RU2791051C2 - Оболочечный вирус, резистентный к инактивации комплементом, для лечения злокачественных новообразований - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению слитого белка, содержащего последовательность CD55, и может быть использовано для лечения опухолевых заболеваний с помощью онколитических вирусов. Рекомбинантным путем получают слитый белок, который содержит последовательность пептида CD55, линкерную последовательность и последовательности трансмембранного и внутриклеточного доменов CD8. Изобретение позволяет получить слитый белок, содержащий CD55, который способен ингибировать систему комплимента человека, обеспечивая оболочечному онколитическому вирусу, содержащему слитый белок на своей мембране, устойчивость к инактивации нормальной сывороткой человека и улучшенные клинические свойства. 7 н. и 20 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 4 пр.

Description

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Список последовательностей, поданный в электронном виде в форме текстового файла Annex C/ST.25 и имеющий регистрационный номер 21003-PCT, является частью описания.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проводят тестирования онколитических вирусов в качестве средств для лечения злокачественных новообразований, инфицирующих и разрушающих опухолевые клетки. Эти онколитические вирусы включают вирус болезни Ньюкасл, аденовирус, вирус Синдбис, вирус осповакцины, вирус герпеса и т.д. Вирус болезни Ньюкасл (NDV) обладает большим потенциалом в отношении уменьшения опухоли у пациентов со злокачественными новообразованиями благодаря его уникальному свойству преференциальной репликации в опухолевых клетках и их лизиса, вероятно, вследствие того, что большинство опухолевых клеток имеют дефектный интерфероновый путь (Pecora et al., 2002; Laurie et al., 2006; Lorence et al., 2007). Несмотря на многообещающие предварительные клинические результаты, NDV в качестве противоопухолевого терапевтического средства имеет недостаток: большинство частиц NDV неизбежно будут разрушаться под действием врожденной иммунной системы пациента, альтернативного пути комплемента, после проникновения вирусов в организм пациента.

Система комплемента является частью врожденной и адаптивной иммунной системы (см. обзор Volanakis, J.E., 1998. Chapter 2 в The Human Complement System in Health and Disease под редакцией J. E. Volanakis и M.M. Frank. Marcel Dekker, Inc., New York pp 9-32). Комплемент играет важную роль в уничтожении микроорганизмов и транспорте и выведении иммунных комплексов. Многие из продуктов активации системы комплемента также связаны с провоспалительными или иммунорегуляторными функциями. Система комплемента состоит из белков плазмы и мембрано-ассоциированных белков, объединенных в три каскада ферментативной активации: классический, лектиновый и альтернативный пути. Все три пути могут приводить к образованию терминального комплекса комплемента/мембраноатакующего комплекса (TCC/MAC) и ряда биологически активных продуктов.

Клетки и органы человека содержат семейство мембраносвязанных регуляторных белков комплемента для их защиты от гомологичного комплемент-опосредованного лизиса. Эти регуляторные белки комплемента включают CD55 (комплементзамисимый стимулятор гемолиза, DAF), CD46 (мембранный кофакторный белок, MCP), CD35 (рецептор комплемента 1, CR1), и CD59 (мембранный ингибитор реактивного лизиса) (Carroll et al., 1988; Rey-Campos et al., 1988; Lublin et al., 1989; Morgan et al., 1994; Kim and Song, 2006).

CD55 является гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-заякоренным белком и прикрепляется к плазматической мембране через гликолипидный остаток (GPI-якорь) на его C-конце. GPI-заякоренные белки, такие как CD55, могут подвергаться эндоцитозу и деградировать или расщепляться и высвобождаться из плазматической мембраны клетки (Censullo and Davitz, 1994a, 1994b; Turner 1994). Например, GPI-заякоренные белки, включая CD55, могут высвобождаться с поверхности клетки под действием GPI-специфических фосфолипаз C и D (Turner 1994). Эта ферментативная активность, вероятно, контролирует катаболизм GPI-заякоренных белков и регулирует экспрессию белков на поверхности клетки (Censullo and Davitz, 1994b).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному слитому белку, содержащему: (a) последовательность пептида CD55, (b) линкерную последовательность, C-концевую относительно последовательности CD55, (c) трансмембранный домен, C-концевой относительно линкерной последовательности, и (d) внутриклеточный домен, C-концевой относительно трансмембранного домена, где слитый белок не содержит GPI-якорь. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам и экспрессирующим векторам, кодирующим белок, клеткам, экспрессирующим белок, оболочечным вирусам, включающим белок на вирусной мембране, фармацевтическим композициям, содержащим вирус, включающий белок, по настоящему изобретению, а также способам лечения и применению вируса.

Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того, что вирус, экспрессирующий слитый белок по настоящему изобретению, являлся резистентным к инактивации нормальной сывороткой человека, о чем свидетельствует более высокий коэффициент выделения по сравнению с вирусом, не экспрессирующим слитый белок. Онколитический оболочечный вирус, продуцируемый сконструированными клетками по изобретению, включающий ингибитор комплемента в форме рекомбинантного слитого белка на вирусной мембране, является улучшенным противоопухолевым терапевтическим средством и обеспечивает лучшие клинические исходы у пациентов со злокачественными новообразованиями по сравнению с соответствующим вирусом, в котором отсутствует ингибитор комплемента на вирусной мембране, благодаря способности к выживанию в сыворотке человека до достижения очага опухоли. Преимущество является трехкратным: 1) онколитический вирус можно получать в системе культивирования клеток в биореакторе; 2) необходимо меньше вирусных частиц для достижения той же терапевтической эффективности по сравнению с родительским онколитическим вирусом, получаемым с помощью куриных яиц; 3) С помощью инфузии меньшего количества вирусных частиц пациенту со злокачественным новообразованием можно снижать побочные эффекты, ассоциированные с большими количествами вирусных частиц, такие как цитокиновая буря или эффекты, связанные с примесями.

В других исследованиях эффектов регуляторного белка комплемента CD55 в отношении защиты вируса болезни Ньюкасл (NDV) (Biswas et al., 2012; Rangaswamy et al., 2016) использовали нативный немодифицированный CD55, включающий гликозилфосфатидил-инозитоловый (GPI) якорь. В отличие от этого, слитый белок по настоящему изобретению не включает GPI-якорь. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что невключение GPI-якоря изменяло динамику катаболизма CD55 на поверхности клетки. Слитый белок по настоящему изобретению был способен противостоять инактивирующим условиям сильнее, чем белки, используемые Biswas и Rangaswamy. Biswas использовал в анализах активации 5-10% нормальной сыворотки человека, а Rangaswamy использовал 0,3-5% нормальной сыворотки человека. В приведенном ниже примере использовали 40% нормальной сыворотки человека для осуществления анализа инактивации NDV, включающего рекомбинантный слитый белок.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Клетка млекопитающего, экспрессирующая последовательность конструкции, кодирующей рекомбинантный комплемент-ингибирующий слитый белок, состоящий из секреторного сигнального пептида, четырех коротких консенсусных повторов (SCR) CD55, гибкого линкера, трансмембранного домена CD8 и укороченного внутриклеточного домена CD8 с последующим селективным маркером IRES-neo и синтетическим сигналом полиаденилирования (поли-A).

Фигура 2. Диаграмма, на которой представлена ориентация зрелого комплемент-ингибирующего слитого белка на мембране сконструированной клетки DF1 или модифицированной мембране NDV.

Фигура 3. Экспрессия рекомбинантного комплемент-ингибирующего слитого белка на поверхности клетки. Анализ экспрессии слитого белка посредством проточной цитометрии с использованием CD55-специфического антитела. На гистограмме слева представлены наивные клетки DF1 в качестве отрицательного контроля. На гистограмме справа представлены клетки DF1, стабильно экспрессирующие SEQ ID NO: 2 (клон клетки № 8).

Фигура 4. Анализ цитотоксичности NDV, продуцируемого сконструированными клетками DF1 (клон № 8), включающего комплемент-ингибирующий слитый белок, в линиях опухолевых клеток.

Фигура 5. Аминокислотная последовательность рекомбинантного комплемент-ингибирующего слитого белка, состоящего из секреторного сигнального пептида, четырех коротких консенсусных повторов (SCR) CD55, гибкого линкера, трансмембранного домена CD8 и укороченного внутриклеточного домена CD8 (SEQ ID NO: 2).

Двойным подчеркиванием указан секреторный сигнальный пептид

Нормальным шрифтом указаны SCR CD55

Подчеркиванием указан линкер (G4S1)3

Полужирным шрифтом указан трансмембранный домен CD8

Курсивом указан укороченный внутриклеточный домен CD8

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Что касается слитого белка по настоящему изобретению, можно использовать любую последовательность пептида CD55 для последовательности (a). В варианте осуществления последовательность пептида CD55 является последовательностью пептида CD55 человека. Последовательность пептида CD55, предпочтительно, содержит четыре коротких консенсусных повтора (SCR) CD55. Для последовательности (b) можно использовать любой гибкий линкер, например, общепринятый гибкий линкер, известный в этой области. В одном из вариантов осуществления используют линкер G4S1, предпочтительно, линкер (G4S1)3. Для последовательности (c) можно использовать любой трансмембранный домен, например, общепринятый трансмембранный домен, известный в этой области. В одном из вариантов осуществления трансмембранный домен является трансмембранным доменом CD8. Для последовательности (d) можно использовать любой внутриклеточный домен, например, общепринятый внутриклеточный домен. В одном из вариантов осуществления трансмембранный домен является трансмембранным доменом CD8, предпочтительно, укороченным трансмембранным доменом CD8.

