ES2823948T3

ES2823948T3 - Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosómico

Info

Publication number: ES2823948T3
Application number: ES15735634T
Authority: ES
Inventors: Tubert M Fàtima Bosch; Mendosa M Virginia Haurigot; Sanchez Albert Ribera
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Esteve Pharmaceuticals SA
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Esteve Pharmaceuticals SA
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2015-05-13
Publication date: 2021-05-10
Anticipated expiration: 2035-05-13
Also published as: RU2718248C2; UA123985C2; AU2015261519A2; MX383227B; EP3143146B1; SG11201609314XA; RU2016149206A; CN107002095A; AU2015261519B2; BR112016025819B1; PH12016502248A1; US11149285B2; IL248538A0; NZ726316A; EP3143146A1; KR20170026358A; JP2017523802A; CA2947468C; SA516380290B1; CN107002095B

Abstract

Un vector AAV9 recombinante que contiene un promotor CAG SEQ ID NO: 4 ligado a una secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa SEQ ID NO: 1 es la secuencia SEQ ID NO: 3, la secuencia SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 22.

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosómico

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a vectores que son de utilidad para la expresión de proteínas de interés y su uso en terapia génica. La presente invención también se refiere a vectores y secuencias de ácidos nucleicos que son útiles para el tratamiento de las mucopolisacaridosis (MPS) y, en particular, para el tratamiento de las mucopolisacaridosis tipo III-B o síndrome de Sanfilippo B.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El lisosoma es un orgánulo presente en el citoplasma de las células animales que contiene más de 50 hidrolasas que degradan las biomoléculas durante el reciclado de los componentes celulares desgastados o después de la endocitosis de virus y bacterias. Este orgánulo contiene varios tipos de enzimas hidrolíticas, incluyendo proteasas, nucleasas, glicosidasas, lipasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas. Todas las enzimas son hidrolasas ácidas.

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (LSD) son causadas por defectos genéticos que afectan a una o más enzimas lisosómicas. Estas enfermedades genéticas generalmente son el resultado de una deficiencia en la actividad de una enzima particular presente en el lisosoma. En un menor grado, estas enfermedades pueden deberse a deficiencias en las proteínas involucradas en la biogénesis lisosómica.

Las LSD son raras en una escala individual, si bien como un grupo estos trastornos son relativamente comunes en la población general. La prevalencia combinada de las LSD es de aproximadamente 1 por 5.000 nacimientos vivos. Véase Meikle P, et al., JAMA 1999; 281: 249-254. Sin embargo, algunos grupos de la población general están afectados particularmente por una gran incidencia de LSDs. Por ejemplo, la prevalencia de las enfermedades de Gaucher y Tay-Sachs entre los descendientes de judíos de Europa Central y del Este (Ashkenazi) es de 1 por 600 y de 1 por 3.900 nacimientos, respectivamente.

Las mucopolisacaridosis tipo III (MPSIII), conocidas en su conjunto como síndrome de Sanfilippo, son LSD causadas por una deficiencia en una de las enzimas involucradas en la degradación por pasos del glicosaminoglicano (GAG) heparán sulfato (HS), que conduce a su acumulación patológica. Las MPSIII se clasifican en cuatro subtipos dependiendo de la deficiencia enzimática. La pérdida de la actividad enzimática alfa N-acetilglucosaminidasa es la causa del subtipo IIIB. La enfermedad resultante se caracteriza clínicamente como una neuropatía progresiva del CNS de inicio en la infancia. El transcurso clínico generalmente se puede dividir en tres fases. En la primera fase de la enfermedad, después de un período sin síntomas que abarca los primeros meses de vida, comienza a evidenciarse un retraso en el desarrollo mental. Esto es seguido por problemas de conducta severos y una declinación intelectual progresiva durante la segunda fase de la enfermedad. Al final, con el comienzo de una demencia severa, los problemas de conducta desaparecen lentamente, y comienzan a declinar todas las funciones motoras, dando como resultado finalmente disfagia, una pérdida completa de la locomoción y lesiones en el tracto piramidal. Además de los síntomas neurológicos, los pacientes con MPSIIIB sufren de alteraciones no neurológicas, incluyendo infecciones recurrentes de oídos, nariz, garganta y pecho, diarreas y constipación frecuentes, degeneración progresiva de las articulaciones y anomalías del esqueleto que afectan la movilidad, así como hepato y esplenomegalia. Véase Cleary y Wraith, Arch Dis Child., 1993; 69 (3): 403-6, Neufeld y Muenzer, “The Mucopolysaccharidoses” en Scriver C, et al., Eds., “The metabolic and molecular basis of inherited disease”, McGraw-Hill Publishing Co., Nueva York, NY, US, 2001, páginas 3421-3452, van de Kamp et al., Clin Genet., 1981; 20(2): 152-60, Moog et al, Am J Med Genet C Semin Med Genet., 2007; 145C(3): 293-301. Los pacientes habitualmente mueren al final de la segunda o al comienzo de la tercera década de vida. Véase Neufeld y Muenzer, supra. En un subconjunto de pacientes con MPSIIIB se ha descrito una forma progresiva más lenta de la enfermedad de inicio más tardío y mayor supervivencia, conocida como el fenotipo atenuado. Véase Moog et al., supra y Valstar et al., Ann Neurol., 2010; 68(6): 876-87.

Actualmente no hay ningún tratamiento disponible para la MPSIIIB. Por ello, el control de la enfermedad es sintomático y busca mejorar la calidad de vida de los pacientes y de sus familias. Esto resulta de especial importancia para aquellos síntomas que surgen por alteraciones del CNS. Por ejemplo, un aumento intermitente de la presión intracraneal es una causa reconocida de los trastornos del comportamiento y es bastante frecuente en las MPS. Véase Muenzer et al., Genet Med. 2006; 8(8): 465-73. El engrosamiento de las meninges debido a la deposición de mucopolisacáridos podría ser la causa subyacente del aumento de la presión del líquido cefalorraquídeo (CSF). Por consiguiente, cuando las alteraciones de conducta son refractarias a la medicación convencional, se considera la inserción de una derivación para el líquido cefalorraquídeo con el fin de aliviar la presión. Los síntomas neurológicos mejoraron significativamente en seis pacientes con Sanfilippo en quienes se insertaron derivaciones cefalorraquídeas. Véase Robertson et al., Eur J Pediatr., 1998; 157(8): 653-5. Por otro lado, se considera que la administración de melatonina es el mejor tratamiento para los trastornos del sueño que son característicos de la enfermedad, si bien no es completamente efectiva. Véase Fraser et al., Arch Dis Child., 2005; 90(12): 1239-42. Tampoco hay un tratamiento específico para la patología somática, y sólo se pueden aplicar terapias paliativas para cada síntoma individual.

Se están estudiando nuevos abordajes terapéuticos para la MPSIIIB con diferentes grados de éxito. Las terapias de deprivación de sustrato (SDT) buscan reducir la velocidad de síntesis de GAG, de modo que, si permaneciera alguna actividad enzimática residual, se impide una acumulación excesiva de los GAG o por lo menos se disminuye la velocidad de acumulación. Se ha sugerido que la genisteína, una isoflavona de soja, actúa como un inhibidor de la producción de HS por disminución de la actividad quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Véase Jakobkiewicz-Banecka et al., J Biomed Sci., 2009; 16: 26, Piotrowska et al., Eur J Hum Genet., 2006; 14(7): 846-52. Estudios recientes indican que la genisteína inhibe la síntesis de los GAG en fibroblastos de pacientes que sufren de diversas mucopolisacaridosis (tipos I, II, III-A y III-B); véase Piotrowska et al., supra. La administración por vía oral a corto plazo y a largo plazo de genisteína en un modelo en ratón de la enfermedad de MPSIIIB dio como resultado una reducción del almacenamiento y un mejor desempeño en las pruebas de habilidades motoras. Véase Malinowska et al., Mol Genet Metab., 2009; 98(3): 235-42, Malinowska et al., PLoS One, 2010; 5(12): e14192. Cuando se administra por vía intravenosa, se espera que la genisteína pueda atravesar la barrera hematoencefálica (BBB), permitiendo así el tratamiento de la patología del CNS. Como fundamento de este concepto, un estudio piloto de ensayo abierto en el cual se administró un extracto de soja enriquecido en genisteína a 5 pacientes con MPSIIIA y a 5 pacientes con MPSIIIB durante 12 meses, dio como resultado un alivio significativo de los parámetros tanto somáticos como neurológicos. Véase Piotrowska et al., Current Therapeutic Research., 2008; 69(2): 166-179. Sin embargo, estudios subsiguientes no mostraron mejora alguna en las escalas de discapacidad o en las calificaciones de la conducta de pacientes con MPSIIIA, MPSIIIB o MPSIIIC tratados con genisteína durante 12 meses. Véase Delgadillo et al., J Inherit Metab Dis., 2011; 34(5): 1039-44, estudio NTR N° 1826, registrado en el Registro de Ensayos Nacional de Los Países Bajos y de Ruijter et al., Ann Neurol., 2012; 71(1): 110-20. También se ha demostrado que otra molécula, la rodamina B, es efectiva para disminuir la acumulación de GAG en estudios preclínicos, con una eficacia similar a la observada con genisteína. Véase Hendriksz et al., “Guidelines for the investigation and Management of Mucopolysaccharidosis type III”, 2012, disponible en www.mpssociety.co.uk. Se cree que la rodamina B suprime la síntesis de las cadenas de GAG porque inhibe la formación de los precursores de azúcares y/o la actividad de glicosil transferasas. Véase Roberts et al., Mol Genet Metab., 2007; 92(1-2): 115-21.

Las células normales secretan cantidades significativas de enzimas lisosómicas marcadas con manosa-6-fosfato (M6P), que luego pueden ser captadas por otras células por los receptores de M6P presentes sobre la membrana plasmática. Esto abre la posibilidad de tratar las LSD causadas por deficiencia de hidrolasas solubles mediante infusión de la versión correcta de la enzima que falta. Aunque aún no se encuentran disponibles las terapias de reemplazo enzimáticas (ERT) para los pacientes con Sanfilippo B, la administración intravenosa de la alfa-N-acetilglucosaminidasa recombinante en ratones con MPSIIIB de 3 meses de vida mostró que la enzima recombinante se distribuyó a varios órganos, principalmente al hígado. Se detectó una cantidad insignificante de enzima en el cerebro, que se atribuyó a la presencia de la BBB que limita la entrada de las proteínas provistas exógenamente en el parénquima del cerebro. Véase Yu et al., Mol Genet Metab., 2000; 71(4): 573-80 y Hendriksz et al, supra. Hay un programa en desarrollo temprano de un producto de una ERT para el tratamiento de la enfermedad neurológica en pacientes de MPSIIIB. El programa HGT-3010 (Shire) es una e Rt basada en la administración intratecal de enzimas recombinantes y actualmente se encuentra en la fase preclínica. La administración directa de una ERT en el CNS ha reducido la patología neurológica en ratones con MPSIIIA y actualmente se está evaluando en pacientes con MPSIIIA. Véase Hemsley K, et al., Genes Brain Behav., 2008; 53(2): 161-8, Savas P, et al., Mol Genet Metab., 2004; 82: 273 285, NCT01155778 y NCT01299727 en www.clinicaltrials.gov. Sin embargo, el implante del dispositivo permanente de administración intratecal requerido en esta terapia está asociado a riesgos y defectos sustanciales, y la propia terapia tiene un costo económico muy alto por paciente/año.

Se ha demostrado que el trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) usando células madre derivadas de médula ósea (trasplante de médula ósea, BMT) es eficiente en el tratamiento de ambas patologías somática y neurológica en pacientes con otras MPS. Véase Peters et al., Blood, 1996; 87(11): 4894-902, Peters y Steward, Bone Marrow Transplant 2003; 31(4): 229-39 y Yamada et al., Bone Marrow Transplant 1998; 21(6): 629-34. Las células mieloides derivadas de donantes pueden cruzar la BBB, ingresar en el parénquima del cerebro y diferenciarse en células de la microglía que secretan la enzima lisosómica que falta, que luego es captada por las células circundantes lo cual conduce a la corrección de la acumulación de GAG en el cerebro. Véase Krivit et al., Cell Transplant., 1995; 4(4): 385-92. Sin embargo, no se ha observado un beneficio claro en los pacientes con Sanfilippo A o B que fueron sometidos a un BMT. Véase Hoogerbrugge et al., Lancet 1995; 345(8962): 1398-402, Vellodi et al., J Inherit Metab Dis., 1992; 15(6): 911-8, Güngor y Tuncbilek, Turk J Pediatr., 1995; 37(2): 157-63, Sivakumur y Wraith, J Inherit Metab Dis., 1999; 22(7): 849-50 y Lange et al., Arq Neuropsiquiatr., 2006; 64(1): 1-4. La principal razón del fracaso del BMT parece ser la lentitud del reemplazo de la población de la microglía por la progenie de las células hematopoyéticas en comparación con el progreso rápido de la enfermedad primaria. Véase Rovelli, Bone Marrow Transplant, 2008; 41; suplemento 2: S87-9. Por ello, el HSCT usando un BMT no es considerado actualmente como una opción de tratamiento para los pacientes con MPSIII. Véase Boelens et al., Pediatr Clin North Am. 2010; 57(1): 123-145. El HSCT usando células madre derivadas de sangre del cordón umbilical mejoró los resultados cognitivos en los ratones con MPSIIIB pero era necesaria una administración repetida de las células. Véase Willing et al., Cell Transplantation, 2013; publicación electrónica previa a la edición impresa. Este abordaje se ha usado recientemente para trasplantar varios niños con MPSIIIA y MPSIIIB; aún no queda claro si dará como resultado la protección del CNS frente a la degeneración. Véase de Ruijter et al., Curr Pharm Biotechnol., 2011; 12(6): 923-30.

