JP2023515792A

JP2023515792A - 遺伝子治療

Info

Publication number: JP2023515792A
Application number: JP2022549307A
Authority: JP
Inventors: レベッカアールフォスター，; モインアーソンサリーム－ウディン，; ギャビン，イアンウェルシュ，
Original assignee: ザユニバーシティオブブリストル
Priority date: 2020-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2023-04-14
Also published as: WO2021176220A1; AU2021231959A1; IL296016A; GB202003109D0; CN115315517A; BR112022016936A2; CA3170657A1; US20230101788A1; EP4114957A1; MX2022010934A

Abstract

本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ｃ導入遺伝子；及び最小ネフリンプロモーターＮＰＨＳ１又はポドシンプロモーターＮＰＨＳ２を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター遺伝子治療を提供する。糖尿病性腎臓疾患等の腎臓疾患を処置又は予防するために、遺伝子治療ベクターを使用して、腎臓の糸球体内のポドサイトを標的化することができる。
【選択図】図６

Description

本発明は、ＶＥＧＦＣ導入遺伝子と腎臓特異的プロモーターを含む遺伝子治療ベクター、並びに糖尿病性腎臓疾患の処置又は予防における遺伝子治療ベクターの使用に関する。

全身性内皮機能障害は、糖尿病における血管損傷の発症の開始段階であり、微量アルブミン尿（尿中アルブミン分泌３０～３００ｍｇ／日）を伴う。微量アルブミン尿は糸球体の破壊を示すこと、及び初期糖尿病性腎臓疾患（ＤＫＤ）を臨床的に検出する最初の指標であることは広く受け入れられている。糖尿病性腎臓疾患は、糖尿病患者の最大４５％に発症し、先進国では末期腎疾患患者の５０％を糖尿病患者が占めている。

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ｃは、血管及びリンパ性ネットワークのリモデリングによるマウスモデルにおける多嚢胞性腎臓疾患の発症からの保護、リンパ脈管新生の増強による片側尿管閉塞モデルにおける腎間質線維化からの保護、並びに近年では、腎リンパ管密度の増加を介する、塩分誘発性高血圧症における腎線維化、アルブミン尿、及び血圧上昇に対する保護等、種々の形態の腎機能障害に対する治療薬としての可能性が浮上している。

本発明者らは、近年、ＶＥＧＦＣが糸球体において有益な効果を有し、ＤＫＤから保護し得ることを示した。腎臓ではリンパ管は糸球体を密接に支持していないが、ＶＥＧＦＣはポドサイトで発現し、培養中のヒト糸球体内皮細胞（ＧＥｎＣ）にシグナルが伝達され、バリア性を上昇させる。マウスにおけるポドサイト特異的なＶＥＧＦＣの過剰発現（ｐｏｄＶＥＧＦＣ）は、１型糖尿病モデルにおいてアルブミン尿の発症から保護し、ＧＥｎＣ開窓密度の低下を防止した。さらに、２型糖尿病モデルにおいて、組換え（ｒ）ＶＥＧＦＣは、糸球体のアルブミン透過性をレスキューした。興味深いことに、ｉｎｖｉｖｏでグリコカリックス特異的酵素を用いてＧＥｎＣグリコカリックスを損傷させた場合、糸球体アルブミン透過性はｒＶＥＧＦＣによって有意にレスキューされた。（Ｏｎｉｏｎｓら、２０１８）。これらのデータを合わせると、ＶＥＧＦＣは、ＧＥｎＣ表現型を維持することにより、初期ＤＫＤから保護することが示される。ＶＥＧＦＣは、他のＶＥＧＦと同様に、血漿半減期が約９分であり、そのため、ＶＥＧＦＣの治療可能性は、その継続的な局所発現に依存する。

ＶＥＧＦＣ遺伝子治療は、ヒトでの利用が成功している。アデノウイルス５型（Ａｄｖ５）、リムファクチン（Ｌｙｍｆａｃｔｉｎ）（登録商標）（米国特許出願公開第２０１４／００８７００２号）を用いたヒトにおけるＶＥＧＦＣ遺伝子治療の戦略が考案されている。この遺伝子治療は、患者自身の腹壁又は鼠径部由来の組織のフラップの脂肪パッドへの結節周囲注射（すなわち、標的化送達）により送達される。その後、組織のフラップは外科手術により罹患腕の腋窩領域に移植される。リムファクチン（登録商標）は、第１相臨床試験が成功しており、１５名の患者のコホートにおいて安全であること及びよく忍容されることが実証されている。しかし、全身送達されると、このＡｄｖ５ベクターは急速に不活化されるため、感染効率の点で問題がもたらされる。

ＤＫＤのためにヒトにおいてＶＥＧＦＣ遺伝子発現を駆動する刺激的な機会は未だ残っているが、腎臓への、及び腎臓内の両方に適切に標的化されることが必要である。本発明は、糸球体内の特定の細胞にＶＥＧＦＣを効率的に送達することができ、それによってＤＫＤの処置又は予防のための治療を提供することができる新規な遺伝子治療ベクターを提供することを目的とする。

本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ｃ導入遺伝子と、最小ネフリンプロモーターＮＰＨＳ１又はポドシンプロモーターＮＰＨＳ２とを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター遺伝子治療を提供する。糖尿病性腎臓疾患等の腎臓疾患を処置又は予防するために、この遺伝子治療ベクターを使用して、腎臓の糸球体内のポドサイトを標的化することができる。理論に縛られるものではないが、本発明者らは、ポドサイトが腎臓疾患における遺伝子治療アプローチのための高度に扱いやすい標的を提供すること、並びにＶＥＧＦＣをポドサイトに標的化することによって、糸球体血管の完全性が保護及び／又はレスキューされることができると考えている。

