PL234632B1

PL234632B1 - Przeciwciała oddziałujące z komórkami psich chłoniaków typu B i ich zastosowania

Info

Publication number: PL234632B1
Application number: PL416359A
Authority: PL
Inventors: Arkadiusz MIĄŻEK; Marta LISOWSKA; Andrzej Rapak
Original assignee: Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Polskiej Akademii Nauk
Priority date: 2016-03-02
Filing date: 2016-03-02
Publication date: 2020-03-31
Also published as: RS62002B1; LT3423497T; EP3423497A1; ES2875550T3; EP3423497B1; SI3423497T1; PL416359A1; US11274161B2; US20190144560A1; HUE055076T2; WO2017151000A1; EP3423497A4

Description

Opis wynalazku

Choroby układu limfoidalnego (białaczki, chłoniaki) u psów stanowią około 30% spośród wszystkich diagnozowanych typów nowotworów u tego gatunku zwierząt. Najczęściej występują chłoniaki nieziarnicze typu B analogiczne do ludzkich chłoniaków nieziarniczych Hodgkin'a (NHL), które stanowią około 20% wszystkich psich nowotworów i około 85% nowotworów układu limfoidalnego. Zapadalność na chłoniaki w populacji psów jest większa niż ma to miejsce u ludzi. Chorują psy różnych ras i w różnym wieku, ale najliczniejszą grupę chorych stanowią psy w wieku około 10 lat.

W terapii chłoniaków stosuje się tradycyjne schematy stosowane u ludzi z wykorzystaniem klasycznych leków cytostatycznych (doksorubicyna, winkrystyna, prednisolon, etopozyd) podawanych pojedynczo lub w połączeniu. Wadą takiej terapii jest mała swoistość przy dużych efektach niepożądanych. Bardziej kompleksowa terapia daje szybsze wyleczenie oraz dłuższy czas przeżycia, jednak taka procedura jest bardziej kosztowna i obarczona większą toksycznością. Z kolei terapia pojedynczymi chemoterapeutykami jest tańsza, ale mniej efektywna. Pomimo początkowej remisji choroby, konwencjonalna chemioterapia powoduje powstawanie oporności i nawrót choroby. Poważnym problemem są koszty finansowe, które musi ponosić właściciel psa. Aktualnie brak jest innych skutecznych i jednocześnie łagodnych i tanich metod leczenia. Z powodu podobieństw anatomicznych i fizjologicznych psy stały się użytecznym modelem w badaniach nad nowymi lekami i metodami leczenia dla ludzi. Również naturalnie powstające nowotwory u psów wykazują szereg wspólnych cech.

W leczeniu ludzkich chłoniaków i białaczek stosuje się już humanizowane przeciwciała monoklonalne rozpoznające na limfoidalnych komórkach B antygen CD20 (Rituximab, Ofatumumab ) lub na komórkach szpikowych antygen CD33 (Gemtuzumab), komórkach B i T (CD52) (Alemtuzumab). Wadą tych przeciwciał jest oddziaływanie z prawidłowymi komórkami limfoidalnymi, jednak naturalny proces odnowy puli obwodowych limfocytów B zachodzący w szpiku kostnym zapobiega powstaniu trwałych niedoborów odporności związanych z delecją tych komórek w wyniku immunoterapii anty-CD20. Próba zastosowania Rituximabu u psów zakończyła się niepowodzeniem z powodu braku reakcji krzyżowej z psim CD20. Nowe przeciwciała monoklonalne rozpoznające swoiście cząsteczkę CD20 psa zostały otrzymane przez Rue S.M. i wsp. i testowane w kontekście terapii psich chłoniaków B komórkowych (Sarah M. Rue, Brendan P. Eckelman, Jem A. Efe, Kristin Bloink, QuinnL. Deveraux, David Lowery, Marc Nasoff, Veterinary Immunology and Immunopathology 164 (2015) 148-159).

Oprócz antygenów CD20 i CD33 za cel terapii przeciwnowotworowej uważany jest antygen HLA-DR, należący do głównego układu zgodności tkankowej MHCII. Jego ekspresja znacznie podnosi się w komórkach białaczek i chłoniaków typu B oraz w przebiegu szeregu chorób autoimmunologicznych (m.in. reumatoidalnym zapaleniu stawów, Malone DG, Wahl SM, Tsokos M, Cattell H, Decker JL, Wilder RL., J Clin Invest. 1984 Oct; 74(4): 1173-85., stwardnieniu rozsianym, Olerup O, Fredrikson S, Olsson T, Kam-Hansen S. Lancet. 1987 Aug 8;2(8554):327.

