JP2023537358A - 核酸構築物及び脊髄性筋委縮症治療のためのその使用 - Google Patents

核酸構築物及び脊髄性筋委縮症治療のためのその使用 Download PDF

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Abstract

SMNタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を含む第1の核酸領域、及び、1又は複数の内因性マイクロRNA(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む第2の核酸領域、を含む核酸であって、該第2の核酸領域は該第1の核酸領域の3'位にある、前記核酸。【選択図】なし

Description

(関連出願との相互参照)
本出願は、2020年8月5日出願のPCT 出願番号PCT/CN2020/107173、及び2020年12月21日出願のPCT出願番号PCT/CN2020/138056の出願の利益を主張し、それらそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
(電子的に提出された配列表の参照)
本出願には、ファイル名「14652-017 228_SEQ_LISTING.txt」、作成日2021年7月21日、及びサイズ108,587バイトのASCIIフォーマット形式の配列表として、EFS-Web経由で電子的に提出された配列表が含まれる。このEFS-Web経由で提出された配列表は、本明細書の一部を構成し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
(1．技術分野)
本開示は、核酸構築物、その構築物に基づく遺伝子治療、及びその使用方法に関する。
(2．背景)
脊髄性筋委縮症(SMA)は、常染色体劣性遺伝性神経変性疾患であり、下位運動ニューロンの喪失の結果としての進行性筋力低下及び筋緊張低下を特徴とする。発症年齢及び神経筋症状の重症度に基づいて、4つの臨床表現型が報告されている(Lunn及びWangの文献、Lancet, 371(9630):2120-33(2008))。最重症形態であるI型SMAは、壊滅的な小児期の症状であり、ウェルドニッヒ・ホフマン病としても知られる。SMAのほとんどの症例の要因となる)遺伝子である運動ニューロン生存(SMN)遺伝子が、染色体遺伝子座5q13で特定された(Lefebvreらの文献、Cell、80(1):155-65(1995))。このヒト遺伝子は、テロメアコピー及びセントロメアコピーであるSMN1及びSMN2それぞれで複製される。SMAはSMN1遺伝子の変異又は欠失により引き起こされ、SMN2は充分な量の全長タンパク質を生成できないために、SMNタンパク質の枯渇を生じる。
遺伝子治療を含む治療戦略は、SMN遺伝子の発現上昇に基づいて作成されてきた。しかし、現在利用可能な治療は、例えばSMN遺伝子の発現レベルが不充分であること及びオフターゲット毒性等を含む、様々な課題に直面している。従って、当分野では、最適化されたSMN発現及び低減されたオフターゲット毒性を有する、改善されたSMAの遺伝子治療が求められている。
(3．概要)
1の態様で、本明細書で提供されるのは、(i)SMNタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を含む第1の核酸領域、及び、(ii)1又は複数の内因性マイクロRNA(miRNA)(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む第2の核酸領域、を含む核酸であって、該第2の核酸領域は該第1の核酸領域の3'位にある、前記核酸である。
幾つかの実施態様では、前記SMNタンパク質若しくはその変異体は、配列番号33のアミノ酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号33との同一性を有するアミノ酸配列、を含む。
幾つかの実施態様では、前記第1の核酸領域は、配列番号34及び配列番号35からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、心臓の内因性miRNAの標的セグメントを少なくとも1つ含む。幾つかの実施態様では、前記心臓の内因性miRNAは、hsa-mir-1-5p、hsa-mir-208a-5p、hsa-mir-208b-5p、hsa-mir-133a-1、及びhsa-mir-488-5pからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、前記心臓の内因性miRNAは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、又は配列番号6と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、肝臓の内因性miRNAの標的セグメントを少なくとも1つ含む。幾つかの実施態様では、前記肝臓の内因性miRNAはhsa-mir-122である。幾つかの実施態様では、前記肝臓の内因性miRNAは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号4と同一である核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、hsa-mir-133a-1の標的セグメントを2以上含む。幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、hsa-mir-133a-1の標的セグメントを少なくとも3つ含む。幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、hsa-mir-208a-5pの標的セグメントを少なくとも1つ、hsa-mir-208b-5pの標的セグメントを少なくとも1つ、hsa-mir-122の標的セグメントを少なくとも1つ、及びhsa-mir-133a-1の標的セグメントを少なくとも1つ含む。幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、hsa-mir-208a-5pの標的セグメントを2つ、hsa-mir-208b-5pの標的セグメントを2つ、hsa-mir-122の標的セグメントを3つ、及びhsa-mir-133a-1の標的セグメントを3つ含む。
幾つかの実施態様では、前記hsa-mir-1-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号7と同一である核酸配列を含む;前記hsa-mir-208a-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号8と同一である核酸配列を含む;前記hsa-mir-208b-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号9と同一である核酸配列を含む;前記hsa-mir-122の標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号10と同一である核酸配列を含む;前記hsa-mir-133a-1の標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号11と同一である核酸配列を含む;及び/又は、前記hsa-mir-488-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号12と同一である核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、配列番号11の核酸配列の少なくとも3回反復を含む。幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は更に、肝臓の内因性miRNAの標的セグメントを1又は複数含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、(i)配列番号8の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、(ii)配列番号9の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、(iii)配列番号10の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、及び、(iv)配列番号11の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は更に、標的セグメント間に1又は複数のリンカーを含む。幾つかの実施態様では、該リンカーは、1～10ヌクレオチドを含む。幾つかの実施態様では、前記リンカーは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、(i)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号18と同一である核酸配列、(ii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号19と同一である核酸配列、(iii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号20と同一である核酸配列、又は、(iv)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号21と同一である核酸配列、を含む。
幾つかの実施態様では、前記第1の核酸領域は更に、プロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号36若しくは配列番号37の核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。他の実施態様では、前記プロモーターは、proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号38の領域及び配列番号39の領域を含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号38の領域及び配列番号40の領域を含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号38の領域及び配列番号41の領域を含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号38の領域及び配列番号42の領域を含む。
別の態様で、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される核酸を含むベクターである。幾つかの実施態様では、前記ベクターはウイルスベクターである。幾つかの実施態様では、前記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである。幾つかの実施態様では、前記AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9、又はそれらの組み合せ若しくは変異体に由来する。特別な実施態様では、前記ベクターは、組換えAAV9(rAAV9)ベクター又はその変異体である。
更に別の態様で、本明細書で提供されるのは、(i)導入遺伝子を含む第1の核酸領域、及び(ii)1又は複数の内因性miRNA(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む第2の核酸領域、を含む組換えAAV(rAAV)ベクターであって、少なくとも1つの標的セグメントは心臓の内因性miRNAの標的セグメントであり、かつ少なくとも1つの標的セグメントは肝臓の内因性miRNAの標的セグメントであり、該第2の核酸領域は、該第1の核酸領域の3'位にあり、かつ、該rAAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、又はAAV44-9由来の逆方向末端反復(ITR)を含む、前記組換えAAVベクターである。
幾つかの実施態様では、前記第1の核酸領域は、配列番号33のアミノ酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号33との同一性を有するアミノ酸配列を含むSMAタンパク質若しくはその変異体をコードする核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第1の核酸領域は、配列番号34及び配列番号35からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記心臓の内因性miRNAは、hsa-mir-1-5p、hsa-mir-208a-5p、hsa-mir-208b-5p、hsa-mir-133a-1、及びhsa-mir-488-5pからなる群から選択される、並びに/又は、前記肝臓の内因性miRNAはhsa-mir-122である。
幾つかの実施態様では、(i)前記心臓の内因性miRNAは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、又は配列番号6と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、及び/又は、(ii)前記肝臓の内因性miRNAは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号4と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、hsa-mir-133a-1の標的セグメントを2以上含む。幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、hsa-mir-133a-1の標的セグメントを少なくとも3つ含む。幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、hsa-mir-208a-5pの標的セグメントを少なくとも1つ、hsa-mir-208b-5pの標的セグメントを少なくとも1つ、hsa-mir-122の標的セグメントを少なくとも1つ、及びhsa-mir-133a-1の標的セグメントを少なくとも1つ含む。幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、hsa-mir-208a-5pの標的セグメントを2つ、hsa-mir-208b-5pの標的セグメントを2つ、hsa-mir-122の標的セグメントを3つ、及びhsa-mir-133a-1の標的セグメントを3つ含む。
幾つかの実施態様では、(i)前記hsa-mir-1-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号7と同一である核酸配列を含む、(ii)前記hsa-mir-208a-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号8と同一である核酸配列を含む、(iii)前記hsa-mir-208b-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号9と同一である核酸配列を含む、(iv)前記hsa-mir-122の標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号10と同一である核酸配列を含む、(v)前記hsa-mir-133a-1の標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号11と同一である核酸配列を含む、及び/又は、(vi)前記hsa-mir-488-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号12と同一である核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、配列番号11の核酸配列の少なくとも3回反復を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、(i)配列番号8の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、(ii)配列番号9の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、(iii)配列番号10の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、及び(iv)配列番号11の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は更に、標的セグメント間に1又は複数のリンカーを含み、かつ、任意で該リンカーは1～1500ヌクレオチド、1～500ヌクレオチド、1～100ヌクレオチド、1～50ヌクレオチド、又は1～10ヌクレオチドを含む。
幾つかの実施態様では、前記リンカーは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記第2の核酸領域は、(i)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号18と同一である核酸配列、(ii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号19と同一である核酸配列、(iii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号20と同一である核酸配列、又は、(ii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号21と同一である核酸配列、を含む。
幾つかの実施態様では、前記第1の核酸領域は更にプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号36若しくは配列番号37の核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。他の実施態様では、前記プロモーターは、proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号38の領域及び配列番号39の領域を含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号38の領域及び配列番号40の領域を含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号38の領域及び配列番号41の領域を含む。幾つかの実施態様では、前記プロモーターは、配列番号38の領域及び配列番号42の領域を含む。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクターは、AAV9由来のITRを含む。
更に別の態様で、本明細書で提供されるのは、SMNタンパク質若しくはその変異体をコードする核酸配列、並びにエンハンサー及びコアプロモーターを含む合成プロモーターを含む核酸領域、を含む核酸であって、任意で、(i)該合成プロモーターは、CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含む、(ii)該合成プロモーターは、proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含む、(iii)該合成プロモーターは、proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含む、又は、(iv)該合成プロモーターは、proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含む、前記核酸である。
幾つかの実施態様では、前記hSynプロモーターは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号38と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記CMVエンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号39と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記proC3エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号40と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記proA5エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号41と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記proB15エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号42と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記SMNタンパク質若しくはその変異体は、配列番号33のアミノ酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号33との同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記SMNタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列は、配列番号34及び配列番号35からなる群から選択される核酸配列を含む。
別の態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、若しくは配列番号53の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、若しくは配列番号53との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
別の態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号22若しくは配列番号23、配列番号24、若しくは配列番号25の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、若しくは配列番号25との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
更に別の態様で、本明細書で提供されるのは、(a)本明細書で提供される核酸又はrAAVベクター、並びに、(b)AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9のカプシドタンパク質、又はその変異体、を含む、組換えAAV(rAAV)粒子である。幾つかの実施態様では、前記カプシドタンパク質は、AAV9カプシドタンパク質又はその変異体である。
更に別の態様で、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される核酸、ベクター若しくはrAAVベクター、又はrAAV粒子、並びに医薬的に許容し得る賦形剤、を含む医薬組成物である。
更に別の態様で、本明細書で提供されるのは、細胞内のSMNタンパク質発現を増強する方法であって、該細胞を、本明細書で提供される核酸、ベクター若しくはrAAVベクター、rAAV粒子、又は医薬組成物と接触させることを含む、前記方法である。
更に別の態様で、本明細書で提供されるのは、対象の疾患又は障害を治療する方法であって、該対象へ、本明細書で提供される核酸、ベクター若しくはrAAVベクター、rAAV粒子、又は医薬組成物、を投与することを含む、前記方法である。幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害は、SMN関連疾患又は障害である。幾つかの実施態様では、前記SMN関連疾患又は障害は、SMNタンパク質の不充分な発現に関連する疾患又は障害である。幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害は欠陥SMNタンパク質に関連する。他の実施態様では、前記疾患又は障害は、smn1遺伝子欠失及び/又は変異に関連する。幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害は脊髄性筋委縮症(SMA)である。幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害は、SMA-I型、SMA-II型、SMA-III型、又はSMA-IV型である。幾つかの実施態様では、前記対象は2歳未満である。
(4．図面の簡単な説明)
図1Aは、本明細書で提供されるrAAVベクターの遺伝子設計の例示を示す。図1Bは、複数の標的セグメントを含む本核酸構築物又はrAAVベクターの核酸領域の例を示す。
図2Aは、本明細書で提供される様々なrAAVベクターのSMNタンパク質発現レベルを示す。図2Bは、本明細書で提供されるコドン最適化した構築物についてのトランスクリプトーム分析の結果を示す。
図3は、本rAAV粒子のインビボ有効性アッセイの生存結果を示す。
図4は、本rAAV粒子のインビボ有効性アッセイのオープンフィールド活動結果を示す。
図5は、本rAAV粒子のインビボ有効性アッセイの体重結果を示す。
図6は、miRNAの異なる標的セグメントを含むrAAV間の生存結果の比較を示す。
図7A及び7Bは、合成プロトマー(synthetic protomer)を含む、本明細書で提供される構築物の例を示す。
図8Aは、他のプロモーターを含む構築物と比較した、本明細書で提供される合成プロモーターを含む構築物のインビボ有効性アッセイの結果を示す。
図8Bは、異なるエンハンサーを有する様々な合成プロモーターを含む構築物の、低用量でのインビボ有効性を示す。
(5．詳細な説明)
本開示の一部は、新規な核酸構築物(例えば、SMNタンパク質をコードし、かつ組織特異的なマイクロRNAの標的配列を含む核酸構築物)、それを含むAAVベクター、及びその改善された特性に基づいている。
(5．1．定義)
本明細書に記載又は参照される技法及び手順は、当業者により一般的に良く理解され、かつ/又は、従来法を用いて通常採用されているものを含み、例えば、Sambrookらの文献「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)」(第3版、2001)「分子生物学における現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」(Ausubelら編、2003)「治療用モノクローナル抗体:実験台から臨床まで(Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic)」(An編、2009)「モノクローナル抗体:方法及びプロトコル(Monoclonal Antibodies：Methods and Protocols)」(Albitar編、2010)、及び「抗体設計(Antibody Engineering)」第1巻及び第2巻(Kontermann及びDubel編、第2版、2010)等に記載され、広く使用されている方法を含む。
本明細書で特に定義しない限り、本記載で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。本明細書を解釈する目的で、下記用語の説明が適用され、かつ、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。示された用語の説明が、参照により本明細書に組み込まれている文書と矛盾する場合は、下記に示されている用語の説明が優先される。
用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書中で互換的に使用され、任意長のアミノ酸ポリマーを指す。このポリマーは、線状でも分岐状でもよく、改変アミノ酸を含むことができ、かつ、非アミノ酸が挟まっていてもよい。この用語は又、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質修飾、アセチル化、リン酸化、又はその他の操作又は改変等で、天然に又は介在的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。同様に、本定義内に含まれるのは、限定するものではないが、例えば非天然アミノ酸を含むアミノ酸の類似体や、当分野で公知の他の修飾を1又は複数含むポリペプチドである。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は本明細書中で互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。このヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変ヌクレオチド若しくは塩基、及び/又はそれらの類似体でもよく、又は、DNA若しくはRNAポリメラーゼによって、又は合成反応によって、ポリマーへ組み込むことのできる任意の基質でも良い。ポリヌクレオチドは、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体等の改変ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合の「オリゴヌクレオチド」は、短く、一般的には一本鎖の、合成ポリヌクレオチドであって、必ずしもそうではないが、一般的に長さ約200ヌクレオチド未満であるものを指す。用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドに関する上記説明は、オリゴヌクレオチドにも等しくかつ全て適用可能である。本開示の結合分子を産生する細胞には、親ハイブリドーマ細胞、並びに当該ポリペプチドをコードする核酸が導入された細菌及び真核性宿主細胞が含まれ得る。別の記載がない限り、本明細書に開示された全ての一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は5'末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、5'方向と称される。発生期にRNA転写産物が5'から3'へ付加する方向を、転写方向と称し、RNA転写産物と同一の配列を有するDNA鎖上の、RNA転写産物の5'末端に対して5'位にある配列領域を「上流配列」と称し、RNA転写産物と同一の配列を有するDNA鎖上の、RNA転写産物の3'末端に対して3'位にある配列領域を「下流配列」と称する。
本明細書で使用される場合の「核酸塩基」は、別の核酸と塩基対を形成可能な複素環成分を指すことを意図する。
本明細書で使用される場合の「ヌクレオチド」は、リン酸基を有するヌクレオシドであって、そのリン酸基はそのヌクレオシドの糖部分へ共有結合しているものを指すことを意図する。
本明細書で使用される場合の「ヌクレオシド」は、糖と結合された核酸塩基を指すことを意図する。
DNA鎖及びRNA鎖の非対称な両末端は、5'(5ダッシュ)及び3'(3ダッシュ)末端と呼ばれ、5'末端は末端リン酸基を有し、3'末端は末端ヒドロキシル基を有する。5ダッシュ(5')末端は、その末端に、デオキシリボース又はリボースの糖の環構造中に第5炭素を有する。核酸は、インビボで5'-から3'-方向へ合成されるが、その理由は、新しい鎖を組み立てるために使用されるポリメラーゼが、それぞれの新たなヌクレオチドを、リン酸ジエステル結合を介して3'-ヒドロキシル(-OH)基へ結合するためである。
「単離された核酸」は、例えばRNA、DNA等の核酸、又は核酸の混合物であり、通常は、他のゲノムDNA配列及びタンパク質、又はリボソーム及びポリメラーゼ等の複合体であって、本来的にネイティブ配列に付随するもの、から実質的に分離されている。「単離された」核酸分子は、その核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。更に又、cDNA分子等の「単離された」核酸分子は、組換え技術によって作製された場合は、他の細胞性材料若しくは培地を実質的に含まなくてもよく、又は、化学合成された場合は、化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。この用語は、それが天然で存在する環境から取り出された核酸配列を包含し、かつ、組換え又はクローニングされたDNA単離物及び化学的に合成された類似体又は異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子には、その分子の単離形態が含まれ得る。特別には、本明細書に記載のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、特定され、かつ、それが作製された環境内で通常関係する少なくとも1つの混入核酸分子から分離された核酸分子である。
本明細書で使用される用語「相同性」は、2つのポリヌクレオチド間又は2つのポリペプチド成分間の同一性パーセントを指す。2つのDNA又は2つのポリペプチド配列は、その配列が少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約80%～85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%～98%の配列同一性、少なくとも約99%、又はそれらの間の任意のパーセントを、その分子の定義された長さにわたって示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書で使用する場合に「実質的に相同」は又、特定のDNA又はポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列を指す。
本明細書で使用される場合の用語「同一性」は、それぞれ2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の一致を指す。同一性パーセントの決定方法は、当分野で周知である。例えば、同一性パーセントは、2つの分子間の配列情報の直接的な比較により決定することができ、それはその配列をアラインし、2つのアラインした配列間の正確な一致数を数え、その数を短い方の配列の長さで割り、その結果に100を掛けることによる。容易に入手可能なコンピュータプログラムがこの分析の補助に利用でき、例えばALIGN、Dayhoff、M. O.の文献「タンパク質の配列と構造のアトラス(Atlas of Protein Sequence and Structure)」 M. O. Dayhoff編、追補5版、3:353-358、米国生物医学研究財団、ワシントンD.C.において、ペプチド分析用にSmith及びWatermanの文献、Advances in Appl. Math. 2:482-489、1981の局所相同性アルゴリズムを適用できる。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、同様にSmith及びWatermanアルゴリズムに依拠している、ウィスコンシン配列解析パッケージ、バージョン8(Genetics Computer Group社、マディソン、ウィスコンシンから入手可能)、例えば、BESTFIT、FASTA、及びGAPプログラム等が入手可能である。これらのプログラムは、製造者により推奨され、上記で言及したウィスコンシン配列解析パッケージに記載されているデフォルトパラメータと共に容易に利用可能である。例えば、特定のヌクレオチド配列と参照配列との同一性パーセントは、Smith及びWatermanの相同性アルゴリズムを、デフォルトのスコアリング表及び6つのヌクレオチド位置のギャップペナルティと共に使用して決定できる。本発明の文脈において同一性パーセントを確立する別の方法は、John F. Collins及びShane S. Sturrokにより開発され、エディンバラ大学により著作権所有され、インテリジェネティクス社(Mountain View、カリフォルニア州)により頒布されているプログラムのMPSRCHパッケージを使用することである。この一組のパッケージからSmith-Watermanアルゴリズムを、スコアリング表にデフォルトパラメータ(例えば、ギャップ開始ペナルティは12、ギャップ伸長ペナルティは1、ギャップは6)を使う場合に使用できる。生成されたデータからの「一致」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセント又は類似性パーセントを計算するための他の適切なプログラムは、当分野で一般的に公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムはBLASTであり、デフォルトパラメータと共に使用される。例えば、BLASTN及びBLASTPは、下記デフォルトパラメータ：遺伝コード=標準;フィルタ=無し;鎖=両方;カットオフ値=60;期待値=10;マトリックス=BLOSUM62;Description(記述)=50配列;ソート方法=高スコア;データベース=非冗長、GenBank＋EMBL＋DDBJ＋PDB＋GenBank CDS翻訳＋Swiss-protein＋Spupdate＋PIRを使って使用し得る。これらのプログラムの詳細は、当分野で周知である。或いは、相同性は、相同領域間の安定した二重鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイズし、次に一本鎖特異的ヌクレアーゼ(複数可)で消化し、消化された断片のサイズを決定することにより、決定し得る。実質的に相同なDNA配列は、例えば、その特定の系に関して定義されるようなストリンジェント条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定し得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは、当分野の技術の範囲内である。例えば、Sambrookらの文献(上掲)、DNAクローニング(上掲)、核酸ハイブリダイゼーション(上掲)、を参照されたい。
