CN113846019A - 一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法。将含有用海洋微拟球藻密码子优化的Cas9失活蛋白、表观遗传修饰效应蛋白M3M14和靶基因引导序列的载体导入微拟球藻获得突变体，突变株经培养后实现对靶基因的表观基因组编辑，从而定向提高靶基因的转录水平。本发明为海洋微拟球藻基因表观遗传调控功能研究和表观维度的遗传改良提供了一种新的模型和可行性方法，将为其它模式藻株的分子育种提供借鉴。

Description

一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法。

背景技术

海洋微拟球藻是一种单细胞真核光合微藻，广泛分布于海洋、湖泊、沼泽等不同栖息水域。它们富含叶绿素a、类胡萝卜素、虾青素等光合色素、蛋白质和多不饱和脂肪酸，并且生长迅速。由于其具有较高的油脂含量、较好的环境适应性及适于烟道气培养等特性，在微藻生物燃料、微藻膳食补充剂、水产养殖饲料等产业备受青睐，是“蓝色粮仓”的重要生物资源之一。随着近些年合成生物学的兴起，微拟球藻已经发展为重要的合成生物学光合底盘细胞之一。近些年来，在国内外不同团队的努力下，微拟球藻中相继建立了较完善遗传操作工具。如基于电转化或基因枪等遗传转化方法在几株微拟球藻(N.oceanica IMET1，N.oceanica CCMP1779，N.oceanica CCMP526，N.oceanica CCMP526等)代表种也基本已经建立，正反向遗传学工具如随机插入突变、过表达、RNAi技术和同源重组的方法在不同种(如N.salina)里面也有报道。另外，基因编辑技术在几株代表物种(如N.salina)也已经建立，如基于episome的无选择压力基因编辑等。同时，在不同的微拟球藻藻株也开展了基于转录组和蛋白质组的研究，发现了一系列调控光合固碳、油脂合成代谢的调控靶点，那么遗传工具在验证基因功能和代谢途径改造方面就有了用武之地。然而，基因的表达调控是受多方面制约的，除了受mRNA和蛋白质本身调控，DNA、RNA和蛋白质上面的化学修饰在调控基因表达方面也发挥着重要作用，这就是表观遗传修饰调控。另外，微拟球藻中存在众多的表观遗传相关的酶(如甲基化或去甲基化、乙酰化或去乙酰化等)，并且这些酶在不同胁迫条件下呈现差异表达，推测它们在基因表达调控中起着关键作用。因此，怎样从表观遗传修饰层面调控基因表达也是亟待解决的重要课题。

近几年来CRISPR/Cas9基因编辑技术的广泛使用使得很多以前很难完成的实验想法得以轻松完成，充分显示了Cas9的强大威力。也许基因组范围的基因编辑大家很熟悉，但是近一年来有关表观基因组的基因编辑方兴未艾，目前世界上很多实验室在开始在这个方向进行努力突破。从表观遗传修饰角度进行调控基因表达，在哺乳动物和植物体系目前都已有所开展，尤其是在哺乳动物研究体系，相继开发了以P300为代表的靶向乙酰化修饰(以CRISPR/dCas9为基础，dCas9-P300结合到靶DNA增强子或启动子上，促进组蛋白H3K27发生乙酰化，从而导致基因激活)调控基因表达。此方法可重塑靶区域的表观遗传修饰，进而激活或抑制增强子及其靶基因的转录活性。与其他方法相比，此技术不仅表现出了更稳定的增强子激活或抑制效应，同时还显示了其靶向的高特异性。众所周知，DNA甲基化是表观遗传学领域中最重要的研究方向之一。但是如何在特定区域实现精准的DNA甲基化编辑，长期以来都是一个难以解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋微拟球藻靶向表观基因遗传调控方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法，将含有经海洋微拟球藻密码子优化Cas9失活蛋白、表观遗传修饰效应蛋白M3M14和靶基因引导序列的载体导入微拟球藻获得突变体，突变株经培养后实现对靶基因的表观基因组编辑，从而定向提高靶基因的转录水平。

所述载体以微拟球藻用Cas9表达载体(pNOC-ARS-CRISPR)作为骨架，包含Cas9失活蛋白(即dCas9)、表观遗传修饰效应蛋白M3M14、抗性选择标记基因、至少一个gRNA靶基因引导序列和增强表观遗传修饰的特异序列(SunTag序列)。

SunTag序列：SunTag实质上是一套分子挂钩，其能够将多个拷贝的生物活性分子挂到可用来靶向一些基因或其他的分子的蛋白质支架上，在整合了SunTag的CRISPR分子可用于精确地控制基因组内大量基因的表达。

所述系统以微拟球藻用Cas9表达载体(pNOC-ARS-CRISPR)作为骨架，其含有内源启动子和终止子，其中，启动子为Ribi双向启动子和LDSP启动子，终止子为LDSP终止子。

所述骨架载体Ribi双向启动子一端依次连接dCas9蛋白、表观遗传修饰的特异序列和表观遗传修饰效应蛋白，其驱动dCas9蛋白和表观遗传修饰蛋白融合表达；另一端连接gRNA靶基因引导序列，其驱动gRNA表达；潮霉素抗性基因位于骨架载体LDSP启动子下游，由LDSP驱动表达。

所述载体中含至少一个gRNA靶基因引导序列；其中，所述靶基因引导序列为与性状相关的候选基因，也可是能够调控靶基因表达的非编码序列；所述多个gRNA支架序列时由多个靶基因设计的gRNA串联形成。

进一步的说，针对微拟球藻骨架载体pNOC-ARS-CRISPR，串联设计融合表达用于特定靶基因表观基因编辑的关键结构dCas9-SunTag-M3M14。即在微拟球藻中融合表达dCas9-SunTag-M3M14三个蛋白置于同一读码框的三联复合物(微拟球藻密码子优化，改变了GC含量，使其更适合在微拟球藻中表达或表达效率更高)，并在每个结构之前连接前导核定位信号(SLV40；用于核定位表达，提高dCas9蛋白和表观遗传修饰结构域表达拷贝数)。此外，SunTag序列(选用10XGCN4)用以提高表观遗传修饰效率，增强表观基因编辑M3M14，也是用核定位表达提高表达效率。

