CN102169090B - 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法,其步骤:A、制备碲氢化钾溶液:通过硼氢化钾还原碲粉制备;B、称取氯化镉晶体,用高纯水溶解定容,得氯化镉溶液;C、称取巯基乙酸,用高纯水稀释定容,得巯基乙酸溶液;D、取无氧高纯水,在搅拌和不断通入高纯氮气,分别加入氯化镉溶液、巯基乙酸溶液,用氢氧化钠溶液调节pH值,加入碲氢化钾溶液;E、将混合液分装于聚四氟乙烯消解罐中,氯化镉、碲氢化钾、巯基乙酸的摩尔比率;F、取CdTe量子点,加入N-羟基琥珀酰亚胺于恒温振荡,得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。工艺简单,工艺参数易控制;具有很好的生物相容性;具有双重检测性能,同时可进行荧光检测与酶活性检测。
Description
技术领域
本发明涉及量子点的生物应用,更具体涉及一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法,该探针可用于检测污染物、毒物与酶的作用效应。
背景技术
有机相合成的量子点不具备亲水性,因此不能直接应用于生物体系,必须对其进行表面修饰,其操作过程复杂,条件要求高。水相合成法制备的量子点能够直接用于生物探针,对其研究愈来愈受到重视,有关这方面的研究进展很快。但由于水相合成的量子点所选用的配体多为简单的巯基化合物,表面的活性基团比较少且表面积很小,难以与目标物质结合,因此水相量子点的直接应用存在局限性。因此,将量子点与生物大分子结合既增大了量子点的表面积,又增加了量子点表面活性基团,克服了水相量子点的应用局限性。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法,该制备方法工艺快速简单,工艺参数易控制。该探针水溶性和生物相容性好,检测功能应用广泛,性价比高,在保持了过氧化氢酶(CAT)一定活性的同时,修饰了量子点表面,使其具有较高的荧光强度。
为了实现上述的目的,本发明采用以下技术措施:
其技术构思是:一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针,它包括CdTe量子点(自制,请见A~E步骤)、过氧化氢酶(CAT,SIGMA-ALORICH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,上海延长生化公司)、L-甘氨酸(Glycine,凌飞科技),其余为Tris缓冲溶液。
所述的CdTe量子点中,氯化镉(CdCl2·2.5H2O,国药集团化学试剂有限公司)、碲氢化钾(KTeH4,请见A步骤)、巯基乙酸(TGA,Japan)的摩尔比率分别为 2.5:1:3,100℃条件下加热10~20min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为6.8-7.6。
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法,其步骤如下:
A、 制备碲氢化钾(KH4Te) 溶液:通过硼氢化钾(KBH4,天津市天大化学试剂厂)还原碲粉(Te,国药集团化学试剂有限公司)制备,反应方程式如下:
4KBH4 + 2Te + 7H2O → 2KH4Te + K2B4O7 +11H2↑
分别称取0.337g的硼氢化钾(KBH4)和0.319g的碲粉(Te)于具塞试管中。向硼氢化钾(KBH4)中加入5mL高纯水,至白色粉末完全溶解,后与碲粉(Te)混合,塞上塞子,于3--5℃下反应8~16h,得紫黑色液体,取上清部分1ml,用无氧高纯水定容至100ml,即为0.005mol/L的碲氢化钾(KH4Te)溶液;
B、称取0.228g氯化镉(CdCl2·2.5H2O)晶体,用高纯水溶解定容至100mL,得0.01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液;
C、称取0.092g巯基乙酸(TGA),用高纯水稀释定容至100mL,得0.01mol/L的巯基乙酸(TGA)溶液。
D、取无氧高纯水250mL,在中速搅拌和不断通入高纯氮气(N2)的条件下,依次分别加入50mL0.01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液、60mL0.01mol/L的巯基乙酸(TGA)溶液,用5mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值为10.5~11.5,后加入40mL碲氢化钾(KH4Te) 溶液,反应4-6min。
E、将D步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中,于100℃下微波加热10-20min,即制得浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点。氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为 2.5:1:3。
F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点,加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于37℃恒温振荡0.5-1h,使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基充分进行酯化反应,后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液,于25~35℃下振荡40~60min后,加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联。制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针,该探针在保持了一定酶活性的同时,使量子点的荧光强度得到较大提高(30%~50%)。
所述的CdTe量子点如何制备的过程请见步骤A~E。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:
1. 该探针主要原料大部分来源丰富,价格低廉;过氧化氢酶虽价格较贵,但添加量少,对总体价格影响不大。
2. 该探针制备工艺快速简单,工艺参数易控制。
3. 该探针水溶性和生物相容性好,检测功能应用广泛,性价比高。
具体实施方式
下面通过实施例,进一步阐明本发明的突出特点,仅在于说明本发明而决不限制本发明。
实施例1:
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针,它包括CdTe量子点、过氧化氢酶(CAT,SIGMA-ALORICH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,上海延长生化公司)、L-甘氨酸(Glycine,凌飞科技),其余为Tris缓冲溶液。
所述的CdTe量子点中,氯化镉(CdCl2·2.5H2O,国药集团化学试剂有限公司)、碲氢化钾(KTeH4,)、巯基乙酸(TGA,Japan)的摩尔比率分别为 2.5:1:3,100℃条件下加热10~20min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为6.8-7.6。
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法,其步骤如下:
A、制备碲氢化钾(KH4Te) 溶液:通过硼氢化钾(KBH4)还原碲粉(Te)制备,反应方程式如下:
4KBH4 + 2Te + 7H2O → 2KH4Te + K2B4O7 +11H2↑
分别称取0.337g的硼氢化钾(KBH4)和0.319g的碲粉(Te)于具塞试管中。向硼氢化钾(KBH4)中加入5mL高纯水,至白色粉末完全溶解,后与碲粉(Te)混合,塞上塞子,于3℃、或1℃、或-1℃、或-2℃、或-3℃、或-4℃、或-5℃下反应8 h、或10 h、或12 h、或14 h、或16h,得紫黑色液体,取上清部分1ml,用无氧高纯水定容至100ml,即为0.005mol/L的碲氢化钾(KH4Te)溶液;
