CN112680466A - 一种表达人源ace2的动物模型及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达人源ACE2的动物模型及其用途，本发明将小鼠AC E2基因信号肽序列和人源ACE2基因成熟肽序列合并并经过密码子优化，扩增得到hACE2序列，并进一步制得重组腺相关病毒AAV‑hACE2；小鼠肺部插管喷射重组腺相关病毒AAV‑hACE2，至少2周之后，获得肺和脑组织高表达人源ACE2的小鼠模型。本发明在构建新型冠状肺炎病毒易感小鼠模型的建模速度上比较快，只需要两周即可建模成功。本发明充分揭示了AAV‑hACE2小鼠在感染新型冠病毒后的病理特征，和在新型冠状病毒疫苗上的应用，从而明确了该模型适用于新型冠状病毒疫苗药效学评价。

Description

一种表达人源ACE2的动物模型及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达人源ACE2(血管紧张素转化酶2)的动物模型及其用途。

背景技术

新型冠状肺炎COVID-19在世界范围内形成大流行，弄清楚其病毒感染机制、研发治疗性药物和疫苗等工作极为重要和紧迫。

SARS-COV-2新型冠状病毒突刺(Spike)糖蛋白通过结合人体内细胞人血管紧张素转化酶2(ACE2)受体入侵机体。

但新冠肺炎病毒研究面临的重大关键难题是缺乏理想的动物模型。虽然非人灵长类动物(如猴子)更接近人类，但由于其价格高、试验周期长、操作不便等问题，并不是动物模型的理想选择。

小鼠是潜在的理想动物模型，但其不易感染SARS-CoV-2，因此需要构建专门的人源ACE2转基因小鼠。

传统的转基因小鼠制备技术是DNA原核显微注射和胚胎干细胞囊胚显微注射法。采用传统的方式进行人源ACE2小鼠的制备需要采用构建ACE2的质粒载体转导后通过供体繁育筛选纯合子F0代从而建立转基因小鼠品系。其缺点是筛选周期长、繁育周期长、随机整合容易表型不稳定、表型的组织特异性不明显。

排除以上弊端之外，传统的动物模型如非人灵长类动物、传统转基因动物在造模过程中存在冠状病毒攻毒后症状轻微不明显等问题，很难实现新冠肺炎重症或者危重症模型的造模。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达人源ACE2(血管紧张素转化酶2)的动物模型及其用途，该动物模型对SARS-COV-2易感，并可以感染SARS-CoV-2，从而实现新型冠状病毒肺炎动物病理模型的造模，并可用于对相关疫苗免疫效果的评估。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种表达人源ACE2的动物模型，由以下步骤制得：

(1)将小鼠ACE2基因信号肽序列和人源ACE2基因(hACE2)成熟肽序列合并并经过密码子优化，然后进一步合成克隆载体；设计引物，以克隆载体为模板扩增hACE2序列；

所述合并并经过密码子优化后的序列如SEQ.ID.NO.1所示；

所述引物的序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示；

(2)酶切腺相关病毒载体，获取线性化载体骨架，然后与hACE2序列进行同源重组反应，经转化大肠杆菌获得pAAV-hACE2；

所述的腺相关病毒载体优选pAAV-GFP，使用AgeI、EcoRI酶切；

(3)辅助性质粒pHelper、血清型质粒pRep2Cap9、目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2三质粒共转染293T细胞，并通过梯度密度超速离心纯化制备，获取重组腺相关病毒AAV-hACE2；

步骤(3)中，辅助性质粒pHelper、血清型质粒pRep2Cap9、目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2的比例优选1:1:2；

(4)小鼠肺部插管喷射重组腺相关病毒AAV-hACE2，至少2周之后，获得肺和脑组织高表达人源ACE2的小鼠模型；

步骤(4)中，肺部插管喷射的注射量优选100μL，重组腺相关病毒AAV-h ACE2的浓度为1×10¹⁰vg/μL；

所述的小鼠优选6-8周龄小鼠。

本发明的表达人源ACE2的动物模型可以用于新型冠状肺炎(COVID-19)病理模型的造模中；

具体地，是将SARS-Cov-2病毒对动物模型做滴鼻感染，获得新型冠状肺炎(COVID-19)病理模型；优选地，病毒浓度优选1×10⁵PFU。

本发明的表达人源ACE2的动物模型还可以用于评估新型冠状肺炎(COVI D-19)疫苗的免疫效果；

具体地，对本发明的动物模型采用肌肉注射或鼻腔接种新型冠状肺炎(CO VID-19)疫苗，然后测定模型动物的体重、检测模型动物体内的病毒载量和中和抗体水平，评估疫苗的免疫效果。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明在构建新型冠状肺炎病毒易感小鼠模型的建模速度上比较快，只需要两周即可建模成功，并确定了建模所采用的建模试剂和给药方式、给药剂量，可规模化、标准化地建模。

