5
- La expresión "secuencia de nucleótidos" se refiere a una molécula de
- ácido nucleico, sea AON o ARN, que contiene desoxirribonucleótidos o
- ribonucleótidos. El ácido nucleico puede ser bicatenario, monocatenario, o
- contener partes de secuencia tanto bicatenarias como monocatenarias.
- La expresión "% de identidad de secuencia" se refiere al porcentaje de
- 1O
- nucleótidos de una secuencia candidata que es idéntico a los nucleótidos del
- SEO ID NO: 1, después de alinear las secuencias para lograr el máximo
- porcentaje de identidad de secuencia. El % de identidad de secuencia se
- puede determinar por cualquiera de los procedimientos o algoritmos
- establecidos en la técnica, tales como los algoritmos de ALlGN, BLAST y
- 15
- BLAST 2.0. Véase Altschul S., et al., Nuc. Acids Res. 1977; 25:3389-3402 y
- Altschul S., et al., J. Mol. Bial. 1990; 215:403-410.
- En el presente documento, el % de identidad de secuencia se calcula
- dividiendo el número de nucleótidos que son idénticos después de alinear SEO
- ID NO: 1 y la secuencia candidata, entre el número total de nucleótidos de SEO
- 20
- ID NO: 1, Y multiplicando el resultado por 100.
- El término "codifica" se refiere al código genético que determina cómo
- una secuencia de nucleótidos se traduce en un polipéptido o una proteína. El
- orden de los nucleótidos de una secuencia determina el orden de los
- aminoácidos a lo largo de un polipéptido o una proteína.
- 25
- El término "proteína" se refiere a una cadena lineal de aminoácidos, un
- polipéptido, que está plegada en una forma globular. Las proteínas pueden
- sufrir modificaciones postraduccionales, como la conversión de un resto de
- cisteína en 3-oxoalanina, glicosilación o unión a un metal. La glicosilación de
- una proteína es la adición de diferentes hidratos de carbono que se unen de
- 30
- forma covalente a la cadena de aminoácidos.
- La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una
- sustancia suficiente para lograr el propósito pretendido. Por ejemplo, una
cantidad eficaz de un vector de expresión para aumentar la actividad de la sulfamidasa es una cantidad suficiente para reducir la acumulación de glicosaminoglicanos. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un vector de expresión para tratar una enfermedad o trastorno es una cantidad del vector de expresión suficiente para reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad o trastorno. La cantidad eficaz de una sustancia dada variará con factores tales como la naturaleza de la sustancia, la vía de administración, el tamaño y la especie del animal que va a recibir la sustancia y el propósito por el que se da la sustancia. La cantidad eficaz en cada caso individual la puede determinar empíricamente el experto en la materia de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica.
El término "individuo" se refiere a un animal arbitrario, preferiblemente un humano o mamífero no humano, más preferiblemente ratón, rata, otros roedores, conejo, perro, gato, cerdo, vaca, caballo o primate, aún más preferiblemente un humano.
El término "operativamente unido" se refiere a la relación funcional y a la localización de la secuencia del promotor con respecto al gen de interés, (e.g. un promotor o potenciador está operativamente unido a un secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia). En general, un promotor operativamente unido está contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.
El término "tropismo" se refiere a la forma en la que han evolucionado diferentes virus para dirigirse preferentemente a especies huésped específicas,
o tipos de células específicas en estas especies.
El término "terapia génica" se refiere a la transferencia de material genético (e.g. ADN o ARN) de interés a un huésped para tratar o prevenir una enfermedad o afección genética o adquirida. El material genético de interés codifica un producto (e.g. un polipéptido proteína, péptido o ARN funcional) cuya producción in vivo se desea. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar una enzima, hormona, receptor o polipéptido de valor terapéutico.
El término "promotor GAG" se refiere a la combinación formada por el elemento potenciador temprano del citomegalovirus y el promotor de la ~-actina de pollo (i.e. SEO ID NO: 3). Véase Alexopoulou A, et al. BMG Gell Biology 2008; 9(2): 1-11.
El término "promotor hAAT" se refiere al promotor de la alfa1-antitripsina humana (i.e. SEO ID NO. 4). Véase Hafenrichter H, et al. Blood 1994; 84: 33943404.
El término "partícula de vector viral" se refiere a un virus genéticamente modificado usado para la administración de genes en un organismo. Las partículas de vector viral llevan el genoma viral. El genoma viral comprende la secuencia de nucleótidos que se encuentra situada entre las ITRs en el vector de expresión usado para la producción de las partículas de vector viral. Las partículas de vector viral adeno-asociado se llaman AAV. El término "vector AAV" se refiere a las partículas de vector viral adeno-asociado.
En una realización preferida, la secuencia del primer aspecto de la invención tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con el SEO ID NO: 1 que codifica la proteína del SEO ID NO 2. Preferiblemente, la identidad de secuencia es de al menos 87%. Más preferiblemente, la identidad de secuencia es al menos 90%. Mucho más preferiblemente, la identidad de secuencia es de al menos 95%. Aún más preferiblemente, la identidad de secuencia es de al menos 98%. Incluso más preferiblemente, la identidad de secuencia es de al menos 99%. En una realización más preferida, la secuencia del primer aspecto de la invención es la secuencia de nucleótidos SEO ID NO:
1. En otra realización, la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 1 o a una variante biológicamente activa de esta secuencia. Una variante biológicamente activa incluye una molécula que tiene la misma actividad biológica que SEO ID NO: 1 y una identidad de secuencia de al menos 85%. La actividad biológica se refiere al hecho de que la secuencia de nucleótidos SEO ID NO: 1 se puede transcribir en un ARN mensajero que tiene mayor estabilidad y por lo tanto presenta tasas de traducción altas, permitiendo, por lo tanto, la expresión de niveles altos de la sulfamidasa humana activa.
En una realización preferida del segundo aspecto, la construcción génica comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85%, preferiblemente de 87%, 90%, 95%, 98%, 99% con SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, la construcción génica comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1. Una construcción génica es una molécula de ácido nucleico en la que se han dispuesto diferentes elementos de una forma específica y deseada. Estos elementos pueden ser, entre otros, secuencias de replicación, secuencias de control, secuencias codificantes, secuencias de multiclonación o secuencias de recombinación. En una realización preferida, la construcción génica es un vector. Un vector es una molécula de ácido nucleico usada para transferir material genético a una célula. Aparte de dicho material genético, un vector también puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen elementos de control de la transcripción, como promotores u operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la traducción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones. Los vectores adeno-asociados (AA V) son las partículas de vector viral, por tanto no son moléculas de ácido nucleico sino virus genéticamente modificados usados para la administración de genes en un organismo.
En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, la construcción génica es un vector que se usa para la traducción y la transcripción de un gen de interés, normalmente controlado por un promotor. Un promotor es una secuencia de nucleótidos que controla la traducción del gen de interés. El promotor está operativamente unido al gen de interés. Otro vector preferido es un vector adenoasociado. En una realización preferida, el vector adenoasociado se usa para producir partículas adenoasociadas en las que el serotipo es 1, 2, 5, 7, 8 ó 9. En una realización más preferida, el serotipo es 9. Un vector adenoasociado es un vector derivado del genoma de un virus adenoasociado (AA V) de la familia de Parvovírídae. El genoma del AA V está constituido por ácido desoxirribonucleico monocatenario (ADNss). Los AA V infectan seres humanos pero no son patógenos (es decir, no causan una enfermedad). Pueden infectar células que se dividen y células que no se dividen, y su tropismo cambia dependiendo del serotipo. El serotipo es la clasificación de los virus en grupos, dependiendo de los antígenos de su cápside. El serotipo de los AAV, determinado por las proteínas de su cápside, define el tropismo del virus y permite su entrada en un tipo de célula específico. La producción de partículas de vector adenoasociado se describe más abajo.
En una primera realización preferida del segundo aspecto, el vector de expresión comprende el promotor GAG operativamente unido a la SEO ID NO:
1.
Un vector preferido es un vector de expresión que comprende el promotor GAG, siendo la secuencia del promotor SEO ID NO: 3. Por tanto, una realización del segundo aspecto de la invención es un vector de expresión que comprende el promotor GAG, siendo la secuencia del promotor SEO ID NO: 3 adecuado para el tratamiento de MPS.
En una segunda realización preferida del segundo aspecto, el vector de expresión comprende el promotor hepático hAAT operativamente unido a la SEO ID NO: 1.
Un vector preferido es un vector de expresión que comprende el promotor hAAT, siendo la secuencia del promotor SEO ID NO: 4. Por tanto, una realización del segundo aspecto de la invención es un vector de expresión que comprende el promotor hAAT, siendo la secuencia del promotor SEO ID NO: 4 adecuado para el tratamiento de MPS.
Un aspecto del presente invención se refiere a una partícula de vector viral, también llamada vector de expresión, que lleva la secuencia de nucleótidos del primer aspecto de la invención, o la construcción génica o el vector de expresión del segundo aspecto de la invención.
Un vector de expresión preferido tiene serotipo 1, 2, 5, 7, 8 ó 9. Una partícula de vector viral más preferida tiene serotipo 9. Un vector de expresión preferido tiene serotipo 9 y comprende un
genoma viral que comprende un promotor CAG operativamente unido a SEO ID NO: 1.
