CN102305780B - ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤：A、制备KH4Se溶液：通过硼氢化钾还原硒粉制备；B、分别称取硼氢化钾和硒粉于具塞试管中，加入高纯水，塞上塞子，得无色透明液体，为硒氢化钾；C、称取醋酸锌晶体和还原型谷胱甘肽，溶解于无氧高纯水中；D、在搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入硒氢化钾，用氢氧化钠溶液调节pH值，待其混合；E、分装于聚四氟乙烯消解罐中，加热，KH4Se、Zn(Ac)2·2H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为1/15~1/10：1：1.6~1.8；F、取ZnSe量子点，过氧化氢酶，加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐于恒温振荡，得过氧化氢酶荧光探针。工艺简单，易控制；具有很好的生物相容性和双重检测性能，可进行荧光检测与酶活性检测。
Description
技术领域
本发明涉及量子点的生物应用技术领域，更具体涉及一种ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该探针可用于检测污染物、毒物及与过氧化氢酶的作用效应。
背景技术
有机相合成的量子点不具备亲水性，因此不能直接应用于生物体系，必须对其进行表面修饰，其操作过程复杂，条件要求高。水相合成法制备的量子点能够直接用于生物探针，对其研究愈来愈受到重视，有关这方面的研究进展很快。但由于水相合成的量子点所选用的配体多为简单的巯基化合物，表面的活性基团比较少且表面积很小，难以与目标物质结合，因此水相量子点的直接应用存在局限性。因此，将量子点与生物大分子结合既增大了量子点的表面积，又增加了量子点表面活性基团，克服了水相量子点的应用局限性。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，该方法工艺快速简单，工艺参数易控制。该探针水溶性和生物相容性好，检测功能应用广泛，性价比高，在保持了过氧化氢酶（CAT）活性的同时，修饰了量子点表面，使其具有更高的荧光强度。且完全采取绿色原料，因此可以更好的应用于生物活体检测。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
其技术构思是：一种ZnSe量子点标记牛血清蛋白荧光探针，它包括ZnSe量子点(自制，请见A~E步骤)、过氧化氢酶(CAT，SIGMA-ALORICH)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称EDC，99% 上海共价化学)；2-巯基乙醇(化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；其余为Tris缓冲溶液。
所述的ZnSe量子点中，醋酸锌(Zn(Ac)2·2H2O，上海美兴化工有限公司)、硒氢化钾(KH4Se，请见A，B步骤)、还原型谷胱甘肽(GSH， Japan)的摩尔比率分别为 1：1/15~1/10：1.6~1.8，95℃条件下加热45~60min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为6.8-7.6。
一种ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤如下：
A、 制备硒氢化钾(KH4Se) 溶液：通过硼氢化钾(KBH4，天津市天大化学试剂厂)还原硒粉(Se，天津市科密欧化学试剂开发中心)制备，反应方程式如下：
4KBH4 + 2Se + 7H2O → 2KH4Se + K2B4O7 +11H2↑
B、 分别称取0.03006g硼氢化钾和0.00789g硒粉于具塞试管中，向其中加入2mL高纯水，塞上塞子，于1~5℃下反应0.5~1.5h，得无色透明液体，为0.05mol/L的硒氢化钾；
C、分别称取0.10975~0.16463g醋酸锌晶体和0.24586~0.41489g还原型谷胱甘肽，溶解于200mL无氧高纯水中；
D、在150~300转/min的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入1mL0.05mol/L的硒氢化钾，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为10-11，待其混合，得到一种混合液；
E、将步骤D的混合液以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于93-97℃下微波加热60~75min，KH4Se、Zn(Ac)2·2H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/15~1/10：1：1.6~1.8。
F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L ZnSe量子点，1mL配制好的1×10-9mol/L的过氧化氢酶溶液，再加入0.2mL0.24g/L的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐于40℃恒温振荡0.5-1h，使ZnSe量子点通过偶联剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针，该探针在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高。
所述的ZnSe量子点如何制备的过程请见步骤A~E。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1. 该探针主要原料大部分来源丰富，价格低廉，还原型谷胱甘肽以及过氧化氢酶虽然较贵，但其用量较少，不影响总体价格(0.81953~1.38296×10-3g谷胱甘肽/1mL荧光探针，1.6667×10-13mol/1mL荧光探针)。
2. 该探针制备工艺快速简单（90 min ~105min），工艺参数易控制（pH值为6.8~7.6，温度为25~35℃）。
3. 该探针水溶性和生物相容性好（表面带有氨基羧基等亲水基团），检测功能应用广泛（可检测无机重金属离子和部分有机化合物），性价比高。
4. 该探针采用无毒或低毒原料制备（硒粉，谷胱甘肽，醋酸锌，过氧化氢酶），可更好的应用于生物活体研究，且环境友好。
具体实施方式
下面通过实施例，进一步阐明本发明的突出特点，仅在于说明本发明而决不限制本发明。
实施例1：
一种ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括ZnSe量子点(自制，请见A~E步骤)、过氧化氢酶(CAT，SIGMA-ALORICH)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称EDC，99% 上海共价化学)；2-巯基乙醇(化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；其余为Tris缓冲溶液。