Aktualnie w badaniach klinicznych znajduje się humanizowane przeciwciało przeciwko ludzkiej podjednostce alfa HLA-DR (hL243) (Goldenberg i wsp., Patent USA 8992917B2). Antygen HLA-DR ulega uwolnieniu z powierzchni komórki w wyniku proteolitycznego trawienia i możliwy jest do wykrycia w surowicy krwi i innych płynach ustrojowych. Oznaczanie rozpuszczalnej formy (s-HLA-DR) może być ważnym markerem diagnostycznym w przypadku chorób limfoproliferacyjnych i autoimmunologicznych, a blokowanie oddziaływania s-HLA-DR z receptorem Tirc7 na powierzchni limfocytów T CD4+ może wpływać na ich aktywację (Frischer J, Reindl M, Kunz B, Berger T, Schmidt S, Milford E, Knosp E, Lassmann H, Utku N.Mult Sceler. 2014 Feb 13.).

Steplewski i współpracownicy opisali kilka przeciwciał monoklonalnych otrzymanych przeciwko komórkom psiego chłoniaka i rozpoznających niezidentyfikowane antygeny powierzchniowe na psich komórkach limfoidalnych. Przeciwciała te reagowały w różnym stopniu z prawidłowymi komórkami limfoidalnymi (Z. Steplewski, K.A. Jeglum, C. Rosales, N. Weintraub. Canine lymphoma-associated antigens defined by murine monoclonal antibodies. Cancer Immunol. Immunother. 1987, 24, 197-201; Patent Kanadyjski CA 1340 898 Monoclonal Antibodies Against Lymphoma-associated Antigms, Hybrid Cell Lines Producing These Antibodies, and Use Therefore).

Celem wynalazku jest dostarczenie nowych substancji będących przeciwciałami nadających się do leczenia, profilaktyki i diagnozowania białaczki u psów.

Nieoczekiwanie, określony powyżej problem został rozwiązany w niniejszym wynalazku.

Przedmiot wynalazku stanowi przeciwciało specyficznie oddziałujące z komórkami psich chłoniaków typu B zawierające:

PL 234 632 B1

A) łańcuch ciężki przeciwciała zawierający regiony CDR oznaczone jako sekw. nr 1-3, zwłaszcza zawierający region zmienny łańcucha ciężkiego posiadający sekwencję aminokwasową oznaczoną jako sekw. nr 7 i łańcuch lekki przeciwciała zawierający regiony CDR oznaczone jako sekw. nr 9-11, zwłaszcza zawierający region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową oznaczoną jako sekw. nr 15;

lub

B) łańcuch ciężki przeciwciała zawierający regiony CDR oznaczone jako sekw. nr 4-6, zwłaszcza zawierający region zmienny łańcucha ciężkiego posiadający sekwencję aminokwasową oznaczoną jako sekw. nr 8 i łańcuch lekki przeciwciała zawierający regiony CDR oznaczone jako sekw. nr 12-14, zwłaszcza zawierający region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową oznaczoną jako sekw. nr 16.

Korzystnie, jest ono przeciwciałem produkowanym przez hybrydomę wybraną spośród linii komórkowych zdeponowanych w DSM pod numerami dostępowymi DSM ACC3287 oraz DSM ACC3288.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało według wynalazku określone powyżej przeznaczone do stosowania w leczeniu lub profilaktyce białaczki, zwłaszcza psiej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało według wynalazku określone powyżej przeznaczone do stosowania w diagnostyce białaczki, zwłaszcza psiej.

Nieoczekiwanie, w wyniku selekcji klonów przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko psim komórkom białaczkowym typu B, uzyskano klony, które swoiście rozpoznają komórki psich białaczek i chłoniaków typu B, lecz nie wykazują reaktywności z chłoniakami i białaczkami typu T. Przeciwciała te oddziałują z prawidłowymi limfocytami T i B, jednak poziom ekspresji cząsteczek rozpoznawanych na tych komórkach jest znacznie niższy niż na komórkach białaczek i chłoniaków typu B. Otrzymane przeciwciała mogą być wykorzystane zarówno w diagnostyce jak i terapii psich białaczek i chłoniaków typu B, a także innych schorzeń, w których następuje podwyższenie ekspresji antygenu DLA-DR.

Jednym z aspektów wynalazku są dwa mysie przeciwciała monoklonalne B5 i E11 oraz komórki hybrydoma wydzielające te przeciwciała. Obydwa przeciwciała posiadają izotyp IgG2a łańcucha ciężkiego i rozpoznają konformacyjne epitopy na cząsteczce DLA-DR.

Sekwencje DNA i aminokwasowe fragmentów zmiennych każdego z przeciwciał przedstawiono na Ryc. 1. Przykład 1 ujawnia sekwencję regionów zmiennych, a przykład 4 dowodzi specyficzności antygenowej przeciwciał wobec DLA-DR.

Otrzymane zgodnie z wynalazkiem przeciwciała mogą być znakowane fluorescencyjnymi barwnikami, biotyną, radionuklidami, związkami paramagnetycznymi lub enzymami, i użyte do oznaczeń immunologicznych. Przykład 2 prezentuje barwienia z użyciem przeciwciał sprzężonych z biotyną, natomiast inne typy znakowania przeciwciał mogą być łatwo uzyskane rutynowymi metodami znanymi ze stanu techniki.

