CN102080068B - 荧光素酶活性片段及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明通过将Gaussia荧光素酶(Gaussia Luciferase，GLuc)的N端37个氨基酸缺失的方法，获得了一种GLuc的活性片段，命名为GLuc 148。与野生型Gluc一样，GLuc 148发光活性高、不需要辅因子、生化性质稳定，但GLuc 148分子量更小、在真核细胞中非分泌型表达，更适合作为报告因子和荧光能量供体，应用于细胞和活体成像、高通量筛选、微生物检测等技术领域。

Description

荧光素酶活性片段及其应用

技术领域

本发明涉及生物化学和细胞生物学研究领域，具体涉及Gaussia荧光素酶活性核心片段GLuc 148的改造和应用。

背景技术

荧光素酶(Luciferase)是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于其独特的发光特点和检测简便、灵敏、快速，荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因(reporter)；其在发光免疫分析、活体成像、活细胞共振能量转移(BRET)及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。

目前研究最多且常用的荧光素酶主要是：细菌荧光素酶(BacterialLuciferase，简称BLuc)、萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase，FLuc)和海肾荧光素酶(Renilla Luciferase，RLuc)。相比而言，这些荧光素酶分子量相对较大，酶蛋白在溶液中的稳定性较差，有的在使用时需要共激活因子如ATP、Mg²⁺离子或Ca²⁺离子等，这在很大程度上限制了它们的应用范围。

Gaussia荧光素酶(Gaussia Luciferase，简称GLuc)是从海洋桡脚类动物中分离出的一种新型荧光素酶，目前关于它的研究和报道较少。GLuc不需要ATP来催化底物腔肠素(coelenterazine，CTZ)的氧化反应，且与其它发光报告基因相比还有许多如下的独特优势：

(1)GLuc的荧光信号比RLuc和FLuc高约1000倍，这使其成为更理想的转录报告因子；

(2)Gluc表达时分泌进细胞培养液中，测定不需要裂解细胞；

(3)在哺乳动物细胞中表达相对更稳定，为检测提供了便利；

(4)GLuc只有185个氨基酸，是所有已知荧光素酶中分子量最小的一种，便于进行性质改造和优化，未来可能成为最有发展前景的一种工具酶。

虽然，GLuc具有上述优点，但本领域仍然需要开发出分子量更小、可在真核细胞中非分泌型表达并产生强荧光信号的发光报告基因。

发明内容

本发明的目的之一正是提供一种经改造的荧光素酶，其具有发光活性高、不需要辅因子、生化性质稳定、分子量更小、在真核细胞中非分泌型表达，更适合作为报告因子和荧光能量供体，应用于细胞和活体成像、高通量筛选、微生物检测等技术领域。

具体而言，在本发明的第一方面，提供了一种荧光素酶活性片段，所述活性片段的序列是Gaussia荧光素酶缺失N端37个氨基酸残基所形成的序列，并且所述活性片段具有与野生型Gaussia荧光素酶一致的荧光素酶活性。

在本发明的一个实施方式中，所述活性片段适于在原核或真核细胞内表达。

在本发明的另一个实施方式中，所述活性片段具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在一个优选例中，所述荧光素酶活性片段的分子量为16kDa。