Слитый белок по настоящему изобретению может дополнительно содержать секреторный сигнальный пептид, N-концевой относительно последовательности (a). Что касается предпочтительного способа по настоящему изобретению, слитый белок сначала экспрессируется с сигнальным пептидом. Сигнальный пептид направляет новый синтезированный слитый белок в эндоплазматический ретикулум (ER), где сигнальный пептид отщепляется сигнальной пептидазой. SEQ ID NO: 2 является примером слитого белка по настоящему изобретению, содержащим N-концевой сигнальный пептид. SEQ ID NO: 3 является примером слитого белка по настоящему изобретению, не содержащего N-концевой сигнальный пептид.

Что касается слитого белка по настоящему изобретению, необязательно, можно включать спейсер из одной или более аминокислот между N-концевым сигнальным пептидом и последовательностью (a), между последовательностью (a) и последовательностью (b), между последовательностью (b) и последовательностью (c), между последовательностью (c) и последовательностью (d), между любыми двумя из них, между любыми тремя из них или между всеми четырьмя. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсер между N-концевым сигнальным пептидом и последовательностью (a) отсутствует, или, другими словами, N-концевой сигнальный пептид ковалентно связан с последовательностью (a) одной пептидной связью. В другом варианте осуществления спейсер находится между N-концевым сигнальным пептидом и последовательностью (a).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсер между последовательностью (a) и последовательностью (b) отсутствует, или, другими словами, последовательность (a) ковалентно связана с последовательностью (b) одной пептидной связью. В другом варианте осуществления спейсер находится между последовательностью (a) и последовательностью (b). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсер между последовательностью (b) и последовательностью (c) отсутствует, или, другими словами, последовательность (b) ковалентно связана с последовательностью (c) одной пептидной связью. В другом варианте осуществления спейсер находится между последовательностью (b) и последовательностью (c). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсер между последовательностью (c) и последовательностью (d) отсутствует, или, другими словами, последовательность (c) ковалентно связана с последовательностью (d) одной пептидной связью. В другом варианте осуществления спейсер находится между последовательностью (c) и последовательностью (d). В принципе, нет ограничения размера спейсеров.

CD55 содержит четыре внеклеточных коротких консенсусных повтора (SCR), Ser/Thr/Pro (STP)-богатую область и GPI-заякоренный домен. Что касается слитого белка по настоящему изобретению, GPI-заякоренный домен отсутствует. STP-богатая область может присутствовать или отсутствовать. Один из вариантов осуществления кодирующей последовательности слитого белка по настоящему изобретению дополнительно содержит сигнал полиаденилирования, C-концевой относительно третьей кодирующей последовательности пептида. Сигнал полиаденилирования (поли-A) может являться любым поли-A.

Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, описанный выше. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота является ДНК. Она, необязательно, может содержать один или более интронов между последовательностями, кодирующими сигнальный пептид и последовательность (a), между последовательностью (a) и последовательностью (b), между последовательностью (b) и последовательностью (c), между последовательностью (c) и последовательностью (d) или где-либо еще. В варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 1 является одним из примеров нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2. Т.к. разные кодоны нуклеиновой кислоты кодируют одну и ту же аминокислоту благодаря взаимосвязи, известной как вырожденность генетического кода, можно представить себе и включить в изобретение многие другие последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2.

Вариант осуществления настоящего изобретения является экспрессирующим вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, описанную выше, функционально связанную с контрольной последовательностью, например, промотором. Промотор, регулирующий слитый белок, может являться любым промотором и не ограничен промотором CMV. Если между промотором и кодирующей последовательностью слитого белка находится интрон, можно использовать любой подходящий и общепринятый интрон. Например, подходящим является интрон β-глобина.

Настоящее изобретение относится к линии клеток, стабильно экспрессирующей слитый белок по настоящему изобретению на своей поверхности. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любую общепринятую линию клеток для экспрессии белка. В одном из вариантов осуществления линия клеток является линией клеток млекопитающего. В другом варианте осуществления линия клеток является линией клеток, не принадлежащих млекопитающему, например, линией эмбриональных фибробластов курицы DF-1.

Настоящее изобретение относится к оболочечному вирусу, включающему слитый белок, описанный выше на мембране вируса. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой оболочечный вирус. В варианте осуществления вирус является онколитическим вирусом, например, парамиксовирусом, таким как вирус болезни Ньюкасл (NDV). В примерах ингибитор комплемента в форме рекомбинантного слитого белка находился на оболочке частицы NDV. Рекомбинантный слитый белок по настоящему изобретению можно использовать для иных онколитических вирусов, чем NDV, что приводит к получению онколитических вирусных частиц, более резистентных к инактивации комплементом организма-хозяина. Новый рекомбинантный ингибитор комплемента в форме слитого белка можно использовать для модификации любых других клеток млекопитающих, таких как клетки HeLa, для продукции онколитических вирусов. Онколитические вирусы описывают в международной патентной публикации № WO 2000/062735, содержание которое включено в настоящее описание в качестве ссылки. В экспериментах, результаты которых представлены ниже, используемым NDV являлся PPMK107, описанный в WO 2000/062735.