Ujawnione przeciwciała mogą być użyte w teście immunoenzymatycznym ELISA, z których jedno służy do opłaszczenia płytek ELISA, a drugie znakowane biotyną lub peroksydazą jako czynnik detekcyjny. W przykładzie 5 opisano przykładową realizację takiego testu.

Kolejnym aspektem wynalazku są fragmenty zmienne przeciwciał, rozpoznające antygen mogą zostać przyłączone do fragmentów stałych łańcuchów ciężkich (Fc) oraz lekkich psich immunoglobulin w celu otrzymania chimerowego mysio-psiego przeciwciała o obniżonej immunogenności do celów terapii psich chłoniaków.

Kolejnym aspektem wynalazku są fragmenty przeciwciał (Fab) otrzymane metodą enzymatycznej proteolizy, które mogą być dodatkowo sprzężone z substancjami cytotoksycznymi i/lub cytostatycznymi (np. doxorubicyna, betulina, metotreksat) i użyte w terapii (psich/ludzkich) chłoniaków lub schorzeń o podłożu autoimmunologicznym.

Przeciwciała według wynalazku mogą być również wykorzystane do blokowania oddziaływań rozpuszczalnych cząsteczek DLA-DR (s-DLA-DR) i HLA-DR (s-HLA-DR) obecnych w płynach ustrojowych z komórkami układu odporności, w szczególności z limfocytami T.

Ujawnione w niniejszym zgłoszeniu przeciwciała monoklonalne MAbs B5 i Eli są jedynymi przeciwciałami nie bazującymi na reakcji krzyżowej pomiędzy cząsteczkami DLA-DR i HLA- DR, lecz wytworzonymi poprzez immunizację myszy antygenami psa, co gwarantuje optymalne powinowactwo wobec antygenu docelowego. W przykładzie 2 wykazano, że poziom fluorescencji uzyskanej po związaniu takiej samej ilości przeciwciał B5 i E11 do antygenów DLA-DR obecnych na liniach pochodzących

PL 234 632 B1 z psów jest znacząco wyższy niż na liniach ludzkich wyrażających antygen HLA-DR, co wskazuje na optymalne powinowactwo wobec DLA-DR.

Izotyp IgG2a łańcucha ciężkiego obydwu przeciwciał, ze względu na optymalne wiązanie komponentów dopełniacza i receptorów Fc na komórkach układu odporności, pozwala na wywoływanie efektu cytotoksyczności zależnej od przeciwciał. Są to też jedyne dostępne mysie przeciwciała anty DLA-DR o izotypie IgG2a. Przykład 6 ilustruje poziom cytotoksyczności w teście in vitro z dopełniaczem króliczym i wskazuje, że obydwa przeciwciała wykazują w tym teście aktywność.

Potencjał do diagnostyki psich chłoniaków i białaczek B komórkowych i mieszanych B/T komórkowych przy skojarzonym użyciu przeciwciał B5 i E11 przekracza 94% i znacząco wyższy niż w przypadku innych dostępnych przeciwciał. Przykład 3 wskazuje, że użycie przeciwciał B5 i E11 pozwala na swoiste rozpoznanie ponad 94% rozrostów nowotworowych z limfocytów B lub mieszanych B/T zajmujących węzły chłonne metodą analizy bioptatów cienkoigłowych (do jest obecnie złotym standardem postępowania diagnostycznego). Wykazano natomiast, że bioptaty powiększonych węzłów chłonnych psów nie chorujących na chłoniaki lub białaczki typu B lub psów chorujących na boreliozę nie dają dodatniej reakcji z przeciwciałami B5 i E11.

MAbs B5 i E11 rozpoznają rozpuszczalne formy antygenów DLA-DR w teście ELISA, co nie jest właściwością wszystkich przeciwciał reagujących ze związanymi z błoną komórkową cząsteczek HLADR. Przykład 5 potwierdza potencjał przeciwciał B5 i E11 do wiązania antygenów DLA-DR obecnych w płynach ustrojowych bądź lizatach z komórek nowotworowych.

MAbs B5 i E11 mają potencjał do blokowania oddziaływań pomiędzy związanymi z błoną komórkową lub rozpuszczalnych cząsteczek DLA-DR z receptorami antygenowymi limfocytów T (TCR) lub receptorami Tirc7 na powierzchni limfocytów T.

P r z y k ł a d 1. Otrzymanie hybrydom i ustalenie sekwencji DNA genów kodujących regiony zmienne łańcuchów lekkich i ciężkich wydzielanych przeciwciał, specyficznie oddziałujących z komórkami psich chłoniaków typu B.

