RS62002B1 - Monoklonska antitela koja posebno prepoznaju pseći dla-dr antigen i njihova upotreba - Google Patents

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na monoklonska antitela koja specifično prepoznaju pseći DLA-DR antigen i njihovu upotrebu u lečenju, prevenciji ili dijagnozi leukemija i limfoma, posebno pasa.

[0002] Limfoidne bolesti (leukemija, limfomi) kod pasa čine oko 30% svih dijagnostikovanih vrsta karcinoma kod ove životinjske vrste. Najčešći su B-ćelijski ne-Hodgkin-ovi limfomi, ekvivalentni ljudskim ne-Hodgkin-ovim limfomima (NHL), koji čine oko 20% svih psećih tumora i oko 85% limfoidnih tumora. Incidencija limfoma u populaciji pasa je veća nego kod ljudi. Pogođeni su psi različite rase i starosti, ali najveća grupa pacijenata su psi starosti oko 10 godina.

[0003] Koriste se tradicionalni režimi lečenja humanih limfoma zasnovani na klasičnim citostatičkim lekovima (doksorubicin, vinkristin, prednizolon, etopozid) koji se daju sami ili u kombinaciji. Nedostatak takve terapije je mala specifičnost sa velikim neželjenim efektima. Sveobuhvatnija terapija nudi brži oporavak i duže vreme preživljavanja, ali ovaj postupak je skuplji i toksičniji. Zauzvrat, hemoterapija pojedinačnim lekovima je jeftinija, ali manje efikasna. Uprkos početnoj remisiji bolesti, konvencionalna hemoterapija rezultira razvojem rezistencije i relapsom. Ozbiljan problem su finansijski troškovi koje mora snositi vlasnik psa. Trenutno ne postoje drugi efikasni postupci lečenja koje su istovremeno blage i pristupačne. Zbog anatomskih i fizioloških sličnosti, psi su postali koristan model istraživanja u razvoju lekova i lečenja za ljude.

[0004] Takođe rakovi koji se prirodno javljaju kod pasa pokazuju niz zajedničkih karakteristika.

[0005] Humanizovana monoklonska antitela koja prepoznaju CD20 antigen na limfoidnim B ćelijama (Rituksimab, Ofatumumab) ili CD33 antigen na mijeloidnim ćelijama (Gemtuzumab), B i T ćelijama (CD52) (Alemtuzumab) koriste se za lečenje humanih limfoma i leukemija. Nedostatak ovih antitela je taj što utiču na normalne limfoidne ćelije, ali prirodni proces obnavljanja cirkulišućih B ćelija iz koštane srži sprečava trajne imunološke nedostatke povezane sa brisanjem ovih ćelija imunoterapijom anti-CD20. Pokušaji upotrebe rituksimaba kod pasa bili su neuspešni zbog nedostatka unakrsne reaktivnosti sa psećim CD20. Nova monoklonska antitela koja specifično prepoznaju pseći CD20 dobila je Rue S.M. i dr. i testiran u kontekstu lečenja limfoma B-ćelija pasa(Sarah M. Rue, Brendan P. Eckelman, Jem A. Efe, Kristin Bloink, Quinn L. Deveraux, David Lowery, Marc Nasoff, Veterinary Immunology and Immunopathology 164 (2015) 148-159).

[0006] Pored antigena CD20 i CD33, cilj HIL-DR antigena, koji pripada glavnom kompleksu histokompatibilnosti MHC II, je meta antikancerogene terapije. Njegova ekspresija je značajno povećana kod leukemija i limfoma B-ćelija i kod brojnih autoimunih bolesti, uključujući reumatoidni artritis (Malone DG, Wahl SM, Tsokos M, Cattell H, Decker JL, Wilder RL., J Clin Invest. 1984 Oct;74(4):1173-85) i multipla sklerozu (Olerup O, Fredrikson S, Olsson T, Kam-Hansen S. Lancet, 1987 Aug 8;2(8554):327).