上述提及dCas9蛋白是由点突变获得的失活切割靶序列功能的蛋白，只保留此基因的靶向功能，而原来Cas9蛋白切割靶DNA序列的功能消失，并且为了提高表达效率，经密码子优化改变了GC含量，使其更适合在微拟球藻中表达；

gRNA编辑序列为微拟球藻碳酸酐酶基因(此基因与微拟球藻碳浓缩机制息息相关)以及基因组上的任何DNA序列(可以针对不同靶基因设计gRNA序列)；

抗性基因为潮霉素基因以及所有对应于微拟球藻敏感的抗生素、农药的基因；

表观遗传修饰效应蛋白M3M14为微拟球藻密码子优化(使其适合在微拟球藻中表达)的外源蛋白结构域，并且包含经密码子优化的核定位信号序列；

上述与性状相关的候选基因为直接或间接参与光合、固碳、抗逆、油脂积累、耐高温、耐高CO₂浓度、耐酸、耐氧胁迫、耐水胁迫相关的基因，也可是与上述性状相关的非编码RNA，比如长链非编码RNA(lncRNA)等。

所述gRNA靶基因引导序列以碳酸酐酶(g6125)为靶基因设计获得。

所述载体为SEQ ID NO:1所示，其中，密码子优化的dCas9蛋白的碱基为SEQ IDNO:1中从2404bp到6504bp，密码子优化的表观遗传修饰效应蛋白M3M14为SEQ ID NO:1中从7447bp到8139bp，密码子优化的抗性选择标记基因为SEQ ID NO:1中从10545bp到11570bp，密码子优化的增强表观遗传编辑的特异序列为SEQ ID NO:1中从6682bp到7286bp。

所述载体的构建方法：

(1)重组质粒的构建，即(1)利用骨架载体构建包含有Cas9失活蛋白、启动子和终止子，以及潮霉素抗性基因，将原载体Cas9蛋白失活为dCas9蛋白；(2)将表观遗传修饰效应蛋白M3M14和增强表观基因编辑的SunTag序列连接到dCas9蛋白下游，并由同一启动子驱动表达；(3)将至少一个gRNA支架序列连接到所述上述重组质粒上，构建载体。

将所述突变株经培养后实现对碳酸酐酶(g6125)的表观基因组编辑，而后于在空气水平CO₂浓度380-400ppm下培养，光强控制在50±10umol/m²/s，通气速率在100±5ml/min条件下培养，从而实现碳酸酐酶编码RNA的m6A甲基化的定向激活，实现其靶基因表观基因组的遗传调控。

本发明所具有的优点：

本发明方法通过构建微拟球藻的基于CRISPRa(dCas9-SunTag-M3M14介导的表观编辑)表观基因编辑表达系统。通过特定靶基因的gRNA或多个靶基因gRNA的串联，能够有效的激活微拟球藻靶基因的转录水平，并通过分子和生理表型筛选获得转基因突变藻株，再通过突变株的表型筛选和生理参数评估，使其实现对靶基因的表观基因遗传调控。与现有技术相比，本发明实现了微拟球藻基因组工程技术的重点突破，具有如下有益效果：

1.众所周知，微拟球藻中已经相继建立了较完善的基因操作工具，但都是基于传统调控模式的基因修饰，如基因过表达、基因编辑和基因敲低等都需要改变基因序列本身，而表观基因组编辑是在不改变基因序列本身的前提下实现调控基因表达，是基因表达调控的另一维度。本发明旨在海洋微拟球藻中建立基于dCas9-M3M14/gRNA基因表观遗传编辑平台，其使用失活dCas9联合使用表观遗传修饰结构域M3M14，在gRNA引导下，利用dCas9的招募功能从而实现靶基因被表观遗传修饰，并且此载体可串联多个gRNA，也就是可用于多基因的表观遗传修饰，用于基因功能研究及大规模基因功能研究，特别是非编码RNA研究的首选工具。

2.本发明提供用于微拟球藻代谢工程改造或合成生物学底盘细胞设计的dCas9-SunTag-M3M14/gRNA(CRISPRe)表观遗传控制系统。利用该CRISPRe系统可用于解析微拟球藻基因组中所有相关蛋白、酶和非编码RNA的调控机理并用于改良特异的生物性状(如提高光的捕获、吸收与利用和能量转化效率，改善多元抗逆性能、大幅提高生物质产量和提高油脂产量等)，可实现在不改变基因序列本身的前提下，改善微拟球藻相关特异性状。

3.本发明提供用于微拟球藻基因表观基因编辑(CRISPRe)的dCas9-SunTag-M3M14/gRNA序列，包含设计并密码子优化的SunTag序列，可用于微拟球藻通用的遗传修饰体系或多个种属单细胞微藻通用的表观遗传改造体系。

4.本发明能够靶向表观控制和转录调控微拟球藻的內源基因和非编码序列(如长链非编码RNA、环状RNA等)，利用甲基转移酶基因构建微拟球藻的dCas9-SunTag-M3M14/gRNA基因表观基因编辑体系。

5.本发明利用微拟球藻碳酸酐酶基因作为表观编辑的靶基因，主要是研究中发现此基因在不同二氧化碳浓度下，此基因的m6A甲基化水平存在差异变化，而且是被低碳诱导表达，推测此碳酸酐酶基因的转录可能受m6A甲基化调控，因此用dCas9-SunTag-M3M14/gRNA基因表观基因编辑体系靶向提高其m6A甲基化水平，从而提高其转录活性。

6.本发明表观基因编辑系统能够调控微拟球藻內源基因的转录和翻译水平，从而影响到靶基因的代谢途径。

7.借助本发明构建的表观遗传工程微藻，可具备更加优越的多元抗逆性能，如抗虫性、抗病性、抗盐耐旱、抗除草剂等。设计与构建针对特定工程微藻的低成本高光效反应设施，降低规模培养成本。并且微拟球藻是积累高附加值底物(多不饱和脂肪酸如EPA和DHA、色素、虾青素、甾醇等)，借助本发明构建的表观基因编辑工程微藻，可以进一步提高其高附加值产物的产量；同时微拟球藻具有光合效率高、繁殖快、环境适应性强的特点，借助本发明构建的表观遗传工程微藻，可以进一步提其固碳效率，从而可以有效的固定二氧化碳，降低大气中二氧化碳的浓度；

8.微拟球藻核基因组序列、叶绿体基因组序列以及non-coding RNA组序列已经测定，借助本发明可以在微拟球藻对其进行功能基因组学研究以及核基因组和叶绿体基因组之间的相互作用；还可以在微拟球藻对其进行功能基因组学研究；同时，可以在微拟球藻中对其进行功能基因组学研究，对于非编码RNA的研究，借助CRISPRe系统；