Zastosowano standardową, powszechnie opisywaną procedurę immunizacji myszy oraz fuzji splenocytów w celu otrzymywania hybrydom produkujących przeciwciała monoklonalne. W skrócie, komórki linii psiego chłoniaka typu B (CLB70) w ilości 6 x 106 zostały zawieszone w 300 mikrolitrach soli fizjologicznej i emulsyfikowane w 300 mikrolitrach niekompletnego adiuwantu Freunda. Tak przygotowany antygen został podawany w trzech dootrzewnowych iniekcjach w ilości 200 mikrolitrów/iniekcję myszy CD-1 w dwutygodniowych odstępach.

Cztery dni po ostatniej iniekcji splenocyty immunizowanej myszy poddano fuzji w obecności glikolu polietylenowego (PEG 1500) z linią szpiczaka SP2.0 i hodowano w obecności podłoża selekcyjnego zawierającego hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 5% CO2. Supernatanty znad hodowli hybrydoma (500 klonów) zostały sprawdzone na reaktywność wobec komórek CLB70 metodą cytometrii przepływowej.

W puli analizowanych hybrydom nieoczekiwanie zidentyfikowane dwie linie produkujące przeciwciała monoklonalne o bardzo wysokim powinowactwie do komórek psich chłoniaków typu B (CLB70). Przeciwciała te zostały nazwane B5 i E11, a produkujące je hybrydomy odpowiednio IITD PAN B5 oraz IITD PAN E11. Hybrydomy te zostały zdeponowane zgodnie z traktatem budapesztańskim w DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) pod następującymi numerami dostępu: DSM ACC3287 (linia IITD PAN B5) oraz DSM ACC3288 (IITD PAN E11).

Z wybranych hybrydom produkujących pożądane przeciwciała został wyizolowany mRNA, który po przepisaniu na cDNA standardowymi metodami biologii molekularnej został amplifikowany starterami oligonukleotydowymi o sekwencjach komplementarnych w stosunku do regionów Vk (5’CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTATACA) i Vh (5’-AGGTCCAGCTGCTCGAGTCTGG) oraz Ch 5’GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC i Ck 5’-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG mysich immunoglobulin. Otrzymane, fragmenty cDNA klonowano i poddawano sekwencjonowaniu DNA metodą Sangera. Na Rycinie 1 wykazano sekwencje DNA kodujące regiony zmienne łańcuchów ciężkich VH i lekkich Vk immunoglobulin B5 i E11. W numeracji pozycji aminokwasów odpowiadających regionom zmiennym immunoglobulin posłużono się nomenklaturą Kabata. Regiony hiperzmienne wytłuszczono w sekwencji aminokwasowej i podpisano odpowiednio CDR-1, -2, -3.

P r z y k ł a d 2. Analiza reaktywności przeciwciał B5 i E11 z antygenami powierzchniowymi obecnymi na wybranych psich i ludzkich liniach komórkowych metodą cytofluorymetrii przepływowej

PL 234 632 B1

Biotynylowane przeciwciała B5 i E11 lub biotynylowane kontrolne mysie przeciwciało anty- DNP w ilości 1,5 mikrograma na 100 mikrolitrów buforowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS) z dodatkiem 2% bydlęcej surowicy płodowej (FBS) były inkubowane z zawiesinami 10⁵ komórek wskazanych na Rycinie 2 na lodzie przez 30 minut. Po odpłukaniu niezwiązanych przeciwciał r-rem PBS+2% FBS komórki były inkubowane w 100 mikrolitrach na próbę z koniugatem fluorescencyjnym streptawidyny z fikoerytryną (Streptavidin PE, eBioscience) rozcieńczonym 1:1000. Analizy cytofluorymetryczne przeprowadzono z wykorzystaniem urządzenia BD Calibur. Wyniki przedstawiono w formie histogramów (szare wypełnienie) w odniesieniu do poziomu fluorescencji komórek barwionych przeciwciałem kontrolnym (brak wypełnienia). W analizach tych wykazano, że antygeny rozpoznawane przez przeciwciała B5 i E11 są obecne na powierzchni linii psich (CLBL1 i CLB70) i ludzkich (Raji) chłoniaków B komórkowych, które wykazują, udokumentowaną w innych publikacjach, ekspresję antygenów MHC II haplotypu DRB, lecz są nieobecne na psich (CL-1 ) i ludzkich (Hut-78, Jurkat) liniach T komórkowych oraz psiej linii mastocytomy (NL-1). Ekspresja antygenu dla B5, lecz nie E11 występuje na psiej linii (GL-1) posiadającej markery limfocytów B i T.

P r z y k ł a d 3. Analiza reaktywności przeciwciał B5 i E11 wobec próbek krwi i bioptatów węzłów chłonnych psów.

