KR100958161B1 - 청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 이용하여 제조된 넉아웃벡터, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 동물세포에서유전자를 넉아웃 시키는 방법 - Google Patents
청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 이용하여 제조된 넉아웃벡터, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 동물세포에서유전자를 넉아웃 시키는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 이용하여 제조된 넉아웃 벡터, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 동물세포에서 유전자를 넉아웃 시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 넉아웃 벡터의 레포터로 청색형광단백질을 사용하되, 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 개시코돈을 청색형광단백질 유전자의 개시코돈을 포함하는 ORF(Open Reading Frame) 서열로 대체하고, 넉아웃 유전자의 프로모터 서열과 융합시켜 넉아웃 벡터를 제조하고, 상기 넉아웃 벡터를 동물세포에 도입하여 특정 유전자의 기능을 넉아웃 시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 청색형광단백질을 레포터로 이용하는 넉아웃 벡터에 있어서, 넉아웃 유전자의 개시코돈인 ATG를 청색형광단백질의 개시코돈을 포함한 ORF로 대체하고, 상기 ORF를 넉아웃 유전자의 프로모터 서열에 연결함으로써 기존의 IRES 시스템 보다 안정적이고 효과적으로 레포터가 발현되는 뛰어난 효과가 있다.
청색형광단백질(CFP) 레포터(reporter) 넉인벡터(knock-in vector), 넉아웃 벡터(knock-out vector), 넉아웃 유전자
Description
본 발명은 청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 이용하여 제조된 넉아웃 벡터, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 동물세포에서 유전자를 넉아웃 시키는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 넉아웃 벡터의 레포터로 청색형광단백질을 사용하되, 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 개시코돈을 청색형광단백질 유전자의 개시코돈을 포함하는 ORF(Open Reading Frame) 서열로 대체하고, 넉아웃 유전자의 프로모터 서열과 융합시켜 넉아웃 벡터를 제조하고, 상기 넉아웃 벡터를 동물세포에 도입하여 특정 유전자의 기능을 넉아웃 시키는 방법에 관한 것이다.
유전자의 기능을 연구하기 위한 가장 직접적이고도 효율적인 방법은 그 유전자를 제거(knock-out)한 형질전환체를 통해 그 표현형을 조사하는 것이다. 특정유 전자의 발현을 제거한 동물을 만들기 위해서는 통상 양성 선택 마커(positive selection marker)와 음성 선택 마커(negative selection marker)가 들어가 있는 넉아웃(knock-out) 벡터를 이용하여 그 전략을 디자인한다. 양성 선택 마커는 동종 재조합(homologus recombination)에 이용될 2군데의 유전자군 사이에 위치하며 음성 선택 마커는 2개 유전자군의 좌측 혹은 우측에 놓인다. 이를 통해 동종 재조합이 일어난 줄기세포(embryonic stem cells)는 양성 선택 마커에 의해 살아갈 수 있으며, 동종 재조합에 의하지 않고 무작위적으로 삽입된 벡터는 음성 선택 마커에 의해 살지 못하게 하는 2중의 선택을 통해 원하는 줄기세포를 얻을 수 있도록 고안되어 있다.
그러나, 이러한 줄기세포를 이용하여 유전자 넉아웃 형질전환동물을 제작하는 데는 시간과 인적자원 그리고 매우 많은 비용이 든다는 문제점이 있다. 이 기술이 개발된 지 근 30여 년이 되고 있지만 아직 그 효용면에서는 크게 개선되고 있지 못한 실정이며 따라서 세계적으로도 그렇게 널리 이용되고 있지 못한 것이 현실이다. 그 중에서도 가장 중요한 문제점 중의 하나는 많은 수의 유전자 넉아웃 형질전환동물들이 뚜렷한 표현형을 보이지 못함으로써 보고조차 되지 못하고 있다는 것이다. 이를 통계적으로 나타낼 수 있는 자료는 보고된 바 없지만, 10마리 중 7∼8마리는 표현형을 뚜렷하게 찾을 수 없는 관계로 학계에 보고조차 되고 있지 못하는 것으로 추정되고 있다.
한편, 형질전환된 생명체에서 그들의 표현형이 분석되는 유전자를 "레포터(reporter) 유전자"라 하는데, 조절지역의 유전자 삭제여부, 즉 유전자 넉아웃 분석에 이용된다. 삭제여부 분석을 수행하기 전에 클로닝된 유전자의 발현에 대한 결손의 효과를 분석하는 방법이 결정되어야 하는데, 그 효과는 그 유전자를 그 유전자의 기원이 되는 종에 클로닝하여야만 관찰될 수 있다. 만약 어떤 식물 유전자가 박테리아에 클로닝되면, 식물에서의 빛에 대한 조절연구에는 적당치 않다. 최근 모든 개체의 유전자에 적용될 수 있는 클로닝 벡터가 개발되어 본래의 숙주로의 유전자 클로닝이 용이하게 되었다. 그러나, 대부분의 경우 숙주는 이미 클로닝된 유전자와 동일한 복사체를 지니고 있다는 문제점이 있어 클로닝된 유전자의 발현양상에서의 변화를 숙주 내의 유전자의 복사체에 대한 정상적인 발현양상과 구별하기 위하여 레포터 유전자를 사용하는 것이다. 이는 연구하고자 하는 유전자의 앞부분에 위치하는 테스트 유전자로서, 바람직하게는 원래의 클로닝된 유전자를 대체한다. 숙주에 클로닝되었을 레포터 유전자의 발현양상은 원래의 유전자와 동일한 조절에 의해 조절되므로 원래의 유전자의 것과 거의 유사하게 된다.
레포터 유전자를 선택하는 첫 번째 조건으로는 레포터 유전자가 숙주에서 발현되지 않는 표현형을 나타낼 수 있어야 하며, 숙주로 클로닝 되었을 때 검정하기 용이하고 그 표현형을 정량적으로 분석 가능해야 한다. 이러한 조건을 충족시키는 다양한 레포터 유전자가 유전자 조절에 관한 연구를 위해 이용되고 있는데, 그 중 LacZ(β-Galactosidase)와 형광단백질(fluorescence protein)들이 많이 이용된다. 특히, 형광단백질은 레포터로서 숙주세포에 발현되지 않으며, 누구나 쉽게 검정이 용이하여 가장 널리 사용되는 레포터 중 하나이다.
이러한 레포터의 안정적 발현을 위해 기존에는 IRES (Internal Ribosome Entry Segment)를 이용하여 레포터 유전자를 발현시키는 시스템이 널리 이용되어 왔으나, 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 개시코돈인 ATG로부터 레포터 유전자를 발현시킬 수 있는 시스템이 없다. IRES는 전사체의 번역(translation) 시 라이보좀 복합체가 번역진행의 시작으로 인식하는 염기서열을 일컫는 것으로, 주로 넉아웃 유전자의 엑손(exon) 사이에 레포터와 함께 클로닝되어 사용된다. 따라서, 사용하는 IRES의 종류 및 넉아웃되는 유전자에 따라서 레포터의 발현이 영향을 받는 경우가 많은 단점이 있다.
