CN114350706A - 一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法，构建方法包括如下步骤：以化学合成的人ACE2基因CDS区序列为模板，进行hACE2基因序列扩增；使用限制性内切酶对pCAG‑EGFP‑N1质粒和hACE2扩增产物进行酶切，胶回收目的DNA片段；pCAG‑EGFP‑N1的DNA片段和hACE2的DNA片段酶连接，得到pCAG‑hACE2‑N1质粒载体，再次酶切和胶回收，得到线性化的注射DNA片段；将注射DNA片段注射到小鼠受精卵的细胞核内，将注射后的小鼠受精卵移植到假孕小鼠的体内，得到首建鼠，进行传代，感染并筛选出新冠病毒感染致死的小鼠，得到新冠病毒感染致死性小鼠动物模型。
Description
技术领域
本发明属于在基因工程的领域，具体涉及一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法。
背景技术
COVID-19的病原体为严重急性呼吸系统综合症相关冠状病毒(SARSr-CoV)，命名为SARS-CoV-2。尽管为控制该疾病做出了相当大的努力，但该病毒仍在许多国家继续流行，具有不同程度的临床表现。SARS-CoV-2入院患者表现出肺炎症状，胸部CT扫描结果异常；其感染的临床症状从无症状到有症状不等，包括呼吸道症状、发烧、呼吸急促、咳嗽、呼吸困难和病毒性肺炎，在严重的情况下，肺炎、严重急性呼吸系统综合症、心力衰竭、肾功能衰竭，甚至死亡。与COVID-19相关的主要死亡原因是呼吸衰竭，其次是感染性休克、肾衰竭、出血和心力衰竭。
冠状病毒是有包膜的、基因组为线性单股正链的RNA病毒，属于Nidovirales目中的冠状病毒科。该病毒有四个属，即alpha(α)、beta(β)、gamma (γ)和delta(δ)。然而，新型SARS-CoV-2属于β-冠状病毒属，其RNA基因组大小为29.9kb。SARS-CoV-2是继SARS-CoV和MERS-CoV之后的第3 种高致病性冠状病毒。据报道，SARS-CoV-2与SARS-CoV的序列相似性为79％，与MERS-CoV的相似性为50％。越来越多的研究表明，SARS-CoV-2 和SARS-CoV和MERS-CoV一样，是通过血管紧张素转换酶2(ACE2)进入细胞，并感染机体，但具体发病机制尚不完全明确。此外是，尽管SARS-CoV-2 和SARS-CoV之间具有受体结合域(RBD)结构同源性，但一些已发表的 SARS-CoV RBD单克隆抗体仍无法中和SARS-CoV-2。因此我们需要更多的动物感染模型来了解病毒发病机制、疫苗开发和药物筛选。
然而，之前的研究表明，SARS-CoV-2可以使用人类、蝙蝠或果子狸 ACE2作为细胞受体，但不能使用小鼠ACE2作为受体。非人类灵长类动物也有助于临床前评估，但非人灵长类、蝙蝠和果子狸受到实验室动物应用范围、成本、饲养等条件的限制，无法广泛应用于实验研究，而作为最常使用的实验动物，SARS-CoV-2在小鼠中复制能力很差，基本上不感染。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法，构建表达hACE2蛋白的小鼠，为SARS-CoV-2发病机制、疫苗开发和药物筛选提供新型实验动物模型。
为了实现上述目的，本发明提供的一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)以化学合成的人ACE2基因CDS区序列为模板，进行hACE2基因序列扩增，得到hACE2扩增产物；
(2)使用EcoRI限制性内切酶and NotI限制性内切酶对pCAG-EGFP-N1 质粒进行酶切；
(3)使用EcoRI限制性内切酶and NotI限制性内切酶对步骤(1)得到的hACE2扩增产物进行酶切；
(4)胶回收步骤(2)酶切的pCAG-EGFP-N1质粒载体，得到pCAG-EGFP-N1的DNA片段，胶回收步骤(3)酶切的hACE2扩增产物，得到hACE2的DNA片段；
(5)将步骤(4)得到的pCAG-EGFP-N1的DNA片段和hACE2的DNA 片段酶连接，得到pCAG-hACE2-N1质粒载体；
(6)使用SpeI限制性内切酶和AflII限制性内切酶对步骤(5)得到的 pCAG-hACE2-N1质粒载体进行酶切；
(7)胶回收步骤(6)酶切的pCAG-hACE2-N1质粒载体，得到线性化的注射DNA片段。
(8)取小鼠受精卵，将步骤(7)得到的注射DNA片段注射到小鼠受精卵的细胞核内，将注射后的小鼠受精卵移植到假孕小鼠的体内，得到首建鼠，首建鼠进行传代；
(9)步骤(8)得到的首建鼠传代繁育的小鼠感染新冠病毒，筛选出新冠病毒感染致死的小鼠，得到新冠病毒感染致死性小鼠动物模型。
进一步地，步骤(1)的扩增体系中包括基因正向引物序列、基因反向引物序列和PCR反应体系，其中
基因正向引物序列hACE2-F：5’-GAATTCGCCACCATGtcaagctcttc-3’，
基因反向引物序列hACE2-R：5’-gcggccgcCTAaaaggaggtct-3’。
优选地，步骤(1)中得到的所述hACE2扩增产物的序列为 GAATTCGCCACCATGtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgctcagtccacca ttgaggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagccgaagacctgttctatcaaagttcacttgcttctt ggaattataacaccaatattactgaagagaatgtccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgcctttttaaag gaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctcacagtcaagcttcagctgcaggctcttca gcaaaatgggtcttcagtgctctcagaagacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcaccatctac agtactggaaaagtttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccaggtttgaatgaaataatggcaaac agtttagactacaatgagaggctctgggcttgggaaagctggagatctgaggtcggcaagcagctgaggccattatat gaagagtatgtggtcttgaaaaatgagatggcaagagcaaatcattatgaggactatggggattattggagaggagact atgaagtaaatggggtagatggctatgactacagccgcggccagttgattgaagatgtggaacatacctttgaagagat taaaccattatatgaacatcttcatgcctatgtgagggcaaagttgatgaatgcctatccttcctatatcagtccaattggat gcctccctgctcatttgcttggtgatatgtggggtagattttggacaaatctgtactctttgacagttccctttggacagaaa ccaaacatagatgttactgatgcaatggtggaccaggcctgggatgcacagagaatattcaaggaggccgagaagtt ctttgtatctgttggtcttcctaatatgactcaaggattctgggaaaattccatgctaacggacccaggaaatgttcagaaa gcagtctgccatcccacagcttgggacctggggaagggcgacttcaggatccttatgtgcacaaaggtgacaatgga cgacttcctgacagctcatcatgagatggggcatatccagtatgatatggcatatgctgcacaaccttttctgctaagaaa tggagctaatgaaggattccatgaagctgttggggaaatcatgtcactttctgcagccacacctaagcatttaaaatccat tggtcttctgtcacccgattttcaagaagacaatgaaacagaaataaacttcctgctcaaacaagcactcacgattgttgg gactctgccatttacttacatgttagagaagtggaggtggatggtctttaaaggggaaattcccaaagaccagtggatga aaaagtggtgggagatgaagcgagagatagttggggtggtggaacctgtgccccatgatgaaacatactgtgacccc gcatctctgttccatgtttctaatgattactcattcattcgatattacacaaggaccctttaccaattccagtttcaagaagcactttgtcaagcagctaaacatgaaggccctctgcacaaatgtgacatctcaaactctacagaagctggacagaaactgtt caatatgctgaggcttggaaaatcagaaccctggaccctagcattggaaaatgttgtaggagcaaagaacatgaatgta aggccactgctcaactactttgagcccttatttacctggctgaaagaccagaacaagaaCtcttttgtgggatggagtac cgactggagtccatatgcagaccaaagcatcaaagtgaggataagcctaaaatcagctcttggagataaagcatatga atggaacgacaatgaaatgtacctgttccgatcatctgttgcatatgctatgaggcagtactttttaaaagtaaaaaatcag atgattctttttggggaggaggatgtgcgagtggctaatttgaaaccaagaatctcctttaatttctttgtcactgcacctaa aaatgtgtctgatatcattcctagaactgaagttgaaaaggccatcaggatgtcccggagccgtatcaatgatgctttccg tctgaatgacaacagcctagagtttctggggatacagccaacacttggacctcctaaccagccccctgtttccatatggc tgattgtttttggagttgtgatgggagtgatagtggttggcattgtcatcctgatcttcactgggatcagagatcggaagaa gaaaaataaagcaagaagtggagaaaatccttatgcctccatcgatattagcaaaggagaaaataatccaggattcca aaacactgatgatgttcagacctcctttTAGgcggccgc。
优选地，步骤(5)得到pCAG-hACE2-N1质粒载体的序列为 ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATA TGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACC GCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAG TAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGG TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCC CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGT ACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCA TCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCC CATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTA TTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGG GGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGG CGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAG GCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGG AGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCGCGC CGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGC GGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGG CTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGGAGG GCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTG TGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGC GCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGAGGG GAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGG GAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGG GTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCC GAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGGGGC GTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGG GTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGA GGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAG CCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTT CCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCAC CCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGA AATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTC CATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGG GACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTA GAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTGGCAAA
GAATTCGCCACCATGtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgctcagtccaccattgaggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagccgaagacctgttctatcaaagttcacttgc ttcttggaattataacaccaatattactgaagagaatgtccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgccttttta aaggaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctcacagtcaagcttcagctgcaggctc ttcagcaaaatgggtcttcagtgctctcagaagacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcaccat ctacagtactggaaaagtttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccaggtttgaatgaaataatggc aaacagtttagactacaatgagaggctctgggcttgggaaagctggagatctgaggtcggcaagcagctgaggccat tatatgaagagtatgtggtcttgaaaaatgagatggcaagagcaaatcattatgaggactatggggattattggagagg agactatgaagtaaatggggtagatggctatgactacagccgcggccagttgattgaagatgtggaacatacctttgaa gagattaaaccattatatgaacatcttcatgcctatgtgagggcaaagttgatgaatgcctatccttcctatatcagtccaat tggatgcctccctgctcatttgcttggtgatatgtggggtagattttggacaaatctgtactctttgacagttccctttggaca gaaaccaaacatagatgttactgatgcaatggtggaccaggcctgggatgcacagagaatattcaaggaggccgaga agttctttgtatctgttggtcttcctaatatgactcaaggattctgggaaaattccatgctaacggacccaggaaatgttcag aaagcagtctgccatcccacagcttgggacctggggaagggcgacttcaggatccttatgtgcacaaaggtgacaat ggacgacttcctgacagctcatcatgagatggggcatatccagtatgatatggcatatgctgcacaaccttttctgctaag aaatggagctaatgaaggattccatgaagctgttggggaaatcatgtcactttctgcagccacacctaagcatttaaaatccattggtcttctgtcacccgattttcaagaagacaatgaaacagaaataaacttcctgctcaaacaagcactcacgattg ttgggactctgccatttacttacatgttagagaagtggaggtggatggtctttaaaggggaaattcccaaagaccagtgg atgaaaaagtggtgggagatgaagcgagagatagttggggtggtggaacctgtgccccatgatgaaacatactgtga ccccgcatctctgttccatgtttctaatgattactcattcattcgatattacacaaggaccctttaccaattccagtttcaaga agcactttgtcaagcagctaaacatgaaggccctctgcacaaatgtgacatctcaaactctacagaagctggacagaa actgttcaatatgctgaggcttggaaaatcagaaccctggaccctagcattggaaaatgttgtaggagcaaagaacatg aatgtaaggccactgctcaactactttgagcccttatttacctggctgaaagaccagaacaagaaCtcttttgtgggatg gagtaccgactggagtccatatgcagaccaaagcatcaaagtgaggataagcctaaaatcagctcttggagataaagc atatgaatggaacgacaatgaaatgtacctgttccgatcatctgttgcatatgctatgaggcagtactttttaaaagtaaaa aatcagatgattctttttggggaggaggatgtgcgagtggctaatttgaaaccaagaatctcctttaatttctttgtcactgc acctaaaaatgtgtctgatatcattcctagaactgaagttgaaaaggccatcaggatgtcccggagccgtatcaatgatg ctttccgtctgaatgacaacagcctagagtttctggggatacagccaacacttggacctcctaaccagccccctgtttcc atatggctgattgtttttggagttgtgatgggagtgatagtggttggcattgtcatcctgatcttcactgggatcagagatcg gaagaagaaaaataaagcaagaagtggagaaaatccttatgcctccatcgatattagcaaaggagaaaataatccag gattccaaaacactgatgatgttcagacctcctttTAGgcggccgc
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优选地，步骤(5)中所述pCAG-EGFP-N1的DNA片段和所述hACE2 的DNA片段通过T4DNA连接酶进行酶连接。
进一步地，步骤(8)得到的首建鼠和步骤(9)中传代繁育的小鼠在感染新冠病毒前进行基因型鉴定。
优选地，所述首建鼠和所述传代繁育的小鼠通过PCR方法进行基因型鉴定，其中正向鉴定引物序列为5’-TGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCA-3’，反向鉴定引物序列为5’-CAGGTCTTCGGCTTCGTGGTTAA-3’。
优选地，步骤(8)中注射DNA片段以100ng/uL的浓度注射到小鼠受精卵的细胞核内。
进一步地，步骤(8)中小鼠受精卵的获取，包括以下步骤：取4-5周龄的雌性小鼠，注射孕马血清促性腺激素10IU，间隔46-48小时后，注射人绒毛膜促性腺激素10IU，注射激素后的雌性小鼠与10周龄以上雄性小鼠合笼10-12小时，检栓，取受精卵。
本发明还提供一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型，根据上述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法构建。
本发明提供的一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法，具有如下有益效果：
1、构建表达hACE2蛋白的小鼠，我们使用DNA显微注射技术和随机整合技术构建hACE2过表达小鼠，获得的Founder小鼠即首建鼠全部进行传代后，筛选新冠病毒敏感且新冠病毒感染致死的hACE2小鼠进行保留，为 SARS-CoV-2发病机制、疫苗开发和药物筛选提供新型实验动物模型；
2、技术难度比较低，且获得的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型在新冠病毒感染验证上结果更好。
附图说明
图1为本具体实施方式中的pCAG-hACE2-N1质粒载体的基因组结构图。
图2为本具体实施方式中的pCAG-hACE2-N1质粒载体的线性模式图。
图3为本具体实施方式中的小鼠基因型判定的PCR电泳图。
图4为本实施例2中的CMV hACE2小鼠SARS-CoV-2病毒感染后病毒载量图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型以及构建方法，构建表达hACE2 蛋白的小鼠，我们使用DNA显微注射技术和随机整合技术构建hACE2过表达小鼠，获得的Founder小鼠即首建鼠全部进行传代后，筛选新冠病毒敏感且新冠病毒感染致死的hACE2小鼠进行保留，为SARS-CoV-2发病机制、疫苗开发和药物筛选提供新型实验动物模型。
新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，包括以下步骤：
1、取化学合成的人ACE2基因编码区序列(coding sequence，CDS区序列)进行hACE2基因序列扩增
(1)基因正向引物序列hACE2-F:5’-GAATTCGCCACCATGtcaagctcttc-3’ (SEQ IDNO.1)，基因反向引物序列hACE2-R：5’-gcggccgcCTAaaaggaggtct-3’ (SEQ ID NO.2)，通过PCR扩增，得到hACE2扩增产物。
其中PCR扩增反应体系(共25μL)的配制：
| 组分 | 一次加入量(μL) |
| 2×KOD FX Neo buffer | 12.5 |
| dNTPs | 5 |
| hACE2-F | 1 |
| hACE2-R | 1 |
| KOD FX Neo | 0.5 |
| ddH<sub>2</sub>O | 3 |
| 化学合成的人ACE2基因CDS区序列 | 2 |
PCR反应条件：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸150s，35个循环；72℃继续延伸10min，4℃保存。
得到的hACE2扩增产物序列为2438bp，具体为GAATTCGCCACCATGtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgctcagtccacca ttgaggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagccgaagacctgttctatcaaagttcacttgcttctt ggaattataacaccaatattactgaagagaatgtccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgcctttttaaag gaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctcacagtcaagcttcagctgcaggctcttca gcaaaatgggtcttcagtgctctcagaagacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcaccatctac agtactggaaaagtttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccaggtttgaatgaaataatggcaaac agtttagactacaatgagaggctctgggcttgggaaagctggagatctgaggtcggcaagcagctgaggccattatat gaagagtatgtggtcttgaaaaatgagatggcaagagcaaatcattatgaggactatggggattattggagaggagactatgaagtaaatggggtagatggctatgactacagccgcggccagttgattgaagatgtggaacatacctttgaagagat taaaccattatatgaacatcttcatgcctatgtgagggcaaagttgatgaatgcctatccttcctatatcagtccaattggat gcctccctgctcatttgcttggtgatatgtggggtagattttggacaaatctgtactctttgacagttccctttggacagaaa ccaaacatagatgttactgatgcaatggtggaccaggcctgggatgcacagagaatattcaaggaggccgagaagtt ctttgtatctgttggtcttcctaatatgactcaaggattctgggaaaattccatgctaacggacccaggaaatgttcagaaa gcagtctgccatcccacagcttgggacctggggaagggcgacttcaggatccttatgtgcacaaaggtgacaatgga cgacttcctgacagctcatcatgagatggggcatatccagtatgatatggcatatgctgcacaaccttttctgctaagaaa tggagctaatgaaggattccatgaagctgttggggaaatcatgtcactttctgcagccacacctaagcatttaaaatccat tggtcttctgtcacccgattttcaagaagacaatgaaacagaaataaacttcctgctcaaacaagcactcacgattgttgg