Otrzymane zawiesiny jednojądrzastych komórek z krwi obwodowej (PBMC) (Tabela 1) lub z bioptatów węzłów chłonnych (Tabela 2) psów ze zdiagnozowanymi chłoniakami lub powiększonych w wyniku potwierdzonej infekcji Borrelia burgdorferi zostały zabarwione jak w Przykładzie 2 i poddane analizie cytofluorymetrycznej FACS. Odsetki PBMC wykazujących reaktywność z mAb B5 i E11 były największe dla analizowanych przypadków chłoniaków B-komórkowych i wynosiły odpowiednio trzy spośród trzech analizowanych dla mAb B5 i dwa spośród trzech dla mAb E11 (Tabela 1). Natomiast brak reaktywności obydwu przeciwciał odnotowano dla prób od psów zdrowych, zakażonych Borrelia burgdorferi lub ze zdiagnozowanymi chłoniakami T-komórkowymi. Odsetek komórek z węzłów chłonnych, wykazujących specyficzną fluorescencję, ponad fluorescencję kontroli izotypowej (>15% komórek pozytywnych), zostały zestawione w Tabeli 2, oddzielnie dla każdego psa. Na 13 osobników z potwierdzonymi chłoniakami B-komórkowymi 11 (84,6%) oraz 12 (92,3%) wykazywało reaktywność odpowiednio z przeciwciałami B5 i E11. Wśród psów z chłoniakami T-komórkowymi wartości te wynosiły odpowiednio 1 na 5 z mAb B5 (20%) i 0 na 5 z mAb E11. Na 5 analizowanych chłoniaków o fenotypie mieszanym B/T-komórkowym 5 (100%) było pozytywnych dla mAb B5, a 4 (80%) dla mAb E11. W Tabeli 3 poddano ocenie poziom ekspresji antygenów rozpoznawanych przez mAb B5 i El 1. Wykazano, że najwyższe średnie natężenie fluorescencji (MFI) wynoszące 539 i 294 wykazują odpowiednio chłoniaki o fenotypie mieszanym B/T-komórkowym i chłoniaki B-komórkowe barwione przeciwciałem B5. Dla przeciwciała E11 wartości te wynosiły odpowiednio 308 i 162. Natomiast MFI dla chłoniaków T-komórkowych wynosiło 23 i 15 odpowiednio dla przeciwciał B5 i E11. Wartości MFI dla PBMC od psów zdrowych lub chorych na boreliozę nie przekraczały wartości 10,5.

P r z y k ł a d 4. Identyfikacja antygenów rozpoznawanych przez przeciwciała B5 i E11.

Na podstawie sekwencjonowania białek immunoprecypitowanych z lizatów białkowych z linii CLBL1 metodą spektroskopii masowej, wstępnie wytypowano dimery antygenu zgodności tkankowej klasy II, DLA-DR jako swoiście wiązane przez przeciwciała B5 i E11. W celu potwierdzenia tej identyfikacji transfekowano ludzką linię karcynomy płodowej (HEK293) konstrukcjami genowymi kodującymi łańcuchy psich antygenów zgodności tkankowej DLA-DRa i DLA-DR3 w wektorze ekspresyjnym pcDNA3 lub kontrolnie pustym wektorem ekspresyjnym. W skrócie 3 μg oczyszczonego DNA plazmidowego było inkubowane z odczynnikiem Metafecten Pro (Biontex) zgodnie z protokołem producenta, a następnie mieszanina DNA/Metafecten Pro była wprowadzona do 2 x 10⁵ komórek HEK.293 hodowanych na płytce 12 dołkowej w 1 ml podłoża OptiMEM (Life Technologies). Po 24 godzinach od transfekcji komórki zostały poddane analizie cytofluorymetrycznej FACS przeciwciałami B5 i E11 jak opisano w Przykładzie 2. Na Rycinie 4a pokazano przykładową, reprezentatywną analizę FACS komórek po transfekcji. Komórki transferowane pojedynczymi konstrukcjami kontrolnymi (pcDNA3) bądź kodującymi łańcuchy DLA-DRa lub DLA-DR3, nie barwiły się koniugatami fluorescencyjnymi przeciwciał B5 i E11. Natomiast barwienie wykazano dla obydwu przeciwciał w przypadku ko-transfekcji komórek HEK293 konstrukcjami kodującymi łańcuchy DLA-DRa i DLA-DR3.

Używając techniki Western blotting na lizatach białkowych z komórek transferowanych powyżej opisanymi konstrukcjami genowymi wykazano, że przeciwciała B5 i E11 rozpoznają dimer DLA-DRa3 o masie cząsteczkowej 55 kD, lecz nie rozpoznają pojedynczych łańcuchów DLA-DRa lub DLA-DR3 (Rycina 4b). Dodatkowo wykazano, reaktywność obydwu uzyskanych przeciwciał techniką Western

PL 234 632 B1 blotting na lizatach z linii chłoniaków B komórkowych (CLBL1 i CLB70), lecz nie wykazano jej w stosunku do lizatów z linii T komórkowej (CL-1) lub B-komórkowej (GL-1) pozbawionej antygenów DLA-DR, a także na lizatach z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej PBMCs, Rycina 4b. Co więcej, ustalono, że epitopy rozpoznawane przez przeciwciała B5 i E11 mają charakter konformacyjny, gdyż traktowanie lizatów białkowych 6M r-rem mocznika lub ich gotowanie znosi oddziaływanie przeciwciałoantygen.