本明細書で使用される場合の用語「ベクター」は、例えば核酸配列を宿主細胞に導入するために、核酸配列を運搬又は含有するために使用される物質を指す。使用に適用可能なベクターには、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及び人工染色体が含まれ、それらは宿主細胞の染色体への安定した組み込み操作を可能にする選択配列又はマーカーを含み得る。更にベクターは、1又は複数の選択可能化マーカー遺伝子及び適切な発現制御配列を含むことができる。含有可能な選択可能化マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質又は毒素に対する耐性を提供するか、栄養要求性不全を補完するか、又は培地に存在しない必須栄養素を供給する。発現制御配列は、構成型プロモーター及び誘導可能プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーター等を含むことができ、これらは当分野で周知である。2以上の核酸分子を共発現させる場合、両方の核酸分子を、例えば単一の発現ベクターに、又は別々の発現ベクターに、挿入することができる。宿主細胞への核酸分子の導入は、当分野で周知の方法を使用して確認できる。そのような方法には、例えば、mRNAのノーザンブロッティング又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるmRNAの増幅等の核酸分析、遺伝子産物発現のイムノブロッティング、又は導入された核酸配列又はその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の適切な分析方法が含まれる。用語「ベクター」には、クローニングビヒクル及び発現ビヒクル、並びにウイルスベクターが含まれる。或る実施態様では、本明細書で提供されるベクターは、組換えAAVベクターである。
本明細書で使用される場合の用語「組換えAAVベクター(rAAVベクター)」は、AAV由来の核酸配列及び1又は複数の異種の配列(即ち、AAV起源ではない核酸配列)を含むポリヌクレオチドベクターをいう。幾つかの実施態様では、前記1又は複数の異種の配列には、少なくとも1つ、或る実施態様では2つのAAV逆方向末端反復配列(ITR)が隣接する。幾つかの実施態様では、そのようなrAAVベクターは、例えば、適切なヘルパーウイルスに感染していて(又は適切なヘルパー機能を発現していて)AAV rep及びcap遺伝子産物(即ち、AAV Rep及びCapタンパク質)を発現している宿主細胞内に存在する場合、複製されて、感染性ウイルスカプシド粒子内にパッケージングし得る。rAAVベクターは、より大きなポリヌクレオチドの中(例えば、染色体内、又はクローニング又はトランスフェクションに使用されるプラスミド等の別のベクター内)に組み込むことができ、AAVパッケージング機能及び適切なヘルパー機能がある場合に複製及びカプシド形成によって「レスキュー」することができる。rAAVベクターは多数の形態のいずれかを取ることができ、その形態には、限定するものではないが、プラスミド、線状人工染色体、脂質との複合体、リポソーム内へのカプセル化物、及び、ウイルスカプシド粒子内、特にAAV粒子内へのカプシド封入化物が含まれる。rAAVベクターをAAVカプシド内にパッケージングして「組換えアデノ随伴ウイルスカプシド粒子(rAAV粒子)」を生成することができる。
本明細書で使用される場合の用語「異種の」は、コード配列及び制御配列等の核酸配列に関する場合、通常は一緒に結合されない配列、及び／又は特定の細胞と通常は関連しない配列をいう。従って、核酸構築物又はベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内又は別の核酸分子へ結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではそのコード配列と関連して見出されない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、そのコード配列自体が天然には見出されない(例えば、天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列である)構築物である。
本明細書で使用される場合の用語「隣接する」は、他のエレメントが隣接する配列に関する場合、その配列に関して、上流及び／又は下流に、即ち5'及び／又は3'に、1以上の隣接エレメントが存在することを示す。用語「隣接する」は、必ずしもそれら配列が連続していると示すことは意図しない。例えば、導入遺伝子をコードする核酸及び隣接エレメントとの間に介在配列があってもよい。他の2つのエレメント(TR等)が「隣接する」配列(例えば、導入遺伝子)では、1のエレメントがその配列の5'位にあり、残りのエレメントがその配列の3'位にあるが、それらの間には介在配列があってもよいことを示す。
本明細書で使用される場合の用語「逆方向末端反復」又は「ITR」配列は、ウイルスゲノムの末端に見出される比較的短い配列であって、逆向きのものをいう。「AAV逆方向末端反復(ITR)」配列は当分野で周知であり、通常は、天然一本鎖AAVゲノムの両末端に存在する約145個のヌクレオチド配列である。ITRの最も外側の125ヌクレオチドは、2つのオルタナティブな方向のいずれかで存在することができ、異なるAAVゲノム間及び単一のAAVゲノムの両端間に不均一性をもたらす。最も外側の125 ヌクレオチドは又、自己相補的な幾つかのより短い領域(A、A'、B、B'、C、C'、及びD領域と呼ばれる)も含み、ITRのこの部分内で鎖内塩基対の生成を可能にする。
「コード配列」又は選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の制御の下に置かれた場合に、転写される核酸分子(DNAの場合)、及びポリペプチドへと翻訳される核酸分子(mRNAの場合)である。コード配列の境界は、5'(アミノ)末端の開始コドン及び3'(カルボキシ)末端の翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列の3'側に位置してもよい。
用語「制御配列」は、特定の宿主生物内で作動可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列をいう。原核生物に好適な制御配列には、例えば、プロモーター、任意でオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサーを利用することが公知である。
本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」及び類似の言い回し(例えば、遺伝子的に融合された)は、核酸又はアミノ酸に関して使用される場合、互いに機能的な関係にそれぞれ配置された、核酸配列又はアミノ酸配列の作動可能な連結を指す。例えば、作動可能に連結されたプロモーター、エンハンサーエレメント、オープンリーディングフレーム、5'及び3' UTR、及びターミネーター配列は、核酸分子(例えばRNA)の正確な産生を生じる。幾つかの実施態様では、作動可能に連結された核酸エレメントは、オープンリーディングフレームの転写を生じ、最終的にポリペプチドの産生(即ち、オープンリーディングフレームの発現)をもたらす。別の例では、作動可能に連結されたペプチドは、その中の複数の機能的ドメインが、各ドメインの意図された機能を付与するために、互いに適切な距離を置いて配置されているペプチドである。
本明細書で使用される場合の、通常の意味での用語「プロモーター」は、DNA制御配列を含むヌクレオチド領域を指し、この制御配列は、RNAポリメラーゼに結合して、下流(3'方向)コード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。転写プロモーターは「誘導可能プロモーター」(プロモーターへ作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析対象物、補因子、制御性タンパク質等によって誘導される場合)「抑制可能プロモーター」(プロモーターへ作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析対象物、補因子、調節タンパク質等によって誘導される場合)、及び「構成型プロモーター」を含み得る。
本明細書で広義に使用される場合の用語「導入遺伝子」は、ウイルスベクターに組み込まれた任意の異種ヌクレオチド配列を意味し、例えば、標的細胞内での発現のためには、発現制御配列、例えばプロモーターと関連するものでもよい。当業者は、発現制御配列が、標的細胞内で導入遺伝子発現を促進する能力に基づいて選択されることを理解する。導入遺伝子の例は、治療用ポリペプチド又は検出可能なマーカーをコードする核酸である。
本明細書で使用される場合の用語「AAVカプシド」又は「AAVカプシドタンパク質」又は「AAV cap」は、AAVカプシド(cap)遺伝子(例えば、VPI、VP2、及びVP3)若しくはその変異体によってコードされるタンパク質をいう。例えば、この用語は、限定するものではないが、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAV-2/1、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAVLK03、AAVrh10、AAVrh74、AAV44-9、又はその変異体等の、任意のAAVセロタイプ由来のカプシドタンパク質を含む。この用語は又、キメラAAV等の組換えAAVによって発現されるか、又はそれに由来するカプシドタンパク質を含む。
本明細書で使用される場合の用語「AAVカプシド粒子」又は「AAV粒子」は、少なくとも1つのAAVカプシドタンパク質(例えば、VP1タンパク質、VP2タンパク質、VP3タンパク質、若しくはそれらの変異体)を含み、そして任意で、AAVゲノムの核酸若しくはAAVゲノム由来の核酸をカプセル化する。
ベクター又はウイルスカプシドに関して使用される用語「セロタイプ」は、カプシドタンパク質配列及びカプシド構造に基づく明確な免疫学的プロファイルによって定義される。
本明細書で使用される場合の用語「キメラの」は、ウイルスカプシド又は粒子に関する場合、そのカプシド又は粒子が、異なるパルボウイルス由来の配列、好ましくは異なるAAVセロタイプ由来の配列を含むことを意味し、それらはRabinowitzらの文献、米国特許第6,491,907号に説明されており、その開示は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
用語「組換え」は、自然界で一般的に見られるものから明確に区別される遺伝子的実体を意味する。ポリヌクレオチド又は遺伝子に適用される場合、この用語は、そのポリヌクレオチドが、自然界に見られるポリヌクレオチドから明確に区別される構築物の産生をもたらすような、クローニング、制限処理ステップ及び／又はライゲーションステップ、並びに他の手順の様々な組み合せの産物であることを意味する。
本明細書で使用される場合の用語「組換えウイルス」は、例えば、粒子への異種核酸構築物の添加又は挿入によって遺伝子改変されたウイルスをいう。例えば、本明細書で使用される場合の用語「組換えAAV粒子」又は「rAAV」は、例えば、内因性AAV遺伝子の欠失若しくは他の変異、及び／又は、AAV粒子のポリヌクレオチド内への異種核酸構築物の添加若しくは挿入によって遺伝子的に変更されたAAVをいう。
本明細書で使用される場合は「脱標的化活性」は、アンチセンス化合物のその標的核酸へのハイブリダイゼーションに起因する任意の検出可能又は測定可能な活性をいう。或る実施態様では、脱標的化活性とは、標的核酸又はその標的核酸によってコードされるそのタンパク質産物の量又は発現の減少である。
本明細書で使用される場合の「内因性miRNA」は、例えば任意の哺乳動物細胞によって発現される既知又は未知のマイクロRNAであって、例えば、プロセシングステップの後に、水素結合を介した標的核酸へのハイブリダイゼーション、又はタンパク質/RNA複合体化が可能なものをいう。内因性miRNAの非限定的な例には、一本鎖及び二本鎖のDNA若しくはRNA、又は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、shRNA、ssRNA、miRNA、lncRNA等の核酸化合物、並びに占有率基準の(occupancy-based)化合物が含まれる。
本明細書で使用される場合の「脱標的化阻害」は、標的核酸レベルと比較して標的核酸に相補的な内因性miRNAの存在下での、又は内因性miRNAの非存在下での標的核酸レベルの減少をいう。
本明細書で使用される場合の「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応するセグメントにハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を有する、一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。幾つかの実施態様では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%が、該標的核酸内の標的領域へ相補的である配列を有する。例えば、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドの20個の核酸塩基中18個が標的領域に相補的であって、従って特異的に標的領域とハイブリダイズする内因性miRNAは、90パーセント相補性として表される。内因性miRNAの標的核酸の領域との相補性パーセントは、ベーシックローカルアラインメント検索ツール(BLASTプログラム)を使用してルーチン的に決定することができる(Altschulらの文献、J. Mol. Biol.,215,403-410(1990);Zhang及びMaddenの文献、Genome Res.,7,649-656(1997)を参照)。幾つかの実施態様では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドには、SMN1 mRNAを発現するrAAVベクターにハイブリダイズする内因性miRNA及び他のmiRNAが含まれ、これら内因性miRNAの代表的な配列は本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合の「野生型SMN1転写産物」は、組織特異的なmiRNAの標的セグメントのアレイを伴う又は伴わない野生型SMN1 mRNAを含むAAVベクターから産生される転写産物を意味する。従って、組織特異的なmiRNAの標的セグメントのアレイを伴う又は伴わない野生型SMN1転写産物は、カノニカルに転写された哺乳動物細胞「SMN1センス転写産物」であって、宿主細胞smn1遺伝子のコード鎖(センス鎖とも呼ばれる)から産生されたものとは異なる。
本明細書で使用される場合の「特異的にハイブリダイズ可能」とは、特異的結合が望まれる条件下、即ち、インビボアッセイ及び治療的処置の場合の生理学的条件下において、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的核酸との間で充分な程度の相補性を有し、所望の効果を誘導する一方で、非標的核酸に対して最小限の効果しか示さないか又は全く効果を示さないアンチセンス化合物をいう。
本明細書で使用される場合の「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」又は「ストリンジェント条件」は、オリゴマー化合物がその標的配列へハイブリダイズする一方、他の配列には最小数でハイブリダイズする条件をいう。
本明細書で使用される場合の「標的セグメント」は、アンチセンス化合物(例えば、miRNA)が標的とする標的核酸のヌクレオチドの配列をいう。「5'標的部位」は、標的セグメントの最も5'側のヌクレオチドを指す。「3'標的部位」は、標的セグメントの最も3'側のヌクレオチドを指すことを意図する。miRNAの標的セグメントは核酸配列であり、そのmRNA転写産物はmiRNAによって特異的にハイブリダイズ可能である。
本明細書で使用される場合の用語「トランスフェクトする」又は「形質転換する」又は「形質導入する」は、それにより外因性核酸が宿主細胞内に移入又は導入されるプロセスをいう。「トランスフェクトした」又は「形質転換した」又は「形質導入した」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、又は形質導入したものである。例えば、用語「トランスフェクション」は、細胞による外来DNAの取り込みを指すために使用され、外因性DNAが細胞膜内に導入された場合、細胞は「トランスフェクト」されたことになる。多くのトランスフェクション技術が当分野で一般に公知である。例えば、Grahamらの文献、(1973)Virology, 52 :456、Sambrookらの文献、(1989)「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning, a laboratory manual)」Cold Spring Harbor Laboratories,ニューヨーク、Davisらの文献、(1986)「分子生物学の基本的方法(Basic Methods in Molecular Biology)」Elsevier、及び、Chuらの文献、(1981)Gene、13:197を参照されたい。このような技術を使用して、1つ又は複数の外因性分子を適切な宿主細胞に導入することができる。ウイルスによる細胞の「形質導入」は、ウイルス粒子からのDNA又はRNA等の核酸の細胞への移入があることを意味する。
本明細書で使用される場合の用語「宿主細胞」は、核酸分子でトランスフェクトし得る特定の細胞、及びそのような細胞の子孫又は潜在的な子孫をいう。宿主細胞は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞であり得る。
用語「精製された」とは、それが存在する試料の過半数パーセントを目的物質が構成するような、物質(化合物、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、ポリペプチド組成物)の単離をいう。通常は、試料中の実質的に精製された成分は、試料の50%、80%～85%、90-99%、例えば少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%を構成する。目的のポリヌクレオチド及びポリペプチドを精製するための技術は、当分野で周知であり、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、及び密度勾配沈降法が含まれる。
本明細書で使用される場合の用語「医薬的に許容し得る」は、動物、より具体的には人間での使用に関して、連邦政府又は州政府の規制当局によって承認されていること、又は米国薬局方、欧州薬局方、又は他の一般的に認められている薬局方に列記されていること、を意味する。
1の実施態様では、各成分が「医薬的に許容し得る」とは、医薬製剤の他の成分と適合性があり、かつ過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、又はその他の問題又は合併症無しに、ヒト及び動物の組織又は器官に接触させて使用するのに適切であり、合理的な利益/リスク比につり合うという意味である。例えば、Lippincott Williams及びWilkinsの文献、フィラデルフィア、PA、2005;「医薬賦形剤ハンドブック(Handbook of Pharmaceutical Excipients)」第6版;Roweら編、The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association、2009;「医薬添加物ハンドブック(Handbook of Pharmaceutical Additives)」第3版;Ash及びAsh編の文献、Gower Publishing Company、2007;「医薬品の予備処方及び製剤(Pharmaceutical Preformulation and Formulation)」、第2版;Gibson編、CRC Press LLC：Boca Raton、FL、2009を参照されたい。幾つかの実施態様では、医薬的に許容し得る賦形剤は、採用される投与量及び濃度でそれに対して曝露された細胞又は哺乳動物に対して無毒である。幾つかの実施態様では、医薬的に許容し得る賦形剤は、pH緩衝水溶液である。
本明細書で使用される場合の用語「治療する」「治療」及び「治療すること」は、1つ又は複数の療法の投与に起因する、疾患又は症状の、進行、重症度、及び／又は期間の軽減又は改善を指す。治療は、患者がまだ原疾患に苦しんでいるとしても、その患者に改善が観察されるような、その原疾患に関連する1以上の症状の減少、軽減及び/又は緩和があるか否かを評価することによって決定し得る。用語「治療」には、疾患の管理及び緩解の両方が含まれる。用語「管理する」「管理すること」、及び「管理」は、必ずしも疾患の治癒をもたらすとは限らない療法から、対象が得る有益な効果を指す。「治療」又は「治療すること」には、(1)疾患を予防すること、即ち、疾患にさらされる可能性がある又は疾患にかかりやすくなっているが、まだ疾患を経験していない又は疾患の症候を示していない対象において、疾患の症候を予防すること、又は疾患をより軽く発生させること、(2)疾患を阻止すること、即ち、発病を抑止すること、進行を予防若しくは遅延させること、又は疾患状態を元に戻すこと、(3)疾患症候を緩和すること、即ち、対象が経験する症候の数を減少させること、並びに、(4)疾患又はその症候の進行を軽減すること、予防すること、又は遅延させること、が含まれる。用語「予防する」「予防すること」、及び「予防」は、疾患、障害、症状、又は関連する症候(複数可)の発症(又は再発)の可能性を減らすことを指す。
本明細書で使用される場合の「投与する」「投与」、又は「投与すること」は、物質(例えば、本明細書で提供されるコンジュゲート又は医薬組成物)を対象又は患者(例えば、ヒト)へ、注入するか或いはそうではなくて物理的に送達する行為をいい、例えば、経口、粘膜性、局所的、皮内、非経口、静脈内、硝子体内、関節内、網膜下、筋肉内、髄腔内の送達によるか、及び／又は本明細書に記載の若しくは当分野で公知の、任意の他の物理的送達法による。特別な実施態様では、投与は静脈内注入による。本明細書で提供されるコンジュゲート又は組成物は、全身的に又は特定の組織に送達し得る。
本明細書で使用される場合の用語「有効量」又は「治療有効量」は、所与の症状、障害若しくは疾患及び/又はそれに関連する徴候の、治療、診断、予防、発症の遅延、軽減、並びに/又は、その重症度及び/若しくは期間の改善に充分な治療薬(例えば、本明細書で提供されるコンジュゲート若しくは医薬組成物)の量を指す。これらの用語は又、所与の疾患の増強若しくは進行を低減、遅延、若しくは改善するために、所与の疾患の再発、発病若しくは発症を低減、遅延、若しくは改善するために、及び/又は、別の療法の予防効果若しくは治療効果を改善若しくは増強するために、又は、別の療法への架け橋として作用するために、必要な量を包含する。幾つかの実施態様では、本明細書で使用される場合の「有効量」は又、特定された結果を達成するための、本明細書に記載のコンジュゲート量をもいう。本明細書で使用される場合、用語「対象」及び「患者」は互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、対象は、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等)又は霊長類(例えば、サル及び人間)、例えばヒト等の哺乳動物である。或る実施態様では、対象は、本明細書で提供される疾患又は障害と診断された哺乳動物、例えばヒトである。別の実施態様では、対象は、本明細書で提供される疾患又は障害を発病するリスクのある哺乳動物、例えばヒトである。特別な実施態様では、対象はヒトである。
本明細書で使用される場合の用語「複数の療法」及び「療法」は、疾患又は障害若しくはその症候(例えば、本明細書で提供される疾患若しくは障害、又はそれに関連する1以上の症候又は症状)の、予防、治療、管理、又は改善に使用できる、任意のプロトコル(複数可)、方法(複数可)、組成物、製剤、及び／又は薬剤(複数可)を指すことができる。或る実施態様では、用語「複数の療法」及び「療法」は、薬物療法、アジュバント療法、放射線療法、手術、生物学的療法、支持療法、及び／又は疾患若しくは障害、若しくはその1以上の症候の治療、管理、予防、又は改善に有用な他の療法を指す。或る実施態様では、用語「療法」は、本明細書に記載のコンジュゲート又はその医薬組成物以外の療法をいう。
本明細書で使用される場合の用語「SMN関連疾患又は障害」は、例えば、症候又は直接的若しくは間接的要因のいずれかとして、SMNが関与する疾患又は障害(SMNタンパク質の異常な発現レベルを含む)をいう。SMN関連疾患又は障害には、限定するものではないが、smn1遺伝子の発現低下に関連する又は変異型smn1遺伝子に関連する疾患又は障害が含まれる。
用語「約」及び「およそ」は、所与の値又は範囲の20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3%以内、2%以内、1%以内、又はそれ未満を意味する。
本開示及び特許請求の範囲で使用されるような、単数形「a」「an」及び「the」は、文脈が別個に明確に規定しない限り、複数形を含む。
実施態様が用語「含む」を用いて本明細書に記載された場合はいずれも「からなる」及び／又は「から本質的になる」の語句で記載された別の類似の実施態様も同様に提供されることが理解される。同様に、実施態様が語句「から本質的になる」を用いて本明細書に記載された場合はいずれも「からなる」の語句で記載された別の類似の実施態様も同様に提供されることが理解される。
「A及びBの間」又は「A-Bの間」等の語句で使用される用語「の間」は、A及びBの両方を含む範囲をいう。
本明細書の「A及び／又はB」等の語句で使用される用語「及び／又は」は、A及びBの両方;A又はB;A(単独);並びにB(単独)を含むことが意図される。同様に「A、B、及び/又はC」等の語句で使用される用語「及び/又は」は、次のそれぞれの実施態様：A、B、及びC;A、B、又はC;A又はC;A又はB;B又はC;A及びC;A及びB;B及びC;A(単独);B(単独);並びにC(単独)を包含することが意図される。
(5．2．核酸構築物)
1の態様で、本明細書で提供されるのは、目的タンパク質をコードする第1の核酸領域、及び、1又は複数の内因性RNA(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)(又、miRNAの標的配列とも称される)を含む第2の核酸領域、を含む新規な核酸である。
幾つかの実施態様では、前記第1の核酸領域は治療用分子(例えば、SMNタンパク質)をコードする。幾つかの実施態様では、前記1又は複数の標的セグメントを含む第2の核酸領域は、目的タンパク質をコードする第1の核酸領域の3'位にある。幾つかの実施態様では、前記1又は複数の標的セグメントを含む第2の核酸領域は、前記目的タンパク質をコードする第1の核酸領域の3'位の直後にあるか又は隣接している。他の実施態様では、前記1又は複数の標的セグメントを含む第2の核酸領域は、目的タンパク質をコードする第1の核酸領域の3'位から、1以上のヌクレオチド(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上のヌクレオチド)だけ離れている。
(5．2．1．目的タンパク質又はその変異体をコードする核酸)
幾つかの実施態様では、本明細書で提供される核酸構築物は、SMNタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供される核酸構築物は、配列番号33のアミノ酸配列を有するSMNタンパク質をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、前記SMNタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号34及び配列番号35からなる群から選択される。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供される核酸は、配列番号34又は配列番号35の核酸配列との、特定の同一性パーセントを有する。幾つかの実施態様では、本明細書で提供される目的タンパク質をコードする核酸は、少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%のいずれかの、配列番号34との配列同一性を有する。幾つかの実施態様では、本明細書で提供される目的タンパク質をコードする核酸は、少なくとも約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%のいずれかの、配列番号35との配列同一性を有する。
2つの配列(例えば、アミノ酸配列又は核酸配列)間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを使用して達成できる。2つの配列を比較するために使用される数学アルゴリズムの、1つの好ましく非限定的な例は、Karlin及びAltschulの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:2264 2268(1990)アルゴリズムを、Karlin及びAltschulの文献、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873 5877(1993)で修正したものである。このようなアルゴリズムを、Altschulらの文献、J. Mol. Biol. 215:403(1990)のNBLAST及びXBLASTプログラムへ組み込む。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメータセット、例えば、スコア＝100、ワード長＝12で実施して、本明細書に記載の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラムパラメータセットで、例えば、スコア＝50、ワード長＝3で実施して、本明細書に記載のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップアラインメントを得るためには、Gapped BLASTを、Altschulらの文献、Nucleic Acids Res. 25:3389 3402(1997)に記載のように利用できる。或いは、PSI BLASTを使用して、分子間の遠縁関係(distant relationship)を検出する反復検索を実施してもよい(同上)。BLAST、Gapped BLAST、及びPSI Blastプログラムを使用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ(例えば、XBLAST及びNBLASTのもの)を使用できる(例えば、米国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.govを参照)。配列を比較するために使用される数学アルゴリズムの、別の非限定的な例は、Myers及びMillerの文献、CABIOS 4:11-17(1998)のアルゴリズムである。このアルゴリズムを、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ALIGNプログラム(バージョン 2.0)へ組み込む。アミノ酸配列比較のためにALIGNプログラムを利用する場合、PAM120重み付き残差表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティ=12、及びギャップペナルティ=4を使用できる。
2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ許容あり又は許容無しに、上記と類似する技術を使用して決定できる。同一性パーセントの計算では、通常、完全一致のみがカウントされる。
幾つかの実施態様であって、本明細書に記載の配列のものは、糖部分、ヌクレオシド間結合、又は核酸塩基に対する1つ又は複数の改変を更に含み得る。
或る実施態様では、核酸はヒト核酸(即ち、ヒトsmn1遺伝子に由来する核酸)である。他の実施態様では、核酸は非ヒト核酸(即ち、非ヒトsmn1遺伝子に由来する核酸)である。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供される核酸は、1つ又は複数の挿入、欠失、反転、及び／又は置換を含む。幾つかの実施態様では、本明細書で提供される核酸構築物は、コドン最適化された核酸領域を含む。1の実施態様では、smn1をコードする核酸はコドン最適化される。1の実施態様では、smn1をコードする核酸は、真核生物内、例えばヒト内での発現のためにコドン最適化される。幾つかの実施態様では、smn1をコードするコード配列は、特に細胞内、例えば真核細胞内での発現のためにコドン最適化される。真核細胞は、特定の生物。例えば哺乳動物のもの又はそれに由来するものでもよく、その生物には、例えば、限定するものではないが、ヒト、又は非ヒト真核生物若しくは動物、又は本明細書で議論される哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、食用家畜等、若しくは非ヒト哺乳動物又は霊長類が含まれる。一般に、コドン最適化は、目的の宿主細胞内での発現を増強するために、天然配列の少なくとも1つのコドン(例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50若しくはそれ以上の又はそれらをおおよそ超える数のコドン)を、天然アミノ酸配列を維持しつつ、その宿主細胞の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置換することによって、核酸配列を改変するプロセスをいう。様々な種が、特別なアミノ酸の或るコドンに対して特別なバイアスを示す。コドンバイアス(生物間でのコドン使用頻度の違い)は、多くの場合、メッセンジャーRNA(mRNA)の翻訳効率と相関し、それはとりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーRNA(tRNA)分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞内での選択されたtRNAの優位性は、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子を、所与の生物内での最適な遺伝子発現のために、コドン最適化技術に基づき調整できる。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.orjp/codon/で入手可能な「コドン使用頻度データベース」で容易に利用可能であり、これらの表は多くの方法で適合可能である。Nakamura、Y.らの文献、Nucl. Acids Res. 28:292(2000)を参照されたい。特定の宿主細胞内での発現のための特定配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムも又、利用可能であり、例えばGene Forge(Aptagen社、Jacobus、PA)が同様に利用可能である。
本開示の核酸分子(例えば、smn1核酸を含む)は、標準的な分子生物学技術を使用して単離できる。目的の核酸配列の全部又は一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用すると、核酸分子が、(例えば、Sambrook,J.、Fritsh,E.F.、及びManiatis,T.の文献「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989年、に記載のような)標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術を使用して単離できる。