[0007] Trenutno su u toku klinička ispitivanja na ljudima za humanizovana antitela protiv alfa podjedinice čoveka HLA-DR (hL243) (Goldenberg i dr., US Patent 8992917B2) Navedeni dokument prikazuje indukciju apoptoze u ćelijama limfoma pasa korišćenjem hL243.

[0008] HLA-DR antigen se proteolitičkom digestijom oslobađa sa ćelijske površine i može se otkriti u serumu i drugim telesnim tečnostima. Određivanje rastvorljivog oblika (s-HLA-DR) može biti važan dijagnostički marker za limfoproliferativne i autoimune bolesti, a blokiranje interakcije s-HLA-DR sa Tirc7 receptorima na površini CD4+ T ćelija može uticati na njihovu aktivaciju (Frischer J, Reindl M, Künz B, Berger T, Schmidt S, Milford E, Knosp E, Lassmann H, Utek N.Mult Scler.2014 Feb 13).

[0009] Sarmiento i Valli su opisali monoklonsko antitelo koje prepoznaje antigen T200 (LCA, CD45) koje se može koristiti u imunohistohemiji za otkrivanje ćelija limfoidnih tumora pasa (Sarmiento UM, Valli V. A canine Lymphocyte Surface Antigen detectable by a Monoclonal antibody (DT200). Can J Vet Res 1987,51, 110-116).

[0010] Steplewski i saradnici su opisali nekoliko monoklonskih antitela dobijenih protiv ćelija psećeg limfoma i prepoznajući neidentifikovane površinske antigene na limfoidnim ćelijama pasa. Ova antitela su u različitom stepenu reagovala sa normalnim limfoidnim ćelijama (Z. Steplewski, K. A. Jeglum, C. Rosales, N. Weintraub. Antigeni povezani sa psećim limfomom definisani mišjim monoklonskim antitelima. Cancer Immunol. Immunother. 1987, 24, 197-201; CA1340898 "Monoclonal Antibodies Against Lymphoma-associated Antigens, Hybrid Cell Lines Producing These Antibodies, and Use Therefore").

[0011] EP 0289053A "Monoclonal antibodies against lymphoma-asociated antygenes, hybrid cell line producing these antibodies and use, therefore" Z. Steplewskog i K.A. Jeglum obelodanjuje monoklonska antitela koja se vezuju za ćelije limfnih čvorova pasa, međutim nisu pokazani dokazi da su se takva antitela vezala za DLA-DR. Autori spekulišu samo na osnovu molekularne mase imunoprecipitiranih proteina da meta ovih Mabs može biti Ia ili DR molekul.

[0012] Još jedna objava Steplewskog i saradnika (Z. Steplewski, M. Obrocka, M., K. A. Jeglum, C. Rosales. Cytolytic Activity of Murine Anti-dog Lymphoma Monoclonal Antibodies with Canine Effector Cells and Complement. Cellular Immunol. 1988, 115,420-428) opisuje monoklonska antitela koja bi trebalo da pokazuju sposobnost aktiviranja komplementa u cilju liziranja tumorskih ćelija. Međutim, ova objava ne ukazuje jasno da antitela pokazuju ADCC aktivnost.

[0013] Cilj pronalaska je da obezbedi nove supstance pogodne za lečenje, prevenciju i dijagnozu leukemija i limfoma kod pasa.

[0014] Iznenađujuće, iznad opisani problem rešen je u predmetnom pronalasku.

[0015] Predmet pronalaska je antitelo koje se specifično vezuje za pseći DLA-DR i komunicira sa ćelijama psećeg limfoma i leukemije koje imaju:

A) teški lanac antitela koji sadrži CDR regione označene kao SEQ ID No.1-3, posebno koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označen kao SEQ ID No.7 i laki lanac antitela koji sadrže CDR regione označene kao SEQ ID No.9 -11, posebno koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID No.15

ili

B) teški lanac antitela koji sadrži CDR regione označene kao SEQ ID No.4-6, posebno koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označen kao SEQ ID No.8 i laki lanac antitela koji sadrže CDR regione označene kao SEQ ID No.12-14, posebno koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID No.16

[0016] Poželjno je da antitelo prema pronalasku predstavlja himerno mišje-pseće antitelo koje ima: teški lanac antitela koji sadrži konstantni region teškog lanca izveden iz psećeg imunoglobulina, naročito iz psećeg antitela, i laki lanac antitela koji sadrži konstantni region lakog lanca izveden iz psećeg imunoglobulina, posebno iz psećeg antitela.