Вирус можно включать в фармацевтическую композицию, содержащую вирус и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение относится к способу лечения неопластического заболевания млекопитающего, включающему введение индивидууму количества описанного выше вируса, эффективного для лечения неопластического заболевания. В случае лечения злокачественных новообразований вирус можно вводить пациентам любым общепринятым путем, например, посредством одной или более внутриопухолевых или внутривенных инъекций. В случае внутриопухолевого введения диапазон доз может составлять от 1×10⁷ до 5×10¹² БОЕ/опухоль. В случае внутривенного введения диапазон доз может составлять от 1×10⁷ до 1×10¹³ БОЕ/м² ("БОЕ" является сокращением для "бляшкообразующей единицы").

Онколитический вирус по настоящему изобретению также можно конструировать так, чтобы он включал другие молекулы, такие как ГМ-КСФ, для повышения эффективности онколитического вируса. Кроме того, онколитический вирус может являться частью комбинированной противоопухолевой терапии с использованием ингибитора контрольных точек, такого как молекула против PD1 или против PDL1. Кроме того, онколитический вирус может являться частью комбинированной противоопухолевой терапии с использованием других химиотерапевтических средств. Химиотерапевтические средства могут являться, в качестве неограничивающих примеров, камптотециновыми соединениями, например, иринотеканом или топотеканом.

Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме до той степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная в настоящее описание в качестве ссылки. Также в качестве ссылки включена любая дополнительная информация, опубликованная вместе с любой из указанных выше публикаций, патентов и патентных заявок. Например, некоторые статьи в журналах опубликованы с дополнительной информацией, как правило, доступной он-лайн.

Изобретение будет более понятным с учетом следующих примеров, иллюстрирующих, но не ограничивающих изобретение, представленное в настоящем описании.

ПРИМЕРЫ

Пример 1:

Получали модифицированную версию рекомбинантного CD55 с четырьмя короткими консенсусными повторами (SCR) CD55 ниже секреторного сигнального пептида с последующим гибким линкером (3xG4S1) и трансмембранным доменом CD8 и укороченным внутриклеточным доменом CD8 (фигура 1). Кодирующую последовательность клонировали в экспрессирующую конструкцию млекопитающего, содержащую промотор CMV, синтетический интрон, регулирующий экспрессию рекомбинантного белка. Экспрессирующая кассета также содержала селективный маркер лекарственного средства, неомицинфосфотрансферазу, ниже IRES. Экспрессирующая кассета заканчивалась синтетическим сигналом полиаденилирования. SEQ ID NO: 1 является нуклеотидной последовательностью экспрессирующей конструкции клетки млекопитающего. SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность экспрессируемого белка. При экспрессии на поверхности эмбриональных фибробластов курицы DF1 или на мембране вируса сигнальный пептид отщепляется, что приводит к получению зрелого рекомбинантного слитого белка (SEQ ID NO: 3), имеющего такую конфигурацию/ориентацию, что CD55 SCR находится вне клетки или вирусной мембраны, гибкий линкер, смежный с клеткой или вирусной мембраной, должен обеспечивать максимальную гибкость для SCR CD55 для выполнения его биологической функции, т.е. блокировать C3-конвертазу, являющуюся центральным регулятором пути комплемента. После гибкого линкера следует трансмембранный домен CD8 и укороченный внутриклеточный домен CD8.

Пример 2:

Используя экспрессирующую конструкцию млекопитающего, с помощью PEI25K-опосредованной трансфекции (полиэтиленимина, линейного, 25 кДа, Polysciences, кат. № 23966) трансфицировали эмбриональные фибробласты курицы DF1. Через семьдесят два часа после трансфекции трансфицированные клетки подвергали селекции с использованием 300 мкг/мл G418 (Geneticin®, аминогликозидного антибиотика) для получения стабильной линии клеток, конститутивно экспрессирующей SEQ ID NO: 2. Стабильная линия клеток конститутивно экспрессировала SEQ ID NO: 3 на поверхности клеток, что определяли с помощью моноклонального антитела (R&D Systems, кат. № MAB20091), специфического в отношении зрелого CD55 человека. Как показано на фигуре 3, рекомбинантный слитый белок экспрессировался на клетках DF1, стабильно трансфицированных с использованием конструкции, кодирующей рекомбинантный слитый белок, что определяли посредством проточной цитометрии (фигура 3, гистограмма справа). Наивные клетки DF1 служили в качестве отрицательного контроля (фигура 3, гистограмма слева).