在另一个优选例中，所述荧光素酶活性片段为非分泌型表达。

在本发明的第二方面中，提供了本发明荧光素酶活性片段的编码序列。

在本发明的一个实施方式中，所述编码序列选自：

(i)如SEQ ID NO：1所示的序列；和

(ii)在严格条件下能与SEQ ID NO：1的序列杂交的分子。

在本发明的另一个实施方式中，所述编码序列经密码子偏爱优化。

在本发明的第三方面中，提供了本发明的荧光素酶活性片段或其编码序列在作为报告因子、荧光能量供体中的用途。

在本发明的第四方面中，提供了本发明的荧光素酶活性片段或其编码序列在细胞或活体成像、药物的高通量筛选、微生物检测或蛋白质拓朴结构鉴定中的用途。

在本发明的第五方面中，提供了一种试剂盒，其包含：本发明的荧光素酶活性片段或其编码序列。

在一个优选例中，所述试剂盒还任选包含：用于测试的容器、缓冲液、底物、稀释剂和/或使用说明书。

在本发明的第六方面中，提供了一种制备荧光素酶活性片段的方法，所述方法包括步骤：使得Gaussia荧光素酶缺失N端37个氨基酸残基。

在一个优选例中，所述缺失是通过化学合成、或使用重组技术从原核或真核宿主中产生相关序列而完成的，优选所述宿主选自：细菌、酵母、高等植物、昆虫或哺乳动物细胞。

在本发明的另一实施方式中，提供了一种鉴定蛋白质拓朴结构的方法，所述方法包括：

将荧光素酶活性片段插入待确定其拓朴结构的蛋白质的不同位点，从而获得融合蛋白；以及

检测融合蛋白所产生的荧光强度；

若荧光强度低，则表明融合位点位于细胞质中；

若荧光强度高，则表明融合位点位于周质空间中。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图简述

图1：Gaussia荧光素酶(GLuc)的一级序列分析和二硫键的质谱鉴定及GLuc148的DNA序列。

图1A为Gluc的一级结构，其中示出了经质谱法鉴定所确认的三对二硫键C2-C3、C4-C5和C9-C10；

图1B为根据原核生物和真核哺乳动物偏爱密码子合成的Gluc 185和GLuc 148的DNA序列(SEQ ID NO：1)；

图1C为人工合成GLuc 148的DNA序列与天然序列的比较。

图2：活性片段GLuc 148的克隆、纯化和鉴定。

图2A为通过实施例2所述方法分离得到蛋白质的凝胶过滤层析图；

图2B为目的蛋白的SDS-PAGE电泳鉴定。

图3：活性片段GLuc 148的荧光发光光谱。

图3A为野生型Gaussia荧光素酶的作用底物腔肠素(Coelenterazine)的结构示意图；

图3B为由Gluc催化底物的氧化反应，该反应生成CO2并同时发出波长为480nm的蓝光；

图3C为纯化得到的活性片段GLuc 148催化腔肠素的氧化反应时的发光光谱。

图4：活性片段GLuc 148与野生型GLuc、以及Gluc 169和Gluc 142的发光活性比较，以荧光素酶浓度为横坐标，发光强度为纵坐标，取对数作图。

图4A为活性片段GLuc 148与野生型GLuc的发光活性比较；

图4B为活性片段GLuc 148与Gluc 169和Gluc 142的发光活性比较。

图5：不同CcmH片段融合GLuc 148在活体大肠杆菌中表达的发旋光性质。

图5A为不同CcmH片段融合GLuc 148在活体大肠杆菌中表达的相对发光强度，CcmH123-GLuc 148，CcmH138-GLuc 148，CcmH196-GLuc 148，CcmH256-GLuc 148，CcmH288-GLuc 148和CcmH345-GLuc 148分别表示将GLuc 148融合在大肠杆菌内膜蛋白CcmH的不同位点所形成的融合片段；

图5B为通过免疫印迹法检测融合蛋白的表达量(抗His-tag抗体)。

图6：GLuc 148和GLuc在真核细胞中表达的发光活性比较。

图6A为GLuc 148和GLuc在HEK 293T表达量(抗myc抗体)；

图6B和图6C分别为GLuc和GLuc 148在真核细胞中表达后，在细胞裂解液和培养液中的荧光素酶活性。

图7：免疫印迹法检测活性片段GLuc 148和N端缺失43个AA的Gluc142在真核细胞中表达的表达稳定性。

其中，以pCDNA3.1为空质粒阴性对照。

具体实施方式

本发明人通过长期而深入的研究发现，通过使得Gaussia荧光素酶(Gluc)N端37个氨基酸缺失的方法，可获得一种Gluc的活性片段(命名为GLuc 148)。经研究表明，该活性片段Gluc 148具有与野生型GLuc相似的生化性质，发光活性高、不需要辅因子、稳定性好，并且与全长的GLuc相比，Gluc 148具有分子量更小、在真核细胞中非分泌型表达的优点，更适合作为报告基因和应用于活体成像、高通量筛选、微生物检测等技术领域。

并且，与N端缺失更多个氨基酸残基(例如，N端缺失43个氨基酸残基的Gluc142)的荧光素酶相比，虽然缺失更多氨基酸残基的荧光素酶具有更小的分子量，但其在真核系统(如pcDNA 3.1/HEK 293T系统)中不表达或很快被降解，而Gluc148能够很好的真核表达。

