JP6416117B2 - Jagged1に結合する抗体 - Google Patents
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Description
本発明の第五の態様によると、本発明は、組換型の先に規定した抗体を発現する細胞又は細胞株を提供する。
J1のNotch受容体への結合を遮断する能力のあるヒトJ1-特異的mAbを作製するために、長さの異なる3種のヒトJ1抗原を作製した。これらは、細菌により発現され且つリフォールドされたDSL-EGF3(DSL+EGF1-3)及びDSLドメイン組換えタンパク質、並びにNotchタンパク質との直接接触を媒介することが報告された領域[65]に対応するDSLドメイン-由来18merペプチドで構成される。これらを免疫原として使用し、MF1マウスを免疫化した。免疫化された動物由来の脾細胞及びマウス骨髄腫融合パートナー細胞株NS0を使用する標準の融合技術により、ハイブリドーマ細胞株を作製した。これらの免疫原に対するELISAによるスクリーニングは、99種の反応性抗体を同定した。J1トランスフェクションされた細胞に対する免疫染色及びFACSは、細胞表面J1を認識することができるわずか21種のハイブリドーマを同定した(表1)。
J1-N1タンパク質:タンパク質相互作用を破壊する能力を伴うmAbを機能的に同定するために、ハイブリドーマ培養上清を、FACS-ベースの結合アッセイにおいて試験した。ビオチン化された可溶性ヒトN1 EGF11-13組換えタンパク質を、アビジン-コートされたビーズへ結合させ、且つFACSによる、細胞表面hJ1を認識する各mAbの存在又は非存在下での、J1-発現細胞の染色に使用した。21種のmAbのうちの5種(J1-65D、-156A、-183D、-187B及び-142B、最後のJ1-142Bは本発明の抗体ではない)は、J1へのN1結合を、異なる有効性で、遮断することができ:J1-65D、-183D及び-156Aは、この結合を完全に遮断したのに対し、J1-187B及び-142Bは、結合を部分的に遮断した(図1A)。4種の本発明の遮断性抗体はまた、ELISAアッセイにおいて、組換えCD46のビオチン-タグ付きJ1 DSL-EGF3組換えタンパク質への結合を遮断することもできた(図1B)。こうして、複数の受容体へのJ1結合を遮断するそれらの能力を明らかにする。4種の本発明の遮断性mAbを、無血清-培養上清から精製し、且つ等濃度の精製した抗体を使用し、それらの活性を引き続きのアッセイにおいて比較した(ハイブリドーマ上清が特定されなかった場合を除いて)。DSLドメインを超える配列保存は、J1 mAbが、Jagged 2(J2)タンパク質へも結合することができる可能性を生じた。抗体結合特異性は、最初に、hJ1及びhJ2トランスフェクタントのサイトスピン試料の免疫細胞化学標識により試験した(図2)。全ての抗体は、J1トランスフェクタントを染色したが、いずれもJ2でトランスフェクトされた細胞を染色せず、且つ同一実験においてJ2発現を、市販の抗-J2抗体を用いて確認した。精製されたmAbの特異性を、hJ2、ヒトDelta-様リガンド4(hDLL4)、又はmJ1によりトランスフェクトされた哺乳動物細胞において更に調べた(図3)。トランスフェクタントは、4種の遮断性mAbの各々10μg/mlにより、FACS染色した。先に認められたように、これら全てのmAbは、hJ1トランスフェクタントを染色した。J1-65D及びJ1-183D mAbのmJ1への弱い結合のみが認められ、このことはこれらの被験物質は、mJ1のN1への結合を機能的に遮断することができないこと(図1)と一致した。これらのmAbのいずれも、hDLL4への有意な結合は示さなかったが、J2への非常に弱い結合が、J1-156A及びJ1-187Bについて認められた(図3)。
先の実験のほとんどは、組換発現されたJ1を用いて行った。J1 mAbの内在性発現されたJ1へ結合する能力を、乳癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、及び結腸直腸癌を含む異なる組織型由来の癌細胞株の、FACS染色により試験した(表4及び図12A)。4種のJ1 mAbは一般に、同様に挙動したが、J1-65D及びJ1-183Dは、わずかに幅広に細胞株パネルを染色した。これは、J1に関するそれらのより高い親和性と一致している。細胞表面J1発現を明らかにしている染色プロファイルは、RT-PCR及びウェスタンブロットなどの他の技術によりJ1発現を検出した先行する刊行物の結果[58, 59]と、大部分一致した。