따라서, 본 발명은 종래기술의 단점을 개선하고자 안출한 것으로, 청색형광단백질을 레포터로 사용하여 동물에서 특정 유전자를 넉아웃 시키고자 할 때 IRES가 없이도 레포터 유전자가 안정하게 효율적으로 발현할 수 있는 청색형광단백질 레포터 넉인벡터 및 이를 이용하여 제작한 넉아웃 벡터를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 넉아웃 벡터를 이용하여 동물세포에서 유전자를 넉아웃 시키는 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열목록 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는 "CFPKI-PS"라 명명된 청색형광단백질(CFP, Cyan Fluorescent Protein) 레포터 넉인벡터(knock-in vector)를 제공한다.
또한, 본 발명은 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 개시코돈 ATG를 청색형광단백질 유전자의 개시코돈을 포함하는 ORF(Open Reading Frame) 서열로 대체한 것을 특징으로 하는 청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터(knock-out vector)를 제공한다.
또한, 본 발명은
i) 개시코돈인 ATG를 포함하는 청색형광단백질(CFP) 유전자 서열을 변이시켜 서열번호 2에 기재된 CFP 유전자의 ORF 서열을 제조하는 단계;
ii) 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 프로모터 서열 및 이에 연결되는, 상기 i) 단계에서 CFP ORF 서열 제조 시 결실된 CFP의 5' 말단부의 결실된 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; 및
iii) 상기 i) 단계에서 제조된 CFP의 ORF 서열의 5' 말단 쪽에 ii) 단계에서 제조한 프로모터 서열 및 폴리뉴클레오티드를 연결하는 단계를 포함하는,
청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 넉아웃 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 분리된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 넉아웃 벡터를 이용하여 동종 재조합 방법에 의해 인간을 제외한 포유동물 게놈상의 유전자를 넉아웃 시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자의 넉아웃 방법에 따라 수득될 수 있는 Rhox2 (Reproductive Homeobox 2)의 기능이 넉아웃된, 인간을 제외한 형질전환 동물을 제공한다.
본 발명은 넉아웃 동물을 제작함에 있어 특정 유전자를 넉아웃 시키고자 할 때 청색형광단백질을 레포터로 이용하되, 넉아웃 유전자의 개시코돈인 ATG를 청색형광단백질의 개시코돈을 포함한 ORF로 대체하고, 상기 ORF를 넉아웃 유전자의 프 로모터 서열과 연결함으로써 기존의 IRES 시스템보다 안정적이고 효과적으로 레포터가 발현되는 뛰어난 효과가 있다.
또한, 본 발명의 청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 넉아웃 동물개발에 이용할 경우 넉아웃 유전자의 발현 패턴에 대해 정확한 고찰이 가능해지며, 이를 통해 유전자의 기능연구에 매우 유용한 정보를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명자는 청색형광단백질 ORF(Open Reading Frame)에 PmlI 절단 부위를 첨가시킨 청색형광단백질 발현벡터를 제작하고, 유전자 특이적인 프라이머 디자인과 PCR(Polymerase chain reaction)을 이용하여 최종적으로 청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 제작하였다. 이러한 청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 넉아웃 동물개발 등에 이용할 시 넉아웃 유전자의 발현패턴에 대한 정확한 고찰이 가능해지며, 이를 통해 유전자의 기능연구에 매우 유용한 정보를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 서열목록 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는, 청색형광단백질 레포터 넉인벡터(knock-in vector, 이하 "CFP 레포터 넉인벡터"라고도 함), CFPKI-PS vector를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, phrGFPⅡ-C벡터(Stratagene, Cat. number: 240144)를 주형으로 하고 서열번호 3 및 4의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 이용한 돌연변이 스트랜드 합성반응을 실시하여 얻은 PCR 산물을 Top10 컴피턴트 세포에 형질전환시켜 CFP의 ORF 내에 PmlI 절단부위를 포함하는 클론을 확보하고 이를 "CFPKI-PmlI 벡터"로 명명한다. 다음으로, CFPKI- PmlI 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 5 및 6의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 이용한 돌연변이 스트랜드 합성반응을 실시하여 얻은 PCR 산물을 Top10 컴피턴트 세포에 형질전환시켜 SalI 절단부위를 포함하는 클론을 확보하고 이를 "CFPKI-S 벡터"로 명명한다. 끝으로, CFPKI-S 벡터를 주형으로 하고, 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 이용한 돌연변이 스트랜드 합성반응을 실시하여 얻은 PCR 산물을 Top10 컴피턴트 세포에 형질전환시켜 PacI 절단부위를 포함하는 클론을 확보하여 최종적으로 CFP 레포터 넉인벡터인,"CFPKI-PS 벡터"를 제작한다(도 1).
본 발명에서 유전자 "넉아웃(knock-out)" 이라 함은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미하며, 유전자 "넉인(knock-in)" 이란 특정 외래 유전자가 발현될 수 있도록 숙주의 게놈상에 도입되는 것을 의미한다.
본 발명에서 "ORF(Open Reading Frame)"이라 함은 코딩서열(coding sequence, CDS)을 나타내는 것으로 단백질 합성에서 주형(template)이 되는 부분을 말한다.
본 발명에서 “레포터(reporter) 유전자”라 함은 형질전환된 생명체에서 그들의 표현형이 분석되는 유전자로서, 조절지역의 유전자 삭제여부, 즉 유전자 넉아 웃 분석에 이용된다. 본 발명은 동물세포인 숙주세포에서 원래 발현되지 않고 검정이 용이하여 유전자의 넉아웃 양상을 확인하기 위한 레포터로서 적절한 CFP 유전자를 레포터 유전자로 사용하되, CFP 의 ORF의 개시코돈인 ATG 를 변형시켜 PmlI 절단부위를 첨가시킨 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 가진다.
본 발명에서 “PmlI 절단부위”라 함은 PmlI 제한효소에 의해 자를 수 있는 DNA 부위를 말하며, CAC/GTG 부위를 말한다.
본 발명의 CFP 레포터 넉인벡터는 넉아웃 유전자의 개시코돈인 ATG로부터 CFP의 개시코돈을 포함한 ORF가 쉽게 대체될 수 있도록 고안된 것으로, 이를 이용하여 넉아웃 벡터를 제조하는 경우 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 발현을 효과적으로 제거함과 동시에 넉아웃 유전자의 발현이 CFP 유전자의 발현으로 대체될 수 있도록 함으로써, CFP 유전자가 보다 안정적으로 클로닝되고, 레포터의 발현이 보다 안정적이고 효율적으로 이루어질 수 있게 된다.
또한, 본 발명은 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 개시코돈인 ATG를 청색형광단백질 유전자의 개시코돈을 포함하는 ORF(Open Reading Frame) 서열로 대체한 것을 특징으로 하는 청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터(knock-out vector)를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 넉아웃 벡터는 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 개시코돈인 ATG가 CFP 유전자의 개시코돈인 ATG를 포함하는 ORF로 대체되도록 디자인한 것으로, CFP의 개시코돈인 ATG 를 변형시켜 PmlI 절단부위를 첨가한 CFP 레포터 넉인벡터를 제작함으로써, 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 염기서열에 관계없이 모든 유전자에 대해 그 유전자의 개시코돈인 ATG로부터 CFP의 ORF를 용이하게 대체시킬 수 있는 방법이 가능해 지도록 한 것이다.