在此基础上，本发明人完成了本发明。

Gaussia荧光素酶的活性片段

如本文所用，术语“Gaussia荧光素酶的活性片段”、“Gluc的活性片段”、“Gluc 148”或“本发明的活性片段/蛋白质或多肽”可互换使用，均表示使得Gaussia荧光素酶的N端37个氨基酸缺失后得到的仍然具有与野生型Gluc相似的发光活性的蛋白质或多肽(Gluc 38-185)，且可在真核或原核细胞中稳定表达。

本发明的蛋白质或多肽可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

该定义中也包括具有荧光素酶活性的上述蛋白质或多肽的变异形式。所述蛋白质或多肽的序列包括但不限于：(a)SEQ ID NO：2所示的序列；或(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有荧光素酶活性的由(a)衍生的蛋白质或多肽。优选，所示蛋白质或多肽具有SEQ ID NO：2所示的序列。

本发明蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-30个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能；同源序列；保守性变异体；等位变异体；天然突变体；诱导突变体；在高或低的严紧度条件下能与Gluc 148蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白。

可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(b)中的蛋白质或多肽。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明活性片段的编码序列

如本文所用，术语“Gaussia荧光素酶活性片段的编码序列”、“Gluc 148编码序列”或“Gluc 148的DNA序列”可互换使用，均是指编码并可在原核生物和/或真核生物载体中表达出本发明的活性蛋白质或多肽的核苷酸序列。

优选根据原核生物和真核生物(如哺乳动物)的密码子偏爱，对所述编码序列进行优化，以使其能在原核细胞和真核细胞中高效表达。在本发明中，所述编码序列包括但不限于：(i)如SEQ ID NO：1所示的序列；(ii)在严格条件下能与SEQ ID NO：1的序列杂交的分子。

如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为SEQ ID NO：1序列的互补序列。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。

本发明活性片段的特点及用途

本发明的Gluc 148活性片段的长度为148Aa，其分子量仅为16kDa，与野生型GLuc(185Aa，19.9kDa)相比，具有长度更短、分子量更小的特点，由此可具有更高的稳定性。并且，本领域技术人员更容易通过例如化学合成等方法获得Gluc 148、对其进行进一步的性质改造和优化、或使该小片段与其它多肽或蛋白质融合以用于报告或检测等用途。

本发明的Gluc 148活性片段具有与野生型Gluc荧光素酶相似的生化性质和发光活性，且其与底物的荧光反应无需辅因子的存在，具有反应便捷、易于检测等特点。

并且，本发明的Gluc 148活性片段在原核或真核细胞中非分泌型表达，基本上不分泌到细胞培养物中。而现有技术中的Gluc为分泌型表达，无法用于活体成像，并且Gluc在细胞培养物和细胞裂解物中均会产生荧光，从而在检测时造成较高背景荧光，影响测定的准确性。因此，本发明的Gluc 148活性片段更适于作为报告基因应用于活体成像、高通量筛选及微生物检测等技术领域。

并且，与N端缺失更多个氨基酸残基(例如缺失43个氨基酸残基的Gluc 142)的荧光素酶相比，虽然缺失更多氨基酸残基的荧光素酶具有更小的分子量，但其在真核系统(如pcDNA 3.1/HEK 293T系统)中不表达或很快被降解，而本发明的Gluc 148则能进行稳定的真核表达。

本发明的活性荧光素酶片段或其编码序列可用作报告因子、荧光能量供体，并可用于细胞或活体成像、药物的高通量筛选、微生物检测或蛋白质拓朴结构鉴定中。

例如在鉴定蛋白质拓朴结构中，可将荧光素酶活性片段插入待确定其拓朴结构的蛋白质的不同位点，从而获得融合蛋白；然后检测融合蛋白所产生的荧光强度；若荧光强度低，则表明融合位点位于细胞质中，若荧光强度高，则表明融合位点位于周质空间中(荧光素酶活性片段的正确折叠而产生较高的活性有赖于周质空间中的折叠酶)。该方法与本领域中常用于鉴定蛋白质拓朴结构的方法(例如磷脂酶活性法，化学修饰法)相比，具有更高的灵敏度，且操作更为简便。