DSLドメインの保存面は、Notch受容体結合に重要であるとして確定された[65]。FACSにより細胞表面上のJ1を認識した21種の抗-J1 mAbのうち、13種の認識したエピトープは、ELISAによりDSLドメインに含まれた(図6A)。残りの抗体はおそらく、EGFドメイン内のエピトープ、DSL-EGFドメイン境界に広がるエピトープ、又はコンホメーション感受性があり且つ隣接ドメインを必要とするエピトープを有するであろう。
J1 mAbは、J1リガンドのその受容体N1への結合を遮断することができることを確立したので、Notchシグナル伝達経路の活性に対するそれらの作用を調べた。Notch補因子RBPJの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現しているヒト結腸直腸癌細胞株LS174Tを、固定されたJ1タンパク質の2つの形で刺激した:EGF3までのN-末端及びEGF12までのN-末端。両方のタンパク質は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子活性を効果的に活性化し、且つこの誘導は、基本的なNotchシグナル伝達も阻害する汎Notchインヒビターであるγ-セクレターゼインヒビターDBZにより遮断されることがわかった(図9A)。J1 mAbがこの培養システムへ添加された場合、ルシフェラーゼ活性は有意に阻害され、J1-65D及びJ1-183Dは最強の阻害を示した。重要なことに、最良の2種のJ1 mAb(J1-65D及びJ1-183D)はまた、リガンド特異性を検証するために、他のNotchリガンドに対して試験した。図9Bに示したように、これらのmAbのいずれも、他の被験リガンド(J2及びDLL4)により誘導されたNotch活性化を防止することができなかった。
標準2-D成長条件下で、J1 mAbは、MDA-MB-231乳癌細胞の成長を阻害しなかった(データは示さず)。同様の知見が、LS-1034細胞株上で試験した場合に、Merck 抗-N1 mAbについても報告されている[66]。細胞-細胞接触は、Notchシグナル伝達の活性化に必要であるので、スフェロイド-ベースの3-D成長モデルを使用し、J1 mAbの腫瘍成長を遮断する能力を試験した。更に、この3-Dモデルは、低酸素症及びアシドーシスを含むインビボ条件を比較的良く模倣しており、より現実的な状況におけるこれらのmAb作用を評価することを可能にする。スフェロイドは、MDA-MB-231乳癌細胞から作製し、且つ異なる濃度のJ1-65D mAbのそれらの成長を阻害する能力を、評価した。最大成長阻害は、最小抗体濃度5μg/mlで認められた(図11A)。10μg/mlは、Notch標的遺伝子HES1及びプロ-腫瘍形成性サイトカインIL6のわずかにより良い転写抑制を生じた(各々、図11B及び11C)ので、この濃度を、その後の実験のために選択した。
MDA-MD-231乳癌3-Dスフェロイドを、乳癌の標準治療用薬物であるパクリタキセル(図14A)又はドキソルビシン(図14B)の亜致死量と組み合わせた、J1-65D又はJ1-183D抗体により処置した。両方の併用療法は、いずれかの単独治療のみよりも、スフェロイド成長の減少においてより効果があることを証明した。
MDA-MB-231乳癌細胞及びU87神経膠腫細胞を、ヒトJ1タンパク質をコードしているレトロウイルスにより、安定して形質導入した。インビトロにおけるそれらの成長を、親細胞のJ1-過剰発現細胞との共培養により、調べた。ベクター-形質導入された細胞を、対照として使用した(図15A)。両方の細胞株において、J1過剰発現は、細胞成長を有意に促進し、その理由はベクター-形質導入された細胞ではなく、J1-形質導入された細胞は、時間をかけてそれらの親細胞を過剰成長するからである。BALB/cヌードマウスをU87安定細胞により異種移植したインビボモデルにおいて、ヒトJ1タンパク質は、U87異種移植片の成長に対し、有意なインビボにおける成長の利点を付与した(図15B)。
ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231細胞がBALB/cヌードマウスへ注射された異種移植片モデルを使用し、J1遮断性mAb(J1-65D及びJ1-183D)の、インビボにおける腫瘍成長に対する作用を調べた。これらのmAbを、腫瘍移植と同時に注射し、引き続き投与量10mg/kgで、3又は4日毎に注射した場合、遮断性mAbは、対照群と比べ、腫瘍成長を遅らせることができた(図17A)。遮断性mAb J1-183Dは、最も強力な阻害を示し(30日間にわたり有意な成長低下を伴う)、J1-187B及びJ1-65Dは、軽度の阻害を示した。20mg/kgで、両方の遮断性mAb(J1-65D及びJ1-183D)は、最初の36日間、腫瘍成長を有意に阻害した(図17C)。