Dadas las limitaciones de las opciones terapéuticas actuales para la MPSIII, y en particular para la MPSIIIB, se necesitan abordajes alternativos. Las terapias génicas in vivo ofrecen la posibilidad de un tratamiento de una sola vez para la MPS IIIB y otras enfermedades heredadas, con la perspectiva de efectos beneficiosos para toda la vida. Se han evaluado varios abordajes de terapias génicas sobre la base del uso de diferentes vectores virales combinados con distintas rutas de administración en modelos animales de la enfermedad MPSIIIB.

Se han administrado vectores lentivirales que codifican el gen de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, por vía intravenosa a ratones jóvenes con MPSIIIB, dando como resultado niveles bajos de expresión del transgen en hígado, bazo, pulmón y corazón, que redujeron pero no normalizaron la acumulación de GAG en estos tejidos. Véase Di Natale et al., Biochem J. 2005; 388(2): 639-46. También se evaluó el potencial terapéutico de los vectores lentivirales mediante administración directa de los vectores en el parénquima cerebral por administración intracraneal. Véase Di Domenico et al., Am J Med Genet A., 2009; 149A(6): 1209-18. Los ratones con MPSIIIB que recibieron la administración en un solo sitio en el cerebro mostraron una mayor actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa hasta 6 meses después del tratamiento, que solo corrigió parcialmente las lesiones debidas al almacenamiento lisosómico.

En particular, la transferencia de genes mediada por vectores de virus adenoasociados (AAV), está surgiendo rápidamente como el abordaje de elección para muchas aplicaciones de terapia génica in vivo, debido a la gran eficiencia de transducción y la falta de patogenicidad de estos vectores. Los vectores de AAV pueden transducir células postmitóticas y varios estudios preclínicos y clínicos han demostrado el potencial de la transferencia de genes mediada por vectores de AAV para dirigir eficazmente una expresión sostenida de transgenes terapéuticos para una variedad de enfermedades. Véase Bainbridge et al., N Engl J Med., 2008; 358(21): 2231-9, Hauswirth et al., Hum Gene Ther., 2008; 19(10): 979-90, Maguire et al., N Engl J Med., 2008; 358(21): 2240-8, Niemeyer et al., Blood, 2009; 113(4): 797 806, Rivera et al., Blood, 2005; 105(4): 1424-30, Nathawani et al., N Engl J Med., 2011; 365(25): 2357-65 y Buchlis et al., Blood, 2012; 119(13): 3038-41.

Cuando se administraron vectores de AAV del serotipo 2 que codifican la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana en el parénquima de cerebro de ratones con MPSIIIB en una sola ubicación, la expresión y la actividad de la alfa-N-acetilglucosaminidasa estaban restringidos al sitio de la inyección y sólo se logró un alivio parcial del fenotipo de la enfermedad. Véase Fu et al., Mol Ther., 2002; 5(1): 42-9, Cressant et al., J Neurosci., 2004; 4(45): 10229-39. Los vectores de AAV2 administrados por vía intravenosa a ratones con MPSIIIB después de un pretratamiento con manitol para permeabilizar la BBB, condujeron a una supervivencia significativamente prolongada, un desempeño de conducta mejorado y una reducción de la patología lisosómica en el cerebro, aunque solamente se logró una corrección parcial de la enfermedad somática. Véase McCarty et al., Gene Ther., 2009; 16(11): 1340-52. Por otro lado, una sola administración de los vectores de AAV2 en el líquido cefalorraquídeo (CSF) mediante inyección intracisternal condujo al restablecimiento de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa y a una reducción de los GAG en el cerebro de ratones con MPSIIIB, aunque no se observó una actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa detectable en tejidos somáticos. Véase Fu et al., J Gene Med., 2010; 12(7): 624-33. Se ha demostrado que una terapia combinada que comprende la administración intracisternal e intravenosa de AAV2 tiene una eficacia terapéutica a largo plazo significativa en el CNS, así como una corrección somática parcial. Véase Fu et al., Gene Ther., 2007; 14(14): 1065-77.

Otros estudios han aprovechado el tropismo elevado que tienen los vectores de AAV del serotipo 5 para células neuronales después de una administración intraparenquimal. Sin embargo, estos vectores tienen una baja distribución en el parénquima de cerebro, y el abordaje requiere múltiples inyecciones. La administración de los vectores de AAV5 en múltiples sitios del cerebro de ratones con MPSIIIB recién nacidos en combinación con un trasplante de médula ósea, presentó una eficacia terapéutica similar a la obtenida con los vectores del serotipo 2. Véase Heldermon et al., Mol Ther., 2010; 18(5): 873-80. En los modelos animales con un tamaño de cerebro más grande, la administración estereotáctica de vectores de AAV5 en cuatro ubicaciones diferentes del cerebro de perros con MPSIIIB condujo a la detección de una alfa-N-acetilglucosaminidasa activa en amplias áreas del cerebro. Sin embargo, la actividad enzimática permaneció baja o indetectable en las regiones más rostrales y más caudales, en especial en el cerebelo. Véase Ellinwood et al., Mol Ther., 2011; 19(2): 251-9. La patología lisosómica mejoró pero no fue corregida por completo en los perros con MPSIIIB tratados, indicando que los niveles de actividad enzimática alcanzados con este abordaje eran insuficientes para afrontar el almacenamiento de GAG. A pesar de esta eficacia parcial, recientemente se ha iniciado un ensayo clínico basado en este abordaje. Véase ISRCTN19853672 en el registro de ISRCTN. Cuanto más grande es el cerebro, más difícil se vuelve abarcar el volumen completo del órgano con inyecciones intraparenquimales, y para la administración a seres humanos es necesario administrar vectores en varios sitios, lo que hace que la administración sea técnicamente más desafiante y requiere el desarrollo de procedimientos quirúrgicos específicos. Véase Souweidane et al., J Neurosurg Pediatr., 2010; 6(2): 115-122.

Aunque se ha descrito vectores de AAV del serotipo 9 (AAV9) para su uso en el tratamiento de MPSIIIA, los cuales comprenden un promotor CAG y secuencias de nucleótidos optimizadas por codones para la expresión de sulfamidasa humana (documento WO2011154520), hasta la fecha, sólo se ha informado de un estudio que emplea vectores de AAV del serotipo 9 para el tratamiento de MPSIIIB. El abordaje aprovecha la capacidad de los vectores de AAV9 para transducir el CNS cuando se administran sistémicamente. Véase Foust et al., Nat Biotechnol., 2009; 27(1): 59-65 y Duque, et al., Mol Ther., 2009; 17(7): 1187-1196. La administración intravenosa de los vectores de AAV9-alfa-N-acetilglucosaminidasa a ratones con MPSIIIB, dio como resultado la corrección de la patología de almacenamiento lisosómico en el CNS y órganos somáticos, una mejora en el desempeño de la conducta y una extensión de la esperanza de vida. Véase Fu et al., Mol Ther., 2011; 19(6): 1025-33 y US2013039888. Sin embargo, esta propuesta de curso de acción tiene varios defectos. Primero, se ha informado que el promotor CMV utilizado produce silenciamiento. Véase Loser et al., J Virol., enero de 1998; 72(1): 180-90. Segundo, la eficacia terapéutica se logró con una dosis muy alta del vector (> 1 x 1013 vg/kg). El uso de tales dosis altas representaría un desafío para la transferencia clínica desde el punto de vista de su elaboración y seguridad.

Ninguno de los abordajes mencionados previamente ha restablecido por completo la actividad de la alfa-N-acetilglucosaminidasa, ni logrado una erradicación completa de las inclusiones intracitoplasmáticas en el CNS y los tejidos somáticos ni corregido todos los signos clínicos de MPSIIIB. Por consiguiente, persiste la necesidad de nuevos abordajes para el tratamiento de MPSIIIB que ofrezcan mejores perfiles de eficacia y seguridad.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevos vectores recombinantes para el tratamiento de enfermedades, en particular para el tratamiento de las mucopolisacaridosis tipo III (MPSIII), en especial la MPSIIIB.

En un primer aspecto, la invención se refiere a vectores de virus adenoasociados del serotipo 9 recombinantes (vector AAV9) que contienen un promotor CAG SEQ ID NO: 4 unido a una secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu) SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica para Naglu SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID n O: 3, s Eq ID NO: 19 o la secuencia SEQ ID NO: 22. Los vectores de AAV de acuerdo con la invención son del serotipo 9 (AAV9). Estos vectores demostraron ser muy eficientes en la reversión completa del almacenamiento patológico de GAG en todas las regiones del cerebro y en tejidos somáticos.

Los vectores de AAV9 de la presente invención contienen además un promotor ligado a la secuencia de nucleótidos codificante con el fin de controlar la expresión de Naglu. El promotor adecuado es el promotor CAG, SEQ ID NO: 4.

Otro aspecto de la invención se refiere a plásmidos que contienen un promotor CAG unido a una secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu), SEQ ID NO: 1, en donde el promotor CAG y la secuencia de nucleótidos esta flanqueada por AAV2 ITRs, y en donde dichos plásmidos son pAAV-CAG-cohNaglu con número de acceso DSM 26626, que contienen la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3 que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO: 1, pAAV-CAG-cohNaglu-version2 con numero de acceso DSM 32042, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 19 que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO: 1, pAAV-CAG-cohNaglu-version3 con numero de acceso DSM 32043, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 22 que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO: 1.

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de los vectores de AAV9 de la invención o de un plásmido como se describe aquí.

La presente descripción proporciona además métodos que son de utilidad para administrar polinucleótidos, en especial polinucleótidos de Naglu.

Aún otro aspecto adicional de la invención se refiere a los vectores de AAV9 de la invención o a un plásmido descrito aquí para su uso como medicamento, en particular para el tratamiento de las mucopolisacaridosis tipo III (MPSIII), en especial la MPSIIIB.

La presente invención también proporciona un método para la producción de los vectores de AAV 9 de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional la invención se refiere a células aisladas que comprenden el vector de la invención AAV9.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS

Figura 1: Administración hidrodinámica de plásmidos que codifican la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, (pAAV-CAG-hNaglu). Se inyectaron de manera hidrodinámica 50 |jg del plásmido pAAV-CAG-hNaglu a ratones con MPSIIIB de dos meses de vida. Los histogramas muestran la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU) medida 1 semana después de la administración del plásmido en hígado (A) y suero (B). La actividad NAGLU de ratones WT que recibieron inyecciones de salina se definió como el 100%. Los valores representan la media ± SEM de 3-4 ratones por grupo. *** P<0,001 versus WT (tipo salvaje).

Figura 2: Administración intravenosa (IV) de los vectores de AAV9 que codifican la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, (AAV9-CAG-hNaglu). Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el hígado (A) y en suero (B) de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB tratados con una inyección IV de 5 x 1011 vg de AAV9-CAG-hNaglu. (C) Cuantificación de glicosaminoglicano (GAG) en órganos somáticos. Los valores representan la media ± SEM de 5 a 8 ratones por grupo. $$$ P<0,001 versus WT, ** P<0,01, *** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado.

Figura 3: Administración intravenosa de los vectores de AAV9 que codifican la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, (AAV9-CAG-hNaglu). (A) Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en diferentes partes del cerebro (I-IV) de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB tratados con una inyección IV de 5 x 1011 vg de AAV9-CAG-hNaglu. (B) Cuantificación de glicosaminoglicano (GAG) en las mismas partes del cerebro. Los valores representan la media ± SEM de 5 a 8 ratones por grupo. *** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado

Figura 4: Administración intravenosa de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa humana optimizada, (AAV9-CAG-cohNaglu). Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el hígado (A) y en suero (B) de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB tratados con una inyección IV de 5 x 1011 vg de AAV9-CAG-cohNaglu. (B) Cuantificación de glicosaminoglicano (GAG) en órganos somáticos. Los valores representan la media ± SEM de 5 a 8 ratones por grupo. $$$ P<0,001 versus WT, ** P<0,01, *** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado.

Figura 5: Administración intravenosa de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa humana optimizada, (AAV9-CAG-cohNaglu). (A) Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en diferentes partes del cerebro (I-IV) de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB tratados con una inyección IV de 5 x 1011 vg de AAV9-CAG-cohNaglu. (B) Cuantificación de glicosaminoglicano (GAG) en las mismas partes del cerebro. Los valores representan la media ± SEM de 5 a 8 ratones por grupo. *** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado.