含有本发明活性片段或其编码序列的试剂盒

本发明活性片段或其编码序列可用于制备试剂盒，所述试剂盒中除了包括所述活性片段或其编码序列以外，还可任选包含(包括但不限于)：容器、底物、缓冲液、稀释剂和/或使用说明书。

本发明的试剂盒可用于细胞或生物的活体成像、高通量筛选(例如药物筛选)、微生物检测或蛋白质拓朴结构鉴定等技术领域。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验手册》(Molecular cloning：A laboratory manual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.Gaussia荧光素酶(GLuc)的一级序列分析和二硫键的质谱鉴定

对已知的GLuc一级序列进行分析，并采用质谱法对其中二硫键所在位置进行确认。

试验结果显示：GLuc的一级序列(图1A)共含有185个氨基酸残基；其N端为一段17Aa的信号肽序列，指导分泌型表达；核心酶(其在序列中的范围为44～185Aa)具有两个同源性很高的亚结构域，各含有五个半胱氨酸残基；经Ellman法测定，GLuc不含游离的半胱氨酸巯基，形成五对二硫键。用质谱法进一步鉴定，确认了其中三对二硫键：C2-C3、C4-C5和C9-C10，另有两对二硫键尚未确定。

实施例2.Gluc全基因和Gluc 148DNA序列的人工合成、其克降、表达及目的对 比的纯化

根据原核生物和真核哺乳动物的密码子偏爱，优化Gluc全基因的部分密码子和Gluc 148(Gluc 38-185)DNA序列的部分密码子，使其能在原核细胞和哺乳动物细胞中高效表达。经密码子优化的Gluc 185和Gluc 148的DNA序列示于图1B中，Gluc 148的DNA序列与原基因序列的比较示于图1C中。

将所得优化的GLuc、GLuc148基因分别克隆到pET-22b(+)质粒(购自Novagen)中，并用该质粒转化大肠杆菌OrigamiB菌株(购自Novagen)，37℃条件下过夜培养。将培养物接种到培养基(LB培养基)，37℃培养3小时，加入IPTG(终浓度50μM)，22℃诱导8小时。离心菌体，破碎再离心，取上清结合于Ni-NTA柱(购自Qiagen)，用20mM咪唑洗去杂蛋白后，再用250mM咪唑洗脱目的蛋白。离心浓缩初级分离的蛋白质，采用凝胶过滤层析进一步纯化得到目的蛋白(图2A)，并用SDS-PAGE电泳鉴定所得目的蛋白(图2B)。

凝胶过滤层析和SDS-PAGE电泳结果分别如图2A和2B所示。图2A显示：凝胶过滤层析能够将Gluc 148与杂蛋白很好地分离开来。图2B显示：GLuc 148性质稳定，且分子量小于GLuc。

实施例3.活性片段GLuc 148的荧光发光光谱

采用荧光光度计(购自Varian，型号Cary Eclipse)对Gluc 148的荧光发光光谱进行研究，用于测试的溶液是50mM PBS，pH7.8，500mM NaCl，浓度的GLuc148，在反应体系中，于室温下催化腔肠素(终浓度1μM)氧化发光(反应时间为10秒)。在400-580nm间获取荧光发光光谱。

野生型Gaussia荧光素酶是以腔肠素(Coelenterazine)(结构参见图3A)为底物的荧光素酶，催化底物的氧化反应(如图3B所示)，该反应中生成CO₂，并同时发出波长为480nm的蓝光。图3C为纯化得到的活性片段GLuc 148催化腔肠素的氧化反应时的发光光谱，可见GLuc 148的最大发射波长位于480nm，与野生型GLuc一致。

实施例4.活性片段GLuc 148与野生型GLuc、及与N端缺失17个Aa的Gluc 169和 N端缺失43个Aa的Gluc 142的发光活性的比较

在六个数量级(10^-12～10^-7)上分别取相同浓度的GLuc 148、Gluc 169(N端缺失17个Aa)、Gluc 142(Gluc的N端缺失43个Aa)和GLuc，在50mM PBS，pH 7.8，500mM NaCl反应体系中，催化腔肠素(终浓度1μM)氧化发光，反应时间为10秒，测量波长480nm处的相对发光值(Promega GloMax 20/20Luminometer)。以荧光素酶浓度为横坐标，以生物发光强度为纵坐标，均取对数作图，结果如图4所示。