最小ヒトネフリンプロモーター（ＮＰＨＳ１）の例示的なＤＮＡ配列を示す。ヒトＶＥＧＦＣ導入遺伝子のための例示的なｃＤＮＡ配列を示す。ＷＰＲＥ配列の例示的なＤＮＡ配列を示す。ｂＧＨポリ（Ａ）シグナル配列のための例示的なＤＮＡ配列を示す。ＡＡＶＬＫ０３ＶＥＧＦＣの生産に使用したコンストラクトを示す。このコンストラクトでは、ｈポドシン（ｈｐｏｄｏｃｉｎ）をＶＥＧＦＣで置き換えた。陽性対照（トランスフェクトされたＨＥＫ２９３）及びＡＡＶＬＫ０３ＶＥＧＦＣ感染ポドサイトにおけるヒトＶＥＧＦＣ－ＦＬＡＧの発現を示す。近位尿細管細胞又は糸球体内皮細胞における発現は観察されず、このことはＶＥＧＦＣの発現がポドサイトに特異的であることを示す。ｐＣＭＶ３－ＶＥＧＦＣ発現プラスミド又はｍｏｃｋを使用してトランスフェクトしたＨＥＫ細胞、及びＮｐｈｓ１．ＡＡＶ－ＶＥＧＦＣ又は対照ウイルスを使用してトランスフェクトしたポドサイトから得られたＶＥＧＦＣ馴化培地の効果を示す。ＨＥＫ細胞からの馴化培地で刺激した糸球体内皮細胞へのＷＧＡ結合が増加し（図７Ａ参照）、ポドサイトの馴化培地で刺激した糸球体内皮細胞へのＷＧＡ結合が有意に増加する（図７Ｂ参照）強い傾向があった。

適切なＡＡＶベクター血清型は、２／９、ＬＫ０３及び３Ｂを含む。

ＡＡＶ２／９血清型は、新生児及び成体マウス腎臓に対する有意なトロピズムを示し、糸球体及び尿細管に局在し（Ｌｕｏら、２０１１；Ｐｉｃｃｏｎｉら、２０１４；Ｓｃｈｉｅｖｅｎｂｕｓｃｈら、２０１０）、腎臓静脈注射と組み合わせたＡＡＶ２／９ベクターは腎臓標的化遺伝子送達に適していることが示されている（Ｒｏｃｃａら、２０１４）。したがって、ＡＡＶ２／９は、本発明の遺伝子治療で使用するための１つの適切なベクターである。

ＬＫ０３等の合成ＡＡＶキャプシドも、本発明の遺伝子治療で使用するための適切なベクターであり得る。このベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏにおいて、ヒト初代肝細胞を高い効率で形質導入することが示されている。しかし、現在まで、腎臓標的化遺伝子送達には利用されていなかった。驚くべきことに、ＡＡＶ－ＬＫ０３ベクターは、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてヒトポドサイトにおいて１００％に近い高い形質導入を達成でき、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてポドサイトを特異的に形質導入するために使用できる（国際公開第２０２０／１４８５４８号を参照）。

ＡＡＶ－ＬＫ０３キャップ配列は、７つの異なる野生型血清型（ＡＡＶ１、２、３Ｂ、４、６、８、９）由来の断片からなるが、ＡＡＶ－３Ｂがキャップ遺伝子配列の９７．７％、及びアミノ酸配列の９８．９％を占める。ＡＡＶ－３Ｂは、そのヒト肝細胞へのトロピズムでも知られており、本発明の遺伝子治療における使用に適切な他のベクターである。現在までのところ、これは腎臓標的化遺伝子送達には利用されていない。

ＶＥＧＦＣはリンパ脈管新生増殖因子であり、ＶＥＧＦＲ－３（Ｆｌｔ４）及びＶＥＧＦＲ－２（Ｆｌｋ４）という２つの受容体を介してシグナル伝達を行うことが知られている。ＶＥＧＦＣは細胞によってプレプロペプチド形態で産生され、二量体化した後、ＶＥＧＦ相同ドメインを含む２つのＮ末端３１ｋＤａ形態とＢＲ３モチーフを含む２つのシステインリッチＣ末端２９ｋＤＡ形態から構成される四量体に切断される。この四量体形態は、細胞によって分泌された後、２１ｋＤａＶＥＧＦ相同ドメインを含む１つの３１ｋＤａ形態、ＢＲ３モチーフを含む１つのシステインリッチ２９ｋＤａ形態、及び２１ｋＤａＶＥＧＦ相同ドメインからなる中間形態に切断される。その後、Ｎ末端のプロペプチドが除去され、非共有相互作用によって結合した２つの２１ｋＤａＶＥＧＦ相同ドメインから構成される成熟ＶＥＧＦＣが生じる。ＶＥＧＦＣのタンパク質分解処理のさらなる詳細は、例えば、Ｊｏｕｋｏｖら、１９９７に記載されている。

ＶＥＧＦＣ導入遺伝子は、ＶＥＧＦＣの任意の形態、例えばプレプロペプチド形態、四量体形態、中間形態、又は完全に処理された成熟ＶＥＧＦＣをコードするポリヌクレオチドを含む。所望の場合、異なる形態のＶＥＧＦＣポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを任意の組合せで使用することができる。好ましくは、ＶＥＧＦＣ導入遺伝子は、ＶＥＧＦＣ生物学的活性を有する１つ又は複数のポリペプチド、すなわち、ＶＥＧＦＲ－２及び／又はＶＥＧＲＦ－３に結合して活性化できるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。より好ましくは、ＶＥＧＦＣ導入遺伝子は、ＶＥＧＦＣ相同ドメインを含み、ＶＥＧＦＣ生物学的活性を有するポリペプチド、すなわち、ＶＥＧＦＲ－２及び／又はＶＥＧＲＦ－３に結合して活性化できるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。適切なＶＥＧＦＣポリヌクレオチド及びポリペプチドのさらなる詳細には、国際公開第２０１５／０２２４４７号及び米国特許出願公開第２０１４／００８７００２号に記載のものが含まれる。

