CN108503701A - 一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用 - Google Patents

一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用，涉及生物医学光学与分子影像学技术领域。本发明公开的荧光蛋白相对于现有的荧光蛋白mCrimson包括由氨基酸突变位点C158D。该突变位点使得本发明的荧光蛋白的荧光光谱性质发生了改变，具有较大的斯托克斯位移特性，可用于单光子或多光子显微多色成像中，能有效地减少不同荧光蛋白的荧光光谱相互之间的串扰，提高成像的灵敏度，保证不同光谱的荧光蛋白可被同时荧光成像，降低对光学器件的高要求。

Description

一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用
技术领域
本发明涉及生物医学光学与分子影像学技术技术领域，具体而言，涉及一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用。
背景技术
在使用荧光蛋白进行活体成像时，往往难以实现多通道同时成像，若能突破这一限制，则可实现对多个生物快速反应事件的检测，将极大推动神经科学的发展。
在单光子成像中，可采用由不同激发波长的光激发多种荧光蛋白来实现多通道同时成像。然而，在多光子成像中，添加一个二级钛蓝宝石雷射或光学参数振荡器的费用较高，并且难以将它们调控到一起，因此，多种荧光蛋白同时成像较难实现。
目前同时成像多个生物分子事件的显微镜方法主要依赖对激光的动态调制，需要多套重复的光学器件，成本昂贵，并且难以实现精确的同步控制。
斯托克斯位移指的是荧光物质的最大发射波长和最大激发波长之差。该差值若大于100nm，则认为该荧光蛋白具有大斯托克斯位移的特性。
开发出大斯托克斯位移(激发峰与发射峰之间的距离)的荧光蛋白可有效的解决这一问题，实现同一激发波长的光同时激发两种荧光蛋白，然后发射出不同波长区域的光，达到两种荧光蛋白多光子同时成像的目的。并能和常用的绿色荧光蛋白结合在一起使用，将使两种不同的生物反应事件可视化，大大降低对光学器件的高要求。大斯托克斯位移的荧光蛋白在多色双光子成像时，可保证两个不同光谱的荧光蛋白被同时荧光成像，并且有效地减少荧光光谱的串扰。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光蛋白，该荧光蛋具有较大的斯托克斯位移特性，其是一种新的大斯托克斯位移荧光蛋白，其可与现有的荧光蛋白结合在一起，用于单光子或多光子显微多色成像中，避免多个荧光蛋白分子之间的荧光光谱的串扰，实现多种荧光蛋白同时成像的效果，降低对光学器件的高要求。
本发明的再一目的在于提供一种融合蛋白，该融合蛋白含有上述的荧光蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种分离的核酸，用于编码上述的荧光蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种载体，其含有上述的核酸。
本发明的另一目的在于提供含有上述载体的重组细胞。
本发明的另一目的在于提供上述的荧光蛋白在活体成像中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种生物发光共振能量转移系统，该生物发光共振能量转移系统的成像效果好，各荧光分子间不发生荧光光谱的干扰。
本发明是这样实现的：
一种荧光蛋白，其相对于荧光蛋白mCrimson包括以下氨基酸突变位点：C158D。
一种融合蛋白，其含有上述的荧光蛋白。
一种分离的核酸，其编码上述的荧光蛋白。
一种载体，其含有上述的核酸。
含有上述载体的重组细胞。
上述的荧光蛋白荧光蛋白在单光子或多光子显微多色成像中的应用。
一种生物发光共振能量转移系统，以上述的荧光蛋白为所述生物发光共振能量转移系统的供体或者受体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的提供的荧光蛋白，其相对于现有的荧光蛋白mCrimson包括氨基酸突变位点C158D，该突变位点使得本发明的荧光蛋白的荧光光谱性质发生了改变，具有较大的斯托克斯位移特性，其激发峰和发射峰分别是451nm和613nm，因此，该荧光蛋白可与现有的荧光蛋白列如绿色荧光蛋白一起使用，可用于单光子或多光子显微多色成像中，能有效地减少不同荧光蛋白的荧光光谱相互之间的串扰，有助于提高成像的灵敏度，保证不同光谱的荧光蛋白可被同时荧光成像，降低对光学器件的高要求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson与荧光蛋白mCrimson的氨基酸序列比对结果；