本開示の方法で使用するための核酸分子は又、目的の核酸分子の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によっても単離できる。本開示の方法で使用される核酸分子は、標準的なPCR増幅技術に従って、cDNA、mRNA、又は代わりにゲノムDNAをテンプレートとして、かつ適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅可能である。
更に、目的のヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドも又、標準技術を使用して化学的に合成することができる。ポリデオキシヌクレオチドを化学的に合成する多数の方法が公知であり、それには市販のDNA合成装置で自動化されている固相合成が含まれる(例えば、参照されるのはItakuraらの文献、米国特許第4,598,049号;Caruthersらの文献、米国特許第4,458,066;及びItakuraの文献、米国特許第4,401,796号及び4,373,071号であり、これらは参照により本明細書中に組み込まれる)。合成オリゴヌクレオチドを設計するための自動化方法が利用可能である。例えば、Hoover,D.M.及びLubowskiの文献、J. Nucleic Acids Research、30(10)：e43(2002)を参照されたい。
他の実施態様では、本明細書で提供される核酸構築物は、SMNタンパク質変異体をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、前記SMNタンパク質変異体は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号33との同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本明細書に記載のタンパク質の変異体が調製し得ることが意図される。例えば、ペプチド変異体は、コードしているDNAへ適切なヌクレオチド変化を導入することによって、及び/又は所望のポリペプチドの合成によって、調製することができる。そのアミノ酸変化の価値を認識する当業者は、当該ペプチドの翻訳後プロセスを変化し得る。
変異は、ポリペプチドをコードする1以上のコドンの置換、欠失、又は挿入であって、元のポリペプチドと比較して、そのアミノ酸配列内に変化を生じるものでもよい。
アミノ酸置換は、1のアミノ酸の、類似の構造特性及び／又は化学特性を有する別のアミノ酸での置換、例えば、ロイシンをセリンで置き換える等の保存的アミノ酸置換、の結果でもよい。当業者に公知の標準技術を使用して、本明細書で提供される分子をコードするヌクレオチド配列内に変異を導入することができ、それには、例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特異的変異誘発及びPCR介在性変異誘発が含まれる。挿入又は欠失は、任意で約1～5アミノ酸の範囲内であり得る。
或る実施態様では、置換、欠失、又は挿入には、元の分子と比較して25未満のアミノ酸置換、20未満のアミノ酸置換、15未満のアミノ酸置換、10未満のアミノ酸置換、5未満のアミノ酸置換、4未満のアミノ酸置換、3未満のアミノ酸置換、若しくは2未満のアミノ酸置換を含む。特別な実施態様では、置換は、1つ又は複数の予測される非必須アミノ酸残基でなされる保存的アミノ酸置換である。許容される変異は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を体系的に行うこと、及び、得られた変異体を親ペプチドが示す活性について試験することによって決定できる。
アミノ酸配列挿入には、1の残基から複数の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端及び／若しくはカルボキシル末端融合、並びに、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有するポリペプチドが含まれる。
保存的アミノ酸置換によって生成されたタンパク質は、本開示に含まれる。保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は、類似の電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基で置換される。上記のように、類似の電荷を伴う側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を持つアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を持つアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分岐側鎖を持つアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖を持つアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。或いは、変異は、例えば飽和変異誘発により、コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに導入されてもよく、得られた変異体は生物活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を特定することができる。変異誘発の後に、コードされたタンパク質を発現させ、そのタンパク質活性を決定することができる。保存的な(例えば、類似の特性及び/又は側鎖を有するアミノ酸群内での)置換を行って、その特性が維持するか、又はその特性が有意に変化されないようにすることができる。置換の例示を下表に示す。
(表1．アミノ酸置換)
Figure 2023537358000001
アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる(例えば、Lehningerの文献「生化学(Biochemistry)」 73-75(第2版、1975)を参照)。(1)非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)、(2)非荷電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)、(3)酸性：Asp(D)、Glu(E)、及び、(4)塩基性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。それとは別に、天然型残基を、共通の側鎖特性に基づいてグループ化してもよい。(1)疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile、(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln、(3)酸性：Asp、Glu、(4)塩基性：His、Lys、Arg;(5)鎖の向きに影響を与える残基：Gly、Pro、及び、(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
例えば、本明細書で提供されるポリペプチドの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基も又、例えば、アラニン又はセリン等の別のアミノ酸で置換して、分子の酸化安定性を改善し、異常架橋を防止することができる。
非保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
アミノ酸配列挿入には、1残基から100以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲の、アミノ末端及び／若しくはカルボキシル末端の融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、N末端メチオニル残基を有するポリペプチドが含まれる。
変異は、オリゴヌクレオチド介在性(部位特異的)変異誘発、アラニンスキャニング、及びPCR変異誘発等の、当分野で公知の方法を使用して行うことができる。部位特異的変異誘発(例えば、Carterの文献、Biochem J. 237:1-7(1986)、及びZollerらの文献、Nucl. Acids Res. 10:6487-500(1982)を参照)、カセット変異誘発(例えば、Wellsらの文献、Gene 34:315-23(1985))、又は他の公知の技術を、クローン化DNAに対して実施して、ポリペプチド変異DNAを生成することができる。
別の態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号35の核酸配列、又は少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列番号35との同一性を有する核酸配列を含む、SMNタンパク質をコードする、最適化された核酸である。幾つかの実施態様では、本明細書で提供される最適化された核酸は更に、配列番号36若しくは配列番号37を含むプロモーター領域を含む。幾つかの特別な実施態様で本明細書で提供されるのは、配列番号36の核酸及び配列番号35の核酸を含む核酸である。他の特別な実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号37の核酸及び配列番号35の核酸を含む核酸である。
(5．2．2．内因性miRNAの標的セグメント)
或る実施態様では、本明細書で提供される核酸構築物は、前記目的タンパク質(例えば、SMNタンパク質)をコードする核酸に加えて、1又は複数の内因性miRNA(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む核酸(若しくはmiRNAの標的配列)を含む。下記第6節に示すように、1又は複数の内因性miRNA(複数可)の特定の標的セグメント(複数可)の含有は、遺伝子治療(例えば、AAVベースの遺伝子治療)へのオフターゲット毒性を低下させる有利な特性を示した。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、2以上の内因性miRNAの標的セグメントを含み、その2以上の内因性miRNA(複数可)は組織特異的miRNA(複数可)である。本明細書で使用される場合は、組織特異的miRNAとは、他の部分と比較して1以上の特異的組織でその量が多いmiRNA、例えば肝臓特異的miRNA及び心臓特異的miRNAである。幾つかの実施態様では、前記2以上の内因性miRNAは、同一の組織に特異的である。他の実施態様では、前記2以上の内因性miRNAは、異なる組織に特異的である。幾つかの特別な実施態様では、本核酸は、1以上の肝臓特異的miRNA(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)及び1以上の心臓特異的miRNA(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、1～50標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、1～40標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、1～30標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、1～20標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、1～15標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、5～15標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、7～11標的セグメントを含む。
miRNAの標的セグメントは、miRNA(例えば、組織特異的内因性miRNA)と特異的にハイブリダイズ可能であるか、又は相補性のある核酸セグメントをいう。ハイブリダイゼーションの最も一般的なメカニズムは、核酸分子の相補性核酸塩基の間の水素結合(例えば、ワトソン-クリック型、フーグスティーン型、又は、逆フーグスティーン型水素結合)を伴う。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、ハイブリダイズさせる核酸分子の特性及び組成によって決定される。ある配列が別の配列と特異的にハイブリダイズ可能であるか否かを決定する方法は、当分野で周知である。
内因性miRNA及び標的核酸は、充分な数の内因性miRNAの核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と水素結合して、所望の効果(例えば、本明細書で提供される標的セグメントを有するsmn1等の、標的核酸のアンチセンス阻害)が生じることが可能な場合、互いに相補的である。
miRNAと、標的セグメントを有するsmn1との間で非相補的である核酸塩基があったとしても、そのmiRNAが標的核酸へ特異的にハイブリダイズ可能に維持される限り、忍容され得る。更に、miRNAは、介在する又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベント(例えば、ループ構造、ミスマッチ又はヘアピン構造)に関与しないように、標的セグメントを有するsmn1の1以上のセグメントに対してハイブリダイズし得る。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるmiRNA若しくはその特定の部分は、本件核酸構築物で提供されるmiRNAの標的配列又はその一部へ相補的であるか、又は、少なくとも70%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%相補的である。
標的核酸を有するmiRNAのパーセント相補性は、ルーチン的な方法を使用して決定できる。例えば、そのmiRNAの20個の核酸塩基中18個が標的領域に相補的であって、特異的にハイブリダイズするmiRNAは、90パーセント相補性として表される。この例の場合、残りの非相補的核酸塩基は、相補性核酸塩基と共にクラスター化していても点在していてもよく、互いに又は相補性核酸塩基と隣接している必要はない。そのため、標的核酸に完全に相補的な2つの領域によって隣接されている4(4個の)非相補的核酸塩基を有し、18核酸塩基長であるmiRNAは、標的核酸との全体相補性が77.8%であり、そのため本開示の範囲内である。標的核酸の領域を有するmiRNAの相補性パーセントは、当分野で公知のBLASTプログラム(ベーシックローカルアラインメント検索ツール)及びPowerBLASTプログラム(Altschulらの文献、J. Mol. Biol.、1990、215、403 410;Zhang及びMaddenの文献、Genome Res.、1997、7、649 656)を使用してルーチン的に決定することができる。パーセント相同性、配列同一性又は配列相補性は、例えば、Gapプログラム(ウィスコンシン配列解析パッケージ、Unix用バージョン8、Genetics Computer Group社、University Research Park、マディソン、ウィスコンシン)により、デフォルト設定を使って、Smith及びWatermanのアルゴリズム(Adv. Appl. Math.、1981、2、482 489)を使用して決定することができる。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるmiRNA又はその特定の部分は、標的核酸又はその特定の部分に完全に相補的(即ち、100％相補性)である。例えば、幾つかの実施態様では、miRNAは、本明細書で提供される標的セグメントに完全に相補的であり得る。本明細書で使用される場合の「完全に相補的」とは、miRNAの各核酸塩基が、標的核酸の対応する核酸塩基と正確に塩基対形成できることを意味する。例えば、20個の核酸塩基miRNAは、そのmiRNAに完全に相補的な標的核酸の対応する20個の核酸塩基部分が存在する限り、400核酸塩基長である標的配列に完全に相補的である。「完全に相補的」は又、第1及び／又は第2の核酸の特定部分に関しても使用できる。例えば、30個の核酸塩基miRNAの20核酸塩基部分は、400核酸塩基長である標的配列に「完全に相補的」であり得る。30個の核酸塩基オリゴヌクレオチドの20個の核酸塩基部分は、標的配列が対応する20核酸塩基部分を有していて、核酸塩基それぞれがmiRNAの20個の核酸塩基部分に相補的である場合、その標的配列に完全に相補的である。その場合、その30個の核酸塩基miRNA全体は、miRNAの残りの10個の核酸塩基が又その標的配列に相補的であるか否かによって、その標的配列に完全に相補的であるかもしれないし、完全には相補的ではないかもしれない。
非相補的核酸塩基の位置は、miRNAの5'末端若しくは3'末端、又は5'末端と3'末端との間の任意の場所であり得る。或いは、非相補的な1又は複数の核酸塩基が、miRNAの内部に位置してもよい。2以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、それらは、連続して(即ち、連結されて)いても不連続でもよい。1の実施態様では、非相補的核酸塩基はギャップマー型アンチセンスオリゴヌクレオチドのウィングセグメント内に存在する。
幾つかの実施態様では、長さが12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、若しくは30核酸塩基である、又は最大でこれらの長さの核酸塩基であるmiRNAは、標的核酸に比べて8を超えない、7を超えない、6を超えない、5を超えない、4を超えない、3を超えない、2を超えない、又は1を超えない非相補的核酸塩基(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、長さが12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、若しくは30核酸塩基である、又は最大でこれらの長さの核酸塩基であるmiRNAは、標的核酸に比べて8を超えない、7を超えない、6を超えない、5を超えない、4を超えない、3を超えない、2を超えない、又は1を超えない非相補的核酸塩基(複数可)を含む。
本明細書で提供されるmiRNAは又、標的核酸の部分に相補的なものを含む。本明細書で使用される場合の「部分」は、標的核酸の領域又はセグメント内の、特定数の連続した(即ち、連結された)核酸塩基をいう。「部分」は又、miRNAの特定数の連続する核酸塩基を指す場合もある。幾つかの実施態様では、miRNAは、標的セグメントの少なくとも8核酸塩基部分に相補的である。幾つかの実施態様では、miRNAは、標的セグメントの少なくとも9核酸塩基部分に相補的である。幾つかの実施態様では、miRNAは、標的セグメントの少なくとも10核酸塩基部分に相補的である。幾つかの実施態様では、miRNAは、標的セグメントの少なくとも11核酸塩基部分に相補的である。幾つかの実施態様では、miRNAは、標的セグメントの少なくとも12核酸塩基部分に相補的である。幾つかの実施態様では、miRNAは、標的セグメントの少なくとも13核酸塩基部分に相補的である。幾つかの実施態様では、miRNAは、標的セグメントの少なくとも14核酸塩基部分に相補的である。幾つかの実施態様では、miRNAは、標的セグメントの少なくとも15核酸塩基部分に相補的である。同様に意図されるのは、標的セグメントの少なくとも9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、若しくはそれを超えた数の核酸塩基部分、又は、任意の2つのこれらの値により定義された範囲に相補的であるmiRNAである。
内因性miRNAの非限定的な例示、及びそれらmiRNAの例の標的セグメントの非限定的な例示を、下表2に示す。
(表2．miRNA及びその標的化配列のリスト)
Figure 2023537358000002
幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、配列番号1を含む。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、少なくとも80%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約80%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約81%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約82%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約83%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約84%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約85%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約86%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約87%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約88%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約89%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約90%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約91%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約92%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約93%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約94%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約95%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約96%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約97%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約98%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約99%が配列番号1と同一である。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記miRNAの1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む。
幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、配列番号2を含む。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、少なくとも80%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約80%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約81%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約82%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約83%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約84%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約85%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約86%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約87%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約88%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約89%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約90%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約91%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約92%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約93%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約94%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約95%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約96%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約97%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約98%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約99%が配列番号2と同一である。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記miRNAの1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む。
幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、配列番号3を含む。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、少なくとも80%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約80%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約81%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約82%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約83%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約84%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約85%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約86%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約87%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約88%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約89%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約90%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約91%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約92%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約93%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約94%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約95%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約96%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約97%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約98%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約99%が配列番号3と同一である。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記miRNAの1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む。
幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、配列番号4を含む。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、少なくとも80%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約80%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約81%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約82%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約83%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約84%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約85%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約86%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約87%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約88%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約89%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約90%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約91%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約92%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約93%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約94%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約95%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約96%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約97%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約98%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約99%が配列番号4と同一である。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記miRNAの1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む。
幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、配列番号5を含む。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、少なくとも80%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約80%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約81%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約82%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約83%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約84%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約85%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約86%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約87%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約88%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約89%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約90%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約91%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約92%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約93%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約94%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約95%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約96%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約97%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約98%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約99%が配列番号5と同一である。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記miRNAの1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む。
幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、配列番号6を含む。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、少なくとも80%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約80%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約81%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約82%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約83%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約84%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約85%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約86%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約87%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約88%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約89%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約90%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約91%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約92%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約93%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約94%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約95%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約96%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約97%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約98%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記内因性miRNA配列は、約99%が配列番号6と同一である。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記miRNAの1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号7と同一の核酸配列を含む、標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの特別な実施態様では、前記核酸は、配列番号7を有する標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記標的セグメント(複数可)の、例えば配列番号7の核酸配列を有する標的セグメントの、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の数の反復を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号8と同一の核酸配列を含む、標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの特別な実施態様では、前記核酸は、配列番号8を有する標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記標的セグメント(複数可)の、例えば配列番号8の核酸配列を有する標的セグメントの、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の数の反復を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号9と同一の核酸配列を含む、標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの特別な実施態様では、前記核酸は、配列番号9を有する標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記標的セグメント(複数可)の、例えば配列番号9の核酸配列を有する標的セグメントの、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の数の反復を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号10と同一の核酸配列を含む、標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの特別な実施態様では、前記核酸は、配列番号10を有する標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記標的セグメント(複数可)の、例えば配列番号10の核酸配列を有する標的セグメントの、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の数の反復を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号11と同一の核酸配列を含む、標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの特別な実施態様では、前記核酸は、配列番号11を有する標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記標的セグメント(複数可)の、例えば配列番号11の核酸配列を有する標的セグメントの、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の数の反復を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号12と同一の核酸配列を含む、標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの特別な実施態様では、前記核酸は、配列番号12を有する標的セグメントの1以上の反復(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、任意の上記標的セグメント(複数可)の、例えば配列番号12の核酸配列を有する標的セグメントの、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれ以上の数の反復を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、hsa-mir-133a(又はhsa-mir-133a-1)の少なくとも1つの標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、hsa-mir-133a(又はhsa-mir-133a-1)の標的セグメントの少なくとも2回の反復を含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、hsa-mir-133a(又はhsa-mir-133a-1)の標的セグメントの少なくとも3回の反復を含む。
幾つかの実施態様では、前記核酸は、hsa-mir-133a(又はhsa-mir-133a-1)の少なくとも1つの標的セグメント及び肝臓特異的miRNAの少なくとも1つの標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、hsa-mir-133a(又はhsa-mir-133a-1)の標的セグメントの少なくとも2回の反復及び肝臓特異的miRNAの少なくとも1つの標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、前記核酸は、hsa-mir-133a(又はhsa-mir-133a-1)の標的セグメントの少なくとも3回の反復及び肝臓特異的miRNAの少なくとも1つの標的セグメントを含む。幾つかの実施態様では、肝臓特異的miRNAはhsa-mir-122である。幾つかのより特異的な実施態様では、hsa-mir-133aの標的セグメントは配列番号11を含み、かつhsa-mir-122の標的セグメントは配列番号10を含む。
(表3．リンカーの例示)
Figure 2023537358000003
幾つかの実施態様では、本核酸構築物の標的配列中の複数の標的セグメントは重複してもよい。或いは、それらは、重複しなくてもよい。幾つかの実施態様では、標的領域内の標的セグメントは、多数のヌクレオチド、即ち、約250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、20、又は10ヌクレオチド、それらの数を超えないもの、それらの数をおおよそ超えないもの、又は、任意の上記2つの値により定義された範囲のもので分離されている。幾つかの実施態様では、標的配列内の標的セグメントは、5個を超えない、又は約5個を超えないヌクレオチドで分離されている。幾つかの実施態様では、標的セグメントは連続している。
幾つかの実施態様では、1又は複数のリンカーが2つの標的セグメントの間に存在する。幾つかの実施態様では、全ての標的セグメントがリンカーによって連結される。他の実施態様では、標的セグメントの部分のみがリンカーによって連結される。幾つかの実施態様では、核酸中のリンカーは同一である。他の実施態様では、異なるリンカーが本核酸内に存在する。
リンカーの例示を表3に示す。幾つかの実施態様では、核酸は、配列番号13を有する1又は複数のリンカー(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、核酸は、配列番号14を有する1又は複数のリンカー(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、核酸は、配列番号15を有する1又は複数のリンカー(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、核酸は、配列番号16を有する1又は複数のリンカー(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、核酸は、配列番号17を有する1又は複数のリンカー(複数可)を含む。幾つかの実施態様では、核酸は、それぞれ独立して配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17から選択される2以上のリンカーを含む。
複数の内因性miRNAの複数の標的セグメントを含む核酸(又はmiRNAの標的配列)の例示を、下記第6節の表6に示す。
幾つかの実施態様では、複数の標的セグメントを含む核酸(又はmiRNAの標的配列)は、hsa-mir-208aの少なくとも1つの標的セグメント、hsa-mir-208bの少なくとも1つの標的セグメント、hsa-mir-122の少なくとも1つの標的セグメント、及びhsa-mir-133aの少なくとも1つの標的セグメントを含む。幾つかのより特異的な実施態様では、複数の標的セグメントを含む核酸(又はmiRNAの標的配列)は、hsa-mir-208aの2つの標的セグメント、hsa-mir-208bの2つの標的セグメント、hsa-mir-122の3つの標的セグメント、及びhsa-mir-133aの3つの標的セグメントを含む。特別な実施態様では、複数の標的セグメントを含む核酸(又はmiRNAの標的配列)は、配列番号8の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、配列番号9の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、配列番号10の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、及び配列番号11の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復を含む。幾つかの実施態様では、複数の標的セグメント(又はmiRNAの標的配列)を含む核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号19と同一である核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、複数の標的セグメント(又はmiRNAの標的配列)を含む核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号18と同一である核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、複数の標的セグメント(又はmiRNAの標的配列)を含む核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号20と同一である核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、複数の標的セグメント(又はmiRNAの標的配列)を含む核酸は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号21と同一である核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記構成要素標的セグメントは、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のものと同一の順序である。他の実施態様では、前記構成要素標的セグメントは、配列番号18、配列番号19、配列番号20、又は配列番号21のものと異なる順序(5'から3'まで)である。
(5．2．3．合成プロモーター)
下記第6節で実証されたように、本明細書で提供される特定の合成プロモーターは、特にSMNを送達するAAVベースの遺伝子治療での使用において、驚くべき優れた効果を提供する。
従って、更に別の態様で、本明細書で提供されるのは、SMNタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列並びにエンハンサー及びコアプロモーターを含む合成プロモーターを含む核酸領域、を含む核酸である。
幾つかの実施態様では、前記合成プロモーターは、CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記合成プロモーターは、proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。幾つかの実施態様では、前記合成プロモーターは、proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。他の実施態様では、前記合成プロモーターは、proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含む。
幾つかの実施態様では、前記合成プロモーターは、CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含み、該hSynプロモーターは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号38と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、かつ該CMVエンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号39と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記合成プロモーターは、proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含み、該hSynプロモーターは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号38と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、かつ該proC3エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号40と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記合成プロモーターは、proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含み、該hSynプロモーターは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号38と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、かつ該proA5エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号41と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記合成プロモーターは、proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含み、該hSynプロモーターは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号38と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含み、かつ該proB15エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号42と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む。
幾つかの実施態様では、前記SMNタンパク質若しくはその変異体は、配列番号33のアミノ酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号33との同一性を有するアミノ酸配列、を含む。
幾つかの実施態様では、SMNタンパク質又はその変異体をコードしている前記核酸配列は、配列番号34及び配列番号35からなる群から選択される核酸配列を含む。
本合成プロモーターを含むrAAVベクターの例示を下記第6節に記載する。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号45の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号45との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号46の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号46との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号47の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号47との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号48の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号48との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号49の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号49との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号50の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号50との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号51の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号51との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号52の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号52との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号53の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号53との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクターである。
(5．3．遺伝子治療用の組換えウイルスベクター及びウイルス粒子)
同様に本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される核酸の送達用ウイルスベースの遺伝子治療である。従って、別の態様で、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される(目的タンパク質をコードする核酸領域、及びmiRNAの標的セグメントを含む核酸領域を含む)核酸を含む、ウイルスベクター(例えば、rAAVベクター)である。更に別の態様で、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される核酸を含むウイルス粒子(例えば、rAAV又はrAAV粒子)である。
(5．3．1．ウイルスベースの遺伝子送達システム)
哺乳動物細胞への遺伝子移入のために、多数のウイルスベースの系が開発されてきた。ウイルスベクターの例には、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が含まれる。ウイルスベクター技術は当分野で周知であり、例えば、Sambrookらの文献(2001「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)」Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク)、並びに、他のウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。
或る実施態様では、本明細書で提供されるウイルスベクター又はウイルス粒子は、アデノウイルスに由来する。ベクターの例示としては、HAd5、ChAd3、HAd26、HAd6、AdCH3NSmut、HAd35、ChAd63、HAd4、rcAd26に基づく又は由来するものである。組換えアデノウイルスベクターは、当分野で公知の方法に従って構築できる。例えば、O'Connorらの文献、Virology、217(1):11-22(1996);Hardyらの文献、Journal of Virology、73(9):7835-7841(1999);Hardyらの文献、Journal of Virology、71(3):1842-1849(1997)を参照されたい。幾つかの実施態様では、第3世代アデノウイルスベクター(「高効率(high capacity)アデノウイルスベクター」(HCAd)、ヘルパー依存性又は「ガットレス」アデノウイルスベクターとも称される)を本明細書で使用して、より長い配列を送達することができる。幾つかの実施態様では、目的のポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子は、ITR及びパッケージングシグナルのみを含むアデノウイルスベクターへクローン化される。ヘルパーアデノウイルスベクターをHEK細胞に同時トランスフェクトして、アデノウイルス粒子を産生することができる。Leeらの文献、Genes and Diseases、4(2):43-63(2007)、4(2):43-63(2007)を参照されたい。
或る実施態様では、本明細書で提供されるウイルスベクター又はウイルス粒子は、レンチウイルスに由来する。ベクターの例示としては、HIV-1、HIV-2、SIVSM、SIVAGM、EIAV、FIV、VNV、CAEV、又はBIVに基づく又は由来するものである。レンチウイルスベクターは、当分野で公知の方法、例えば、Cribbsらの文献、BMC Biotechnology、13:98(2003);Mertenらの文献、Mol Ther Methods Clin Dev.、13(3):16017(2016);Durand及びCimarelliの文献、Viruses、3:132-159(2011)の記載に基づいて生成できる。幾つかの実施態様では、第3世代の自己不活化型レンチウイルスベクターが本明細書で使用される。
或る実施態様では、本明細書で提供されるウイルスベクター又はウイルス粒子は、単純ヘルペスウイルス(HSV)に由来する。幾つかの実施態様では、前記単純ヘルペスウイルスは、単純ヘルペス1型ウイルス(HSV-1)、単純ヘルペス2型ウイルス(HSV-2)、又は任意のそれら誘導体である。ベクターの例示としては、HSV-1、HSV-2、CMV、VZV、EBV、及びKSHVに基づく又は由来するものである。HSVベースのベクターは、当分野で公知の方法、例えば米国特許番号第7,078,029号、6,261,552号、5,998,174号、5,879,934号、5,849,572号、5,849,571号、5,837,532号、5,804,413号、及び5,658,724号、並びに国際特許出願公開WO91/02788、WO96/04394、WO98/15637、及びWO99/06583号の記載に基づいて構築でき、これらは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれている。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるHSVベースのベクターは、アンプリコンベクターである。他の実施態様では、本明細書で提供されるHSVベースのベクターは、複製欠損型ベクターである。更に他の実施態様では、本明細書で提供されるHSVベースのベクターは複製能のあるベクターである。
アンプリコンは、HSV DNA複製起点(ori)及びHSV切断-パッケージング認識配列(pac)の両方を含むように操作したプラスミド由来のベクターである。アンプリコンをHSVヘルパー機能を有する哺乳動物細胞にトランスフェクトすると、それらは複製され、頭-尾(head to tail)結合されたコンカテマー(concatamer)を形成し、次にウイルス粒子内にパッケージされる。2つの主要な方法がアンプリコン粒子を生成するために現在使用されており、その1つは欠損型ヘルパーHSVでの感染に基づき、他方はHSV-1遺伝子、例えばpac欠失した重複コスミドのセット、又はpac欠失及びICP27欠失したBAC-HSV-1、のトランスフェクションに基づく。幾つかの実施態様では、本明細書で使用されるアンプリコンは、導入遺伝子の複数のコピー(例えば、最大15個のコピー)を含む外来DNAの大断片(例えば、最大で152kb)を収容することができ、非毒性である。
幾つかの実施態様では、本明細書で使用されるHSVベースのベクターは、少なくとも1つの必須HSV遺伝子に欠陥があり、そしてこのHSVベースのベクターは又、非必須遺伝子の1つ又は複数の欠失を含み得る。幾つかの実施態様では、HSVベースのベクターは複製欠損型である。ほとんどの複製欠損型HSVベースのベクターは、1又は複数の間初期(intermediate-early)、初期、又は後期HSV遺伝子が削除される欠失を含み、複製が阻害されている。他の実施態様では、HSVベースのベクターは、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、及びそれらの組み合せからなる群から選択される前初期遺伝子に欠陥がある。特別な実施態様では、HSVベースのベクターは、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47の全てに欠陥がある。複製能のあるベクターの例示には、NV-1020(HSV-1)、RAV9395(HSV-2)、AD-472(HSV-2)、NS-gEnull(HSV-1)、及びImmunoVEX(HSV2)が含まれる。複製欠損型ベクターの例示には、dl5-29(HSV-2)、dl5-29-41L(HSV-1)、DISC-dH(HSV-1及びHSV-2)、CJ9gD(HSV-1)、TOH-OVA(HSV-1)、d106(HSV-1)、d81(HSV-1)、HSV-SIV d106(HSV-1)、並びにd106(HSV-1)が含まれる。
複製欠損型HSVベースのベクターは、通常、複製欠損型HSVベースのベクター内には存在しないがウイルス増殖に必要な遺伝子機能を、高力価のウイルスベクターストックを生成するために適切なレベルで提供する、補完細胞株内で産生される。細胞株の一例では、複製欠損型HSVベースのベクターには存在しない少なくとも1つの複製に必須の遺伝子機能、及び幾つかの実施態様では、全ての複製に必須の遺伝子機能を補完する。例えば、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、及びICP47に欠陥のあるHSVベースのベクターは、ヒト骨肉腫株U2OSによって補完され得る。この細胞株は又、それが欠落していると増殖又は複製効率を低下させる非必須遺伝子(UL55等)も又、補完することができる。補完細胞株は、初期領域、前初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連領域、又はそれらの組み合せによってコードされる、少なくとも1つの複製必須遺伝子機能の欠陥を補完することができ、この複製必須遺伝子機能には、全てのHSV機能(例えば、逆方向末端反復及びパッケージングシグナルのみ、若しくはITR及びHSVプロモーターのみ等の、最小HSV配列を含むHSVアンプリコンの増殖を可能にする機能)が含まれる。幾つかの実施態様では、この細胞株は更に、HSVベースのベクターと重複しない様式で補完性遺伝子を含み、HSVベースのベクターゲノムが細胞のDNAで組換えられる可能性を最小限に抑え、実質的に排除することを特徴とする。従って、複製能のあるHSVの存在が、たとえベクターストック内では回避できなくても最小化されるために、それは特定の治療目的、特に遺伝子治療目的に好適である。補完細胞株の構築に必要なのは、当分野で周知の標準的な分子生物学及び細胞培養技術である。
或る実施態様では、本明細書で提供されるウイルスベクター又はウイルス粒子は、アデノ随伴ウイルス(AAV)由来のものである。AAVに関する更なる詳細な説明は、下記第5.3.2節～第5.3.4節で提供される。
目的の核酸は、当分野で公知の任意の分子クローニング法を使用してベクターにクローン化することができ、その方法は例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位及び1つ又は複数の選択可能化マーカーを使用することを含む。幾つかの実施態様では、核酸はプロモーターに作動可能に連結される。哺乳動物細胞内での遺伝子発現のために、様々なプロモーターが探求されており、当分野で公知の任意のプロモーターを本開示内で使用し得る。プロモーターは、構成型プロモーター、又は、例えば誘導可能プロモーター等の調節プロモーターとして大まかに分類し得る。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供される核酸は、構成型プロモーターに作動可能に連結される。構成型プロモーターは、異種の遺伝子(又、導入遺伝子とも称される)を宿主細胞内で構成的に発現させる。本明細書で意図される構成型プロモーターの例示は、限定するものではないが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ヒト伸長因子-1アルファ(hEF1α)、ユビキチンCプロモーター(UbiC)、ホスホグリセロキナーゼプロモーター(PGK)、シミアンウイルス40初期プロモーター(SV40)、並びに、CMV初期エンハンサーと組み合せたニワトリβ-アクチンプロモーター(CAGG)を含む。これら構成型プロモーターの導入遺伝子発現の駆動効率は、膨大な数の研究において広く比較されている。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供される核酸は、誘導可能プロモーターに作動可能に連結される。誘導可能プロモーターは、調節プロモーターのカテゴリーに属す。誘導可能プロモーターは、例えば物理的条件、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞の微小環境、若しくは遺伝子操作された免疫エフェクター細胞の生理学的状態、誘導因子(即ち、誘導剤)、又はそれらの組み合せ等の1以上の条件によって誘導し得る。
幾つかの実施態様では、前記誘導条件は、遺伝子操作された哺乳動物細胞内で、及び／又は医薬組成物を投与される対象内で、内因性遺伝子の発現を誘導しない。幾つかの実施態様では、前記誘導条件は、誘導因子、線照射(電離放射線、光線等)、温度(熱等)、レドックス状態、腫瘍環境、及び、遺伝子操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群から選択される。
当業者は、標的細胞が特異的プロモーターを必要とし得ることを認識し得るであろうし、その特異的プロモーターには、限定するものではないが、種特異的な、誘導可能な、組織特異的な、又は細胞周期特異的な、プロモーターが含まれる(Parrらの文献、Nat. Med. 3:1145-9(1997)、その内容全体が、参照により本明細書中に組み込まれている)。1の実施態様では、プロモーターは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの発現を駆動するのに効率的であるとみなされるプロモーターである。ほとんどの組織での発現を促進するプロモーターには、例えば、限定するものではないが、ヒト伸長因子1α-サブユニット(EF1α)、前初期サイトメガロウイルス(CMV)、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ-1(PGK)プロモーター、シミアンウイルス40(SV40)プロモーター及びCK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATロモーター、LSPプロモーター、肝臓特異的キメラプロモーター(LSP)、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター、ニワトリβ-アクチン(CBA)及びその誘導体CAG及びミニCBA、βグルクロニダーゼ(GUSB)、又はユビキチンC(UBC)が含まれる。限定するものではないが、神経細胞、アストロサイト、又は希突起膠細胞への発現を制限するために使用できる神経系プロモーター等のように、組織特異的発現エレメントを使用して、特定の細胞型への発現を制限することができる。神経細胞のための組織特異的発現エレメントの非限定的な例には、神経細胞特異的エノラーゼ(NSE)、血小板由来増殖因子(PDGF)、血小板由来増殖因子B鎖(PDGF-β)、シナプシン(Syn)、メチル-CpG結合タンパク質2(MeCP2)、CaMKII、mGluR2、NFL、NFH、nβ2、PPE、Enk、及びEAAT2プロモーターが含まれる。上記プロモーターは、他の短い合成調節エレメントと組み合せて、DNA配列中に中心相同性(center homology)を有する新規な合成プロモーターを生成することができる。
幾つかの実施態様では、プロモーターは、神経細胞内で異種の核酸を発現することができる。幾つかの実施態様では、プロモーターは、運動ニューロン内で異種の核酸を発現することができる。幾つかの実施態様では、プロモーターはアストロサイト内で異種の核酸を発現することができる。幾つかの実施態様では、プロモーターは、ヒトシナプシン1(hSyn)プロモーター、又は神経細胞に特異的な合成調節エレメントと組み合わされたhSynである。幾つかの実施態様では、プロモーターは、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)若しくはEAAT2プロモーター、又は、GFAP若しくはEAAT2を、アストロサイトに特異的な合成調節エレメントと組み合せたものである。
1の実施態様では、前記核酸構築物は、限定するものではないが、CMV若しくはU6、又はCMV又はU6を合成調節エレメントと組み合せたもの等のプロモーターを含む。非限定的な例として、本rAAVベクター内のプロモーターは、CBA又はミニCBAプロモーターである。別の非限定的な例として、本rAAVベクター内のプロモーターは、被修飾ミニCBAプロモーターである。1の実施態様では、rAAVベクターは、遺伝子操作されたプロモーターを有する。1の実施態様では、rAAVベクターは更に、合成エンハンサーエレメントを含む。