2、本发明充分揭示了AAV-hACE2小鼠在感染新型冠病毒后的病理特征，和在新型冠状病毒疫苗上的应用，从而明确了该模型适用于新型冠状病毒疫苗药效学评价。

附图说明

图1是重组腺相关病毒AAV-hACE2对小鼠各组织人源ACE2表达量影响的WesternBlot结果。

图2是重组腺相关病毒AAV-hACE2对小鼠各组织人源ACE2表达量影响的免疫组化结果。

图3是不同给药方式对小鼠肺部组织表达人源ACE2的影响。

图4是模型小鼠感染SARS-Cov-2后体重变化和中体抗体水平；其中，A-体重变化，B-中体抗体水平。

图5是模型小鼠感染SARS-Cov-2后有关基因表达量的变化及肺组织病毒滴度检测结果；A-基因表达量变化，B-病毒滴度检测结果。

图6是模型小鼠感染SARS-Cov-2后细胞因子转录水平检测结果。

图7是模型小鼠感染SARS-Cov-2后的免疫组化结果图。

图8是不同接种方式接种疫苗后模型小鼠的体重变化、病毒载量和中体抗体水平检测结果；A-肌肉注射，B-鼻腔接种。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Samb rook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商提供说明书条件。

实施例中用到的材料如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、表达人源ACE2的肺部疾病小鼠模型的建立

一、重组腺相关病毒骨架载体的构建

通过NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)进行检索，获取小鼠ACE2基因(NCBI Reference Sequence:NM_001130513.1)信号肽序列，获取人源ACE2基因(NCBI Reference Sequence:NM_001371415.1)成熟肽序列，将序列合并并经过密码子优化(SEQ.ID.NO.1)，由苏州金唯智科技有限公司合成克隆载体，即PUC-hACE2。

设计引物F:5’-tccaccggtcgccaccatgtccagctcctcc-3’(SEQ.ID.NO.2)、R:5’-atctcgagcggaattctcagaaactcgtttg-3’(SEQ.ID.NO.3)，以PUC-hACE2为模板扩增hACE2序列。

利用限制性内切酶AgeI、EcoRI酶切腺相关病毒载体pAAV-GFP，采用琼脂糖凝胶电泳，并切割电泳后DNA产物的大片段，获取线性化载体骨架pAAV-CAG-MCS-WPRE-SV40polyA，采用南京诺唯赞生物技术有限公司的重组试剂盒将hACE2与pAAV-CAG-MCS-WPRE-SV40polyA进行同源重组反应，经转化大肠杆菌感受态DH5α(Takara)获得目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2。

pAAV-GFP由广州派真生物技术有限公司根据pAAV-MCS(厂家：Agilent)的序列进行连接CAG启动子元件、GFP基因、WPRE元件、SV40polyA元件改造获得，其完整序列见SEQ.ID.NO.4。本操作为本领域人员根据《分子克隆：实验室手册》可进行操作获得。

二、造模试剂的制备

重组腺相关病毒通过辅助性质粒pHelper、血清型质粒pRep2Cap9、目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2三质粒以1:1:2的比例共转染293T细胞，并通过梯度密度超速离心纯化制备，获取重组腺相关病毒AAV-hACE2，并通过SYBR Green I qPCR染料法检测重组腺相关病毒AAV-hACE2的滴度，滴度为1×10¹³vg/mL。

对照病毒AAV-GFP的制备：重组腺相关病毒通过辅助性质粒pHelper、血清型质粒pRep2Cap9、目的基因骨架表达载体pAAV-GFP三质粒以1:1:1的比例共转染293T细胞，并通过梯度密度超速离心纯化制备，获取重组腺相关病毒A AV-GFP，并通过SYBR Green I qPCR染料法检测重组腺相关病毒AAV-GFP的滴度，滴度为1×10¹³vg/mL。