Figura 6: Administración intracisternal (IC) de los vectores de AAV9 que codifican la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, (AAV9-CAG-hNaglu). (A) Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en diferentes partes del cerebro (I-IV) de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB tratados con una inyección intracisternal de 9,3 x 109 vg de AAV9-CAG-hNaglu. (B) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en las mismas áreas de cerebro. Los valores representan la media ± SEM de 5 a 8 ratones por grupo. *** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado.

Figura 7: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, (AAV9-CAG-hNaglu). (A) Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el hígado de ratones de tipo salvaje (sanos) y de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB tratados con una inyección intracisternal de 9,3 x 109 vg de AAV9-CAG-hNaglu. (B) Cuantificación de glicosaminoglicano (GAG) en órganos somáticos. Los valores representan la media ± SEM de 5 a 8 ratones por grupo. $$$ P<0,001 versus WT, ** P<0,01, *** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado.

Figura 8: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa humana optimizada, (AAV9-CAG-cohNaglu). (A) Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en diferentes partes del cerebro (I-IV) de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB tratados con una inyección intracisternal de 9,3 x 109 vg de AAV9-CAG-cohNaglu. (B) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en las mismas áreas de cerebro. Los valores representan la media ± SEM de 5 a 8 ratones por grupo. *** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado.

Figura 9: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa humana optimizada, (AAV9-CAG-cohNaglu). (A) Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el hígado de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB tratados con una inyección intracisternal de 9,3 x 109 vg de AAV9-CAG-cohNaglu. (B) Cuantificación de glicosaminoglicano (GAG) en órganos somáticos. Los valores representan la media ± SEM de 5 a 8 ratones por grupo. $$$ P<0,001 versus WT, ** P<0,01, *** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado.

Figura 10: Administración hidrodinámica de un plásmido que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana optimizada versión 2 (pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2). Se inyectaron de manera hidrodinámica 50 |jg del plásmido pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2 a ratones con MPSIIIB de dos meses de vida. Los histogramas muestran la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU) medida 1 semana después de la administración del plásmido en hígado (A) y suero (B). La actividad NAGLU de ratones WT que recibieron inyecciones de salina se definió como el 100%. Los valores representan la media ± SEM de 3-4 ratones por grupo. *** P<0,001 versus WT.

Figura 11: Administración hidrodinámica de un plásmido que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana optimizada versión 3 (pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3). Se inyectaron de manera hidrodinámica 50 jg del plásmido pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3 a ratones con MPSIIIB de dos meses de vida. Los histogramas muestran la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU) medida 1 semana después de la administración del plásmido en hígado (A) y suero (B). La actividad NAGLU de ratones WT que recibieron inyecciones de salina se definió como el 100%. Los valores representan la media ± SEM de 3-4 ratones por grupo. *** P<0,001 versus WT.

Figura 12: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa murina optimizada, (AAV9-CAG-comNaglu). Biodistribución de los genomas del vector después de la administración de 3 x 1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu en la cisterna magna de ratones con MPSIIIB. Se cuantificaron los genomas del vector en cerebro (A) y en tejidos somáticos (B) mediante una PCR cuantitativa y con referencia a la cantidad de ADN contenida en un genoma diploide. ND: no detectado.

Figura 13: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa murina optimizada, (AAV9-CAG-comNaglu). (A) Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en diferentes partes del cerebro (I-V) de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB que recibieron la administración en la cisterna magna de 3,9 x 1010 vg de vector control (AAV9-Nulo) o bien, 3 x 1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. (B) Cuantificación de glicosaminoglicanos (GAG) en las mismas áreas de cerebro. Los valores representan la media ± SEM de 4 ratones por grupo. ** P<0,01, *** P<0,001 versus MPSIIIB-nulos. nd: no detectado.

Figura 14: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa murina optimizada, (AAV9-CAG-comNaglu). (A) Cuantificación de la intensidad de la señal obtenida en diferentes áreas del cerebro después de tinción para el marcador lisosómico LIMP-2, que proporciona una indicación del tamaño del compartimento lisosómico, en ratones de tipo salvaje (sanos) y en ratones con MPSIIIB que recibieron la administración en la cisterna magna de ya sea 3,9 x 1010 vg de vector control (AAV9-Nulo) o bien, 3 x 1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. Los valores representan la media ± SEM de 4 ratones por grupo. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001 versus MPSIIIB-nulos. (B) Análisis por microscopía electrónica de la corteza cerebral y de cerebelo de tipo salvaje (paneles de la izquierda), de ratones con MPSIIIB no tratados (paneles del medio) y de ratones con MPSIIIB que recibieron una administración en la cisterna magna de AAV9-CAG-comNaglu (paneles de la derecha). 1. neuronas; 2. células de la glía perineuronal; 3. neuronas de Purkinje. (C) Actividad de otras enzimas lisosómicas en extractos de cerebro obtenidos de ratones de tipo salvaje (WT), de ratones con MPSIIIB no tratados (MPSIIIB) y de ratones con MPSIIIB que recibieron la administración en la cisterna magna de ya sea 3,9 x 1010 vg de vector control (AAV9-Nulo) o bien, 3 x 1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. SGSH, N-sulfoglucosamina sulfohidrolasa, GUSB, betaglucuronidasa, HEXB, hexosaminidasa B. Las actividades de la enzima WT se definieron en el 100%. Los valores representan la media ± SEM de 4 ratones por grupo. *** P<0,001 versus MPSIIIB-Nulos.

Figura 15: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa murina optimizada, (AAV9-CAG-comNaglu). Los histogramas representan la intensidad de la señal medida después de una inmunotinción para el marcador de astrocitos GFAP (A) y para el marcador de microglía BSI-B4 (B) en secciones de la corteza frontal, parietal y occipital, el colículo superior y el tálamo de ratones de tipo salvaje (sanos) y de ratones con MPSIIIB que recibieron una administración en la cisterna magna ya sea con 3,9 x 1010 vg de vector control (AAV9-Nulo) o 3 x 1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. Los valores representan la media ± SEM de 2-3 ratones por grupo. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001 versus MPSIIIB-nulos. (C) Clasificación funcional basado en la anotación de Ontología Genética (GO). Gráfico de sectores que indica la fracción de transcritos asociados con cada término de proceso biológico. Claramente, la mayoría de los términos representan categorías relacionadas con inflamación/inmunidad. (D) Agrupación jerárquica de todos los grupos experimentales basado en el conjunto de genes que el software CTEN asignó como representativos de la microglía. Cada columna representa un gen y cada fila representa un animal. Se muestra el nivel de expresión de cada gen con relación a la abundancia promedio de dicho gen en todas las muestras según la escala de grises que se muestra en la parte inferior. El dendrograma de muestras que se muestra arriba de la matriz representa las similitudes globales de los niveles de transcrito. Claramente, todos los ratones con MPSIIIB tratados con AAV9-CAG-comNaglu tienen un perfil de expresión génica semejante al de los compañeros de camada WT sanos, de la misma edad.

Figura 16: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa murina optimizada, (AAV9-CAG-comNaglu). Actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el hígado (A) y suero (B) de ratones de tipo salvaje (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB que recibieron la administración en la cisterna magna de ya sea 3,9 x 1010 vg de vector control (AAV9-Nulo) o bien, 3 x 1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. (C) Cuantificación de glicosaminoglicano (GAG) en órganos somáticos. Los valores representan la media ± SEM de 4 a 8 ratones por grupo. $ P<0,05 versus ^{W t ,}** P<0,01, ** P<0,001 versus MPSIIIB no tratados. nd: no detectado. (D) Análisis por microscopía electrónica del hígado. Se pueden observar múltiples vacuolas electrolúcidas (flechas) en el citoplasma de hepatocitos de ratones con MPSIIIB tratados con el vector nulo y estas vesículas desaparecen en los animales tratados con AAV9-CAG-mNaglu. (E) Actividad de otras enzimas lisosómicas en extractos de hígado obtenidos de las mismas cohortes de animales que en (A y B). IDS, iduronato-2-sulfatasa, IDUA, alfa-L-iduronidasa, SGSH, N-sulfoglucosamina sulfohidrolasa, GUSB, beta-glucuronidasa, HEXB, hexosaminidasa B. Actividades de la enzima WT se definieron como el 100%. Los valores representan la media ± SEM de 4 ratones por grupo. ** P<0,01 y *** P<0,001 versus MPSIIIB-Nulos.

Figura 17: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa murina optimizada, (AAV9-CAG-comNaglu). Evaluación de la conducta de ratones de tipo salvaje no tratados previamente con este tratamiento (naíve) para la evaluación (sanos), de ratones con MPSIIIB no tratados y de ratones con MPSIIIB que recibieron la administración en la cisterna magna ya sea con 3,9 x 1010 vg de vector control (AAV9 Nulo) o bien, con 3 x 1010 vg de AAV9-CAG-comNaglu. Los datos corresponden a la actividad locomotora y exploratoria registrada durante los primeros 2 minutos, y se representan como la media ± SEM de 10 a 15 animales por grupo. (A) Latencia al centro, (B) Tiempo en el límite, (C) Entradas al centro, (D) Tiempo de reposo, (E) Distancia total recorrida, (F) Número total de líneas cruzadas. *P < 0,05 y **P < 0,01 versus MPSIIIB-nulo. (G) Análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en ratones WT (n = 23), ratones con MPSIIIB no tratados (n = 12), ratones con MPSIIIB que habían recibido inyecciones con 3,9 x 1010 vg de AAV9-Nulo (n = 5) o 3 x 109 vg de AAV9-CAG-comNaglu (n = 8). El tratamiento con terapia génica de AAV9-CAG-comNaglu extendió considerablemente la esperanza de vida de animales con MPSIIIB. P = 0,0007 para ratones con MPSIIIB tratados con AAV9-CAG-comNaglu versus ratones con MPSIIIB-nulo.

Figura 18: Administración intracisternal de los vectores de AAV9 que codifican una alfa-N-acetilglucosaminidasa canina optimizada, (AAV9-CAG-cocNaglu) a perros de la raza Beagle. (A) Seguimiento de los títulos de anticuerpos neutralizantes (Nab) anti-AAV9 en muestras correspondientes de suero y CSF antes y después de una administración intra-CSF de los vectores AAV9-CAG-cocNaglu a perros de la raza Beagle sanos. Los perros 3 y 4 fueron preinmunizados mediante administración intravenosa de 1 x 1011 vg/kg de vectores AAV9-nulos un mes antes de la administración intracisternal. (B) Seguimiento de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el CSF de perros de la raza Beagle adultos sanos después de la administración intra-CSF de 6,5 x 1012 vg de los vectores de AAV9 que codifican la alfa-N-acetilglucosaminidasa canina. Los perros 1 y 2 (símbolos abiertos) no habían sido tratados con anterioridad al momento de la administración en tanto que los perros 3 y 4 (símbolos rellenos) tenían inmunidad preexistente contra el vector AAV9. Los recuentos de glóbulos blancos (WBC) en el CSF para cada punto de tiempo de todos los perros se muestran en el mismo gráfico (líneas punteadas).

Figura 19: Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-hNaglu (A) y representación esquemática del genoma del vector de AAV recombinante, AAV9-CAG-hNaglu (B).

Figura 20: Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-cohNaglu (A) y representación esquemática del genoma del vector de AAV recombinante, AAV9-CAG-cohNaglu (B).

Figura 21: Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2 (A) y representación esquemática del genoma del vector de AAV recombinante, AAV9-CAG-cohNaglu-versión 2 (B).

Figura 22: Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3 (A) y representación esquemática del genoma del vector de AAV recombinante, AAV9-CAG-cohNaglu-versión 3 (B).

Figura 23: Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-comNaglu (A) y representación esquemática del genoma del vector de AAV recombinante, AAV9-CAG-comNaglu (B).

Figura 24: Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-cocNaglu (A) y representación esquemática del genoma del vector de AAV recombinante AAV9-CAG-cocNaglu (B).

DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

El plásmido pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6) fue depositado el 13 de noviembre, 2012, con el número de acceso DSM 26626 en el DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, InhoffenstralJe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.

El plásmido pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 5) fue depositado el 13 de marzo, 2014, con el número de acceso DSM 28568 en el DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, InhoffenstralJe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.

El plásmido pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2 (SEQ ID NO: 20) fue depositado el 29 de abril, 2015, con el número de acceso DSM 32042 en el DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, InhoffenstralJe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.

El plásmido pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3 (SEQ ID NO: 23) fue depositado el 29 de abril, 2015, con el número de acceso DSM 32043 en el DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, InhoffenstralJe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.

DEFINICIONES

El término “secuencia de nucleótidos” se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea de ADN o de ARN, que contiene desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, respectivamente. El ácido nucleico puede ser de cadena doble, de cadena simple o contener porciones de ambas, secuencia de cadena doble o de cadena simple.