P r z y k ł a d 5 Test ELISA do oznaczania DLA-DR i s-DLA-DR na lizatach komórkowych w płynach ustrojowych w oparciu o wykorzystanie przeciwciał B5 i E11.

Płytki do testu ELISA (Maxisorp, Nunc) opłaszczano roztworem przeciwciała E11 o stężeniu μg/ml PBS w temperaturze 4°C przez 12 godzin. Po blokowaniu płytki 1 % roztworem kazeiny TBS (50 mM Tris-Cl, pH=7,5; 150 mM NaCl) z 0,05% detergentem Tween-20 przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, płytki inkubowano z badanymi roztworami (lizat komórkowy, surowica krwi), przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, po czym trzykrotnie płukano roztworem TBS+0,05% Tween-20 i inkubowano z biotynylowanym przeciwciałem B5 (1,5 μg/ml) przez 1 h w temperaturze 37°C. Po trzykrotnym płukaniu, jak wyżej, inkubowano płytki w z koniugatem streptawidyny z peroksydazą chrzanową (1:1000, eBioscence) przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, a następnie wywoływano barwną reakcję dodając substatrat TMB. W Tabeli 4 wykazano, że lizaty z komórek cechujących się ekspresją antygenów zgodności tkankowej DLA-DR wykazują około 40 krotnie wyższą specyficzną absorbancję w teście ELISA w stosunku do komórek kontrolnych, a także że surowice krwi psów z chłoniakami wykazują średnio dwukrotnie wyższą specyficzną absorbancję w tym teście w stosunku do kontroli.

P r z y k ł a d 6. Analiza cytotoksyczności zależnej od dopełniacza przeciwciał B5 i E11 wobec psiego chłoniaka CLBL1

Komórki psiego chłoniaka CLBL1 (2 x 105) były inkubowane z przeciwciałami B5 lub E11 w stężeniu 1 μg/100 μl przez 1 godzinę na lodzie w podłożu RPMI bez surowicy. Po zwirowaniu komórek (300 x g przez 5 minut) i odpłukaniu przeciwciał (5 ml podłoża RPMI), komórki zostały zawieszone w 1 ml RPMI do którego dodano roztworu nietoksycznego dopełniacza króliczego (Sigma) w ilości 50 μ|. Komórki z dopełniaczem inkubowano przez 40 minut w łaźni wodnej o temperaturze 37°C z okresowym zamieszaniem próbki co 10 minut. Po inkubacji komórki zwirowano (300 x g przez 5 minut), przepłukano r-rem PBS+2% FBS i analizowano żywotność przez inkubację z jodkiem propidyny (50 ng/ml) w teście cytofluorometrycznym FACS. Zliczano także komórki martwe i żywe w komorze Burkera stosując barwienie błękitem trypanu. W Tabeli 5 pokazano, że przeciwciała B5 i E11, lecz nie mysie przeciwciało kontrolne o tym samym co B5 i E11 izotypie, wykazują efekt cytotoksyczny zależny od dopełniacza.

PL 234 632 Β1

SEQUENCE LISTING <110> Instytut Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN <120> Przeciwciała monoklonalne rozpoznające swoiście psi antygen DLA-DRB i ich zastosowania <130> PK/3642/RW <160> 24 <170> Patentln verslon 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B5VH CDR1 <400> 1

Ser Tyr Phe Ile His

5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> ARTIFICIAL <220>

<223> B5VH CDR2 <400> 2

Trp Ile Phe Pro Gly Asn Ile Asn Ala Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Arg

10 15

Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B5VH CDR3

PL234 632B1 <400> 3

Ala Pro Leu Leu Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr
1	5	10
<210>	4
<211>	5
<212>	PRT
<213>	artificial
<220> <223>	E11VH CDR1
<400>	4
Ser Tyr	Tyr Ile His
1	5
<210>	5
<211>	17
<212>	PRT
<213>	artificial
<220> <223>	E11VH CDR2
<400>	5
Trp Ile	¹ Tyr Pro Gly	Ser	Gly	Asn	Ser	Lys Tyr Asn Glu	Lys Phe Lys
1	5					10	15
Gly

<210>	6
<211>	11
<212>	PRT
<213>	artificial
<220>
<223>	E11VH CDR3
<400 >	6
Gly Gly Ser Gly Tyr Val	Gly Ala Met Asp Cys
1	5	10