[0017] Poželjno, antitelo prema pronalasku je antitelo proizvedeno hibridomom odabranim od ćelijskih linija deponovanih u DSM pod pristupnim brojevima DSM ACC3287 i DSM ACC3288.

[0018] Dalji predmet pronalaska je antitelo kako je iznad definisano za upotrebu u lečenju ili prevenciji leukemije, posebno pseće, ili limfoma, posebno pseće.

[0019] Dalji predmet pronalaska je antitelo kako je iznad definisano za upotrebu u lečenju ili prevenciji leukemije, posebno pseće, ili limfoma, posebno pseće.

[0020] Dalji predmet pronalaska je hibridom odabran između ćelijskih linija deponovanih u DSM pod pristupnim brojevima DSM ACC3287 i DSM ACC3288.

[0021] Obelodanjeni su varijabilni regioni lakog (Vk) i teškog (VH) lanca dva antitela nazvana B5 i E11, koji specifično komuniciraju sa antigenima na ćelijama limfoma pasa i leukemije. B5 antitelo sadrži CDR-ove Vk i VH lanaca čije su sekvence aminokiselina i njihove odgovarajuće kodirajuće nukleotidne sekvence prikazane na slici 1 kao B5Vk i B5VH, dok E11 antitelo sadrži CDR lanaca Vk i VH čije aminokiselinske sekvence i njihove odgovarajuće kodirajuće nukleotidne sekvence prikazane su na Sl.2 kao E11Vk i E11VH.

[0022] Antitela na B5 i E11 proizvode hibridomske ćelije deponovane u DSM pod pristupnim brojevima DSM ACC3287 (za B5 antitelo) i DSM ACC3288 (za E11 antitelo). Iznenađujuće, kao rezultat odabira klonova monoklonskih antitela usmerenih protiv pseće B-ćelijske leukemije, identifikovani su klonovi koji posebno prepoznaju ćelije psećih B-ćelija, T-ćelija i mešovite B/T leukemije i limfome koji izražavaju pseći MHC klase II antigeni (DLA-DR). Ova antitela stupaju u interakciju sa normalnim limfocitima T i B, ali je nivo ekspresije molekula prepoznatih na ovim ćelijama mnogo niži od nivoa ćelija leukemije i limfoma. Dobijena antitela se mogu koristiti u dijagnozi i lečenju psećih leukemija i limfoma, kao i kod drugih bolesti kod kojih je povećana ekspresija DLA-DR antigena.

[0023] Jedan aspekt pronalaska su dva mišja monoklonska antitela B5 i E11 i hibridomske ćelije koje luče ta antitela, kako je definisano u patentnim zahtevima. Oba antitela imaju izotip teškog lanca IgG2a i prepoznaju konformacione epitope na molekulu DLA-DR.

[0024] DNK i aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona svakog od antitela prikazane su na Slikama 1 i 2. Primer 1 obelodanjuje sekvencu varijabilnih regiona, a Primer 4 pokazuje antigensku specifičnost antitela za DLA-DR.

[0025] Antitela prema pronalasku mogu biti obeležena fluorescentnim bojama, biotinom, radionuklidima, paramagnetnim jedinjenjima ili enzimima i upotrebljena za imunološke testove. Primer 2 prikazuje bojanje antitelima konjugovanim sa biotinom, dok se druge vrste obeležavanja antitela mogu lako dobiti rutinskim postupcima iz stanja tehnike.