9.微拟球藻可筛选条件特异启动子，比如强光诱导型、蓝光诱导型、营养盐诱导型启动子来驱动本方法所属表观遗传编辑系统，即可实现条件特异表观遗传修饰与编辑。另外也可筛选特定细胞器表达的启动子再驱动本方法所属表观基因编辑系统，即可实现叶绿体或线粒体基因的表观遗传修饰。因此，本系统可用于开发时空特异的表观基因(组)编辑与转录调控表达，也可用于非编码转录组的表达调控。

10.利用此表观遗传系统具有显著优势，可大大减少突变株在实际应用中的不安全性问题。由于表观遗传修饰不会改变DNA序列编码，从而提高了环境释放的安全性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的人工合成可同时表达dCas9蛋白、密码子优化M3M14表观修饰结构域、密码子优化SunTag序列、gRNA和潮霉素基因的表观基因编辑系统表达载体物理图谱。

图2为本发明实施例提供的靶基因碳酸酐酶在不同CO₂浓度下m6A甲基化的富集及其修饰丰度。

图3为本发明实施例提供的表观遗传编辑突变株和野生型微拟球藻(野生型和突变株)中靶基因碳酸酐酶在转录水平的表达，其中WT为野生型。

图4为本发明实施例提供的表观遗传编辑突变株和野生型微拟球藻(野生型和突变株)中靶基因碳酸酐酶的mRNA的6mA水平丰度变化，其中WT为野生型。

图5为本发明实施例提供的微拟球藻甲基转移酶表观基因编辑突变株的生长情况。

图6为本发明实施例提供的微拟球藻碳酸酐酶表观基因编辑突变株(M1和M3)以及野生型(白色圆圈)的生长曲线表型鉴定。

图7为本发明实施例提供的微拟球藻碳酸酐酶表观基因编辑突变株的光合参数测量。

图8为本发明实施例提供的微拟球藻碳酸酐酶表观基因编辑突变株的光合放氧速率参数测量。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

本发明利用含表观遗传修饰结构域M3M14的招募下通过增加靶序列或位点的m6A甲基化水平进行调控特定靶基因，表观基因组遗传调控基于基因编辑在海洋微拟球藻中建立dCas9-M3M14/gRNA基因表观遗传编辑系统，其中，转录CRISPRe催化失活的Cas9(dCas9)连上表观遗传修饰系统，可以有效促进基因组特定位点的表观基因组编辑，即在微拟球藻中引入SunTag和M3M14系统，其中SunTag系统类似一套分子挂钩，其能够将多个拷贝的生物活性分子挂到可用来靶向一些基因或其它的分子的蛋白质支架上，而M3M14催化结构域具有表观遗传修饰功能，它能够在RNA的A上添加甲基，将二者融合并在dCas9蛋白靶向作用下实现特定基因的表观遗传编辑和转录激活。

所获得的微拟球藻转基因表观遗传修饰系统突变株，是通过高压电击法或基因枪法等其他直接导入方法，将含有本发明的dCas9-SunTag-M3M14/gRNA载体导入微拟球藻,通过利用dCas9蛋白在gRNA的指导下的靶向功能和利用M3M144表观遗传修饰的功能实现特定基因的表观基因组编辑，从而定向提高靶基因的转录水平。

实施例：

实现内源基因碳酸酐酶基因(g6125)在微拟球藻中的靶向表观基因编辑系统的构建：

一、人工合成可以表达dCas9蛋白(密码子优化，通过GC含量调整以适合在微拟球藻中表达)，M3M14表观遗传修饰催化结构域(密码子优化)，SunTag序列(密码子优化)，潮霉素抗性基因(密码子优化)，核定位信号SLV(密码子优化)的转录激活载体(CRISPR/dCas9-Suntag-M3M14):

1)骨架载体：利用已知的海洋微拟球藻基因组(NCBI：ASM187094v1)序列，以该微拟球藻基因编辑载体(pNOC-ARS-CRISPR)为骨架，骨架载体中含内源启动子(Ribi和LDSP)和LDSP终止子，其为能够驱动表达Cas9蛋白表达可基因编辑的表达载体。

2)合成dCas9蛋白：将Cas9蛋白失活或用失活的dCas蛋白(DNA序列全部合成)置换掉原载体Cas9蛋白。即，Cas9蛋白失活采用现有基因合成方式将原Cas9蛋白的DNA序列第2539-2541位点(CAT)突变为(GCC)，使其失去切割靶序列功能，只保留其靶向功能；或是，直接采用化学合成方式合成海洋微拟球藻的dCas9蛋白全序列。

3)M3M14结构域来自常用在植物或哺乳动物系统的序列，其能够催化mRNA的甲基化，本实施例选自源于哺乳动物(人Hela细胞)的同源序列并按照现有技术进行密码子优化，使其适于在海洋微拟球藻中表达，其M3M14序列(3’-5’)：从序列表1中5187bp到5336bp，长度为150bp，

SunTag序列来自常用在植物或哺乳动物系统的序列，本实施例选自源于植物(拟南芥)的并按照现有技术进行密码子优化，使其适于在海洋微拟球藻中表达，其SunTag序列(3’-5’)：

从序列表1中5397bp到6101bp，长度为705bpDNA，

核定位信号SLV40来自原载体pNOC-ARS-CRISPR，其DNA序列为CCGAAAAAGAAGAGGAAGGTC。

4)表观遗传编辑载体构建：

将上述合成的dCas9蛋白，M3M14结构域(与dCas9蛋白融合表达)，SunTag序列(与dCas9蛋白融合表达)，潮霉素抗性基因，分别放在不同的启动子下游分别表达；其中，dCas9蛋白、10XSunTag和M3M14由Ribi双向启动子驱动表达，gRNA也由Ribi双向启动子驱动表达。潮霉素抗性基因由LDSP启动子驱动表达(图1)；同时，所述dCas9蛋白、增强表观遗传修饰的特异序列和表观基因编辑效应蛋白之前均通过前导核定位信号连接(即，核定位信号SLV40)；具体过程为：首先，将载体pNOC-ARS-CRISPR中Cas9蛋白的切割靶序列功能结构域进行点突变设计，再合成密码子优化的dCas9蛋白的DNA序列(即，两端设计有酶切位点PspXI和HpaI，用于换掉原载体Cas9蛋白)，获得失活dCas9蛋白的载体(即上述合成dCas9蛋白)；其次，合成SunTag序列和M3M14表观遗传修饰结构域，将两个结构域在同一读码框下进行序列合成，两端设计(HpaI和NheI)酶切位点，利用这两个酶切位点连入上步包含dCas9蛋白的载体，进而获得表观遗传编辑载体(CRISPR/dCas9-Suntag-M3M14)(图1)。