El término “% de identidad de secuencia” se refiere al porcentaje de nucleótidos de una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos de la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias para lograr el % máximo de identidad de secuencia. El % de identidad de secuencia se puede determinar mediante cualquier método o algoritmo establecido en el arte, tales como los algoritmos ALIGN, BLAST y BLAST 2.0. Véase Altschul S, et al., Nuc Acids Res., 1977; 25: 3389-3402 y Altschul S, et al., J Mol Biol., 1990; 215: 403-410.

En la presente, el % de identidad de secuencia se calcula dividiendo el número de nucleótidos que son idénticos después de alinear la secuencia de referencia y la secuencia candidata por el número total de nucleótidos de la secuencia de referencia y multiplicando el resultado por 100.

Los términos “codificar” o “codificación” se refieren al código genético que determina cómo una secuencia de nucleótidos es traducida en un polipéptido o una proteína. El orden de los nucleótidos en una secuencia determina el orden de aminoácidos a lo largo de un polipéptido o de una proteína.

El término “proteína” se refiere a una macromolécula compuesta por una o más cadenas lineales de aminoácidos o de polipéptidos. Las proteínas pueden sufrir modificaciones postraduccionales, como la conversión de un residuo cisteína en 3-oxoalanina, glicosilación o unión a metales. La glicosilación de una proteína es la adición de diferentes carbohidratos que están unidos de manera covalente a la cadena de aminoácidos.

El término “cantidad efectiva” se refiere a una cantidad de una sustancia que es suficiente para lograr el propósito pretendido. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un vector de AAV9 para aumentar la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa (NAGLU) es una cantidad suficiente para reducir la acumulación de glicosaminoglicano. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” de un vector de expresión para tratar una enfermedad o un trastorno es una cantidad del vector de expresión suficiente como para reducir o erradicar los signos y los síntomas de la enfermedad o del trastorno. La cantidad efectiva de una sustancia dada variará según factores tales como la naturaleza de la sustancia, la ruta de administración, el tamaño y la especie de animal que recibirá la sustancia y el propósito de administrar la sustancia. El especialista puede determinar de manera empírica la cantidad efectiva para cada caso individual de acuerdo con métodos establecidos en el arte.

El término “individuo” se refiere a un mamífero, preferiblemente un mamífero humano o no humano, más preferiblemente un ratón, una rata, otros roedores, conejo, perro, gato, cerdo, vaca, caballo o primate, más preferiblemente aún es un ser humano.

El término “ ligado operativamente” se refiere a la relación funcional y la ubicación de la secuencia del promotor con respecto al gen de interés (por ejemplo, un promotor o un potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia). En general, un promotor ligado operativamente es contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.

El término “tropismo” se refiere a la manera en que diferentes virus han evolucionado para buscar preferencialmente especies huésped específicas o tipos celulares específicos en dichas especies.

El término “terapia génica” se refiere a la transferencia de material genético (por ejemplo, ADN o ARN) de interés en un huésped para tratar o prevenir una enfermedad o condición genética o adquirida. El material genético de interés codifica un producto (por ejemplo, una proteína, un polipéptido, un péptido o un ARN funcional) cuya producción in vivo es deseable. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar una enzima, una hormona, un receptor o un polipéptido con valor terapéutico.

Los términos “vector viral recombinante”, “vector viral”, “vector recombinante” o “vector” se refieren a un agente obtenido de un virus natural por medio de técnicas de ingeniería genética que permiten transferir un material genético (por ejemplo ADN o ARN) de interés a una célula, que da como resultado la producción del producto codificado por dicho material genético (por ejemplo, una proteína, un polipéptido, un péptido o un ARN funcional) en la célula blanco. En el contexto de la presente invención, un “vector recombinante” o un “vector” se considera que es una proteína de la cápside así como el material genético contenido en ella usada para transferir dicho material genético al interior de una célula. Cuando se hace referencia a un “vector recombinante” o a un “vector” mediante una secuencia de nucleótidos, significa que se refiere a un “vector recombinante” o a un “vector” cuyo genoma es como se muestra en el correspondiente listado de secuencias (SEQ ID).

El término “plásmido recombinante” o “plásmido” se refiere a una pequeña molécula de ADN, circular, de cadena doble, autorreplicante, obtenido mediante técnicas de ingeniería genética que permite transferir un material genético de interés al interior de una célula, que da como resultado la producción del producto codificado por dicho material genético (por ejemplo, una proteína, un polipéptido, un péptido o un ARN funcional) en la célula blanco. Aún más, el término “plásmido recombinante” o “plásmido” también se refiere a una pequeña molécula de ADN, circular, de cadena doble, autorreplicante, que se obtiene mediante técnicas de ingeniería genética utilizadas durante la elaboración de vectores virales como vehículos del genoma del vector recombinante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Además del material genético, el vector recombinante también puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen elementos de control de la transcripción como promotores u operadores, regiones de unión a factores de transcripción o potenciadores y elementos de control para iniciar o terminar la traducción.

Los vectores de acuerdo con la invención son vectores adenoasociados (AAV) que se usan para la transferencia del gen de interés. Se ha demostrado su gran eficacia en la transducción de células postmitóticas en un amplio rango de tejidos. En el contexto de la presente invención, los vectores se usan para suministrar un polinucleótido de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana de codones optimizados, (cohNaglu) (Se Q ID NO: 3, SEQ ID NO: 19 or SEQ ID NO: 22). Un vector adenoasociado es un vector derivado del genoma de un virus adenoasociado de la familia Parvoviridae. El genoma del virus adenoasociado está compuesto por un ácido desoxirribonucleico de cadena simple (ADNcd). Estos vectores infectan a mamíferos pero no son patogénicos (es decir, no causan ninguna enfermedad). Pueden infectar células en división o que no están en división, y su tropismo cambia dependiendo del serotipo. El serotipo es la clasificación de los grupos de virus, según los antígenos de su cápside. El serotipo del virus adenoasociado, determinado por la proteína de su cápside, define el tropismo del virus y permite su entrada en un tipo celular específico. En el contexto de la presente invención, el serotipo 9 de los vectores de virus adenoasociados (AAV9) tiene la mejor capacidad para suministrar el material genético en el cerebro, así como a órganos periféricos, luego de una sola administración.

Los inventores han encontrado sorprendentemente que la asociación, en la misma entidad, de la cápside de AAV9 con una secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa, junto con un promotor CAG específico permite la expresión a largo plazo de la enzima que falta en todas las áreas del cerebro. En consecuencia, se corrige la acumulación lisosómica de glicosaminoglicano (GAG), impidiendo de esa manera las alteraciones neurológicas que son características de las enfermedades de MSPIII y, en particular, de la MPSIIIB. Este efecto se ha obtenido incluso en el bulbo olfatorio, que está distante del punto de administración de los vectores. Además, los vectores AAV9 de acuerdo con la invención, suministrados en el líquido cefalorraquídeo, pudieron alcanzar la circulación sistémica para transducir el hígado. La producción y la secreción de la enzima por las células hepáticas dieron como resultado un aumento en la actividad de la alfa-N-acetilglucosaminidasa en suero, produciendo finalmente una reducción de la patología lisosómica en muchos tejidos somáticos. Esto representa una clara ventaja de los vectores de acuerdo con la invención sobre los abordajes existentes, que solo corrigen parcialmente los signos clínicos de la enfermedad, y que habitualmente ejercen su efecto en el cerebro o en la circulación sistémica, pero no en ambos.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a vectores de AAV9 recombinantes que contienen un promotor CAG (SEQ ID NO: 4) ligado a una secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa SEQ ID NO: 1, es la secuencia SEQ ID NO: 3, la secuencia SEQ ID NO: 19 o la secuencia SEQ ID NO: 22.

En una forma de realización preferida de la descripción, la secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 2.

Los vectores de AAV9 de acuerdo con la presente invención contienen un promotor que controla la traducción y la transcripción del gen de interés. Un promotor es una secuencia de nucleótidos ligada operativamente a dicho gen de interés. El promotor usado en la presente invención es el promotor CAG que se refiere a la combinación que comprende el elemento potenciador temprano de citomegalovirus y el promotor de p-actina de pollo. Además, incluye una porción del intrón de la p-globina que confiere estabilidad al ARNm derivado del gen de interés. Véase Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology, 2008; 9(2): 1-11. El promotor CAG incluido en los vectores de AAV9 de la presente invención tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4. En particular, este promotor CAG demostró ser más eficiente que el promotor CMV utilizado habitualmente en el arte.

En una forma de realización preferida adicional de la descripción, el vector de AAV9 recombinante se selecciona entre AAV9-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 9), AAV9-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 10), AAV9-CAG-cohNaglu-versión 2 (SEQ ID NO: 21) y AAV9-CAG-cohNaglu-versión 3 (SEQ ID NO: 24). Preferiblemente, el vector de AAV9 recombinante se selecciona entre AAV9-CAG-hNaglu (SEQ iD NO: 9) or AAV9-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 10). Más específicamente, los vectores de AAV9 recombinantes de la presente invención están compuestos por la cápside viral del serotipo 9 del virus adenoasociado humano y un genoma modificado que contiene las repeticiones terminales invertidas (ITR) del virus adenoasociado humano del serotipo 2, el promotor CAG, la secuencia codificante (CDS) del gen de la alfa-N-acetilglucosamidinasa humana (Naglu) y la secuencia poliA del gen de beta-globina de conejo.

La presente invención también se refiere a plásmidos que contienen un promotor CAG unido a la secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1, en donde el promotor CAG y la secuencia de nucleótidos están flanqueadas por AAV2 ITRs. En particular, los plásmidos de acuerdo con la presente invención contienen una secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 que es la SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 22.

Estos plásmidos son de utilidad para producir los vectores de AAV9 recombinantes de la presente invención por transfección de células HEK293 usando métodos conocidos en el estado del arte.

En una forma de realización preferida de la descripción, la secuencia de nucleótidos contenida en los plásmidos de la invención y que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 2.

En otra forma de realización preferida de la invención, la secuencia de nucleótidos contenida en los plásmidos de la invención y que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 3.

En otra forma de realización preferida de la invención, la secuencia de nucleótidos contenida en los plásmidos de la invención y que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 19.

En otra forma de realización preferida de la invención, la secuencia de nucleótidos contenida en los plásmidos de la invención y que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 22.

Los plásmidos de la descripción se seleccionan entre pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ID NO: 5), pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6), pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2 (SEQ ID ^{N o :}20) y pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3 (SEQ ID NO: 23) y en especial se seleccionan entre pAAV-CAG-hNaglu (SEQ ^{i D}NO: 5) y pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6), y preferiblemente el plásmido es el pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6).

Los plásmidos de la invención se eligen entre pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6) con número de acceso DSM 26626, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3 que codifica alfa-N-acetilglucosaminidasa SEQ ID NO: 1, pAAV -CAG-cohNaglu-versión2 (SEQ ID NO: 20) con número de acceso DSM 32042, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 19 que codifica para alfa-N-acetilglucosaminidasa SEQ ID NO: 1 o pAAV-CAG-cohNagluversión3 (SEQ ID NO: 23) con número de acceso DSM 32043, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 22 que codifica alfa-N-acetilglucosaminidasa SEQ ID NO: 1, y preferiblemente el plásmido es pAAV-CAG-cohNaglu (SEQ ID NO: 6).

La presente invención proporciona además un método para la producción de los vectores virales adenoasociados recombinantes de AAV9 de acuerdo con la invención. El proceso comprende los pasos de:

i) proporcionar un primer vector que comprende el promotor CAG ligado operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para alfa-N-acetilglucosaminidasa interpuesta entre una primera repetición terminal AAV y una segunda repetición terminal AAV; un segundo vector que comprende un gen AAV rep y un gen AAV cap del serotipo 9; y un tercer vector que comprende el gen de función auxiliar del adenovirus;

ii) cotransfectar células competentes con los vectores del paso i);

iii) cultivar las células transfectadas del paso ii); y

iv) purificar los vectores de expresión a partir del cultivo del paso iii).

En una forma de realización preferida, la primera y la segunda repeticiones terminales de AAV del primer vector son las ITR del serotipo 2 de AAV. En otra forma de realización preferida, los genes rep de AAV del segundo vector son del serotipo 2 de AAV. En otra forma de realización preferida, las células competentes son células HEK293.

La descripción también proporciona un método para la preparación de los plásmidos de acuerdo con la invención, que comprende los pasos de:

i) recortar la secuencia que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa del plásmido de partida, mediante digestión, en particular usando Mlul/EcoRI,

ii) clonar la secuencia que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa entre dos sitios de restricción del esqueleto de AAV del plásmido pAAV-CAG, para así obtener el plásmido correspondiente que incluye la secuencia que codifica la para alfa-N-acetilglucosaminidasa.

La presente invención contempla, en un aspecto adicional, composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de los vectores de AAV9 de la invención, o una cantidad terapéuticamente efectiva de los plásmidos de la invención.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden los vectores de AAV9 recombinantes en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición también puede comprender por lo menos una sustancia auxiliar. Las sustancias auxiliares se pueden seleccionar entre vehículos, excipientes, solventes, diluyentes o adyuvantes. Los vehículos, diluyentes o adyuvantes aceptables son no tóxicos y preferiblemente son inertes a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones amortiguadoras tales como fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; antioxidantes; polipéptidos de bajo peso molecular, proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos; aminoácidos; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol, contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como copolímeros de bloques de polietileno-polioxipropileno (Pluronic F68®) polietilenglicol (PEG).