图2为本发明实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson的激发光谱和发射光谱图；
图3为本发明实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson的高效液相色谱峰图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用进行具体说明。
最早报道的大斯托克斯位移的荧光蛋白为mKeima，它是一种红色荧光蛋白，其发射与吸收峰分别位于440和620nm，采用458nm的光激发CFP和mKeima，可达到同时激发两个荧光分子的目的，从而实现单光源的多色成像。但mKeima的缺点在于，它有两个激发峰，除了能在440nm处被激发，还能在584nm处被激发，这对多色成像造成了一些困难。
为了克服mKeima的这一缺点，PiatkevichK.D.等人于2010年得到了荧光蛋白突变体LSS-mKate1和LSS-mKate2，这两个突变体具有同样的激发波长，但发射波长却不同，因此，可较好的利用它们进行双光子活体观察肿瘤细胞的转移等生理生化反应。但这两种荧光蛋白的量子产率比较低。
本发明的发明人在现有的荧光蛋白mCrimson(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)基础上，通过对mCrimson的氨基酸序列和结构的分析，采用定点诱变技术，将mCrimson基因通过聚合酶链式反应扩增，然后在组成型表达载体pNCS上对突变体进行表达和筛选，所用表达菌株为Stellar(购买自安捷伦科技公司)，为确保文库的完整性，每个突变体设置10个克隆，最后通过肉眼分辨以及蓝光LED激发光透过橙色丙烯酸滤波器检测突变体的荧光性质，从而筛选出表达大斯托克斯位移的荧光蛋白的单克隆，命名该荧光蛋白为LSSmCrimson。
一方面，本发明提供了一种荧光蛋白，其相对于荧光蛋白mCrimson包括以下氨基酸突变位点：C158D。
利用上述突变位点C158D，即mCrimson氨基酸序列的第158位(如图1所示的氨基酸序列比对的氨基酸残基编号位置，起始的甲硫氨酸残基编为第-4位，下游的氨基酸残基的位号依次递增，其他突变位点的编号同此)的半胱氨酸被天冬氨酸所取代，使得本发明的荧光蛋白的荧光光谱性质发生了改变，具有较大的斯托克斯位移特性，其激发峰和发射峰分别是451nm和613nm。因此，该荧光蛋白可与现有的荧光蛋白列如绿色荧光蛋白一起使用，实现同一激发波长的光同时激发两种荧光蛋白，然后发射出不同波长区域的光，达到两种荧光蛋白多光子同时成像的目的。
该荧光蛋白同样可用于单光子或多光子显微多色成像中，由于就有较大的斯托克位移，能有效地减少不同荧光蛋白的荧光光谱相互之间的串扰，有助于提高成像的灵敏度，保证不同光谱的荧光蛋白可被同时荧光成像，降低对光学器件的高要求。
优选地，本发明提供的荧光蛋白相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：M61F和F174I中的一种或两种。
更优选地，本发明提供的荧光蛋白相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：M61F和F174I。
突变位点M61F和F174I，具体为mCrimson的氨基酸序列的第61位的甲硫氨酸(Met)被苯丙氨酸(Phe)所取代，第174位的苯丙氨酸(Phe)被异亮氨酸(Ile)所取代。该突变位点体现了荧光蛋白的亮度特性，使得本发明提供的荧光蛋白在具有大斯托克斯位移的特点上，还具有了较高的亮度。
容易理解，两个突变位点M61F和F174I均能体现荧光蛋白的亮度特性，因此，只要包括其中任意一个突变位点，或者同时包括两个突变位点均能提高本发明荧光蛋白的亮度。
进一步地，优选地，本发明提供的荧光蛋白相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H中的一种或多种的组合。更优选地，本发明提供的荧光蛋白相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H。
这些突变位点R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H，具体为mCrimson的氨基酸序列的第10位的精氨酸(Arg)被苏氨酸(Thr)所取代，第23位的谷氨酰胺(Gln)被酪氨酸(Tyr)所取代，第75位的甘氨酸(Gly)被天冬氨酸(Asp)所取代，第111位的谷氨酰胺(Gln)被精氨酸(Arg)所取代，第114位的谷氨酸(Glu)被缬氨酸(Val)所取代，第121位的亮氨酸(Leu)被缬氨酸(Val)所取代，第135位的谷氨酰胺(Gln)被精氨酸(Arg)所取代，第218位的酪氨酸(Tyr)被组氨酸(His)所取代，体现了荧光蛋白的成熟率特性，使得本发明的荧光蛋白还具有了较高的成熟率。