Пример 3:

Стабильную линию клеток, экспрессирующую SEQ ID NO: 3 на поверхности клеток, инфицировали NDV дикого типа, полученным из оплодотворенных куриных яиц. Затем вирус титровали с использованием линии опухолевых клеток человека HT1080. Равное количество вируса (определяемое по БОЕ) инкубировали с 40% нормальной сыворотки человека (NHS) и 40% термически инактивированной нормальной сыворотки человека (iNHS), соответственно. Затем подсчитывали вирус, остающийся живым после инкубации с сывороткой человека, на клетках HT1080 с помощью анализа бляшкообразования. Вычисляли соотношение вируса, выделенного после инкубации с NHS и iNHS. Как представлено в таблице 1, коэффициент выделения для вируса, полученного с помощью оплодотворенных куриных яиц, составлял 0,5%, что позволяет предполагать, что подавляющее большинство частиц NDV, полученных с помощью куриных яиц, инактивировалось, наиболее вероятно, под действием альтернативного пути комплемента человека. Аналогично, коэффициент выделения вируса, полученного с помощью родительских эмбриональных фибробластов курицы DF1, составлял 0,5%. Неожиданно, коэффициент выделения вируса, полученного из объединенных неклональных клеток DF1, стабильно экспрессирующих SEQ ID NO: 3 на своей поверхности, составлял 5,8%, более чем в 10 раз больше вируса дикого типа. При исследовании всего 11 клональных популяций клеток DF1, экспрессирующих SEQ ID NO: 3, коэффициент выделения находился в диапазоне от 0,8 до 20%, при этом у пяти клонов наблюдали более низкий коэффициент выделения, а у шести клонов - более высокий коэффициент выделения, чем у объединенной неклональной линии клеток (таблица 1). Вирус, полученный с помощью клона № 8, имел коэффициент выделения 10%, что было в 20 раз больше, чем в случае вируса, полученного с помощью оплодотворенных куриных яиц или родительских клеток DF1. Вирус, полученный с помощью клона № 40, имел коэффициент выделения 20%, что было в 40 больше, чем в случае вируса, полученного с помощью оплодотворенных куриных яиц или родительских клеток DF1. Эти данные позволяют предполагать, что активность комплемента, присутствующего в нормальной сыворотке человека, приводила к быстрому разрушению частиц NDV, полученных с помощью оплодотворенных куриных яиц или родительских эмбриональных фибробластов курицы DF1. Однако, новые частицы NDV, продуцируемые клетками DF-1, стабильно экспрессирующими рекомбинантный ингибитор комплемента на своей поверхности, демонстрировали значительное повышение коэффициента выделения до 40 раз по сравнению с вирусом, полученным с помощью куриных яиц или родительских клеток DF1 после инкубацией с 40% нормальной сывороткой человека в идентичных экспериментальных условиях.

Таблица 1. Коэффициент выделения вируса, измеряемый по соотношению вируса, выделенного после инкубации с 40% нормальной сывороткой человека (NHS) или 40% термически инактивированной сывороткой человека (iNHS)
Онколитический NDV, полученный с помощью	% коэффициент выделения после инкубации с сывороткой человека
Оплодотворенные куриные яйца	0,5
Родительские клетки DF1	0,5
Неклональные клетки DF1, экспрессирующие SEQ ID NO: 3	5,8
Клон #1 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	4,3
Клон #2 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	5,2
Клон #3 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	0,8
Клон #4 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	6,8
Клон #5 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	3,6
Клон #6 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	1,5
Клон #7 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	7,1
Клон #8 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	10,0
Клон #10 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	6,1
Клон #11 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	6,0
Клон #40 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3	20,0

Пример 4:

Широкий спектр онколитической активности NDV, полученного с помощью DF1 клеток, стабильно экспрессирующих комплемент-ингибирующий слитый белок на своей поверхности (клон № 8), оценивали с использованием раствора CellTiter96® AQueous One Solution. Этот раствор действует аналогично анализу MTT (т.е. 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида), в котором метаболически активные клетки способны биовосстанавливать реагент MTS тетразолий (т.е. 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий) в растворимый хромогенный формазан. В кратком изложении, три разные линии опухолевых клеток HT1080 (фибросаркомы), PANC-1 (эпителиальной карциномы поджелудочной железы) и OV-CAR3 (аденокарциномы яичника) выращивали в отдельных 96-луночных планшетах. На следующий день в соответствующие лунки добавляли серийные разведения вируса NDV и инкубировали планшет в течение 6 дней при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂. В день 6 измеряли поглощение во всех лунках каждого планшета при 490 нм с использованием спектрофотометра. IC₅₀ вычисляли с использованием 4-параметрического анализа логистической нелинейной регрессии для каждой линии клеток. Получали конечные значения IC₅₀ 255, 120 и 47 БОЕ/лунку для линий клеток HT1080, OV-CAR-3 и PANC-1, соответственно (фигура 4). Эти результаты свидетельствуют о том, что частицы NDV, полученные с помощью клеток DF-1, стабильно экспрессирующих рекомбинантный ингибитор комплемента на своей поверхности, сохраняли способность лизировать различные линии опухолевых клеток дозо-зависимым образом.