PL 234 632 Β1 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B5VH <400> 7

Gin

Val

Gin

Leu

Gin

Ser

Gly

Pro

Glu

Leu

Met

Lys

Pro

Gly

Thr

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

Thr

Ser

Tyr

Phe

Ile

His 35

Trp

Met

Lys Gin

Arg 40

Pro

Gly Gin

Gly

Leu 45

Glu

T rp

Ile

Gly

T rp

Ile

Phe

Pro

Gly

Asn

Ile

Asn

Ala

Lys

Tyr

Asn

Glu

Asn

Phe

50

55

60

Arg

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Ile

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Tyr

Cys

85

90

95

Ala

Arg

Ala

Pro

Leu

Gly

Asn

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Trp

Gly

Gin

Gly

100

105

110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 <210> 8 <211> 12Θ <212> PRT <213> artificial <220>

<223> E11VH <400> 8

PL234 632B1

Glu 1

Val Gin

Leu

Arg Glu 5

Ser

Gly

Pro Glu 10

Leu Val

Lys

Pro

Gly Thr 15

Ser

Val

Lys

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Arg

Leu

Thr

Ser

Tyr

20

25

30

Tyr

Ile

His

Trp

Val

Lys

Gin

Arg

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

Glu

Trp

Ile

35

40

45

Gly

T np

Ile

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gly

Asn

Ser

Lys

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

50

55

60

Lys

Gly

Lys

Ala

Thr

Leu

Thr

Ala

Asp

Thr

Ser

Thr

Ala

Tyr

65

70

75

80

Met

Gin

Leu

Ser

Leu

Thr

Ser

Glu

Asp

Ser

Ala

Val

Phe

Tyr

cys

85

90

95

Ala

Arg

Gly

Ser

Gly

Tyr

Val

Gly

Ala

Met

Asp

Cys

T rp

Gly

Gin

100

105

110

Gly

Thr

Ser

Val

Thr

Val

Ser

115

120

<210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> artificial <22θ>

<223> B5Vk CDR1 <400> 9 Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu Ser
1	5	10

<210>	10
<211>	7
<212>	PRT
<213>	artificial

PL 234 632 Β1 <220>

<223> B5Vk CDR2 <400> 10

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1	5
<210>	11
<211>	9
<212>	PRT
<213>	artificial
<220> <223>	B5Vk CDR3
<400>	11
Gin Asn	Phe Phe Ile	Thr	Pro	Tyr	Thr
1	5
<210>	12
<211>	11
<212>	PRT
<213>	artificial
<220> <223>	EllVk CDR1
<400 >	12
Arg Thr	Ser Glu Asn	Ile	Tyr	Ser	Phe	Leu Ala
1	5					10
<210>	13
<211>	7
<212>	PRT
<213>	artificial
<220> <223>	EllVk CDR2
<400>	13
Asn Ala	Lys Thr Leu	Val	Glu

5 <210> 14

PL234 632B1

<211>	9
<212>	PRT
<213>	artificial
<220> <223>	EllVk CDR3
<400 >	14

Gin His His Tyr Gly Thr Pro Leu Thr

5 <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> B5Vk <400> 15

Glu Leu 1

Val

Leu

Thr 5

Gin Ser

Pro

Ala Ser Leu Ser 10

Ala Ser

Val 15

Gly

Glu

Thr

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Gly

Ala

Ser

Glu

Asn

Ile

Tyr

Gly

Ala

2Θ

25

30

Leu

Ser

T rp

Tyr

Gin

Arg

Lys

Gin

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Ile

35

40

45

Tyr

Gly

Ala

Thr

Asn

Leu

Ala

Asp

Gly

Leu

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Arg

Gin

Tyr

Ser

Leu

Lys

Ile

Ser

Leu

His

Pro

65

70

75

80

Asp

Val

Ala

Thr

Tyr

cys

Gin

Asn

Phe

Ile

Thr

Pro

Tyr

85

90

95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys Arg

100 105 <210> 16

PL 234 632 Β1 <211> 108 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> EllVk <400> 16

Glu 1

Leu Val

Leu Thr Gin 5

Ser

Pro

Ala

Ser 10

Leu

Ser

Ala

Ser

Val 15

Gly

Glu

Thr

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Arg

Thr

Ser

Glu

Asn

Ile

Tyr

Ser

Phe

20

25

30

Leu

Ala

Trp

Ser

Gin

Lys

Gin

Gly

Lys

Ser

Pro

Gin

Leu

Val

35

40

45

Tyr

Asn

Ala

Lys

Thr

Leu

Val

Glu

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

Phe

Ser

Gly

50

55

60

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Gin

Phe

Ser

Leu

Arg

Ile

Asn

Ser

Leu

Gin

Pro

65

70

75

80

Glu

Asp

Phe

Gly

Ser

Tyr

cys

Gin

His

Tyr

Gly

Thr

Pro

Leu

85

90

95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys

1ΘΘ

Leu Glu Val Lys Arg

105 <210> 17 <211> 357 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> B5VH cDNA <400> 17 caggtccaac tgcaacagtc tcctgcaagg cttctggcta cctggacagg gacttgagtg tggacctgaa ctgatgaagc cactttcaca agctacttta gattggatgg atttttcctg ctgggacttc agtgaagatt tacactggat gaagcagagg gaaatattaa tgctaaatat