ヒト化及び脱免疫化を、Lonza Biologics社に外部委託した。更なるタンパク質操作は、可能性のある翻訳後修飾を回避/除去すること、及び等電点の変化の最小化を含んだ。4種の軽鎖及び4種の重鎖の変種を、インシリコでデザインし、一緒にして、J1-65D及びJ1-183Dの両方について、16種の抗体変種を作製した(表5)。未変更のCDRsを含むキメラ抗体も構築した。
DSLドメイン及び3つの隣接EGFリピート(アミノ酸185-335)を含むヒトJ1細胞外領域の一部は、N-末端His6タグ及びC-末端ビオチン化タグを伴い、大腸菌NM554において、先に説明されたように[65]、発現した。DSLドメイン(アミノ酸185-230)をコードしている類似の構築体は、同様の様式で発現した。これらのタンパク質を、Ni2+-アフィニティクロマトグラフィーにより、細胞溶解液から精製し、インビトロにおいてリフォールディングし、陰イオン交換FPLC及び逆相HPLCにより更に精製した。DSLドメイン由来の還元されたペプチド(アミノ酸197-214 NKFCRPRDDFFGHYACDQ (配列番号.35))を、市販のGenScriptにより合成し、リフォールディングし、キーホールリンペットヘモシアニンと複合させた。
96ウェルMaxiSorpプレートを、PBS中の好適なJ1抗原10μg/mlにより、4℃で一晩コーティングした。その後プレートを、PBS/0.1%Tween-20で洗浄し、PBS中の1%BSAにより室温で2時間ブロックした。プレートを再度洗浄し、その後ハイブリドーマ上清を添加し、1時間インキュベーションした。洗浄後、HRP複合型抗-マウス二次抗体を、各ウェルへ1:1000希釈で添加し、1時間インキュベーションした。基質ABTSを各ウェルに添加し、その後洗浄し、5〜30分以内にOD405nmをプレートリーダーで測定した。
完全長ヒトJ1に関するIMAGEクローンを、SourceBioscience社から購入し、オープンリーディングフレーム配列を、PCRにより増幅し、pEGFP-N1発現ベクターへ方向性をもってクローニングした。Myc-DDK-タグ付きヒトJ2完全長発現ベクターを、Origene Technologies社から購入した。ヒトDLL4及びmJ1は、先に説明されている[25]。細胞表面上にヒト及びマウスJ1-DSL-EGF3を発現するために、pEGFP-N1をベースにした発現ベクターを構築し、C-末端でEGFPに融合されたN-末端-タグ付きCD1b分子(そのα3ドメイン、膜貫通領域、及び細胞質側末端を含む)を発現した。ヒト及びマウスJ1-DSL-EGF3をコードしているcDNA配列を、PCR増幅し、前記ベクターへ方向性をもってクローニングした。ウサギ及びモルモットのJ1アミノ酸配列を、ヒトの配列と比較し、FLAG-EGFP-タグ付きヒトJ1構築体を、ウサギ(I275T)及びモルモット(R231K、L247I、D250N、I275T、N277I)J1構築体の作製に従い変異した。FLAG-EGFP-タグ付きマウスJ1構築体を、ラット構築体(D228E)を作製するように変異した。
ヒトJ1、J2又はFLAG-EGFP-タグ付きDSL-EGF3構築体によりトランスフェクトされたHEK293細胞、ヒトDLL4又はマウスJ1によりトランスフェクトされたB16F10細胞、並びにヒト癌細胞株を、FACS洗浄緩衝液(PBS中2%FBS+0.1%アジ化ナトリウム)中に10μg/mlに希釈された精製された抗-J1抗体、又は未希釈のハイブリドーマ上清のいずれかにより、染色し、引き続きアロフィコシアニン(APC)-複合型二次抗体の1:200希釈物で染色し:マウス一次抗体については、ヤギ抗-マウス-APC(eBioscience社)を使用し;ヒト化抗体及びキメラ抗体には、ヤギ抗-ヒトIgG(H+L)二次抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)を使用した。洗浄後、試料を、1%パラホルムアルデヒド(PBS中)で固定し、FACSCaliburにより獲得した。FACSデータを、FlowJoソフトウェア(TreeStar社)により解析した。場合によっては、APC-複合型J1-65D及びJ1-183D抗体を使用した(例えば、図4E)。