또한, 본 발명의 넉아웃 벡터는 CFP의 ORF가 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 프로모터 서열에 연결되도록 제작한 것으로, 상기 프로모터는 5' 말단 쪽에 제한효소 자리를 갖도록 고안된 5'-프라이머(서열번호 12)와 CFP 레포터 넉인벡터 제조 시 결실된 CFP의 5' 말단 쪽 폴리뉴클레오티드(서열번호 10)를 포함하도록 고안된 3'-프라이머(서열번호 13)를 이용하여 PCR 증폭시켜 얻으며, 서열번호 11에 기재된 것을 사용한다. 또한, 기존의 IRES 대신에 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 프로모터 서열과 청색형광단백질 레포터 유전자의 ORF 서열이 직접 연결되어 있으므로, IRES의 종류 및 넉아웃 유전자에 따른 레포터 유전자의 발현에 대한 영향을 제거하여 레포터 유전자가 보다 안정적으로 클로닝되고, 레포터 유전자의 발현이 안정적이고 효율적으로 이루어질 수 있도록 하였다.
본 발명의 넉아웃 시키고자 하는 유전자는 Rhox2이나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 넉아웃 벡터는 CFP의 ORF의 3' 말단 쪽에 넉아웃 유전자의 3' 말단부의 염기서열을 추가로 연결할 수 있다. 다시 말해, CFP의 ORF가 넉아웃 유전자의 프로모터 서열에 융합됨으로써 결실되는 넉아웃 유전자의 엑손을 제외한 나머지 엑손 부위를 말하는 것이다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 3' 말단부 염기서열은 Rhox2의 엑손 4를 포함한다.
본 발명에서 "벡터"라 함은 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있고, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란, 일반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어, 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 본 발명 에 따르면, 넉아웃 벡터는 선택마커로 MCI neo(MCI promoter; neo: poly A-less neomycin resistant gene) 및 PGK-DTA(PGK: phosphoglycerate kinase promoter; DTA: diphtheria toxin-A chain gene) 서열을 포함한다.
본 발명의 목적에 따라 숙주가 동물세포인 경우 적합한 시그널 서열로는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 넉아웃 벡터는 숙주세포 내로 형질전환, 형질감염 또는 감염되어 레포터 유전자를 발현할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 숙주세포는 R1 생쥐 배아줄기세포이나, 넉아웃 벡터를 도입하여 레포터 유전자를 발현할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은
i) 개시코돈인 ATG를 포함하는 청색형광단백질(CFP) 유전자 서열을 변이시켜 서열번호 2에 기재된 CFP 유전자의 ORF 서열을 제조하는 단계;
ii) 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 프로모터 서열 및 이에 연결되는, 상기 i) 단계에서 CFP ORF 서열 제조 시 결실된 CFP의 5' 말단부의 결실된 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; 및
iii) 상기 i) 단계에서 제조된 CFP의 ORF 서열의 5' 말단 쪽에 ii) 단계에서 제조한 프로모터 서열 및 폴리뉴클레오티드를 연결하는 단계를 포함하는,
청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, Rhox2 유전자의 개시코돈 ATG로부터 5'-업스트림으로 약 3.3kb 되는 부분(프모모터 서열, 서열번호 11)을 증폭하기 위해 프라이머를 고안하고(서열번호 12 및 13), 이를 이용하여 PCR 증폭시켜 약 3.3kb의 프로모터 서열(서열번호 14)을 준비하고, CFP 넉인 벡터에 포함된 CFP 유전자의 5' 말단부 쪽에 클로닝한다.
상기 프로모터 서열을 증폭하기 위한 5'-프라이머(서열번호 12)는 CFP 레포터 넉인벡터와의 재조합이 가능하도록 고안된 제한효소 자리, 예를 들어 KpnI에 해당하는 염기서열(GGT ACC)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 3'-프라이머(서열번호 13)는 CFP의 5' 말단 쪽 결실된 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 고안된 것으로, 본 발명에 따르면, CAT(서열번호 10)의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
클로닝된 재조합 넉인벡터의 5'-아암(arm)은 넉아웃에 사용된 기본벡터인 Osdupde1 벡터에 클로닝되고, Rhox2 유전자의 엑손 4가 포함된 약 3.1kb의 재조합 넉인벡터의 3'-아암은 상기 5'-아암이 클로닝된 Osdupde1 벡터의 CFP 유전자 뒷부분에 바로 클로닝하여 넉아웃 벡터를 제조한다.
또한, 본 발명은 상기 넉아웃 벡터를 이용하여 동종 재조합 방법에 의해 인간을 제외한 포유동물 게놈상의 유전자를 넉아웃 시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 Rhox2 넉아웃 벡터를 R1 생쥐 배아줄기세포에 도입하여 동종 재조합을 유도한다. 이러한 동종 재조합에 의해 Rhox2 유전자 개시코돈 ATG로부터 CFP 개시코돈인 ATG를 시작으로 청색형광단백질 전체 ORF로 대체된다.
넉아웃 벡타제작의 정확성 여부는 청색형광단백질의 발현 여부에 따라 나타나는 형광도를 측정하여 확인하는 것이 바람직하며, 배아줄기세포를 이용한 넉아웃 클론도 넉아웃 유전자가 배아줄기세포에 발현한다면 청색형광단백질의 발현 여부로 쉽고 정확하게 확인이 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 유전자의 넉아웃 방법에 따라 수득될 수 있는 Rhox2의 기능이 넉아웃된, 인간을 제외한 형질전환 동물을 제공한다.
바람직하게는, 넉아웃 형질전환 동물 제작 시, 넉아웃 유전자와 동종 동물을 넉아웃 대상동물로 선택하는 것이 좋다. 예를 들어, Rhox2 유전자가 마우스인 경우, 넉아웃 대상 동물로 마우스를 선택한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<실시예 1> CFP 레포터 넉인벡터의 제작
phrGFPⅡ-C 벡터(Stratagene, Cat. number: 240144)로부터 돌연변이(mutagenesis)를 통해 PmlI, SalI, PacI 절단부위를 phrGFPⅡ-C 벡터에 삽입하여 CFPKI-PS 벡터(CFP 레포터 넉인벡터)를 제작하였다.
구체적으로, phrGFPⅡ-C 벡터에 PmlI 절단부위를 첨가하기 위해 프라이머(서열번호 3 및 4)를 제작하고, 돌연변이(mutagenesis)는 QuikChange®Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene, Cat. Number: 200518)를 사용하였으며 사용 설명서에 따라 실시하였다(표 1 참조). PCR 산물을 Top10 컴피턴트 세포(competent cell)에 형질전환하여 PmlI 절단부위가 성공적으로 만들어진 클론을 확보하였고, 염기서열분석을 통해 최종적으로 확인하고, "CFPKI-PmlI 벡터"라고 명명하였다.