二、表观基因编辑载体的gRNA设计与构建

本实施例所用表观基因编辑载体的gRNA设计采用ChopChop(http://chopchop.cbu.uib.no/)软件，选定靶基因(g6125；碳酸酐酶，即其参与CO₂和碳酸氢盐的相互转变，是微拟球藻碳浓缩机制的关键组分之一，已经被实验证实如果此碳酸酐酶被敲除，微拟球藻的CCM会明显削弱，因此此基因在微拟球藻碳浓缩或光合固碳中扮演重要角色。另外，此基因在不同CO₂浓度下，甲基化m6A的修饰水平的丰度明显不同(图2)，它编码RNA的m6A甲基化水平在低CO₂下明显增加，推测它的表达可能受m6A甲基化诱导调控)的启动子区或转录起始位点上游序列作为靶位点区域(AAAAAATATGTCAACCCTTGGGG；红色GGG为PAM位点)，然后设计合成引物F:5-cgaTTTTTTctgatgagtccgtgaggacgaaacgagtaagctcgtcAAAAAATATGTCAACCCTTG-3；和，R:5-AAACAAGGGTTGACATATTTTTTgacgagcttactcgtttcgtcctcacggactcatcagAAAAAA-3，

首先等体积比例混合正向和反向引物，在100℃水浴煮沸10分钟，然后让其自然冷却到室温，目的形成双链，最后再用T4连接酶与表观遗传编辑载体(CRISPR/dCas9-Suntag-M3M14)连接，即得微拟球藻的dCas9-SunTag-M3M14/gRNA基因表观编辑系统，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示，再转化E.coli DH5α，最后得到阳性克隆pM3M14。经液体培养pM3M14后，提取质粒并用限制性内切酶AseI酶切，达到线性化片段(浓度在1μg/μL以上)用于下一步电转化。

SEQ ID NO:1表观基因编辑载体全序列

微拟球藻表观基因编辑载体全序列(正向)

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DNA序列长度：14186bp

dCas9序列(3’-5’)：从2404bp到6504bp，长度为4101bp

M3M14序列(3’-5’)：从7447bp到8139bp，长度为693bp

SunTag序列(3’-5’)：从6882bp到7286bp，长度为605bp

抗性基因Hyg序列(3’-5’)：从10545bp到11570bp，长度为1026bp

启动子Ribi序列(3’-5’)：从1188bp到2372bp，长度为1184bp

启动子LDSP序列(3’-5’)：从9399bp到9916bp，长度为518bp

核定位信号SLV40序列为：CCGAAAAAGAAGAGGAAGGTC

三、电穿孔方法将线性化载体片段导入微拟球藻中并挑选单克隆

在转化前1h，取培养至对数生长期的微拟球藻藻液(光密度值OD750在3.0-5.0之间)，其浓度约为1-3×10⁷cells/mL，然后以4500g转速在4℃离心5min，弃上清，再用375mM山梨醇溶液(提前预冷至4℃)漂洗2次，最后用375mM山梨醇调整细胞浓度到2×10⁸cells/mL。将浓缩藻体分装为200μl的小份，每份加入3-10μg上述步骤二获得线性化载体和1μl变性处理的鲑鱼精DNA(使其终浓度为15μg/mL)，混匀后在冰上放置10min。预冷完后，将藻液与载体的混合物转移入2mm电击转化杯，以2200V(HV)，50μF进行电击，电击后立即将藻体转移入5mL新鲜f/2培养基。25℃摇床中低速50rpm培养复苏，通常弱光或黑暗复苏48h。微藻细胞被均匀地涂布到潮霉素(5μg/ml)的f/2固体平板，培养15-25天之后，挑10-20个单克隆放到一个24孔培养板进行培养14天。用菌落PCR方法验证转化子是否转化成功。

四、藻落或藻液PCR方法筛选转化株和靶基因表达水平的qPCR验证

通过藻落或藻液PCR方法筛选转化株，即使用NEB公司生产的Q5缓冲液作为裂解液，吸取2μl上述步骤中获得藻液，2μl的Q5缓冲液，再加水补充至10μl，将此混合液在沸水中煮沸10min或在thermocycler上加热10min，待冷却到室温或4℃后，再加入引物(正向：5’gtttatcggcactttgcatcggccgc3’；反向：5’gcacgaggtgccggacttcggggcag3’)和PCR用Taq酶的预混液进行聚合酶链式反应PCR扩增，电泳PCR产物验证转化株。而后挑取验证的阳性转化株(微拟球藻CA-g6125基因表观遗传编辑突变株)，记作：M1-M7。对阳性转化株进行液体扩大培养，用于靶基因的表达水平验证。

选取上述获得突变株(即，M1-M7)和野生型分别在空气水平CO₂浓度下培养，光强控制一致在50umol/m²/s，通气速率在100ml/min。待微藻培养至对数生长期时收集微藻，5000g离心5min，然后用液氮迅速冷冻，保存在-80℃备用。

突变株表达丰度实验测量分为以下三步：

第一步RNA的提取，将冷冻保存的藻细胞(突变株或野生型)进行RNA提取，首先采用液氮研磨的方式破碎藻细胞，一般液氮研磨5-10min，然后加入1ml Trizol(Invitrogen公司)迅速充分混匀并加入200ul氯仿在12000rpm下离心10min，吸取上清液转入新的eppendorf管中再加入等体积氯仿，充分振荡混匀，静置2-3min后以12000rpm下离心10min，将上清液转入新的离心管并加入等体积异丙醇室温沉淀15min，离心15min后，再用75％乙醇洗涤沉淀后，吹干加入50ul DEPC处理的ddH₂O，测量RNA浓度后，保存于-80℃备用；

第二步，cDNA的制备，将上述获得RNA样本按照Takara试剂

RTreagent Kit With gDNA Eraser kit的流程说明使用随机引物进行cDNA的合成，备注基因组DNA去除反应体系为20ul，其中包括2ug的总RNA、5X reaction buffer和gDNA Eraser酶；

第三步，荧光定量PCR反应，通过

480II(采用罗氏的快速启动通用绿色荧光)荧光定量qRT-PCR进行定量。PCR的反应体系为1ul的cDNA(来自上一步的反转录制备)、正反向引物各1ul、10ul的2X Roche FastStart SYBR Green Master(ROX)、ddH₂O添加7ul补足至20ul，其中，正反向引物为CA-6125基因引物序列为正向引物：5’ACCTTGAGAAGATGGAGTC 3’；反向引物：5’CCGACAGTCTGGAAGTTA 3’，内参基因引物序列为正向引物：5’GCCGTTATTGGATGGATATG 3’；反向引物：5’ACAACAACTCTCCTTCACA 3’。反应条件参照Roche试剂盒说明执行。实时荧光qPCR结果数据的分析使用2^-ΔΔCt方法,其中ΔΔCt值为(Ct_{CA-6125基因}-Ct_内参基因)_突变株-(Ct_{CA-6125基因}-Ct_内参基因)_野生型。