1の実施態様では、前記ベクターゲノムは、導入遺伝子の標的特異性及び発現を増強する少なくとも1つのエレメント、例えば、イントロン、又は哺乳動物ゲノム由来の改変配列を有する合成イントロンを含む(例えば、Powellらの文献「遺伝子治療における導入遺伝子の標的特異性及び発現を増強するウイルス性発現カセットエレメント(Viral Expression Cassette Elements to Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy)」2015(その内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている)を参照)。イントロンの非限定的な例には、MVM(67～97 bps)、第IX因子(F.IX)トランケート型イントロン1(300 bps)、β-グロビンSD/免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター(250 bps)、アデノウイルス・スプライスドナー/免疫グロビン・スプライスアクセプター(500 bps)、SV40後期スプライスドナー/スプライスアクセプター(19S/16S)(180 bps)、及びハイブリッド・アデノウイルス・スプライスドナー/IgGスプライスアクセプター(230 bps)が含まれる。1の実施態様では、イントロンは、100～500長のヌクレオチドでもよい。イントロンは、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490又は500の長さでもよい。プロモーターは、80～100、80～120、80～140、80～160、80～180、80～200、80～250、80～300、80～350、80～400、80～450、80～500、200～300、200～400、200～500、300～400、300～500、又は400～500の間の長さでもよい。
幾つかの実施態様では、前記ベクターは又、ベクターを介してトランスフェクトされた宿主細胞集団から、タンパク質を発現する細胞を選択するための、選択可能化マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を含む。選択可能化マーカー及びレポーター遺伝子の両方には、宿主細胞内での発現を可能にするために適切な制御配列が隣接していてもよい。例えば、ベクターは、核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモーターを含み得る。
(5．3．2．組換えAAVベクター)
更に特定の特異的実施態様では、本明細書で提供される核酸はAAVベースの系により送達され、そのため、組換えAAVベクター内に含まれる。
任意のAAVセロタイプ又はその変異体が、本開示で使用できる。AAVセロタイプは、限定するものではないが、AAV1(Genbank受託番号NC_002077.1;HC000057.1)、AAV2(Genbank受託番号NC_001401.2、JC527779.1)、AAV2i8(Asokan,A.の文献、2010、Discov. Med. 9:399)、AAV3(Genbank受託番号NC_001729.1)、AAV3-B(Genbank受託番号AF028705.1)、AAV4(Genbank受託番号NC_001829.1)、AAV5(Genbank受託番号NC_006152.1;JC527780.1)、AAV6(Genbank受託番号AF028704.1;JC527781.1)、AAV7(Genbank受託番号NC_006260.1;JC527782.1)、AAV8(Genbank受託番号NC_006261.1;JC527783.1)、AAV9(Genbank受託番号AX753250.1;JC527784.1)、AAV10(Genbank受託番号AY631965.1)、AAVrh10(Genbank受託番号AY243015.1)、AAV11(Genbank受託番号AY631966.1)、AAV12(Genbank受託番号DQ813647.1)、AAV13(Genbank受託番号EU285562.1)、AAVLK03、AAVrh74、AAVDJ(Wu Zらの文献、J Virol. 80:11393-7(2006))、AAVAnc81、Anc82、Anc83、Anc84、Anc110、Anc113、Anc126、若しくはAnc127(Zin,E.らの文献、Cell. Rep. 12:1056(2016))、AAV_go.1(Arbetum,A.E.らの文献、J. Virol. 79:15238(2005))、AAVhu.37、AAVrh8、AAVrh8R、及びAAV rh.8(Wangらの文献、Mol. Ther. 18:119-125(2010)、又はその変異体を含み得る。
AAV変異体は、限定するものではないが、AAV1変異体(例えば、AAV1変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV2変異体(例えば、AAV2変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV3変異体(例えば、AAV3変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV3-B変異体(例えば、AAV3-B変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV4変異体(例えば、AAV4変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV5変異体(例えば、AAV5変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV6変異体(例えば、AAV6変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV7変異体(例えば、AAV7変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV8変異体(例えば、AAV8変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAVrh8、AAVrh8R(例えば、AAVrh8又はAAVrh8R変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV9変異体(例えば、AAV9変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV10変異体(例えば、AAV10変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAVrh10変異体(例えば、AAVrh10変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV11変異体(例えば、AAV11変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV12変異体(例えば、AAV12変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAV13変異体(例えば、AAV13変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、AAVLK03変異体(例えば、AAVLK03変異体カプシドタンパク質を含むAAV)、又はAAVrh74変異体(例えば、AAVrh74変異体カプシドタンパク質を含むAAV)を含む。
本開示で使用される組換えAAV(rAAV)ベクターは、公知の技術に基づき構築できる。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、転写方向に作動可能に連結された構成要素、転写開始領域を含む調節エレメント、本明細書で提供されるポリヌクレオチド、及び転写終結領域を含むように構築される。調節エレメントは、目的の細胞に基づいて選択できる。幾つかの実施態様では、得られたrAAVベクター構築物は、作動可能に連結された構成要素を含み、機能的AAV ITR配列が隣接(5'及び3')している。
或る実施態様では、本明細書で提供されるポリペプチド(例えば、SMNタンパク質をコードする)は、少なくとも1つの制御配列に作動可能に連結される。或る実施態様では、この制御配列は、例えば、プロモーター配列、上流エンハンサー配列(USE)等のエンハンサー配列、スプライシングシグナル等のRNAプロセシングシグナル、ポリアデニル化シグナル配列、細胞質mRNA、転写後調節性エレメント(PRE)及び/又はマイクロRNA(miRNA)標的配列を安定化する配列、を含み得る。或る実施態様では、制御配列は、翻訳効率を増強する配列(例えば、コザック配列)、タンパク質の安定性を増強する配列、並びに/又はタンパク質のプロセシング及び／若しくは分泌を増強する配列を含み得る。或る実施態様では、ポリヌクレオチドは調節性miRNAをコードし得る。
或る実施態様では、制御配列は、構成型プロモーター及び/又は制御性調節エレメントを含む。或る実施態様では、制御配列は、調節可能なプロモーター及び/又は制御性調節エレメントを含む。或る実施態様では、制御配列は、偏在性プロモーター及び/又は制御性調節エレメントを含む。或る実施態様では、制御配列は、細胞特異的又は組織特異的プロモーター及び/又は制御性調節エレメントを含む。或る実施態様では、制御性調節エレメントは、タンパク質のコード配列の5'にある(即ち、5'非翻訳領域(5'UTR)に存在する)。他の実施態様では、制御性調節エレメントは、タンパク質のコード配列の3'にある(即ち、3'非翻訳領域(3'UTR)に存在する)」。或る実施態様では、ポリヌクレオチドは、1を超える制御性調節エレメントを含み、例えば、2、3、4又は5つの調節エレメントを含み得る。ポリヌクレオチドが1を超える調節エレメントを含む場合、それぞれの調節エレメントは、独立して、タンパク質のコード配列の5'位に、3'位に、タンパク質のコード配列に隣接して、又はタンパク質のコード配列中に存在し得る。
或る実施態様では、調節エレメントはエンハンサーである。幾つかの実施態様では、前記含まれている調節エレメントは、インビボ対象内で当該タンパク質のポリヌクレオチドの転写又は発現を指示する。調節エレメントは、選択された目的のポリヌクレオチドと関連する正常な(normal)制御配列、又はその代わりに異種の制御配列、を含み得る。
制御配列の例示には、哺乳動物遺伝子又はウイルス遺伝子をコードする配列由来のもの、例えば、神経細胞特異的エノラーゼプロモーター、GFAPプロモーター、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP);単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、CMV前初期プロモーター領域(CMVIE)等のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、合成プロモーター、及びハイブリッドプロモーター等が含まれる。
或る実施態様では、プロモーターは細胞特異的又は組織特異的ではない。例えば、プロモーターは偏在性プロモーターとみなされる。複数の細胞内又は組織型内での発現を促進し得るプロモーター配列の例には、例えば、ヒト伸長因子1a-サブユニット(EFla)、サイトメガロウイルス(CMV)前初期エンハンサー及び/若しくはプロモーター、ニワトリβ-アクチン(CBA)及びその誘導体、例えばS40イントロンと組み合せたCBAプロモーター等のCAG、βグルクロニダーゼ(GUSB)、又はユビキチンC(UBC)が含まれる。
或る実施態様では、プロモーター配列は、特定の細胞型内又は組織内での発現を促進できる。例えば、ある実施態様では、プロモーターは筋肉特異的プロモーターでもよく、例えば、哺乳動物筋肉クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター、哺乳動物デスミン(DES)プロモーター、哺乳動物トロポニンI(TNNI2)プロモーター、又は哺乳動物の骨格α-アクチン(ASKA)プロモーターでもよい。他の実施態様では、プロモーター配列は、神経細胞内又は細胞型内での発現を促進可能なものでもよく、例えば、神経細胞特異的エノラーゼ(NSE)、シナプシン(Syn)、メチル-CpG結合タンパク質2(MeCP2)、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)、代謝型グルタミン酸受容体2(mGluR2)、ニューロフィラメント軽鎖(NFL)若しくは重鎖(NFH)、β-グロビンミニ遺伝子hb2、プレプロエンケファリン(PPE)、エンケファリン(Enk)、又は興奮性アミノ酸トランスポーター2(EAAT2)プロモーターでもよい。他の実施態様では、プロモーター配列は、肝臓内での発現を促進してもよく、例えば、α-1-アンチトリプシン(hAAT)又はチロキシン結合グロブリン(TBG)プロモーターでもよい。更に他の実施態様では、プロモーター配列は、心臓組織内での発現を促進してもよく、例えば、MHC、cTnT、又はCMV-MUC2kプロモーター等の心筋細胞特異的プロモーターでもよい。
或る実施態様では、ポリヌクレオチドは、当分野で周知の少なくとも1つのポリアデニル化(ポリA)シグナル配列を含み得る。ポリアデニル化配列が存在する場合、それは一般的に導入遺伝子コード配列の3'末端と3'ITRの5'末端との間に位置する。或る実施態様では、ポリヌクレオチドは、ポリAシグナル配列の5'側のポリA上流エンハンサー配列を更に含む。特定の例では、前記制御配列は、翻訳効率を高める配列、例えばコザック配列である。
或る実施態様では、ポリヌクレオチドは、イントロンを含む。或る実施態様では、イントロンは、本明細書で提供されるタンパク質のコード配列内に存在する。或る実施態様では、イントロンはタンパク質のコード配列の5'又は3'位にある。或る実施態様では、イントロンは、タンパク質のコード配列の5'又は3'末端に隣接する。或る実施態様では、ポリヌクレオチドは、2個のイントロンを含む。幾つかの実施態様では、1のイントロンはタンパク質のコード配列の5'位にあり、かつ1のイントロンは該タンパク質のコード配列の3'位にある。或る実施態様では、1のイントロンはタンパク質のコード配列の5'末端に隣接し、かつ第2のイントロンは、該タンパク質のコード配列の3'末端に隣接する。或る実施態様では、イントロンはSV40イントロン、例えば5'UTR SV40イントロンである。
当分野で公知のAAV ITR配列が、本rAAVベクターで使用できる。幾つかの実施態様では、本ベクターで使用されるAAV ITRは、野生型ヌクレオチド配列を有する。他の実施態様では、本ベクターで使用されるAAV ITR配列は野生型配列ではなく、その代わりに、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を含む。本明細書で提供されるAAV ITRは、限定するものではないが、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9、又はその変異体を含む任意のAAVセロタイプに由来してもよい。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクター内のヌクレオチド配列に隣接する5'及び3'ITRは同一であり、同じAAVセロタイプに由来する。他の実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクター内のヌクレオチド配列に隣接する5'及び3'ITRは異なる、及び／又は、異なるAAVセロタイプに由来する。
幾つかの実施態様では、AAV ITRが隣接するタンパク質のポリヌクレオチドを含むrAAVベクターは、目的のポリヌクレオチドをAAVゲノム内に、例えば切り出されたAAVオープンリーディングフレーム内に直接挿入して構築することができ、かつ、AAVゲノムの特定の部分は任意に削除することができ、それらの方法は、例えばWO1993/003769;Kotinの文献、(1994)、Human Gene Therapy 5:793-801;Shelling及びSmith(1994)の文献、Gene Therapy 1:165-169;並びに、Zhouらの文献、(1994)J. Exp. Med. 179:1867-1875に記載されている。
他の実施態様では、AAV ITRは、AAVゲノムから、又はそのようなITRを含むAAVベクターから切り出され、次いで、標準的なライゲーション技術を使用して、別のベクター内に存在するタンパク質のポリヌクレオチド配列の5'及び3'に融合される。
或る実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクターは、組換え自己補完性ゲノムを含む。自己補完性ゲノムを含むrAAVは、通常、その部分的補完(例えば、導入遺伝子のコード鎖及び非コード鎖を補完する)配列によって二本鎖DNA分子を迅速に形成できる。更に具体的には、幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクターは、第1の異種ポリヌクレオチド配列(例えば、治療的導入遺伝子コード鎖)及び第2の異種ポリヌクレオチド配列(例えば、治療的導入遺伝子の非コード鎖又はアンチセンス鎖)を含むrAAVゲノムを含み、該第1の異種ポリヌクレオチド配列は該第2のポリヌクレオチド配列と鎖内塩基対を形成できる。幾つかの実施態様では、前記第1の異種ポリヌクレオチド配列及び第2の異種ポリヌクレオチド配列が、例えばヘアピンDNA構造等の鎖内塩基対合を促進する配列により連結される。幾つかの実施態様では、前記第1の異種ポリヌクレオチド配列及び第2の異種ポリヌクレオチド配列が変異ITRにより連結され、repタンパク質がその変異ITRにおいてウイルスゲノムを切断しない。自己補完性ゲノムを含むrAAVベクターは、例えば、米国特許番号第7,125,717号、7,785,888号、7,790,154号、7,846,729号、8,093,054号、及び8,361,457号に記載のような、当分野で公知の方法を使用して作製できる。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクター内のポリヌクレオチド分子は、約5キロベース(kb)未満のサイズである。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクター内のポリヌクレオチド分子は、約4．5kb未満のサイズである。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクター内のポリヌクレオチド分子は、約4．0kb未満のサイズである。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクター内のポリヌクレオチド分子は、約3．5kb未満のサイズである。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクター内のポリヌクレオチド分子は、約3．0kb未満のサイズである。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAVベクター内のポリヌクレオチド分子は、約2．5kb未満のサイズである。
1の態様(apsect)で、本明細書で提供されるのは、(i)導入遺伝子を含む第1の核酸領域、及び(ii)1又は複数の内因性miRNA(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む第2の核酸領域、を含む組換えAAV(rAAV)ベクターであって、少なくとも1つの標的セグメントは心臓の内因性miRNAの標的セグメントであり、かつ少なくとも1つの標的セグメントは肝臓の内因性miRNAの標的セグメントであり、該第2の核酸領域は、該第1の核酸領域の3'位にあり、かつ、該rAAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、又はAAV44-9由来の逆方向末端反復(ITR)を含む、前記組換えAAVベクターである。幾つかの実施態様では、前記第1の核酸は、SMN又はその変異体をコードする。
幾つかの特別な実施態様では、本rAAVベクター内の第2の核酸領域は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号18と同一の核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV1由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV2由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV2i8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV3由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV3-B由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV4由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV5由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV6由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV7由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh8R由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV9由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV10由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh10由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV11由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV12由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV13由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV-DJ由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVLK03由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh74由来のITRを含む。
幾つかの特別な実施態様では、本rAAVベクター内の第2の核酸領域は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号19と同一の核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV1由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV2由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV2i8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV3由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV3-B由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV4由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV5由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV6由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV7由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh8R由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV9由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV10由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh10由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV11由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV12由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV13由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV-DJ由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVLK03由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh74由来のITRを含む。
幾つかの特別な実施態様では、本rAAVベクター内の第2の核酸領域は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号20と同一の核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV1由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV2由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV2i8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV3由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV3-B由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV4由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV5由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV6由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV7由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh8R由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV9由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV10由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh10由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV11由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV12由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV13由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV-DJ由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVLK03由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh74由来のITRを含む。
幾つかの特別な実施態様では、本rAAVベクター内の第2の核酸領域は、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号21と同一の核酸配列を含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV1由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV2由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV2i8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV3由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV3-B由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV4由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV5由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV6由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV7由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh8由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh8R由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV9由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV10由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh10由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV11由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV12由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV13由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAV-DJ由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVLK03由来のITRを含む。幾つかの実施態様では、前記rAAVベクターは、AAVrh74由来のITRを含む。
幾つかのより特異的な実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号22の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号22との同一性を有する核酸配列を含むベクターである。
幾つかのより特異的な実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号23の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号23との同一性を有する核酸配列を含むベクターである。
幾つかのより特異的な実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号24の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号24との同一性を有する核酸配列を含むベクターである。
幾つかのより特異的な実施態様で、本明細書で提供されるのは、配列番号25の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号25との同一性を有する核酸配列を含むベクターである。
(5．3．3．組換えAAV粒子)
別の態様で、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される核酸、及び少なくとも1のAAVカプシドタンパク質を含む組換えAAV(rAAV)又はrAAV粒子である。この核酸は、上記第5.2節及び第5.3.2節に記載の任意の核酸及びrAAVベクターを含む。
カプシドタンパク質は、ITRと同一のセロタイプに由来しても、又はその誘導体でもよい。カプシドは又、ITRとは異なるセロタイプのものでもよい。例えば、或る実施態様では、AAV粒子には、AAV2 ITR及びAAV6カプシド(AAV2/6)、AAV2 ITR及びAAV7カプシド(AAV2/7)、AAV2 ITR及びAAV8カプシド(AAV2/8)、又はAAV2 ITR及びAAV9カプシド(AAV2/9)が含まれる。
天然型AAVカプシドはAAV VP1、VP2及びVP3カプシドタンパク質を含み、それらはそれぞれAAV cap遺伝子のスプライシングバリアントによりコードされる。一般的に、AAV粒子は、VP1、VP2、及びVP3の3つのタンパク質を含み、ここでVP2及びVP3は、VP1の切断バージョンであるためにVP1にも含まれる配列を有する。一般的に、VP1のアミノ酸配列がカプシドのセロタイプを定義する。従って、例えば、VP1カプシドタンパク質がAAV2 VP1タンパク質をコードする場合、AAVはAAV2セロタイプであり、一方、VP1カプシドタンパク質がAAV8 VP1タンパク質をコードする場合、AAVはAAV8 セロタイプになる。
幾つかの実施態様では、本rAAV粒子中のAAVカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2及び／又はVP3)は、天然型カプシドタンパク質ではない。幾つかの実施態様では、AAVカプシドタンパク質(例えば、VP1、VP2及び／又はVP3)は、天然型カプシドタンパク質に由来する。
幾つかの実施態様では、AAVカプシドタンパク質はVP1カプシドタンパク質である。他の実施態様では、AAVカプシドタンパク質はVP2カプシドタンパク質である。他の実施態様では、AAVカプシドタンパク質はVP3カプシドタンパク質である。幾つかの実施態様では、rAAV粒子は、VP1カプシドタンパク質、VP2カプシドタンパク質、及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。他の実施態様では、rAAV粒子は、VP1カプシドタンパク質、VP2カプシドタンパク質、及びVP3カプシドタンパク質を含む。幾つかの実施態様では、rAAV粒子は、VP1カプシドタンパク質、VP2カプシドタンパク質、及び/又はVP3カプシドタンパク質を含み、該rAAV粒子のカプシドタンパク質は、同じセロタイプのものである。他の実施態様では、rAAV粒子は、VP1カプシドタンパク質、VP2カプシドタンパク質、及びVP3カプシドタンパク質を含み、該AAV粒子のカプシドタンパク質は、同じセロタイプのものである。
或る態様では、カプシドタンパク質は変異体カプシドタンパク質である。変異体カプシドタンパク質は、天然の親カプシドタンパク質(即ち、それが由来するカプシドタンパク質)等の、対応する参照カプシドタンパク質と比較して、例えばアミノ酸置換、アミノ酸欠失、及び異種のペプチド挿入等の、1又は複数の変異を含み得る。幾つかの実施態様では、AAVカプシドタンパク質のアミノ酸配列は、野生型の、又は参照の、又は親のAAVカプシドタンパク質のアミノ酸配列と、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸残基以外は、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30アミノ酸残基の置換以外は、同一である。幾つかの実施態様では、本明細書に記載のカプシドタンパク質又はAAV粒子は、それぞれ2以上のAAVセロタイプカプシドタンパク質又は粒子のタンパク質配列をそれぞれ含む、キメラのカプシドタンパク質又はAAV粒子でもよい。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるrAAV粒子中のカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9カプシドタンパク質に由来する。特定の実施態様では、本明細書で提供されるrAAV粒子中のカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9カプシドタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%が同一のアミノ酸配列を有する。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV1のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV2のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV2i8のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV3のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV3-BのVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV4のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV5のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV6のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV7のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV8のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAVrh8のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAVrh8RのVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV9のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV10のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAVrh10のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV11のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV12のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV13のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV-DJのVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAVLK03のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAVrh74のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