다음으로, CFPKI-PmlI 벡터에 SalI 절단부위를 첨가하기 위해 프라이머(서열번호 5 및 6)를 이용하여 상기와 같이 돌연변이를 실시하였다(표 1). PCR 산물을 Top10 컴피턴트 세포에 형질전환하여 SalI 절단부위가 성공적으로 만들어진 클론을 확보하였고, 염기서열분석을 통해 최종적으로 확인하고, "CFPKI-S 벡터"라 명명하였다.
마지막으로. CFPKI-S 벡터에 PacI 절단부위를 첨가하기 위해 프라이머(서열번호 7 및 8)를 이용하여 상기와 같이 돌연변이를 실시하였다(표 1). PCR 산물을 Top10 컴피턴트 세포에 형질전환하여 PacI 절단부위가 성공적으로 만들어진 클론을 확보하였고, 염기서열분석을 통해 최종적으로 확인함으로써, PmlI, SalI 및 PacI 절단부위를 포함하는 4.8kb의 CFP 레포터 넉인벡터인 CFPKI-PS 벡터를 완성하였다(도 1). 상기 벡터의 염기서열은 서열번호 1로 나타내었으며, 변이된 CFP의 ORF는 서열번호 2에 나타내었다.
도 1과 같이, CFP의 ORF에 PmlI 절단부위가 첨가된 새로운 CFP 레포터 넉인벡터를 제조함으로써, 넉아웃 유전자의 염기서열에 관계없이 모든 넉아웃 유전자에 대해 개시코돈인 ATG로부터 CFP의 ORF로 대체시킬 수 있는 방법이 가능토록 하였다. 이하 실시예를 통해 그 방법을 설명한다.
<실시예 2> CFP 레포터 넉인벡터를 이용한 넉아웃 벡터의 제작
실시예 1에서 제작한 CFP 레포터 넉인벡터를 넉아웃 유전자의 프로모터 서열과 이에 연결되는 CFP 유전자의 ATG로부터 실시예 1의 CFP 레포터 넉인벡터 제작 시 결실되었던 CFP ORF의 5' 말단 염기서열을 포함하는 유전자 조각과 연결하여 넉아웃 벡터를 클로닝 하였다.
우선, CFP 레포터 넉인벡터에 포함된 CFP 유전자의 5' 말단과 연결하여 넉아웃 유전자의 개시코돈을 CFP의 개시코돈을 포함한 ORF로 전환할 수 있도록 프라이머를 고안하였다(도 2).
5' 프라이머 내에 박스로 표시된 염기서열(AAG CTT) 부분은 CFP 레포터 넉인벡터의 클로닝 부분에 사용될 수 있는 제한효소 중 유용한 제한효소를 선택하여 사용하도록 고안한 것으로, HindIII, Kpn I, BamHI, SmaI 등을 사용할 수 있으며, 이들 특정 제한효소로 제한되지 아니한다. 제한효소가 적절하게 작동될 수 있도록 5' 말단에 3개의 염기서열(CCG)을 첨가하여 디자인하였다(서열번호 9). 3' 쪽은 넉아웃 유전자의 5' 단편의 5'쪽의 염기서열(프로모터 서열)에 해당한다.
3' 프라이머에서 노란색 염기서열(CAT, 서열번호 10) 부분은 CFP 레포터 넉인벡터 제조 시 삭제되었던 CFP ORF의 5' 말단 쪽 ATG 염기서열을 나타내는 것이다. 이의 보완을 통해 완전한 CFP ORF를 만들고 레포터로서의 발현을 확인하였다. 상기 3bp 염기서열과 함께 넉아웃 유전자의 개시코돈인 ATG의 5' 방향 염기서열을 이용하여 프라이머를 디자인하였다.
이로써, 넉아웃 유전자의 염기서열에 관계없이 넉아웃 유전자의 ATG로부터 CFP의 ORF가 치환되어 레포터로 발현될 수 있게 하였다.
마우스의 Rhox2 유전자를 넉아웃시키고 이의 발현양상을 CFP 레포터 넉인을 이용하여 알아보고자 넉아웃 벡터를 고안하였다.
Rhox2 유전자의 개시코돈 ATG로부터 5'-업스트림으로 약 3.3kb 되는 부분(3267bp 단편, 서열번호 11)을 상기 고안된 프라이머 중 KpnI 제한효소 자리를 갖도록 고안된 5'-프라이머(서열번호 12: Rhox2/KO/5'-1: 5'- CCGGGTACCAAACATTGCACACCAGGTGTC -3')와 CFP의 5' 말단 쪽의 결실된 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 고안된 3'-프라이머(서열번호 13: Rhox2/KO/3'-1: 5'- CATGTCTGTAAAGCCGTGGAAG-3')를 이용하여 주형 0.5㎕(10ng of plasmid DNA), 프라이머 쌍(10pmole) 1㎕/1㎕, 10×buffer 2.5㎕, dNTP(10mM) 1㎕, Taq Polymerase 0.5㎕(2.5U) 및 dH2O 18.5㎕로 총 25㎕의 반응액을 제조하여, 94℃, 2분; 94℃, 60초/60℃, 60초/ 72℃, 2분으로 30 사이클; 72℃, 10분의 조건으로 PCR 증폭시켰다.
PCR 산물(서열번호 14)을 KpnI 제한효소로 처리하고, 실시예 1에서 제조한 CFP 레포터 넉인벡터의 CFP 유전자의 5' 말단 쪽을 KpnI/PmlI로 절단한 후 클로닝 하였다.
이렇게 클로닝된 재조합벡터의 5'-아암은 넉아웃에 사용된 기본벡터인 OsdupdeI(미국 National Institutes of Health의 Heiner Westphal 박사로부터 기증 받음)의 MCS1의 KpnI 와 PacI 사이트 사이에 클로닝되었다. 또한, Rhox2 유전자의 엑손 4가 포함된 약 3.1kb(3088bp 단편, 서열번호 15)의 재조합벡터의 3'-아암은 PmlI/XbaI으로 절단하여 상기 5'-아암이 클로닝된 OsdupdeI 벡터의 MCS2의 PmlI 사이트에 클로닝되어 CFP 유전자 뒷부분에 위치하게 하였다(도 3).
이렇게 제작된 Rhox2 넉아웃 벡터를 R1 생쥐 배아줄기세포(Heiner Westphal 박사로부터 기증받음)에 도입하여 동종 재조합을 유도하였고, 5'-프로브 및 3'-프로브를 이용하여 써던 블롯을 수행하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, R1 생쥐 배아줄기세포의 클론번호(39, 42, 43)은 넉아웃 벡터와 동종 재조합이 일어난 것으로 확인되었고, 클론번호(40, 41, 44)은 음성이었다. 총 91개의 클론 중 18개의 클론에서 동종재조합에 의해 Rhox2의 개시코돈인 ATG 부터 청색형광단백질의 ORF로 대체된 것을 확인하였다.