通过以上方法计算g6125基因在突变株中的相对野生型的基因表达丰度，结果证实突变株(M1或M3)的g6125基因表达丰度在空气水平CO₂浓度培养条件下显著高于野生型g6125的表达，证实g6125基因在转录水平被激活，大约上调4-8倍(图3)。

五、靶基因碳酸酐酶表观基因编辑突变株的甲基化水平丰度分析

将上述获得突变株和野生型分别在空气水平CO₂浓度下培养，光强控制一致在50umol/m²/s，通气速率在100ml/min。待微藻培养至对数生长期时收集微藻，5000g离心5min，然后用液氮迅速冷冻，保存在-80℃备用。

按照上述步骤四的方法提取RNA，即将冷冻保存的藻细胞(突变株或野生型)进行RNA提取，首先采用液氮研磨的方式破碎藻细胞，一般液氮研磨5-10min，然后加入1mlTrizol(Invitrogen公司)迅速充分混匀并加入200ul氯仿在12000rpm下离心10min，吸取上清液转入新的eppendorf管中再加入等体积氯仿，充分振荡混匀，静置2-3min后以12000rpm下离心10min，将上清液转入新的离心管并加入等体积异丙醇室温沉淀15min，离心15min后，再用75％乙醇洗涤沉淀后，吹干加入50ul DEPC处理的ddH₂O，测量RNA浓度后，保存于-80℃备用。

采用特异的抗6mA甲基化抗体富集含有6mA甲基化的片段RNA，具体步骤为用RNA片段化试剂盒(Invitrogen公司)将RNA片段化处理，然后回收片段化的RNA。再用抗6mA甲基化的抗体(Sybaptic systems公司)富集RNA，将3-10ug的RNA加入含有5ug抗6mA甲基化抗体的免疫共沉淀缓冲液中(IP buffer：)，在4℃旋转孵育2h-4h，让抗体充分与RNA结合。然后再加入含有二抗的Protein A/G磁珠(ThermoFisher公司)再在4℃旋转孵育2h。孵育完成后，置于磁力架洗脱RNA，吸取上清液转入新的eppendorf管中再加入等体积氯仿，充分振荡混匀，静置2-3min后以12000rpm下离心10min，将上清液转入新的离心管并加入等体积异丙醇和glycogen室温沉淀15min，离心15min后，再用75％乙醇洗涤沉淀后，吹干加入50ul DEPC处理的ddH₂O，备用。

通过荧光定量PCR反应测量靶基因6mA甲基化的丰度，首先使用使用随机引物进行cDNA的合成(见上述步骤四)，再通过

480II(采用罗氏的快速启动通用绿色荧光)荧光定量qRT-PCR进行定量。PCR的反应体系为1ul的cDNA(来自上一步的反转录制备)、正反向引物各1ul、10ul的2X Roche FastStart SYBR Green Master(ROX)、ddH₂O添加7ul补足至20ul，其中三对引物序列分别为(正向引物：5’TACTCCTGATCTTGCAAGGA3’；反向引物：5’ACGAAGTACACAAGAAAC3’)、(正向引物：5’ACCTTCTCGGGCCACAAATGC3’；反向引物：5’CGTGTGCTCGGCGTTATG3’)和(正向引物：5’CGAGGACAAAGACCAAATCCTC3’；反向引物：5’ACATCATAGGCGTTGATC3’)。反应条件参照Roche试剂盒说明执行。实时荧光qPCR结果数据的分析使用ΔCt方法,其中ΔCt值为：

ΔCt[normalized 6mA-IP]＝(Ct[6mA-IP]-(Ct[Input]-Log2(Input DilutionFactor)。

再使用2^-ΔΔCt方法计算碳酸酐酶g6125基因突变株与野生型的差异背书,其中ΔΔCt值为(Ct_{CA-g6125基因}-Ct_内参基因)_突变株-(Ct_{CA-g6125基因}-Ct_内参基因)_野生型。

通过以上方法计算碳酸酐酶g6125基因在突变株中的相对野生型的基因6mA甲基化表达丰度，结果证实突变株(M4或M7)的g6125基因甲基化丰度在空气水平CO₂浓度培养条件下显著高于野生型g6125的表达，进一步证实g6125基因在转录水平被激活，大约上调5-8倍(图4)。

六、靶基因碳酸酐酶表观基因编辑突变株的生理表型鉴定

将野生型微藻和上述突变株(选用M1和M3；图5)分别在200ml柱式反应器中接种到新鲜f/2液体培养基中，并在通空气条件下培养，每天测量生长曲线和培养6天测光合作用参数Fv/Fm等生理指标。

测量结果如图5所示，发现突变株在空气水平CO₂浓度下生长明显快于野生型，经10天培养生长速率增加30％以上(图5和图6)。另外，突变株的光合作用参数Fv/Fm也比野生型提高25％(图7)，进一步证实该基因可能通过影响光合作用基因的甲基化来调控其功能。因此，通过基因转录激活的方法初步验证了碳酸酐酶g6125的基因表观遗传调控功能，这个基因在微拟球藻生长中扮演重要角色，可能是能够间接调控CO₂固定或光合作用的重要酶，此基因的具体功能有待深入的研究。

七、靶基因碳酸酐酶表观基因编辑突变株的生理表型光合放养速率的测量

将上述微拟球藻CA-g6125基因表观遗传编辑突变株和野生型细胞的光合放氧速率测定采用Clark-II型氧电极(英国Hansatech公司)进行，测定时反应槽的温度为4℃(水浴调整)，光强用遮光片调整为300μmol m-2s-1。将微拟球藻突变株和野生型细胞培养至对数生长期，以5000g离心5min收集藻细胞与15ml离心管，每个样品收集两份，一份用于测定光合放氧速率，另外一份用于叶绿素含量的测量。收集的微藻细胞先用无碳水(预先通入N2排除掉溶液中的CO2)洗涤，然后又悬浮在pH值等于7.8的缓冲液中，为20mmol L-1Tris缓冲液的无碳水中(pH是7.8)，缓冲液的配置用海水然后分别测定突变株和野生型细胞在此pH条件下的光合放氧速率。同时每个样品留取一份用来测量叶绿素a的含量，叶绿素a的测量采用甲醇抽提的方法，采用以下这个公式计算叶绿素a(Chla)的含量：