導入遺伝子種は、好ましくは、患者種に一致させる。例えば、ヒトの患者を処置する場合、典型的には、ヒトの導入遺伝子を使用することになる。導入遺伝子は、天然に存在する、例えば、野生型であっても、又は組換え型であってもよい。導入遺伝子は典型的には、ｃＤＮＡ配列として遺伝子治療ベクターに含まれる。しかしながら、ＶＥＧＦＣ導入遺伝子は、上述したような任意のＶＥＧＦＣポリペプチドをコードする核酸配列を含む、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ等の任意のポリヌクレオチドであってもよい。例えば、ＶＥＧＦＣポリヌクレオチドは、図２のＶＥＧＦＣオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列を含んでいてもよい。ＶＥＧＦＣポリヌクレオチドは、その生物学的活性、特にＶＥＧＦＲ－２及びＶＥＧＦＲ－３に結合して活性化する能力を保持しているＶＥＧＦＣポリペプチドをコードする限り、図２のＶＥＧＦＣＯＲＦ配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含んでいてもよい。好ましくは、図２のＶＥＧＦＣ配列は、ポリヌクレオチド配列の末端に終止コドンを含む。適切な終止コドンは当業者に周知であり、ＴＡＧ、ＴＡＡ及びＴＧＡを含む。好ましくは、終止コドンはＴＡＡである。

上記の記載において、用語「同一性」は、２つの配列の類似性を指すために使用される。本発明の目的のために、ここでは、２つの配列のパーセント同一性を決定するために、配列は最適な比較目的のために整列される（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適な整列のために、第１の配列の配列にギャップが導入されてもよい）ことが定義される。その後、各位置のヌクレオチド／アミノ酸残基を比較する。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸又はヌクレオチド残基によって占められている場合、その位置において分子は同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（すなわち、重複位置）×１００）。一般的に、２つの配列は同じ長さである。配列比較は、典型的には、比較される２つの配列の全長にわたって実施される。

当業者は、２つの配列間の同一性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータプログラムが利用可能であるという事実を認識するであろう。例えば、配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つの核酸配列間のパーセント同一性は、グローバルＤＮＡ整列；パラメータ：二本鎖；スコアリングマトリクス：線形（ミスマッチ２、オープンギャップ（ＯｐｅｎＧａｐ）４、エクストギャップ（ＥｘｔＧａｐ）１）を使用して、配列整列ソフトウェアクローンマネージャー９（Ｓｃｉ－Ｅｄソフトウェア－ｗｗｗ．ｓｃｉｅｄ．ｃｏｍ）を用いて、決定することができる。

或いは、２つのアミノ酸又は核酸配列間のパーセント同一性は、ブロッサム（Ｂｌｏｓｕｍ）６２マトリクス又はＰＡＭ２５０マトリクスのいずれかと、１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重みと、１、２、３、４、５又は６の長さ重みを使用して、アクセルリス（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｇｃｇ／で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込んだＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）のアルゴリズムで決定できる。２つのアミノ酸又は核酸配列間のパーセント同一性を評価するためのさらなる方法は、例えば、デフォルトパラメータを使用したヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴｎ又はアミノ酸配列用のＢＬＡＳＴｐを使用して、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｗｗｗ．ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で利用可能なＢＬＡＳＴ配列比較ツールを使用することであってもよい。

最小ネフリンプロモーター、例えばＮＰＨＳ１又はポドシンプロモーターＮＰＨＳ２の使用によって、遺伝子治療ベクターをポドサイトに特異的に標的化することが可能になる（Ｍｏｅｌｌｅｒら、２００２；Ｐｉｃｃｏｎｉら、２０１４）。これにより、導入遺伝子の発現を腎臓の糸球体基底膜のポドサイトに特異的に標的化することが可能になり、オフターゲットの発現が最小限に抑えられる。ポドサイトは終末分化した非分裂細胞であるため、導入遺伝子の安定的な発現のために標的化することができ、ベクター希釈効果の危険性を低減又は回避することができる。本発明の好ましい実施形態において、プロモーターはＮＰＨＳ１である。ＮＰＨＳ１プロモーターの適切なＤＮＡ配列の一例を図１に示す。導入遺伝子と同様に、プロモーターの種は、好ましくは患者の種に一致させる。例えば、ヒト患者を治療する場合、典型的にはヒトＮＨＰＳ１又はヒトＮＰＨＳ２を使用することになる。

ＡＡＶベクターは、ウッドチャック（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ）肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含んでいてもよい。ＷＰＲＥは、転写されると、発現を増強する三次構造を作成するＤＮＡ配列である。ＷＰＲＥを含むことにより、ベクターによって送達される導入遺伝子の発現を上昇させることができる。ＷＰＲＥ配列は、ＲＮＡ増強活性を著しく失うことなく発癌性を低下させるように変異させてもよい（Ｓｃｈａｍｂａｃｈら、２００５、参照により本明細書に組み込まれる）。適切なＷＰＲＥ配列の一例を図３に示す。

ＶＥＧＦＣ導入遺伝子は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ等のタンパク質タグを含んでいてもよい。ＨＡはエピトープタグとして使用することができ、それが付加されたタンパク質の生物学的活性又は生体内分布を妨げないことが示されている。タンパク質タグは、導入遺伝子の検出、単離、及び精製を容易にすることができる。他の適切なタンパク質タグとしては、Ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ及びｆｌａｇタグが挙げられる。