结果显示：GLuc 148、Gluc 169、Gluc 142和GLuc在六个数量级上，发光强度和酶浓度具有基本相同的线性关系。该结果表明：活性片段Gluc 148、Gluc169、Gluc 142和野生型GLuc的酶活性一致。

实施例5.活性片段GLuc 148用于分析膜蛋白的拓扑结构

采用常规方法构建表达融合蛋白的载体，将活性片段GLuc 148融合在大肠杆菌内膜蛋白CcmH的不同位点，从而获得如下融合产物：CcmH 123-GLuc 148、CcmH 138-GLuc 148、CcmH 196-GLuc 148、CcmH 256-GLuc 148、CcmH288-GLuc 148和CcmH 345-GLuc 148。

将含有融合基因表达质粒的大肠杆菌在22℃诱导8小时后，置于冰上30分钟，取10μl菌液，用加入485μL新鲜的LB培养基稀释，再加入5μL底物CTZ(100μM)，立即检测发光强度。

大肠杆菌是革兰氏阴性菌，在外膜和内膜之间形成一个被称为“周质空间”的类似内质网的空腔。不同于细胞内的还原环境(GLuc 148在细胞内不能正确折叠成有活性的形式)，周质空间内提供氧化环境并含有很多二硫键异构酶，从而有利于含有二硫键蛋白的正确折叠。

实验结果显示：虽然融合蛋白的表达量并没有很大的差异(图5B)，但融合的GLuc 148活性有很大的不同(图5A)。融合蛋白CcmH 123-GLuc 148和CcmH138-GLuc 148所产生的荧光强度较弱，反映了荧光素酶活性很低，这表明CcmH的123位和138位的氨基酸残基位于细胞质中；而CcmH 196-GLuc 148、CcmH256-GLuc 148、CcmH 288-GLuc 148和CcmH 345-GLuc 148所产生的荧光强度较高，反映了荧光素酶活性很高，从而证明这些融合位点在周质空间(周质空间的氧化环境有利于GLuc 148的折叠形成正确的构象)中。

该结果与采用化学修饰法获得的CcmH拓朴结构的结果相吻合，但比化学修饰法更方便。

上述结果提示：通过在膜蛋白的不同位点融合GLuc 148，再原位检测荧光素酶活性的方法，可用于研究大肠杆菌内膜蛋白的拓扑结构。

实施例6.活性片段GLuc 148和GLuc在真核细胞中表达的发光活性比较

首先，实现GLuc 148和GLuc在真核细胞中的表达。将GLuc和GLuc 148基因克隆到真核载体pcDNA 3.1/myc-His(购自Invitrogen)，转化HEK 293T细胞(购自ATCC)，表达48小时后，采用免疫印迹法检测表达，检测结果如图6A所示。由图可见，活性片段GLuc 148和野生型GLuc均可在真核体系中表达。

取细胞裂解液上清和细胞培养液，将两者稀释到同一比例(具体为细胞培养液为1ml，细胞裂解液上清为100μl，将其稀释10倍至与细胞培养液为同一比例)，酶活测定体系为50mM PBS，pH7.8，500mM NaCl，[CTZ]＝1μM，反应时间为10秒，测量波长480nm处的相对发光值(Promega GloMax20/20Luminometer)。测定结果分别如图6B和图6C所示。

由结果可见：相对于GLuc 148和GLuc的表达量，活性片段GLuc 148在细胞裂解液中表达的发光活性与GLuc相近；但野生型的GLuc的表达活性85％分泌至培养液中，而活性片段GLuc 148则有99.8％的活性为非分泌型表达。

上述结果表明：GLuc 148可在细胞内以高稳定性表达，由此可用于蛋白质在真核细胞中的定位，区分分泌型(细胞外培养液)，在内质网(氧化环境)或细胞液(还原环境)中的定位；更适合作为报告因子和荧光能量供体，应用于细胞和活体成像、高通量筛选、微生物检测等技术领域。

实施例7.活性片段GLuc 148和N端缺失43个AA的Gluc 142在真核细胞中表达的 表达稳定性比较

将Gluc、Gluc 148和编码N端缺失43个Aa的荧光素酶的Gluc 142基因克隆到真核载体pcDNA 3.1/myc-His(购自Invitrogen)中，以空质粒作为阴性对照，转化HEK 293T细胞(购自ATCC)，表达48小时后，采用免疫印迹法检测表达，检测结果如图7所示。