Chla的含量(ug/ml)＝16.5169X A₆₆₅-8.0962X A₆₅₂

光合放氧速率用叶绿素a的含量进行换算。测量结果显示，基因g6125表观遗传编辑突变株细胞的光合放氧速率比野生型的光合放氧速率有显著提高，增加了30％(图8)。

八、多基因同时表观遗传修饰编辑的设计

为实现多基因的同时表观遗传修饰，可以设计多个基因的gRNA序列，然后将设计的多个gRNA序列(即，根据性状相关的不同的靶基因对应设计不同的gRNA)用短的中间序列串联起来(短的中间序列可以是20-40bp随机序列，可以不用考虑读码框，没有特殊要求，例如CTTACCGCATGACTAATCTTTAAGGCTA)，再去合成并在这多个gRNA串联序列两端设计BspQI酶切位点，利用此位点可与前面所述载体连在一起，在启动在的驱动下可同步表达多个gRNA。然后利用其引导功能，将dCas9蛋白和相应的表观遗传修饰结构域靶向到多个特定基因，以实现多个基因的同时被表观遗传编辑，也可以设计在同一代谢通路的基因作为靶基因，达到整个代谢通路被表观遗传修饰。

序列表

<110> 海南师范大学

<120> 一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaaagctga cgcccttttc gtcgtcgttg ctggtgttaa aattgcgcgt ttcttttttt 60

tccgtctttg tcgtcttttg acttttttat cttcttttct gtcttctttt attcttctct 120

tcttcttcat cactccctct tcatttttct tcttcttttt cctcgtctat tgtcctcggg 180

cattaccagt tgtgctgctc acgtgcgcgc aagcggtgaa agggtgagag gatacacgga 240

caacaatcat tgaaaattac gcttaaagcc ggtgcctgga aaagtccacg cgcagatggc 300

ctttgcttgc cttgctgctg ctgcagctgc tgctgctgtc gcctgtgatg gtaatggttg 360

ttgttgtggt cctgcttgct tgctagtttg cattgcgttt gcggttgcct tatgaccgac 420

tccgtgtgat tgatccttaa acatatttta tcattgatgt ggattgtgtg acgacggcaa 480

aaaagaatta ctttacacat gactatcaca cctgctcccc tcccttctcc tttcaatcgg 540

tcaacttccc aaccgctcct cgaaaatatt tcagttgaat cctctactac gtacccctta 600

cttaaattta ctttctctct ccccatcaat gcgccgttgt tctgaagttg tattattgat 660

gggagatgat tggcactgca ccagacctgg ccaaaagcca ccacaggtgg ccacatactc 720

ttgcatgggt atactctacc gaggcaaaga ttaaagtgca cgtcccctgc ccctctctct 780

ccctacttcc ttcagtctca gtggttccgt gcccgttcag cactacatcg ccctgcccgc 840

tgttccttct caaacagcca cccatcccaa cccacataca cagaaacaac ctttcctaca 900

cattttccca agtcttctct tcactattct acactaatac accaccgtga tatgccggtt 960

atctagatgt cctttctcct ttctcatcct ttctttccca tggtacccag gagtcccatt 1020

cgccatgccg aagcatgttg cccagccggc gccagcgagg aggctgggac catgccggcc 1080

aaaagcaccg actcggtgcc actttttcaa gttgataacg gactagcctt attttaactt 1140

gctatttcta gctctaaaac gaagagccaa ggcctgctct tcatcgattc tgtggatgga 1200

gggagggaag gaggggggga gtgagtgagt cgagagaacg acgactgggg caaagagagg 1260

atgacgccac tgcaacaaaa gacagggaag aatagaggct gttggaaaac aggaacacag 1320

tgaagaatag aggctgcagg gtaacaggca catttatcgc agagaggcgg gcggcagggg 1380

cgatacgtaa agagacccct aaacttctcc gcgtcatccg ttcacgctac ctccttccct 1440

ccctttactc ccattgatca ccaaggcagc gcccgcagcc accagcagcc accgtcctca 1500

gtgtcacagc tagacgcgtc cccatcaggc agcagaccac cagaatatgc gctttcgctt 1560

cccatcatat ccctccctcc tccccttcta ttcctcatca tgcatcattt ctttctcctt 1620

gctgcatgcc cctcttctta ccttggctaa gatctaccgg aggaagaagt cttcaacgat 1680

agataaatgc ctgtatcgtg atggttgttt gaatggtgga agtgagccag gtattgagaa 1740

cgaggggcgc aagggtgcgt ggaagaaggc agggagaggc gaggcgaagg agaagggcat 1800

gtggtgggaa cgaagcctcc acaccacagc cacccatgct tttctctgtt cgagttcccg 1860

ggttctactc tcacacacta cacgtgcaca gaaaacattc acgcacaaca gagatacaga 1920

gggatccgtc gagatggtct acacgtccta atgtcccctg ctttcgaagc ccagagccat 1980

cgctttctgt ttttatccat tcgcaacaca tcctgttctc gcgacctctc ctcttcctgg 2040

ccaccatcgc ttctccgtgc catgccctgt acatccttcc ctccctcgtt gtctaccaca 2100

ctaatcatgc gctctgcagc agacactcgg ctactatttg tgtcgtacgg attgagggga 2160

gggaggggaa gggaggcaag aagtaaatcg gtggtcaaca acagacgcgg tctccccacc 2220

ctccctcatt cctttcccct cctataatga gcgaagaaag ccatggacac cgagtcaccc 2280

actctcctaa tccaccacca ccagggcact aacggactca cgctcaccaa actcggtaac 2340

aatatccact gcacacagat acacacgcaa ccctcgagca tgcccaagaa aaagcggaag 2400

gtggacaaga agtactccat tgggctcgcc atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 2460