상기 넉아웃된 게놈 DNA 벡터를 생쥐섬유아세포 (MEF; mouse embryonic fibroblast)에 통상의 방법에 따라 트랜스펙션하여 형광도를 측정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, CFP 레포터 넉인벡터가 들어있지 않은 벡터가 트랜스펙션된 경우, 형광도가 전혀 나타나지 않는 반면, CFP 레포터 넉인벡터가 트랜스펙션된 경우에는 Rhox2 프로모터에 의해 CFP의 형광이 나타남을 확인할 수 있었다.
도 1은 PmlI 절단부위를 포함하는 청색형광단백질(CFP) 레포터가 삽입되어 있는 CFP 레포터 넉인벡터의 개열지도를 도시한 것이다.
도 2는 CFP 레포터 넉인벡터를 이용하여 넉아웃 벡터를 제조하기 위해 넉아웃 유전자의 개시코돈인 ATG로부터 CFP의 개시코돈과 CFP 레포터 넉인벡터 제조 시 결실된 3개 염기서열을 포함하는 재조합벡터의 5' 말단 유전자 조각을 만들기 위한 프라이머 디자인 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 CFP 레포터 넉인벡터를 이용하여 Rhox2 유전자를 넉아웃 시키기 위한 넉아웃 벡터를 클로닝하는 전 과정을 나타내는 벡터제작 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 배아줄기세포에서 본 발명의 넉아웃 벡터와 동종 재조합이 일어난 것을 보이는 써던 블롯 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 넉아웃 벡터를 MEF (mouse embryonic fibroblast) 세포에 트랜스펙션하여 형광도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
<120> A knock-out vector constructed by using CFP reporter knock-in
vector and methods for preparing thereof and knocking out gene in
animal
<160> 15
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 4849
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFPKI-PS knock-in vector
<220>
<221> variation
<222> (778)..(783)
<223> PmlI site
<220>
<221> variation
<222> (1780)..(1785)
<223> SalI site
<220>
<221> variation
<222> (1804)..(1809)
<223> PacI site
<220>
<221> gene
<222> (887)..(1497)
<223> Open Reading Frame of Cyan Fluorescent Protein
<400> 1
aggcgcgccg cgatgtacgg gccagattta cgcgttgaca ttgattattg actagttatt 60
aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat 120
aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa 180
taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg 240
agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc 300
cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct 360
tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga 420
tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa 480
gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc 540
caaaatgtcg taacaactcc gccccattga agcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg 600
aggtctatat aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg 660
aaattaatac gactcactat agggagaccc aagcttctgg aggcccgggc tttcagggta 720
ccgaagaagg atccaaggag gaattctgca gatatccatc acactggcgg ccgcacccac 780
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 840
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 900
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 960
gtgaccaccc tgacctgggg cgtgcagtgc ttcgcccgct accccgacca catgaagcag 1020
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 1080
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 1140
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 1200
ctggagtaca acgccatcag cgacaacgtc tatatcaccg ccgacaagca gaagaacggc 1260
atcaaggcca acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 1320
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 1380
ctgagcaccc agtccaagct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 1440
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaagct 1500
cgagcatgca tctagagggc cctattccct ttagtgaggg ttaattgcta gagctcgctg 1560
atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 1620
ttccttgacc ctggaaggtg ccactctcac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 1680
atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa 1740
gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggcg tcgacgcgcg taaattgtaa 1800
gcgttaatta attgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc 1860
aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga 1920
gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag 1980
ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt 2040
ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta 2100
gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag 2160
cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg 2220
cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa 2280
cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac 2340
cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagaatcc tgaggcggaa agaaccagct 2400
gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat 2460
gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc 2520
aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac 2580
tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga 2640
ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 2700
cctaggcttt tgcaaagatc gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 2760
aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 2820
gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 2880
gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg 2940
cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 3000
tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 3060
catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 3120
atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 3180
cacgtactcg gatggaagcc ggtcttctcg atcaggatga tctggacgaa gaacatcagg 3240
ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc 3300
tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 3360
ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 3420
ctacccgtga tattgctgaa gaacttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 3480
acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 3540
tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg 3600
agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga 3660
cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccctag 3720
ggggaggcta actgaaacac ggaaggagac aataccggaa ggaacccgcg ctatgacggc 3780
aataaaaaga cagaataaaa cgcacggtgt tgggtcgttt gttcataaac gcggggttcg 3840
gtcccagggc tggcactctg tcgatacccc accgagaccc cattggggcc aatacgcccg 3900
cgtttcttcc ttttccccac cccacccccc aagttcgggt gaaggcccag ggctcgcagc 3960