ＡＡＶベクター遺伝子治療は、プロモーターとＶＥＧＦＣ導入遺伝子との間にコザック（Ｋｏｚａｋ）配列をさらに含んでいてもよい。コザック配列は、翻訳プロセスの開始において主要な役割を果たすことが知られており、そのため、ＶＥＧＦＣ導入遺伝子の発現を増強することができる。

ＡＡＶベクター遺伝子治療は、例えば図４に示すように、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル等のポリアデニル化シグナルをさらに含んでいてもよい。ポリアデニル化は、メッセンジャーＲＮＡに対するポリ（Ａ）テールの付加である。ポリ（Ａ）テールは複数のアデノシン一リン酸からなり、言い換えれば、アデニン塩基のみを有するＲＮＡの伸長部である。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳、及び安定性に重要である。したがって、ポリアデニル化シグナルを含めることによって、ＶＥＧＦＣ導入遺伝子の発現を増強することができる。

ＡＡＶベクター遺伝子治療は、ベクターのいずれかの端部に逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含んでいてもよい。例えば、ベクターの構造は、以下の順：ＩＴＲ－プロモーター－導入遺伝子（任意選択でタンパク質タグを有する）－任意選択のＷＲＰＥ－ポリアデニル化シグナル－ＩＴＲであってもよい。

したがって、本発明の遺伝子治療ベクターは、患者における腎臓疾患、特に糖尿病性腎臓疾患（ＤＫＤ）を処置又は予防するために用いることができる。ＤＫＤは、初期糖尿病性腎臓疾患であってもよい。糖尿病は血管損傷を伴っており、全身性内皮機能障害はこの損傷の開始段階である。全身性内皮機能障害は、糸球体の破壊を示す、微量アルブミン尿（尿アルブミン分泌３０～３００ｍｇ／日）を伴っている。微量アルブミン尿は、最初の臨床的に検出可能なＤＫＤの指標である。そのため、初期ＤＫＤは、糸球体濾過速度（ＧＦＲ）の上昇を伴っていてもよい、微量アルブミン尿の存在によって識別されることがある。患者は、１型糖尿病又は２型糖尿病を含む糖尿病を有していてもよい。

ＤＫＤは、１型糖尿病又は２型糖尿病に関連していてもよい、確立されたＤＫＤであってもよい。ＤＫＤのステージ分類において、ＧＦＲは腎臓がどの程度機能しているかを確認するために使用することができる試験である。特に、糸球体が１分間に濾過する量を推定する。確立された（中等度）ＤＫＤの患者は、約４０～５０ｍｌ／分のＧＦＲを有していてもよい。正常なＧＦＲは約１１０ｍｌ／分であり、一方、約３０ｍｌ／分未満の速度は重度のＤＫＤを示し、約１５ｍｌ／分未満では透析が必要となる。タンパク尿のレベルもＤＫＤのステージ分類に用いることができ、確立したＤＫＤは３００ｍｇ／日を超える尿蛋白の分泌を伴う。タンパク尿レベルは、単独で、又はＧＦＲと組み合わせて、ＤＫＤのステージ分類に使用することができる。

本明細書で使用される用語「患者」は、ヒトを含む任意の哺乳動物を含んでいてもよい。患者は、成人であっても、新生児若しくは乳児等の小児科の患者であってもよい。

ＡＡＶベクター遺伝子治療は、静脈内注射等によって、全身投与されてもよい。本発明の実施形態において、ＡＡＶベクター遺伝子治療は、腎動脈への注射によって投与されてもよい。本発明の代替的な実施形態において、ＡＡＶベクター遺伝子治療は、逆行性投与、例えば、尿道カテーテルを用いた尿管経由によって投与されてもよい。

遺伝子治療は、単回投与として投与されてもよく、言い換えれば、ベクターのその後の投与は必要でない場合もある。繰り返し投与が必要な場合には、ベクターに異なるＡＡＶ血清型を使用することができる。例えば、最初の投与で使用されるベクターは、ＡＡＶ－ＬＫ０３又はＡＡＶ－３Ｂを含んでいてもよく、一方、その後の投与で使用されるベクターは、ＡＡＶ２／９を含んでいてもよい。

遺伝子治療は、例えば、経口ステロイドによる処置と同時に、又はそれに続いて遺伝子治療を投与することによって、患者の一時的な免疫抑制と任意選択で組み合わせて投与してもよい。ベクターに対する患者の免疫応答を抑制するために、遺伝子治療の処置前及び／又はその間、免疫抑制が望ましいことがある。しかし、ＡＡＶキャプシドはベクターによってコードされていないため、形質導入された細胞内に一過性にのみ存在する。したがって、キャプシドは徐々に分解されて除去される、これは、キャプシド配列が形質導入された細胞から除去されるまで、キャプシドに対する免疫応答を遮断する短期免疫調節レジメンは、導入遺伝子の長期発現を可能にし得る。したがって、遺伝子治療の投与後、約６週間の期間、免疫抑制が望ましいことがある。

遺伝子治療ベクターは、追加的又は代替的に、既存の治療と組み合わせて投与することができる。例えば、遺伝子治療ベクターは、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アルドステロンアンタゴニスト（例えば、スピロノラクトン）又はアンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）等のレニン－アンジオテンシン処置戦略と組み合わせて、追加的に又は代替的に投与されてもよい。遺伝子治療ベクターは、追加的又は代替的に、１つ又は複数のＳＧＬＴ２阻害剤と組み合わせて投与してもよい。

ＡＡＶベクター遺伝子治療は、医薬組成物の形態で投与してもよい。すなわち、ＡＡＶベクター遺伝子治療は、１つ又は複数の薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わされていてもよい。適切な医薬組成物は、好ましくは無菌である。