或る実施態様では、本明細書で提供されるAAV粒子は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%又は100%の配列同一性を、AAV44-9のVP1、VP2、又はVP3の任意のアミノ酸配列に対して有する、VPl、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質配列を有する、VP1、VP2及び/又はVP3カプシドタンパク質を含む。
幾つかの特別な実施態様では、本明細書で提供されるrAAV粒子は、本明細書で提供される目的タンパク質をコードする核酸及び、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31又は配列番号32のアミノ酸配列を有する、AAVのVP1を含む。特別な実施態様では、VP1は配列番号29のアミノ酸配列を含む。
(表4．VP1、VP2及びVP3タンパク質の例示)
Figure 2023537358000004
Figure 2023537358000005
Figure 2023537358000006
Figure 2023537358000007
Figure 2023537358000008
Figure 2023537358000009
本明細書に記載のrAAV粒子は、当分野で公知の任意の適切な方法を使用して生成してもよい。例えば、宿主細胞(例えば、哺乳動物細胞)を操作して、AAV粒子の産生に必要な成分を安定して発現させることができる。これは、AAV rep遺伝子及びAAV cap遺伝子を含むプラスミド(又は複数のプラスミド)、並びに、例えば抗生物質(ネオマイシン又はアンピシリン等)耐性遺伝子等の選択可能化マーカーを細胞のゲノム中に組み込むことによって達成できる。細胞は、例えば、昆虫細胞又は哺乳動物細胞でもよく、それは次に、ヘルパーウイルス(例えば、ヘルパー機能を提供するアデノウイルス又はバキュロウイルス)並びに5'及び3'AAV ITRを含むrAAVベクターで同時感染させることができる。選択可能化マーカーを使用すると、rAAVの大規模生産が可能になる。別の非限定的な例として、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用して、rep遺伝子及びcap遺伝子をパッケージング細胞内に導入できる。更に別の非限定的な例として、5'及び3' AAV ITR並びにrep及びcap遺伝子を含む両方のウイルスベクターを、プロデューサー細胞のDNA内に安定して組み込むことができ、ヘルパー機能を野生型アデノウイルスによって提供して、rAAVを産生することができる。
AAV用ヘルパーウイルスとは、AAVが宿主細胞によって複製及びパッケージ化されることを可能にするウイルスをいう。ヘルパーウイルスは、AAVの複製を可能にするヘルパー機能を提供する。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア等のポックスウイルスを含む、多くのヘルパーウイルスが特定されている。サブグループCのアデノウイルス5型(Ad5)が最も一般的に使用されているが、アデノウイルスには多数の異なるサブグループが包含されている。ヒト、非ヒト哺乳動物、及び鳥類起源の多数のアデノウイルスが公知であり、ATCC等の寄託機関から入手可能である。ヘルペスウイルス科も又、ATCC等の寄託機関から入手可能であり、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、サイトメガロウイルス(CMV)及びプソイド狂犬病ウイルス(PRV)が含まれる。AAV複製のためのアデノウイルスヘルパー機能の例には、E1A機能、E1B機能、E2A機能、VA機能及びE4orf6機能が含まれる。
AAVの調製物は、感染性AAV粒子の感染性ヘルパーウイルス粒子に対する比が、少なくとも約102：1、少なくとも約104：1、少なくとも約106：1、又は少なくとも約108：1である場合に、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と称される。調製物は又、ヘルパーウイルスタンパク質(即ち、上述のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形で存在する場合に、このようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在するであろうタンパク質)の均等量を含まない。ウイルス性及び/又は細胞性タンパク質の混入は、一般に、SDSゲル上のクマシー染色バンドの存在(例えば、AAVカプシドタンパク質VP1、VP2、及びVP3に対応するもの以外のバンドの出現)として観察できる。
或る実施態様では、上記rAAVベクターを含む宿主細胞は、本明細書で提供される目的タンパク質をコードしており、AAV ITRが隣接しているポリヌクレオチドを複製及びカプセル化するためのAAVヘルパー機能が提供されて、rAAV粒子を生成することが可能となる。AAVヘルパー機能は、一般的にはAAV由来のコード配列であって、発現してAAV遺伝子産物を提供可能であり、次に産生的AAV複製のためにトランスで機能する。AAVヘルパー機能は、rAAVベクターから欠落している必須のAAV機能を補完するために本明細書で使用される。幾つかの実施態様では、AAVヘルパー機能は、主要なAAV ORF、即ちrep及びcapコード領域、又はその機能的相同体の一方又は両方を含む。
AAVヘルパー機能は、rAAVベクターのトランスフェクションの前又はそれと並行してのいずれかで、宿主細胞をAAVヘルパー構築物でトランスフェクトすることにより、宿主細胞内へ導入できる。例えば、AAVヘルパー構築物を使用して、AAV rep及び／又はcap遺伝子の少なくとも一過性発現を提供し、産生的AAV感染に必須であるが欠落しているAAV機能を補完することができる。通常、AAVヘルパー構築物はAAV ITRを欠き、それ自体では複製もパッケージ化もできない。AAVヘルパー構築物は、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態でもよい。
或る実施態様では、宿主細胞は又、rAAV粒子を産生するための非AAV由来機能又は「アクセサリ機能」を提供することができるか、又は提供される。アクセサリ機能は、例えば、AAV複製に必要な非AAVタンパク質及びRNA等の、AAVがその複製を依存する非AAV由来のウイルス性及び/又は細胞性機能であり、AAV遺伝子転写、段階特異的なAAV mRNAスプライシング、AAV DNA複製、Cap発現産物の合成、及びAAVカプシドアセンブリ、の活性化に関与するものが含まれる。幾つかの実施態様では、ウイルスベースのアクセサリ機能は、公知のヘルパーウイルスに由来するものでもよい。
幾つかの実施態様では、ヘルパーウイルス及び／又はアクセサリ機能ベクターでの宿主細胞の感染の結果として、組換えAAV粒子が産生され、その産生されたrAAV粒子は、感染性の複製欠損型ウイルスであり、AAV ITRが両側に隣接する目的の異種ヌクレオチド配列をカプセル化するAAVタンパク質シェルを含む。
rAAV粒子は、例えばクロマトグラフィー、CsClグラジエント、及び、例えば米国特許番号第6,989,264号及び8,137,948号、並びに国際公開WO2010/148143号に記載されている他の方法等の当分野で公知の精製方法を使用して、宿主細胞から精製可能である。幾つかの実施態様では、残留ヘルパーウイルスは、公知の方法を使用して、例えば加熱によって不活化できる。
(5．3．4．細胞)
様々な宿主細胞を使用して、本明細書に記載のrAAV粒子を産生することができる。本明細書で提供されるポリヌクレオチド及びAAVベクターからAAV粒子を産生するための適切な宿主細胞には、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物細胞が含まれる。通常、そのような細胞は、異種核酸分子のレシピエントとして使用することができ、又は使用されてきており、例えば懸濁培養液及びバイオリアクター内で培養できる。
幾つかの実施態様では、前記細胞は、哺乳動物の宿主細胞、例えば、HEK293、HEK293-T、A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293、Jurkat、2V6.11、Saos、C2C12、L、HT1080、HepG2、初代の線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞等である。
他の実施態様では、細胞は、昆虫細胞、例えば、Sf9、SF21、SF900＋、又は、ショウジョウバエ属細胞株、ヒトスジシマカ(Aedes albopictus)由来細胞株等の蚊細胞株、ボンビクスモリ細胞株等の家蚕細胞株、High Five細胞等のトリコプルシア・ニ細胞株、若しくは、アスカラファ・オドラタ細胞株等の鱗翅目細胞株である。幾つかの実施態様では、昆虫細胞はバキュロウイルス感染しやすい昆虫種由来の細胞であり、High Five、Sf9、Se301、SeIZD2109、SeUCR1、Sf900＋、Sf21、BTI-TN-5B1-4、MG-1、Tn368、HzAm1、BM-N、Ha2302、Hz2E5及びAo38が含まれる。例えば、Sf9昆虫細胞等の細胞内での組換えAAVの大規模生産は、Kotin RM.の文献 Hum Mol Genet. 20(R1):R2‐R6(2011)doi:10.1093/hmg/ddr141により説明されている。昆虫細胞内でのポリペプチドの分子的操作及び発現のための方法は、例えば、Summers及びSmithの文献「バキュロウイルスベクター及び昆虫培養手順の方法マニュアル(A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures)」Texas Agricultural Experimental Station Bull. No. 7555、College Station、テキサス(1986);King,L. A.及びR. D. Posseeの文献「バキュロウイルス発現系(The baculovirus expression system)」Chapman and Hall、英国(1992);O'Reilly,D.R.、L.K.Miller、V.A.Luckowの文献「バキュロウイルス発現ベクター:実験マニュアル(Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual)」ニューヨーク(1992);W.H.Freeman及びRichardson,C.D.の文献「バキュロウイルス発現プロトコル(Baculovirus Expression Protocols)」Methods in Molecular Biology、volume 39(1995)に記載されている。
(5．4．医薬組成物)
1の態様では、本開示は更に、本開示のベクター又はウイルス粒子を含む医薬組成物を提供する。幾つかの実施態様では、本医薬組成物は、治療有効量の本明細書で提供されるベクター又はウイルス粒子、及び医薬的に許容し得る賦形剤を含む。
幾つかの実施態様で、本明細書で提供されるのは、治療有効量の本明細書で提供されるrAAVベクター及び医薬的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物である。
他の実施態様で、本明細書で提供されるのは、治療有効量の本明細書で提供されるrAAV粒子及び医薬的に許容し得る賦形剤を含む医薬組成物である。
特別な実施態様では、用語「賦形剤」は又、希釈剤、アジュバント(例えば、(完全若しくは不完全)フロイントアジュバント、キャリア又はビヒクルをいう。医薬賦形剤は、例えば水及び油剤等の滅菌された液体でもよく、石油、動物、野菜又は合成起源のもの、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む。生理食塩水溶液並びに、水性のグルコース及びグリセロール溶液も又、液体賦形剤として使用できる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はpH緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、散剤、徐放製剤等の形態をとることができる。適切な医薬賦形剤の例は「レミントンの薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」(1990)Mack Publishing Co.、Easton、PAに記載されている。そのような組成物は、本明細書で提供される活性成分の予防的又は治療的に有効な量を例えば精製された形態で、患者への適切な投与のための形態を提供するために適切な量の賦形剤と共に含むであろう。製剤は、投与様式に適合させる必要がある。
幾つかの実施態様では、賦形剤の選択はある程度、特定の細胞、ウイルス粒子、及び／又は投与方法によって決定される。従って、様々な適切な製剤が存在する。
通常は、許容し得るキャリア、賦形剤、又は安定化剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝剤、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化剤;保存剤、等張化剤、安定化剤、金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);EDTA等のキレート化剤及び/又は非イオン性界面活性剤を含む。
特に安定性がpHに依存する場合、治療的有効性を最適化する範囲にpHを調整するために、緩衝液を使用できる。本開示での使用に適切な緩衝剤には、有機酸及び無機酸の両方、並びにそれらの塩が含まれる。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩。更に、緩衝液は、ヒスチジン及びトリス(Tris)等のトリメチルアミン塩を含み得る。
保存剤を添加して、微生物の増殖を遅らせることができる。本開示での使用に適切な保存剤には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;ハロゲン化ベンザルコニウム(例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化ベンザルコニウム、ヨウ化ベンザルコニウム)、ベンゼトニウム塩化物;チメロサール、フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール;メチルパラベン又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾールが含まれる。
「安定化剤」として知られることもある等張化剤が、組成物中の液体の張性を調整又は維持するために存在してもよい。タンパク質及び抗体等の大型で荷電性の生体分子と共に使用する場合、等張化剤はアミノ酸側鎖の荷電基と相互作用して、分子間及び分子内相互作用の可能性を減らすことができるため、しばしば「安定化剤」と称される。等張化剤の例示には、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトール等の、多価の糖アルコール、三価以上の糖アルコールが含まれる。
追加的な賦形剤の例示には、(1)増量剤、(2)溶解促進剤、(3)安定化剤、及び(4)変性防止剤又は容器壁への付着防止剤が含まれる。そのような賦形剤には、多価の糖アルコール(上に列挙した);アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン、ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等のアミノ酸;スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース(myoinisitose)、ミオイニシトール(myoinisitol)、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール(例えば、イノシトール)、ポリエチレングリコール等の有機糖類又は糖アルコール;例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム等のイオウ含有還元剤;ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン又は他の免疫グロブリン等の低分子量タンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;単糖類(例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース);二糖類(例えば、ラクトース、マルトース、スクロース);ラフィノース等の三糖類;並びに、デキストリン及びデキストラン等の多糖類が含まれる。
非イオン性界面活性剤又は洗浄剤(「湿潤剤」としても知られる)は、治療薬の可溶化を助けると共に、攪拌によって誘発される凝集から治療用タンパク質を保護するために存在してもよく、これらは又、治療活性タンパク質の変性を引き起こさずに、製剤がせん断表面応力へ曝されることを可能とする。適切な非イオン性界面活性剤には、例えばポリソルベート(20、40、60、65、80等)、ポリオクサマー(polyoxamer)(184、188等)、プルロニック(登録商標)ポリオール、TRITON(登録商標)、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル(TWEEN(登録商標)-20、TWEEN(登録商標)-80等)、ラウロマクロゴール400、ステアリン酸ポリオキシル40、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油10、50、及び60、モノステアリン酸グリセロール、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース(methyl celluose)、並びにカルボキシメチルセルロースが含まれる。使用できるアニオン性界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム塩、及びスルホン酸ジオクチルナトリウム塩が含まれる。カチオン性洗浄剤には、ベンザルコニウム塩化物又はベンゼトニウム塩化物が含まれる。
医薬組成物をインビボ投与で使用するために、それらは滅菌されていることが好ましい。医薬組成物は、滅菌濾過膜での濾過によって滅菌してもよい。本明細書の医薬組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静注液バッグ又はバイアルに入れることができる。
投与経路は、公知であって容認された方法に従うものであり、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内若しくは関節内経路による注射若しくは注入、硝子体内、網膜下注射、局所投与、吸入による等の、単回若しくは長期間にわたる複数回のボーラス若しくは注入による、又は、持続型放出若しくは徐放手段による、適切な様式のものである。
別の実施態様では、医薬組成物を制御型放出又は持続型放出系として提供してもよい。1の実施態様では、ポンプを使用して、制御型又は持続型放出を達成し得る(例えば、Seftonの文献、Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201-40(1987);バックワルドらの文献、Surgery、88:507-16(1980);及びSaudekらの文献、N. Engl. J. Med. 321:569-74(1989)を参照)。別の実施態様では、ポリマー性材料を使用して、本明細書で提供される予防若しくは治療薬又は組成物の制御型又は持続型放出を達成し得る(例えば「制御放出の医学的適用(Medical Applications of Controlled Release)」(Langer及びWise編、1974);「制御型の薬物生物学的利用能、医薬品の設計及び性能(Controlled Drug Bioavailability、Drug Product Design and Performance)」(Smolen及びBall編、1984);Ranger及びPeppasの文献、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126(1983);Levyらの文献、Science 228:190-92(1985);Duringらの文献、Ann. Neurol. 25:351-56(1989);Howardらの文献、J. Neurosurg. 71:105-12(1989);米国特許番号第5,679,377号、5,916,597号、5,912,015号、5,989,463号、及び5,128,326号、国際出願公開第WO99/15154及びWO99/20253号を参照)。持続型放出製剤に使用されるポリマーの例には、限定するものではないが、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(メチルメタクリレート)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ酸無水物、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリ乳酸(PLA)、ポリ(乳酸-co-グリコリド)(PLGA)、及びポリオルトエステルが含まれる。1の実施態様では、持続型放出製剤に使用されるポリマーは、不活性で、溶出不純物がなく、貯蔵安定性があり、滅菌され、かつ生分解性である。
更に別の実施態様では、制御型又は持続型放出系は、特定の標的組織、例えば、鼻道又は肺に近接して配置することができ、そのため、全身用量の一部しか必要としない(例えば、Goodsonの文献、Medical Applications of Controlled Release Vol. 2、115-38(1984)を参照)。制御型放出系は、例えば、Langerの文献、Science 249:1527-33(1990)で議論されている。当業者に公知の任意の技術を使用して、本明細書に記載の1つ又は複数の薬剤を含む持続型放出製剤を作製することができる(例えば、米国特許第4,526,938号、国際出願公開WO91/05548及びWO96/20698号、Ningらの文献、Radiotherapy & Oncology 39:179-89(1996);Songらの文献、PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50:372-97(1995);Cleekらの文献、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-54(1997)、並びにLamらの文献、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-60(1997)を参照)。
本明細書に記載の医薬組成物は又、特別な兆候を治療する必要に応じて、1を超える活性化合物又は薬剤を含み得る。或いは、又は更に、組成物は、細胞毒性剤、化学療法薬、サイトカイン、免疫抑制剤、若しくは増殖阻害剤を含み得る。そのような分子は、好適には意図する目的に効果的な量の組み合せで存在する。
活性成分は又、マイクロカプセル内に捕捉されていてもよく、例えば、ヒドロキシメチルセルロース若しくはゼラチンのマイクロカプセル、及びポリ(メチルメタシレート)[methylmethacylate]マイクロカプセルがそれぞれ、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル)であるか、又はマクロエマルジョンであるように、例えばコアセルベーション技術によるか又は界面重合によって調製されてもよい。このような技術は「レミントンの薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)」第18版に開示されている。
様々な組成物及び送達系が公知であり、本明細書で提供される治療薬に使用でき、それらには、限定するものではないが、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル内へのカプセル化、本明細書で提供される治療用分子を発現可能な組換え細胞、ウイルスベクター又は他のベクターの一部としての核酸の構築物等が含まれる。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供される医薬組成物は、結合分子及び/又はウイルス粒子を、疾患又は障害を治療又は予防するために効果的な量、例えば治療的な有効量又は予防的な有効量で含む。幾つかの実施態様での治療的又は予防的効能を、治療された対象を周期的に評価してモニタリングする。数日間又はそれ以上にわたる繰り返し投与では、条件、治療に応じて、疾患症候に対して所望の抑制が発生するまで繰り返される。しかし、他の投与量レジメンを利用してもよく、決定されてもよい。
(5．5．方法及び使用)
別の態様で、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるベクター又はウイルス粒子(rAAV)を使用するための方法又は使用である。
このような方法及び使用には、例えば、分子、それを含むrAAV又は組成物の、疾患又は障害を有する対象への投与を含む治療法及び使用が含まれる。幾つかの実施態様では、前記分子、ウイルス粒子、及び／又は組成物は、疾患又は障害の治療に有効な量で投与される。使用には、そのような方法及び治療におけるウイルス粒子の使用、及びそのような治療法を実行するための医薬品の調製における使用が含まれる。幾つかの実施態様では、前記方法は、ウイルス粒子、又はそれを含む組成物を、疾患若しくは症状を有する、又は有する疑いのある対象に投与することによって実施される。幾つかの実施態様では、前記方法によって対象の疾患又は障害を治療する。
幾つかの実施態様では、本明細書で提供される治療は、疾患若しくは障害、又は症候、有害な効果若しくは転帰、又はそれらに関連する表現型の、完全若しくは部分的な、改善又は軽減を引き起こす。治療の望ましい効果には、限定するものではないが、疾患の発生若しくは再発の防止、症候の軽減、疾患の直接的若しくは間接的な病理学的結果の低減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、並びに、寛解又は予後改善が含まれる。これらの用語は、疾患の完全な治癒、又は、いずれかの症候の完全な排除、又は、全ての症候若しくは転帰に対する効能(複数可)を含むが、それらが必然的に含まれるわけではない。
本明細書で使用される場合、幾つかの実施態様では、本明細書で提供される治療は、疾患又は障害の発病を遅延させる、例えば、疾患(SMA等)の発病を留め、妨げ、遅らせ、阻止し、安定化し、抑制し、及び／又は延期させる。この遅延は、疾患の病歴及び/又は治療を受けている個体に応じて、様々な期間となり得る。当業者に明らかなように、充分な又は有意な遅延は、個体が疾患又は障害を発病しないという点で、有効であり、予防を包むことができる。
他の実施態様では、本明細書で提供される方法又は使用は、疾患又は障害を予防する。
幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害はSMNに関連する。幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害はSMNタンパク質の不充分な発現に関連する。幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害は欠陥SMNタンパク質(変異SMNタンパク質等)に関連する。幾つかの実施態様では、本明細書に記載のベクター又はウイルス粒子は、smn1の欠失及び/又は変異を有するSMA罹患対象の治療に使用される。幾つかの実施態様では、前記対象は1以上のsmn1の変異又はマイクロ欠失を有する。幾つかの実施態様では、前記対象は1以上のsmn1ナンセンス変異を有する。幾つかの実施態様では、前記対象は1以上のsmn1フレームシフト変異を有する。
幾つかの特別な実施態様では、前記疾患又は障害は、SMAである。或る実施態様では、本開示は、SMN(例えば、SMN1)関連疾患又は障害、例えば、神経筋退行変性疾患、例えばSMA-I型、SMA-II型、SMA-III型、及びSMA-IV型の、遺伝子治療法を提供する。幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害は、SMA-I型、II型、III型、及びIV型等の神経筋退行変性疾患である。幾つかの特別な実施態様では、前記疾患又は障害は、SMA-I型である。幾つかの実施態様では、前記疾患又は障害はSMA-II型である。他の実施態様では、前記疾患又は障害は、SMA-III型である。更に他の実施態様では、前記疾患又は障害は、SMA-IV型である。
smn1遺伝子中のマイクロ欠失及びナンセンス変異は、SMA-I型の最もありふれた遺伝子要因である。神経学的健常者の大多数では、血中に充分なレベルのSMN1タンパク質発現が検出される。SMNタンパク質(例えば、SMN1)発現の欠如は又、例えばパーキンソン病、進行性核上性麻痺、運動失調症、大脳皮質基底核症候群、ハンチントン病様症候群、クロイツフェルト-ヤコブ病、及びアルツハイマー病を含む、他の神経変性疾患の病因としても特定されている。幾つかの実施態様では、SMN関連疾患又は障害は、SMNタンパク質発現不全関連疾患(例えば、SMN1発現不全関連疾患)である。
脊髄性筋委縮症(SMA)、早発性神経筋変性疾患は、例えば、運動皮質、脳幹及び脊髄内の運動ニューロンの選択的死によって特徴付けられる、進行性かつ不治の病である。SMA-I型と診断された患者は、例えば、痙性、反射亢進又は反射減弱、筋線維束性攣縮、筋萎縮及び麻痺を特徴とする進行性の筋表現型を発症する。これらの運動障害は、運動ニューロンの喪失による筋肉の除神経によって引き起こされる。SMA-I型の主な病理学的特徴には、皮質脊髄路の変性及び下位運動ニューロン(LMN)又は前角細胞の広範な喪失、一次運動野内のベッツ細胞及び他の錐体細胞の変性及び喪失、並びに運動野及び脊髄内での反応性グリオーシスが含まれる。SMA-I型は通常、診断後0.9～2年以内に呼吸不全及び/又は炎症により死に至る。
幾つかの実施態様では、SMAの症候には、限定するものではないが、運動ニューロン変性、筋力低下、筋萎縮、筋硬直、呼吸困難、不明瞭発語、筋線維束性攣縮発症、前頭側頭型認知症、及び/又は早期死亡が含まれ、これらは、治療された対象では改善される。他の態様では、本開示の組成物は、脳及び脊髄の一方又は両方に適用される。幾つかの実施態様では、筋肉協調性及び筋肉機能の一方又は両方が改善される。幾つかの実施態様では、対象の生存期間が延長される。
幾つかの実施態様では、AAV由来の野生型smn1又はコドン最適化したsmn1の発現の総合的な増強は、対象におけるSMAの効果を低下させる。
幾つかの実施態様では、開示の組成物の対象への投与は、対象の形質導入細胞内でのsmn1(例えば、野生型smn1又はコドン最適化したsmn1)mRNA転写を増強し得る。幾つかの実施態様では、野生型smn1及び/又はコドン最適化したsmn1の転写は、約30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%、200%、300%又は500%、又は少なくとも20～30%、20～40%、20～50%、20～60%、20～70%、20～80%、20～90%、20～95%、20～100%、30～40%、30～50%、30～60%、30～70%、30～80%、30～90%、30～95%、30～100%、40～50%、40～60%、40～70%、40～80%、40～90%、40～95%、40～100%、50～60%、50～70%、50～80%、50～90%、50～95%、50～100%、60～70%、60～80%、60～90%、60～95%、60～100%、70～80%、70～90%、70～95%、70～100%、80～90%、80～95%、80～100%、90～95%、90～100%又は95～100%、100～500%で、対象のCNS領域内の又は対象のCNSの特定の細胞を含む、形質導入細胞において増強され得る。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載のベクター又はウイルス粒子を、初期段階のSMAである対象に投与することができる。初期段階の症候には、限定するものではないが、弱くかつ柔らかい若しくは硬直して堅くけいれん性の筋肉、筋肉のけいれん及び単収縮(筋線維束性攣縮)、筋肉量低下(萎縮)、疲労、低いバランス機能、不明瞭発語、弱握力、並びに/又は歩行時のつまずきが含まれる。症状は身体の1つの領域に限定される場合もあれば、軽度の症状が複数の領域に及ぶ場合もある。非限定的な例として、本明細書に記載のベクター又は粒子の投与は、初期段階のSMAの症状の重症度及び／又は発症を軽減し得る。
他の実施態様では、本明細書に記載のベクター又はウイルス粒子は、SMA-I型の中期段階若しくはSMA-I型の後期段階、又はSMA-II～IV型の初期段階にある対象に投与し得る。SMA-I型の中期段階若しくはSMA-I型の後期段階、又はSMA-II～IV型の初期段階には、限定するものではないが、初期段階と比較してより広範な筋肉症状が含まれ、一部の筋肉は麻痺する一方他の筋肉は衰弱する若しくは影響を受けないか、継続的な筋肉単収縮(筋線維束性攣縮)が生じるか、使用されていない筋肉は、拘縮を生じて関節が堅くなり、疼痛があり、変形が生じ得るか、嚥下筋の衰弱は、窒息、並びに、摂食及び唾液調整の更なる困難性を引き起こす可能性があるか、咀嚼筋の衰弱は、臥位で顕著になる呼吸不全を引き起こす可能性があるか、及び/又は、対象は制御不能かつ不適切な泣き笑い発作を示すことがある(情動調節障害)。非限定的な例として、本明細書に記載のベクター又はウイルス粒子の投与は、中期SMA-I型若しくは後期SMA-I型、又は初期SMA-II～IV型の重症度及び／又は症状の発症を軽減し得る。
本明細書に記載の組成物は、任意の経路で、例えば、血管内(例えば、静脈内(IV)若しくは動脈内)、直接的な動脈内、全身的(例えば、静脈内注射による)、又は局所的(例えば、動脈内若しくは眼内注射による)によって個体に投与することができる。非限定的な投与方法の例示には、静脈内(例えば、注入ポンプによる)、腹腔内、眼内、動脈内、肺内、経口、吸入、小胞内(intravesicular)、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、経皮、経胸膜、動脈内、局所的、吸入性(例えば、スプレーミストとして)、粘膜的(鼻粘膜経由等)、皮下、経皮、消化器官、関節内、脳槽内、脳室内、頭蓋内、尿道内、肝管内、腫瘍内、硝子体内及び網膜下、への注射が含まれる。幾つかの実施態様では、SMA治療のための本開示の組成物は、それを必要とする対象に、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内及び／又は脳室内に投与され、本発明の核酸が血液-脳バリア並びに血液脊髄バリアの一方又は両方を通過することを可能とする。幾つかの実施態様では、前記方法は、対象の中枢神経系(CNS)へ直接的に(例えば、注入ポンプ及び/又は送達スキャフォールドを使用して)本開示の組成物の治療有効量を投与(例えば、脳室内投与及び/又は髄腔内投与)することを含む。ベクター又はウイルス粒子を使用して、対象におけるsmn1遺伝子発現を増強し、及び/又はSMAの1以上の症状を低減して、SMAを治療的に処置するようにし得る。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載の核酸配列を含むAAVベクター又はAAV粒子の組成物は、組成物が中枢神経系へ入って運動ニューロン内へ進入することを促進する様式で投与してもよい。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、筋肉注射により投与してもよい。