容易理解，这些突变位点R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H，各自均体现了荧光蛋白的成熟率特性，因此，只要包括突变位点R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H中的一种或多种的组合的荧光蛋白，其成熟率特性均有改善或提高。
进一步地，优选地，本发明提供的荧光蛋白其相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失中的一种或多种的组合。更优选地，本发明提供的荧光蛋白其相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失。
这些突变位点A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失，具体为mCrimson的氨基酸序列的第161位的丙氨酸(Ala)被精氨酸(Arg)所取代，第191位的酪氨酸(Tyr)被赖氨酸(Lys)所取代，第219位的丝氨酸(Ser)被苏氨酸(Thr)所取代，第220位的苏氨酸(Thr)被天冬酰胺(Asn)所取代，第221位的甘氨酸(Gly)被缬氨酸(Val)所取代，第222-230位的氨基酸缺失，体现了荧光蛋白的单体性，使得本发明的荧光蛋白还具有良好的单体性，易于与其他蛋白融合或相互作用，改善成像效果。
容易理解，上述突变位点A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失，各自均体现了荧光蛋白的单体性，因此，上述突变位点A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失中的任意一种或多种的组合，改善均能提高荧光蛋白的单体性，提高其与其他蛋白的融合性或相互作用。
另一方面，还提供了一种融合蛋白，其含有上述的荧光蛋白。由于本发明提供的荧光蛋白较大的斯托克斯位移特性，因此，可通过基因工程的技术将其与其他感兴趣的蛋白进行融合，也或者是将荧光蛋白标记其他感兴趣的蛋白。通过对荧光蛋白的成像，可以有效减少该荧光蛋白与其他荧光蛋白的荧光光谱之间的串扰，提高成像效果，实现对目标蛋白的准确研究。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，该核酸可编码上述的荧光蛋白。根据密码子的简并性，在荧光蛋白的氨基酸序列确定的情况下，其相应的编码核酸序列也有很多种情况，其均属于本发明的保护范围。需要说明的是，这类核酸的应用也属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供了含有上述核酸的载体。载体可以是克隆载体或表达载体等，优选为表达载体。其中，表达载体可以是真核表达载体或原核表达载体，优选为真核表达载体。又或者是其他类型的载体，均属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明还提供了含有上述载体的重组细胞。重组细胞可以是原核细胞也可以是真核细胞。当然，重组细胞也可以是大肠杆菌、酵母菌或动物细胞或人类细胞，或者是其他类型的细胞或细菌均属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供了上述荧光蛋白在活体成像中的应用，尤其可适用于多通道同时成像中。有效替代现有的显微镜方法。
优选地，本发明提供了上述荧光蛋白在单光子或多光子显微多色成像中的应用。本发明提供的荧光蛋白具有大斯托克斯位移特性，，其激发峰和发射峰分别是451nm和613nm，该荧光蛋白可与现有的荧光蛋白列如绿色荧光蛋白一起使用，在单光子或多光子显微多色成像中，同时被单色光激发进行多色成像，能有效地减少不同荧光蛋白的荧光光谱相互之间的串扰，有助于提高成像的灵敏度，保证不同光谱的荧光蛋白可被同时荧光成像，降低对光学器件的高要求。
当然，上述荧光蛋白也可应用于光片式非线性光学显微成像。
另外，上述荧光蛋白LSSmCrimson也可用于基于随机单分子定位的超分辨技术成像，用该荧光蛋白标记细胞中的结构和细胞器后，利用激发光照射样品，得到图像上的点不会有两个靠得很近的点同时亮，就可以通过定位的方式实现超分辨。虽然一次定位只能得到少数几个分子，但是通过数千张图片对数十万个单分子的定位，就可以获得一张高分辨率的图像。