J1及びJ2 HEK293トランスフェクタントのアセトン固定したサイトスピン細胞調製品を、未希釈のハイブリドーマ上清と共に、室温で30分間インキュベーションした。J2モノクローナル抗体MHJ2-523(Biologend社)を、J2染色のための陽性対照として1:50希釈で使用した。PBS中で2回洗浄後、これらのスライドを、ポリクローナルヤギ抗-マウス免疫グロブリン/HRP抗体(Dako社、P0447)の1:50希釈物と共に、室温で30分間インキュベーションした。ポリクローナルウサギ抗-ヤギ免疫グロブリン/HRP抗体(Dako社、P0449)を、1:25希釈でJ1ヤギポリクローナル抗体染色したスライドのために使用した。PBS中で2回洗浄後、呈色反応を、REAL Envision Detection System、ペルオキシダーゼ/DAB+、ウサギ/マウスキット(Dako社、K5007)を用いて、発色させた。これらのスライドを洗浄し、Harrisヘマトキシリン中で対比染色し、その後Aquatex Mounting Agent (BDH/VWR社、63123S)中に搭載した。
簡単に述べると、パラフィン-包埋したスフェロイド切片を、脱脂し(de-waxed)、加圧下で、マイクロウェーブオーブン内750Wで10分間、熱が誘導した抗原賦活化を施した(クエン酸塩pH6賦活化緩衝液;Dako社)。切片を、Ki67-特異的Ab(M7240;Dako社;1:50)と共に、室温で1時間インキュベーションした。結合したAbを、Envisionシステム(DAKOCytomation社、イーリー、ケンブリッジシャー、英国)を用いて検出し、2,3-ジアミノベンジジン色素原を用いて可視化し、ヘマトキシリンにより対比染色した。
先に説明されたように[74]、ヒトN1 EGF11-13(411-526)を、大腸菌において発現させ、インビトロにおいてリフォールディングさせ、紫色の蛍光アビジン-コートされたビーズ(Spherotech社)により標識した。ヒトJ1によりトランスフェクトされたHEK293細胞又はマウスJ1によりトランスフェクトされたB16F10細胞を、HBBS/10%FCS中に希釈されたJ1抗体上清又は精製された抗体(マウス、キメラ又はヒト化)の存在下、N1蛍光ビーズにより染色した。細胞を洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁させ、その後FACSCaliburにより分析し、データをCellQuestにより解析した。ヒトJagged 2によりトランスフェクトされたHEK293細胞並びにヒト及びマウスDLL4によりトランスフェクトされたB16F10細胞を、同様に染色し、特異性の遮断を試験した。
96-ウェルMaxiSorpプレートを、トリス緩衝食塩水中の濃度5μg/mlのCD46(CCP1-CCP3)によりコーティングし、4℃で一晩インキュベーションした。このプレートを、20mM HEPES、pH7.4、1%BSA中で、4℃で一晩ブロックした。その後、ELISA緩衝液(ビオチン化されたJ1 DSL-EGF3(0.5μg/ml)を含有する、20mM HEPES、pH7.4、10mM CaCl2、0.005%Tween 20、0.25%NP40、4%BSA)中、各ハイブリドーマ上清の1:10 希釈物の非存在又は存在下で、室温で2時間インキュベーションした。ELISA緩衝液で5回洗浄した後、プレートを、ニュートラビジンHRP複合体(Invitrogen社)の1:1000希釈物と共にインキュベーションした。プレートを、6回洗浄し、2,2’-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩(Sigma-Aldrich社)により呈色させた。
精製したJ1 mAbを、EZ-link Micro Sulfo-NHS-ビオチン化キット(Fisher Scientific社)を製造業者のマニュアルに従い用いて、ビオチン化した。ビオチン化されたmAbを使用し、J1の1.0μg/mlにより安定してトランスフェクトされたHEK293細胞を、様々な濃度の非-ビオチン化J1 mAbの存在下で、4℃で20分間、染色した。洗浄後、ストレプトアビジン-PE(Sigma-Aldrich社、1:200)を使用し、ビオチン化されたJ1 mAb染色を検出し、暗所において4℃で20分間インキュベーションした。その後試料を洗浄し、1%パラホルムアルデヒドにより固定し、その後FACSCaliburにより分析した。FACSデータを、Flowjoソフトウェア(TreeStar社、カリフォルニア州)により解析した。