三、动物模型的制备

6-8周龄小鼠肺部插管喷射hACE2造模试剂AAV-hACE2(1×10¹⁰vg/μL，注射体积为100μL)。2周、4周、10周后，从AAV-GFP对照组、AAV-hACE2给药组做检测比较分析，结果如图1和图2所示：小鼠在感染AAV-hACE2 2周、4周和10周后，通过Western Blot和石蜡包埋实验小鼠组织，进行免疫组化实验各组织，检测到肺和脑组织均能检测到高表达人源ACE2，肝组织表达量较低，肾组织几乎检测不到表达。AAV-GFP对照组则无表达。表明成功获得表达人源ACE2的肺部疾病小鼠模型。

实施例2、对比不同给药方式进行造模

在实施例1的步骤三中，小鼠采用肺部插管喷射、尾静脉注射，肺部插管喷射和尾静脉注射联用三种给药方式，给药hACE2造模试剂AAV-hACE2(1×10¹⁰vg/μL，给药体积为100μL)，其中联用组为肺部插管喷射50μL和尾静脉注射50μL。

图3显示了造模2周后，每组选取三个小鼠，取小鼠肺部组织研磨，加入蛋白裂解液进行WesternBlot检测。模型检测结果显示，尾静脉注射给药并不能使小鼠在肺部表达人源ACE2基因。肺部插管喷射和尾静脉注射联用组其表达水平也并没有优于肺部插管喷射组。

实施例3、采用SARS-Cov-2攻毒hACE2模型小鼠

采用1×10⁵PFU SARS-Cov-2病毒对肺部插管喷射组小鼠(实施例1制得的模型小鼠)和对照组AAV-GFP小鼠进行滴鼻感染。肺部插管喷射组小鼠在感染S ARS-Cov-2后体重开始下降，在第7天体重下降至对照组的80％，并持续到第12天；而后体重逐渐恢复，在实验终点21天时，体重恢复至对照组的90％，如图4A所示。

对hACE2模型小鼠和对照组小鼠分别在10天和21天采用PRNT50的方法进行SARS-COV-2中和抗体检测，hACE2模型小鼠在第10天和第21天均高于对照组，如图4B所示。

感染SARS-Cov-2病毒后2天肺组织中SARS-Cov-2的N和ORF1基因表达显著高于对照组，随后表达水平逐渐下降，到6天时基本检测不到表达(图5A)；进一步对小鼠肺组织中染毒后2天肺病毒滴度检测显示，ACE2组是对照组的3倍(图5B)。

采用荧光定量PCR检测细胞因子转录水平检测，表明IL-6、IL-10、IL-15、IFNγ、Cxcl10、TNFα、CCL2、CD8等显著高于对照组，出现促炎症细胞因子水平的水平升高表明有炎症反应，如图6所示。

AAV-hACE2组小鼠染毒4天后肺部出现典型肺炎症状，主要表现为大量炎性细胞浸润，如图7所示。

实施例4、新型冠状肺炎疫苗免疫AAV-hACE2小鼠模型后的评价

采用肌肉注射(i.m.)5×10¹⁰vp/mL Ad5-S腺病毒载体疫苗(携带S蛋白的5型腺病毒载体)(由中国科学院广州生物医药与健康研究院陈凌课题组提供)免疫AAV-hACE2载体构建小鼠模型(实施例1制得的模型小鼠)，采用5×10¹⁰vp/mL Ad5-empty腺病毒载体(无携带目的基因的对照腺病毒载体)作为对照组。对小鼠进行逐日称量体重，对照组体重持续下降，在7-8天达到最低值，Ad5-S腺病毒载体疫苗组体重变化不大。对照组小鼠中病毒载量达到4FFU/g，疫苗组低于检测限(LOD)，采用FRNT₅₀的方法检测中和抗体水平显著升高，如图8A所示。

采用鼻腔接种(i.n.)5×10¹⁰vp/mL Ad5-S腺病毒载体疫苗(携带S蛋白的5型腺病毒载体)免疫AAV-hACE2载体构建小鼠模型，采用5×10¹⁰vp/mL Ad5-e mpty腺病毒载体(无携带目的基因的对照腺病毒载体)作为对照组。使用AAV-hACE2载体构建小鼠模型显示鼻腔接种(i.n.)5×10¹⁰vp/mL Ad5-S腺病毒载体疫苗(携带S蛋白的5型腺病毒载体)的小鼠中病毒载量显著降低，中和抗体水平显著升高，如图8B所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州派真生物技术有限公司