幾つかの実施態様では、本開示の核酸を含むAAVベクター又はAAV粒子は、周囲注射及び/又は鼻腔内送達により、対象へ投与される。
幾つかの実施態様では、前記本開示の核酸を含むAAVベクター又はAAV粒子は、頭蓋内送達(例えば、髄腔内若しくは脳室内投与、例えば、その内容は参照により本明細書に全体として組み込まれている米国特許番号8,119,611号を参照)により、対象へ投与される。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又は粒子を含む組成物は、静脈内又は頭蓋内で、対象の中枢神経系(CNS)へ投与される。他の実施態様では、本開示のAAVベクター又は粒子を含む組成物は、例えば神経細胞、運動ニューロン、ミクログリア、及びアストロサイト等のCNSへ投与される。他の実施態様では、本開示のAAVベクター又は粒子を含む組成物は、アストロサイトへ投与される。
幾つかの実施態様では、前記本開示のAAVベクター又は粒子を含む組成物は、特別な種類の標的細胞中へ送達されてもよく、その標的細胞には、神経細胞、運動ニューロン;希突起膠細胞、アストロサイト、及びミクログリア等のグリア細胞;並びに/又はT細胞等の神経細胞を取り囲む他の細胞が含まれる。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、治療有効量、例えば、該疾患と関連する少なくとも1つの症状を緩和及び/若しくは予防する、又は対象の症状の改善を提供するのに充分な量、で投与してもよい。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、SMAを有する対象の機能及び/又は生存期間を改善するために、治療有効量でCNSへ投与してもよい。非限定的な例として、該組成物は、静脈内及び/又は髄腔内投与してもよい。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、対象の機能低下(例えば、SMA機能評価スケール(SMAFRS)等の公知の評価法を使用して決定される)を遅延させるため、及び/又は、対象の人工呼吸器非依存生存期間を延長させる(例えば、死亡率若しくは呼吸補助の必要性の低下)ために、治療有効量で対象へ(例えば、対象のCNSへ)投与してもよい。非限定的な例として、該組成物は、静脈内及び/又は髄腔内投与してもよい。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、脊髄運動ニューロン及び/又はアストロサイトを形質導入するために、治療有効量で大槽に投与してもよい。非限定的な例として、該組成物は、髄腔内投与してもよい。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、脊髄運動ニューロン及び/又はアストロサイトを形質導入するために、治療有効量で髄腔内注入法を使用して投与してもよい。非限定的な例として、該組成物は、髄腔内投与してもよい。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、ボーラス注入法を使用して投与してもよい。
幾つかの実施態様では、前記本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、数分間、数時間又は数日間にわたる持続的送達法を使用して、投与してもよい。注入速度は、対象、分布、製剤又はそれとは別の送達パラメータに応じて変化し得る。
幾つかの実施態様では、カテーテルを、複数部位送達のために脊椎の複数の部位に配置してもよい。幾つかの実施態様では、前記本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、持続型注入及び/又はボーラス注入で送達してもよい。各送達部位は、異なる投薬レジメンであってもよく、又は各送達部位で同一の投薬レジメンを使用してもよい。非限定的な例として、送達部位は、子宮頸部及び腰部領域でもよい。別の非限定的な例として、送達部位は、子宮頸部領域でもよい。別の非限定的な例として、送達部位は、腰部領域でもよい。
幾つかの実施態様では、対象を、本明細書に記載のAAVベクター又はAAV粒子の送達前に、脊椎解剖学的及び病理学的に分析してもよい。非限定的な例として、脊柱側弯症の対象は、脊柱側弯症ではない対象と比較して、異なる投薬レジメン及び/又はカテーテル位置にしてもよい。
幾つかの実施態様では、本AAVベクター又は粒子の送達中の対象の脊椎の向きを、地面に対して鉛直にしてもよい。他の実施態様では、該AAVベクター又はAAV粒子の送達中の対象の脊椎の向きを、地面に対して水平にしてもよい。
幾つかの実施態様では、対象の脊椎は、本AAVベクター又はAAV粒子の送達中、地面に対して角度をなしてもよい。対象の脊椎の、地面に対する角度は少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、又は180度でもよい。
幾つかの実施態様では、送達方法及び送達持続期間は脊髄に広範な形質導入を提供するように選択される。非限定的な例として、髄腔内送達を使用して、脊髄の吻側-尾側長さに沿って広範な形質導入を提供する。別の非限定的な例として、複数部位注入で、脊髄の吻側-尾側長さに沿ってより均一な形質導入を提供する。更に別の非限定的な例として、長期間の注入で、脊髄の吻側-尾側長さに沿ってより均一な形質導入を提供する。
本開示の医薬組成物は、SMN関連障害(例えば、SMA)を軽減、予防及び／又は治療するのに効果的な任意の量を使用して対象に投与してもよい。正確な必要量は、対象の人種、年齢、及び一般的な状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与様式、その活性様式等に応じて、対象ごとに異なり得る。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、液体溶液若しくは懸濁液として、液体溶液若しくは液体溶液中の懸濁液に適した固体形態として、任意の適切な形態で投与してもよく、かつ、適切で医薬的に許容し得る任意の賦形剤と共に製剤化してもよい。幾つかの実施態様では、該AAVベクター又は粒子は製剤化される。非限定的な例として、製剤の塩基性及び／又は浸透圧を最適化して、中枢神経系又は中枢神経系の領域若しくは成分内の最適な薬物分布を確保することができる。
幾つかの実施態様では、前記本明細書で提供される医薬組成物は、懸濁液、例えば冷蔵懸濁液である。幾つかの実施態様では、前記方法は更に、投与ステップ前に、この懸濁液を攪拌して懸濁液の均一な分布を確実にすることを含む。幾つかの実施態様では、前記方法は更に、投与ステップ前に、この医薬組成物を室温まで温めることを含む。この組成物は又、持続型放出製剤で投与することもできる。持続型放出装置(例えば、ペレット、ナノ粒子、マイクロ粒子、ナノスフィア、マイクロスフィア等)を、様々な位置に、注入により投与しても、外科的に埋め込んでもよい。
本開示の組成物は、通常、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために単位剤形で製剤化される。しかし、本開示の組成物の1日総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する特別な治療上有効性は、治療される障害及びその障害の重篤度;使用される特定の化合物の活性;使用される特定の組成物;患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食事;投与時間;投与経路;治療時間;使用される特定の化合物と組み合せて又は同時に使用される薬物;並びに、医学分野で周知の同様の要因、を含む様々な要因に依存するであろう。
幾つかの実施態様では、対象の年齢及び性別を、本開示の組成物の用量を決定するために使用できる。非限定的な例として、より年上の対象へは、より若い対象と比較して、より多くの組成物用量(例えば、5～10%、10～20%、15～30%、20～50%、25～50%、又は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、若しくは90%を超えてそれ以上)を投与し得る。別の非限定的な例として、より若い対象へは、より年上の対象と比較して、より多くの組成物用量(例えば、5～10%、10～20%、15～30%、20～50%、25～50%、又は少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%若しくは90%を超えてそれ以上)を投与し得る。更に別の非限定的な例として、女性である対象へは、男性対象と比較して、より多くの組成物の用量(例えば、5～10%、10～20%、15～30%、20～50%、25～50%、又は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%若しくは90%を超えてそれ以上)を投与し得る。更に別の非限定的な例として、男性である対象へは、女性対象と比較して、より多くの組成物用量(例えば、5～10%、10～20%、15～30%、20～50%、25～50%、又は、少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%若しくは90%を超えてそれ以上)を投与し得る。
幾つかの実施態様では、本開示の核酸を送達するための、AAVベクター又はAAV粒子の用量は、疾患症状、対象、及び治療戦略に応じて適合させることができる。
幾つかの実施態様では、投与されるベクター又はウイルス粒子の濃度は、製造方法に応じて異ってもよく、特定の投与経路について治療的に有効であると決定された濃度に基づいて選択又は最適化し得る。
幾つかの実施態様では、1ミリリットル当たりのベクターゲノム濃度(vg／ml)は、約108 vg/ml、約109 vg/ml、約1010 vg/ml、約1011 vg/ml、約1012 vg/ml、約1013 vg/ml、約1014 vg/ml、及び約1015 vg/mlからなる群から選択される。幾つかの実施態様では、濃度は、1010 vg/ml～1014 vg/ml、例えば、1010 vg/ml～1015 vg/ml、1010 vg/ml～1014 vg/ml、010 vg/ml～1013 vg/ml、1010 vg/ml～1012 vg/ml、1010 vg/ml～1011 vg/ml、1011 vg/ml～1014 vg/ml、1011 vg/ml～1013 vg/ml、1011 vg/ml～1012 vg/ml、1012 vg/ml～1014 vg/ml、1012 vg/ml～1013 vg/ml、1013 vg/ml～1014 vg/ml、又は1014 vg/ml～1015 vg/mlの範囲である。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるベクター又はウイルス粒子は、静脈内で、頭蓋内注射、又は大槽内注射、又は髄腔内注射、又は筋肉内注射、又は硝子体内注入により送達される。幾つかの実施態様では、本明細書で提供されるベクター又はウイルス粒子は、約0.1 ml～約20 mlの間の体積で、例えば、約0.1 ml～約20 ml、約0.5 ml～約20 ml、約1 ml～約20 ml、約5 ml～約20 ml、約0.1 ml～約5.0 ml、約0.1 ml～約2.0 ml、約0.1 ml～約1.0 ml、約0.1 ml～約0.8 ml、約0.1 ml～約0.6 ml、約0.1 ml～約0.4 ml、約0.1 ml～約0.2 ml、約0.2 ml～約1.0 ml、約0.2 ml～約0.8 ml、約0.2 ml～約0.6 ml、約0.2 ml～約0.4 ml、約0.4 ml～約1.0 ml、約0.4 ml～約0.8 ml、約0.4 ml～約0.6 ml、約0.6 ml～約1.0 ml、約0.6 ml～約0.8 ml、約0.8 ml～約1.0 mlの間の体積で、又は約0.1 ml、約0.2 ml、約0.4 ml、約0.6 ml、約0.8 ml、及び約1.0 mlの体積で注射される。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載の核酸を含むrAAVを、対象へ、1×108～1×1017ベクターゲノム(vg)の用量で、例えば1×109～1×1017ベクターゲノム(vg)又は1×1014～1×1015ベクターゲノム(vg)の用量で、例えば、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013、9×1013、1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014、9×1014、1×1015、2×1015、3×1015、4×1015、5×1015、6×1015、7×1015、8×1015、9×1015、1×1016、2×1016、3×1016、4×1016、5×1016、6×1016、7×1016、8×1016、9×1016、1×1017、2×1017、3×1017、4×1017、5×1017、6×1017、7×1017、8×1017、又は9×1017ベクターゲノム(vg)を含む用量で、投与できる。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載の核酸を含むrAAVを、対象へ、1×108～1×1017ベクターゲノム/kg(vg/kg)の用量で、例えば1×1013～1×1016 vg/kgの用量で、例えば、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013、9×1013、1×1014、2×1014、3×1014、4×1014、5×1014、6×1014、7×1014、8×1014、又は9×1014 vg/kgを含む用量で、投与できる。
幾つかの実施態様では、1以上の追加的な治療薬を対象へ投与してもよい。
本明細書に記載の組成物の有効性は、幾つかの基準でモニタリングできる。例えば、本開示の方法を使用して治療後に、対象を、例えば、疾患状態の1以上の徴候又は症状の、進行の改善及び／若しくは安定化及び／若しくは遅延について、本明細書に記載されているものを含む1以上の臨床パラメータによって評価し得る。そのような試験の例は、当分野で公知であり、客観的及び主観的(例えば、対象が報告する)手段を含む。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、単一経路投与で対象に送達し得る。他の実施態様では、本開示のAAVベクター又はAAV粒子は、複数部位、例えば、2、3、4、5又は5を超える部位での投与経路を介して対象に送達してもよい。
本AAVベクター又はAAV粒子を含む医薬組成物は、単独の1日投与用量で投与してもよく、又は1日投与用量を、1日に2、3、若しくは4回の分割された投薬量で投与してもよい。本明細書で提供される組成物は又、複数回(例えば、2回、3回、4回、又は5回)をある期間(例えば、1週、2週、3週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4か月、5か月、6か月、7か月、8か月、9か月、10か月、11か月間、1年、2年、又は3年間)内に投与してもよい。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又は粒子を含む組成物は、SMAの治療のための単独治療薬又は併用治療薬として投与される。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又は粒子を含む組成物は、1以上の他の治療薬と組み合せて使用し得る。「と組み合せて」は、これらの送達方法が本開示の範囲内であったとしても、その薬剤を、同時に投与しなければならない、及び／又は一緒に送達するために製剤化しなければならないとすることを意図するものではない。組成物は、1以上の他の所望の治療的又は医療的手順と同時にか、その前にか、又はその後に、投与することができる。一般に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量及び／又は時間スケジュールで投与されるであろう。
幾つかの実施態様では、本開示のAAVベクター又は粒子と組み合せて使用し得る治療薬は、例えば、免疫抑制剤、抗酸化剤、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、カルシウム調節剤、抗グルタミン酸剤、構造タンパク質阻害剤、及び金属イオン調節に関与する化合物を含む小分子化合物であり得る。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載のベクター又はウイルス粒子と組み合せて使用し得るSMA治療のための化合物は、限定するものではないが、リルゾール、トピラマート、タランパネル、ラモトリギン、デキストロメトルファン、ガバペンチン及びAMPAアンタゴニスト等の抗グルタミン酸剤;ミノサイクリン、フェニル酪酸ナトリウム及びアリモクロモール等の抗アポトーシス剤;ガングリオシド、セレコキシブ、シクロスポリン、アザチオプリン、シクロホスファミド、プラズマフェレシス(Plasmaphoresis)、グラチラマー酢酸塩及びサリドマイド等の抗炎症剤;セフトリアキソン;Beat-ラクタム系抗生物質;プラミペキソール(ドパミンアゴニスト);ニメスリド;ジアゾキシド;ピラゾロン誘導体;酸化ストレス誘導性細胞死を阻害するフリーラジカルスカベンジャー、例えばブロモクリプチン;フェニルカルバメート化合物;神経保護化合物;並びにグリコペプチド類が含まれる。
幾つかの実施態様では、本明細書に記載のベクター又はウイルス粒子との併用療法で使用し得る治療薬は、神経細胞喪失を保護できるホルモン又は変異体、例えば副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)若しくはその断片(例えば、米国特許公開番号20130259875号);エストロゲン(例えば、米国特許第6，334，998及び6，592，845号)等でもよく、これら文献それぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれている。
幾つかの実施態様では、神経栄養因子が、本開示のAAVベクター又はAAV粒子との併用療法でSMA治療のために使用し得る。一般に、神経栄養因子は、神経細胞の生存、成長、分化、増殖及び／若しくは成熟を促進する、又は神経細胞の活性増加を刺激する物質として定義される。幾つかの実施態様では、本方法は更に、治療を必要とする対象への1以上の栄養因子の送達を含む。栄養因子は、限定するものではないが、IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、コリベリン、キサリプロデン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン及びADNF、並びにそれらの変異体を含み得る。
(5．6．アッセイ)
(5．6．1．mRNAレベルの分析)
遺伝子(例えば、smn1核酸)のレベル又は発現の増強は、当分野で公知の様々な方法でアッセイすることができる。
例えば、mRNAレベルを検出又は定量化する幾つかの方法が、当分野で公知である。方法の例には、限定するものではないが、ノーザンブロッティング、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、PCRに基づく方法等が含まれる。遺伝子のmRNA配列を使用して、mRNA配列に少なくとも部分的に相補的なプローブを調製することができる。次に、そのプローブを使用して、任意の適切なアッセイ、例えばPCRに基づく方法、ノーザンブロッティング、ディップスティックアッセイ等を使用して試料中のmRNAを検出することができる。
アッセイ法は、所望のmRNA情報の種類に応じて変更可能である。方法の例には、限定するものではないが、ノーザンブロッティング及びPCRに基づく方法(例えば、qRT-PCR)が含まれる。qRT-PCR等の方法も又、試料中のmRNAの量を正確に定量できる。
任意の適切なアッセイプラットフォームを使用して、試料中のmRNAの存在を決定することができる。例えば、アッセイは、ディップスティック、膜、チップ、ディスク、試験片、フィルタ、マイクロスフェア、スライド、マルチウェルプレート、又は光ファイバの形態でもよい。アッセイ系は、その上にmRNAに対応する核酸が付着される固体支持体を有してもよい。固体支持体には、例えば、プラスチック、ケイ素、金属、樹脂、ガラス、膜、粒子、沈殿物、ゲル、ポリマー、シート、球体、多糖類、キャピラリー、フィルム、プレート、又は、スライドが含まれ得る。アッセイの構成要素を調製して、mRNA検出用キットとして一緒にパッケージングできる。
核酸は、必要に応じて標識して、標識化mRNA集団を作製することができる。一般に、試料は、当分野で周知の方法(例えば、DNAリガーゼ、ターミナルトランスフェラーゼを使用するか、又はRNA骨格を標識することによる等)を使用して標識できる。例えば、Ausubelらの文献「分子生物学ショートプロトコル(Short Protocols in Molecular Biology)」(Wiley & Sons、第3版、1995);Sambrookらの文献「分子クローニング:実験マニュアル(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)」(Cold Spring Harbor、N.Y.,第3版、2001)を参照されたい。幾つかの実施態様では、試料は蛍光標識で標識される。蛍光色素の例示には、限定するものではないが、キサンテン色素、フルオレセイン色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、6-カルボキシフルオレセイン(FAM)、6カルボキシ-2',4',7',4,7-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、6-カルボキシ-4',5'-ジクロロ-2',7'-ジメトキシフルオレセイン(JOE))、ローダミン色素(例えば、ローダミン110(R110)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、5カルボキシローダミン6G(R6G5又はG5)、6-カルボキシローダミン6G(R6G6又はG6))、シアニン色素(例えば、Cy3、Cy5、及びCy7)、Alexa色素(例えば、Alexa-fluor-555)、クマリン、ジエチルアミノクマリン、ウンベリフェロン、ベンズイミド色素(例えば、ヘキスト33258)、フェナントリジン色素(例えば、テキサスレッド)、エチジウム色素、アクリジン色素、カルバゾール色素、フェノキサジン色素、ポルフィリン色素、ポリメチン色素、BODIPY色素、キノリン色素、ピレン、フルオレセインクロロトリアジニル、エオシン色素、テトラメチルローダミン、リサミン、ナプソフルオレセイン(Napthofluorescein)等が含まれる。
通常のmRNAアッセイ法は、(1)表面に結合した対象プローブを得るステップ、(2)特異的結合を提供するのに充分な条件下で、mRNAの集団を表面に結合したプローブにハイブリダイズさせるステップ、(3)ハイブリダイゼーション後に洗浄して、表面に結合したプローブに特異的に結合していない核酸を除去するステップ、及び、(4)ハイブリダイズしたmRNAを検出するステップを含むことができる。これらの各ステップで使用される試薬及びその使用条件は、特別な応用に応じて変動可能である。
ハイブリダイゼーションは、適切なハイブリダイゼーション条件下で行うことができ、ストリンジェンシーは所望に応じて変化し得る。通常の条件でも、相補的結合メンバー間、即ち、表面結合した対象プローブと試料中の相補的mRNAとの間で、固体表面上にプローブ/標的複合体を生成するのに充分である。或る実施態様では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を採用し得る。
ハイブリダイゼーションは、通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施される。標準的な(例えば、試料中の標的 mRNAがプローブへ特異的結合するのに充分な条件下での)ハイブリダイゼーション技術は、Kallioniemiらの文献、Science、258:818-821(1992)及び国際公開WO93/18186号に記載されている。一般的な技術に対する幾つかの案内、例えば、Tijssenの文献「核酸プローブでのハイブリダイゼーション、第I部及び第II部(Hybridization with Nucleic Acid Probes、Part I and II)」(Elsevier、アムステルダム、1993)が利用可能である。インサイチュハイブリダイゼーションに好適な技術の説明については、Gallらの文献、Meth. Enzymol. 1981, 21:470-480;Angererらの文献、Genetic Engineering：Principles and Methods,Vol 7,pgs 43-65(Plenum Press、ニューヨーク、Setlow及びHollaender編、1985)を参照されたい。温度、塩濃度、ポリヌクレオチド濃度、ハイブリダイゼーション時間、洗浄条件のストリンジェンシー等を含む適切な条件の選択は、試料源、捕捉剤の同一性、予測される相補性の程度等を含む実験計画に依存するであろうし、これらは、当業者にとって日常的な実験事項として決定し得る。
当業者は、代替ではあるが同等のハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件が、類似のストリンジェンシー条件を提供するために使用できることを、容易に認識するであろう。
mRNAハイブリダイゼーション手順後に、通常は、表面に結合したポリヌクレオチドを洗浄して、結合していない核酸を除去する。洗浄は、洗浄条件が通常のストリンジェントである場合には、上記のような任意の便利な洗浄プロトコルを使用して行うことができる。次に、標的mRNAのプローブへのハイブリダイゼーションを、標準技術を使用して検出する。
他の方法、例えばPCRに基づく方法も又、遺伝子の発現を検出するために使用できる。PCR法の例は、米国特許第6,927,024号に見出すことができ、その全体が参照により本明細書中に組み込まれている。RT-PCR法の例は、米国特許第7,122,799号に見出すことができ、その全体が参照により本明細書中に組み込まれている。蛍光インサイチュPCR法は、米国特許第7,186,507号に記載されており、その全体が参照により本明細書中に組み込まれている。
幾つかの実施態様では、定量的逆転写PCR(qRT-PCR)を、RNA標的の検出及び定量化の両方に使用できる(Bustinらの文献、Clin. Sci. 2005、109:365-379)。qRT-PCRによって得られた定量的結果は、一般的に定性的データよりも情報的に価値がある。従って、幾つかの実施態様では、qRT-PCRに基づくアッセイは、細胞に基づくアッセイ中にmRNAレベルを測定するのに使用できる。qRT-PCR法は又、患者の治療をモニターするのに有用である。qRT-PCRに基づく方法の例は、例えば、米国特許第7，101，663号に見出すことができ、その全体が参照により本明細書中に組み込まれている。
標準的な逆転写酵素PCR及びアガロースゲルによる分析とは対照的に、qRT-PCRは定量的結果を与える。qRT-PCRの追加的な利点は、使用が比較的簡単で便利なことである。qRT-PCR用の機器、例えばApplied Biosystems 7500が市販されており、又、試薬、例えばTaqMan(登録商標)「配列検出ケミストリー」も同様である。例えば、TaqMan(登録商標)遺伝子発現アッセイを、製造者の使用説明書に従って使用できる。これらのキットは、ヒト、マウス、及びラットのmRNA転写産物を迅速かつ確実に検出及び定量するための、事前調製された遺伝子発現アッセイである。特定のアンプリコン蓄積に関連する蛍光シグナルがしきい値(CTと称される)を超える時のサイクル数を決定するために、例えば、7500リアルタイムPCRシステム配列検出ソフトウェアを使用して、それに対して比較CT相対定量計算法を使用して、このデータを分析できる。この方法を使用すると、アウトプットは発現レベルの倍率変化として表される。幾つかの実施態様では、前記しきい値レベルを、ソフトウェアによって自動的に決定されるように選択できる。幾つかの実施態様では、前記しきい値レベルを、ベースラインより上であるが、増幅曲線の指数関数的増幅領域内にあるように充分に低く設定する。
他の実施態様では、標的RNAは、次世代シーケンシング(NGS)により検出又は定量化できる。
(5．6．2．タンパク質レベルの分析)
smn1核酸のタンパク質発現の増幅は、SMNタンパク質レベルの測定によって評価できる。タンパク質レベルは、当分野で周知の様々な方法、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット分析(イムノブロッティング)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、定量的タンパク質アッセイ、タンパク質活性アッセイ(例えば、カスパーゼ活性アッセイ)、免疫組織化学、免疫細胞化学若しくは蛍光活性化細胞選別(FACS)、LC-MS(液体クロマトグラフィー-MassSpec)、及びその他の方法で、評価又は定量化できる。標的に対する抗体は特定可能であり、かつ様々な供給元から、例えば抗体のMSRSカタログ(Aerie Corporation社、バーミンガム、ミシガン州)から入手し得るし、当分野で周知の従来のモノクローナル又はポリクローナル抗体生成方法を介して調製することもできる。マウス、ラット、サル、及びヒトのsmn1の検出に有用な抗体が市販されている。MassSpecの場合、タンパク質レベルは、標識化法又は非標識化法を使用して測定できる。
(5．6．3．インビボ分析)
インビボアッセイを使用して、運動機能及び呼吸を改善し、その一方で肝臓及び／又は心臓におけるオフターゲット毒性を低減する等の、smn1の増強された発現を評価することができる。
幾つかの実施態様では、動物の運動機能を、オープンフィールド活動能の体勢立ち直りにより測定する。或る実施態様では、動物の呼吸を、全身プレチスモグラフ、侵襲的抵抗、及びコンプライアンス測定によって評価する。
幾つかの実施態様では、全生存期間(OS)及び無病生存期間(DFS)を、生きている動物を1日2回、体重、健康状態を観察して測定する。
試験は、正常動物又は実験用疾患モデルで実施してもよい。動物への投与のために、医薬的に許容し得る希釈剤、例えばリン酸緩衝生理食塩水内のオリゴヌクレオチドを処方することができる。投与には、例えば腹腔内、静脈内、及び皮下等の非経口経路の投与が含まれる。オリゴヌクレオチド投薬量及び投薬頻度の計算は、当業者の能力の範囲内であり、投与経路及び動物体重等の要因に依存する。オリゴヌクレオチドでの処置期間の後、肝臓、心臓、脾臓、CNS組織又はCSFを含む目的組織からRNAを単離して、smn1核酸発現の変化を、例えばNGSを使用して測定することができる。
(5．7．キット及び製造物品)
更に提供されるのは、本明細書に記載の任意の組成物を含むキット、単位用量品、及び製造物品である。幾つかの実施態様では、キットが提供され、そのキットは本明細書に記載の医薬組成物のいずれかを含み、好ましくは、その使用のための使用説明書を提供する。
本願のキットは、適切なパッケージに入っている。適切なパッケージには、限定するものではないが、バイアル、ボトル、ジャー、可撓性パッケージ(例えば、密封されたマイラーバッグ又はプラスチック袋)等が含まれる。キットは、任意で、緩衝材及び説明情報等の追加的コンポーネントを提供し得る。従って、本出願は又、バイアル(密閉バイアル等)、ボトル、ジャー、可撓性パッケージ等を含む製造製品も提供する。
製造物品は、容器、及び容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含むことができる。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。一般に、容器は、本明細書に記載の疾患又は障害(SMA等)を治療するために有効な組成物を保持するものであり、減菌アクセスポートを有してもよい(例えば、容器は、皮下注射針で穿刺可能な栓を有する静注液バッグ若しくはバイアルでもよい)。ラベル又は添付文書は、組成物が個体の特定の状態を治療するために使用されることを示す。ラベル又は添付文書は更に、個体に組成物を投与するための使用説明書を含むであろう。ラベルには、再構成及び/又は使用の指示が示されていてもよい。医薬組成物を保持する容器は、再構成された製剤の繰り返し投与(例えば、2～6回投与)が可能な多用途バイアルでもよい。添付文書とは、治療用製品の市販パッケージ内に慣習的に含まれている使用説明書を指し、その治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投薬量、投与法、禁忌、及び/又は警告に関する情報が含まれる。製造物品は追加的に、医薬的に許容し得る緩衝液、例えば静菌性注射用水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液、を含む第2の容器を更に含み得る。それは更に、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含む、商業的観点及び使用者観点から望ましい他の材料を含み得る。
キット又は製造物品は、薬局、例えば病院薬局及び調剤薬局での貯蔵及び使用に充分な量でパッケージングされた、複数の単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含み得る。
簡潔性のために、特定の略語が本明細書で使用される。一つの例は、アミノ酸残基を表す1文字略語である。アミノ酸、並びにそれらに対応する3文字略語及び1文字略語は下記の通りである。
Figure 2023537358000010
本開示は、一般に、多数の実施態様を説明するために肯定的な言葉を使用して本明細書に開示される。本開示には又、例えば物質若しくは材料、方法のステップ及び条件、プロトコル、手順、アッセイ若しくは分析等の、特定の主題が完全に又は部分的に除かれている実施態様も具体的に含まれる。従って、本開示は、本開示が含まないものに関して本明細書で一般的に示していないとしても、本開示に明示的に含まれていない態様は、本明細書により開示されている。
本開示の多数の実施態様が説明された。その多数の実施態様に係わらず、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な修正を加え得ることが理解されるであろう。従って、次の実施例は、特許請求の範囲に記載された開示の範囲を説明することを意図しており、限定することを意図していない。
(6．実施例)
下記は、研究で使用された様々な方法及び材料の説明であり、当業者に、本開示をどのように実施及び使用するかについての完全な開示及び説明を提供するために述べられている。そして、下記は、本発明者らが開示とみなす範囲を限定することを意図するものではなく、下記実験が実施され、実施され得る全ての実験であることを表すことを意図するものでもない。現在時制で書かれた例示的な説明は必ずしも実行されたわけではなく、むしろ、この説明は、本開示の教示に関するデータ等を作成するために実施可能であることを理解されたい。使用される数値(例えば、量、パーセンテージ等)に関して正確性を確保するための努力がなされたが、実験誤差及び偏差の幾つかは説明されるべきである。
(6．1．実施例1：SMNをコードする核酸の構築物)
この実施例は、SMNをコードする第1の核酸領域、及び、複数の内因性マイクロRNA(miRNA)の複数の標的セグメント(複数可)を含む第2の核酸領域、を含む、本明細書で提供される代表的核酸の構築物を説明する(図1Aを参照)。
ヒトSMN1(hSMN1)のコード配列の最適化を、野生型SMN1タンパク質配列(配列番号33)に基づき、GPS技術(ATUM社、米国)、OptimWiz(GeneWiz社、米国)、Optimum Gene(GenScript社、米国)、及びPyCUB(J. Kalfonの文献、2018)を含む、アルゴリズム並びにプラットフォームを使用して実施した。次に、野生型hSMN1コード配列(配列番号34)及びコドン最適化したhSMN1コード配列(例えば、配列番号35)をクローン化して、本明細書で提供される最適化したプロモーター配列(配列番号36若しくは配列番号37)を含む発現ベクターとした。コドン最適化は、トランスクリプトーム分析により測定したインビトロでのhSMN1 mRNA発現を増大させ(図2B)、この結果は、更に詳細に下記で説明するウェスタンブロット法を使用したタンパク質発現分析と一致する(図2A)。加えて、更に詳細に下記で議論するが、インビボ有効性アッセイが示す、注射された動物の生存率中央値の上昇が観察された。