En una forma de realización preferida, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención son adecuadas para una administración parenteral. Los ejemplos de administración parenteral son inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracisternales e intramusculares. Preferiblemente, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención es adecuada para una administración intravenosa o intracisternal. Las composiciones adecuadas para dicha administración parenteral incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles, polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles. Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención se preservan contra la acción contaminante de bacterias y hongos.

La dosificación diaria para seres humanos y animales puede variar dependiendo de factores que se basan en las respectivas especies o de otros factores tales como la edad, el sexo, el peso o el grado de enfermedad, y semejantes.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso terapéutico de los vectores de AAV9 descritos precedentemente o de los plásmidos descritos precedentemente. Según se mencionó previamente, los vectores de AAV9 recombinantes de acuerdo con la invención logran expresar la enzima Naglu faltante, corrigiendo de esa manera la acumulación lisosómica de GAG. Esto permite corregir todos los signos clínicos de la mucopolisacaridosis tipo III (MPSIII) y en especial la MPSIIIB. En este sentido, la presente invención también se refiere a los vectores de AAV9 recombinantes descritos precedentemente o a los plásmidos de la invención para su uso como un medicamento.

En particular, la invención se refiere a los vectores de AAV9 recombinantes de la invención o a los plásmidos de la invención para aumentar la actividad alfa N-glucosaminidasa en el cuerpo para su uso en el tratamiento de las mucopolisacaridosis.

En un aspecto preferido adicional, la presente invención se refiere a los vectores de AAV9 recombinantes o a los plásmidos de la invención para su uso en el tratamiento de las mucopolisacaridosis tipo III (MPSIII) y en especial de la MPSIIIB.

En aún otra forma de realización, la presente descripción se refiere al uso de los vectores de AAV9 recombinantes descritos precedentemente o de los plásmidos descritos precedentemente en la elaboración de un medicamento de utilidad para el tratamiento de las mucopolisacaridosis tipo III (MPSIII) y en especial de la MPSIIIB.

Otra forma de realización de la presente descripción está dirigida al método de tratamiento de las mucopolisacaridosis tipo III (MPSIII) y en especial de la MPSIIIB, que comprende el paso de administrar por lo menos un vector de AAV9 recombinante descrito precedentemente o por lo menos un plásmido descrito precedentemente a un sujeto que lo necesita.

La presente descripción proporciona además una célula aislada que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1. En particular, la célula de acuerdo con la descripción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 que presenta por lo menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 presenta por lo menos un 84% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. En particular la secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 presenta un 84%, un 87%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. En un aspecto particular adicional, la secuencia de nucleótidos que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1 presenta por lo menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3, y preferiblemente un 85%, un 87%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.

En una forma de realización preferida, las células de la descripción comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID ^{N o :}1.

En otra forma de realización preferida, las células de la descripción comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3 que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID ^{N o :}1.

En otra forma de realización preferida, las células de la descripción comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 19 que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1.

En otra forma de realización preferida, las células de la descripción comprenden la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 22 que codifica la alfa-N-acetilglucosaminidasa de la SEQ ID NO: 1.

Otro aspecto de la invención se refiere a una célula aislada que comprende cualquiera de los vectores recombinantes AAV9 de la invención.

Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos de determinadas formas de realización de la invención y no deben considerarse como restrictivos en modo alguno.

PROCEDIMIENTOS GENERALES

1. Vectores de AAV recombinantes

Los vectores de AAV que se describen aquí se obtuvieron mediante una transfección triple. Los materiales necesarios para elaborar los vectores fueron: células HEK293 (que expresan genes E1), el plásmido auxiliar que proporciona la función de adenovirus, el plásmido que proporciona los genes rep de AAV del serotipo 2 y los genes cap del serotipo 9 (AAV9) y, finalmente, el plásmido esqueleto con las ITR de AAV2 y la construcción de interés.

Para generar los vectores de AAV que expresan la alfa-N-acetilglucosaminidasa, se clonaron los CDS optimizados o no optimizados de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, murina o canina en un plásmido esqueleto de AAV bajo el control del promotor híbrido ubicuo CAG.

Los vectores fueron generados mediante la transfección sin virus auxiliar de células HEK293 utilizando tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita T, et al., Gene Ther., 1998; 5: 938-945 y Wright J, et al., Mol. Ther., 2005; 12: 171-178. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en frascos rotatorios (RB) (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM suplementado con FBS al 10 % y después se cotransfectaron con: 1) un plásmido portador del casete de expresión flanqueado por las ITR virales del AAV de serotipo 2 (descrito previamente); 2) un plásmido portador de los genes rep2 y cap9 del AAV; y 3) un plásmido portador de las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio utilizando un protocolo optimizado, según se describió previamente. Véase Ayuso E, et al., Gene Ther., 2010; 17: 503-510. Los vectores se dializaron contra PBS, se filtraron, se titularon mediante una qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta el momento de su uso.

Los vectores de la presente invención se construyeron de acuerdo con técnicas de biología molecular bien conocidas en el arte.

2. Animales

Se obtuvo un modelo de ratón mutante congénito C57Bl/6J deficiente en alfa-N-acetilglucosaminidasa (MPSIII-B) de The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE.UU. Lote 003827). Véase Li et al., Proc Natl Acad Sci., 1999; 96(25): 14505-10. Se cruzaron por endogamia ratones con MPSIII-B y ratones control sanos a partir de fundadores heterocigotos. Se determinó el genotipo del ADN genómico en muestras procedentes de pequeños cortes en la cola con un análisis por PCR que amplifica una secuencia que comprende la mutación de interés. Las secuencias de los respectivos cebadores sentido y antisentido eran: Cebador directo: 5'-GTC GTC TCC TGG TTC TGG AC-3' (SEQ ID NO: 13), Cebador inverso: 5'-ACC ACT TCA TTC TGG CCA AT-3' (SEQ ID NO: 14), Mutación del cebador inverso: 5'- CGC TTT CTG GGC TCA GAG-3' (SEQ ID NO: 15). Los ratones fueron alimentados ad libitum con una dieta estándar (Harlan, Tekland)) y se mantuvieron según un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 9: 00 A.M.).

3. Administración hidrodinámica de plásmidos que codifican hNAGLU a los ratones

Para la administración hidrodinámica de los plásmidos pAAV-CAG-hNaglu, pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2 y pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3, los animales con MPSIIIB y de tipo salvaje de 2 meses de vida recibieron inyecciones por la vena de la cola, en <5 segundos, una dosis total de 50 |jg de plásmido en un volumen igual al 10% del peso corporal del animal. Esta técnica dio como resultado la expresión de los transgenes codificados por los plásmidos principalmente en el hígado. Véase Liu et al., Gene Ther., 1990; 6(7): 1258-66. Como control, a una cohorte de ratones se le administró un volumen igual de solución salina. Los ratones fueron sacrificados 1 semana después de la inyección hidrodinámica de los plásmidos. Los órganos se cosecharon como se describe en la sección siguiente.

4. Administración del vector y recolección de muestras

Para la administración intracisternal a ratones de los vectores AAV9-CAG-comNaglu, se inyectó una dosis total de 3 x 1010 vg en la cisterna magna de animales de 2 meses de vida con MPSIII-B. Se inyectaron 3,9 x 1010 vg de vector de control no codificante (AAV9-nulo) a una cohorte similar de animales. A los 5 meses de vida, es decir 3 meses después de la administración del vector, los ratones fueron anestesiados y después se perfundieron por vía transcardiaca con 10 ml de PBS para eliminar completamente la sangre de los tejidos. Se recolectó la totalidad del cerebro y de múltiples tejidos somáticos (incluyendo hígado, bazo, páncreas, riñón, pulmón, corazón, músculo esquelético y testículos) y se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C, o bien se introdujeron en formalina para los subsiguientes análisis histológicos.

Para la administración intravenosa de los vectores AAV9-CAG-hNaglu y AAV9-CAG-cohNaglu, los animales de 2 meses de vida con MPSIII-B recibieron una dosis total de 5 x 1011 vg mediante una inyección en la vena de la cola. A los 4 meses de vida, es decir, 2 meses después de la administración del vector, los ratones fueron sacrificados y sus órganos se recolectaron como se describió en el párrafo precedente.

Para la administración intracisternal de los vectores AAV9-CAG-hNaglu y AAV9-CAG-cohNaglu, se inyectó una dosis total de 9,3 x 109 vg en la cisterna magna de animales con MPSIII-B de 2 meses de vida. A los 4 meses de vida, es decir, 2 meses después de la administración del vector, los ratones fueron sacrificados y sus órganos se recolectaron como se describió en el párrafo precedente.

Para la administración intracisternal de los vectores AAV9-CAG-cocNaglu a perros, se administró una dosis total de 6,5 x 1012 vg a perros adultos sanos de la raza Beagle mediante una inyección en la cisterna magna. Dos de los animales recibieron una inyección intravenosa de 1 x 1011 vg/kg de vectores AAV9-nulo 6 semanas antes de la administración de los vectores Naglu para preinmunizarlos contra AAV9. Se recolectaron muestras de CSF y de suero, al principio semanalmente y después mensualmente, y se almacenaron a -80 °C.

5. Cuantificación del número de copias del genoma del vector

Los tejidos (“ 100 mg) fueron digeridos durante la noche (ON) a 56 °C en 400 pl de una solución de Proteinasa K (0,2 mg/ ml). Se aisló ADN total a partir de los sobrenadantes después de una extracción con técnicas convencionales. El ADN se resuspendió en agua destilada y se cuantificó mediante el uso de un NanoDrop ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, d E, EE.UU.). Se determinó el número de copias del genoma del vector en 20 ng de ADN total mediante una PCR cuantitativa en tiempo real con cebadores y sondas específicos para el transgen de la alfa-N-acetilgluosaminidasa murina que no amplifica el locus genómico endógeno. Cebador directo: 5'-GCC GAG GCC CAG TTC TAC-3' (SEQ ID NO: 16); Cebador inverso: 5'-TTG GCG TAG TCC AGG ATG TTG-3' (SEQ ID NO: 17); Sonda: 5'-AGC AGA ACA GCA Ga T ACC AGA TCA CCC-3' (SEQ ID NO: 18). Los valores finales se determinaron por comparación de una curva estándar de referencia, construida a partir de diluciones sucesivas del plásmido linealizado usado para la producción del vector AAV agregado en 20 ng de ADN genómico no transducido.

6. Cuantificación de la actividad de la alfa-N-acetilglucosaminidasa y de glicosaminoglicano

Se sonicaron muestras de hígado y de cerebro en agua Mili-Q. El suero se analizó sin procesar. La actividad de la alfa-N-acetilglucosaminidasa se determinó con un sustrato fluorogénico derivado de la 4-metilumbeliferona (Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL), según se describió previamente. Véase Marsh y Fensom, Clin Genet., 1985; 27(3): 258-262. Los niveles de actividad en cerebro y en hígado se normalizaron frente a la cantidad total de proteína, cuantificada mediante el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). La actividad en suero se normalizó contra el volumen.

Para la cuantificación de los glucosaminoglucanos (GAG) se pesaron muestras de tejido y después se digirieron con proteinasa K y los extractos se clarificaron por centrifugación y filtración. Los niveles de GAG se determinaron en los extractos tisulares con el kit de glucosaminoglucano sulfatado de Blyscan (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB), utilizando 4-sulfato de condroitina como estándar. Los niveles de GAG se normalizaron para el peso de tejido húmedo.

7. Actividad de otras enzimas lisosómicas

La actividad IDUA se midió en 15 pg de proteína incubada durante 1 h a 37 °C con 4-metilumbeliferil-a-N-iduronato (Glycosynth). Para la actividad IDS, primero se incubaron 15 pg de proteína con 4-metilumbeliferil-a-L-iduronato-2-sulfato (Moscerdam Substrates) durante 4 h a 37 °C, seguido por una segunda incubación de 24 h a 37 °C con un grupo de enzimas lisosómicas de testículo de bovinos (LEBT-M2, Moscerdam Substrates). La actividad SGSH se midió como se describió previamente. Véase Haurigot et al., J Clin Invest 2013; 123(8): 3254-71. Para la actividad GUSB, se incubaron 10 pg de proteína con 4-metilumbeliferil-p-D-glucuronato (Sigma) a 37 °C durante 1 h. La actividad HEXB se evaluó por incubación de 0,1 pg de proteína con 4-metilumbeliferil-N-acetil-p-D-glucoaminida (Sigma) durante 1 h a 37 °C. Después de detener las reacciones por aumento del pH, se midió la fluorescencia liberada con un fluorímetro FLx800 (BioTek Instruments). Todas las actividades enzimáticas se normalizaron contra el contenido de proteínas totales cuantificadas mediante Bradford (Bio-Rad).