广东省实验动物监测所

<120> 一种表达人源ACE2的动物模型及其用途

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2418

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtccagct cctcctggct ccttctcagc cttgttgctg ttactactgc tcaaagcacg 60

attgaagagc aggcaaagac atttctagac aagtttaatc atgaagcaga agatttgttc 120

tatcagtcgt ccctggcctc ctggaactac aatacaaaca tcacagagga gaacgtgcag 180

aatatgaaca atgccggaga caagtggagt gccttcttga aggagcaaag tactctggcc 240

caaatgtatc ccctccaaga gatccagaat ctgacagtga aactgcaatt acaagccctt 300

caacagaatg ggagttcagt gctgtctgaa gacaagagta agcgcctcaa caccatattg 360

aacacaatgt ccaccatcta cagcacaggc aaggtgtgca atccagacaa tccccaggag 420

tgtctgctcc tggaacctgg actcaatgaa attatggcta attcactgga ttacaacgaa 480

cggctgtggg cctgggaaag ctggaggtct gaggtgggaa aacagctgag gccgctctat 540

gaggaatatg tggtcctaaa gaatgagatg gccagggcta accactacga agactatgga 600

gattactgga gaggggacta cgaagtgaac ggcgtcgacg gctatgacta cagccgtgga 660

cagcttattg aggatgtaga gcatactttt gaagaaataa aacctctcta tgaacatttg 720

catgcctatg tacgcgcaaa gctgatgaac gcttacccct cctacatctc ccccatcggc 780

tgcctcccag cccatcttct tggtgacatg tggggtcgct tttggaccaa cctgtatagt 840

ctaacagttc cttttggtca gaagcctaac attgacgtga cagacgccat ggtggaccag 900

gcttgggatg cccagagaat attcaaagag gctgagaagt tctttgtttc tgtcggcctg 960

ccaaacatga ctcagggctt ttgggagaat agcatgttga cagatccagg taatgttcag 1020

aaagcagtct gtcaccctac cgcatgggac ctgggaaagg gggactttag gatcctcatg 1080

tgtaccaagg tcaccatgga tgacttccta actgctcacc acgaaatggg ccacattcag 1140

tatgatatgg catatgcagc acagcctttc ttgttacgga atggtgccaa cgaagggttc 1200

catgaggctg tgggggaaat catgtctttg tcagccgcca cgccgaagca cctcaaatcc 1260

atagggcttc tttccccaga tttccaggag gacaatgaga cagaaatcaa cttcctcctg 1320

aagcaggctc tgactatcgt aggtacctta ccattcacgt acatgcttga gaaatggcgc 1380

tggatggtgt tcaagggaga gattcccaag gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440

aagagagaga ttgtgggcgt agttgagccg gtccctcatg atgagaccta ctgtgaccca 1500

gcgtcattat tccacgtgtc gaatgattat tcctttatac ggtactacac ccggaccctc 1560

taccagtttc agttccaaga agcgctttgc caggctgcca agcacgaggg acccctccac 1620

aaatgcgata ttagcaacag caccgaagcg gggcagaagc tatttaacat gctgcgtctc 1680

gggaagagcg agccatggac attagcactg gaaaatgtgg tgggcgcaaa aaatatgaat 1740

gtaaggcccc tgctgaacta ttttgagcct ctgttcacct ggctgaaaga ccaaaacaaa 1800

aacagctttg tgggctggag cactgactgg agtccgtatg cggatcagtc catcaaagtg 1860

aggatttctt tgaaatcagc tctgggggat aaggcttacg agtggaatga caacgagatg 1920

tacctgttca ggtccagtgt ggcttatgct atgagacagt acttccttaa agtgaagaac 1980

cagatgatcc tgtttggaga ggaagatgtt cgagtggcaa atttaaagcc acggattagc 2040

ttcaactttt ttgtcacagc cccaaaaaat gtctcagaca tcatccccag aactgaggtt 2100

gaaaaagcca tcagaatgag ccgatcccgc ataaatgacg ctttcaggct caacgataac 2160

tctctagagt ttttgggtat tcaacccacc ctgggacctc ccaatcagcc acctgttagc 2220

atctggctca ttgtcttcgg cgttgtgatg ggtgtcatag ttgtcgggat cgtgatcctg 2280

atcttcactg ggatccgaga tagaaagaaa aagaacaagg cacgatctgg agaaaacccc 2340

tacgcctcca ttgacatttc taaaggcgag aacaaccctg gcttccagaa cactgatgat 2400

gtccaaacga gtttctga 2418

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccaccggtc gccaccatgt ccagctcctc c 31