マウスJ1 mAbの異なる形のJ1可溶性タンパク質への結合親和性を、BIACore T-3000により試験した。J1 mAbを、チップ表面にカップリングしている第一級アミンを介して固定した。J1可溶性タンパク質を、10mM HEPES(pH7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性剤P20中で、チップ上を通過させた。力価決定を、濃度範囲0.8nMから10nMまで(J1-187Bについて7.8nMから100nMまで)にわたり、流量10μl/分、25℃で、行った。
J1完全長cDNAを、レトロウイルスベクターLZRSpBMN-リンカー-IRES-EGFPへクローニングした。HEK293T細胞を、このウイルス構築体によりトランスフェクトし、且つパッケージング混合物及びウイルス粒子を、トランスフェクション後24、48及び72時間に収集した。ウイルス含有培養上清を、0.45μmシリンジフィルターユニットにより濾過し、標的細胞MDA-MB-231及びU87に適用した。これらの細胞を、7日間培養し、分割し、必要な場合は培地を交換した。次にGFPを高発現している集団を、FACS検索し、培養において拡大した。J1発現を確認し、FACS染色により、GFP発現と相関させた。空ベクターを形質導入した細胞も、並行して作製した。
レンチウイルスベクターTRC2中のMission shRNA (配列CCGGGTGCACCTCTGACTCCTATTACT CGAGTAATAGGAGTCAGAGGTGCACTTTTTG (配列番号:36))を購入し(Sigma-Aldrich社)、且つHEK293T細胞を、パッケージングプラスミド(Invitrogen社)及びレンチウイルスプラスミドにより、同時トランスフェクトすることにより、レンチウイルス粒子を作製した。ウイルス粒子を含有する培養上清を、トランスフェクション後24、48及び72時間に収集し、0.45μmシリンジフィルターユニットにより濾過した。次にウイルス粒子を、標的細胞MDA-MB-231に適用し、これらの細胞を、7日間培養し、分割し、必要な場合は培地を交換し、その後それらのJ1発現レベルを、前述のようにFACSにより試験した。
J1 DSL-EGF3構築体においてY190H、F199A、R201A、R203A、F207A、N215A、E228D及びR231Kを作製するためのミスセンス変異を、Pfu DNAポリメラーゼによるPCR-ベースの部位特異的変異誘発により、野生型構築体のcDNA配列を含むpQE30組換えプラスミドへ導入した。所望の変異の作製は、DNAシークエンシングにより確認した。変異型構築体を、野生型J1 DSL-EGF3 BirAについて説明したように、精製した。質量は、エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)により確認した。野生型及び変異型構築体を、検出に適した濃度で調製し、ニトロセルロース上に1μlをスポットした。タンパク質を、希釈したハイブリドーマ上清又は精製したmAbにより、図面の説明文に示された濃度で、引き続き抗-マウスHRP複合体(1:1000)で検出し、化学発光により可視化した(Amersham社、ECL Plusウェスタンブロット検出システム)。
細胞培養物/スフェロイドからの総RNAを、RNeasyミニキット(Qiagen社、英国)を製造業者の指示に従い用いて分離した。相補的DNA(cDNA)を、総RNAの0.5〜1μgから、Superscript III第一鎖システム(Invitrogen社)を用いて合成した。定量的PCR(qPCR)分析を、SYBR GreenER qPCR SuperMix Universal(Invitrogen社)及びChromo4蛍光検出装置(MJ Research社、米国)を用い、3つ組みで行った。相対定量を、β2-ミクログロブリン遺伝子又はマウスβ-アクチン発現に対し規準化する、ΔΔCt法を用いて行った。プライマーに関する配列を、下記表に示す。
