CN102169090B - 量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤：A、制备碲氢化钾溶液：通过硼氢化钾还原碲粉制备；B、称取氯化镉晶体，用高纯水溶解定容，得氯化镉溶液；C、称取巯基乙酸，用高纯水稀释定容，得巯基乙酸溶液；D、取无氧高纯水，在搅拌和不断通入高纯氮气，分别加入氯化镉溶液、巯基乙酸溶液，用氢氧化钠溶液调节pH值，加入碲氢化钾溶液；E、将混合液分装于聚四氟乙烯消解罐中，氯化镉、碲氢化钾、巯基乙酸的摩尔比率；F、取CdTe量子点，加入N-羟基琥珀酰亚胺于恒温振荡，得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。工艺简单，工艺参数易控制；具有很好的生物相容性；具有双重检测性能，同时可进行荧光检测与酶活性检测。
Description
技术领域
本发明涉及量子点的生物应用，更具体涉及一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该探针可用于检测污染物、毒物与酶的作用效应。
背景技术
有机相合成的量子点不具备亲水性，因此不能直接应用于生物体系，必须对其进行表面修饰，其操作过程复杂，条件要求高。水相合成法制备的量子点能够直接用于生物探针，对其研究愈来愈受到重视，有关这方面的研究进展很快。但由于水相合成的量子点所选用的配体多为简单的巯基化合物，表面的活性基团比较少且表面积很小，难以与目标物质结合，因此水相量子点的直接应用存在局限性。因此，将量子点与生物大分子结合既增大了量子点的表面积，又增加了量子点表面活性基团，克服了水相量子点的应用局限性。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该制备方法工艺快速简单，工艺参数易控制。该探针水溶性和生物相容性好，检测功能应用广泛，性价比高，在保持了过氧化氢酶（CAT）一定活性的同时，修饰了量子点表面，使其具有较高的荧光强度。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
其技术构思是：一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括CdTe量子点（自制，请见A~E步骤）、过氧化氢酶(CAT，SIGMA-ALORICH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海延长生化公司)、L-甘氨酸(Glycine，凌飞科技)，其余为Tris缓冲溶液。
所述的CdTe量子点中，氯化镉(CdCl2·2.5H2O，国药集团化学试剂有限公司)、碲氢化钾(KTeH4，请见A步骤)、巯基乙酸(TGA，Japan)的摩尔比率分别为 2.5：1：3，100℃条件下加热10~20min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为6.8-7.6。
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下：
A、 制备碲氢化钾(KH4Te) 溶液：通过硼氢化钾(KBH4，天津市天大化学试剂厂)还原碲粉(Te，国药集团化学试剂有限公司)制备，反应方程式如下：
4KBH4 + 2Te + 7H2O → 2KH4Te + K2B4O7 +11H2↑
分别称取0.337g的硼氢化钾(KBH4)和0.319g的碲粉(Te)于具塞试管中。向硼氢化钾(KBH4)中加入5mL高纯水，至白色粉末完全溶解，后与碲粉(Te)混合，塞上塞子，于3--5℃下反应8~16h，得紫黑色液体，取上清部分1ml，用无氧高纯水定容至100ml，即为0.005mol/L的碲氢化钾(KH4Te)溶液；
B、称取0.228g氯化镉(CdCl2·2.5H2O)晶体，用高纯水溶解定容至100mL，得0.01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液；
C、称取0.092g巯基乙酸(TGA)，用高纯水稀释定容至100mL，得0.01mol/L的巯基乙酸(TGA)溶液。
D、取无氧高纯水250mL，在中速搅拌和不断通入高纯氮气（N2）的条件下，依次分别加入50mL0.01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液、60mL0.01mol/L的巯基乙酸（TGA）溶液，用5mol/L的氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH值为10.5~11.5，后加入40mL碲氢化钾(KH4Te) 溶液，反应4-6min。
E、将D步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于100℃下微波加热10-20min，即制得浓度为1 mmol/L （以Cd2+计）CdTe量子点。氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为 2.5：1：3。
F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L （以Cd2+计）CdTe量子点，加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于37℃恒温振荡0.5-1h，使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基充分进行酯化反应，后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液，于25~35℃下振荡40~60min后，加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联。制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针，该探针在保持了一定酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到较大提高（30%~50%）。
所述的CdTe量子点如何制备的过程请见步骤A~E。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1. 该探针主要原料大部分来源丰富，价格低廉；过氧化氢酶虽价格较贵，但添加量少，对总体价格影响不大。
2. 该探针制备工艺快速简单，工艺参数易控制。
3. 该探针水溶性和生物相容性好，检测功能应用广泛，性价比高。
具体实施方式
下面通过实施例，进一步阐明本发明的突出特点，仅在于说明本发明而决不限制本发明。
实施例1：
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括CdTe量子点、过氧化氢酶(CAT，SIGMA-ALORICH)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，上海延长生化公司)、L-甘氨酸（Glycine，凌飞科技），其余为Tris缓冲溶液。
所述的CdTe量子点中，氯化镉(CdCl2·2.5H2O，国药集团化学试剂有限公司)、碲氢化钾(KTeH4，)、巯基乙酸(TGA，Japan)的摩尔比率分别为 2.5：1：3，100℃条件下加热10~20min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为6.8-7.6。
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下：
A、制备碲氢化钾(KH4Te) 溶液：通过硼氢化钾(KBH4)还原碲粉(Te)制备，反应方程式如下：
4KBH4 + 2Te + 7H2O → 2KH4Te + K2B4O7 +11H2↑