gactctgccatttacttacatgttagagaagtggaggtggatggtctttaaaggggaaattcccaaagaccagtggatga aaaagtggtgggagatgaagcgagagatagttggggtggtggaacctgtgccccatgatgaaacatactgtgacccc gcatctctgttccatgtttctaatgattactcattcattcgatattacacaaggaccctttaccaattccagtttcaagaagca ctttgtcaagcagctaaacatgaaggccctctgcacaaatgtgacatctcaaactctacagaagctggacagaaactgtt caatatgctgaggcttggaaaatcagaaccctggaccctagcattggaaaatgttgtaggagcaaagaacatgaatgta aggccactgctcaactactttgagcccttatttacctggctgaaagaccagaacaagaaCtcttttgtgggatggagtac cgactggagtccatatgcagaccaaagcatcaaagtgaggataagcctaaaatcagctcttggagataaagcatatga atggaacgacaatgaaatgtacctgttccgatcatctgttgcatatgctatgaggcagtactttttaaaagtaaaaaatcag atgattctttttggggaggaggatgtgcgagtggctaatttgaaaccaagaatctcctttaatttctttgtcactgcacctaa aaatgtgtctgatatcattcctagaactgaagttgaaaaggccatcaggatgtcccggagccgtatcaatgatgctttccg tctgaatgacaacagcctagagtttctggggatacagccaacacttggacctcctaaccagccccctgtttccatatggc tgattgtttttggagttgtgatgggagtgatagtggttggcattgtcatcctgatcttcactgggatcagagatcggaagaa gaaaaataaagcaagaagtggagaaaatccttatgcctccatcgatattagcaaaggagaaaataatccaggattcca aaacactgatgatgttcagacctcctttTAGgcggccgc(SEQ ID NO.3)。
其中开头的GAATTC为限制性核酸内切酶EcoRI的酶切识别位点，末尾的gcggccgc为NotI的酶切识别位点。
(2)使用EcoRI(NEB公司EcoRI-HF，货号R3101S)和NotI(NEB 公司EcoRI-HF，货号R3101S)限制性内切酶对pCAG-EGFP-N1质粒载体进行酶切，反应条件：温度37℃，酶切1小时30分钟。其中pCAG-EGFP-N1 质粒的质量不大于1μg。
上述的pCAG-EGFP-N1质粒载体的序列如下(其中下文序列中带下划线的碱基为酶切位点)：
ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCC CATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGG CTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTT CCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACT ATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCC AAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATC TACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTC TGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTT ATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGG GCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGA GGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAG TTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGA AGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCG CTCCGCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTAC TCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTA GCGCTTGGTTTAATGACGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGC CTTAAAGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGG GGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCG CTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCG CTCCGCGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGT GCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCG TGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTG CGGGGCTCCGTGCGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGG GGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCC GGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGC TGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCG AGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATC TGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGC GGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCC GCGCCGCCGTCCCCTTCTCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGG ACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTT CTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATC ATTTGGCAAAGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGATCCA CCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTG GTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTC AGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACC CTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGA CCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTAC GTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACC CGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAG CTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAG CTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGC AGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGG ACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCG GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGT CCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGC TGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTA CAAGTAAAGCGGCCGCGACTCTAGATCATAATCAGCCATACCACATTTGT AGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGAACCTG AAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTAT AATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATT TTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA AGGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTT GTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCT TATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTG GAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCG AAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAA TCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTA AAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGG CGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTG GCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTA ATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCG CGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTC ATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGA GTCCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTG TGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCA TCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCA GGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCC CGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCAT TCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGC CGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGA GGCCTAGGCTTTTGCAAAGATCGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTT CGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGG TGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTT GTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCA GCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGC TCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAG TGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGT ATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTA CCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTAC TCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCAT CAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATG CCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGA ATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGG CTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATAT TGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTAC GGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGA CGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCG ACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGA AAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTC CAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCTAGGGGGAGGC TAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGA CGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGTGTTGGGTCGTTTGTTCA TAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCG AGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCA CCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGC GGCAGGCCCTGCCATAGCCTCAGGTTACTCATATATACTTTAGATTGATTT AAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAA TCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAG ACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGC GTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTT GTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTT CAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTA GGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCT AATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCG GGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTG AACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACAC CGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCC GAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAAC AGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTAT AGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATG CTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTT TTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGC GTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCAT(SEQ ID NO.7)。
双酶切体系(共20μL)的配制：
| 组分 | 一次加入量(μL) |
| EcoRⅠ | 1 |
| NotⅠ | 1 |
| 10×cutsmart Buffer | 2 |
| pCAG-EGFP-N1 | 10-12 |
| 无菌水 | 补足至20 |
(3)使用EcoRI和NotI限制性内切酶对步骤(1)得到的hACE2扩增产物进行酶切，反应条件：温度37℃，酶切1小时30分钟。
双酶切体系(共20μL)的配制：
| 组分 | 一次加入量(μL) |
| EcoRⅠ | 1 |
| NotⅠ | 1 |
| 10×cutsmart Buffer | 2 |
| hACE2 | 10-12 |
| 无菌水 | 补足至20 |
(4)胶回收目的条带
使用天根生化科技有限公司Universal DNA纯化回收试剂盒(货号： DP214)从琼脂糖凝胶中分别回收酶切的pCAG-EGFP-N1质粒和酶切的 hACE2扩增产物的DNA片段，步骤如下：
A、柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱CB2放入收集管中)加入500 μL平衡液BL，12000rpm(相对离心力是13400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
B、将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分) 放入干净的离心管中，称取重量。
C、向胶块中加入等倍体积溶液PC(例如凝胶重为0.1g，其体积可视为 100μL，则加入100μL PC溶液)，50℃水浴放置10min左右，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。
D、将步骤C所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)， 12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
E、向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
F、重复操作步骤E。
G、将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底晾干。
H、将吸附柱CB2放入一个干净离心管中，向吸附柱的吸附膜中间位置悬空滴加50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12000rpm离心2min，收集DNA溶液。
(5)hACE2与pCAG-EGFP-N1连接
在碎冰上的微量离心管中进行以下反应，体系中加入T4 DNA连接酶缓冲液、载体pCAG-EGFP-N1(Vector DNA)、插入hACE2(Insert DNA)、水，最后加入T4 DNA连接酶(NEB公司T4 DNA Ligase，货号M0202S)。其中，表格显示了一个连接使用的载体DNA与插入DNA指示的DNA大小为摩尔比1:3。
反应体系的配制：
| 组分 | 一次加入量(μL) |
| T4 DNA Ligase Buffer(10X)* | 2 |
| Vector DNA(4kb) | 50ng(0.020pmol) |
| Insert DNA(1kb) | 37.5ng(0.060pmol) |
| Nuclease-free water | 补足至20 |
| T4 DNA Ligase | 1 |
反应过程如下：
A、通过上下移液和微吸法轻轻地混合反应。
B、16℃下过夜连接。
C、过夜连接后，65℃加热灭活10min。
D、取1-5μL的反应液放入冰块中，转化为50μL的感受态细胞。
hACE2与pCAG-EGFP-N1连接后，得到pCAG-hACE2-N1质粒载体(如图1所示)，序列如下，其中括号内为插入的hACE2序列：
ACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCA TATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTG ACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCA TAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTA CGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTAC GCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCC AGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAG TCATCGCTATTACCATGGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCT CCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAA TTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGG CGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTG CGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGC GAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGC GGGAGTCGCTGCGTTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCGCCGCCTCG CGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCG GGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGA CGGCTCGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTAAAGGGCTCCGGG AGGGCCCTTTGTGCGGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTG AGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCGTGTGCGCGA GGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGA GGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAG GGGGTGTGGGCGCGGCGGTCGGGCTGTAACCCCCCCCTGCACCCCCCTC CCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTGCGG GGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTG GGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGG GGAGGGGCGCGGCGGCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGC GAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGA CTTCCTTTGTCCCAAATCTGGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCG CACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAG GAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTC TCCATCTCCAGCCTCGGGGCTGCCGCAGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTC TAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCT GGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTGGCAAA
(GAATTCGCCACCATGtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgctcagtccaccattgaggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagccgaagacctgttctatcaaagttcact tgcttcttggaattataacaccaatattactgaagagaatgtccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgccttt ttaaaggaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctcacagtcaagcttcagctgcagg ctcttcagcaaaatgggtcttcagtgctctcagaagacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcac catctacagtactggaaaagtttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccaggtttgaatgaaataatg gcaaacagtttagactacaatgagaggctctgggcttgggaaagctggagatctgaggtcggcaagcagctgaggcc attatatgaagagtatgtggtcttgaaaaatgagatggcaagagcaaatcattatgaggactatggggattattggagag gagactatgaagtaaatggggtagatggctatgactacagccgcggccagttgattgaagatgtggaacatacctttga agagattaaaccattatatgaacatcttcatgcctatgtgagggcaaagttgatgaatgcctatccttcctatatcagtcca attggatgcctccctgctcatttgcttggtgatatgtggggtagattttggacaaatctgtactctttgacagttccctttgga cagaaaccaaacatagatgttactgatgcaatggtggaccaggcctgggatgcacagagaatattcaaggaggccga gaagttctttgtatctgttggtcttcctaatatgactcaaggattctgggaaaattccatgctaacggacccaggaaatgttc agaaagcagtctgccatcccacagcttgggacctggggaagggcgacttcaggatccttatgtgcacaaaggtgaca atggacgacttcctgacagctcatcatgagatggggcatatccagtatgatatggcatatgctgcacaaccttttctgcta agaaatggagctaatgaaggattccatgaagctgttggggaaatcatgtcactttctgcagccacacctaagcatttaaaatccattggtcttctgtcacccgattttcaagaagacaatgaaacagaaataaacttcctgctcaaacaagcactcacgat tgttgggactctgccatttacttacatgttagagaagtggaggtggatggtctttaaaggggaaattcccaaagaccagt ggatgaaaaagtggtgggagatgaagcgagagatagttggggtggtggaacctgtgccccatgatgaaacatactgt gaccccgcatctctgttccatgtttctaatgattactcattcattcgatattacacaaggaccctttaccaattccagtttcaa gaagcactttgtcaagcagctaaacatgaaggccctctgcacaaatgtgacatctcaaactctacagaagctggacag aaactgttcaatatgctgaggcttggaaaatcagaaccctggaccctagcattggaaaatgttgtaggagcaaagaaca tgaatgtaaggccactgctcaactactttgagcccttatttacctggctgaaagaccagaacaagaaCtcttttgtgggat ggagtaccgactggagtccatatgcagaccaaagcatcaaagtgaggataagcctaaaatcagctcttggagataaa gcatatgaatggaacgacaatgaaatgtacctgttccgatcatctgttgcatatgctatgaggcagtactttttaaaagtaa aaaatcagatgattctttttggggaggaggatgtgcgagtggctaatttgaaaccaagaatctcctttaatttctttgtcact gcacctaaaaatgtgtctgatatcattcctagaactgaagttgaaaaggccatcaggatgtcccggagccgtatcaatga tgctttccgtctgaatgacaacagcctagagtttctggggatacagccaacacttggacctcctaaccagccccctgtttc catatggctgattgtttttggagttgtgatgggagtgatagtggttggcattgtcatcctgatcttcactgggatcagagatc ggaagaagaaaaataaagcaagaagtggagaaaatccttatgcctccatcgatattagcaaaggagaaaataatcca ggattccaaaacactgatgatgttcagacctcctttTAGgcggccgc)
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(6)使用SpeI(NEB公司SpeI-HF，货号#R3133M)和AflII(NEB公司AflII(星选酶)，货号#R0520L)限制性内切酶对合成的pCAG-hACE2-N1 质粒载体进行双酶切，并进行胶回收反应，获得线性质粒pCAG-hACE2-N1 (如图2所示)，其中CMV增强子和鸡β-actin启动子为pCAG质粒上携带。
2、DNA显微注射和Founder小鼠的获得
(1)受精卵的获得：选4～5周龄C57BL/6JNifdc小鼠(以下简称C57小鼠)作为受精卵的供体小鼠，以10IU/只的剂量分别进行PMSG(pregnant mare Serum gonadotropin，孕马血清促性腺激素)(宁波第二激素厂)和hCG(human chorionic gonadotropin，人绒毛膜促性腺激素)(宁波第二激素厂)的注射，两种激素的注射间隔时间为46-48h，供体小鼠超排卵。hCG注射后立即与10 周龄以上健康雄性C57小鼠合笼10-12小时，至第二天早上8点，检栓取受精卵。
(2)将步骤1得到的的线性质粒pCAG-hACE2-N1以100ng/uL的注射到受精卵的细胞核中，并将注射后的受精卵移植到假孕昆明小鼠(KM小鼠) 体内，假孕昆明小鼠(KM小鼠)生成，获得Founder小鼠(其中假孕KM小鼠是通过将结扎雄性KM小鼠和雌性性KM小鼠交配获得)。
(3)将获得的Founder小鼠和其传代繁育的小鼠通过PCR方法进行基因型鉴定。
鉴定引物为hACE2-GI-F：5’-TGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCA-3’ (SEQ ID NO.5)，hACE2-GI-R：5’-CAGGTCTTCGGCTTCGTGGTTAA-3’ (SEQ ID NO.6)。
PCR总反应体积为20μL，其中含2×PCR Mix：2μL，上下游引物(100 pmol/μL)各1μL，基因组DNA：1μL，纯水(ddH2O)：7μL。PCR反应程序为：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，退火温度50℃，30s，72℃延伸，45s，30个循环；72℃继续延伸7min；扩增产物4℃保存。
PCR产物理论大小为163bp，有清晰明显条带，则小鼠基因型判定为阳性；无条带判定为阴性。如图3所示，E1、E8、E29、E32、E39为阳性，其余小鼠为阴性。
(4)Founder小鼠全部进行按支系传代后，感染新冠病毒，筛选出新冠病毒敏感且新冠病毒感染致死的hACE2小鼠支系进行保留，得到新冠病毒感染致死性小鼠动物模型。
实施例1，CMV hACE2小鼠SARS-CoV-2新冠病毒感染致死性验证
所有的小鼠均在军事医学科学院生物安全三级实验室生物安全柜内进行 SARS-CoV-2病毒感染实验。
(1)将各支系F2代基因型鉴定阳性、6-8周龄雄性CMV hACE2转基因小鼠和C57小鼠分为对照组、SARS-CoV-2感染组，每组3只。
(2)对小鼠进行称重，并腹腔注射1％戊巴比妥那溶液，注射剂量为100 mg/kg，即每10g动物体重注射0.1mL 1％戊巴比妥那溶液，观察小鼠呼吸，小鼠深度麻醉后进行后续手术操作。
(3)稀释SARS-CoV-2病毒(病毒毒株由军事医学科学院提供)：从-80℃冰箱取出装有SARS-CoV-2病毒的冻存管，用移液器量取病毒至含有适量 DMEM的冻存管中进行稀释，得到滴度为5×103PFU/ml的病毒液。
(4)取出麻醉好小鼠，鼻腔滴注40μL稀释好的SARS-CoV-2病毒，对照组小鼠滴鼻给予40μL DMEM溶液。等待小鼠从麻醉中恢复，将其放入鼠笼中饲养观察。
(5)连续7天观察动物SARS-CoV-2病毒感染后的状态和存活情况，保留7天内SARS-CoV-2病毒感染后全部死亡的支系。结果显示line3系(首建鼠编号E29)小鼠SARS-CoV-2病毒感染后7天内全部死亡，Line4系(首建鼠编号E32)小鼠和C57小鼠不死亡。
实施例2，CMV hACE2小鼠SARS-CoV-2病毒感染后病毒载量验证
(1)将Line3和Line4支系F2代基因型鉴定阳性、6-8周龄雄性CMV hACE2转基因小鼠和C57小鼠分别进行SARS-CoV-2感染，每组3只。
(2)对小鼠进行称重，并腹腔注射1％戊巴比妥那溶液，注射剂量为 100mg/kg，即每10g动物体重注射0.1mL 1％戊巴比妥那溶液，观察小鼠呼吸，小鼠深度麻醉后进行后续手术操作。
(3)稀释SARS-CoV-2病毒(病毒毒株由军事医学科学院提供)：从-80℃冰箱取出装有SARS-CoV-2病毒的冻存管，用移液器量取病毒至含有适量 DMEM的冻存管中进行稀释，得到滴度为5×103PFU/ml的病毒液。
(4)取出麻醉好小鼠，鼻腔滴注40μL稀释好的SARS-CoV-2病毒，对照组小鼠滴鼻给予40μL DMEM。等待小鼠从麻醉中恢复，将其放入鼠笼中饲养观察。
(5)病毒感染后第三天，在生物安全柜中对小鼠进行解剖，观察病毒感染增殖情况。取0.1g小鼠心、肝、肺、脑、鼻甲、气管、胃、小肠等组织，把组织剪碎放入无核酶的2mL离心管中，加100μL TRIzol(Thermo Fisher Scientific，货号15596026)及5～6个磁珠(去核酶)，于均质仪上研磨1min 左右。组织块充分研磨后，加入900μL TRIzol，颠倒混匀后冰上静置1min。
(6)加入200μL预冷的三氯甲烷，颠倒充分混匀，冰浴15min。12000 rpm、4℃离心15min。
(7)吸取上清液，加入等体积预冷的异丙醇，取颠倒充分混匀，-80℃冻存过夜。
(8)冰上溶解冻存的RNA混合液，12000rpm、4℃离心15min。
(9)出现白色沉淀后，弃上清。加500μL冷75％乙醇，用移液器吹打几次，使沉淀重悬，12000rpm、4℃离心10min。
(10)重复步骤(9)，弃掉上清液。
(11)12000rpm、4℃离心1min，弃掉上清液。
(12)在无核酶的环境下，开盖晾干沉淀(10min左右)，加DEPC(Diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)水冰上溶解。然后用测量RNA(ibonucleicAcid，核糖核酸)样品浓度和OD(optical density，光密度)值，评估RNA质量。
(13)以各组织的RNA为模板，用Taqman One-step RT-PCR Master Mix (TaKaRa)体系进行Real-Time PCR扩增。反应体系为：2×Taq PCR Master mix 12.5μL，逆转录酶0.5μL，Taq酶0.5μL，SARS-CoV-2病毒上下游引物和 Taqman探针各1.0μL(10μmol/L)，模版2.0μL，补水至25μL。反应程序为：RT 42℃，5min；94℃预变性，15s；PCR 95℃变性，5s，60℃退火延伸， 30s，40个循环。靶向检测片段为SARS-CoV-2E基因保守区112bp的基因。
(14)Real-Time PCR引物序列为：
E-Sarbeco-F:5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’(SEQ ID NO.8)；
E-Sarbeco-R：5’-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3’(SEQ ID NO.9)；
探针：5’FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BBQ 3’(SEQ ID NO.10)。
计算病毒拷贝数，并统计。
如图4所示，结果显示Line3系小鼠SARS-CoV-2病毒3天后肺、脑和鼻甲有病毒扩增，且肺脏病毒载量最高；而C57小鼠和Line4系小鼠SARS-CoV-2 病毒感染3天后组织内均无病毒扩增。因此，Line3系CMV hACE2小鼠为 SARS-CoV-2病毒感染致死性小鼠模型。
技术难度比较低，且获得的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型在新冠病毒感染验证上结果更好。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 斯贝福（北京）生物技术有限公司
<120> 一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法
<130> P20210148
<141> 2021-12-14
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaattcgcca ccatgtcaag ctcttc 26
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggccgcct aaaaggaggt ct 22
<210> 3
<211> 2438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaattcgcca ccatgtcaag ctcttcctgg ctccttctca gccttgttgc tgtaactgct 60
gctcagtcca ccattgagga acaggccaag acatttttgg acaagtttaa ccacgaagcc 120
gaagacctgt tctatcaaag ttcacttgct tcttggaatt ataacaccaa tattactgaa 180
gagaatgtcc aaaacatgaa taatgctggg gacaaatggt ctgccttttt aaaggaacag 240
tccacacttg cccaaatgta tccactacaa gaaattcaga atctcacagt caagcttcag 300
ctgcaggctc ttcagcaaaa tgggtcttca gtgctctcag aagacaagag caaacggttg 360
aacacaattc taaatacaat gagcaccatc tacagtactg gaaaagtttg taacccagat 420