実験に先立ち、透明な底の96-ウェルプレート(CELLSTAR社)ウェルを、J1-ECD断片(NE3-Fc及びNE12-Fc)、他のNotch-リガンド(J2又はDLL4;両方共R&D社より)又は対照タンパク質(mIgG2b)のいずれかにより、0.1%BSA-PBS中濃度5μg/mlでコーティングした(4℃で一晩インキュベーション)。次にNotch補因子RBPJの制御下でルシフェラーゼ遺伝子を発現しているLS174T結腸直腸癌細胞を、異なるmAb(10μg/ml)又はDBZ(100nM)の存在下で、播種した(4×104個細胞/ウェル)。次にルシフェラーゼ活性を、24時間後、Bright-Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega社)を使用し、定量した。
細胞を収集し、2.5%マトリゲル(BD)-完全DMEM培地中に再懸濁した。細胞懸濁液を、低接着96-ウェルプレート(Corning社)上に播種し(200μl/ウェル)、次にほぼ固定された細胞数(MDA-MB-231及びMDA-MB-468細胞株について5×103個細胞;MCF7細胞について2×103個細胞)のスフェロイドを、プレートを1800rpmで10分間回転することにより、作製した。翌日、スフェロイドの写真を撮影し(1日目)、処置を加えた(mAbを、10μg/ml[ヒト化抗体について5μg/ml]、他方DBZを、濃度100nMで使用)。一部の実験において、パクリタキセル(1nM)及びドキソルビシン(20nM)を、J1-65D mAb処置と併用した。2日毎に、写真を撮影し、培地の半分を、mAb/薬物を含有する新鮮な培地と交換した。実験の最後に、スフェロイドを、RNA抽出のために溶解し、免疫組織化学分析のためにプロセシングし且つパラフィン包埋するか、又はFACS分析のために単独細胞懸濁液へピペッティング及びトリプシン処理により、解離させるかのいずれかで処置した。スフェロイドサイズは、ImageJソフトウェアを使用する、画像解析により、評価した。
スフェロイド解離後、細胞を、CD44-CD24表面発現(MDA-MB-231細胞株における癌幹細胞-濃厚な集団を同定することができるマーカーの組合せ[75])又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ1活性(幹細胞を同定するより一般的な方法[76])のいずれかにより分析した。CD44-CD24分析に関して、細胞を、フィコエリトリン(PE)-複合型抗-ヒトCD44抗体(クローン2C5;R&D Systems社)により、製造業者の指針に従い染色した。洗浄後、試料を、1%パラホルムアルデヒド(PBS中)で固定し、FACSCaliburにより獲得した。アルデヒドデヒドロゲナーゼ1活性に関して、細胞を調製し、製造業者のプロトコールに従い分析した(ALDEFLUOR(商標)キット;STEMCELL Technologies社)。
J1-又はベクター-形質導入されたMDA-MB-231細胞及びU87細胞を、それらの親細胞と共に、6ウェルプレートにおいて、5週間、共培養した。細胞を毎週2回分割し、GFP陽性集団(形質導入された細胞を表す)を、各分割後、FACSにより測定した。
マトリゲル100μl中のMDA-MB-231細胞(1×107個)又はU87安定細胞株(1×107個ベクター又はヒトJ1形質導入された)を、BALB/c nu/nuマウスの側腹部へ皮下注射した。指定された濃度のJ1遮断性mAb、対照IgG1 mAb、又は等容積のPBSを、腫瘍移植片として、同時に、及びその後3又は4日毎に、腹腔内注射した。腫瘍寸法を測定し、腫瘍容積を、説明されたように[77]、L×W×H×π/6として算出した。幾何平均直径(GMD)を、(L×W×H)1/3として算出した。
J1 mAb(J1-65D及びJ1-183D)を、Lonza Biologics社により、ヒト化及び脱免疫化した。簡単に述べると、インシリコヒト化及び脱免疫化を、両方のmAb配列について、CDRグラフティング技術及びT-細胞エピトープ減少を使用し、行った。重鎖及び軽鎖可変領域cDNAsを合成し、ヒトIgG1フレームワークをコードしている発現ベクターへとクローニングした。合計で16種の変種を、各mAbについて作製した。一過性トランスフェクションを、CHOK1SV GS-KO細胞において行い、ヒト化抗体を、プロテインAクロマトグラフィーにより、200ml培養上清から精製した。
RASGNIHNYLA
配列番号2
NAKTLADDI
配列番号3
QHFWSAPWT
配列番号4
DYEMH
配列番号5
QPGGGGTAYNQKFKG
配列番号6
RGYDDYPFAY
配列番号7
KSSQSLLNSSNQKNYLA
配列番号8
FASTRESGV
配列番号9
QQHYSTPYT
配列番号10
DYAMH
配列番号11
NTYYGDASYNQKFKG