还有，上述荧光蛋白也可用于新的生物发光共振能量转移系统BRET。例如该系统中受体为荧光素酶NanoLuc，供体为上述的荧光蛋白LSSmCrimson。荧光素酶NanoLuc的发射光谱大体与LSSmCrimson的吸收光谱重叠，因此，如果这两种蛋白间的距离足够近的话，NanoLuc的氧化反应中间体所产生的能量将通过生物发光共振能量转移(BRET)的原理转移给LSSmCrimson，从而激发后者，导致该系统发射出LSSmCrimson的发射光谱。
另一方面，本发明提供了一种生物发光共振能量转移系统，该系统以上述的本发明提供的荧光蛋白为生物发光共振能量转移系统的供体或者受体。
优选地，本发明提供了一种生物发光共振能量转移系统，以荧光素酶NanoLuc作为受体，以上述的荧光蛋白作为供体。与受体荧光素酶NanoLuc结合，可在生物体内形成一种新的高灵敏的生物发光共振能量转移系统，大大提高了活体成像的深度和灵敏度。
综上，本发明的提供的荧光蛋白，其相对于现有的荧光蛋白mCrimson包括氨基酸突变位点C158D，该突变位点使得本发明的荧光蛋白的荧光光谱性质发生了改变，具有较大的斯托克斯位移特性，其激发峰和发射峰分别是451nm和613nm，因此，该荧光蛋白可与现有的荧光蛋白列如绿色荧光蛋白一起使用，可用于单光子或多光子显微多色成像中，能有效地减少不同荧光蛋白的荧光光谱相互之间的串扰，有助于提高成像的灵敏度，保证不同光谱的荧光蛋白可被同时荧光成像，降低对光学器件的高要求。此外，本发明提供的荧光蛋白可以作为一种优良的标签蛋白应用于超分辨显微成像和高灵敏活体生物发光成像。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其相对于荧光蛋白mCrimson(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)包括以下氨基酸突变位点：C158D。
该突变位点C158D，mCrimson氨基酸序列的第158位的半胱氨酸被天冬氨酸所取代，使得本发明的荧光蛋白的荧光光谱性质发生了改变，具有较大的斯托克斯位移特性，其激发峰和发射峰分别是451nm和613nm，因此，该荧光蛋白可与现有的荧光蛋白列如绿色荧光蛋白一起使用，可用于单光子或多光子显微多色成像中，能有效地减少不同荧光蛋白的荧光光谱相互之间的串扰，有助于提高成像的灵敏度，保证不同光谱的荧光蛋白可被同时荧光成像，降低对光学器件的高要求。
实施例2
本实施例提供的荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其相对于荧光蛋白mCrimson包括以下氨基酸突变位点：C158D、M61F和F174I。
本实施例提供的荧光蛋白不仅具有同实施例1的荧光蛋白的相同效果，且通过M61F和F174I突变位点的引入，该两个突变位点体现了荧光蛋白的亮度特性，使得本发明提供的荧光蛋白在具有大斯托克斯位移的特点上，还具有了较高的亮度。
实施例3
本实施例提供的荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其相对于荧光蛋白mCrimson包括以下氨基酸突变位点：C158D、R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H。
本实施例提供的荧光蛋白不仅具有同实施例1的荧光蛋白的相同效果，且通过R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H多个突变位点的引入，这些位点体现了荧光蛋白的成熟率特性，使得本发明提供的荧光蛋白在具有大斯托克斯位移的特点上，还具有了较高的成熟率。
实施例4
本实施例提供的荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其相对于荧光蛋白mCrimson包括以下氨基酸突变位点：C158D、A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失。
本实施例提供的荧光蛋白不仅具有同实施例1的荧光蛋白的相同效果，且通过：A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失的引入，这些位点体现了荧光蛋白的单体性特性，使得本发明提供的荧光蛋白在具有大斯托克斯位移的特点上，还具有了较高的单体性。
实施例5
本实施例提供的荧光蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，命名为LSSmCrimson，其与荧光蛋白mCrimson的氨基酸序列比对结果如图1所示，其相对于荧光蛋白mCrimson包括以下氨基酸突变位点：
体现大斯托克斯位移特性的：C158D；
体现亮度特性的：M61F和F174I；
体现成熟率特性的：R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H；