ＤＫＤは、糸球体で発症する疾患であるが、糸球体特異的な治療戦略がない。現在のところ、処置の主流は血圧の上昇を標的とすることである。ＤＫＤの初期の指標である糸球体濾過速度の上昇及び微量アルブミン尿は、共にポドサイトの超微細構造変化が見られる前の糸球体内皮の超微細構造の変化に関連している。この時点で標的化処置を開始することが最も有益であろう。

本研究の目的は、ＤＫＤの微小血管合併症から保護するための成功している戦略と、安全及び成功している遺伝子送達アプローチを組み合わせ、疾患の初期にＶＥＧＦＣ遺伝子発現をポドサイトに送達できるようにすることである。

仮説：標的化ポドサイトアデノ随伴ウイルスＶＥＧＦＣ遺伝子治療は、内皮機能障害から保護し、ＤＫＤを予防する。

目的１：ポドサイト特異的ＶＥＧＦＣ形質導入のためのＡＡＶ遺伝子治療ツールの作成及び検証。

目的２：これが試験的ＤＫＤの発症を予防することの実証。

目的３：原理証明：ヒト糸球体組織におけるポドサイトＶＥＧＦＣ遺伝子発現の標的化。
ポドサイト標的化遺伝子治療：本発明者らは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いて、ヒト及びマウスのポドサイトにおける標的化遺伝子送達システムを開発した（国際出願ＰＣＴ／ＧＢ２０２０／０５００９７参照）。ポドサイト特異的プロモーター（ネフリン）を用いて、ＡＡＶ血清型２／９がｉｎｖｉｖｏでポドサイトに感染し、ポドシンの発現を誘導することに成功した。Ｃｒｅ－Ｌｏｘｐシステムを用いてポドシンをノックダウンした、タンパク尿がもたらされる動物（ＮＰＨＳ２ｆｌ／ｆｌ）では、ＡＡＶ処置によりポドシンの発現を回復し、タンパク尿を改善させることに成功した。また、本発明者らは、同一プロモーターを用いた、ＡＡＶＬＫ０３によるヒトポドサイトへのＧＦＰの効率的及び特異的な形質導入（ＡＡＶ２／９より効率が良い）を示している。これらの技術を組み合わせて、マウスにおいてポドサイトのＶＥＧＦＣ遺伝子形質導入を駆動し、その後ヒト糸球体組織で原理証明を示すことを目的としている。

目的１：ポドサイト特異的ＶＥＧＦＣ形質導入のためのＡＡＶ遺伝子治療ツールの作成及び検証
この計画では、マウス研究にはＡＡＶ２／９を、及びヒト研究にはＡＡＶＬＫ０３を使用する予定である。ＡＡＶ３Ｂはヒト研究にも使用され、大動物試験にも使用される。本発明者らは、細胞培養とマウスモデルの両方において、ＡＡＶを使用して、最小ネフリンプロモーター（１．２Ｋｂ）が、ＡＡＶのパッケージサイズの制限（４．７Ｋｂ）にもかかわらず、ポドサイトにおける形質導入の誘導に成功していることを、実証している。ヒト及びマウスの両方の最小ネフリンプロモーターがマウス組織への形質導入の駆動に有効であったため、この計画を通じてヒトネフリンプロモーターを使用する。このことは、ｉｎｖｉｖｏでポドサイトにおける遺伝子形質導入を効果的に駆動できることを実証している。

ヒトｒＶＥＧＦＣは、以前に、浸透圧ミニポンプで送達した場合、マウス腎臓でｉｎｖｉｖｏで効果があることが示されており、ヒトＶＥＧＦＣは、マウスの皮膚で遺伝子導入により過剰発現され、機能的効果があることが示されている。したがって、ヒトＶＥＧＦＣは、マウス及びヒトの研究で同一コンストラクトを使用する。

ＡＡＶベクターは、ヒトにおける遺伝子送達の代表的なプラットフォームと考えられている。ＡＡＶベクターは一本鎖のＤＮＡゲノムを有する直径２６ｎｍのキャプシドである。ＡＡＶベクターは非病原性で免疫原性が低く、多くの臨床試験で成功が証明されており、最初は、リポタンパク質リパーゼをコードするＡＡＶ１であるグリベラ（Ｇｌｙｂｅｒａ）であり、全身適用を含む他が続く（ＡＡＶ８及びＡＡＶ９）。ポドサイトへの標的化形質導入は、全身適用後に、肝トロピズムの影響を取り除くと考えられる。

Ｎ末端ＨＡタグ（１２６０ｂｐ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）又はＮ末端ＭｙＣタグを有するヒト全長ＶＥＧＦＣ（Ｊｈａら）は、ヒト最小ネフリンプロモーター（ＮＰＨＳ２）を含む本発明者らのＡＡＶ２／９、ＡＡＶＬＫ０３及びＡＡＶＬ３ベクターにライゲーションされる。

マウスポドサイト、糸球体内皮細胞、及び近位尿細管上皮細胞をＡＡＶ２／９ＶＥＧＦＣ又は空ベクターに感染させる。適切な力価を決定する。感染は、ＲＮＡ抽出及びウイルス粒子についてのＱＰＣＲにより定量化する。形質導入は、ＨＡ、ＭｙＣの免疫蛍光染色及び／又は細胞溶解液のＶＥＧＦＣ発現のＥＬＩＳＡによる定量により確認する。

ヒトポドサイト、及び糸球体内皮細胞、及び近位尿細管上皮細胞をＡＡＶＶＥＧＦＣ（ＬＫ０３又は３Ｂ）又は空ベクターに感染させる。感染及び形質導入は、上記のマウス細胞株と同様に確認する。