Un vector de expresión preferido tiene serotipo 8 ó 9 y comprende un genoma viral que comprende un promotor hAAT operativamente unido a SEO ID NO: 1.
Un vector de expresión preferido tiene serotipo 9 y comprende un genoma viral que comprende un promotor hAAT operativamente unido a SEO ID NO: 1.
En una realización preferida, el vector de expresión es AAV-CAG-co-hu-SFMO, y más preferiblemente, AAV9-CAG-co-hu-SFMO.
En otra realización preferida, el vector de expresión es AAV-hAAT-co-huSFMO, y más preferiblemente, AAV8-hAAT-co-hu-SFMO o AAV9-hAAT-co-huSFMO. El vector más preferido que emplea el promotor hAAT es AAV9-hAATco-hu-SFMO.
En una realización preferida del tercer aspecto, la composición farmacéutica se administra por administración parenteral. La administración parenteral se refiere a la vía de administración de una composición farmacéutica en forma de una inyección o infusión. Ejemplos de administración parenteral son la inyección intravenosa, subcutánea, intracisternal e intramuscular. Preferiblemente, la composición farmacéutica se administra por administración intravenosa o intracisternal.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la secuencia de nucleótidos, la construcción génica o el vector de expresión de la invención.
En una realización preferida del cuarto aspecto de la invención, la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención se usan como un medicamento. En una realización preferida, se usan para aumentar la actividad de la sulfamidasa en el cuerpo.
En otra realización preferida, la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención se usan como un medicamento para la terapia génica o de sustitución enzimática, preferiblemente la terapia génica. Los inventores de la presente invención proponen un nuevo procedimiento de terapia génica para el tratamiento terapéutico de la MPSIIIA que es más eficaz que otros conocidos en la materia. Este procedimiento se basa en los vectores AA V que expresan la sulfamidasa. La terapia de sustitución enzimática (TSE) es un tratamiento médico que consiste en sustituir una enzima en pacientes en los que una enzima particular es deficiente o está ausente. La enzima normalmente se produce como una proteína recombinante y se administra al paciente.
En una realización adicional, la secuencia de nucleótidos, la construcción génica, el vector de expresión o la composición farmacéutica de la invención se usan preferiblemente para el tratamiento de la mucopolisacaridosis de tipo III o síndrome de Sanfilippo, preferiblemente por terapia génica. Dentro de la mucopolisacaridosis de tipo 111, el síndrome de subtipo A es especialmente susceptible de responder al tratamiento con la presente invención.
En una realización preferida del quinto aspecto de la invención, se reivindica un método para la producción de los vectores de expresión de la invención. El proceso comprende los pasos:
- i)
- proporcionar un primer vector que comprende la SEQ ID NO: 1
- entre
- una primera repetición terminal AA V y una segunda
- repetición
- terminal AAV, un promotor CAG o hAAT
- operativamente unido a la SEQ ID NO: 1; un segundo vector que
- comprende un gen rep de AAV y un gen cap de AA V; un tercer
- vector que comprende el gen con función de "adenovírus he/per';
- ii)
- cotransfectar células competentes con los vectores del paso (i);
- iii)
- cultivar las células transfectadas del paso (ii); Y
- iv)
- purificar los vectores de expresión resultantes del cultivo del paso
- (iii).
En una realización preferida, las repeticiones terminales AA V primera y segunda del primer vector son ITRs de AAV de serotipo 2. En otra realización preferida, los genes rep de AA V del segundo vector son de AA V de serotipo 2. En otra realización preferida más, los genes cap de AA V del segundo vector son de AAV de serotipo 1, 2, 5, 7, 8, o 9. Más preferiblemente, los genes cap de AA V del segundo vector son de AA V de serotipo 9. En otra realización preferida, las células competentes son células HEK293.
Los vectores virales son administrados en cantidades suficientes para transducir las células y para permitir niveles suficientes de transferencia génica y expresión para permitir un beneficio terapéutico sin efectos adversos inadecuados, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que pueden ser determinadas por aquellas personas expertas en las artes médicas.
En una realización preferida del sexto aspecto de la invención, se reivindica el método de fabricación de las composiciones farmacéuticas de la invención. Este método comprende combinar cualquier de las secuencias nucleotídicas, construcciones génicas, vectores o vectores de expresión de la invención con un vehículo o un portador farmacéuticamente aceptable que facilite su administración para origen paso a las composiciones farmacéuticas de la invención. El portador es, por ejemplo, agua, o una solución salina tamponada, con o sin un conservante. Las composiciones farmacéuticas pueden estar liofilizadas para su resuspensión al momento de su administración o en solución.
En una realización preferida del séptimo aspecto de la invención, se reivindica un método de tratamiento de un sujeto con mucopolisacaridosis tipo lilA con las secuencias nucleotídicas, construcciones génicas, vectores, vectores de expresión o composiciones farmacéuticas de la invención. Las pautas y dosis de administración de las secuencias nucleotídicas, construcciones génicas, vectores, vectores de expresión o composIciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención pueden determinarse de acuerdo con los protocolos de dosificación conocidos en el estado de la técnica. En una realización preferida, las secuencias nucleotídicas, construcciones génicas, vectores, vectores de expresión o composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se administran una sola vez.
En una realización adicional, una composición farmacéutica para el tratamiento por terapia génica de la MPS consiste en la administración parenteral de un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 90% con SEO ID NO: 1.
En otra realización adicional, se usa un vector viral que comprende el potenciador temprano del GMV/promotor de la ~-actina de pollo (GAG) y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 95% con SEO ID NO: 1, para la terapia génica para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosómico (LSO) mediante una inyección intramuscular.
En otra realización adicional, se usa un vector AA V con serotipo 1 que comprende el promotor GAG y una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 87% con SEO ID NO: 1, como un medicamento para tratar la MPS y se administra por vía intravenosa.
En otra realización adicional, se administra una composición farmacéutica que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia del 98% con SEO ID NO: 1 y un promotor ubicuo, por vía parenteral para tratar la enfermedad.
Habiendo descrito la invención en términos generales, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos que se presentan como ilustración, y no se pretende que limiten la invención.
1. Vectores AA V recombinantes
Los vectores AA V descritos en el presente documento se construyeron por transfección triple. Los materiales necesarios para hacer los vectores son: células HEK293 (que expresan genes E1), plásmido auxiliar que proporciona la función de adenovirus, plásmido auxiliar que proporciona los genes de AA V rep de serotipo 2 y genes cap del serotipo deseado (e.g. AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9) y finalmente, el plásmido de la cadena principal con ITR y la construcción de interés.
Para generar los vectores AA V que expresan la sulfamidasa, se clonó el AONc de la sulfamidasa murina en un plásmido de la cadena principal del AA V bajo el control del promotor híbrido ubicuo CAG o el promotor específico de hígado hAAT.
Los vectores (partículas de vector viral) se generaron mediante transfección sin virus auxiliar en células HEK293 usando 3 plásmidos sin modificaciones. Véase Matsushita T, et al., Gene Ther. 1998; 5:938-945 y Wright J, et al., Mol. Ther. 2005; 12:171-178. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en botellas de cultivo rotatorias (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en OMEM ( del inglés "Oulbeccos's Modified Eagle Medium") complementado con FBS (suero fetal bovino) al 10% Y después se transfectaron simultáneamente con: 1) un plásmido que lleva el casete de expresión flanqueado por las ITR virales (descrito antes); 2) un plásmido auxiliar que lleva el rep2 de AA V y los correspondientes genes cap (cap1 y cap9); y 3) un plásmido que lleva las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron por dos gradientes consecutivos de cloruro de cesio usando un protocolo estándar o un protocolo optimizado como se ha descrito previamente. Véase Ayuso E, et al., Gene Ther. 2010; 17:503-510. Los vectores se dializaron contra PBS, se filtraron, se valoraron por PCR cuantitativa y se conservaron a -80º C hasta su uso.
a. Construcción de pAAV-CAG-mu-SFMO-WPRE
Se usó el AON copia (AONc) de la sulfamidasa murina como material de partida (ID del clon: 0330015N16; Riken, Saitama, JP). El AONc se recibió dentro del plásmido pFLCI-Sgsh. Se llevó a cabo la PCR de alta fidelidad para amplificar la región que codifica para la sulfamidasa con cebadores que incluían sitios de restricción Mlul en ambos extremos. Las secuencias de los respectivos cebadores directo y reverso fueron: SEQ ID NO: 5 (Directo) CTTACTTATGACGCGTATGCACTGCCCGGGACTG y SEQ ID NO: 6 (Reverso) TATCCTATCGACGCGTTCAGAGTTCATTGTGAAGCGGTC.
El plásmido original pAAV-CAG-WPRE se generó previamente y contenía ambas ITR del genoma de AAV2, el promotor de CAG, el elemento WPRE y la señal de poliA de la ~-globina de conejo. El promotor de CAG es un promotor híbrido compuesto del potenciador temprano/intermedio de CMV y el promotor de la ~-actina de pollo. Este promotor es capaz de dirigir una potente expresión de forma ubicua. El elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de marmota (WPRE) es una secuencia de hepadnavirus que se
5 usa ampliamente como un módulo regulador de actuación en cis en diferentes
tipos de plásmidos o vectores virales. Cuando se coloca en la región 3' no
traducida de los casetes de transferencia de genes, el WPRE potencia la
producción del transgén aumentando los niveles de ARNm tanto nuclear como
citoplasmático. Véase Zanta-Boussif M, et al., Gene Ther. 2009; 16:605-619.
