CN113171471A - 一种用于治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物及其应用。所述基因药物是一种可利用宿主细胞表达黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的重组腺相关病毒。该药物不仅能够恢复睾酮水平、促进性腺发育，而且能够明显促进精子的生成，重建生育力；同时该基因药物未见明显副作用，安全性高。另外，基因药物可应用于制备基因药物组合物或生产黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的生物反应器，具有很高的应用价值。

Description

一种用于治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物及应用

技术领域

本发明属于基因药物领域，具体涉及治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物。

背景技术

睾酮对男性生殖功能及第二性征的发育和维持至关重要。男性体内95％以上的睾酮由睾丸间质细胞在多种睾酮合成关键基因的共同作用下合成及分泌。当基因突变引起睾酮合成关键基因失活时，睾酮合成减少，继而造成性腺发育不良、生精阻滞及男性不育，称为遗传性睾丸间质细胞功能障碍(Leydig cell dysfunction,LCD)。

现有的临床实践中，睾酮替代疗法可以恢复血清睾酮水平以及促进性腺发育(如《应正确合理进行睾酮替代疗法，张桂元，国家计划生育委员会科研所，北京100081》、《睾酮替代疗法及其影响身体机能和代谢的遗传药理学，Michael Zitzmann，ASIAN JOURNAL OFANDROLOGY，2008》)，然而现有的疗法几乎无法解决遗传性LCD引起的男性不育难题。因此，亟需研发用于治疗遗传性LCD的新方法。

随着人类基因组测序计划的完成，基因突变在人类疾病中的作用越来越受重视。而当睾酮合成关键基因发生失活型突变时，能否通过基因治疗纠正或补偿突变位点是治疗该类疾病的关键问题之一。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对遗传性LCD治疗手段不足的问题，提供一种可以治疗LCD的药物。该药物能够恢复睾酮水平、促进性腺发育，而且能够明显促进精子的生成，重建生育力；同时该基因药物未见明显副作用，安全性高。

本发明的目的是提供黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体基因在制备睾丸间质细胞功能障碍治疗药物方面的应用。

本发明的另一目的是提供一种治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物。

本发明的另一目的是提供一种制备睾丸间质细胞功能障碍的基因药物的pAAV表达载体。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体基因(Lhcgr)在制备睾丸间质细胞功能障碍治疗药物方面的应用。

其中，优选地，黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体基因为全长黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的开放阅读框。

作为一种可选择的优选方案，黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体基因和重组腺相关病毒组合用于制备睾丸间质细胞功能障碍治疗药物。

其中，优选地，所述的药物是一种基因药物，所述基因药物是利用宿主细胞，表达黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的重组腺相关病毒。

作为一种可选择的优选方案，重组腺相关病毒包含pAAV表达载体、包装质粒、辅助质粒，其中pAAV表达载体的开放阅读框含编码黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的核酸序列。

其中，优选地，pAAV表达载体的启动子为CAG、CMV、EF1α、UBC、或睾丸间质细胞特异性启动子中的任意一种。

其中，优选地，包装质粒为AAV Rep/Cap Vector，辅助质粒为AAV Helper Vector，所述的衣壳的血清型为AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVnc80、AAVDJ中的任意一种。

其中，优选地，所述的编码黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的核酸序列为全长黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的cDNA。

另外，所述基因药物可用于制备基因药物组合物，或用于制备生产黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的生物反应器。

本发明具有以下有益效果：

(1)能够明显恢复或促进精子的生成，重建生育力，可用于治疗遗传性LCD，可以解决传统睾酮替代疗法不能解决的遗传性LCD引起的男性不育难题。

(2)具有传统的睾酮替代疗法能够恢复睾酮水平以及促进性腺以及附属性腺的发育的优点。

(3)能够更好的感染睾丸间质细胞前体细胞，但不感染支持细胞及生精细胞，证明其专一性、特异性和安全性高。

(4)基因载体游离于基因组独立存在，不遗传给子代，具有较高的安全性。

附图说明

图1显示的为AAV-Lhcgr载体的示意图。

图2显示AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVnc80、AAVDJ等类型能够较好地感染睾丸间质细胞前体细胞。