ССЫЛКИ

Carroll, M. C., E. M. Alicot, P. J. Katzman, L. B. Klickstein, J. A. Smith, and D. T. Fearon. 1988. Organization of the genes encoding complement receptors type 1 and 2, decay-accelerating factor, and C4-binding protein in the RCA locus on human chromosome 1. J. Exp. Med. 167:1271.

Rey-Campos, J., P. Rubinstein, and S. Rodriguez de Cordoba. 1988. A physical map of the human regulator of complement activation gene cluster linking the complement genes CR1, CR2, DAF, and C4BP. J. Exp. Med. 167:664.

Lublin, D. M., and J. P. Atkinson. 1989. Decay-accelerating factor: biochemistry, molecular biology, and function. Annu. Rev. Immunol. 7:35. 5. Nakano, Y., K. Sumida, N. Kikuta, N. H. Miura, T. Tobe, and M. Tomita. 1992. Complete determination of disulfide bonds localized within the short consensus repeat units of decay accelerating factor (CD55 antigen). Biochim.Biophys.Acta 1116:235.

Censullo, P., and M.A. Davitz. 1994a. How GPI-anchored proteins turnover: or where do they go after arrival at the plasma membrane. SeminImmunol. 6:81.

Censullo, P., and M.A. Davitz. 1994b. The fate of GPI-anchored molecules. Braz J. Med. Biol. Res. 27:289

Morgan, B. P., and S. Meri. 1994. Membrane proteins that protect against complement lysis. Springer Semin.Immunopathol.15:369.

Turner A.J. 1994. PIG-tailed membrane proteins.Essays Biochem.28:113.

Kim D.D., and W.C. Song. 2006. Membrane complement regulatory proteins. Clin.Immunol.118:127.

Pecora, A.L., Rizvi, N., Cohen, G.I., Meropol, N.J., Sterman, D., Marshall, J.L., Goldberg, S., Gross, P., O'Neil, J.D., Groene, W.S., Roberts, M.S., Rabin, H., Bamat, M.K., and R.M. Lorence. 2002. Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J. Clin. Oncol.20:2251.

Laurie, S.A., Bell, J.C., Atkins, H.L., Roach, J., Bamat, M.K., O'Neil, J.D., Roberts, M.S., Groene, W.S., and R.M. Lorence. 2006. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, using two-step desensitization. Clin. Cancer Res. 12:2555.

Lorence, R.M., Roberts, M.S., O'Neil, J.D., Groene, W.S., Miller, J.A., Mueller, S.N., and M.K. Bamat. 2007. Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus. 7:157.

Biswas, M., Johnson, J.B., Kumar, S.R.P. Parks, G.D., and E. Subbiah. 2012. Incorporation of host complement regulatory proteins into Newcastle disease virus enhances complement evasion. J. Virol. 86:12708.

Rangaswamy, U.S., Cotter, C.R., Chang, X., Jin, H., and Z. Chen. 2016. CD55 is a key complement regulatory protein that counteracts complement-mediated inactivation of Newcastle disease virus. J. Gen. Virol. 97:1765

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Wellstat ImmunoTherapeutics Corporation

<120> ОБОЛОЧЕЧНЫЙ ВИРУС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К ИНАКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТОМ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ

ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

<130> 21003-PCT

<150> US 62/504,120

<151> 2017-05-10

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6606

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Экспрессирующая конструкция клетки млекопитающего

<220>

<221> misc_feature

<222> (1064)..(1165)

<223> Кодирующая последовательность секреторного сигнального пептида

<220>

<221> misc_feature

<222> (1166)..(2119)

<223> Кодирующая последовательность SCR CD55

<220>

<221> misc_feature

<222> (2120)..(2164)

<223> Кодирующая последовательность линкера (G4S1)3

<220>

<221> misc_feature

<222> (2165)..(2227)

<223> Кодирующая последовательность трансмебранного домена CD8

<220>

<221> misc_feature

<222> (2228)..(2260)