10 La región que codifica para la sulfamidasa amplificada por PCR se clonó en el sitio de restricción Mlul del plásmido AAV original pAAV-CAG-WPRE, yel plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-mu-SFMO-WPRE. Véase SEO ID NO:7.
15 b. Construcción de pAAV-CAG-mu-SFMO
El elemento WPRE en el plásmido pAAV-CAG-mu-SFMO-WPRE está flanqueado por dos sitios de restricción EcoRI. Para generar el plásmido pAAVCAG-mu-SFMO (Número de acceso OSM 24818), el plásmido pAAV-CAG-mu
20 SFMO-WPRE se digirió con EcoRI, para eliminar la secuencia de WPRE, y posteriormente se volvió a ligar. Véase SEO ID NO: 8.
c. Construcción de pAAV-CAG-co-hu-SFMO
25 El plásmido pAAV-CAG-mu-SFMO se digirió con Mlul y EcoRI para separar la región que codifica para la sulfamidasa murina. Posteriormente, el AONc de la sulfamidasa humana de codones optimizados (co-hu-SFMO) se digirió y se clonó en los mismos sitios de restricción para generar el plásmido pAAV-CAG-co-hu-SFMO (Número de acceso OSM 24817). Véase SEO ID NO:
30 9.
d. Construcción de pAAV9-CAG-hu-SFMO
El plásmido pAAV9-CAG-hu-SFMO se obtuvo por cotransfección de células HEK293 con el plásmido pAAV-CAG-co-hu-SFMO, un plásmido que codifica la función "he/per" de adenovirus y un plásmido que codifica para los genes rep de AAV2 y cap de AAV9.
e. Construcción de pGG2-hAAT-mu-SFMO
La región codificante de la sulfamidasa murina se escindió del plásmido pAAV-CAG-mu-SFMO-WPRE por digestión con Mlul. Esta región se clonó en el sitio Mlul en el plásmido AAV original pGG2-hAAT para dar lugar al plásmido pGG2-hAAT-mu-SFMO (Número de acceso OSM 24819). Véase SEQ ID NO:
10.
f. Construcción de pGG2-hAAT-co-hu-SFMO
La región codificante de la sulfamidasa humana de codones optimizados se escindió del plásmido pAAV-CAG-co-hu-SFMO (Número de acceso 24817) por digestión con Mlul-EcoRI. El plásmido pGG2-hAAT-mu-SFMO (Número de acceso OSM 24819) se digirió con Mlul para quitar el gen mu-SFMO y, posteriormente, la región codificante de la sulfamidasa humana de codones optimizados se clonó en este sitio por ligación de extremos romos. El plásmido resultante se llamó pGG2-hAAT-co-hu-SFMO. Véase SEQ ID NO: 11.
El plásmido pGG2-hAAT-co-hu-SFMO contenía ambas AAV2-ITRs, el promotor hAAT y la señal de poliadenilación derivada de SV40.
g. Construcción de pAAV9-hAAT-co-hu-SFMO y pAAV8-hAAT-co-huSFMO
Los vectores se generaron mediante la transfección de células HEK293 en ausencia de virus "he/per", con los tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita, 1998, supra y Wright, 2005, supra. Las células se cultivaron hasta el 70% de confluencia en botellas rodantes (RB) (Corning, Corning, NY, US) en DMEM suplementado con 10% FBS, y entonces se contransfectaron con: 1) un plásmido que lleva el casete de expresión flanqueado por las ITRs virales (pGG2-hAAT-co-hu-SFMD); 2) un plásmido "he/per" que lleva el gen rep2 de AAV y los correspondientes genes cap (cap8 o cap9); y 3) un plásmido que lleva las funciones de adenovirus "he/per". Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos de cloruro de cesio usando bien un protocolo estándar o bien un protocolo optimizado como se ha descrito previamente. Véase Ayuso, 2010, supra. Los vectores se dializaron en PBS, se filtraron, se titularon por qPCR y se almacenaron a -80º C hasta su uso.
El plásmido pGG2-hAAT-co-hu-SFMD contenía ambas AAV2-ITRs, el promotor hAAT y la señal de poliadenilación derivada de SV40. El promotor hAAT es un promotor híbrido compuesto de 4 repeticiones en tándem del potenciador de la región control de hepatocitos (HCR) de la apolipoproteína E y el promotor de la alfa-antitripsina humana. Su expresión está limitada a los hepatocitos. Véase Mingozzi F, et al. J. Clin. Invest. 2003; 111: 1347-1356.
Los vectores de la presente invención se construyeron de acuerdo a las técnicas de biología molecular bien conocidas en la técnica. Véase Brown T., "Gene Cloning" (Chapman & Hall, London, Reino Unido, 1995); Watson R., et a/., "Recombinant DNA", 2ª Ed. (Scientific American Books, New York, NY, EE.UU., 1992); Alberts B., et a/., "Molecular Biology of the Cell" (Garland Publishing Inc., New York, NY, EE.UU., 2008); Innis M., et a/., Eds., "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications" (Academic Press Inc., San Diego, CA, EE.UU., 1990); Erlich H., Ed., "PCR Technology. Principies and Applications for DNA Amplification" (Stockton Press, New York, NY, EE.UU., 1989); Sambrook J., et a/., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU., 1989); Bishop T., et a/., "Nucleic Acid and Protein Sequence. A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1987); Reznikoff W., Ed., "Maximizing Gene Expression" (Butterworths Publishers, Stoneham, MA, EE.UU., 1987); Davis L., et a/., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier Science Publishing Co., New York, NY, EE.UU., 1986), Schleef M., Ed., "Plasmid for Therapy and Vaccination" (Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Alemania, 2001).
2. Animales
5 Se usó una colonia de ratones congénicos deficientes en sulfamidasa C57BI/6 (MPSIIIA). Véase Crawley A, et al., Braín Res. 2006; 1104:1-17. Los ratones control sanos y los afectados por MPSIIIA se criaron a partir de fundadores heterozigotos. El genotipo se determinó por análisis de PCR del ADN genómico de muestras cortadas de la cola, que amplifica una secuencia
10 que abarca la mutación, y posterior digestión con la enzima de restricción MspA11, como se ha descrito previamente. Véase Bhattacharyya R, et al., Glyeobíology 2001; 11 :99-103. Los ratones se alimentaron a voluntad con una dieta estándar (Panlab, Barcelona, ES) y se mantuvieron en un ciclo de luzoscuridad de 12 h (las luces se encendían a las 9:00 A.M.).
3. Administración del vector y recolección de la muestra
Para la administración intravenosa de los vectores AAV, se inyectó una 1012
dosis total de genomas del vector AA V adecuado en animales con
20 MPSIIIA de 2 meses de edad por la vena de la cola. Para la inyección intramuscular, los animales con MPSIIIA de 2 meses de edad se anestesiaron con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg), y se inyectó una dosis total de 1012 genomas del vector AA V adecuado en 6 músculos de las extremidades traseras (cuádriceps, gastrocnemio y músculo tibial anterior
25 de ambas patas). A los 10 meses de edad, los ratones se anestesiaron y después se perfundieron por vía transcardíaca con 10 mi de PBS para eliminar completamente la sangre de los tejidos. Se recogieron el cerebro entero y múltiples tejidos somáticos (incluyendo el hígado, bazo, páncreas, riñón, pulmón, corazón, músculo esquelético y testículos) y se congelaron en
30 nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC o se sumergieron en formalina para posteriores análisis histológicos.
4. Análisis de ARN
El ARN total se obtuvo de muestras de músculo esquelético y de hígado usando el reactivo de aislamiento TriPure (Rache Diagnostics, Barcelona, ES) y se analizó por Northern blot. Las transferencias se hibridaron con una sonda de sulfamidasa murina, marcada con 32p-dCTP por cebado aleatorio con Readyto-Go DNA Labelling Beads (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US).
5. Actividad de la sulfamidasa y cuantificación de glicosaminoglicanos
Las muestras de hígado, músculo esquelético y cerebro se trataron con ultrasonidos y se analizó la actividad de la sulfamidasa en los líquidos sobrenadantes con un sustrato fluorogénico derivado de 4-metilumbeliferona (Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL) como se ha descrito previamente. Véase Karpova E, et al., J. Inherít. Metab. Oís. 1996; 19:278-285. Los niveles de actividad de la sulfamidasa se normalizaron respecto a la cantidad total de proteína, cuantificados usando el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, US).
Para la cuantificación de los glicosaminoglicanos (GAG), se pesaron muestras de tejido y después se hicieron digerir con proteinasa K y los extractos se clarificaron por centrifugación y filtración. Los niveles de GAG en los extractos de tejidos y en la orina se determinaron usando el kit de glicosaminoglicano sulfatado de Blyscan (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB) con 4-sulfato de condroitina como referencia. Los niveles de GAG en los tejidos se normalizaron respecto al peso del tejido húmedo y en la orina respecto a la concentración de creatinina, medidos con un kit específico (Horiba ABX, Irvine, CA, US).