图3显示AAV8-Lhcgr治疗组Lhcgr^-/-小鼠睾丸间质中有较强的Lhcgr表达，而PBS注射的Lhcgr^-/-小鼠睾丸间质中未见Lhcgr表达。

图4显示AAV8-Lhcgr治疗组的Lhcgr^-/-小鼠的睾丸内睾酮水平，与血清睾酮水平一致。

图5显示AAV8-Lhcgr治疗组的小鼠的成熟Leydig细胞标记物细胞色素P450家族17亚科A成员1(Cyp17a1)表达增加。

图6显示与PBS处理组相比，AAV8-Lhcgr处理的Lhcgr^-/-小鼠的睾丸明显下降且阴茎明显发育。

图7显示与PBS处理组相比，AAV8-Lhcgr处理的Lhcgr^-/-小鼠的睾丸明显下降且阴茎明显发育。

图8显示AAV8-Lhcgr病毒载体(基因药物)组合物治疗后小鼠精液密度及活力明显增加，而与之相对应的PBS注射的Lhcgr^-/-小鼠未见精子。

图9显示基因药物治疗后通过IVF成功获得了子代，且经鉴定均为Lhcgr^+/-小鼠，表明基因载体治疗后重建了Lhcgr^-/-小鼠的生育力。

图10提示子代基因组中未检测到基因载体拷贝。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中所用Lhcgr缺陷(Lhcgr^-/-)雄性小鼠的睾丸间质细胞发育不良以及细胞丧失对黄体生成素刺激的反应，导致睾酮水平低下，从而表现出性腺发育不良和精子成熟阻滞，引起不育。突变的纯合小鼠与人的LCD表型具有一致性，因此可作为评估基因载体治疗效果的合适动物模型。

所述Lhcgr^-/-小鼠通过胚胎干细胞打靶技术获得，详见(Biol Reprod.2004；doi:10.1095/biolreprod.104.031161)。

实施例1：AAV载体的构建和分离纯化

质粒AAV-Lhcgr的构建如图1所示，主要元件包括CAG启动子及Lhcgr序列。病毒载体是通过质粒共转染的方法获得的，将不同种类的AAV Rep/Cap质粒、AAV-Helper质粒和AAV-Lhcgr质粒与HEK 293细胞共转染，形成AAV载体。经碘克沙醇密度梯度超速离心法纯化后，通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度，最后用银染方法确认病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素，并分装置于-80℃储存。

实施例2：载体筛选

构建携带mCherry的AAV载体，我们筛选了11种AAV血清亚型AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV7m8、AAVnc80、AAVDJ。将构建后的病毒载体组合物用生理盐水稀释到1×10¹³vg/mL，用0.2％avertin(0.2mL/10g)麻醉小鼠后，用微量注射仪向两侧睾丸内各注射8μL稀释后的载体组合物。1周后，取小鼠睾丸组织行组织免疫荧光染色，染睾丸间质细胞前体细胞标记物巢蛋白(Nestin)；最后，使用共聚焦显微镜观察并拍照。

图2显示AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVnc80、AAVDJ与Nestin共表达比例较高，提示上述AAV类型能够较好地感染睾丸间质细胞前体细胞。

实施例3：基因药物表达Lhcgr，恢复睾酮水平，促进睾丸间质细胞成熟

选择以实施例2中的AAV8作为基因递送工具，并构建AAV8-CAG-Lhcgr病毒载体(基因药物)。为了检测基因载体是否在睾丸内成功的表达及发挥作用；3w龄Lhcgr^-/-小鼠睾丸间质注射AAV8-Lhcgr或PBS，同窝的Lhcgr^+/+或Lhcgr^+/-作为对照。

免疫荧光染色结果显示AAV8-Lhcgr治疗组Lhcgr^-/-小鼠睾丸间质中有较强的Lhcgr表达，而在PBS注射的Lhcgr^-/-小鼠睾丸间质中未见Lhcgr表达(图3)。

此外，与PBS注射组相比，用AAV8-Lhcgr处理的Lhcgr^-/-小鼠中血清睾酮水平也明显上升。其血清睾酮水平可达到Lhcgr^+/+或Lhcgr^+/-小鼠睾酮水平的30％左右，而在PBS处理的Lhcgr^-/-雄性小鼠血清中几乎无法检测到睾酮。睾丸内睾酮水平对于生精发挥着重要作用。我们观察到用AAV8-Lhcgr的Lhcgr^-/-小鼠的睾丸内睾酮水平，与血清睾酮水平一致，也明显上升。提示AAV8-Lhcgr治疗可有效恢复Lhcgr^-/-小鼠的睾酮水平(图4)。