配列番号12
LYDYDGGFAY
配列番号13
RTSENIYSYLT
配列番号14
NAKILAAGV
配列番号15
QHHYDIPWT
配列番号16
DYAIH
配列番号17
NTYYGDSKYNQKFKD
配列番号18
GYDGFAY
配列番号19
RASENIYSYLA
配列番号20
NAKTLAEVV
配列番号21
QHHYGTPLT
配列番号22
DYAMH
配列番号23
NTYYGDARYNQKFKG
配列番号24
GLEGFAY
配列番号79
QQHYSTPYT
配列番号80
NAKTLAEGV
配列番号81
QHHYGTPWT
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Claims (24)
- ヒトJagged 1のDelta/Serrate/LAG-2配列(DSL)ドメインを含む配列番号77の一部を含むエピトープを特異的に認識し、ヒトJagged 1とNotch及びCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害する抗体であって、前記のヒトJagged 1のDSLドメインの一部が残基E228を含む、抗体。
- 前記抗体が、ヒトJagged 1と、ヒトNotch 1、ヒトNotch 2、ヒトNotch 3、ヒトNotch 4、マウスNotch 1、マウスNotch 2、マウスNotch 3、マウスNotch 4、ヒトCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害する、請求項1に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトDelta様リガンド4を特異的に認識しない、請求項1又は2に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトDelta様リガンド4とNotchとの相互作用を阻害しない、請求項1〜3の何れか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトDelta様リガンド4と、ヒトNotch 1、ヒトNotch 2、ヒトNotch 3、ヒトNotch 4、マウスNotch 1、マウスNotch 2、マウスNotch 3、マウスNotch 4からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害しない、請求項4に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトJagged 2を特異的に認識しない、請求項1〜5の何れか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトJagged 2とNotchとの相互作用を特異的に認識しない、請求項1〜6の何れか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、ヒトJagged 2と、ヒトNotch 1、ヒトNotch 2、ヒトNotch 3、ヒトNotch 4、マウスNotch 1、マウスNotch 2、マウスNotch 3、マウスNotch 4からなる群より選択される受容体相互作用を阻害しない、請求項1〜7の何れか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、マウスJagged 1と、Notch及びCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害しない、請求項1〜8の何れか一項に記載の抗体。
- 前記抗体が、マウスJagged 1と、ヒトNotch 1、ヒトNotch 2、ヒトNotch 3、ヒトNotch 4、マウスNotch 1、マウスNotch 2、マウスNotch 3、マウスNotch 4、及びヒトCD46からなる群より選択される受容体との相互作用を阻害しない、請求項1〜9の何れか一項に記載の抗体。
- 前記抗体のCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2、及びCDR-H3が、
それぞれ配列番号1〜6のアミノ酸配列;
それぞれ配列番号7〜12(ここで任意により、前記抗体のCDR-L1、CDR-L2、及びCDR-L3が、それぞれ配列番号79〜81のアミノ酸配列を有する);
それぞれ配列番号13〜18のアミノ酸配列;或いは
それぞれ配列番号19〜24のアミノ酸配列