6. Análisis histológico
Los tejidos se fijaron durante 12-24 h en formalina, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones, seguido de la recuperación del epítopo inducida por calor (tampón de citrato, pH 6). Para la detección inmunohistoquímica de LAMP1, las secciones en parafina se incubaron durante la noche a 4ºC con anticuerpos anti-LAMP1 de rata (1D4B; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, US) diluido hasta 1:100 y posteriormente las secciones se incubaron con anticuerpos anti-rata de conejo biotinilado (Dako, Glostrup, DK) a 1 :300. La señal de LAMP1 se amplificó incubando las secciones con el kit de tinción de ABC-Peroxidase (Thermo Scientific, Waltham, MA, US) a 1:100 y se visualizaron usando 3,3-diaminobencidina (SigmaAldrich, St. Louis, MO, US) como cromógeno. Se obtuvieron imágenes de campo claro con un microscopio óptico (Eclipse E800; Nikon, Tokyo, JP). Para la inmunotinción con parvalbúmina y calbindina, las secciones de parafina se incubaron durante la noche a 4ºC con D28k anti-calbindina de conejo (Swant, Marly, CH) diluido a 1 :2.000 o con anti-parvalbúmina de conejo (Swant, Marly, CH) diluido a 1:100. Después, las muestras se incubaron con las IgG anticonejo de cabra biotinilada (Vector Labs., Burlingame, CA, US), y con estreptavidina-Alexa 488 (1:100, Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, US), y los núcleos se tiñeron con TOPRO-3. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal (Leica Microsystems, Heidelberg, DE).
Para la inmunotinción doble de LAMP1 y Mac2, las secciones primero se incubaron durante la noche a 4ºC con anticuerpos anti-LAMP1 de rata a 1 :100, después con anticuerpos anti-rata de conejo biotinilado a 1 :300, seguido de incubación con estreptavidina-Alexa 488 (1 :300). Después, las secciones se incubaron con anti-Mac2 de conejo a 1 :50, después con anti-conejo de cabra biotinilado a 1 :300, seguido de una incubación con estreptavidina-Alexa 568 (1 :300; Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA, US). Finalmente, los núcleos se tiñeron con Hoechst (1 :100; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US).
7. Análisis por transferencia western
Se homogeneizaron mitades de cerebelo en tampón de lisis de proteína. Se hicieron correr 10 microgramos de proteína en un SDS-PAG E al 10% (peso/vol), se transfirieron a membranas de poli(difluoruro de vinilideno) y se hibridaron durante la noche a 4ºC con anticuerpos primarios contra calbindina (Swant, Marly, CH) y a-tubulina (Abcam, Cambridge, MA, US). La detección se llevó a cabo usando un anticuerpo anti-conejo de cerdo marcado con peroxidasa de rábano picante (Dako, Glostrup, DK) y el reactivo de detección
5 de transferencia western ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, US).
8. Análisis por microscopio electrónico de transmisión
10 Los ratones se sacrificaron mediante una sobredosis de isofluorano (Isofluo, Labs. Esteve, Barcelona, ES) y se perfundieron por la vena cava inferior con 1 mi de glutaraldehído al 2,5% y paraformaldehído al 2%. Se seccionaron una pequeña porción (aproximadamente 1 mm3) del lóbulo lateral del hígado y del culmen del cerebelo y se incubaron durante 2 horas a 4º C en
15 el mismo agente de fijación. Después de lavar en tampón de cacodilato frío, las muestras se fijaron posteriormente en tetraóxido de osmio al 1%, se tiñeron en acetato de uranilo acuoso, y después se deshidrataron a través de una serie escalonada de etanol y se insertaron en resina epoxídica. Se tiñeron secciones ultrafinas (600-800 Á) de los bloques de resina usando citrato de plomo y se
20 examinaron en un microscopio electrónico de transmisión (H-7000; Hitachi, Tokyo, JP).
9. Análisis estadístico
25 Todos los resultados se expresan como media ± EEM. Las comparaciones estadísticas se hicieron usando el ensayo t o ANOVA de un factor. Se consideró la significancia estadística si P < 0,05.
30 Ejemplo 1 Administración intramuscular de AAV1-CAG-mu-SFMO-WPRE
Se inyectó una dosis total de 1012 genomas de vector AAV1-CAG-muSFMD-WPRE en 6 músculos de las extremidades traseras (cuádriceps, gastrocnemio y músculo tibial anterior de ambas patas) de ratones con MPSIIIA macho y hembra de 2 meses de edad.
Ocho meses después de la administración, los músculos inyectados presentaban niveles altos de expresión y actividad de la sulfamidasa derivada del vector, pero se observaron niveles muy bajos de actividad de la sulfamidasa en el suero (6-7% de los ratones control), lo que sugería una eficacia de secreción baja del músculo esquelético. Véase las figuras 1 A Y 1 B. Además, se observó una expresión de la sulfamidasa derivada del vector muy baja pero significativa en el hígado de estos ratones, lo que indicaba que, en el momento de la inyección, el vector se filtraba del músculo esquelético a la circulación y se transducía al hígado. Incluso con los bajos niveles de actividad de la sulfamidasa alcanzados en sangre, se observó la corrección de la acumulación de GAG en el hígado, y una reducción significativa en algunos otros tejidos somáticos (bazo, corazón, páncreas), pero no en otros (riñón, pulmón). Véase la figura 1 C. No se logró una reducción del almacenamiento de GAG en el cerebro.
Ejemplo 2
Administración intramuscular de AAV8-CAG-mu-SFMO-WPRE
Se inyectó una dosis total de 1012 genomas de vector AAV8-CAG-muSFMD-WPRE en 6 músculos de las extremidades traseras (cuádriceps, gastrocnemio y músculo tibial anterior de ambas patas) de ratones con MPSIIIA macho y hembra de 2 meses de edad.
Ocho meses después de la administración, los músculos inyectados presentaban niveles de actividad de la sulfamidasa similares a los de un animal control sano. Véase la figura 2A. Se observaron niveles bajos de actividad de la sulfamidasa en el suero (10-15% de los ratones control). Véase la figura 2B. También se observó la filtración del vector al hígado, puesto que se vio expresión y actividad de la sulfamidasa derivada del vector en el hígado, incluso con niveles más altos que en ratones tratados con AAV1 intramuscular.
Véase el ejemplo 1. La corrección de la acumulación de GAG se vio en el hígado y el bazo, y se observó una reducción mayor en otros tejidos somáticos (corazón, páncreas, vejiga urinaria), pero los riñones y los pulmones permanecieron sin corregir en gran medida. Véase la figura 2C. No se logró reducción del almacenamiento de GAG en el cerebro.
Ejemplo 3
Administración intravenosa de AA V8-CAG-mu-SFMO-WPRE
Se inyectó una dosis total de 1012 genomas de vector AAV8-CAG-mu-SFMD-WPRE en la vena de la cola de ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad.
Ocho meses después de la administración, los machos tratados presentaban una actividad de la sulfamidasa en el hígado similar a los niveles de los ratones control, pero 4 veces inferior en hembras. Véase la figura 3A. Consecuentemente, la actividad de la sulfamidasa en suero fue alta en machos (con niveles similares a los de los ratones control) e inferior en hembras (25% de los ratones de control). Véase la figura 3B. Estos niveles altos de sulfamidasa en suero fueron capaces de corregir la acumulación de GAG en el hígado, corazón, bazo, páncreas y vejiga urinaria, y reducirla significativamente en los pulmones, pero no en los riñones. Véase la figura 3C para la cuantificación de GAG en el hígado. No se observó reducción de GAG en el cerebro.
Ejemplo 4
Administración intravenosa de AAV8-hAA T-mu-SFMO
Se inyectó una dosis total de 1012 genomas de vector AAV8-hAAT-muSFMD en la vena de la cola de ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad.
Ocho meses después de la administración, los machos tratados presentaban un nivel de actividad de la sulfamidasa en el hígado 500% más alto que en los animales control. En las hembras, el nivel de la sulfamidasa en el hígado alcanzó el mismo nivel que en los ratones control. Véase la figura 4A.
La actividad de la sulfamidasa en suero fue consecuentemente mayor en machos que en hembras (500% en machos frente a 160% en hembras). Véase la figura 4B. Estos niveles suprafisiológicos de la sulfamidasa en suero fueron capaces de corregir la acumulación de GAG en todos los órganos somáticos, incluyendo el riñón. Véase la figura 4C para la cuantificación de GAG en el hígado.
Los machos tratados mostraron unos niveles bajos de actividad de la sulfamidasa y una acumulación de GAG reducida en el cerebro. Véase las figuras 5A y B. Las células de Purkinje del cerebelo de los machos tratados presentaron menos inclusiones electrodensas cuando se examinaron por microscopía electrónica. Véase la figura 5C. El tratamiento intravenoso con el vector AAV8-hAAT-mu-SFMD ("iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD") logró la corrección de la patología somática, pero sólo mejoró la neurodegeneración característica de los ratones con MPSIIIA.