接下来，我们评估了AAV8-Lhcgr睾丸内注射对3w龄Lhcgr^-/-小鼠Leydig细胞成熟的作用。发现与PBS注射的Lhcgr^-/-小鼠相比，AAV8-Lhcgr注射的小鼠的成熟Leydig细胞标记物细胞色素P450家族17亚科A成员1(Cyp17a1)表达增加(图5)。

这些数据表明，病毒载体(基因药物)AAV8-Lhcgr睾丸内注射能够在睾丸内成功的表达及发挥作用。

实施例4：基因药物治疗后促进小鼠性腺发育

为了进一步探索基因药物对Lhcgr^-/-小鼠性腺发育的影响，3周龄Lhcgr^-/-小鼠经过AAV8-Lhcgr基因药物治疗4周后，我们对小鼠性腺的发育情况进行了检测。

图6显示与PBS处理组相比，AAV8-Lhcgr处理的Lhcgr^-/-小鼠的睾丸明显下降且阴茎明显发育。

图7显示，经载体组合物治疗4周后，Lhcgr^-/-小鼠性腺和附属性腺发育相比PBS处理组明显改善，且几乎可达到Lhcgr^+/+小鼠的水平。证明基因载体可以促进Lhcgr^-/-小鼠性腺以及附属性腺的发育。

实施例5：基因药物治疗后促进小鼠生精，重建小鼠生育力

我们进一步研究了基因载体对生精的影响。通过使用CASA评估附睾精液情况，图8显示AAV8-Lhcgr病毒载体(基因药物)组合物治疗后小鼠精液密度及活力明显增加，而与之相对应的PBS注射的Lhcgr^-/-小鼠未见精子。我们进一步探究了治疗后小鼠的生育力是否恢复。

从基因载体治疗4周后的Lhcgr^-/-小鼠的附睾尾中收集精子，与C57B6J野生型雌性小鼠卵母细胞进行IVF。图9显示基因药物治疗后通过IVF成功获得了子代，且经鉴定均为Lhcgr^+/-小鼠，表明基因载体治疗后重建了Lhcgr^-/-小鼠的生育力。

实施例6：基因药物治疗后子代基因组中未见基因载体整合

为了评估基因载体的安全性，我们从子代小鼠尾巴中提取基因组DNA。使用针对基因载体上的CAG启动子和插入的Lhcgr基因的特异性引物，通过PCR后进行琼脂糖凝胶电泳分析子代中是否有基因载体整合。图10提示子代基因组中未检测到基因载体拷贝，说明对亲本进行的治疗的基因载体不会插入子代基因组中，提示本发明的基因药物及应用具有较高的安全性。

Claims (10)

1.黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体基因在制备睾丸间质细胞功能障碍治疗药物方面的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体基因为全长黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的开放阅读框。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体基因和重组腺相关病毒组合用于制备睾丸间质细胞功能障碍治疗药物。

4.一种用于治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物，其特征在于，所述基因药物是利用宿主细胞表达黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的重组腺相关病毒。

5.如权利要求4所述的治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物，其特征在于，所述的重组腺相关病毒包含pAAV表达载体、包装质粒、辅助质粒，其中pAAV表达载体的开放阅读框含编码黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的核酸序列。

6.如权利要求5所述的治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物，其特征在于，所述的pAAV表达载体的启动子为CAG、CMV、EF1α、UBC、或睾丸间质细胞特异性启动子中的任意一种。

7.如权利要求5所述的治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物，其特征在于，所述的包装质粒决定的血清型为AAV5、AAV6、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVnc80、AAVDJ中的任意一种。

8.如权利要求5所述的治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物，其特征在于，所述的包装质粒为AAV Rep/Cap Vector，辅助质粒为AAV Helper Vector。

9.如权利要求5所述的治疗睾丸间质细胞功能障碍的基因药物，其特征在于，所述的编码黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的核酸序列为全长黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的cDNA。

10.如权利要求4～9任一所述的基因药物，用于制备基因药物组合物，或用于制备生产黄体生成素/促绒毛膜性腺激素受体的生物反应器。

Images