本核酸構築物中で使用される標的セグメントそれぞれのmRNA転写産物は、例えばhsa-mir-122等の肝臓特異的miRNA、並びに、hsa-mir-1-5p、hsa-mir-208a、hsa-mir-208b、hsa-mir-133a、及びhsa-mir-448-5p等の心臓-特異的内因性miRNA等の組織特異的内因性miRNAによって、特異的なハイブリダイズが可能である。上記miRNAのそれぞれのための標的セグメントの例示は、上の表2に示す。図1Bは、複数の標的セグメントを含む特異的核酸領域を示す。複数の内因性miRNAの複数の標的セグメントを含む第2の核酸領域の例示の配列も又、下の表6に示し、共にそれぞれの核酸配列のための構成要素標的セグメントも表示する。図1A、図1B、及び表6において、miR-1はhsa-mir-1-5pの標的セグメントを表し、miR-208aはhsa-mir-208a-5pの標的セグメントを表し、miR-208bはhsa-mir-208b-5pの標的セグメントを表し、miR-122はhsa-mir-122の標的セグメントを表し、miR-133はhsa-mir-133a-1の標的セグメントを表し、及びmiR-488はhsa-mir-488-5pの標的セグメントを表す。これら構築物の例示の5'(左側)はSMNコード配列及びその緩衝配列と一致し、かつ、これら構築物の例示の3'(右側)はポリA配列及びその緩衝配列と一致する。特定の標的セグメント間にはリンカーが存在する。例示されるように、構築物は複数の反復配列を有することができる。配列が構築物の例示として提供され、これらの標的セグメントの順序は変更可能であり、本開示に含まれる。
(表5．SMNの配列及びプロモーター配列)
Figure 2023537358000011
Figure 2023537358000012
Figure 2023537358000013
Figure 2023537358000014
(表6．複数の標的セグメントを含むmiRNAのスポンジ領域の例示)
Figure 2023537358000015
Figure 2023537358000016
(6．2．実施例2：核酸を含むAAVベクターの構築)
この実施例では、第6.1節に記載のものを含む核酸配列を、AAV9由来のrAAVベクターの例へ導入し、図1Aに示すような、例えばEXG202、EXG204、EXG205、EXG206、EXG207、EXG209、及びEXG211を含むrAAVベクターを作製した。rAAVベクター(即ち、EXG204、EXG207、EXG209及びEXG211)の核酸配列の例示を、下の表に示す。これらrAAVベクター中の標的セグメントは、表6及び表7に示す。本明細書で提供されるrAAVベクターの構成要素の例示を、表8に同様に提供する。
(表7．rAAVベクターの例示)
Figure 2023537358000017
Figure 2023537358000018
Figure 2023537358000019
Figure 2023537358000020
Figure 2023537358000021
Figure 2023537358000022
Figure 2023537358000023
Figure 2023537358000024
Figure 2023537358000025
Figure 2023537358000026
(表8．例示的rAAVベクターの構成要素)
Figure 2023537358000027
Figure 2023537358000028
(6．3．実施例3：タンパク質発現アッセイ)
HEK 293細胞を、10％ウシ胎児血清を補充したDMEMを有する12ウェルプレート中で培養し、感染操作前に37℃、5％CO2のインキュベーターで24時間インキュベートした。HEK 293細胞は、感染操作の24 時間前に、12ウェルプレート内に、ウェルあたり4×105 HEK 293細胞を1 mL DMEM、10% FBSで播種し、37℃、5％CO2のインキュベーターでインキュベートした。次いで、HEK 293細胞を、本明細書で提供されるrAAV-SMN(105GC/細胞)及びヒトアデノウイルス5(Ad5)ヘルパーウイルス(10iu／細胞)で共感染させ、37℃、5％CO2のインキュベーターで72時間インキュベートした。正常293FT細胞をブランク対照として使用した。細胞を72時間で回収し、PBSで洗浄し、遠心分離によりペレット化し、細胞溶解緩衝液に溶解させた。BCAアッセイから計算された総タンパク質濃度に基づいて、等量のタンパク質(1.25ug/試料)を含む試料を、製造者(Invitrogen社)の推奨に従って、4%～12%のBis-Trisゲル電気泳動によって個別に分離し、次にパワーブロッターステーションを25Vで7分間使用してニトロセルロース膜上へ転写し、SMN抗体及びチューブリン抗体でプローブした。
本実施例で試験したrAAVベクターを上の表8に示す。例えば、EXG101-01-03は、プロモーター配列(配列番号35)によって駆動されるhSMN1配列(配列番号36)を含み;EXG101-05Mは、プロモーター配列(配列番号35)によって駆動されるhSMN1配列(配列番号37)を含み;EXG101-02Mは、プロモーター配列(配列番号34)によって駆動されるhSMN1配列(配列番号37)を含み;及びEXG101-01M2は、プロモーター配列(配列番号34)によって駆動されるhSMN1配列(配列番号36)を含む。
発現強度をSMN/チューブリンの比によって測定し、結果を図2Aに示す。
(6．4．実施例4：インビボ有効性アッセイ)
本明細書で提供される構築物をインビボ有効性アッセイで、運動ニューロン生存1(smn1)遺伝子内に2対立遺伝子変異を有する脊髄性筋萎縮症(SMA)を患うP0～2齢マウスを治療することにより、試験及び分析した。インビボ有効性アッセイとは、smn1-/-欠陥マウスモデルでのレスキュー実験、生存期間中央値の測定、及び、例えば姿勢立ち直り、体重測定等の他の関連するインビボパラメータをいう。SMA-I型マウスモデルは、体勢立ち直り又は後足立ち上がり能力を自主的に獲得する前の下位運動ニューロンの喪失に関連する、進行性筋力低下を発症することによって定義される。
図3～6に示すように、本構築物、例えばEXG204で治療したマウスは、優れた生存率、治療なしの野生型マウス対照と同等のオープンフィールド活動性、及び非常に均一な体重分布を実証した。
結果は又、(例えば、EXG204及びEXG206における)標的セグメントhsa-mir-133aが、他のmiRNAの標的セグメント、(例えば、EXG202及びEXG205における)例えばhsa-mir-1及びhsa-mir-488aよりも効果的であることを実証する(図6を参照)。更に又、標的セグメントhsa-mir-133aの複数回反復、例えば3回反復は、EXG204及びEXG206の比較で例示されるように、単一の標的セグメントhsa-mir-133aと比較してより優れた結果を示した。
要約すると、smn1遺伝子送達用の本rAAV9ウイルスベクターは、最適化されたプロモーター配列によって駆動されるヒトSMN1タンパク質を発現し、同時に、内因性マイクロRNAの3'標的化配列による転写後調節を介して、インビボで忍容された肝臓毒性及び心臓毒性を(＞60%良く)達成し、並びに、肝臓及び心臓中でSMN1の組織特異的ダウンレギュレーションを最大化することが実証された。
(6．5．実施例5：合成プロモーターを含む構築物)
本研究では、合成プロモーターを含む様々な核酸構築物を作製して試験した。具体的には、図7A及び図7Bに示すように、特定の構築物において、様々なエンハンサーをコアプロモーター(hSyn)と組み合せた。例えば、EXG304は、proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含み;EXG305は、proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含み;EXG306は、proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含み;並びに、EXG307は、CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含み;そして、EXG340は、SMN1タンパク質のコード配列をヒトSMN1のコドン最適化配列で置き換えることによって設計されているが、他の構成要素はEXG307と同一である。様々なエンハンサー及びプロモーターを、表9に示す。図7Bに示したrAAVベクター(即ち、EXG301、EXG302、EXG303、EXG304、EXG305、EXG306及びEXG307)、EXG340、並びにEXG341の配列を、下の表10に示す。
(表9．コアプロモーター及びエンハンサー配列)
Figure 2023537358000029
Figure 2023537358000030
Figure 2023537358000031
(表10．様々なプロモーターを有するrAAVベクターの例示)
Figure 2023537358000032
Figure 2023537358000033
Figure 2023537358000034
Figure 2023537358000035
Figure 2023537358000036
Figure 2023537358000037
Figure 2023537358000038
Figure 2023537358000039
Figure 2023537358000040
Figure 2023537358000041
Figure 2023537358000042
Figure 2023537358000043
Figure 2023537358000044
実施例4に記載のインビボ有効性アッセイを使用して、1.98×1014又は3.96×1014 vg/kgの用量レベルでの単回静脈内(IV)投与により、上記の異なるプロモーターを有する様々な構築物を検査した。図8A及び図8Bに示すように、EXG303、EXG307、及びEXG340は、生存率において用量依存的な改善を示した。全てのEXG候補は、GFP対照EXG100-07と比較して一貫した治療効果を実証したが、EXG307はEXG301、EXG204及びEXG101-01よりも有意に優れた有効性を示した。驚くべきことに、異なる合成プロモーターを有する構築物を単回IV投与様式で用量レベル3.96×1014 vg/kgで投与した場合、合成プロモーター含有構築物EXG307及びEXG340は、他の合成プロモーター、例えばEXG304、EXG305、及びEXG306等を含む他のプロモーターと比較して生存率の有意な改善を実証した。これらの結果は、hSynプロモーターを伴うCMVエンハンサー等の、特定のエンハンサーと特定のコアプロモーターとの特定の特別な組み合せの優れた効果を実証し、特にAAVベクター媒介型遺伝子治療におけるSMN1との使用において優れた効果を実証した。
本明細書に引用される全ての特許、公開出願及び参考文献の教示は、参照により全体として組み込まれている。
例示的な実施態様が特別に示され、説明されているが、当業者は、添付の特許請求の範囲に包含される実施態様の範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更が行われ得ることを、理解するであろう。
上述の通り、特定の実施態様が、説明を目的として本明細書に記載されているが、本明細書に提供されるものの概念及び範囲から逸脱することなく、様々な修正が行われ得ることが理解されるであろう。上記で言及した全ての参考文献は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれている。

Claims (70)

  1. (i)SMNタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列を含む第1の核酸領域、及び、
    (ii)1又は複数の内因性マイクロRNA(miRNA)(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む第2の核酸領域、
    を含む核酸であって、
    該第2の核酸領域は該第1の核酸領域の3'位にある、前記核酸。
  2. 前記SMNタンパク質若しくはその変異体は、配列番号33のアミノ酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号33との同一性を有するアミノ酸配列、を含む、請求項1に記載の核酸。
  3. 前記第1の核酸領域は、配列番号34及び配列番号35からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1又は2に記載の核酸。
  4. 前記第2の核酸領域は、心臓の内因性miRNAの標的セグメントを少なくとも1つ含む、請求項1～3のいずれか1項に記載の核酸。
  5. 前記心臓の内因性miRNAは、hsa-mir-1-5p、hsa-mir-208a-5p、hsa-mir-208b-5p、hsa-mir-133a-1、及びhsa-mir-488-5pからなる群から選択される、請求項4記載の核酸。
  6. 前記心臓の内因性miRNAは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、又は配列番号6と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項4記載の核酸。
  7. 前記第2の核酸領域は、肝臓の内因性miRNAの標的セグメントを少なくとも1つ含む、請求項1～6のいずれか1項に記載の核酸。
  8. 前記肝臓の内因性miRNAはhsa-mir-122である、請求項7記載の核酸。
  9. 前記肝臓の内因性miRNAは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号4と同一である核酸配列を含む、請求項7記載の核酸。
  10. 前記第2の核酸領域は、hsa-mir-133a-1の標的セグメントを2以上含む、請求項1～3のいずれか1項に記載の核酸。
  11. 前記第2の核酸領域は、hsa-mir-133a-1の標的セグメントを少なくとも3つ含む、請求項10記載の核酸。
  12. 前記第2の核酸領域は、hsa-mir-208a-5pの標的セグメントを少なくとも1つ、hsa-mir-208b-5pの標的セグメントを少なくとも1つ、hsa-mir-122の標的セグメントを少なくとも1つ、及びhsa-mir-133a-1の標的セグメントを少なくとも1つ含む、請求項1～3のいずれか1項に記載の核酸。
  13. 前記第2の核酸領域は、hsa-mir-208a-5pの標的セグメントを2つ、hsa-mir-208b-5pの標的セグメントを2つ、hsa-mir-122の標的セグメントを3つ、及びhsa-mir-133a-1の標的セグメントを3つ含む、請求項12記載の核酸。
  14. (i)前記hsa-mir-1-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号7と同一である核酸配列を含む、
    (ii)前記hsa-mir-208a-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号8と同一である核酸配列を含む、
    (iii)前記hsa-mir-208b-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号9と同一である核酸配列を含む、
    (iv)前記hsa-mir-122の標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号10と同一である核酸配列を含む、
    (v)前記hsa-mir-133a-1の標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号11と同一である核酸配列を含む、及び/又は、
    (vi)前記hsa-mir-488-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号12と同一である核酸配列を含む、
    請求項5、8、及び10～13のいずれか1項に記載の核酸。
  15. 前記第2の核酸領域は、配列番号11の核酸配列の少なくとも3回反復を含む、請求項1～3のいずれか1項に記載の核酸。
  16. 前記第2の核酸領域は更に、肝臓の内因性miRNAの標的セグメントを1又は複数含む、請求項15に記載の核酸。
  17. 前記第2の核酸領域は、
    (i)配列番号8の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、
    (ii)配列番号9の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、
    (iii)配列番号10の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、及び、
    (iv)配列番号11の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、
    を含む、請求項1～3のいずれか1項に記載の核酸。
  18. 前記第2の核酸領域は更に、標的セグメント間に1又は複数のリンカーを含み、かつ、任意で該リンカーは1～10ヌクレオチドを含む、請求項1～17のいずれか1項に記載の核酸。
  19. 前記リンカーは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項18記載の核酸。
  20. 前記第2の核酸領域は、
    (i)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号18と同一である核酸配列、
    (ii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号19と同一である核酸配列、
    (iii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号20と同一である核酸配列、又は、
    (iv)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号21と同一である核酸配列、
    を含む、請求項1～3のいずれか1項に記載の核酸。
  21. 前記第1の核酸領域は更に、
    (i)配列番号36若しくは配列番号37の核酸配列を有するプロモーター、
    (ii)CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含むプロモーター、
    (iii)proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含むプロモーター、
    (iv)proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含むプロモーター、又は
    (v)proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含むプロモーター、
    を含む、請求項1～20のいずれか1項に記載の核酸であって、
    任意で、該hSynプロモーターは、配列番号38の核酸配列を含む、該CMVエンハンサーは、配列番号39の核酸配列を含む、該proC3エンハンサーは、配列番号40の核酸配列を含む、該proA5エンハンサーは、配列番号41の核酸配列を含む、及び/又は、該proB15エンハンサーは、配列番号42の核酸配列を含む、前記核酸。
  22. 請求項1～21のいずれか1項に記載の核酸を含むベクター。
  23. 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項22記載のベクター。
  24. 前記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項23記載のベクター。
  25. 前記AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9、又はそれらの組み合せ若しくは変異体に由来する、請求項24記載のベクター。
  26. 前記ベクターは、組換えAAV9(rAAV9)ベクター又はその変異体である、請求項25記載のベクター。
  27. (i)導入遺伝子を含む第1の核酸領域、及び、
    (ii)1又は複数の内因性miRNA(複数可)の1又は複数の標的セグメント(複数可)を含む第2の核酸領域、
    を含む組換えAAV(rAAV)ベクターであって、
    少なくとも1つの標的セグメントは心臓の内因性miRNAの標的セグメントであり、かつ少なくとも1つの標的セグメントは肝臓の内因性miRNAの標的セグメントであり、
    該第2の核酸領域は、該第1の核酸領域の3'位にあり、かつ、
    該rAAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、又はAAV44-9由来の逆方向末端反復(ITR)を含む、前記組換えAAVベクター。
  28. 前記第1の核酸領域は、配列番号33のアミノ酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号33との同一性を有するアミノ酸配列を含むSMAタンパク質若しくはその変異体をコードする核酸配列を含む、請求項27記載のrAAVベクター。
  29. 前記第1の核酸領域は、配列番号34及び配列番号35からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項27又は請求項28記載の核酸。
  30. 前記心臓の内因性miRNAは、hsa-mir-1-5p、hsa-mir-208a-5p、hsa-mir-208b-5p、hsa-mir-133a-1、及びhsa-mir-488-5pからなる群から選択される、並びに/又は、前記肝臓の内因性miRNAはhsa-mir-122である、請求項27～29のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  31. (i)前記心臓の内因性miRNAは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号5、又は配列番号6と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、及び/又は、
    (ii)前記肝臓の内因性miRNAは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号4と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、
    請求項27～29のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  32. 前記第2の核酸領域は、hsa-mir-133a-1の標的セグメントを2以上含む、請求項27～29のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  33. 前記第2の核酸領域は、hsa-mir-133a-1の標的セグメントを少なくとも3つ含む、請求項32記載のrAAVベクター。
  34. 前記第2の核酸領域は、hsa-mir-208a-5pの標的セグメントを少なくとも1つ、hsa-mir-208b-5pの標的セグメントを少なくとも1つ、hsa-mir-122の標的セグメントを少なくとも1つ、及びhsa-mir-133a-1の標的セグメントを少なくとも1つ含む、請求項27～29のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  35. 前記第2の核酸領域は、hsa-mir-208a-5pの標的セグメントを2つ、hsa-mir-208b-5pの標的セグメントを2つ、hsa-mir-122の標的セグメントを3つ、及びhsa-mir-133a-1の標的セグメントを3つ含む、請求項27～29のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  36. (i)前記hsa-mir-1-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号7と同一である核酸配列を含む、
    (ii)前記hsa-mir-208a-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号8と同一である核酸配列を含む、
    (iii)前記hsa-mir-208b-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号9と同一である核酸配列を含む、
    (iv)前記hsa-mir-122の標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号10と同一である核酸配列を含む、
    (v)前記hsa-mir-133a-1の標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号11と同一である核酸配列を含む、及び/又は、
    (vi)前記hsa-mir-488-5pの標的セグメントは、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号12と同一である核酸配列を含む、
    請求項30及び32～35のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  37. 前記第2の核酸領域は、配列番号11の核酸配列の少なくとも3回反復を含む、請求項27～29のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  38. 前記第2の核酸領域は、
    (i)配列番号8の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、
    (ii)配列番号9の核酸配列を有する標的セグメントの2回反復、
    (iii)配列番号10の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、及び、
    (iv)配列番号11の核酸配列を有する標的セグメントの3回反復、
    を含む、請求項27～29のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  39. 前記第2の核酸領域は更に、標的セグメント間に1又は複数のリンカーを含み、かつ、任意で該リンカーは1～10ヌクレオチドを含む、請求項27～38のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  40. 前記リンカーは、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、及び配列番号17からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項39記載のrAAVベクター。
  41. 前記第2の核酸領域は、
    (i)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号18と同一である核酸配列、
    (ii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号19と同一である核酸配列、
    (iii)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号20と同一である核酸配列、又は、
    (iv)少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、若しくは100%が配列番号21と同一である核酸配列、
    を含む、請求項27～29のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  42. 前記第1の核酸領域は更に、
    (i)配列番号36若しくは配列番号37の核酸配列を有するプロモーター、
    (ii)CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含むプロモーター、
    (iii)proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含むプロモーター、
    (iv)proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含むプロモーター、又は、
    (v)proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含むプロモーター、
    を含む、請求項27～41のいずれか1項に記載のrAAVベクターであって、
    任意で、該hSynプロモーターは、配列番号38の核酸配列を含む、該CMVエンハンサーは、配列番号39の核酸配列を含む、該proC3エンハンサーは、配列番号40の核酸配列を含む、該proA5エンハンサーは、配列番号41の核酸配列を含む、及び/又は、該proB15エンハンサーは、配列番号42の核酸配列を含む、前記rAAVベクター。
  43. 前記ITRはAAV9に由来する、請求項27～42のいずれか1項に記載のrAAVベクター。
  44. 配列番号22若しくは配列番号23、配列番号24、若しくは配列番号25の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、若しくは配列番号25との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクター。
  45. SMNタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列、並びにエンハンサー及びコアプロモーターを含む合成プロモーターを含む核酸領域、を含む核酸であって、任意で、
    (i)該合成プロモーターは、CMVエンハンサー及びhSynプロモーターを含む、
    (ii)該合成プロモーターは、proC3エンハンサー及びhSynプロモーターを含む、
    (iii)該合成プロモーターは、proA5エンハンサー及びhSynプロモーターを含む、又は、
    (iv)該合成プロモーターは、proB15エンハンサー及びhSynプロモーターを含む、
    前記核酸。
  46. 前記hSynプロモーターは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号38と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項45記載の核酸。
  47. 前記CMVエンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号39と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項45記載の核酸。
  48. 前記proC3エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号40と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項45記載の核酸。
  49. 前記proA5エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号41と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項45記載の核酸。
  50. 前記proB15エンハンサーは、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%が配列番号42と同一である核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項45記載の核酸。
  51. 前記SMNタンパク質若しくはその変異体は、配列番号33のアミノ酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号33との同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項45～50のいずれか1項に記載の核酸。
  52. 前記SMNタンパク質又はその変異体をコードする核酸配列は、配列番号34及び配列番号35からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項45～50のいずれか1項に記載の核酸。
  53. 請求項45～52のいずれか1項に記載の核酸を含むベクター。
  54. 前記ベクターはウイルスベクターである、請求項53記載のベクター。
  55. 前記ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、請求項54記載のベクター。
  56. 前記AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9、又はそれらの組み合せ若しくは変異体に由来する、請求項55記載のベクター。
  57. 前記ベクターは、組換えAAV9(rAAV9)ベクター又はその変異体である、請求項56記載のベクター。
  58. 配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、若しくは配列番号53の核酸配列、又は、少なくとも80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%が配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、若しくは配列番号53との同一性を有する核酸配列を含む、rAAVベクター。
  59. (a)請求項1～21及び45～52のいずれか1項に記載の核酸、又は請求項27～44及び58のいずれか1項に記載のrAAVベクター、並びに、
    (b)AAV1、AAV2、AAV2i8、AAV3、AAV3-B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV-DJ、AAVLK03、AAVrh74、AAV44-9のカプシドタンパク質、又はその変異体、
    を含む、組換えAAV(rAAV)粒子。
  60. 前記カプシドタンパク質は、AAV9カプシドタンパク質又はその変異体である、請求項59記載のrAAV粒子。
  61. 請求項1～21及び45～52のいずれか1項に記載の核酸、請求項22～44及び53～58のいずれか1項に記載のベクター若しくはrAAVベクター、又は請求項45～46、59及び60のいずれか1項に記載のrAAV粒子、並びに医薬的に許容し得る賦形剤、を含む医薬組成物。
  62. 細胞内のSMNタンパク質発現を増強する方法であって、該細胞を、請求項1～21及び45～52のいずれか1項に記載の核酸、請求項22～44及び53～58のいずれか1項に記載のベクター若しくはrAAVベクター、請求項59～60のいずれか1項に記載のrAAV粒子、又は請求項61に記載の医薬組成物と接触させることを含む、前記方法。
  63. 対象の疾患又は障害を治療する方法であって、該対象へ、請求項1～21及び45～52のいずれか1項に記載の核酸、請求項22～44及び53～58のいずれか1項に記載のベクター若しくはrAAVベクター、請求項59～60のいずれか1項に記載のrAAV粒子、又は請求項61に記載の医薬組成物、を投与することを含む、前記方法。
  64. 前記疾患又は障害は、SMN関連疾患又は障害である、請求項63に記載の方法。
  65. 前記SMN関連疾患又は障害は、SMNタンパク質の不充分な発現に関連する疾患又は障害である、請求項64に記載の方法。
  66. 前記疾患又は障害は欠陥SMNタンパク質に関連する、請求項63に記載の方法。
  67. 前記疾患又は障害は、smn1遺伝子欠失及び/又は変異に関連する、請求項63に記載の方法。
  68. 前記疾患又は障害は脊髄性筋委縮症(SMA)である、請求項63に記載の方法。
  69. 前記疾患又は障害は、SMA-I型、SMA-II型、SMA-III型、又はSMA-IV型である、請求項63に記載の方法。
  70. 前記対象は2歳未満である、請求項63～69のいずれか1項に記載の方法。
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