B、称取0.228g氯化镉(CdCl2·2.5H2O)晶体,用高纯水溶解定容至100mL,得0.01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液;
C、称取0.092g巯基乙酸(TGA),用高纯水稀释定容至100mL,得0.01mol/L的巯基乙酸(TGA)溶液。
D、取无氧水250mL,在中速搅拌和不断通入高纯氮气(N2)的条件下,依次分别加入50mL0.01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液、60mL0.01mol/L的巯基乙酸(TGA),用5mol/L的氢氧化钠溶液(NaOH)调节pH值为10.5、或11、或11.3、或11.5,后加入40mL碲氢化钾(KH4Te) 溶液,反应5min。
E、将D步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中,于100℃下微波加热10或12或14或16或18或20min,即制得浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点。氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为 2.5:1:3。
F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L (以Cd2+计)CdTe量子点,加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于37℃恒温振荡0.5h,使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基充分进行酯化反应,后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液,于25℃、或27℃、或29℃、或31℃、或33℃、或35℃下振荡40min、或45min、或50min、或56min、或60min后,加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联。所制得的荧光探针具有一定酶活性,且荧光强度得到较大提高(30%~50%)。
实施例2:
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针,它包括CdTe量子点(自制)、过氧化氢酶(CAT,)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,)、L-甘氨酸(Glycine,),其余为Tris缓冲溶液。
所述的CdTe量子点中,氯化镉(CdCl2·2.5H2O,)、碲氢化钾(KTeH4,自制)、巯基乙酸(TGA,)的摩尔比率分别为 2.5:1:3,100℃条件下加热10~20min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为7.2。
取氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为 2.5:1:3的混合溶液,调节溶液pH值为11.0,以每罐50ml分装于聚氟乙烯消解罐中,于100℃下微波加热20min制得CdTe量子点。取4mL制备好的浓度为1 mmol/L(以Cd2+计)CdTe量子点,加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于37℃下恒温振荡0.5h,后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶CAT溶液,于35℃恒温振荡60min后,再加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联,制得CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针,所制得的荧光探针具有一定酶活性,且荧光强度得到较大提高(40%)。
其它实施步骤与实施例1相同。
实施例3:
取氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比分别为 2.5:1:3的混合溶液,调节溶液pH值为11.4,以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中,于100℃下微波加热15min制得CdTe量子点。取4mL制备好的浓度为1 mmol/L(以Cd2+计)CdTe量子点,加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于30℃恒温振荡0.5h,后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液,于30℃下恒温振荡45min后,再加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联,制得CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针,所制得的荧光探针具有一定酶活性,且荧光强度得到较大提高(50%)。
其它实施步骤与实施例1相同。
Claims (1)
1.一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法,其步骤如下:
制备碲氢化钾溶液:通过硼氢化钾还原碲粉制备,反应方程式如下:
4KBH4 + 2Te + 7H2O → 2KH4Te + K2B4O7 +11H2↑
分别称取0.337g的硼氢化钾和0.319g的碲粉于具塞试管中,向硼氢化钾中加入5mL高纯水,至白色粉末完全溶解,后与碲粉混合,塞上塞子,于3~-5℃下反应8~16h,得紫黑色液体,取上清1ml,用无氧高纯水定容至100ml,为0.005mol/L的碲氢化钾溶液;
B、称取0.228g氯化镉晶体,用高纯水溶解定容至100mL,得0.01mol/L的氯化镉溶液;
C、称取0.092g巯基乙酸,用高纯水稀释定容至100mL,得0.01mol/L的巯基乙酸溶液;
D、取无氧高纯水250mL,在搅拌和不断通入高纯氮气的条件下,依次分别加入50mL0.01mol/L的氯化镉溶液、60mL0.01mol/L的巯基乙酸溶液,用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为10.5~11.5,后加入40mL碲氢化钾 溶液,反应4-6min;
E、将(D)步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中,于100℃下微波加热10-20min,即制得浓度为1 mmol/L CdTe量子点,氯化镉、碲氢化钾、巯基乙酸的摩尔比率分别为 2.5:1:3;
F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L CdTe量子点,加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺于37℃恒温振荡0.5-1h,使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基进行酯化反应,后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶溶液,于25~35℃下振荡40~60min后,加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸终止交联,制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。
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