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctcgagcg gaattctcag aaactcgttt g 31

<210> 4

<211> 4884

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggccattc ggtacaattc acgcgtcgac attgattatt gactagctct 180

ggtcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 240

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 300

tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 360

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 420

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tactcgaggc cacgttctgc 480

ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa 540

ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg 600

cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc 660

gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga 720

agcgcgcggc gggcgggagc gggatcagcc accgcggtgg cggcctagag tcgacgagga 780

actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt tgtcttttat ttcaggtccc 840

ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta 900

ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg aattgtaccc gcggccgatc 960

caccggtcgc caccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc 1020

tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg 1080

gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg 1140

tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc 1200

ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg 1260

agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg 1320

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acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg 1440

acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca 1500

gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc 1560

tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc 1620

gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg 1680

agctgtacaa gtaaatcgaa ttccgctcga gataatcaac ctctggatta caaaatttgt 1740

gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 1800

ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 1860

aaatcctggt tagttcttgc cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg 1920

acaggggctc ggctgttggg cactgacaat tccgtggtgt ttatttgtga aatttgtgat 1980

gctattgctt tatttgtaac catctagctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 2040

atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 2100

gtttcaggtt cagggggaga tgtgggaggt tttttaaagc ggccgcagga acccctagtg 2160

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 2220

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 2280

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 2340

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 2400

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 2460

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 2520

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 2580

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 2640

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 2700

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 2760

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 2820

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 2880

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 2940

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 3000

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 3060

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 3120

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 3180

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 3240

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 3300

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 3360

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 3420

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 3480

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 3540

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 3600

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 3660

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 3720

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 3780

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 3840

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 3900

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 3960

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 4020

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 4080

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 4140

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 4200

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 4260

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 4320

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 4380

tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 4440

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 4500

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 4560

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Claims (10)

1.一种表达人源ACE2的动物模型，其特征在于是由以下步骤制得：

(1)将小鼠ACE2基因信号肽序列和人源ACE2基因成熟肽序列合并并经过密码子优化，然后进一步合成克隆载体；设计引物，以克隆载体为模板扩增hACE2序列；

(2)酶切腺相关病毒载体，获取线性化载体骨架，然后与hACE2序列进行同源重组反应，经转化大肠杆菌获得目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2；

(3)辅助性质粒pHelper、血清型质粒pRep2Cap9、目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2三质粒共转染293T细胞，并通过梯度密度超速离心纯化制备，获取重组腺相关病毒AAV-hACE2；

(4)小鼠肺部插管喷射重组腺相关病毒AAV-hACE2，至少2周之后，获得肺和脑组织高表达人源ACE2的小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的表达人源ACE2的动物模型，其特征在于：步骤(4)中，肺部插管喷射的注射量为100μL，重组腺相关病毒AAV-hACE2的浓度为1×10¹⁰vg/μL。

3.根据权利要求1所述的表达人源ACE2的动物模型，其特征在于：步骤(1)所述引物的序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的表达人源ACE2的动物模型，其特征在于：步骤(2)所述的腺相关病毒载体为pAAV-GFP，使用AgeI、EcoRI酶切。

5.根据权利要求1所述的表达人源ACE2的动物模型，其特征在于：步骤(3)中，辅助性质粒pHelper、血清型质粒pRep2Cap9、目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2的比例为1:1:2。

6.根据权利要求1所述的表达人源ACE2的动物模型，其特征在于：步骤(4)所述的小鼠为6-8周龄小鼠。

7.权利要求1-6任一项所述的表达人源ACE2的动物模型在新型冠状肺炎COVID-19病理模型造模中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将SARS-Cov-2病毒对动物模型做滴鼻感染，获得新型冠状肺炎COVID-19病理模型；病毒浓度为1×10⁵PFU。

9.权利要求1-6任一项所述的表达人源ACE2的动物模型在评估新型冠状肺炎COVID-19疫苗免疫效果中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：对动物模型采用肌肉注射或鼻腔接种新型冠状肺炎COVID-19疫苗，然后测定模型动物的体重、检测模型动物体内的病毒载量和中和抗体水平，评估疫苗的免疫效果。

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