<223> Кодирующая последовательность укороченного внутриклеточного домена CD8

<400> 1

tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60

ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120

aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540

caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600

caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660

cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720

tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780

tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840

gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900

actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960

tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020

aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcgcc accatgacag tggccagacc 1080

ttctgtgcct gccgccctgc ctctgctggg agaactgcct agactgctgc tgctggtgct 1140

gctgtgtctg cctgccgtgt ggggcgattg tggcctgcct cccgatgtgc ctaatgccca 1200

gcctgccctg gaaggcagaa ccagcttccc cgaggacacc gtgatcacct acaagtgcga 1260

ggaatccttc gtgaagatcc ccggcgagaa ggatagcgtg atctgcctga agggcagcca 1320

gtggagcgac atcgaagagt tctgcaacag atcctgcgag gtgcccaccc ggctgaatag 1380

cgcctctctg aagcagccct acatcaccca gaactacttc cctgtgggca ccgtggtgga 1440

atacgagtgc agacccggct acagaagaga gccctccctg agccctaagc tgacctgcct 1500

gcagaacctg aagtggtcca ccgccgtgga gttctgtaaa aagaagtcct gccccaaccc 1560

tggcgagatc cggaacggcc agattgatgt gcctggcggc atcctgttcg gcgccacaat 1620

cagcttcagc tgcaacaccg gctacaagct gttcggcagc acctccagct tttgcctgat 1680

cagcggcagc agcgtgcagt ggagtgaccc tctgcctgag tgcagagaga tctactgccc 1740

tgccccccct cagatcgaca acggcatcat tcagggcgag cgggaccact acggctacag 1800

gcagagcgtg acctacgcct gcaacaaggg cttcaccatg atcggcgagc acagcatcta 1860

ctgcaccgtg aacaacgacg agggcgagtg gagcggccca ccccctgagt gtagaggcaa 1920

gagcctgacc agcaaggtgc cccccaccgt gcagaaaccc accaccgtga atgtgcctac 1980

caccgaggtg tccccaacca gccagaaaac aaccaccaag accaccaccc ccaacgccca 2040

ggccaccaga tctacccctg tgtccaggac caccaagcac ttccacgaga caacccctaa 2100

caagggcagc ggcacaaccg gtggcggagg atctggcggc ggaggaagcg gagggggagg 2160

atccatctat atctgggccc ctctggccgg cacctgtggc gtgctgctgc tgtctctcgt 2220

gatcaccctg tactgcaacc accggaaccg gcggagagtg tgatgagaat tcacgcgtgg 2280

tacctctaga gtcgaccctc tagggcggcc aattccgccc ctctccctcc ccccccccta 2340

acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt 2400

ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga 2460

cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg 2520

tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt 2580

gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat 2640

aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg 2700

aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg 2760

taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt 2820

cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa 2880

cacgatgata agcttgccac aacccgggat aattcctgca gccaatatgg gatcggccat 2940

tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta 3000

tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca 3060

ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga 3120

cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga 3180

cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct 3240

cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg 3300

gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga 3360

gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca 3420

tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga 3480

tgatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg 3540

cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc 3600

gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt 3660

gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga 3720

gttcttctga ggggatcaat tctgggcggc ctcgagaata aacaatcatt attttcattg 3780

gatctgtgtg ttggtttttt gtgtgggctt gggggagggg gaggccagaa tgactccaag 3840

agctacagga aggcaggtca gagaccccac tggacaaaca gtggctggac tctgcaccat 3900

aacacacaat caacagggga gtgagctgga tcgagctgct cgagatccgg gctggcgtaa 3960

tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg 4020

gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 4080

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 4140

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 4200

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 4260

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 4320

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 4380

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 4440

aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta 4500

cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 4560

ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 4620

gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 4680

agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat 4740

ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg 4800

gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc 4860

tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta 4920

ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg 4980

ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg 5040

gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac 5100

gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg 5160

acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt 5220

actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg 5280

ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac 5340

cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt 5400

gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag 5460

caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc 5520

aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc 5580

ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta 5640

tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg 5700

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga 5760

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac 5820

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa 5880

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat 5940

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc 6000

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg 6060

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc 6120

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg 6180

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg 6240

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa 6300

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg 6360

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga 6420

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct 6480

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca 6540

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atggctcgac 6600

agatct 6606

<210> 2

<211> 399

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Слитый белок

<220>

<221> СИГНАЛ

<222> (1)..(34)

<223> Секреторный сигнальный пептид

<220>

<221> ПЕПТИД

<222> (35)..(352)

<223> SCR CD55

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (353)..(367)

<223> Линкер (G4S1)3

<220>

<221> TRANSMEM

<222> (368)..(388)

<223> Трансмембранный домен CD8

<220>

<221> DOMAIN

<222> (389)..(399)

<223> Укороченный внутриклеточный домен CD8

<400> 2

Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly

1 5 10 15

Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val

20 25 30

Trp Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala

35 40 45

Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys

50 55 60

Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile

65 70 75 80

Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg

85 90 95

Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro

100 105 110

Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu

115 120 125

Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr

130 135 140

Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys

145 150 155 160

Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val

165 170 175

Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr

180 185 190

Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly

195 200 205

Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg

225 230 235 240

Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly

245 250 255

Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp

260 265 270

Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu

275 280 285

Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val

290 295 300

Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr

305 310 315 320

Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr

325 330 335

Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr

340 345 350

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile

355 360 365

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

370 375 380

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val

385 390 395

<210> 3

<211> 365

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Зрелый слитый белок (a после отщепления сигнального пептида).