所述的ZnSe量子点中，醋酸锌(Zn(Ac)2·2H2O，上海美兴化工有限公司)、硒氢化钾(KH4Se，请见A，B步骤)、还原型谷胱甘肽(GSH， Japan)的摩尔比率分别为 1：1/15~1/10：1.6~1.8，95℃条件下加热45~60min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为6.8或7或7.2或7.4或7.6。
一种ZnSe量子点标记牛血清蛋白荧光探针的制备方法，其步骤如下：
A、 制备硒氢化钾(KH4Se) 溶液：通过硼氢化钾(KBH4，天津市天大化学试剂厂)还原硒粉(Se，天津市科密欧化学试剂开发中心)制备，反应方程式如下：
4KBH4 + 2Se + 7H2O → 2KH4Se + K2B4O7 +11H2↑
B、 分别称取0.03006g硼氢化钾和0.00789g硒粉于具塞试管中，向其中加入2mL高纯水，塞上塞子，于5或4或3或2或1℃下反应0.5或1或1.5h，得无色透明液体，为0.05mol/L的硒氢化钾；
C、分别称取0.10975~0.16463g醋酸锌晶体和0.24586~0.41489g还原型谷胱甘肽，溶解于200mL无氧高纯水中；
D、在150~300转/min的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入1mL0.05mol/L的硒氢化钾，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为10-11，待其混合，得到一种混合液；
E、讲步骤D的混合液以每罐50mL分装于聚四氟乙烯消解罐中，于93或94或95或96或97℃下微波加热60或63或65或68或70或73或75min，KH4Se、Zn(Ac)2·2H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/15~1/10：1：1.6~1.8。
F、取4mL制备好的浓度为1 mmol/L ZnSe量子点，1mL配制好的1×10-9mol/L的过氧化氢酶溶液，再加入0.2mL0.24g/L的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐于25或28或30或32或35℃恒温振荡35或40或45或50min后，使ZnSe量子点通过偶联剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（50~100%）。
实施例2：
一种ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针，它包括ZnSe量子点(自制，请见A~E步骤)、过氧化氢酶(CAT，SIGMA-ALORICH)、乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydroehloide 简称EDC，99% 上海共价化学)；2-巯基乙醇(化学纯，中国医药集团上海化学试剂公司)；其余为Tris缓冲溶液。
所述的ZnSe量子点中，醋酸锌(Zn(Ac)2·2H2O，上海美兴化工有限公司)、硒氢化钾(KH4Se，请见A，B步骤)、还原型谷胱甘肽(GSH， Japan)的摩尔比率分别为 1：1/10：1.6，95℃条件下加热60min。
所述的Tris缓冲溶液pH值为7.2。
取醋酸锌(Zn(Ac)2·2H2O)、硒氢化钾(KH4Se)、还原型谷胱甘肽(GSH)的摩尔比率分别为 1：1/10：1.6，调节溶液pH值为10.5，以每罐50mL分装于聚四氟乙烯消解罐中，于95℃条件下加热60min制得ZnSe量子点。
取4mL制备好的浓度为1mmol/L ZnSe量子点，1mL配制好的1×10-9mol/L的过氧化氢酶溶液，再加入0.2mL0.24g/L的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐于35℃恒温振荡60 min后，使ZnSe量子点通过偶联剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（50%）。
其它实施步骤与实施例1相同。
实施例3：
取醋酸锌(Zn(Ac)2·2H2O)、硒氢化钾(KH4Se)、还原型谷胱甘肽(GSH)的摩尔比率分别为 1：1/10：1.6，调节溶液pH值为10.5，以每罐50mL分装于聚四氟乙烯消解罐中，于95℃条件下加热60min制得ZnSe量子点。
取4mL制备好的浓度为1 mmol/L ZnSe量子点，1mL配制好的1×10-9mol/L的过氧化氢酶溶液，再加入0.2mL0.24g/L的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐于30℃恒温振荡45 min后，使ZnSe量子点通过偶联剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。该探针在过氧化氢酶在保持了酶活性的同时，使量子点的荧光强度得到了很大的提高（100%）。
其它实施步骤与实施例1相同。
Claims (1)
1.一种ZnSe量子点标记过氧化氢酶荧光探针的制备方法，其步骤是：
A、制备硒氢化钾溶液：通过硼氢化钠还原硒粉制备，反应方程式如下：
4KBH4 + 2Se + 7H2O → 2KH4Se + K2B4O7 +11H2↑
B、 分别称取0.03006g硼氢化钾和0.00789g硒粉于具塞试管中，向其中加入2mL高纯水，塞上塞子，于1~5℃下反应0.5~1.5h，得无色透明液体，为0.05mol/L的硒氢化钾；
C、分别称取0.10975~0.16463g醋酸锌晶体和0.24586~0.41489g还原型谷胱甘肽，溶解于200mL无氧高纯水中；
D、在150~300转/min的搅拌和不断通入高纯氩气的条件下，加入1mL0.05mol/L的硒氢化钾，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值为10-11，待其混合；
E、以每罐50ml分装于聚四氟乙烯消解罐中，于93-97℃下微波加热60~75min，KH4Se、Zn(Ac)2·2H2O，还原型谷胱甘肽的摩尔比率分别为 1/15~1/10：1：1.6~1.8；
F、取4mL根据步骤A-E的方法制备好的浓度为1 mmol/L的 ZnSe量子点，1ml配制好的1×10-9mol/L的过氧化氢酶溶液，再加入0.2mL0.24g/L的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐于30℃恒温振荡0.5-1h，使ZnSe量子点通过偶联剂乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐与过氧化氢酶溶液进行充分反应，加入0.3mL、0.1mol/L的2-巯基乙醇终止交联，制得量子点标记过氧化氢酶荧光探针。
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| Electrogenerated chemiluminescence of blue emitting ZnSe quantum dots and its;Xiaofeng Hu et. al.;《Biosensors and Bioelectronics》;20091224;第25卷;1843-1846 * |
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