8. Análisis histológicos

Los tejidos se fijaron durante 12-24 h en formalina, se embebieron en parafina y se seccionaron. Para la detección inmunohistoquímica de LAMP1 en los tejidos somáticos, se sometieron las secciones en parafina a una recuperación del epítopo inducida por calor en solución amortiguadora de citrato, pH 6, y después se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-LAMP1 de rata (1D4B; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) diluido 1:100 y subsiguientemente se incubaron con el anticuerpo anti-rata de conejo biotinilado (Dako, Glostrup, DK) a una relación de 1:300. Para la detección inmunohistoquímica de LIMP2 en el cerebro, se incubaron secciones en parafina durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-LIMP2 de conejo (NB400; Novus Biologicals, Littleton, CO, EE.UU.) diluido 1:100 y subsiguientemente se incubaron con el anticuerpo anti-conejo de cabra biotinilado (31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) a 1:300. Para la inmunotinción de la GFAP en las muestras cerebrales, se incubaron secciones en parafina durante la noche a 4 °C con el anticuerpo anti-GFAP de conejo (Ab6673; Abcam, Cambridge, RU) diluido 1:1.000 y subsiguientemente se incubaron con el anticuerpo anti-conejo de cabra biotinilado (31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) a una relación de 1:300. Las señales de LAMP1, LIMP2 y GFAP fueron amplificadas incubando las secciones con el kit de tinción de ABC-peroxidasa (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) a una dilución de 1:100 y se visualizaron utilizando 3,3-diaminobencidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) como cromógeno. Las imágenes de campo claro se obtuvieron con un microscopio óptico (Eclipse 90i; Nikon, Tokio, JP).

Para teñir las células microgliales de las muestras cerebrales, se incubaron secciones en parafina durante la noche a 4 °C con Bsi-B4 lectina (L5391; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) diluida a 1:100. La señal de Bsi-B4 se visualizó mediante el uso de 3,3-diaminobencidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) como cromógeno. Las imágenes de campo claro se obtuvieron con un microscopio óptico (Eclipse 90i; Nikon, Tokio, JP).

Se usó el software NIS Elements Advanced Research 2.20 para cuantificar las señales de LIMP2, GFAP y Bsi-B4 en 3 - 5 imágenes de cada región cerebral (aumento original, x 20) por animal, mediante el uso de los mismos ajustes de señal umbral en todos los animales. Después se calculó el porcentaje de área positiva, es decir, el área, en pixeles, con una señal positiva con respecto al área tisular total en la imagen.

9. Análisis por microscopía electrónica de transmisión

Los ratones fueron sacrificados mediante una sobredosis de isofluorano (Isofluo Labs. Esteve, Barcelona, ES) y fueron perfundidos por la vena cava inferior con 1 ml de glutaraldehído al 2,5% y paraformaldehído al 2%. Se seccionó una pequeña porción (de aproximadamente 1 mm3) del lóbulo lateral del hígado y de la corteza cerebral y se incubaron durante 2 horas a 4 °C en el mismo fijador. Después de lavarlas con solución amortiguadora de cacodilato frío, las muestras se fijaron luego en tetraóxido de osmio al 1%, se tiñeron con acetato de uranilo acuoso y después se deshidrataron mediante una serie de etanol graduado y se embebieron en resina epoxi. Se tiñeron secciones ultrafinas (600-800 A) de bloques de la resina utilizando citrato-plomo y se examinaron mediante microscopía electrónica de transmisión (H-7000; Hitachi, Tokio, JP).

10. Análisis transcriptómico

Se homogeneizó mecánicamente medio cerebro de ratón (~250 mg) y se aisló el ARN total utilizando mirVanaTM (Ambion, Life Technologies). Se sintetizó el ADNc y subsiguientemente se hibridó en la placa de array GeneChip Mouse Gene 2.1 ST 16 (Affymetrix) por Progenika Biopharma (España); el procesamiento de las muestras, la hibridación y el escaneo se llevaron a cabo según los protocolos y el equipo recomendado por Affymetrix. La normalización de los datos se efectuó usando el método RMA (Robust Multiarray Averaging) con la herramienta Affymetrix® Expression ConsoleTM, y se obtuvieron valores normalizados transformados con log2. Los datos se filtraron para centrar el análisis en secuencias codificantes conocidas, con lo cual se obtuvo un listado inicial de 26688 genes alterados, que luego se volvieron a filtrar para eliminar los genes con una varianza por debajo del percentil 75. Este proceso permitió generar un listado de trabajo de 6672 genes. Para los genes expresados diferencialmente, se establecieron criterios de FDR (Índice de Descubrimientos Falsos) <0,1 con un 80% de confianza. Para los análisis de agrupamiento, se estandarizaron los datos y se representaron como un mapa de calor usando el software J-Express Pro (jexpress.bioinfo.no). El análisis funcional se condujo usando Genecodis Tool 2.0 (genecodis2.dacya.ucm.es). Los datos del ordenamiento fueron enviados a la base de datos ArrayExpress (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/; código de acceso: E-MTAB-2984).

11. Evaluación de la conducta

Los cambios de conducta fueron evaluados mediante la prueba de Campo abierto. Los animales se colocaron en la esquina inferior izquierda de una cámara intensamente iluminada (41 * 41 * 30 cm). La superficie de la arena se dividió en tres cuadrados concéntricos: centro (14 * 14 cm), periferia (27 * 27 cm) y borde (41 * 41 cm). Se registraron la conducta exploratoria y la actividad general durante los primeros dos minutos usando un sistema de seguimiento por video (Smart Junior, Panlab). La prueba siempre se condujo a la misma hora del día (9:00 am a 1:00 pm) para minimizar la influencia de los ciclos circadianos.

12. Análisis estadístico

Todos los resultados se expresan como la media ± SEM. Las comparaciones estadísticas se efectuaron usando un ANOVA de una sola vía, y las comparaciones múltiples entre los grupos de control y los grupos de tratamiento se realizaron con una postprueba de Dunnett. Se consideraba que había significancia estadística si P < 0,05. Se usará el método de Kaplan-Meier para analizar la supervivencia, y la prueba de rango logarítmico para las comparaciones.

EJEMPLOS

Ejemplo de referencia 1: Construcción del pAAV-CAG-hNaglu

Se utilizó la secuencia codificante (CDS) de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana como material de partida (secuencia de referencia del NCBI: NM_000263) y se sintetizó químicamente para este fin (GeneArt; Life Technologies). La CDS se recibió clonada en el plásmido pMA (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en los extremos 5' y 3', respectivamente. La CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa se escindió mediante digestión con MluI/EcoRI y se clonó entre los sitios de restricción MluI y EcoRI del esqueleto AAV del plásmido pAAV-CAG (AmpR). El plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-hNaglu (DSM, N° de Acceso: 28568). Véase la SEQ ID NO: 5 y la Figura 19 A.

El plásmido pAAV-CAG se había generado previamente y contenía las ITR del genoma del AAV2, el promotor CAG y la señal de poliA de la p-globina de conejo, así como un sitio de multiclonación para la clonación de las CDS de interés. El promotor CAG es un promotor híbrido compuesto por el potenciador temprano/intermedio del CMV y el promotor de la p-actina de pollo. Este promotor permite dirigir una potente expresión de manera ubicua. Véase Sawicki J et al., Exper Cell Res., 1998; 244: 367-369, Huang J et al., J Gene Med., 2003; 5: 900-908, Liu Y et al., Exp Mol Med. 2007; 39(2): 170-175.

Ejemplo de referencia 2: Producción de AAV9-CAG-hNaglu

Los vectores AAV9-CAG-hNaglu (la SEQ ID NO: 9 y la Figura 19 B)) se generaron mediante transfección sin virus auxiliar de células HEK293 utilizando tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita, 1998, supra y Wright, 2005, supra. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en frascos rotatorios (RB) (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM suplementado con FBS al 10% y después se cotransfectaron con: 1) un plásmido con el casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-hNaglu); 2) un plásmido con los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido con las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron con dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio utilizando un protocolo estándar o un protocolo optimizado, como se describió previamente. Véase Ayuso, 2010, supra. Los vectores se dializaron contra PBS, se filtraron, se titularon mediante qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta el momento del uso.

Ejemplo 3: Construcción del pAAV-CAG-cohNaglu

Se diseñaron y obtuvieron casetes de expresión que incluían una versión optimizada de la CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana (cohNaglu). Se optimizó la secuencia (GeneArt®) para maximizar la eficacia de producción de la proteína alfa-N-acetilglucosaminidasa en seres humanos por eliminación de sitios de corte y empalme crípticos y de elementos desestabilizantes de la secuencia de ARN para aumentar la estabilidad del ARN, adición de elementos estabilizantes de la secuencia de ARN, optimización de los codones y adaptación del contenido de G/C, evitando estructuras secundarias estables en el ARN, entre otros cambios. La CDS optimizada se recibió clonada en el plásmido pMA-RQ (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y 3', respectivamente.

El plásmido pMA-RQ-cohNaglu fue digerido con MluI y EcoRI para escindir la CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa optimizada. Posteriormente, este fragmento se clonó entre los mismos sitios de restricción del esqueleto del plásmido pAAV-CAG para generar el plásmido pAAV-CAG-cohNaglu (DSM, N° de Acceso: 26626). Véase la SEQ ID NO: 6 y la Figura 20 A.

Ejemplo 4: Producción de AAV9-CAG-cohNaglu

Los vectores AAV9-CAG-cohNaglu (la SEQ ID NO: 10 y la Figura 20 B) se generaron mediante transfección sin virus auxiliar de células HEK293 utilizando tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita, 1998, supra y Wright, 2005, supra. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en frascos rotatorios (RB) (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM suplementado con FBS al 10% y después se cotransfectaron con: 1) un plásmido con el casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-cohNaglu); 2) un plásmido con los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido con las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron con dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio utilizando un protocolo estándar o un protocolo optimizado, como se describió previamente. Véase Ayuso, 2010, supra. Los vectores se dializaron contra PBS, se filtraron, se titularon mediante qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta el momento del uso.

Ejemplo 5: Construcción de pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2

Se diseñaron y obtuvieron casetes de expresión incluyendo una segunda versión optimizada de la CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana (cohNaglu-version 2). La CDS optimizada (DNA 2.0®) se recibió clonada en el plásmido pJ208 (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y 3', respectivamente.

El plásmido pJ208-cohNaglu-versión 2 fue digerido con MluI y EcoRI para escindir la CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa-versión 2 optimizada. Posteriormente, este fragmento se clonó entre los mismos sitios de restricción del esqueleto del plásmido pAAV-CAG para generar el plásmido pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2 (DSM, N° de Acceso: 32042). Véase la SEQ ID No : 20 y la Figura 21 A.

Ejemplo 6: Producción de AAV9-CAG-cohNaglu-versión 2

Los vectores AAV9-CAG-cohNaglu-versión 2 (la SEQ ID NO: 21 y la Figura 21 B) se generaron mediante transfección sin virus auxiliar de células HEK293 utilizando tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita, 1998, supra y Wright, 2005, supra. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en frascos rotatorios (RB) (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM suplementado con FBS al 10% y después se cotransfectaron con: 1) un plásmido con el casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2); 2) un plásmido con los genes rep del AAV2 y cap del a AV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido con las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron con dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio utilizando un protocolo estándar o un protocolo optimizado, como se describió previamente. Véase Ayuso, 2010, supra. Los vectores se dializaron contra PBS, se filtraron, se titularon por qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta el momento del uso.

Ejemplo 7: Construcción de pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3

Se diseñaron y obtuvieron casetes de expresión incluyendo una tercera versión optimizada de la CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana (cohNaglu-versión 3). La CDS optimizada (GenScript, Inc) se recibió clonada en el plásmido pUC57 (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y 3', respectivamente.

El plásmido pUC57-cohNaglu-versión 3 fue digerido con MluI y EcoRI para escindir la CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa-versión 3 optimizada. Posteriormente, este fragmento se clonó entre los mismos sitios de restricción del esqueleto del plásmido pAAV-CAG para generar el plásmido pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3 (DSM, N° de Acceso: 32043). Véase la SEQ ID No : 23 y la Figura 22 A.

Ejemplo 8: Producción de AAV9-CAG-cohNaglu-versión 3

Los vectores AAV9-CAG-cohNaglu-versión 3 (la SEQ ID NO: 24 y la Figura 22 B) se generaron mediante transfección sin virus auxiliar de células HEK293 utilizando tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita, 1998, supra y Wright, 2005, supra. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en frascos rotatorios (RB) (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM suplementado con FBS al 10% y después se cotransfectaron con: 1) un plásmido con el casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-cohNaglu-versión 3); 2) un plásmido con los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido con las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron con dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio utilizando un protocolo estándar o un protocolo optimizado, como se describió previamente. Véase Ayuso, 2010, supra. Los vectores se dializaron contra PBS, se filtraron, se titularon por qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta el momento del uso.

Ejemplo de referencia 9: Construcción de pAAV-CAG-comNaglu

La CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa murina (secuencia de referencia del NCBI: NM_013792) fue sometida a una optimización de secuencia (GeneArt; Life Technologies). La CDS optimizada se recibió clonada en el interior del plásmido pMA-RQ (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y 3', respectivamente.