caacgtcggg gcggcaggcc ctgccatagc ctcaggttac tcatatatac tttagattga 4020
tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 4080
gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 4140
caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 4200
accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 4260
ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt 4320
aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 4380
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 4440
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 4500
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 4560
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 4620
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 4680
ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 4740
aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 4800
gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcc 4849
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Open Reading Frame of Cyan Fluorescent protein
<400> 2
cacgtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgacctg gggcgtgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaacgccat cagcgacaac gtctatatca ccgccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg ccaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccaa gctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
720
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFPKI-PmlI-5'
<400> 3
actggcggcc gcacccacgt gagcaagggc gag 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFPKI-PmlI-3'
<400> 4
ctcgcccttg ctcacgtggg tgcggccgcc agt 33
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFPKI-SI-5'
<400> 5
gcatgctggg gcgtcgacgc gcgtaaattg taagc 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFPKI-SI-3'
<400> 6
gcttacaatt tacgcgcgtc gacgccccag catgc 35
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFPKI-PacI-5'
<400> 7
cgcgcgtaaa ttgtaagcgt taattaattg ttaaaattcg c 41
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CFPKI-PacI-3'
<400> 8
gcgaatttta acaattaatt aacgcttaca atttacgcgc g 41
<210> 9
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5'primer: designed by containing restriction site
<400> 9
ccgggtacc 9
<210> 10
<211> 3
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer: designed by containing polynucleotides deleted from
ORF of CFP
<400> 10
cat 3
<210> 11
<211> 3267
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(3267)
<223> promoter of Rhox2
<400> 11
accaaacatt gcacaccagg tgtctgtctc tactgtagag ccctctgcag atacttatca 60
gcatttttgg gcagatgcag cagcatggtc ctgagagtta tcatgacggg tgtccgtatc 120
tgcttggctt cactaggcac ctccaaacag caggaggact ggattctatg atttccccat 180
gcccacagtc tctgtttaac caagtttaca tcagctttct gtgtgcctgg ctctgactga 240
gaactaaccg tttgtggtgc acttaaattg ctcctataag gttagaattt atgcttagtt 300
ttcactattt caattcttta ggatcagggt tatctccagt aatatgattc ttatttatat 360
aatttatatt tcataacccc agtgggatgt ctcataattg atatcccgaa gatatcaatg 420
ttttaaagaa tttcatatat atgtatatat gtgagtttga atatcaattt tattaataca 480
agtattaatg catagagagt atatggtaca atatatattt gtagtttata tgcaagatac 540
atctatatct gatctgtgtg tgtgtgtgtt ctgtgttcct ttgagaagct gtgctctgtg 600
ttaaaatgag ccatttcaag ttggttgggg tctcttattc aattatatac tcagaaagaa 660
cataaggctc aaaagtcatt ataaggaggc tgtagagaag agttaagagc acttgatgct 720
cttgtagggg aagaaccaag tttggttcct agcccatgca taaccactcc taaatccagg 780
gaatttcata tcctcttctc tctctgagaa cacctgcaca catgctccat gcacacacag 840
gcaaatctat atacgtgaat gaaaattata aaaagatttt aaaaatttca ttttgaaaca 900
tagcacttaa aacaccacca ccagcagcac caggaccacc accaccactt tgcgcctagg 960
ttaaaagtat ccaagataag aatcaagttc tacaatggct ctcctgtcaa aatgtcttct 1020
tctccttacc ataactctgg cttcactcac acctatccat cttgccagat gtcttctggg 1080
ggaaaaatag cagatattca gtattgggca ttttgaaaga aatgaaaagc tccagcaaag 1140
agaaggagaa catccttgtg acaaagagac tgcatacaga atggtggaaa aacctttgcc 1200
aactataatt ctgtcaaagt gttggtgtct agaatataca aagaacctta aaaactaaat 1260
ggcaggaaaa catgcaccca gttaaacatt tcagcttgaa ttagacaggg agtactcaca 1320
agggccctgt gtatatgaat tcatcccctg tgactactta taaaagccct gcacagaaaa 1380
aggctagcca aaacgctaag gcgaatagga gaaagccttg ggaatgtcca ttcaaatggt 1440
aagggtgacc attgacttca gctgggggaa ggagagtcac tttgctgcca tggtaacatc 1500
atgaagatgt tatgcatgct ccagtaatgg tcttacatca gtatacacac aggcagcaaa 1560
aaggagacta agtagatgtt aaaaacataa aataggaaga gagaagtaga gaggaacagg 1620
gcaggggtaa ttggagcaaa gaaaatgtga gggtgtattt gagctgctgc attataagca 1680
aggatgcaat gctcagacag taaaattaga taaaatgtaa atcaattcgg ccgctcactg 1740
tatgacagga tagtagatga atgagaattg ttaagctgaa acgaatgccc tatatttttt 1800
ttgacacata aactcatgtc tcaggaaatt accttattga gacataacct tgttaaagaa 1860
aaacttctgt atacactcag taactaaaga tggtttggaa aagctgagca gcctgcctct 1920
ctctgccagt gctcacatta caggcactgc ggcattgagc ctccatgctt gctccttcag 1980
tgctccaggt aaaccatggg tggctttata catgttaggt aagactctgc aaactgagct 2040
acatctccag caataaacat atgtcgtcac tatttttcca gactggagag ataaattctc 2100
cagtacttga cactgacaag agcaatgcca ggatttagag caaagaggaa agaaaatcta 2160
ggaaagagaa acatgtaggc tttgttgtga ggtagttatc agagctgtcc aaggagaact 2220
gcagcaccag gagtccactc caaacaaggg acagtgtgga aaaatgatag tggtgcaggg 2280
ccttctattt gggtggatga ggtgaagaac tctgtgtgta ggatcaggaa cggaggcaac 2340
atttgcaata tatatatata catatactca cacacacaca tccccacaca cataattgac 2400
cagaccatgg gaaaatatgg ctgccttacg atgagtctga ctacattcca atgtaggatc 2460
tgtttgaatg acagttccag gacgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtc 2520
caagacaaat gtgaggaagt tcagcacagg taggacaatt ctcacggctt ttacaagcac 2580
ttatcaaagc ctgagagtaa ttctaactcc tccccagaaa ccctggcgaa ggtgagtcct 2640
ctgtgctctc tgtagagcca gcagggcctg caattctgcc caagctcccg taaaggccgt 2700
cctggaagca ggatacacta cgtgaacttc actttctgtg aaagccctaa ggaagaacct 2760
cccacataga atcattagct tatatccggt ctcagccatg gatcagggat gcaatgtgga 2820
gaaatagacg aagcggtatt gtccacacat ttccgcaagg cctccggagg tacagaggta 2880