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 2520

cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 2580

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 2640

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 2700

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 2760

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 2820

aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 2880

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 2940

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 3000

atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 3060

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 3120

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 3180

gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 3240

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 3300

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 3360

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 3420

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 3480

ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 3540

gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 3600

aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 3660

gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 3720

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 3780

agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 3840

gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 3900

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 3960

tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 4020

tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 4080

gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 4140

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 4200

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 4260

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 4320

catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 4380

cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 4440

gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 4500

tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 4560

cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 4620

gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 4680

atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 4740

atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 4800

gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 4860

gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatgcc 4920

atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 4980

gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 5040

aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 5100

actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 5160

cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 5220

accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 5280

aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 5340

taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 5400

tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 5460

atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 5520

aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 5580

ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 5640

gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 5700

cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 5760

gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 5820

tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 5880

aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 5940

tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 6000

tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 6060

cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 6120

cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 6180

caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 6240

atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 6300

cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 6360

cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 6420

gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 6480

gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacgggt ccggcagcgg gtccgttaac 6540

cccaagaaaa aacgcaaggt ggaagatcct aagaaaaagc ggaaagtgga agatgctcca 6600

aagaagaaga gaaaggtcga cggcattggt agtgggagca acggcagcag cggatccaac 6660

ggtccgactg acgccgcgga agaagaactt ttgagcaaga attatcatct tgagaacgaa 6720

gtggctcgtc ttaagaaagg ttctggcagt ggagaagaac ttttgagcaa gaattatcat 6780

cttgagaacg aagtggctcg tcttaagaaa ggttctggca gtggagaaga acttttgagc 6840

aagaattatc atcttgagaa cgaagtggct cgtcttaaga aaggttctgg cagtggagaa 6900

gaacttttga gcaagaatta tcatcttgag aacgaagtgg ctcgtcttaa gaaaggttct 6960

ggcagtggag aagaactttt gagcaagaat tatcatcttg agaacgaagt ggctcgtctt 7020

aagaaaggtt ctggcagtgg agaagaactt ttgagcaaga attatcatct tgagaacgaa 7080

gtggctcgtc ttaagaaagg ttctggcagt ggagaagaac ttttgagcaa gaattatcat 7140

cttgagaacg aagtggctcg tcttaagaaa ggttctggca gtggagaaga acttttgagc 7200

aagaattatc atcttgagaa cgaagtggct cgtcttaaga aaggttctgg cagtggagaa 7260

gaacttttga gcaagaatta tcatcttgag aacgaagtgg ctcgtcttaa gaaaggttct 7320

ggcagtggag aggaattgct atcgaaaaat tatcatcttg agaacgaagt tgctaggctc 7380

aaaaagggcg gtggttccgg aggaggtagt gaagatccta agaaaaagcg gaaagtggaa 7440

gatgctttcc cacctcagtg gatctgttgt gatatccgct acctggacgt cagtatcttg 7500

ggcaagtttg cagttgtgat ggctgaccca ccctgggata ttcacatgga actgccctat 7560

gggaccctga cagatgatga gatgcgcagg ctcaacatac ccgtactaca ggatgatggc 7620

tttctcttcc tctgggtcac aggcagggcc atggagttgg ggagagaatg tctaaacctc 7680

tgggggtatg aacgggtaga tgaaattatt tgggtgaaga caaatcaact gcaacgcatc 7740

attcggacag gccgtacagg tcactggttg aaccatggga aggaacactg cttggttggt 7800

gtcaaaggaa atccccaagg cttcaaccag ggtctggatt gtgatgtgat cgtagctgag 7860

gttcgttcca ccagtcataa accagatgaa atctatggca tgattgaaag actatctcct 7920

ggcactcgca agattgagtt atttggacga ccacacaatg tgcaacccaa ctggatcacc 7980

cttggaaacc aactggatgg gatccaccta ctagacccag atgtggttgc acggttcaag 8040

caaaggtacc cagatggtat catctctaaa cctaagaatt taggcggatc aggtggctcc 8100

ggagggtctg gtggatcggg aacacagagc ttaaatcccc ataatgatta ctgccaacat 8160

tttgtagaca ctggacatag acctcagaat ttcatcaggg atgtaggttt agctgacaga 8220

tttgaagaat atcctaaact gagggagctc atcaggctaa aggatgagtt aatagctaaa 8280

tctaacactc ctcccatgta cttacaagcc gatatagaag cctttgacat cagagaacta 8340

acacccaaat ttgatgtgat tcttctggaa ccccctttag aagaatatta cagagaaact 8400

ggcatcactg ctaatgaaaa atgctggact tgggatgata ttatgaagtt agaaattgat 8460

gagattgcag cacctcgatc atttattttt ctctggtgtg gttctgggga ggggttggac 8520

cttggaagag tgtgtttacg aaaatggggt tacagaagat gtgaagatat ttgttggatt 8580

aaaaccaata aaaacaatcc tgggaagact aagactttag atccaaaggc tgtctttcag 8640

agaacaaagg aacactgcct catggggatc aaaggaactg tgaagcgtag cacagacggg 8700

gacttcattc atgctaatgt tgacattgac ttaattatca cagaagaacc tgaaattggc 8760

aatatagaaa aacctgtaga aatttttcat ataattgagc atttttgtct tggtagaaga 8820

cgccttcatc tatttggaag agatagtaca attcgaccag gctggctcac agttggacca 8880

acgcttacaa atagcaacta caatgcagaa acatatgcat cctatttcag tgctcctaat 8940

tcctacttga ctggttgtac agaagaaatt gagagacttc gaccaaaatc gcctcctccc 9000

tacccctacg acgtgcccga ctacgcgtcc atggtggcta gcccgaaaaa gaagaggaag 9060

gtctgacaat tggaaagatc caagagagac gagtagagat tttttttttg ggattgatgt 9120