全ての細胞型に感染するが、ＶＥＧＦＣの発現はポドサイトにのみ生じることが期待される。

目的２：これが試験的ＤＫＤの発症を予防することの実証
糖尿病性腎症を伴う２つの１型糖尿病マウスモデル：ＳＴＺＤＢＡ２／Ｊ及びＯＶＥ２６ＦＶＢが利用可能である。後者はより重症の糖尿病性腎症モデルを示し、ヒトの病態生理により類似しており（８週までにアルブミン尿、３カ月で過剰濾過、及び９カ月でＧＦＲ低下）、８カ月で血圧が上昇（収縮期及び拡張期）している。ポドサイトの損失は１２週に観察可能である。

ＳＴＺ及びＯＶＥ２６を並行して使用したパイロット試験：
ＡＡＶ－ＶＥＧＦＣ又はビヒクルをＳＴＺ後６週若しくは１２週、又は６週及び１２週齢（ＯＶＥ２６）に尾静脈注射する。群中、Ｎ＝２。尿試料は２週間ごとに採取する。頬静脈血は２週間ごとに採取する。尿アルブミンクレアチニン比（ｕＡＣＲ）及びｅＧＦＲを算出する。糸球体ＶＥＧＦＣ発現を、各モデルにおけるポドサイトの生存率と相関させる。これにより、各モデルにおける（最新の）介入時期及び試験的エンドポイントの決定が補助される。

ＳＴＺＤＢＡ２／Ｊマウス－オスＮ＝９各条件
（ｉ）シャム（Ｓｈａｍ）＋ビヒクル
（ｉｉ）ＳＴＺ＋ビヒクル
（ｉｉｉ）ＳＴＺ＋ＡＡＶＶＥＧＦＣ
読み取り：ｕＡＣＲ、ｅＧＦＲ、糸球体透過性アッセイ、例えばＥＭによる組織学的特徴。

ＯＶＥ２６ＦＶＢマウス－オス及びメス。Ｎ＝９、各条件。
（ｉ）同腹仔対照、非糖尿病性＋ビヒクル
（ｉｉ）糖尿病性＋ビヒクル
（ｉｉｉ）糖尿病性＋ＡＡＶＶＥＧＦＣ
読み取り：ｕＡＣＲ、ｅＧＦＲ、糸球体透過性アッセイ、例えばＥＭによる組織学的特徴。

この目的は、ＶＥＧＦＣ形質導入がＤＫＤの初期ＧＥｎＣ変化とアルブミン尿を予防すること、及びこの処置が長期的に有効であることを確認することである。

目的３：原理証明：ヒト組織におけるポドサイトＶＥＧＦＣ遺伝子発現の標的化
糸球体は、移植に適さないヒトドナー腎臓から単離される。既存の計画でこれらの腎臓を定期的に受け入れるためのインフラが既に設定されている。ＡＡＶに感染させた多能性幹細胞から得たヒト腎臓オルガノイドは、日による発現が以前に示されている。糸球体は、ＡＡＶＬＫ０３ＶＥＧＦＣ、ＡＡＶ３ＢＶＥＧＦＣ、又は空ベクターを培養培地に添加する前に１日間懸濁培養する。５日後、以前懸濁培養したヒト糸球体で行ったように、糸球体を溶解し、ティシュー－テック（ｔｉｓｓｕｅ－ｔｅｋ）で固定し、切片を作成する。

感染：糸球体溶解液は、ｍＲＮＡを抽出し、ＱＰＣＲによりウイルス粒子を定量化する。

ＶＥＧＦＣの発現：内皮細胞又はメサンギウム細胞ではなく、ポドサイトによるＶＥＧＦＣの形質導入を実証するために、共焦点免疫蛍光法共局在試験を行う。また、溶解した糸球体におけるＶＥＧＦＣ発現をヒトＶＥＧＦＣＥＬＩＳＡで定量化する。

ヒト糸球体の生存率：本発明者らは、ヒト糸球体を懸濁状態で１０日間まで培養して、生理的学的反応を維持できること、並びにヒト糸球体は７日間まで培養中で生存可能であることを示した。終了時（培養６日間）に、新鮮な糸球体で生存率を確認する。

これらの試験は、最小で３つの別々のヒト糸球体集団（すなわち、３つの腎臓）に対して実施する。

成功した場合、この目的は、臨床的に安全なベクターを用いてヒト糸球体におけるＶＥＧＦＣの効果的な形質導入を実証することである。

実施例２：ヒトＶＥＧＦＣのＡＡＶベクターへのクローニング
ヒトＶＥＧＦＣ－ＦＬＡＧを、ＡｆｌＩＩ及びＳｂｆＩ制限部位を用いて、最小ネフリンプロモーター（ｈＮＰＨＳ１）下で発現するＡＡＶＬＫ０３ベクターにクローニングした（図５参照）。クローン配列を確認した後、増殖させ、精製した。