tcttttctta ctccccgcaa atgggtttcc tcagtgaact gccatctctt ccttaggaag 2940
ttaattaaac aaggcaggag gactcagcga agatgcaaag tggaagcccc taatatacct 3000
gacttgcaaa gaggaaccat catttccttc taataattcc tgctctgtta acctttccac 3060
tgtcctgagt tttgcagcgt ggacttcagt cgcagcaaca ggagtacaac cagaaggcag 3120
gacacactac cataattgga tatatgctaa tattgaagat ggggaccgga ggtgtggcgg 3180
cagaccattg gtggcttaga agctctactt ccggaattgt tggggggtgt aacagtgaat 3240
aaggacttcc acggctttac agacatg 3267
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rhox2/KO/5'-1
<400> 12
ccgggtacca aacattgcac accaggtgtc 30
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rhox2/KO/3-1
<400> 13
catgtctgta aagccgtgga ag 22
<210> 14
<211> 3273
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(3273)
<223> promoter region of Rhox2 containing PCR primer sequence
<400> 14
ccgggtacca aacattgcac accaggtgtc tgtctctact gtagagccct ctgcagatac 60
ttatcagcat ttttgggcag atgcagcagc atggtcctga gagttatcat gacgggtgtc 120
cgtatctgct tggcttcact aggcacctcc aaacagcagg aggactggat tctatgattt 180
ccccatgccc acagtctctg tttaaccaag tttacatcag ctttctgtgt gcctggctct 240
gactgagaac taaccgtttg tggtgcactt aaattgctcc tataaggtta gaatttatgc 300
ttagttttca ctatttcaat tctttaggat cagggttatc tccagtaata tgattcttat 360
ttatataatt tatatttcat aaccccagtg ggatgtctca taattgatat cccgaagata 420
tcaatgtttt aaagaatttc atatatatgt atatatgtga gtttgaatat caattttatt 480
aatacaagta ttaatgcata gagagtatat ggtacaatat atatttgtag tttatatgca 540
agatacatct atatctgatc tgtgtgtgtg tgtgttctgt gttcctttga gaagctgtgc 600
tctgtgttaa aatgagccat ttcaagttgg ttggggtctc ttattcaatt atatactcag 660
aaagaacata aggctcaaaa gtcattataa ggaggctgta gagaagagtt aagagcactt 720
gatgctcttg taggggaaga accaagtttg gttcctagcc catgcataac cactcctaaa 780
tccagggaat ttcatatcct cttctctctc tgagaacacc tgcacacatg ctccatgcac 840
acacaggcaa atctatatac gtgaatgaaa attataaaaa gattttaaaa atttcatttt 900
gaaacatagc acttaaaaca ccaccaccag cagcaccagg accaccacca ccactttgcg 960
cctaggttaa aagtatccaa gataagaatc aagttctaca atggctctcc tgtcaaaatg 1020
tcttcttctc cttaccataa ctctggcttc actcacacct atccatcttg ccagatgtct 1080
tctgggggaa aaatagcaga tattcagtat tgggcatttt gaaagaaatg aaaagctcca 1140
gcaaagagaa ggagaacatc cttgtgacaa agagactgca tacagaatgg tggaaaaacc 1200
tttgccaact ataattctgt caaagtgttg gtgtctagaa tatacaaaga accttaaaaa 1260
ctaaatggca ggaaaacatg cacccagtta aacatttcag cttgaattag acagggagta 1320
ctcacaaggg ccctgtgtat atgaattcat cccctgtgac tacttataaa agccctgcac 1380
agaaaaaggc tagccaaaac gctaaggcga ataggagaaa gccttgggaa tgtccattca 1440
aatggtaagg gtgaccattg acttcagctg ggggaaggag agtcactttg ctgccatggt 1500
aacatcatga agatgttatg catgctccag taatggtctt acatcagtat acacacaggc 1560
agcaaaaagg agactaagta gatgttaaaa acataaaata ggaagagaga agtagagagg 1620
aacagggcag gggtaattgg agcaaagaaa atgtgagggt gtatttgagc tgctgcatta 1680
taagcaagga tgcaatgctc agacagtaaa attagataaa atgtaaatca attcggccgc 1740
tcactgtatg acaggatagt agatgaatga gaattgttaa gctgaaacga atgccctata 1800
ttttttttga cacataaact catgtctcag gaaattacct tattgagaca taaccttgtt 1860
aaagaaaaac ttctgtatac actcagtaac taaagatggt ttggaaaagc tgagcagcct 1920
gcctctctct gccagtgctc acattacagg cactgcggca ttgagcctcc atgcttgctc 1980
cttcagtgct ccaggtaaac catgggtggc tttatacatg ttaggtaaga ctctgcaaac 2040
tgagctacat ctccagcaat aaacatatgt cgtcactatt tttccagact ggagagataa 2100
attctccagt acttgacact gacaagagca atgccaggat ttagagcaaa gaggaaagaa 2160
aatctaggaa agagaaacat gtaggctttg ttgtgaggta gttatcagag ctgtccaagg 2220
agaactgcag caccaggagt ccactccaaa caagggacag tgtggaaaaa tgatagtggt 2280
gcagggcctt ctatttgggt ggatgaggtg aagaactctg tgtgtaggat caggaacgga 2340
ggcaacattt gcaatatata tatatacata tactcacaca cacacatccc cacacacata 2400
attgaccaga ccatgggaaa atatggctgc cttacgatga gtctgactac attccaatgt 2460
aggatctgtt tgaatgacag ttccaggacg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 2520
tgtgtccaag acaaatgtga ggaagttcag cacaggtagg acaattctca cggcttttac 2580
aagcacttat caaagcctga gagtaattct aactcctccc cagaaaccct ggcgaaggtg 2640
agtcctctgt gctctctgta gagccagcag ggcctgcaat tctgcccaag ctcccgtaaa 2700
ggccgtcctg gaagcaggat acactacgtg aacttcactt tctgtgaaag ccctaaggaa 2760
gaacctccca catagaatca ttagcttata tccggtctca gccatggatc agggatgcaa 2820
tgtggagaaa tagacgaagc ggtattgtcc acacatttcc gcaaggcctc cggaggtaca 2880
gaggtatctt ttcttactcc ccgcaaatgg gtttcctcag tgaactgcca tctcttcctt 2940
aggaagttaa ttaaacaagg caggaggact cagcgaagat gcaaagtgga agcccctaat 3000
atacctgact tgcaaagagg aaccatcatt tccttctaat aattcctgct ctgttaacct 3060
ttccactgtc ctgagttttg cagcgtggac ttcagtcgca gcaacaggag tacaaccaga 3120
aggcaggaca cactaccata attggatata tgctaatatt gaagatgggg accggaggtg 3180
tggcggcaga ccattggtgg cttagaagct ctacttccgg aattgttggg gggtgtaaca 3240
gtgaataagg acttccacgg ctttacagac atg 3273
<210> 15
<211> 3088
<212> DNA
<213> Mus sp.
<220>
<221> exon
<222> (1)..(3088)
<223> 3' arm of Rhox2 genomic DNA including Exon 4
<400> 15
cacgtggtgt gtatgttcta cttggggatg agacttcttc aatctcttgt tttctatgct 60
ttgatcagta gaagatctct atgtcgatca ctactcaaag tagaagtttc tctgatgaga 120
gctgagaact gcaataatta gaatgataca acattagttg tcagtttaat gctatgctga 180
catggcagag taataggaag agggtcttcc cctaggattt gtctaggtta agtttcttag 240
ccctaataat ggtgccaggt ccagttttca acgtgtggag tagacctgaa ttcaattgaa 300
aaactagttg attactacaa ataggaaacg aatactgtag attctttctg gtttttatta 360
agtacttcaa ctataatact agtggtttac tcttgtctac caattctttt tttcacaatg 420
actgtaggaa tggtttttga agaggagaga gaaatacagg agttataaga ggctgtaaag 480
gctcagaggt cctcttcctg cattccggag catctctctg tgaaggctgt ggagaagccc 540
caggcagcca cccatgctca agtcactgta gacagacgat gttgtgccgc caaagccctg 600
ttacaacaca gttatctcct caatacttgt atttgcaata aagagctgaa ttctcaatac 660
atttgttttg tgcttcttct gagattgtta agatacatgt ctcatatcag ggaaatgcca 720
tttaaacacg agaagatctg tttcaaggag gtaacatctg tgcatcccag tcagtaagcc 780