体现单体性特性的：A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失。
本实施例提供的荧光蛋白不仅具有同实施例1的荧光蛋白的相同效果，即具有大斯托克斯位移，可用于单光子和多光子显微多色成像，例如可以与绿色荧光蛋白mNeonGreen一起同时被单色光以双光子的模式激发，提高了双光子成像的分辨率，应用于光片式非线性光学显微成像；还具有：极好的单体性；相对于其它具有大斯托克斯位移的荧光蛋白来说亮度高，成熟时间短；与其它蛋白质具有较好的融合性，不会干扰到被研究的蛋白在细胞内的定位。
此外，本实施例提供的荧光蛋白可以应用于新的生物发光共振能量转移系统BRET，作为供体与受体荧光素酶NanoLuc结合，可在生物体内形成一种新的高灵敏的生物发光共振能量转移系统BRET，大大提高了活体成像的深度和灵敏度。
实施例6
本实施例提供了获得实施例5的荧光蛋白(SEQ ID NO:6)的方法，当然，实施例5所提供的荧光蛋白的获得方法也可参考本实施例。需要说明的是，本发明的荧光蛋白的获得方法并不限于本实施例所提供的方法，在其他的实施例中，采用其他方法所得到的本发明的荧光蛋白同样属于本发明的保护范围。
本实施例提供的获得荧光蛋白(SEQ ID NO:6)的方法，如下。
(1)根据提供的荧光蛋白(SEQ ID NO:6)的氨基序列设计出相应的核酸序列，该核酸序列编码荧光蛋白(SEQ ID NO:6)。
在本实施例中，编码该荧光蛋白的核酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
(2)通过基因合成方法获得上述核酸序列(SEQ ID NO:7)，将该核酸序列连接至表达载体上，并转化感受态细胞，并涂布培养。
(3)挑取单菌落，接种培养，然后测序，取测序正确的单克隆继续培养。
(4)对培养液进行离心、纯化，得到荧光蛋白LSSmCrimson。
实施例7
对实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson(SEQ ID NO:6)的功能性实验
(1)采用B-PER II(购买自皮尔斯公司)对表达LSSmCrimson的菌株进行裂解，然后采用HisPur Cobalt Resin(购买自皮尔斯公司)纯化蛋白，紧接着通过Econo-Pac 10DG重力流色谱柱(购买自美国Bio-Rad公司)去盐。完成以上蛋白纯化步骤后，使用爱丁堡FS920荧光光谱仪检测LSSmCrimson的激发光谱和发射光谱，LSSmCrimson的激发光谱和发射光谱如图2所示，图2显示了实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson的激发光谱和发射光谱，图中：a为激发光谱，b为发射光谱，横坐标为波长(λ)，纵坐标为归一化的荧光强度值。
(2)荧光蛋白LSSmCrimson的摩尔消光系数和量子产率的测量
由于荧光蛋白的N-末端连接有六个组氨酸，所以使用钴树脂纯化(HisPur CobaltResin)。消光系数通过变性方法(对于每个蛋白样品，准备完全一样两份溶液，蛋白溶解在PBS中。其中一份测量吸收峰，另外一份在1N NaOH作用下测量吸收峰，通过公式“变性前/变性后*44000”计算出消光系数)测出，而量子产率则分别测量待测样品和参考蛋白的发射谱和吸收谱，然后分别计算发射谱面积和获得发射谱的吸收值，然后将发射谱面积除以吸收值，然后将待测样品的上述比值除以参考蛋白的比值，然后乘以参考蛋白的量子产率，即可得知待测蛋白的量子产率，具体值见表1。
(3)荧光蛋白LSSmCrimson的酸解离常数(Pka)测量
完成以上蛋白纯化步骤后，得到纯度很高的蛋白液，将蛋白的浓度调到同一浓度。配置不同PH值的(PH＝1.5～13，每种反应液PH相差0.5)的检测液，分别将各种PH的检测液加入到96孔板(黑色，底透明，康宁生产)中，每孔120ul，然后每孔再加入30ul荧光蛋白液，摇床摇5分钟混匀，然后放到多功能酶标仪上(Tecan)检测蛋白激发峰出处的荧光强度。荧光强度随着PH由小到大逐渐增强再减弱，在由小到大过程中，当荧光强度达到最大值和最小值之和二分之一处所对应的PH值即为该蛋白的酸解离常数(PKa)，具体值见表1。
(4)荧光蛋白的亮度检测方法，荧光寿命检测方法和光稳定性检测方法具体请参考文献Chu J,Oh Y,Sens A,et al.A bright cyan-excitable orange fluorescentprotein facilitates dual-emission microscopy and enhances bioluminescenceimaging in vivo.Nat Biotechnology.2016Jul；34(7):760-767.