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(318)

<223> SCR CD55

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (319)..(333)

<223> Линкер (G4S1)3

<220>

<221> TRANSMEM

<222> (334)..(354)

<223> Трансмембранный домен CD8

<220>

<221> DOMAIN

<222> (355)..(365)

<223> Укороченный внутриклеточный домен CD8

<400> 3

Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu Glu

1 5 10 15

Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys Glu

20 25 30

Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys Leu

35 40 45

Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser Cys

50 55 60

Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr Ile

65 70 75 80

Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys Arg

85 90 95

Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys Leu

100 105 110

Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys Ser

115 120 125

Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro Gly

130 135 140

Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Tyr

145 150 155 160

Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser Ser

165 170 175

Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys Pro

180 185 190

Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp His

195 200 205

Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe Thr

210 215 220

Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu Gly

225 230 235 240

Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu Thr Ser

245 250 255

Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val Pro Thr

260 265 270

Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Thr

275 280 285

Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr Thr Lys

290 295 300

His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Gly Gly

305 310 315 320

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Ile

325 330 335

Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

340 345 350

Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val

355 360 365

<---

Claims (27)

1. Слитый белок для улучшения выживания онколитического оболочечного вируса в сыворотке человека, где указанный слитый белок содержит: (a) последовательность пептида CD55, содержащую аминокислоты 35-352 SEQ ID NO:2, (b) линкерную последовательность (G4S1)3, C-концевую относительно последовательности CD55, содержащую аминокислоты 353-367 SEQ ID NO: 2,(c) трансмембранный домен CD8, C-концевой относительно линкерной последовательности, содержащий аминокислоты 368-388 SEQ ID NO: 2, и (d) укороченный внутриклеточный домен CD8, C-концевой относительно трансмембранного домена, содержащий аминокислоты 389-399 SEQ ID NO: 2, где слитый белок не содержит GPI-якорь.

2. Белок по п. 1, где пептидная последовательность (a) ковалентно связана с пептидной последовательностью (b) одной пептидной связью.

3. Белок по п. 1, где пептидная последовательность (a) ковалентно связана с пептидной последовательностью (b) спейсером.

4. Белок по п. 1, где пептидная последовательность (b) ковалентно связана с пептидной последовательностью (c) одной пептидной связью.

5. Белок по п. 1, где пептидная последовательность (b) ковалентно связана с пептидной последовательностью (c) спейсером.

6. Белок по п. 1, где пептидная последовательность (c) ковалентно связана с пептидной последовательностью (d) одной пептидной связью.

7. Белок по п. 1, где пептидная последовательность (c) ковалентно связана с пептидной последовательностью (d) спейсером.

8. Белок по п. 1, где слитый белок дополнительно содержит секреторный сигнальный пептид, N-концевой относительно последовательности (a), содержащий аминокислоты 1-34 SEQ ID NO: 2.

9. Белок по п. 8, где секреторный сигнальный пептид является секреторным сигнальным пептидом CD55.

10. Белок по п. 8, где N-концевой секреторный сигнальный пептид ковалентно связан с последовательностью (a) одним пептидом.

11. Белок по п. 8, где N-концевой секреторный сигнальный пептид ковалентно связан с последовательностью (a) спейсером.

12. Белок по п. 1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2.

13. Белок по п. 1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 3.

14. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок по любому из пп. 1-13.

15. Нуклеиновая кислота по п. 14, где нуклеиновая кислота является ДНК.

16. Нуклеиновая кислота по п. 14, кодирующая белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2.

17. Нуклеиновая кислота по п. 16, имеющая последовательность SEQ ID NO: 1.

18. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 14-17, функционально связанную с контрольной последовательностью.

19. Клетка, стабильно экспрессирующая белок по любому из пп. 1-13 на поверхности клеток, где клетка выбрана из группы, состоящей из клетки млекопитающего и клетки эмбриональных фибробластов курицы DF-1.

20. Клетка по п. 19, где клетка представляет собой клетку млекопитающего.

21. Клетка по п. 19, где клетка является клеткой эмбриональных фибробластов курицы DF-1.

22. Онколитический оболочечный вирус, включающий белок по любому из пп. 1-13 на вирусной мембране.

23. Вирус по п. 22, где онколитический оболочечный вирус является вирусом болезни Ньюкасл.

24. Фармацевтическая композиция для лечения неопластического заболевания у млекопитающего, содержащая вирус по п. 22 или 23 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.

25. Способ лечения неопластического заболевания у млекопитающего, включающий введение индивидууму количества вируса по п. 22, эффективного для лечения заболевания.

26. Способ по п. 25, где вирус вводят внутриопухолево.

27. Способ по п. 25, где вирус вводят внутривенно.

Images