结果表明：Gluc 142在pcDNA 3.1/HEK 293T系统中不表达或很快被降解，而Gluc 148能够很好的真核表达，具有较高的表达稳定性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>荧光素酶活性片段及其应用

<130>095375

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>444

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(444)

<400>1

acc gat ctg gac gcc gac cgg ggc aaa ctc cca gga aag aag ctc cct    48

Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro Gly Lys Lys Leu Pro

1               5                   10                  15

ctg gaa gtc ctc aaa gaa atg gag gct aac gct cgg aag gca gga tgc    96

Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys

            20                  25                  30

acc aga gga tgt ctg atc tgt ctg agc cac att aaa tgc act ccc aag    144

Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys Cys Thr Pro Lys

        35                  40                  45

atg aag aag ttc att ccc ggc agg tgt cat aca tac gag ggc gac aaa    192

Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr Tyr Glu Gly Asp Lys

    50                  55                  60

gag tcc gcc caa ggg gga atc ggg gag gcc atc gtg gac atc ccc gag    240

Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu

65                  70                  75                  80

att cct gga ttc aag gac ctc gaa cca atg gaa cag ttc att gct caa    288

Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala Gln

                85                  90                  95

gtg gac ctc tgc gtg gac tgc acc act ggg tgc ctg aaa ggg ctg gca    336

Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala

            100                 105                 110

aat gtc caa tgc tcc gat ctg ctg aag aag tgg ctc cca caa agg tgc    384

Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Gln Arg Cys

        115                 120                 125

gct aca ttc gcc tcc aaa atc caa gga cag gtc gat aag atc aaa ggc    432

Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val Asp Lys Ile Lys Gly

    130                 135                 140

gct ggc gga gat                                                    444

Ala Gly Gly Asp

145

<210>2

<211>148

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro Gly Lys Lys Leu Pro

1               5                   10                  15

Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala Arg Lys Ala Gly Cys

            20                  25                  30

Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile Lys Cys Thr Pro Lys

        35                  40                  45

Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr Tyr Glu Gly Asp Lys

    50                  55                  60

Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile Val Asp Ile Pro Glu

65                  70                  75                  80

Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu Gln Phe Ile Ala Gln

                85                  90                  95

Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys Leu Lys Gly Leu Ala

            100                 105                 110

Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp Leu Pro Gln Arg Cys

        115                 120                 125

Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val Asp Lys Ile Lys Gly

    130                 135                 140

Ala Gly Gly Asp

145

Claims (9)

1.一种荧光素酶活性片段，其特征在于，所述活性片段的序列是Gaussia荧光素酶缺失N端37个氨基酸残基所形成的序列，并且所述活性片段具有与野生型Gaussia荧光素酶一致的荧光素酶活性，其中所述活性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的荧光素酶活性片段，其特征在于，所述活性片段适于在原核或真核细胞内表达。

3.权利要求1或2所述的荧光素酶活性片段的编码序列。

4.如权利要求3所述的编码序列，其特征在于，所述编码序列选自：

(i)如SEQ ID NO:1所示的序列。

5.如权利要求3所述的编码序列，其特征在于，所述编码序列经密码子偏爱优化。

6.权利要求1或2所述的荧光素酶活性片段或权利要求3-5中任一项所述的编码序列在作为报告因子或荧光能量供体中的用途。

7.权利要求1或2所述的荧光素酶活性片段或权利要求3-5中任一项所述的编码序列作为报告因子或荧光能量供体在细胞或活体成像、药物的高通量筛选、微生物检测或蛋白质拓扑结构鉴定中的用途，其中，所述用途不用于疾病的诊断和治疗目的。

8.一种试剂盒，其包含：权利要求1或2所述的荧光素酶活性片段或权利要求3-5中任一项所述的编码序列。

9.一种鉴定蛋白质拓扑结构的方法，所述方法包括：

将荧光素酶活性片段插入待确定其拓扑结构的蛋白质的不同位点，从而获得融合蛋白；以及

检测融合蛋白所产生的荧光强度；

若荧光强度低，则表明融合位点位于细胞质中；

若荧光强度高，则表明融合位点位于周质空间中；

其中所述活性片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

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