El fragmento de la CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa murina optimizada MluI/EcoRI se escindió del plásmido pMA-RQ y subsiguientemente se clonó entre los sitios de restricción MluI y EcoRI del esqueleto AAV del plásmido pAAV-CAG. El plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-comNaglu. Véase la SEQ ID No : 7 y la Figura 23 A.

Ejemplo de referencia 10: Producción de AAV9-CAG-comNaglu

Los vectores AAV9-CAG-comNaglu (la SEQ ID NO: 11 y la Figura 23 B) se generaron mediante transfección sin virus auxiliar de células HEK293 utilizando tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita, 1998, supra y Wright, 2005, supra. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en frascos rotatorios (RB) (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM suplementado con FBS al 10% y después se cotransfectaron con: 1) un plásmido con el casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-comNaglu); 2) un plásmido con los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido con las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron con dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio utilizando un protocolo estándar o un protocolo optimizado, como se describió previamente. Véase Ayuso, 2010, supra. Los vectores se dializaron contra p Bs , se filtraron, se titularon por qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta el momento del uso.

Ejemplo de referencia 11: Construcción de pAAV-CAG-cocNaglu

La CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa canina (secuencia de referencia del NCBI: XM_548088.4) fue sometida a una optimización de secuencia (GeneArt; Life Technologies). La CDS optimizada se recibió clonada en el interior del plásmido pMA-RQ (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y 3', respectivamente.

El fragmento de la CDS de la alfa-N-acetilglucosaminidasa canina optimizada MluI/EcoRI se escindió del plásmido pMA-RQ y subsiguientemente se clonó entre los sitios de restricción MluI y EcoRI del esqueleto AAV del plásmido pAAV-CAG. El plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-cocNaglu. Véase la SEQ ID NO: 8 y la Figura 24 A.

Ejemplo de referencia 12: Producción de AAV9-CAG-cocNaglu

Los vectores AAV9-CAG-cocNaglu (la SEQ ID NO: 12 y la Figura 24 B) se generaron mediante transfección sin virus auxiliar de células HEK293 utilizando tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita, 1998, supra y Wright, 2005, supra. Las células se cultivaron hasta un 70% de confluencia en frascos rotatorios (RB) (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM suplementado con FBS al 10% y después se cotransfectaron con: 1) un plásmido con el casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-cocNaglu); 2) un plásmido con los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido con las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron con dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio utilizando un protocolo estándar o un protocolo optimizado, como se describió previamente. Véase Ayuso, 2010, supra. Los vectores se dializaron contra p Bs , se filtraron, se titularon por qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta el momento del uso.

Ejemplo de referencia 13: Adm inistración hidrodinámica del plásmido pAAV9-CAG-hNaglu

Se administró una dosis total de 50 |jg del plásmido pAAV9-CAG-hNaglu conteniendo el casete de expresión con la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana de tipo salvaje a ratones con MPSIIIB de 2 meses de vida mediante inyección hidrodinámica en la vena de la cola (HDTV). Esta técnica dirige la expresión del plásmido suministrado al hígado. Véase Liu et al., Gene Ther., 1990; 6(7): 1258-66.

Una semana después de la administración del plásmido, se documentó un aumento considerable de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa por encima de los niveles de pretratamiento en el hígado y el suero de todos los animales que habían sido administrados con los plásmidos que codifican la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana de tipo salvaje. Véase, las Figuras 1A y 1B. No se detectó actividad en los animales con MPSIIIB que habían recibido inyecciones con solución salina. Los niveles de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa observados en el hígado y en el suero de los animales tratados correspondían al 150% y al 1700%, respectivamente, con respecto al valor promedio de actividad medido en el hígado y el suero de animales WT, que se definió como el 100%. Véase las Figuras 1A y 1B.

Ejemplo de referencia 14: Adm inistración intravenosa de AAV9-CAG-hNaglu

Se administró una dosis total de 5 x 1011 de genomas de vector de los vectores AAV9-CAG-hNaglu a ratones con MPSIII-B de 2 meses de vida mediante inyección en la vena de la cola.

De manera consistente con el elevado tropismo de los vectores AAV9 por el hígado, dos meses después de la administración, los animales tratados mostraron niveles altos de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en este órgano (un 700% con respecto a los niveles de actividad observados en animales sanos), que eliminaron por completo o redujeron considerablemente la acumulación patológica de GAG observada en los tejidos somáticos de los ratones con MPSIII-B no tratados. Véase la Figura 2A-C. Además, dada la gran eficacia con que los vectores AAV del serotipo 9 transducen el cerebro luego de una administración sistémica, los animales tratados mostraron niveles significativos de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa (20-30% de los ratones sanos) en todas las regiones del cerebro analizadas. Véase la Figura 3A. Este restablecimiento parcial de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa fue suficiente para limpiar el almacenamiento de GAG de todas las áreas del cerebro. Véase la Figura 3B.

Ejemplo 15: Adm inistración intravenosa de AAV9-CAG-cohNaglu

Se administró una dosis total de 5 x 1011 de genomas de vector de los vectores AAV9-CAG-cohNaglu a ratones con MPSIII-B de 2 meses de vida mediante inyección en la vena de la cola.

Dos meses después de la administración, los animales tratados mostraron niveles altos de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el hígado (un 600% con respecto a los niveles saludables) y un aumento moderado (un 7% con respecto a los niveles saludables) en los niveles de actividad en suero. Véase las Figuras 4A y 4B. La producción de alfa-N-acetilglucosaminidasa eliminó por completo o redujo considerablemente la acumulación patológica de GAG observada en los tejidos somáticos de los ratones con MPSIII-B no tratados. Véase la Figura 4C. Adicionalmente, los animales tratados mostraron niveles significativos de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa (un 18-27% con respecto a los ratones saludables) en todas las regiones de cerebro analizadas. Véase la Figura 5A. Este restablecimiento parcial de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa fue suficiente para limpiar el almacenamiento de GAG de todas las áreas del cerebro. Véase la Figura 5B.

Ejemplo de referencia 16: Adm inistración intracisternal de AAV9-CAG-hNaglu

Se inyectó una dosis total de 9,3 x 109 de genomas de vector del vector AAV9-CAG-hNaglu en la cisterna magna de animales con MPSIII-B de 2 meses de vida en un volumen total de 5 jl.

La administración intra-CSF de los vectores AAV9-CAG-hNaglu condujo a niveles altos de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en todas las áreas de cerebro analizadas (un 50-100% con respecto a los ratones sanos); en las partes más frontales del cerebro, la actividad alcanzó los niveles observados en animales sanos. Véase la Figura 6A. El excesivo almacenamiento de GAG fue anulado por completo en los cerebros de los ratones con MPSIII-B tratados. Véase la Figura 6B. Cuando se administraban en el CSF, los vectores AAV del serotipo 9 pasan al torrente sanguíneo y transducen el hígado. Véase Haurigot et al., J Clin Invest 2013; 123(8): 3254-71. De acuerdo con ello, se detectó actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el hígado de ratones con MPSIII-B tratados, a niveles del 32% con respecto a los animales sanos. Véase la Figura 7A. Este aumento de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa intervino en la corrección de la acumulación de GAG en hígado, bazo, corazón, pulmón, testículo y vejiga urinaria, y también disminuyó significativamente la acumulación de GAG en riñón. Véase la Figura 7B.

Ejemplo 17: Adm inistración intracisternal de AAV9-CAG-cohNaglu

Se inyectó una dosis total de 9,3 x 109 de genomas de vector del vector AAV9-CAG-cohNaglu en la cisterna magna de animales con MPSIII-B de 2 meses de vida en un volumen total de 5 pl.

La administración intracisternal de los vectores AAV9-CAG-cohNaglu condujo a un aumento considerable de los niveles de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa, que variaba en un rango de entre un 22% y un 45% con respecto a los valores saludables, en todas las regiones de cerebro analizadas. Véase la Figura 8A. Por lo tanto, la acumulación patológica de GAG fue revertida por completo en todas las regiones de cerebro de los ratones con MPSIIIB tratados. Véase la Figura 8B. La actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa también aumentó en el hígado de ratones con MPSIII-B tratados en hasta un 25% con respecto a los animales sanos. Véase la Figura 9A. Este aumento de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa intervino en la corrección de la acumulación de GAG en hígado, corazón, pulmón y vejiga urinaria, y también disminuyó significativamente la acumulación de GAG en bazo, testículo y riñón. Véase la Figura 9B.

Ejemplo 18: Adm inistración hidrodinámica del plásmido pAAV9-CAG-cohNaglu-versión 2

Se administró una dosis total de 50 pg del plásmido pAAV9-CAG-cohNaglu-versión 2 portando un casete de expresión que contiene una versión optimizada (versión 2) de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana a ratones con MPSIIIB de 2 meses de vida mediante inyección hidrodinámica en la vena de la cola. Como se mencionó previamente, esta técnica dirige la expresión del plásmido suministrado al hígado. Véase Liu et al., supra.

Una semana después de la administración del plásmido, la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa había aumentado con respecto a los niveles de pretratamiento en hígado y suero de todos los animales que recibieron una inyección hidrodinámica del plásmido que contiene la versión optimizada 2 de la secuencia codificante de la alfa-N-acetilglucosaminidasa. Véase las Figuras 10A y 10B. No se detectó actividad en los animales con MPSIIIB que habían recibido inyecciones con solución salina. En los animales tratados, la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en hígado y suero alcanzó niveles que eran de un 150% y un 1500%, respectivamente, con respecto al valor promedio de dicha actividad observada en animales WT (definido como el 100%). Véase las Figuras 10A y 10B.

Ejemplo 19: Adm inistración hidrodinámica del plásmido pAAV9-CAG-cohNaglu-versión 3

Se administró una dosis total de 50 pg del plásmido pAAV9-CAG-cohNaglu-versión 3 que contiene un casete de expresión con una versión de codones optimizada (versión 3) de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana a ratones con MPSIIIB de 2 meses de vida mediante inyección hidrodinámica en la vena de la cola. Como se mencionó previamente, esta técnica dirige la expresión del plásmido suministrado al hígado. Véase Liu et al., supra.

Una semana después de la administración del plásmido, se documentó un aumento considerable de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa por encima de los niveles de pretratamiento en el hígado y el suero de todos los animales que habían sido administrados con el plásmido que contiene el casete de expresión que contenía la versión 3 de la secuencia codificante de la alfa-N-acetilglucosaminidasa humana de codones optimizados. Véase las Figuras 11A y 11B. No se detectó actividad en los animales con MPSIIIB que habían recibido inyecciones con solución salina. Los niveles de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa observados en el hígado y en el suero de los animales tratados correspondían al 170% y al 1.100%, respectivamente, del valor promedio de actividad determinado en el hígado y el suero de animales WT, que se había definido como el 100%. Véase las Figuras 11A y 11B.

Ejemplo de referencia 20: Adm inistración intracisternal de AAV9-CAG-comNaglu

Se inyectó una dosis total de 3 x 1010 de genomas de vector del vector AAV9-CAG-comNaglu en la cisterna magna de animales con MPSIII-B de 2 meses de vida en un volumen total de 10 pl.

Los genomas del vector AAV9 se pudieron detectar en todas las áreas de cerebro analizadas, así como en la médula espinal. En los tejidos periféricos, los genomas del vector fueron detectados con un número considerable de copias del gen únicamente en el hígado, y con un bajo número de copias del gen en los nódulos linfáticos, en los que drena la cabeza (nódulos linfáticos mandibulares). Véase las Figuras 12A-B.

La administración intra-CSF de los vectores AAV9-CAG-comNaglu condujo a niveles muy altos de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en todas las áreas de cerebro analizadas; alcanzando niveles que eran varias veces mayores que los observados en todas las regiones de los animales sanos. Véase la Figura 13a . Tres meses después de la administración del vector, la patología lisosómica característica de la enfermedad había revertido completamente en los cerebros de los ratones con MPSIII-B tratados, según indicaba la normalización de la acumulación de GAG y la intensidad de la señal del marcador lisosómico LIMP-2+ en todas las áreas de cerebro analizadas. Véase las Figuras 13B y 14A. El análisis ultraestructural de la corteza occipital y del cerebelo mediante microscopía electrónica de transmisión confirmó la reducción de la patología lisosómica, que era muy evidente en las células gliales perineuronales corticales, que aparecían distendidas y llenas de grandes vesículas de almacenamiento en los animales con MPSIII-B que recibieron vector de control, en tanto tenían un aspecto normal en los animales tratados con AAV9-CAG-comNaglu. Véase la Figura 14B. En las LSD, puede estar alterada de manera secundaria a la perturbación de la homeostasis lisosómica normal la actividad de varias enzimas lisosómicas además de la que está afectada de manera directa por la mutación heredada. Véase Sardiello et al., Science: 2009; 325: 473-477. En el cerebro de ratones macho con MPSIIIB no tratados o tratados con vectores nulos de 5 meses de vida, las actividades de iduronato 2-sulfatasa (IDS), N-sulfoglucosamina sulfohidrolasa (SGSH), p-glucuronidasa (GUSB) y phexosaminidasa (HEXB) habían aumentado significativamente. Véase la Figura 14C. De manera consistente con la reducción del almacenamiento de GAG observada 3 meses después de una administración intra-CSF de vectores AAV9-CAG-comNaglu, la actividad de SGSH, GUSB y HEXB en cerebro volvió a los niveles saludables, de tipo salvaje, en los animales tratados. Véase la Figura 14C.