120

180

PL234 632B1 aatgagaact tcaggggcaa ggccacactg acggcagaca catcctccac caccgcctac240 atacagctca gcagcctaac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagcccct300 ttactgggga actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca357 <210> 18 <211> 324 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> B5Vk cDNA <400> 18 gagctcgtgc tcacccagtc tccagcttca ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtg gagcaagtga gaatatttac ggtgctttaa gttggtatca gcggaaacag 120 ggcaagtctc ctcagctcct gatctatggt gcaaccaact tggcagatgg cttgtcatcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtagacag tattctctca agatcagtag cctgcatcct 240 gacgatgttg caacgtatta ctgtcaaaat ttttttatta ctccgtacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggaaatgaa acgg 324 <210> 19 <211> 36Θ <212> DNA <213> artificial <220>

<223> E11VH cDNA <400> 19

gaggtgcagc	tgagagagta	aggacctgaa	ctggtgaagc	ctgggacttc	agtgaagata	60
tcctgcaagg	cttctggcta	caggctcaca	agctactata	tacactgggt	gaagcagagg	120
cctggacagg	gacttgagtg	gattggatgg	atttatcctg	gaagtggcaa	tagtaagtac	180
aatgagaagt	tcaagggcaa	ggccacactg	acggcagaca	catcctccag	cactgcctac	240
atgcagctca	gcagcctaac	atctgaggac	tctgcggtct	tttactgtgc	aagaggtggc	300
tcaggctacg	taggggctat	ggactgctgg	ggtcaaggaa	cctcagtcac	cgtctcctca	360

<210> 20

PL 234 632 Β1 <211> 324 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> EllVk cDNA <400> 20

gagctcgtgc	tcacccagtc	tccagcctcc	ctatctgcat	Ctgtgggaga	gactgtcacc	60
atcacatgtc	gaacaagtga	gaatatttac	agttttttag	catggtctca	gcagaaacag	120
ggaaaatctc	ctcagctcct	ggtctataat	gcaaaaacct	tagtagaagg	tgtgccatca	180
aggttcagtg	gcagtggatc	aggcacacag	ttttctctga	ggatcaacag	cctgcagcct	240
gaagattttg	ggagttatta	ctgtcaacat	cattatggta	ctcctctcac	gttcggcgct	300
gggaccaagc	tggaggtgaa	acgg				324

<210> <211>

<212>

<213>

DNA artificial <220>

<223>

Vk <400>

ccagttccga gctcgtgctc acccagtata ca

<210>	22
<211>	22
<212>	DNA
<213>	artificial
<220>
<223>	primer VH
<400>	22
aggtccagct gctcgagtct gg

<210>	23
<211>	39
<212>	DNA
<213>	artificial
<220>
<223>	primer CH

PL234 632B1 <4Θ0> 23 gcgtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac 39 <210>

<211>

<212>

<213>

DNA artificial <220>

<223>

primer Ck <400>

gcgtctagaa ctggatggtg ggaagatgg

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Przeciwciało specyficznie oddziałujące z komórkami psich chłoniaków typu E3 zawierające:

A) łańcuch ciężki przeciwciała zawierający regiony CDR oznaczone jako sekw. nr 1-3, zwłaszcza zawierający region zmienny łańcucha ciężkiego posiadający sekwencję aminokwasową oznaczoną jako sekw. nr 7 i łańcuch lekki przeciwciała zawierający legiony CDR oznaczone jako sekw. nr 9-11, zwłaszcza zawierający region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową oznaczoną jako sekw. nr 15;

lub

E3) łańcuch ciężki przeciwciała zawierający regiony CDR oznaczone jako sekw. nr 4-6, zwłaszcza zawierający region zmienny łańcucha ciężkiego posiadający sekwencję aminokwasową oznaczoną jako sekw. Nr 8 i łańcuch lekki przeciwciała zawierający regiony CDR oznaczone jako sekw. nr 12-14, zwłaszcza zawierający region zmienny łańcucha lekkiego posiadający sekwencję aminokwasową oznaczoną juko sekw. nr 16.
2. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem produkowanym przez hybrydomę wybraną spośród linii komórkowych zdeponowanych w DSM pod numerami dostępowymi DSM ACC3287 oraz DSM ACC3288.
3. Przeciwciało określone w zastrz. 1-2 do stosowania w leczeniu lub profilaktyce białaczki, zwłaszcza psiej.
4. Przeciwciało określone w zastrz. 1-2 do stosowania w diagnostyce białaczki, zwłaszcza psiej.