ctgtggatta cagcgacttt ccaacatcca tagtagctgt accctgacac aagtgctctt 840
ttttggcaac ccctcttact gttctcacca tgactcttat tccaggcaaa tttacaagag 900
agatgatgca ggacccaagg agaaacagca gtctcttcca aactcaggtg atgcatgcca 960
ccctggcccc ttctcaagat ttcattccag ccctgaactc tgacagaacc ttcatttgag 1020
agaacccaca gggttcacag gacacaagca atgatgtagg aagtacattc ctcccaatta 1080
ttttccttgc cttcattttt ttctgtgaac ctttggggcc atatgtggca tgagacaaca 1140
gttaattctg tcataggtct taggtttagc ttccaccatc atgctgttat tacacactta 1200
gtccctcagc ccttgcattt ccaacaaaga gctgagttct caatatatct gtatcaagtg 1260
tcttctgaga cctttaagga atatgtctaa attaccaagg caatgtcatt taatcagaca 1320
aggcagatgt gacttttctt ggttctgata gttcagagga tctccacttt ccttgcaaat 1380
atttcattct cttccattca tttaaaaaat tcgattaaat gttttaaatg aaaatgaaga 1440
aaagctatca tgcagtggta cagacagtgg agtccttcca tagggaagtg agggtagaca 1500
caacaagtgc tgagcaccat ggccaggagc tgtaatcaca gcacttcaga agtggacttt 1560
tgaatgaagt ggccctcgtt ggccacacag caagttcaag aacagcctgc atgcactaaa 1620
tgaggcctcc atctcacttt taaatgtggg gctgggaaat ggttcagtag ggaaagtgac 1680
tgccagccag caggaagaca tgattgtgac ccccaacata aatgtaaaac agtagccaac 1740
atttcagtct ggatactgag acagagaaag gtggcttcaa agagggtgct ggtcatcctg 1800
ccgagttata actgtgggtt gaggtttaga gacataatgg gatccagaag aggctaacct 1860
agggatggct agagagatgt ctctgcagta agagtacatg ctgctcttgc acagggtcta 1920
agcttgaatc ccaacacaca caacatatag tcaaaatggc atgtaactca agctctatgt 1980
gatctgacac tcttctggct tttacagcca tccagacata tgtgcacaaa ccaccatcag 2040
gcacacatat atgtacatca ttgataaatg aaaatcaagg gtctggagag tatgtacttg 2100
tcttccagag gactcagata gactcctgtc gacctcctgc accaggaggc tcacaaccat 2160
ctctcacttc agctccaaga aacacaacag tctgccttgt aggcatctgt acatatacac 2220
acacacacac acacacacac acacacacac acacacacgc acgcacgcac gcacgcacac 2280
gcacacgcac acgcacacac ttgctgttaa agtaacaaaa ataaatttta aaaaacttac 2340
aataatatgc aaagtgctag aggttgtcgc tcaatgttga cctctgccca gacttgtgaa 2400
cagatgggtt cccatcttga aaatacatgt gtaaacacat ggacagacta cacatgcata 2460
gggtgaaaat tgttttaagt aaaagagaga attcagtcat gtatttggat tgagacacta 2520
aacttttaat acttccacta taaatgttgt aaaaaaaaaa ggttaatgga atttataaca 2580
aaggaattag aggaactcaa gagaaaagtg ttgacaaagg atatcaaact gttttccata 2640
taacaaataa acattcacaa gaaatataaa aaaataaaaa ttctataaat aaaaaataac 2700
ataaggactg atgaggtagc tgtgaacata aaatattttg ccagcagttc taatgacccg 2760
atttccatac ccaggaccca cataatggaa ggagagaaag ttgtcctatg atatccacat 2820
aggaagcact ggtcccttcc cctcagcaat aaataaatga attaaaagta tatatcctaa 2880
cagcattatt tataaagcaa tgacaaataa ctatattgaa taaaaatcac tgcagcagcc 2940
aataagagaa ctgggtagtc ttgaagatgg gtcagttgag agtactcagt ctgagaaatg 3000
gaaataagag aagagggtag tcttgaagat gggtcagttg agagtactca gtctgagaaa 3060
tggaaataag agaagagggt agtctaga 3088
Claims (17)
- 서열목록 서열번호 1에 기재된 염기서열을 가지는, 청색형광단백질(CFP, Cyan Fluorescent protein) 레포터 넉인벡터(knock-in vector).
- 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 개시코돈인 ATG를 청색형광단백질 유전자의 개시코돈을 포함하는 ORF(Open Reading Frame) 서열로 대체한 것을 특징으로 하는 청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터(knock-out vector).
- 제2항에 있어서,청색형광단백질의 ORF 서열은 서열번호 2에 기재된 것임을 특징으로 하는 넉아웃 벡터.
- 제2항에 있어서,청색형광단백질 유전자의 개시코돈은 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 프로모터 서열에 융합되는 것을 특징으로 하는 넉아웃 벡터.
- 제4항에 있어서,프로모터 서열은 서열번호 11에 기재된 것임을 특징으로 하는 넉아웃 벡터.
- 제2항에 있어서,넉아웃 시키고자 하는 유전자가 Rhox2인 것을 특징으로 하는 넉아웃 벡터.
- i) 개시코돈인 ATG를 포함하는 청색형광단백질(CFP) 유전자 서열을 변이시켜 서열번호 2에 기재된 CFP 유전자의 ORF 서열을 제조하는 단계;ii) 넉아웃 시키고자 하는 유전자의 프로모터 서열 및 이에 연결되는, 상기 i) 단계에서 CFP ORF 서열 제조 시 결실된 CFP의 5' 말단부의 결실된 염기로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계; 및iii) 상기 i) 단계에서 제조된 CFP의 ORF 서열의 5' 말단 쪽에 ii) 단계에서 제조한 프로모터 서열 및 폴리뉴클레오티드를 연결하는 단계를 포함하는,청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터의 제조방법.
- 제7항에 있어서,프로모터 서열은 서열번호 11에 기재된 염기서열인 것을 특징으로 하는 청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터의 제조방법.
- 제7항에 있어서,폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 10에 기재된 염기서열인 것을 특징으로 하는 청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터의 제조방법.
- 제7항에 있어서,넉아웃 시키고자 하는 유전자가 Rhox2인 것을 특징으로 하는 청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터의 제조방법.
- 제7항에 있어서,CFP의 ORF의 3' 말단 쪽에, CFP의 ORF의 삽입으로 인해 결실되는 엑손을 제외한 넉아웃 유전자의 3' 말단부의 나머지 엑손의 염기서열을 연결하는 단계를 추가로 포함하는 청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터의 제조방법.
- 제11항에 있어서,넉아웃 유전자의 3' 말단부의 염기서열은 서열번호 15에 기재된 것임을 특징으로 하는 청색형광단백질 레포터 유전자를 포함하는 넉아웃 벡터의 제조방법.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 넉아웃 벡터로 형질전환, 형질감염 또는 감염된 분리된 숙주세포.
- 제13항에 있어서,R1 생쥐 배아줄기세포인 숙주세포.
- 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 넉아웃 벡터를 이용하여 동종 재 조합 방법에 의해 인간을 제외한 포유동물 게놈 상의 유전자를 넉아웃 시키는 방법.
- 제15항에 있어서,청색형광단백질의 발현 여부에 따라 나타나는 형광도를 측정하여 넉아웃 여부를 확인하는 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 포유동물 게놈상의 유전자를 넉아웃 시키는 방법.
- 제15항의 방법에 따라 수득될 수 있는 Rhox2의 기능이 넉아웃된, 인간을 제외한 형질전환 동물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080024871A KR100958161B1 (ko) | 2008-03-18 | 2008-03-18 | 청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 이용하여 제조된 넉아웃벡터, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 동물세포에서유전자를 넉아웃 시키는 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080024871A KR100958161B1 (ko) | 2008-03-18 | 2008-03-18 | 청색형광단백질 레포터 넉인벡터를 이용하여 제조된 넉아웃벡터, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 동물세포에서유전자를 넉아웃 시키는 방법 |
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| KR20090099719A KR20090099719A (ko) | 2009-09-23 |
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-
2008
- 2008-03-18 KR KR1020080024871A patent/KR100958161B1/ko not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
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|---|
| Accession No: DQ092365 |
| Accession No: TRU90717 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| KR20090099719A (ko) | 2009-09-23 |
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