En concordancia con la corrección de la patología lisosómica, todos los signos de inflamación desaparecieron de los cerebros de los ratones con MPSIII-B tratados. Las intensidades de las señales de las tinciones usadas para detectar astrocitosis (GFAP) y microgliosis (BSI-B4) eran similares en los ratones con MPSIII-B tratados y en los animales sanos, en contraposición a las señales documentadas en ratones con MPSIII-B sin tratar, que mostraban una clara sobrerregulación por aumento de estos marcadores de neuroinflamación. Véase las Figuras 15A y 15B. Para evaluar adicionalmente la eficacia de la terapia génica con AAV9-CAG-comNaglu intra-CSF sobre la inflamación del CNS, se condujo un estudio de determinación del perfil de expresión genética usando la plataforma de microarray Affimetrix® con ARN total aislado de encéfalos de WT y MPSIIIB tratados con AAV9-CAG-comNaglu o tratados con AAV9-Nulos. Después de procesar y filtrar los datos, se encontraron 94 genes que estaban expresados diferencialmente entre los tres grupos. Cuando se usó el análisis de enriquecimiento ontológico de genes (GO) para clasificar los genes expresados diferencialmente según el proceso biológico, 67 de los 94 genes fueron anotados con sus correspondientes ontologías. Véase la Figura 15C. Entre ellos, la gran mayoría estaba asociada con inflamación e inmunidad innata o funciones que pueden atribuirse a las células involucradas en estos procesos. Véase la Figura 15C. Para confirmar esta observación, los autores usaron un análisis de enriquecimiento en tipos celulares (CTEN) para evaluar la contribución de los diferentes tipos celulares a los cambios observados en los niveles de transcritos. Este software considera que hay enriquecimiento de un tipo celular específico si la calificación definida por el software es mayor que 2. La calificación más alta para los conjuntos de datos obtenidos por los autores se obtuvo para células de la microglía (calificación = 60), y este resultado concuerda con el rol importante atribuido a la microglía en las enfermedades neurodegenerativas y en las MPSIII. Véase Ohmi et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2003; 100: 1902 1907, McGeer et al., Alzheimer Dis Assoc Disord., 1998; 12 (Suplemento 2): S1-E16, Derecki et al., Nature, 2012; 484: 105-109, DiRosario et al., J Neurosci Res., 2009; 87: 978-990, Archer, et al., J Inherit Metab Dis., 2014; 37: 1-12. Cuando se evaluó el efecto de la administración intra-CSF de los vectores AAV9-CAG-comNaglu, se observó un cambio sorprendente en el perfil de expresión genética con respecto a los animales que recibieron inyecciones de AAV9-Nulo. Tres meses después de la administración del vector, la gran mayoría de los genes en los ratones con MPSIIIB tratados presentaron niveles de transcritos que eran semejantes a los observados en los compañeros de camada sanos. Casi un 90% de los genes expresados diferencialmente en los ratones con MPSIIIB no tratados mostraron una corrección de sus niveles de transcritos de por lo menos un 50% después del tratamiento con AAV9-CAG-comNaglu y en un 60% de ellos la corrección era del 75%. Se observaron grados de normalización de los niveles de transcritos similares o ligeramente más altos cuando el conjunto de los genes asignados por el software CTEN a la microglía se analizaba por separado. Véase la Figura 15D. Esta observación sustenta la idea de que la microglía es responsable en gran medida del perfil de expresión genética observado en la MPSIIIB y concuerda con la reversión completa de las microgliosis documentadas para los animales tratados.

Los vectores AAV9 administrados en el CSF pasan a la periferia y transducen el hígado. Véase la Figura 9 y Haurigot et al., supra. Consecuentemente, se documentó un aumento de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el hígado y el suero de los ratones con MPSIII-B tratados con AAV9-CAG-comNaglu, alcanzando niveles de aproximadamente un 800% de los niveles observados en animales sanos. Véase las Figuras 16A y 16B. Los niveles de actividad enzimática en suero se correlacionan bien con los de actividad en el hígado de los ratones tratados, lo que sugiere que el hígado era la fuente principal de enzima circulante. Cuando se evaluó la eficacia somática de la terapia por cuantificación del contenido en g Ag en diferentes órganos, se observó una normalización completa en la mayoría de los tejidos, incluyendo hígado, bazo, corazón y pulmón, a excepción del riñón en el que se observó una reducción > 50% de GAG. Véase la Figura 16C. El análisis ultraestructural del hígado en los diferentes grupos experimentales demostró la desaparición completa de las vacuolas de almacenamiento que son características de la enfermedad MPSIII-B de los hepatocitos de los ratones con MPSIII-B tratados con AAV9-CAG-comNaglu. Véase la Figura 16D. Al igual que lo observado en el CNS, el aclaramiento del material de almacenamiento del compartimento lisosómico condujo al restablecimiento de la actividad de otras enzimas lisosómicas. En el hígado de ratones con MPSIIIB no tratados o tratados con vectores nulos, estaban alteradas las actividades de a-iduronidasa (IDUA), de iduronato 2-sulfatasa (IDS), SGSH, GUSB y HEXB. Véase la Figura 16E. Tres meses después de la transferencia del gen NAGLU mediada por el AAV9, la actividad de todas estas enzimas habían retornado a niveles normales, lo cual sustenta aún más el concepto de que la transferencia genética por el CSF de NAGLU mediante el vector AAV9-CAG-comNaglu también puede revertir el fenotipo de la enfermedad en los órganos periféricos. Véase la Figura 16E.

El impacto de la administración intra-CSF del AAV9-CAG-comNaglu sobre la conducta fue evaluado con la prueba de campo abierto, que evalúa la actividad locomotora y exploradora general de los ratones en entornos desconocidos. Los ratones con MPSIII-B sin tratar y tratados con AAV9-nulo mostraron una actividad exploradora reducida en comparación con los ratones sanos en términos de latencia para entrar al centro, del tiempo invertido en el límite, del número de entradas al centro, del tiempo de reposo, de la distancia total recorrida y del número de líneas cruzadas. La administración intracisternal de AAV9-CAG-comNaglu corrigió por completo las deficiencias de conducta. Véase las Figuras 17A-F.

Aún más, el tratamiento con AAV9-CAG-comNaglu prolongó significativamente la esperanza de vida de los ratones con MPSIII-B. A los 15 meses de vida, todos los ratones con MPSIII-B sin tratar habían muerto, mientras que el 100% de los animales que recibían AAV9-CAG-comNaglu intracisternal todavía estaban con vida a los 18 meses de vida. Véase las Figuras 17G. Los machos con MPSIII-B tratados mostraban una mediana de supervivencia de 21 meses, en comparación con una mediana de supervivencia de 13,8 meses para los machos con MPSIII-B tratados con AAV9-nulo; P = 0,0007. La mediana de supervivencia de machos sanos era de 26,6 meses. La normalización de las respuestas de conducta y la mayor supervivencia de los ratones con MPSIII-B tratados también demostraron la eficacia terapéutica de AAV9-CAG-comNaglu.

Ejemplo de referencia 21: Adm inistración intracisternal de AAV9-CAG-cocNaglu a perros

El primer paso hacia la aplicación clínica de una metodología de terapia génica requiere la demostración de su viabilidad en un modelo animal grande. Los autores demostraron con anterioridad que la distribución de los vectores AAV9 luego de una administración en el líquido cefalorraquídeo de perros de la raza Beagle, un modelo animal con un tamaño cerebral cercano al de los seres humanos, es muy similar a la observada en ratones que recibían una dosis equivalente de vector por la misma ruta. Véase Haurigot et al., supra. Brevemente, la administración de 2 x 1013 vg de vectores AAV9 que codifican la proteína reportera GFP demostró una transducción de células diseminada en el cerebro, el cerebelo, las meninges, la médula espinal y los ganglios de la raíz dorsal. De manera similar a las observaciones realizadas en ratones, la GFP también se detectó en el hígado de los perros de la raza Beagle, en donde transdujo un promedio de un 3,7% de los hepatocitos. Véase Haurigot et al., supra. Más importante aún, la administración intra-CSF de vectores AAV9 que codifican la enzima lisosómica sulfamidasa, cuya deficiencia causa la MPSIIIA, condujo a niveles sostenidos de la enzima en el CSF de los perros tratados. El CSF baña el CNS, con lo cual la enzima estará disponible para diferentes estructuras del CNS. De hecho, la administración periódica de la enzima recombinante en el CSF es una estrategia terapéutica que actualmente está en investigación clínica para la MPSIIIA. Véase NCT01155778 y NCT01299727, clinicaltrials.gov.

Se ha usado la misma metodología para ilustrar la potencial eficacia de los vectores AAV 9 de acuerdo con la presente invención.

Se administró una dosis total de 6,5 x 1012 vg de vectores AAV9-CAG-cocNaglu en la cisterna magna de 4 perros adultos de la raza Beagle (Perros 1-4). Para evaluar el impacto de la inmunidad preexistente sobre los niveles de actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el CSF que se podrían lograr mediante el tratamiento, dos de estos perros (los perros 3 y 4) fueron inmunizados mediante la administración sistémica de 1 x 1011 vg/kg de vectores no codificantes AAV9-nulos 6 semanas antes de la administración en el CSF. En el momento de efectuar la administración intracisternal de los vectores, los perros sin tratamiento previo tenían títulos bajos de anticuerpos neutralizantes anti-AAV9 (NAbs) en circulación y en el CSF, como se esperaría para animales que no estuvieron expuestos previamente al virus de tipo salvaje o recombinante. Por el contrario, los perros preinmunizados tenían títulos elevados de NAb en la circulación, pero niveles bajos en el CSF, una observación que es compatible con la distribución asimétrica de los NAb a través de la barrera hematoencefálica. Véase la Figura 18A y Haurigot et al., supra. La administración de los vectores AAV9-CAG-cocNaglu en la cisterna magna condujo a un aumento significativo de la actividad de la enzima medida en las muestras de CSF de los 4 perros, con ninguna diferencia significativa con respecto a la presencia o no de una inmunidad preexistente. Véase la Figura 18B. Los niveles de actividad enzimática mostraron un pico entre la 2a y la 3a semana, y alcanzaron niveles de estado estacionario de allí en adelante. Más importante aún, este aumento de la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el CSF era de larga duración (> 4 meses). Véase la Figura 18B.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un vector AAV9 recombinante que contiene un promotor CAG SEQ ID NO: 4 ligado a una secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO: 1, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa SEQ ID NO: 1 es la secuencia SEQ ID NO: 3, la secuencia SEQ iD NO: 19 o SEQ ID NO: 22.

2. Un plásmido que contiene un promotor CAG ligado a una secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO: 1, donde el promotor CAG y la secuencia de nucleótidos están flanqueados por AAV2 ITRs, y donde dicho plásmido es pAAV-CAG-cohNaglu con el número de acceso DSM 26626, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3 que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO : 1, pAAV-CAG-cohNaglu-versión 2 con número de acceso DSM 32042, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 19 que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO: 1 o pAAV-CAG-cohNaglu-versión3 con número de acceso DSM 32043, que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 22 que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa, SEQ ID NO: 1.

3. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del vector AAV9 recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o el plásmido de acuerdo con la reivindicación 2, preferiblemente en donde dicha composición farmaceútica es para administración intravenosa o intracisternal.

4. El vector AAV9 recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o el plásmido de acuerdo con la reivindicación 2, para su uso como medicamento.

5. El vector AAV9 recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o el plásmido de acuerdo con la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento de mucopolisacaridosis en donde dicho vector AAV9 o dicho plásmido incrementan la actividad alfa-N-acetilglucosaminidasa en el cuerpo.

6. El vector AAV9 recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o el plásmido de acuerdo con la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento de mucopolisacaridosis, preferiblemente para mucopolisacaridosis tipo IIIB.

7. Un método de producción de los vectores definidos en la reivindicación 1, que comprende los pasos de:

i) proporcionar un primer vector que comprende el promotor CAG ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica para la alfa-N-acetilglucosaminidasa interpuesta entre una primera repetición terminal del AAV y una segunda repetición terminal del AAV; un segundo vector que comprende un gen Aa V rep y un gen AAV cap del serotipo 9; y un tercer vector que comprende el gen de función auxiliar del adenovirus;

ii) cotransfectar células competentes con los vectores del paso i);

iii) cultivar las células transfectadas del paso ii); y

iv) purificar los vectores de expresión a partir del cultivo del paso iii).

8. Una célula aislada que comprende el vector recombinante AAV9 de acuerdo a la reivindicación 1.