ＶＥＧＦＣ－ＦＬＡＧのＡＡＶベクターへのクローニング
ＶＥＧＦＣのインサートを、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＨＧ１０５４２－ＣＦ）からのｐＣＭＶ３－ＯＲＦ－ＦＬＡＧをテンプレートとして、ＡｆｌＩＩ制限を含むプライマー配列ＧＡＴＣｃｔｔａａｇＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧＣＡＣＴＴＧＣＴＧＧをフォワードとして、ＳｂｆＩ制限部位を含むＧＡＴＣｃｃｔｇｃａｇｇＴＴＡＡＡＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴをリバースとして使用して増幅させた。ＮＥＢＱ５ＨＦ２Ｘマスターミックス（ＭａｓｔｅｒＭｉｘ）（Ｍ０４２Ｓ）を、製造者の指示に従い、プライマーのアニール温度として６０℃を使用した増幅に使用した。ゲル電気泳動により正しいサイズの単一の産物（１２００ｂｐのバンド）を確認した後、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ）（２８１０４）を用いてＰＣＲ反応物を清浄した。ＶＥＧＦＣアンプリコン及びＡＡＶベクターｐＡＶ．Ｈｎｐｈｓ１．ｈｐｏｄＨＡ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨをＡｆｌＩＩ及びＳｂｆＩによって３７℃で、２時間、二重消化した。ＡＡＶベクターの制限消化物を１％アガロースゲルで１００Ｖ、１．５時間流すことによって、消化産物から直鎖化した二重消化ベクターの分離が可能になった。ＶＥＧＦＣＰＣＲ消化物をキアゲンＰＣＲ精製キットで再度清浄した。消化したＡＡＶベクターをゲルから切り出し（６，５００ｂｐのバンド）、キアゲンゲル精製キット（Ｇｅｌｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ）（２８１１５）で精製した。清浄及び精製が完了すると、ベクターとインサートの比率１：１を使用して、１００ｎｇのベクターを用いてライゲーションを設定した。ライゲーションには、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｔ４ライゲース（Ｌｉｇａｓｅ）（Ｍ１８０）を製造者の指示にしたがって使用した。ライゲーションが完了すると、ライゲーション産物をＮＥＢ５－αコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（高効率）（Ｃ２９８７）細胞を用いて、製造者の指示にしたがって形質転換した。形質転換物は、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレート上にプレーティングし、３７℃で一晩静置した。コロニーをＶＥＧＦＣインサートについてスクリーニングし、配列を検証した。

免疫蛍光法による腎臓細胞株におけるＶＥＧＦＣ－ＦＬＡＧの発現
温度感受性ＳＶ４０Ｔ－抗原で形質転換した糸球体内皮細胞（ＧＥｎＣ）、ポドサイト（ＬＹ）、近位尿細管上皮細胞（ＰＴＥＣ）を６ウェルプレートのカバースリップ上に播種し、８０％コンフルエントに達するようにした。その後、２５ｕｌの精製ＡＡＶＬＫ０３ＶＥＧＦＣウイルスに細胞を感染させ、３３℃から３７℃に温度を切り替え、それによってＳＶ４０Ｔ－抗原を分解させ、細胞の分化を可能にした。ＧＥｎＣｓ及びＰＴＥＣは５日間、一方ＬＹは１０日間分化させた。陽性対照として、ＶＥＧＦＣをＣＭＶプロモーター下で発現するｐＣＭＶ３－ＯＲＦ－ＦＬＡＧプラスミドで２９３ＨＥＫ細胞をトランスフェクトし、高い発現レベルがもたらされた。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％ＰＦＡで固定し、シグマ（Ｓｉｇｍａ）の抗ＦＬＡＧＭ２（Ｆ３１６５）、続いてシグマの抗マウス５９４（ＳＡＢ４６０００９２）で染色し、各細胞型での発現レベルを決定した。陽性対照として、２９３ＨＥＫ細胞を、ＣＭＶプロモーター下でＶＥＧＦＣを発現するｐＣＭＶ３－ＯＲＦ－ＦＬＡＧプラスミドでトランスフェクトし、高い発現レベルがもたらされた。その後、細胞を落射蛍光顕微鏡で撮像した。

結果
結果は、陽性対照（トランスフェクトしたＨＥＫ２９３）及びＡＡＶＬＫ０３ＶＥＧＦＣ感染ポドサイトにおける、ヒトＶＥＧＦＣ－ＦＬＡＧの発現を示す（図６参照）。近位尿細管細胞又は糸球体内皮細胞では発現が全く観察されず、このことは、ＶＥＧＦＣの発現がポドサイトに特異的であることを示している。したがって、ＡＡＶＬＫ０３ＶＥＧＦＣベクターは、作製が成功しており、ポドサイトに特異的に標的化することができる。ＶＥＧＦＣが糸球体内皮細胞の生存を促進し、アルブミン透過性を低下させること（Ｆｏｓｔｅｒら、２００８）、並びにＶＥＧＦＣが内皮細胞表面のグリコカリックス層を強化することができ、これが内皮アルブミン透過性を制御すること（Ｆｏｓｔｅｒら、２０１３）を示す本発明者らの以前の研究を共に考慮すると、これらのデータによって、糖尿病性腎臓疾患等の腎臓疾患を治療又は予防するために、本発明の遺伝子治療ベクターを使用して、腎臓の糸球体内のポドサイトを標的化することができることが示される。

実施例３：ＡＡＶ－ＶＥＧＦＣ感染ポドサイトからの馴化培地は糸球体内皮グリコカリックスへの細胞表面レクチン結合を増加させる
ＨＥＫ細胞をｐＣＭＶ３－ＶＥＧＦＣ発現プラスミド又はｍｏｃｋによってトランスフェクトし、ポドサイトをＮｐｈｓ１．ＡＡＶ－ＶＥＧＦＣ又は対照ウイルスに感染させた。馴化培地を除去し、スピンカラムを用いて濃縮し、糸球体内皮培地に再懸濁した。

馴化培地を糸球体内皮細胞に１時間添加し、細胞を固定し、緑色標識小麦アグルチン（ａｇｇｌｕｔｉｎ）レクチン（ＷＧＡ）を用いて免疫蛍光染色を実施した。これは内皮細胞の表面、内皮グリコカリックスの糖残基と結合する。細胞表面の蛍光強度が定量化された。ＨＥＫ細胞からの馴化培地で刺激した糸球体内皮細胞へのＷＧＡの結合は増加し（図７Ａ参照）、ポドサイト馴化培地で刺激した糸球体内皮細胞へのＷＧＡ結合は有意に増加する（図７Ｂ参照、対応なしｔ検定、ｐ＜０．０５）傾向が強かった。このことから、Ｎｐｈｓ１．ＡＡＶ－ＶＥＧＦＣに感染したポドサイトはＶＥＧＦＣを分泌し、これが糸球体内皮細胞に作用してグリコカリックス層を増強していることが示された。