を有する、請求項1〜10の何れか一項に記載の抗体。 - CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3が、
それぞれ配列番号1、26、及び3;又は
それぞれ配列番号1、27、及び3
のアミノ酸配列を有し、
CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3が、
それぞれ配列番号4、5、及び6;
それぞれ配列番号4、29、及び6;又は
それぞれ配列番号4、30、及び6
のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗体。 - 軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)が、
それぞれ配列番号68及び73;
それぞれ配列番号68及び74;
それぞれ配列番号68及び75;
それぞれ配列番号68及び76;
それぞれ配列番号69及び73;
それぞれ配列番号69及び74;
それぞれ配列番号69及び75;
それぞれ配列番号69及び76;
それぞれ配列番号70及び73;
それぞれ配列番号70及び74;
それぞれ配列番号70及び75;又は
それぞれ配列番号70及び76
のアミノ酸配列を有する、請求項12に記載の抗体。 - CDR-L1、CDR-L2及びCDR-L3が、
それぞれ配列番号13、14、及び15;
それぞれ配列番号13、31、及び15;
それぞれ配列番号13、32、及び15;又は
それぞれ配列番号13、33、及び15
のアミノ酸配列を有し、
CDR-H1、CDR-H2及びCDR-H3が、
それぞれ配列番号16、17、及び18;又は
それぞれ配列番号16、34、及び18
のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の抗体。 - 軽鎖可変領域(VL)及び重鎖可変領域(VH)が、
それぞれ配列番号58及び63;
それぞれ配列番号58及び64;
それぞれ配列番号58及び65;
それぞれ配列番号58及び66;
それぞれ配列番号59及び63;
それぞれ配列番号59及び64;
それぞれ配列番号59及び65;
それぞれ配列番号59及び66
それぞれ配列番号60及び63;
それぞれ配列番号60及び64;
それぞれ配列番号60及び65;
それぞれ配列番号60及び66;
それぞれ配列番号61及び63;
それぞれ配列番号61及び64;
それぞれ配列番号61及び65;又は
それぞれ配列番号61及び66
のアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の抗体。 - 請求項1〜15の何れか一項に記載の抗体と、医薬的に許容可能な希釈剤、賦形剤、アジュバント、及び/又は、少なくとも1つの更なる治療剤とを含む医薬組成物。
- 治療に使用される、請求項1〜15の何れか一項に記載の抗体、或いは請求項16に記載の医薬組成物。
- 前記治療が併用療法である、請求項17に記載の抗体又は組成物。
- 前記併用療法が、請求項1〜15の何れか一項に記載の抗体、或いは、請求項16に記載の医薬組成物の投与と、少なくとも1つの化学療法剤、放射線治療、少なくとも1つの更なる抗体、及び/又は、少なくとも1つのサイトカインの適用とを含む、請求項18に記載の抗体又は組成物。
- 腫瘍/癌の治療に使用される、請求項17〜19の何れか一項に記載の抗体又は組成物。
- 腫瘍/癌が、膵癌、B-細胞慢性リンパ性白血病、舌扁平上皮癌、神経膠腫、腎癌、急性白血病、急性骨髄白血病、子宮内膜癌、結腸直腸癌、膠芽腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、エナメル上皮腫、バレット食道腺癌、肺癌、髄芽腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、頭頸部癌、子宮頸癌、B-細胞慢性リンパ性白血病、びまん性大B-細胞リンパ腫、皮膚原発CD30+リンパ球増殖障害、ホジキンリンパ腫、黒色腫、肝細胞癌、癌幹細胞含有腫瘍/癌からなる群より選択される、請求項20に記載の抗体又は組成物。
- 請求項1〜15の何れか一項に記載の抗体を含有及び/又は分泌するハイブリドーマ。
- 組換型の請求項1〜15の何れか一項に記載の抗体を発現する細胞又は細胞株。
- 請求項1〜15の何れか一項に記載の抗体を発現しうる組換発現ベクター。
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