ttgtcgttct ttgagttgtc gtcgagttac gccttttgta agaatgttcc gcaggagagg 9180

aggaggatgg gcatgagtga gggtgagagg gcttgcccgc tttttttttt aaaaacgctg 9240

aagacgtggt tgtcaaacaa accccccata gaaacgattt tgttacggtg cggtccagac 9300

gtcacttgaa tggctccgcg gaaaggccag ggagggaagg ggggagggag gaaacatgaa 9360

acatgttgaa cggctcaaca gggtttgggg gacaagagag gtagcgccct gatggactgc 9420

tccctcccct cctttccctc aatgtctcat tcatccatgc ttcccccttc tctctctccc 9480

ctccgttcca tcccccgcgg gcgtggtagt ggcgtgatgg gatccactaa aatgtacgtg 9540

taagaaaagc cggtgagctt acgcttttgt gaaagtggga gtacgagtgt tgtgtgtgtg 9600

tgtagtggtt tcagacccca gacagaggcg aagcagaaaa agcagacgat gaagacgacg 9660

aagaaatgag cagtctattt ttatcgtgga aacagaagag gtgatatcgt ctcctgcagg 9720

catgcaagct gatccactag aggccatggc ggccgcgatg gagtggatgg aggaggaggc 9780

gagcgtagca gcaagcgtga gttatacagc caggcacatg tcgcaatcct tcggtctcgg 9840

gcttaaaatc cacgcactaa tcacgctggg ccatgcaaag agcaatgccg aggcccacca 9900

cacaaaacgc tgtgtcgcgc gttgcggcct gaagcttcat acttcttagt cgccgccaaa 9960

agggctcgag agacgagacc cgttggcatg accgatgttg ttcgacgcgg tttgcttcgt 10020

cacagtcgac gtgattcagg aatctggagc ctgcagatca tttttttcag cctgatatcg 10080

ttcttttcca ctgagaacca tcagaccacc ttttcttcca ttgtgtgaag gagtaggagt 10140

tgccgtgctg ctttgtggga gacatctgcg atggtgacca gcctcccgtc gtctggtcga 10200

cgtgacgagc ctcttcactg ttcttcgacg gagagacgca agcgagacgg ctctagacct 10260

tttggacacg cattctgtgt gtgaactagt ggacagtgat accacgtctg aaagctcacc 10320

actgcccatg gtgcagctac ttgtcacaaa gttttgactc cgtcggtatc accattcgcg 10380

ctcgtgtgcc tggttgttcc gccacgccgg cctgccccgg ggcggggcaa tattctaaaa 10440

tctcacgcaa aacaccgcac ttacccctca cacatattcg tgatagacca ccaccaatct 10500

cagcccgcat caacacagtc gagggccccg gggggcaata agatatgaaa aagcctgaac 10560

tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt cgacagcgtc tccgacctga 10620

tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt cgatgtagga gggcgtggat 10680

atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa agatcgttat gtttatcggc 10740

actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga cattggggaa ttcagcgaga 10800

gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac gttgcaagac ctgcctgaaa 10860

ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggccat ggatgcgatc gctgcggccg 10920

atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca aggaatcggt caatacacta 10980

catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt gtatcactgg caaactgtga 11040

tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga tgagctgatg ctttgggccg 11100

aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt cggctccaac aatgtcctga 11160

cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga ggcgatgttc ggggattccc 11220

aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt ggcttgtatg gagcagcaga 11280

cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc gccgcggctc cgggcgtata 11340

tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt tgacggcaat ttcgatgatg 11400

cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc cggagccggg actgtcgggc 11460

gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga tggctgtgta gaagtactcg 11520

ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtccgagggc aaaggaatag gctagtagta 11580

gatgccgacc ggagtccgca aaaatcacca gtctctctct acaaatctat ctctctctat 11640

ttttctccag aataatgtgt gagtagttcc cagataaggg aattagggtt cttatagggt 11700

ttcgctcatg tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact 11760

tctatcaata aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tgacctggtt taaaccacag 11820

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 11880

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 11940

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 12000

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 12060

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 12120

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 12180

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 12240

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 12300

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 12360

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 12420

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 12480

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 12540

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 12600

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 12660

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 12720

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 12780

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 12840

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 12900

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 12960

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 13020

cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 13080

aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 13140

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 13200

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 13260

gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 13320

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 13380

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 13440

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 13500

cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 13560

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 13620

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgggtc cttttcatca cgtgctataa 13680

aaataattat aatttaaatt ttttaatata aatatataaa ttaaaaatag aaagtaaaaa 13740

aagaaattaa agaaaaaata gtttttgttt tccgaagatg taaaagactc tagggggatc 13800

gccaacaaat actacctttt atcttgtact tcctgctctc aggtattaat gccgaattgt 13860

ttcatcttgt ctgtgtagaa gaccacacac gaaaatcctg tgattttaca ttttacttat 13920

cgttaatcga atgtatatct atttaatctg cttttcttgt ctaataaata tatatgtaaa 13980

gtacgctttt tgttgaaatt ttttaaacct ttgtttattt ttttttcttc attccgtaac 14040

tcttctacct tctttattta ctttctaaaa tccaaataca aaacataaaa ataaataaac 14100

acagagtaaa ttcccaaatt attccatcat taaaagatac gaggcgcgtg taagttacag 14160

gcaagcgatc cgtctaagaa accggt 14186

Claims (7)

1.一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法，其特征在于：将含有经海洋微拟球藻密码子优化Cas9失活蛋白、表观遗传修饰效应蛋白M3M14和靶基因引导序列的载体导入微拟球藻获得突变体，突变株经培养后实现对靶基因的表观基因组编辑，从而定向提高靶基因的转录水平。

2.按权利要求1所述的海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法，其特征在于：所述载体以微拟球藻用Cas9表达载体(pNOC-ARS-CRISPR)作为骨架，包含Cas9失活蛋白(即dCas9)、表观遗传修饰效应蛋白M3M14、抗性选择标记基因、至少一个gRNA靶基因引导序列和增强表观遗传修饰的特异序列(SunTag序列)。

3.按权利要求1或2所述方法，其特征在于：所述骨架载体Ribi双向启动子一端依次连接dCas9蛋白、表观遗传修饰的特异序列和表观遗传修饰效应蛋白，其驱动dCas9蛋白和表观遗传修饰蛋白融合表达；另一端连接gRNA靶基因引导序列，其驱动gRNA表达；潮霉素抗性基因位于骨架载体LDSP启动子下游，由LDSP驱动表达。

4.按权利要求3所述方法，其特征在于：所述载体中含至少一个gRNA靶基因引导序列；其中，所述靶基因引导序列为与性状相关的候选基因，也可是能够调控靶基因表达的非编码序列；所述多个gRNA支架序列时由多个靶基因设计的gRNA串联形成。

5.按权利要求1-4任意一项所述方法，其特征在于：所述gRNA靶基因引导序列以碳酸酐酶(g6125)为靶基因设计获得。

6.按权利要求5所述方法，其特征在于：所述载体为SEQ ID NO:1所示，其中，密码子优化的dCas9蛋白的碱基为SEQ ID NO:1中从2404bp到6504bp，密码子优化的表观遗传修饰效应蛋白M3M14为SEQ ID NO:1中从7447bp到8139bp，密码子优化的抗性选择标记基因为SEQID NO:1中从10545bp到11570bp，密码子优化的增强表观遗传编辑的特异序列为SEQ IDNO:1中从6682bp到7286bp。

7.按权利要求5所述方法，其特征在于：将所述突变株经培养后实现对碳酸酐酶(g6125)的表观基因组编辑，而后于在空气水平CO₂浓度380-400ppm下培养，光强控制在50±10umol/m²/s，通气速率在100±5ml/min条件下培养，从而实现碳酸酐酶编码RNA的m6A甲基化的定向激活，实现其靶基因表观基因组的遗传调控。

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