表1.实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson光物理性质
表中：N.D表示目前没有相关数据。
(4)荧光蛋白LSSmCrimson的单体性实验
采用B-PER II(购买自皮尔斯公司)对表达LSSmCrimson的菌株进行裂解，然后采用HisPur Cobalt Resin(购买自皮尔斯公司)纯化蛋白，紧接着通过Econo-Pac 10DG重力流色谱柱(购买自美国Bio-Rad公司)去盐。完成以上蛋白纯化步骤后，统一将荧光蛋白的浓度浓缩成10mg/ml，放入到进样瓶中，用岛津高效液相色谱仪检测荧光蛋白的单体性。以现有的荧光蛋白：hmKeima8.5、LSSmKate2、mBeRFP2、fusionred作为参照，结果如图3所示。图3为实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson的高效液相色谱峰图，图中：a为hmKeima8.5，b为LSSmKate2，c为mBeRFP2，d为fusionred，e为LSSmCrimson；横坐标为出峰的时间，单位分钟，纵坐标为蛋白质紫外吸收值。
图2的结果显示，荧光蛋白LSSmCrimson的激发峰和发射峰相差较远，结合表1的数据显示，荧光蛋白LSSmCrimson的激发峰为451nm，发射峰为613nm，且只有一个激发峰，斯托克斯位移为162nm，表明本发明提供的荧光蛋白LSSmCrimson是一种新的大斯托克斯位移荧光蛋白。
此外，表1中的数据显示，相较于现有的大斯托克斯位移荧光蛋白mBeRFP，LSSmKate1、LSSmKate2、mKeima，本发明实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson的亮度更高(7.8)，以及具有较高的量子产率(0.25)；此外，相较于现有的大斯托克斯位移荧光蛋白hmKeima8.5，本发明实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson的pKa也更高(5.7)。
还有，图3的结果显示。本发明实施例5提供的荧光蛋白LSSmCrimson出峰的时间最长，说明该蛋白的单体性在这五种蛋白中是最好的，Fusionred是目前公认单体性很好的荧光蛋白，比它出峰的时间还长说明LSSmCrimson是目前具有大斯托克斯位移荧光蛋白中单体性最好的蛋白。
综上，本发明提供的荧光蛋白具有以下优点：
(1)该荧光蛋白具有大斯托克斯位移，可用于单光子和多光子显微多色成像，因此例如可以与绿色荧光蛋白mNeonGreen一起同时被单色光以双光子的模式激发，提高了双光子成像的分辨率，应用于光片式非线性光学显微成像。
(2)该荧光蛋白具有极好的单体性，是目前大斯托克斯位移荧光蛋白中单体性最好的荧光蛋白。
(3)相对于其它具有大斯托克斯位移的荧光蛋白来说亮度高，成熟时间短。
(4)该荧光蛋白与其它蛋白质具有较好的融合性，不会干扰到被研究的蛋白在细胞内的定位。
(5)该荧光蛋白可以应用于新的生物发光共振能量转移系统，例如作为供体与受体荧光素酶NanoLuc结合，可在生物体内形成一种新的高灵敏的生物发光共振能量转移系统BRET，大大提高了活体成像的深度和灵敏度。
总之，本发明提供的荧光蛋白具有较大的斯托克斯位移特性，可用于单光子或多光子显微多色成像中，能有效地减少不同荧光蛋白的荧光光谱相互之间的串扰，提高成像的灵敏度，保证不同光谱的荧光蛋白可被同时荧光成像，降低对光学器件的高要求。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳先进技术研究院
<120> 一种荧光蛋白、融合蛋白、分离的核酸、载体和应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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Lys
<210> 2
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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Lys
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<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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Lys
<210> 4
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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Asn Phe Lys Thr Thr Tyr Lys Ser Lys Lys Pro Val Lys Met Pro Gly
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Leu Pro Ser Lys Leu Gly His Lys Leu Asn Gly Met Asp Glu Leu Tyr