aatccacaag aatgcttatt acttgaacca ggtttgaatg aaataatggc aaacagttta 480
gactacaatg agaggctctg ggcttgggaa agctggagat ctgaggtcgg caagcagctg 540
aggccattat atgaagagta tgtggtcttg aaaaatgaga tggcaagagc aaatcattat 600
gaggactatg gggattattg gagaggagac tatgaagtaa atggggtaga tggctatgac 660
tacagccgcg gccagttgat tgaagatgtg gaacatacct ttgaagagat taaaccatta 720
tatgaacatc ttcatgccta tgtgagggca aagttgatga atgcctatcc ttcctatatc 780
agtccaattg gatgcctccc tgctcatttg cttggtgata tgtggggtag attttggaca 840
aatctgtact ctttgacagt tccctttgga cagaaaccaa acatagatgt tactgatgca 900
atggtggacc aggcctggga tgcacagaga atattcaagg aggccgagaa gttctttgta 960
tctgttggtc ttcctaatat gactcaagga ttctgggaaa attccatgct aacggaccca 1020
ggaaatgttc agaaagcagt ctgccatccc acagcttggg acctggggaa gggcgacttc 1080
aggatcctta tgtgcacaaa ggtgacaatg gacgacttcc tgacagctca tcatgagatg 1140
gggcatatcc agtatgatat ggcatatgct gcacaacctt ttctgctaag aaatggagct 1200
aatgaaggat tccatgaagc tgttggggaa atcatgtcac tttctgcagc cacacctaag 1260
catttaaaat ccattggtct tctgtcaccc gattttcaag aagacaatga aacagaaata 1320
aacttcctgc tcaaacaagc actcacgatt gttgggactc tgccatttac ttacatgtta 1380
gagaagtgga ggtggatggt ctttaaaggg gaaattccca aagaccagtg gatgaaaaag 1440
tggtgggaga tgaagcgaga gatagttggg gtggtggaac ctgtgcccca tgatgaaaca 1500
tactgtgacc ccgcatctct gttccatgtt tctaatgatt actcattcat tcgatattac 1560
acaaggaccc tttaccaatt ccagtttcaa gaagcacttt gtcaagcagc taaacatgaa 1620
ggccctctgc acaaatgtga catctcaaac tctacagaag ctggacagaa actgttcaat 1680
atgctgaggc ttggaaaatc agaaccctgg accctagcat tggaaaatgt tgtaggagca 1740
aagaacatga atgtaaggcc actgctcaac tactttgagc ccttatttac ctggctgaaa 1800
gaccagaaca agaactcttt tgtgggatgg agtaccgact ggagtccata tgcagaccaa 1860
agcatcaaag tgaggataag cctaaaatca gctcttggag ataaagcata tgaatggaac 1920
gacaatgaaa tgtacctgtt ccgatcatct gttgcatatg ctatgaggca gtacttttta 1980
aaagtaaaaa atcagatgat tctttttggg gaggaggatg tgcgagtggc taatttgaaa 2040
ccaagaatct cctttaattt ctttgtcact gcacctaaaa atgtgtctga tatcattcct 2100
agaactgaag ttgaaaaggc catcaggatg tcccggagcc gtatcaatga tgctttccgt 2160
ctgaatgaca acagcctaga gtttctgggg atacagccaa cacttggacc tcctaaccag 2220
ccccctgttt ccatatggct gattgttttt ggagttgtga tgggagtgat agtggttggc 2280
attgtcatcc tgatcttcac tgggatcaga gatcggaaga agaaaaataa agcaagaagt 2340
ggagaaaatc cttatgcctc catcgatatt agcaaaggag aaaataatcc aggattccaa 2400
aacactgatg atgttcagac ctccttttag gcggccgc 2438
<210> 4
<211> 7464
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180
caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360
accatgggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 420
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 480
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc 660
cttcgccccg tgccccgctc cgcgccgcct cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg 720
cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct 780
tggtttaatg acggctcgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttaaa gggctccggg 840
agggcccttt gtgcgggggg gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg 900
agcgccgcgt gcggcccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc 960
tttgtgcgct ccgcgtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg 1020
gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg 1080
ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga 1140
gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc 1200
gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga 1260
gggctcgggg gaggggcgcg gcggccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc 1320
cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa 1380
atctggcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcgggcgaa 1440
gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg 1500
ccgtcccctt ctccatctcc agcctcgggg ctgccgcagg gggacggctg ccttcggggg 1560
ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct 1620
aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 1680
ctgtctcatc atttggcaaa gaattcgcca ccatgtcaag ctcttcctgg ctccttctca 1740
gccttgttgc tgtaactgct gctcagtcca ccattgagga acaggccaag acatttttgg 1800
acaagtttaa ccacgaagcc gaagacctgt tctatcaaag ttcacttgct tcttggaatt 1860
ataacaccaa tattactgaa gagaatgtcc aaaacatgaa taatgctggg gacaaatggt 1920
ctgccttttt aaaggaacag tccacacttg cccaaatgta tccactacaa gaaattcaga 1980
atctcacagt caagcttcag ctgcaggctc ttcagcaaaa tgggtcttca gtgctctcag 2040
aagacaagag caaacggttg aacacaattc taaatacaat gagcaccatc tacagtactg 2100
gaaaagtttg taacccagat aatccacaag aatgcttatt acttgaacca ggtttgaatg 2160
aaataatggc aaacagttta gactacaatg agaggctctg ggcttgggaa agctggagat 2220
ctgaggtcgg caagcagctg aggccattat atgaagagta tgtggtcttg aaaaatgaga 2280
tggcaagagc aaatcattat gaggactatg gggattattg gagaggagac tatgaagtaa 2340
atggggtaga tggctatgac tacagccgcg gccagttgat tgaagatgtg gaacatacct 2400
ttgaagagat taaaccatta tatgaacatc ttcatgccta tgtgagggca aagttgatga 2460
atgcctatcc ttcctatatc agtccaattg gatgcctccc tgctcatttg cttggtgata 2520
tgtggggtag attttggaca aatctgtact ctttgacagt tccctttgga cagaaaccaa 2580
acatagatgt tactgatgca atggtggacc aggcctggga tgcacagaga atattcaagg 2640
aggccgagaa gttctttgta tctgttggtc ttcctaatat gactcaagga ttctgggaaa 2700
attccatgct aacggaccca ggaaatgttc agaaagcagt ctgccatccc acagcttggg 2760
acctggggaa gggcgacttc aggatcctta tgtgcacaaa ggtgacaatg gacgacttcc 2820
tgacagctca tcatgagatg gggcatatcc agtatgatat ggcatatgct gcacaacctt 2880
ttctgctaag aaatggagct aatgaaggat tccatgaagc tgttggggaa atcatgtcac 2940
tttctgcagc cacacctaag catttaaaat ccattggtct tctgtcaccc gattttcaag 3000
aagacaatga aacagaaata aacttcctgc tcaaacaagc actcacgatt gttgggactc 3060
tgccatttac ttacatgtta gagaagtgga ggtggatggt ctttaaaggg gaaattccca 3120
aagaccagtg gatgaaaaag tggtgggaga tgaagcgaga gatagttggg gtggtggaac 3180
ctgtgcccca tgatgaaaca tactgtgacc ccgcatctct gttccatgtt tctaatgatt 3240
actcattcat tcgatattac acaaggaccc tttaccaatt ccagtttcaa gaagcacttt 3300
gtcaagcagc taaacatgaa ggccctctgc acaaatgtga catctcaaac tctacagaag 3360
ctggacagaa actgttcaat atgctgaggc ttggaaaatc agaaccctgg accctagcat 3420
tggaaaatgt tgtaggagca aagaacatga atgtaaggcc actgctcaac tactttgagc 3480
ccttatttac ctggctgaaa gaccagaaca agaactcttt tgtgggatgg agtaccgact 3540
ggagtccata tgcagaccaa agcatcaaag tgaggataag cctaaaatca gctcttggag 3600
ataaagcata tgaatggaac gacaatgaaa tgtacctgtt ccgatcatct gttgcatatg 3660