La ultraestructura de la corteza cerebral se analizó por microscopía electrónica de transmisión. No se observaron diferencias distinguibles en la ultraestructura de las neuronas corticales occipitales de los sujetos con MPSIIIA tratados y no tratados. Se observó un claro agrandamiento del compartimento lisosómico en las células gliales perineuronales de los ratones con MPSIIIA no tratados que estaba prácticamente ausente en los animales tratados. Véase la figura 10. Estos resultados sugieren que la actividad alta y sostenida de la sulfamidasa en sangre previene la degeneración neuronal en sujetos con MPSIIIA.
A los 17 meses de edad, todos los machos con MPSIIIA no tratados habían muerto, mientras que 100% de los machos tratados con iv-AAV8-hAATmu-SFMD todavía estaban vivos (Supervivencia media = 14,2 ± 0,5 frente a 18,8 ± 0,9 meses para los machos con MPSIIIA no tratados y tratados respectivamente, p= 0,001) Esta mejora no era evidente en el grupo de hembras en el que tanto los sujetos tratados como los no tratados mostraron tasas de supervivencia similares (Supervivencia media = 13,1 ± 0.5 frente a 13,9 ± 1,2 meses para las hembras con MPSIIIA no tratadas y tratadas respectivamente, p= 0,467). Este resultado se corresponde con los niveles
menores de actividad de la sulfamidasa medidos en el suero y el cerebro y el menor grado de reducción de GAG observado en los animales hembra. Véase la figura 11.
La mayor supervivencia de los machos con MPSIIIA tratados con iv-AAV8-hAAT-mu-SFMD demuestra además el potencial terapéutico de niveles sostenidos por encima de los fisiológicos de la sulfamidasa en sangre, obtenidos por transferencia génica dirigida al hígado. El tratamiento con ivAAV8-hAAT-mu-SFMD prolongó el tiempo de vida de los sujetos macho con MPSIIIA. Véase la figura 11.
Ejemplo 5
Administración intravenosa de AAV9-CAG-mu-SFMO
Se inyectó una dosis total de 1012 genomas de vector AAV9-CAG-muSFMD en ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad por la vena de la cola.
Tanto los machos como las hembras tratados mostraron niveles altos de la sulfamidasa en suero (500% de los niveles control en los machos y 150% en las hembras), los cuales corrigieron con eficacia todos los tejidos somáticos en ambos sexos. Además, dada la alta eficacia de transducción en el cerebro del serotipo AA V 9, se observó una actividad significativa de la sulfamidasa en los cerebros de ambos sexos, la cual corrigió de forma eficaz el almacenamiento de GAG en todas las regiones del cerebro. Véase las figuras 6A y 6B. La neuroinflamación (astrogliosis y microgliosis) característica de la MPSIIIA, estaba completamente normalizada en los ratones tratados con AAV9. Además los ratones tratados con AAV9 se comportaron mejor en el ensayo de RotaRod que los animales no tratados. Véase la figura 6C.
El tratamiento intravenoso con el vector AAV9-CAG-mu-SFMD ("ivAAV9-CAG-mu-SFMD") prolongó el tiempo de vida de los animales con MPSIIIA. Véase la figura 12. A los 17 meses de edad todos los machos con MPSIIIA no tratados habían muerto, mientras que 100% de los machos tratados con iv-AAV9-CAG-mu-SFMD todavía estaban vivos a los 20 meses de edad (p< 0,001 y p= 0,037 para machos con MPSIIIA tratados frente a no tratados, respectivamente). Véase la figura 12. El grupo de hembras mostró una mejora similar pero menos impresionante (p= 0,063 Y p= 0,057 para hembras con MPSIIIA tratadas frente a no tratadas, respectivamente). Este resultado se corresponde con los niveles menores de actividad de sulfamidasa medidos en el suero de los animales hembra después de tratamiento con iv-AAV9-CAG-mu-SFMD.
Ejemplo 6
Administración intracisternal de AA V9-CAG-mu-SFMO
Se inyectó una dosis total de 5x1 010 genomas de vector AAV9-CAG-mu-SFMD en la cisterna magna de animales con MPSIIIA de 2 meses de edad, anestesiados, en un volumen total de 5 ¡ll.
Tres meses después de la administración, se alcanzó una corrección completa de la acumulación de GAG en todo el cerebro de los animales tratados. Véase la figura 8. También se encontró expresión de la sulfamidasa derivada del vector en el hígado de los animales tratados, sugiriendo que después de un suministro intracisternal, algunos vectores alcanzan el torrente sanguíneo y llegan al hígado. De acuerdo con este resultado, la acumulación de GAG también se normalizó en el hígado.
El tratamiento intracisternal con el vector AAV9-CAG-mu-SFMD ("ic-AAV9-CAG-mu-SFMD") prolongó el tiempo de vida de los animales con MPSIIIA. Véase la figura 12. A los 17 meses de edad todos los machos con MPSIIIA no tratados habían muerto, mientras que 100% de los machos tratados con ic-AAV9-CAG-mu-SFMD todavía estaban vivos a los 20 meses de edad (p< 0,001 y p= 0,037 para machos con MPSIIIA tratados frente a no tratados, respectivamente). Véase la figura 12. El grupo de hembras mostró una mejora similar pero menos impresionante (p= 0,063 Y p= 0,057 para hembras con MPSIIIA tratadas frente a no tratadas, respectivamente). Este resultado se corresponde con los niveles menores de actividad de sulfamidasa medidos en el suero de los animales hembra después de tratamiento con ic-AAV9-CAG-mu-SFMD.
Ejemplo 7
Administración intravenosa de AA V9-CAG-co-hu-SFMO (secuencia de la
sulfamidasa humana de codones optimizados)
El uso de codones de la sulfamidasa humana se optimizó con el fin de reducir la dosis administrada de vector. El objeto de este procedimiento era estabilizar el ARNm de la sulfamidasa y aumentar su traducción, favoreciendo así una producción más alta de sulfamidasa a partir de la misma dosis de vector.
Se administraron 1012 genomas virales (vg) de un vector AAV9-CAG-huco-SFMD por vía intravenosa a ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad por la vena de la cola. Se obtuvo un aumento de al menos 3 veces del nivel de la sulfamidasa en el hígado en comparación con el gen no optimizado. Véase la figura 9.
Ejemplo 8
Administración intravenosa de AAV9-hAA T-co-hu-SFMO
Siguiendo el mismo protocolo del ejemplo 7, se administran 1012 vg de un vector AAV9-hAAT-hu-co-SFMD por vía intravenosa a ratones con MPSIIIA de 2 meses de edad por la vena de la cola. El nivel de la sulfamidasa se evalúa de la misma forma que el ejemplo 7. Los resultados muestran un aumento significativo con respecto al gen no optimizado.
Ejemplo 9 Administración intracisternal de distintos serotipos de AAV-CAG-GFP-WPRE
Para evaluar el tropismo en el cerebro de los diferentes serotipos de AA V cuando se administran en el líquido cefalorraquídeo, se administraron 5x1010 genomas de vectores AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8 y AAV9 que llevan el gen reportero GFP (construcción CAG-GFP-WPRE) a ratones con MPSIIIA por vía intracisternal.
Se logró una transducción significativa de las células en el puente troncoencefálico con todos los serotipos, con las eficacias más altas y más bajas logradas por AAV9 y AAV1, respectivamente. En el cerebelo, la señal reportera estaba situada principalmente en axones identificados morfológicamente como fibras musgosas, y en especial con AAV1 y AAV9, pero también con los otros serotipos, excepto para AAV8, en las neuronas de Purkinje. Se observaron mayores diferencias en la eficacia de la transferencia génica entre los serotipos en regiones del cerebro distantes. Se transdujeron muchas células en la corteza cerebral, bulbo olfatorio e hipocampo en el grupo al que se inyectó AAV9, yen menor medida en el grupo de AAV7, mientras que no se observaron cuerpos positivos para GFP con los serotipos AAV1, AAV2, AAV5 o AAV8 en estas zonas. En el hipotálamo, el serotipo AAV9 transdujo neuronas eficazmente, y el serotipo AAV1 dio lugar a algunas células GFP+ dispersas. Se podían observar axones positivos para GFP ocasionales por todo el cerebro en todos los grupos, que posiblemente se proyectaban desde las neuronas infectadas cerca de la cisterna magna. Los vectores AAV9 mostraron la mayor eficacia de transducción entre los diferentes serotipos. Véase la figura
7.