参考文献
FOSTER RR, SLATER SC, SECKLEY J, KERJASCHKID, BATES DO, MATHIESON PW, SATCHELL SC. Vascular Endothelial Growth Factor-C, aPotential Paracrine Regulator of Glomerular Permeability, Increases GlomerularEndothelial Cell Monolayer Integrity and Intracellular Calcium. Am J Pathol2008 173:938-948
FOSTER RR, ARMSTRONG L, BAKER S, WONG DWL,WYLIE EC, RAMNATH R, JENKINS R, SINGH A, STEADMAN R, WELSH GI, MATHIESON PW,SATCHELL SC. Glycosaminoglycan Regulation by VEGFA and VEGFC of the GlomerularMicrovascular Endothelial Cell Glycocalyx in Vitro. Am J Pathol 2013183:604-616
JHA, SK, RAUNIYAR, K, KARPANEN, T,LEPPANEN, VM, BROUILLARD, P, VIKKULA, M, ALITALO, K, JELTSCH, M: Efficientactivation of the lymphangiogenic growth factor VEGF-C requires the C-terminaldomain of VEGF-C and the N-terminal domain of CCBE1. Sci Rep, 7: 4916, 2017.
JOUKOV V, SORSA T, KUMAR V, JELTSCH M,CLAESSON-WELSH L, CAO Y, SAKSELA O, KALKKINEN N, ALITALO K. Proteolyticprocessing regulates receptor specificity and activity of VEGF-C. EMBO J. 1997Jul 1;16(13):3898-911.
LUO, X., HALL, G., LI, S., BIRD, A., LAVIN,P. J., WINN, M. P., KEMPER, A. R., BROWN, T. T. & KOEBERL, D. D. 2011.Hepatorenal correction in murine glycogen storage disease type I with adouble-stranded adeno-associated virus vector. Mol Ther, 19, 1961-70.
MOELLER, M. J., SANDEN, S. K., SOOFI, A.,WIGGINS, R. C. & HOLZMAN, L. B. 2002. Two gene fragments that directpodocyte-specific expression in transgenic mice. J Am Soc Nephrol, 13, 1561-7.
ONIONS KL, GAMEZ M, BUCKNER NR, BAKER SL,BETTERIDGE KB, DESIDERI S, DALLYN BP, RAMNATH RD, NEAL CR, FARMER LK, MATHIESONPW, GNUDI L, ALITALO K, BATES DO, SALMON AHJ, WELSH GI, SATCHELL SC, FOSTER RR.VEGFC Reduces Glomerular Albumin Permeability and Protects Against Alterationsin VEGF Receptor Expression in Diabetic Nephropathy. Diabetes. 2019Jan;68(1):172-187
PICCONI, J. L., MUFF-LUETT, M. A., WU, D.,BUNCHMAN, E., SCHAEFER, F. & BROPHY, P. D. 2014. Kidney-specific expressionof GFP by in-utero delivery of pseudotyped adeno-associated virus 9. MolecularTherapy. Methods & Clinical Development, 1, 14014.
ROCCA, C. J., UR, S. N., HARRISON, F. &CHERQUI, S. 2014. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal forkidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene therapy, 21, 618-628.
SCHAMBACH, A., BOHNE, J., BAUM, C., HERMANN,F. G., EGERER, L., VON LAER, D. & GIROGLOU, T. 2005. Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory elementdeleted from X protein and promoter sequences enhances retroviral vector titerand expression. Gene Therapy, 13, 641.
SCHIEVENBUSCH, S., STRACK, I., SCHEFFLER, M.,NISCHT, R., COUTELLE, O., HOSEL, M., HALLEK, M., FRIES, J. W. U., DIENES,H.-P., ODENTHAL, M. & BUNING, H. 2010. CombinedParacrine and Endocrine AAV9 mediated Expression of Hepatocyte Growth Factorfor the Treatment of Renal Fibrosis. Molecular Therapy, 18, 1302-1309.

Claims

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）Ｃ導入遺伝子；及び
最小ネフリンプロモーターＮＰＨＳ１又はポドシンプロモーターＮＰＨＳ２
を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター遺伝子治療。
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ血清型２／９、ＬＫ０３又は３Ｂである、請求項１に記載のＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＶＥＧＦＣ導入遺伝子が、ＶＥＧＦＣプレプロペプチド、又はＶＥＧＦＣの中間形態、又はＶＥＧＦＣの成熟形態をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１又は請求項２に記載のＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＡＡＶベクターが、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＶＥＧＦＣ導入遺伝子がヒトであり、及び／又はヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＡＡＶベクターが、前記プロモーターと前記ＶＥＧＦＣ導入遺伝子の間にコザック配列をさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＡＡＶベクターが、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル等のポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター遺伝子治療。
腎臓疾患の処置又は予防における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記腎臓疾患が糖尿病性腎臓疾患である、請求項８に記載の使用のためのＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記糖尿病性腎臓疾患が初期糖尿病性腎臓疾患である、請求項９に記載の使用のためのＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＡＡＶベクター遺伝子治療がヒト患者に投与される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ヒト患者が１型糖尿病又は２型糖尿病を有する、請求項１１に記載の使用のためのＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＡＡＶベクター遺伝子治療が全身投与される、請求項８～１２のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＡＡＶベクター遺伝子治療が静脈内注射により投与される、請求項８～１３のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶベクター遺伝子治療。
前記ＡＡＶベクター遺伝子治療が、腎動脈への注射により投与される、請求項８～１４のいずれか一項に記載の使用のためのＡＡＶベクター遺伝子治療。