ctatgaggca gtacttttta aaagtaaaaa atcagatgat tctttttggg gaggaggatg 3720
tgcgagtggc taatttgaaa ccaagaatct cctttaattt ctttgtcact gcacctaaaa 3780
atgtgtctga tatcattcct agaactgaag ttgaaaaggc catcaggatg tcccggagcc 3840
gtatcaatga tgctttccgt ctgaatgaca acagcctaga gtttctgggg atacagccaa 3900
cacttggacc tcctaaccag ccccctgttt ccatatggct gattgttttt ggagttgtga 3960
tgggagtgat agtggttggc attgtcatcc tgatcttcac tgggatcaga gatcggaaga 4020
agaaaaataa agcaagaagt ggagaaaatc cttatgcctc catcgatatt agcaaaggag 4080
aaaataatcc aggattccaa aacactgatg atgttcagac ctccttttag gcggccgcga 4140
ctctagatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc 4200
ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt 4260
attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 4320
tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaaggcgta 4380
aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt 4440
ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat 4500
agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa 4560
cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta 4620
atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc 4680
ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc 4740
gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac 4800
acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 4860
gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 4920
acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtcctg aggcggaaag 4980
aaccagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 5040
agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 5100
tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 5160
cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 5220
ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 5280
cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaagatcg atcaagagac 5340
aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 5400
ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 5460
cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 5520
cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 5580
cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 5640
gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 5700
catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 5760
ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 5820
tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 5880
caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 5940
gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 6000
ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg 6060
cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 6120
cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc 6180
gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 6240
aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat 6300
ctcatgctgg agttcttcgc ccaccctagg gggaggctaa ctgaaacacg gaaggagaca 6360
ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca ataaaaagac agaataaaac gcacggtgtt 6420
gggtcgtttg ttcataaacg cggggttcgg tcccagggct ggcactctgt cgatacccca 6480
ccgagacccc attggggcca atacgcccgc gtttcttcct tttccccacc ccacccccca 6540
agttcgggtg aaggcccagg gctcgcagcc aacgtcgggg cggcaggccc tgccatagcc 6600
tcaggttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 6660
taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 6720
cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 6780
cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 6840
gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 6900
aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 6960
cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 7020
tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 7080
acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 7140
ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 7200
ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 7260
tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 7320
tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 7380
ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 7440
gataaccgta ttaccgccat gcat 7464
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgctggttat tgtgctgtct catca 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggtcttcg gcttcgtggt taa 23
<210> 7
<211> 5805
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc 60
cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca 120
ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt 180
caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg 240
ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag 300
tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt 360
accatgggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc ccccctcccc 420
acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg 480
ggggggggcg cgcgccaggc ggggcggggc ggggcgaggg gcggggcggg gcgaggcgga 540
gaggtgcggc ggcagccaat cagagcggcg cgctccgaaa gtttcctttt atggcgaggc 600
ggcggcggcg gcggccctat aaaaagcgaa gcgcgcggcg ggcgggagtc gctgcgttgc 660
cttcgccccg tgccccgctc cgcgccgcct cgcgccgccc gccccggctc tgactgaccg 720
cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt aattagcgct 780
tggtttaatg acggctcgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttaaa gggctccggg 840
agggcccttt gtgcgggggg gagcggctcg gggggtgcgt gcgtgtgtgt gtgcgtgggg 900
agcgccgcgt gcggcccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc ggcgcggggc 960
tttgtgcgct ccgcgtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg 1020
gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg 1080
ggtgtgggcg cggcggtcgg gctgtaaccc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga 1140
gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tgcggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc 1200
gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga 1260
gggctcgggg gaggggcgcg gcggccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc 1320
cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa 1380
atctggcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcgggcgaa 1440
gcggtgcggc gccggcagga aggaaatggg cggggagggc cttcgtgcgt cgccgcgccg 1500
ccgtcccctt ctccatctcc agcctcgggg ctgccgcagg gggacggctg ccttcggggg 1560
ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg cgtgtgaccg gcggctctag agcctctgct 1620
aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 1680
ctgtctcatc atttggcaaa gaattctgca gtcgacggta ccgcgggccc gggatccacc 1740
ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt 1800
cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga 1860
tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc 1920
ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga 1980
ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg 2040
caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg 2100
cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat 2160
cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa 2220
gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt 2280
gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc 2340
cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga 2400
tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct 2460
gtacaagtaa agcggccgcg actctagatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt 2520
ttacttgctt taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca 2580
attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc 2640
acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc 2700
atcaatgtat cttaaggcgt aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa 2760
tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa 2820
atcaaaagaa tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact 2880
attaaagaac gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc 2940
actacgtgaa ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa 3000
tcggaaccct aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc 3060
gagaaaggaa gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt 3120
cacgctgcgc gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtcagg 3180
tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 3240
aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 3300
gaagagtcct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 3360
tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 3420
aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 3480
tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 3540
tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 3600
gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 3660
tgcaaagatc gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 3720
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 3780
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 3840
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct 3900
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 3960
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct 4020
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 4080
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 4140
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 4200
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac 4260
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 4320
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 4380
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 4440
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg 4500
actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat 4560
tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg 4620
atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccctag ggggaggcta 4680
actgaaacac ggaaggagac aataccggaa ggaacccgcg ctatgacggc aataaaaaga 4740
cagaataaaa cgcacggtgt tgggtcgttt gttcataaac gcggggttcg gtcccagggc 4800
tggcactctg tcgatacccc accgagaccc cattggggcc aatacgcccg cgtttcttcc 4860
ttttccccac cccacccccc aagttcgggt gaaggcccag ggctcgcagc caacgtcggg 4920
gcggcaggcc ctgccatagc ctcaggttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4980
catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 5040
ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 5100
tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 5160
ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 5220
ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 5280
ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 5340
gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 5400
aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5460
acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5520
gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5580
gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5640
cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5700
aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct 5760
gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcca tgcat 5805
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acactagcca tccttactgc gcttcg 26
Claims (10)
1.一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以化学合成的人ACE2基因CDS区序列为模板，进行hACE2基因序列扩增，得到hACE2扩增产物；
(2)使用EcoRI限制性内切酶和NotI限制性内切酶对pCAG-EGFP-N1质粒进行酶切；
(3)使用EcoRI限制性内切酶和NotI限制性内切酶对步骤(1)得到的hACE2扩增产物进行酶切；
(4)胶回收步骤(2)酶切的pCAG-EGFP-N1质粒载体，得到pCAG-EGFP-N1的DNA片段，胶回收步骤(3)酶切的hACE2扩增产物，得到hACE2的DNA片段；
(5)使用连接酶将步骤(4)得到的pCAG-EGFP-N1的DNA片段和hACE2的DNA片段酶连接，得到pCAG-hACE2-N1质粒载体；
(6)使用SpeI限制性内切酶和AflII限制性内切酶对步骤(5)得到的pCAG-hACE2-N1质粒载体进行酶切；
(7)胶回收步骤(6)酶切的pCAG-hACE2-N1质粒载体，得到线性化的注射DNA片段。
(8)取小鼠受精卵，将步骤(7)得到的注射DNA片段注射到小鼠受精卵的细胞核内，将注射后的小鼠受精卵移植到假孕小鼠的体内，得到首建鼠，首建鼠进行传代；
(9)步骤(8)得到的首建鼠传代繁育的小鼠感染新冠病毒，筛选出新冠病毒感染致死的小鼠，得到新冠病毒感染致死性小鼠动物模型。
2.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)的扩增体系中包括基因正向引物序列、基因反向引物序列和PCR反应体系，其中
基因正向引物序列hACE2-F：SEQ ID NO.1，
基因反向引物序列hACE2-R：SEQ ID NO.2。
3.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中得到的所述hACE2扩增产物的序列为SEQ ID NO.3。
4.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)得到pCAG-hACE2-N1质粒载体的序列为SEQ ID NO.4。
5.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述pCAG-EGFP-N1的DNA片段和所述hACE2的DNA片段通过T4 DNA连接酶进行酶连接。
6.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(8)得到的首建鼠和步骤(9)中传代繁育的小鼠在感染新冠病毒前进行基因型鉴定。
7.根据权利要求6所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述首建鼠和所述传代繁育的小鼠通过PCR方法进行基因型鉴定，其中正向鉴定引物序列为SEQ ID NO.5，反向鉴定引物序列为SEQ ID NO.6。
8.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(8)中所述注射DNA片段以100ng/uL的浓度注射到小鼠受精卵的细胞核内。
9.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(8)中小鼠受精卵的获取，包括以下步骤：取4-5周龄的雌性小鼠，注射孕马血清促性腺激素10IU，间隔46-48小时后，注射人绒毛膜促性腺激素10IU，注射激素后的雌性小鼠与10周龄以上雄性小鼠合笼10-12小时，检栓，取受精卵。
10.一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型，其特征在于，根据权利要求1-9任一项所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法构建。
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| CN114350706A true CN114350706A (zh) | 2022-04-15 |
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