分别称取0.337g的硼氢化钾(KBH4)和0.319g的碲粉(Te)于具塞试管中。向硼氢化钾(KBH4)中加入5mL高纯水，至白色粉末完全溶解，后与碲粉(Te)混合，塞上塞子，于3℃、或1℃、或-1℃、或-2℃、或-3℃、或-4℃、或-5℃下反应8 h、或10 h、或12 h、或14 h、或16h，得紫黑色液体，取上清部分1ml，用无氧高纯水定容至100ml，即为0.005mol/L的碲氢化钾(KH4Te)溶液；
B、称取0.228g氯化镉(CdCl2·2.5H2O)晶体，用高纯水溶解定容至100mL，得0.01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液；
C、称取0.092g巯基乙酸(TGA)，用高纯水稀释定容至100mL，得0.01mol/L的巯基乙酸(TGA)溶液。
D、取无氧水250mL，在中速搅拌和不断通入高纯氮气（N2）的条件下，依次分别加入50mL0.01mol/L的氯化镉(CdCl2)溶液、60mL0.01mol/L的巯基乙酸(TGA)，用5mol/L的氢氧化钠溶液(NaOH)调节pH值为10.5、或11、或11.3、或11.5，后加入40mL碲氢化钾(KH4Te) 溶液，反应5min。
E、将D步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于100℃下微波加热10或12或14或16或18或20min，即制得浓度为1 mmol/L （以Cd2+计）CdTe量子点。氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为 2.5：1：3。
F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L （以Cd2+计）CdTe量子点，加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于37℃恒温振荡0.5h，使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基充分进行酯化反应，后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液，于25℃、或27℃、或29℃、或31℃、或33℃、或35℃下振荡40min、或45min、或50min、或56min、或60min后，加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联。所制得的荧光探针具有一定酶活性，且荧光强度得到较大提高（30%~50%）。
实施例2：
一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括CdTe量子点（自制）、过氧化氢酶(CAT，)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，)、L-甘氨酸（Glycine，），其余为Tris缓冲溶液。
所述的CdTe量子点中，氯化镉(CdCl2·2.5H2O，)、碲氢化钾(KTeH4，自制)、巯基乙酸(TGA，)的摩尔比率分别为 2.5：1：3，100℃条件下加热10~20min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为7.2。
取氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比率分别为 2.5：1：3的混合溶液，调节溶液pH值为11.0，以每罐50ml分装于聚氟乙烯消解罐中，于100℃下微波加热20min制得CdTe量子点。取4mL制备好的浓度为1 mmol/L（以Cd2+计）CdTe量子点，加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于37℃下恒温振荡0.5h，后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶CAT溶液，于35℃恒温振荡60min后，再加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联，制得CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，所制得的荧光探针具有一定酶活性，且荧光强度得到较大提高（40%）。
其它实施步骤与实施例1相同。
实施例3：
取氯化镉(CdCl2)、碲氢化钾(KH4Te)、巯基乙酸(TGA)的摩尔比分别为 2.5：1：3的混合溶液，调节溶液pH值为11.4，以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于100℃下微波加热15min制得CdTe量子点。取4mL制备好的浓度为1 mmol/L（以Cd2+计）CdTe量子点，加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于30℃恒温振荡0.5h，后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶(CAT)溶液，于30℃下恒温振荡45min后，再加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸(Glycine)终止交联，制得CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，所制得的荧光探针具有一定酶活性，且荧光强度得到较大提高（50%）。
其它实施步骤与实施例1相同。
Claims (1)
1.一种CdTe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下：
制备碲氢化钾溶液：通过硼氢化钾还原碲粉制备，反应方程式如下：
4KBH4 + 2Te + 7H2O → 2KH4Te + K2B4O7 +11H2↑
分别称取0.337g的硼氢化钾和0.319g的碲粉于具塞试管中，向硼氢化钾中加入5mL高纯水，至白色粉末完全溶解，后与碲粉混合，塞上塞子，于3~-5℃下反应8~16h，得紫黑色液体，取上清1ml，用无氧高纯水定容至100ml，为0.005mol/L的碲氢化钾溶液；
B、称取0.228g氯化镉晶体，用高纯水溶解定容至100mL，得0.01mol/L的氯化镉溶液；
C、称取0.092g巯基乙酸，用高纯水稀释定容至100mL，得0.01mol/L的巯基乙酸溶液；
D、取无氧高纯水250mL，在搅拌和不断通入高纯氮气的条件下，依次分别加入50mL0.01mol/L的氯化镉溶液、60mL0.01mol/L的巯基乙酸溶液，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为10.5~11.5，后加入40mL碲氢化钾 溶液，反应4-6min；
E、将（D）步骤的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于100℃下微波加热10-20min，即制得浓度为1 mmol/L CdTe量子点，氯化镉、碲氢化钾、巯基乙酸的摩尔比率分别为 2.5：1：3；
F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L CdTe量子点，加入0.2mL0.5g/L的N-羟基琥珀酰亚胺于37℃恒温振荡0.5-1h，使偶联剂N-羟基琥珀酰亚胺的羟胺基与CdTe量子点的羧酸基进行酯化反应，后加入0.5mL4×10-10 mol/L的过氧化氢酶溶液，于25~35℃下振荡40~60min后，加入0.3mL、0.1mol/L的L-甘氨酸终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。
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