Ejemplo 10
Escalado de la administración intracisternal de AA V9-CAG-co-hu-SFMO
para uso clínico
Como primer paso hacia la potencial aplicación clínica de la administración intracisternal de AAV9, se evaluó si el patrón de transducción observado en ratones se mantenía en un animal con un tamaño de cerebro más relevante. Para este fin, se administró AAV9-CAG-GFP-WPRE 1 ,5x1 012 vg/kg en la cisterna magna de perros Beagle sanos. Se inyectó en un total de 4 perros: en dos animales (perros nº 1 y 4) se usó una bomba para infundir la disolución de vector viral con un flujo similar a la velocidad de formación de LCR (1 ml/10 minutos), y en los otros dos perros (perros nº 2 y 3) el vector se infundió en unos segundos. La figura 13 muestra la detección inmunológica de GFP en muestras del perro 1. Se observó un fuerte marcaje en regiones cercanas a la cisterna magna, tales como la médula oblonga, el puente troncoencefálico y el hipotálamo. Véase la figura 13b, c y d. En el cerebelo, a pesar de estar cerca del punto de inyección, sólo se transdujeron unas pocas
células de Purkinje aisladas, mientras que en el hipocampo, una región lejos de la cisterna, se produjo la transducción eficaz del giro dentado. Véase la figura 13 i Y j. La distribución de los virus por el LCR permitió la transducción de zonas distantes al punto de inyección, tales como el rinencéfalo y la corteza 5 frontal, parietal y occipital, donde las áreas más superficiales mostraron mayor transducción. Véase la figura 13e, h y f. Finalmente, el vector alcanzó también la médula espinal y se detectó la señal GFP en motoneuronas ventral es y astrocitos de los ganglios cercanos. Véase la figura 13a. La comparación semicuantitativa de la localización de GFP en los cuatro perros sugirió que la
10 velocidad de infusión de la solución viral no influye significativamente en la eficacia o la distribución del vector AAV9. Véase la tabla 1.
Finalmente, igual que en las observaciones hechas en ratones después de la administración intracisternal de AAV9, también se detectó GFP en el hígado de los perros Beagle, en el que se transdujo una media de 3,7% de los
15 hepatocitos. Véase la figura 14. Estos resultados sugieren la distribución sistémica del vector AAV9 después de administración intracisternal.
- Zona cerebral
- Perro 1 Perro 2 Perro 3 Perro 4
- Corteza frontal
- +++ +++ ++ +++
- Corteza parietal
- ++++ +++ +++ +++
- Corteza occipital
- ++++ ++++ ++++ ++
- Hipocampo
- ++++ ++++ +++ +++
- Hipotálamo
- ++++ N.O. ++++ +
- Cerebelo
- + ++ ++ N.O.
- Tronco cerebral
- +++ +++ +++ ++
- Médula oblonga
- +++ ++++ +++ +++
- Médula espinal
- +++ ++ ++ N.O.
Tabla 1. Análisis semicuantitativo de la transducción en el cerebro después de
20 la administración ic de vectores AAV9-GFP en perros Beagle sanos. Tres observadores independientes hicieron el recuento en varias imágenes de cada zona del cerebro y se representa la media. Los criterios semicuantitativos eran los siguientes: (+) menos de 10 células positivas para GFP/campo de microscopio 10X; (++) 10-30 células positivas para GFP/campo de microscopio 10x; (+++) 30-60 células positivas para GFP/campo de microscopio 10x y (++++) más de 60 células positivas para GFP/campo de microscopio 10x. N.O. no determinado.
Ejemplo 11
Eficacia funcional de la sulfamidasa humana de codones optimizados
(co-hu-SFMO)
Se diseñaron y obtuvieron casetes de expresión que incluían una versión optimizada de los codones de la secuencia de ADNc de la sulfamidasa humana (co-hu-SFMD). La optimización de codones se realizó para aumentar la eficacia de la producción de la proteína SFMD en seres humanos usando los ARNt más abundantes para la especie y teniendo en cuenta también su perfil de traducción particular. Se usaron ratones para los propósitos experimentales debido a su similitud con los seres humanos y la capacidad predictiva del modelo animal del ratón.
Para asegurar que esta secuencia conducía a la producción de sulfamidasa activa, se inyectó por vía intravenosa en ratones macho con MPSIIIA 1x102 vg de un vector AAV9 en el que se expresaba co-hu-SFMD bajo el control del promotor de CAG ubicuo. La actividad de la sulfamidasa en el suero de estos ratones alcanzó niveles similares a los de los animales sanos control y se mantuvo durante la duración del estudio (2 meses). Véase la figura 15a. Esta actividad sostenida de la sulfamidasa condujo a la normalización del contenido de GAG en los hígados de estos animales, similar a lo que se había observado con el transgén murino administrado mediante AAV9. Véase la figura 15b.
Todas las publicaciones mencionadas en lo que antecede se incorporan en su totalidad por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito con algún detalle con el propósito de claridad y comprensión, el experto en la materia leyendo esta
descripción apreciará que se pueden hacer cambios en la forma y el detalle sin salirse del alcance de la invención y las reivindicaciones adjuntas.
Claims (26)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Una secuencia aislada de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 85% con la SEO ID NO: 1 que codifica para la proteína SEO ID NO: 2.
-
- 2.
- La secuencia aislada de nucleótidos según la reivindicación 1, donde dicha secuencia es SEO ID NO: 1.
-
- 3.
- Una construcción génica que comprende la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.
-
- 4.
- La construcción génica según la reivindicación 3, donde dicha construcción génica es un vector.
-
- 5.
- La construcción génica según la reivindicación 4, donde dicho vector es un vector de expresión.
-
- 6.
- El vector de expresión según la reivindicación 5, donde dicho vector es un vector adenoasociado.
-
- 7.
- El vector de expresión según la reivindicación 6, donde el serotipo es 1, 2,5,7,8 ó 9.
-
- 8.
- El vector de expresión según la reivindicación 7, donde el serotipo es 9.
-
- 9.
- El vector de expresión según la reivindicación 6, que comprende un promotor CAG operativa mente unido a SEO ID NO: 1.
-
- 10.
- El vector de expresión AAV9-CAG-co-hu-SFMD según la reivindicación 9 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 9.
-
- 11.
- El vector plasmídico pAAV-CAG-co-hu-SFMO según la reivindicación 10 con número de acceso OSM 24817.
-
- 12.
- El vector de expresión según la reivindicación 5, que comprende un promotor hAAT operativa mente unido a SEQ ID NO: 1.
-
- 13.
- El vector plasmídico pAAV-hAAT-co-hu-SFMO según la reivindicación 12 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 8 ó 9.
-
- 14.
- El vector plasmídico pAAV-hAAT-co-hu-SFMO según la reivindicación 13 donde el serotipo del vector adeno-asociado es 9.
-
- 15.
- Una composición farmacéutica que comprende: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.
-
- 16.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 15, para administración parenteral, preferiblemente para administración intravenosa o intracisternal.
-
- 17.
- La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.
-
- 18.
- La composición farmacéutica según la reivindicación 15, que comprende una cantidad terapéutica mente eficaz del vector adeno-asociado de serotipo 9 según la reivindicación 9 para administración intracisternal.
-
- 19.
- La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1
ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para su uso como medicamento. -
- 20.
- La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para aumentar la actividad de la sulfamidasa en el cuerpo.
-
- 21.
- La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para su uso como un medicamento para la terapia de sustitución enzimática o la terapia génica, preferiblemente para la terapia génica.
-
- 22.
- La secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para el tratamiento de las mucopolisacaridosis, preferiblemente la mucopolisacaridosis de tipo III o el síndrome de Sanfilippo.
-
- 23.
- Un método para producir los vectores de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 que comprende los pasos siguientes:
i) proporcionar un primer vector que comprende la SEQ ID NO: 1 entre una primera repetición terminal AA V Y una segunda repetición terminal AAV, un promotor CAG o hAA T operativamente unido a la SEQ ID NO: 1; un segundo vector que comprende un gen rep de AA V Y un gen cap de AAV; un tercervector que comprende el gen con función de "adenovirus he/per'; ii) cotransfectar células competentes con los vectores del paso (i); iii) cultivar las células transfectadas del paso (ii); y iv) purificar los vectores de expresión resultantes del cultivo del paso(iii). -
- 24.
- Una célula aislada transfectada con: la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; o el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14.
-
- 25.
- Un método para la fabricación de las composiciones farmacéuticas según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 que comprende combinar la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 y al menos un vehículo o un portador farmacéuticamente aceptable.
-
- 26.