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Lys
<210> 5
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
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Leu Tyr Leu Glu Gly Ser Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Thr His
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Asn Phe Pro Ala Asn Gly Pro Val Met Lys Arg Thr Thr Leu Gly Trp
130 135 140
Glu Pro Ser Thr Glu Thr Leu Tyr Pro Ala Asp Gly Ala Leu Glu Gly
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Arg Asp Asp Met Arg Leu Lys Leu Val Gly Gly Gly His Leu His Cys
165 170 175
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggtgagca agggcgagga gctgatcaag gagaacatga ccagcaagct gtacctggaa 60
ggcagcgtga acggccacta cttcaagtgc acccacgaag gggagggcaa gccctacgag 120
ggcacccaga ccaacaggat caaggtggtg gagggaggcc ccctgccgtt cgcattcgac 180
atcctggcca ccttctttat gtacgggagc aaggccttca tcaagtaccc caaggacctc 240
cccgattatt ttaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagagaac catggtgttc 300
gaagacgggg gcgtgctgac cgccacccag gacaccagcc tcagagacgg cgtgctcatc 360
tacaacgtga aggtgagagg ggtgaacttc ccagccaacg gccccgtgat gaagcggaca 420
acactgggct gggagcccag caccgagacc ctgtaccccg ctgacggcgc cctggaaggc 480
agagacgaca tgagactgaa gctcgtgggc gggggccacc tgcactgcaa catcaagacc 540
acatacaaat ccaagaaacc cgtcaagatg cccggcgtcc acaaggtgga ccgcagactg 600
gaaagaatca aggaggccga caacgagacc tacgtcgagc agcacgaggt ggctgtggcc 660
agacacacca acgtcggcat ggacgagctg tacaag 696

Claims (10)

1.一种荧光蛋白，其特征在于，其相对于荧光蛋白mCrimson包括以下氨基酸突变位点：C158D。
2.根据权利要求1所述的荧光蛋白，其特征在于，其相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：M61F和F174I中的一种或两种。
3.根据权利要求1或2所述的荧光蛋白，其特征在于，其相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：R10T、Q23Y、G75D、Q111R、E114V、L121V、Q135R以及Y218H中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求1或2所述的荧光蛋白，其特征在于，其相对于荧光蛋白mCrimson还包括以下氨基酸突变位点：A161R、Y191K、C219T、D220N、L221V以及第222-230位氨基酸片段的缺失中的一种或多种的组合。
5.一种融合蛋白，其特征在于，其含有权利要求1-4中任一项所述的荧光蛋白。
6.一种分离的核酸，其特征在于，其编码权利要求1-4中任一项所述的荧光蛋白。
7.一种载体，其特征在于，其含有权利要求6所述的核酸。
8.含有权利要求7所述的载体的重组细胞。
9.权利要求1-4中任一项所述的荧光蛋白在活体成像中的应用。
10.一种生物发光共振能量转移系统，其特征在于，以权利要求1-4中任一项所述的荧光蛋白为所述生物发光共振能量转移系统的供体或者受体。
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