- Uso de la secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2; la construcción génica según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5; el vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14; o la composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la mucopolisacaridosis tipo lilA.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10382169 | 2010-06-10 | ||
EP20100382169 EP2394667A1 (en) | 2010-06-10 | 2010-06-10 | Vectors and sequences for the treatment of diseases |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2388620A1 true ES2388620A1 (es) | 2012-10-17 |
ES2388620B1 ES2388620B1 (es) | 2013-11-13 |
Family
ID=42710651
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES201130978A Active ES2388620B1 (es) | 2010-06-10 | 2011-06-10 | Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades. |
ES11724246.1T Active ES2659031T3 (es) | 2010-06-10 | 2011-06-10 | Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES11724246.1T Active ES2659031T3 (es) | 2010-06-10 | 2011-06-10 | Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades |
Country Status (31)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US8999948B2 (es) |
EP (2) | EP2394667A1 (es) |
JP (1) | JP6066902B2 (es) |
KR (1) | KR101952966B1 (es) |
CN (1) | CN103037905B (es) |
AR (1) | AR081868A1 (es) |
AU (1) | AU2011263697B2 (es) |
BR (1) | BR112012031067B1 (es) |
CA (1) | CA2801639C (es) |
CY (1) | CY1119892T1 (es) |
DK (1) | DK2579900T3 (es) |
ES (2) | ES2388620B1 (es) |
HR (1) | HRP20180146T1 (es) |
HU (1) | HUE038190T2 (es) |
IL (1) | IL223274A (es) |
LT (1) | LT2579900T (es) |
ME (1) | ME02940B (es) |
MX (1) | MX2012014372A (es) |
MY (1) | MY172292A (es) |
NO (1) | NO2579900T3 (es) |
NZ (1) | NZ603901A (es) |
PL (1) | PL2579900T3 (es) |
PT (1) | PT2579900T (es) |
RS (1) | RS57458B1 (es) |
RU (1) | RU2588667C2 (es) |
SG (2) | SG186136A1 (es) |
SI (1) | SI2579900T1 (es) |
TW (1) | TWI547288B (es) |
UA (1) | UA112841C2 (es) |
WO (1) | WO2011154520A1 (es) |
ZA (1) | ZA201209103B (es) |
Families Citing this family (58)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2605798A1 (en) | 2010-07-12 | 2013-06-26 | Universidad Autònoma de Barcelona | Gene therapy composition for use in diabetes treatment |
US20130039888A1 (en) * | 2011-06-08 | 2013-02-14 | Nationwide Children's Hospital Inc. | Products and methods for delivery of polynucleotides by adeno-associated virus for lysosomal storage disorders |
EP2492347A1 (en) * | 2012-05-22 | 2012-08-29 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Methods for the production of vectors |
EP2692868A1 (en) | 2012-08-02 | 2014-02-05 | Universitat Autònoma De Barcelona | Adeno-associated viral (AAV) vectors useful for transducing adipose tissue |
KR102346455B1 (ko) * | 2013-03-15 | 2022-01-04 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | Mpsi 치료를 위한 조성물 및 방법 |
KR20220119187A (ko) * | 2013-05-15 | 2022-08-26 | 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미네소타 | 중추 신경계로의 아데노-연관 바이러스 매개 유전자 전달 |
RU2018128780A (ru) * | 2013-07-26 | 2018-12-05 | Юниверсити Оф Айова Рисерч Фаундейшн | Способы и композиции для лечения болезней мозга |
RS57842B1 (sr) * | 2014-04-01 | 2018-12-31 | Swedish Orphan Biovitrum Ab Publ | Modifikovana sulfamidaza i njena proizvodnja |
CA2947468C (en) * | 2014-05-14 | 2022-10-25 | Laboratorios Del Dr. Esteve S.A. | Adenoassociated virus vectors for the treatment of lysosomal storage disorders |
CA2960912A1 (en) * | 2014-09-16 | 2016-03-24 | Universitat Autonoma De Barcelona | Adeno-associated viral vectors for the gene therapy of metabolic diseases |
GB201420139D0 (en) | 2014-11-12 | 2014-12-24 | Ucl Business Plc | Factor IX gene therapy |
US11085055B2 (en) | 2014-12-05 | 2021-08-10 | Universitat Autonoma De Barcelona | Viral vectors for the treatment of diabetes |
EP3233131A1 (en) | 2014-12-16 | 2017-10-25 | Board of Regents of the University of Nebraska | Gene therapy for juvenile batten disease |
JP6956635B2 (ja) * | 2014-12-17 | 2021-11-02 | フンダシオン パラ ラ インベスティガシオン メディカ アプリカダ | ウィルソン病及び他の状態の処置に使用するための核酸構築物及び遺伝子治療ベクター |
KR102526616B1 (ko) | 2014-12-17 | 2023-04-27 | 푼다시온 파라 라 인베스티가시온 메디카 아플리카다 | 윌슨병 및 기타 병태의 치료에 사용되기 위한 핵산 구조물 및 유전자 치료용 벡터 |
WO2016110518A1 (en) | 2015-01-07 | 2016-07-14 | Universitat Autònoma De Barcelona | Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes |
CN107635575A (zh) * | 2015-03-10 | 2018-01-26 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 重组glut1腺相关病毒载体构建体以及用于恢复glut1表达的相关方法 |
RS63927B1 (sr) * | 2015-05-15 | 2023-02-28 | Regenxbio Inc | Povezani adenovirus za terapijsku isporuku u centralni nervni sistem |
EP3101125A1 (en) * | 2015-06-05 | 2016-12-07 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses |
BR112018007453A2 (pt) * | 2015-11-05 | 2018-10-23 | Bamboo Therapeutics Inc | genes modificados de ataxia de friedreich e vetores para a terapia gênica |
MA43968A (fr) | 2016-02-03 | 2018-12-12 | Univ Pennsylvania | Thérapie génique pour traiter la mucopolysaccharidose de type i |
IL305449A (en) | 2016-04-15 | 2023-10-01 | Univ Pennsylvania | Gene therapy for the treatment of type II mucositis |
MX2018012537A (es) | 2016-04-15 | 2019-02-25 | Univ Pennsylvania | Terapia de genes para tratar hemofilia a. |
WO2018011572A1 (en) * | 2016-07-12 | 2018-01-18 | The University Of Manchester | Gene therapy |
EP3494220A1 (en) | 2016-08-02 | 2019-06-12 | Editas Medicine, Inc. | Compositions and methods for treating cep290 associated disease |
KR20190055086A (ko) | 2016-08-19 | 2019-05-22 | 칼리뮨, 인코포레이티드 | 재조합 자기-상보적인 아데노-부속 바이러스를 이용한 병태의 치료 방법 및 조성물 |
AU2017333336B2 (en) * | 2016-09-30 | 2023-11-09 | Esteve Pharmaceuticals, S.A. | Adenoassociated virus vectors for the treatment of mucopolysaccharidoses |
WO2018106956A2 (en) | 2016-12-07 | 2018-06-14 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | IL-1RA CDNAs |
GB201707212D0 (en) * | 2017-05-05 | 2017-06-21 | Ucl Business Plc | Gene therapy for ciliopathies |
US20210324354A1 (en) * | 2017-05-12 | 2021-10-21 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Sulfamidase (sgsh) variants, vectors, compositions and methods and uses for treating mucopolysaccharidosis type iiia (mps iiia) |
CA3068328A1 (en) | 2017-07-06 | 2019-01-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Aav9-mediated gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type i |
JP7221275B2 (ja) | 2017-08-03 | 2023-02-13 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド | Aavを送達するための組成物および方法 |
TWI835747B (zh) | 2017-09-22 | 2024-03-21 | 賓州大學委員會 | 用於治療黏多醣病 ii 型之基因治療 |
KR20200104307A (ko) * | 2017-11-30 | 2020-09-03 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 | 뮤코다당류증 iiia형에 대한 유전자 요법 |
EP3717652A4 (en) * | 2017-11-30 | 2021-11-24 | The Trustees of the University of Pennsylvania | GENE THERAPY FOR MUCOPOLY SACCHARIDOSIS IIIB |
US10610606B2 (en) | 2018-02-01 | 2020-04-07 | Homology Medicines, Inc. | Adeno-associated virus compositions for PAH gene transfer and methods of use thereof |
EP3755795A4 (en) | 2018-02-19 | 2022-07-20 | Homology Medicines, Inc. | ADENO-ASSOCIATED VIRUS COMPOSITIONS FOR RECOVERING F8 GENE FUNCTION AND METHODS OF USE THEREOF |
TW202015742A (zh) | 2018-05-15 | 2020-05-01 | 美商航海家醫療公司 | 投遞腺相關病毒(aav)之組成物和方法 |
WO2019222328A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease |
US20210214749A1 (en) | 2018-05-16 | 2021-07-15 | Voyager Therapeutics, Inc. | Directed evolution |
CN108728495A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-11-02 | 深圳市免疫基因治疗研究院 | 一种Sanfilippo A综合症慢病毒载体、慢病毒及其制备方法和应用 |
US10842885B2 (en) | 2018-08-20 | 2020-11-24 | Ucl Business Ltd | Factor IX encoding nucleotides |
WO2020069461A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof |
WO2020077165A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
EP3897695A1 (en) * | 2018-12-20 | 2021-10-27 | Esteve Pharmaceuticals, S.A. | Recombinant vectors for the long term treatment of mucchopolysacharidosis |
EP3911410A1 (en) | 2019-01-18 | 2021-11-24 | Voyager Therapeutics, Inc. | Methods and systems for producing aav particles |
TW202039856A (zh) * | 2019-03-28 | 2020-11-01 | 西班牙商艾斯提夫製藥股份有限公司 | 製造重組病毒載體之方法 |
US20220333133A1 (en) | 2019-09-03 | 2022-10-20 | Voyager Therapeutics, Inc. | Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations |
TW202140791A (zh) | 2020-01-13 | 2021-11-01 | 美商霍蒙拉奇醫藥公司 | 治療苯酮尿症之方法 |
CN111718947B (zh) * | 2020-06-18 | 2022-08-23 | 舒泰神(北京)生物制药股份有限公司 | 用于治疗ⅲa或ⅲb型粘多糖贮积症的腺相关病毒载体及用途 |
WO2022026410A2 (en) | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Voyager Therapeutics, Inc | Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease |
BR112023001456A2 (pt) | 2020-07-27 | 2023-04-11 | Voyager Therapeutics Inc | Composições e métodos para o tratamento de distúrbios neurológicos relacionados à deficiência de beta glicosilceramidase |
JP2023545707A (ja) | 2020-10-14 | 2023-10-31 | デナリ セラピューティクス インコーポレイテッド | スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ酵素を含む融合タンパク質及びその方法 |
WO2023044483A2 (en) | 2021-09-20 | 2023-03-23 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer |
WO2023091949A2 (en) | 2021-11-17 | 2023-05-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency |
WO2023150051A1 (en) * | 2022-02-04 | 2023-08-10 | M6P Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using two-promoter vector for treatment of lysosomal storage disorders |
CN115029360A (zh) * | 2022-05-30 | 2022-09-09 | 上海勉亦生物科技有限公司 | 用于治疗粘多糖贮积症iiia型的转基因表达盒 |
WO2023240236A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1002091B1 (en) * | 1997-07-09 | 2012-02-29 | Coridon Pty Limited | Nucleic acid sequence and method for selectively expressing a protein in a target cell or tissue |
GB0100889D0 (en) * | 2001-01-12 | 2001-02-21 | Oxford Glycosciences Uk Ltd | Compounds |
WO2001036603A2 (en) * | 1999-11-17 | 2001-05-25 | Avigen, Inc. | Recombinant adeno-associated virus virions for the treatment of lysosomal disorders |
US7351813B2 (en) * | 2000-06-20 | 2008-04-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Liver-specific gene expression cassettes, and methods of use |
EP1521523A4 (en) * | 2002-05-20 | 2006-04-19 | Univ Texas | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DELIVERING NUCLEIC ACID ENZYMES AND MOLECULES IN BRAIN, BONE, AND OTHER FABRICS |
US20060292566A1 (en) * | 2002-11-08 | 2006-12-28 | The University Of Queensland | Method for optimising gene expressing using synonymous codon optimisation |
NZ603330A (en) * | 2003-02-11 | 2015-02-27 | Shire Human Genetic Therapies | Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other sulfatase deficiencies |
WO2008085912A1 (en) * | 2007-01-05 | 2008-07-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions of and methods of using sulfatases from flavobacterium heparinum |
EP3492596A1 (en) | 2007-04-09 | 2019-06-05 | University of Florida Research Foundation, Inc. | Raav vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use |
-
2010
- 2010-06-10 EP EP20100382169 patent/EP2394667A1/en not_active Withdrawn
-
2011
- 2011-06-10 BR BR112012031067-4A patent/BR112012031067B1/pt active IP Right Grant
- 2011-06-10 HU HUE11724246A patent/HUE038190T2/hu unknown
- 2011-06-10 DK DK11724246.1T patent/DK2579900T3/da active
- 2011-06-10 ES ES201130978A patent/ES2388620B1/es active Active
- 2011-06-10 MX MX2012014372A patent/MX2012014372A/es active IP Right Grant
- 2011-06-10 AR ARP110102033 patent/AR081868A1/es active IP Right Grant
- 2011-06-10 US US13/703,179 patent/US8999948B2/en active Active
- 2011-06-10 PL PL11724246T patent/PL2579900T3/pl unknown
- 2011-06-10 SI SI201131405T patent/SI2579900T1/en unknown
- 2011-06-10 LT LTEP11724246.1T patent/LT2579900T/lt unknown
- 2011-06-10 NO NO11724246A patent/NO2579900T3/no unknown
- 2011-06-10 CN CN201180028124.5A patent/CN103037905B/zh active Active
- 2011-06-10 RU RU2013100176/10A patent/RU2588667C2/ru active
- 2011-06-10 ME MEP-2018-27A patent/ME02940B/me unknown
- 2011-06-10 WO PCT/EP2011/059678 patent/WO2011154520A1/en active Application Filing
- 2011-06-10 SG SG2012088704A patent/SG186136A1/en unknown
- 2011-06-10 MY MYPI2012701069A patent/MY172292A/en unknown
- 2011-06-10 TW TW100120296A patent/TWI547288B/zh active
- 2011-06-10 EP EP11724246.1A patent/EP2579900B1/en active Active
- 2011-06-10 AU AU2011263697A patent/AU2011263697B2/en active Active
- 2011-06-10 RS RS20180810A patent/RS57458B1/sr unknown
- 2011-06-10 JP JP2013513706A patent/JP6066902B2/ja active Active
- 2011-06-10 PT PT117242461T patent/PT2579900T/pt unknown
- 2011-06-10 NZ NZ60390111A patent/NZ603901A/en unknown
- 2011-06-10 SG SG10201504583XA patent/SG10201504583XA/en unknown
- 2011-06-10 KR KR1020127034430A patent/KR101952966B1/ko active IP Right Grant
- 2011-06-10 ES ES11724246.1T patent/ES2659031T3/es active Active
- 2011-06-10 CA CA2801639A patent/CA2801639C/en active Active
- 2011-10-06 UA UAA201213636A patent/UA112841C2/uk unknown
-
2012
- 2012-11-26 IL IL223274A patent/IL223274A/en active IP Right Grant
- 2012-11-30 ZA ZA2012/09103A patent/ZA201209103B/en unknown
-
2014
- 2014-11-03 US US14/531,200 patent/US9279132B2/en active Active
-
2018
- 2018-01-25 HR HRP20180146TT patent/HRP20180146T1/hr unknown
- 2018-02-05 CY CY20181100144T patent/CY1119892T1/el unknown
Non-Patent Citations (7)
Title |
---|
FOSTER, H. et al., `Codon and mRNA sequence optimization of microdystrophin transgenes improves expression and physiological outcome in dystrophic mdx mice following AAV2/8 gene transfer¿, MOLECULAR THERAPY : THE JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY OF GENE THERAPY, 2008, Vol. 16, No. 11, pages 1825-1832, ISSN: 1525-0024, Resultados, Figura 2. * |
FRALDI, A. et al., `Functional correction of CNS lesions in an MPS-IIIA mouse model by intracerebral AAV-mediated delivery of sulfamidase and SUMF1 genes.¿, HUM. MOL. GENET., 2007, Vol. 16, No. 22, páginas 2693-2702, ISSN: 0964-6906, Materiales y Métodos, Resultados. * |
FRALDI, A. et al., `SUMF1 enhances sulfatase activities in vivo in five sulfatase deficiencies¿, BIOCHEMICAL JOURNAL, 2007, Vol. 403, No. 2, pages 305-312, ISSN: 0264-6021(print), ISSN: 1470-8728(electronic), todo el documento. * |
LAU, A.A. et al., `SGSH gene transfer in mucopolysaccharidosis type IIIA mice using canine adenovirus vectors¿, MOLECULAR GENETICS, Jun 2010, Vol. 100, No. 2, pages 168-175, ISSN: 1096-7192, todo el documento. * |
MCINTYRE et al., `Lentiviral-mediated gene therapy for murine mucopolysaccharidosis type IIIA¿, MOLECULAR GENETICS AND METABOLISM, 2008, Vol. 93, No. 4, pages 411-418, ISSN: 1096-7192, todo el documento. * |
SHI SHUILIANG et al., `Production of recombinant AAV vectors encoding insulin-like growth factor 1 is enhanced by interaction aniongAAV rep regulatory sequences.¿, VIROLOGY JOURNAL, 2009,Vol. 6, No. 3, pages 1-11, ISSN: 1743-422X, todo el documento. * |
VALSTAR, M. J. et al., `Sanfilippo syndrome: A mini -review¿, JOURNAL OF INHERITED METABOLIC DISEASE, 2008, Vol. 31, No. 2, Pages 240-252, ISSN: 1573-2665, todo el documento. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2388620B1 (es) | Vectores y secuencias para el tratamiento de enfermedades. | |
ES2790834T3 (es) | Vectores virales adenoasociados para el tratamiento de mucopolisacaridosis | |
JP6941632B2 (ja) | Cnsターゲティングaavベクターおよびその使用方法 | |
ES2823948T3 (es) | Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosómico | |
ES2859661T3 (es) | Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento de mucopolisacaridosis | |
US20180066283A1 (en) | Widespread gene delivery to motor neurons using peripheral injection of aav vectors | |
ES2887076T3 (es) | Terapia génica para trastornos neurometabólicos | |
JP5841574B2 (ja) | 神経代謝性疾患についての遺伝子治療 | |
ES2686504T3 (es) | Terapia génica para trastornos neurodegenerativos | |
JP2022101648A (ja) | 一本鎖アデノ随伴ウイルス9または自己相補型アデノ随伴ウイルス9の脳脊髄液への注射 | |
ES2745470T3 (es) | Partícula de AAV2 que comprende una proteína de la cápside de AAV2 y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una tripeptidilo peptidasa 1 (TPP1) para el tratamiento de lipofuscinosis ceroide infantil tardía (LINCL) en un mamífero no roedor mediante inyección intraventricular o administración icv | |
JP7389744B2 (ja) | ムコ多糖症iiia型のための遺伝子療法 | |
JP2022530833A (ja) | ポンペ病の治療のために有用な組成物 | |
JP2024506860A (ja) | ニーマンピック病a型を治療するための組成物及び方法 | |
Gombash et al. | 612. Systemic AAV Injection in Guinea Pigs and Non-Human Primates Targets the Enteric Nervous System |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2388620 Country of ref document: ES Kind code of ref document: B1 Effective date: 20131113 |
|
PC2A | Transfer of patent |
Owner name: ESTEVE PHARMACEUTICALS, S.A. Effective date: 20181016 |