[0026] Obelodanjena antitela se mogu koristiti u ELISA testu imunoenzima, od kojih se jedno koristi za oblaganje ELISA ploča, a drugo je označeno biotinom ili peroksidazom kao sredstvo za detekciju. Primer 5 opisuje primer takvog ispitivanja. Sledeći aspekt su varijabilni regioni antitela, prepoznajući antigen, koji se mogu vezati za teške (Fc) i konstantne regione lakog lanca psećih imunoglobulina da bi se dobila himerna mišja-pseća antitela smanjene imunogenosti u svrhu terapije limfoma pasa. Primer 7 ilustruje metod konstruisanja mišjeg i psećeg himernog antitela na osnovu sekvenci varijabilnih regiona mišjeg E11 antitela (obelodanjenog na Sl.2) i konstantnih regiona psećih imunoglobulina. Slika 6 prikazuje analizu specifičnosti dobijenih himernih antitela primenom protočne citometrije.

[0027] Sledeći aspekt su fragmenti antitela (Fab) dobijeni enzimskom proteolizom koji se mogu dalje konjugovati sa citotoksičnim i/ili citostatičkim supstancama (npr. doksorubicin, betulin, metotreksat) i koji se koriste u terapiji (psećih/humanih) leukemija i limfoma ili autoimunih bolesti.

[0028] Monoklonska antitela B5 i E11 obelodanjena u patentnoj prijavi su jedina antitela koja se ne zasnivaju na unakrsnoj reaktivnosti između molekula DLA-DR i HLA-DR, već se proizvode imunizacijom miševa psećim antigenima, što garantuje optimalan afinitet prema ciljnom antigenu. Primer 2 pokazuje da je nivo fluorescencije dobijen nakon vezivanja iste količine B5 i E11 antitela za DLA-DR antigene prisutne na linijama dobijenim od pasa znatno je veći nego na humanim linijama koje eksprimiraju HLA-DR antigen, što ukazuje na optimalan afinitet za DLA-DR.

[0029] Izotip IgG2a teškog lanca oba antitela, zbog optimalnog vezivanja komponenata komplementa i Fc receptora na imunim ćelijama, omogućava citotoksične efekte zavisne od antitela. Takođe su dostupna jedina dostupna anti-DLA-DR mišja antitela sa izotipom IgG2a. Primer 6 ilustruje nivo citotoksičnosti u in vitro testu sa zečjim komplementom i ukazuje da oba antitela pokazuju aktivnost u ovom testu.

[0030] Dijagnostički potencijal kod limfoma pasa i leukemija B-ćelija i mešanih B/T-ćelija za kombinovanu upotrebu antitela na B5 i E11 prelazi 94% i znatno je veći nego kod ostalih dostupnih antitela. Primer 3 ukazuje da upotreba antitela na B5 i E11 omogućava specifičnu dijagnozu više od 94% B-ćelijskih ili mešovitih B/T neoplazme u limfnim čvorovima korišćenjem aspiracione biopsije fine igle (što je trenutno prihvaćeni standard dijagnostičke procedure). Pokazano je, međutim, da biopsije povećanih limfnih čvorova pasa koji ne boluju od limfoma ili leukemije tipa B ili pasa sa Lajmskom bolešću ne daju pozitivnu reakciju sa antitelima B5 i E11.

[0031] MA5 B5 i E11 prepoznaju rastvorljive oblike DLA-DR antigena u ELISA, što nije karakteristično za sva antitela koja reaguju sa molekulima HLA-DR povezanim sa ćelijskom membranom. Primer 5 potvrđuje potencijal antitela B5 i E11 da vezuju DLA-DR antigene prisutne u telesnim tečnostima ili lizatima tumorskih ćelija.

Primer 1. Generacija hibridoma i DNK sekvenciranje gena koji kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca izlučenih antitela, posebno u interakciji sa ćelijama limfoma psećih B-ćelija.

[0032] Standardni, uobičajeno opisani postupak imunizacije miševa i fuzije splenocita korišćen je za stvaranje hibridoma koji proizvode monoklonska antitela. Ukratko, 6 x 10<6>ćelija psećeg limfoma B-ćelija (CLB70) suspendovano je u 300 mikrolitara fiziološkog rastvora i emulgovano u 300 mikrolitara nepotpunog Frojdovog pomoćnog sredstva. Tako pripremljeni antigen davan je u tri intraperitonealne injekcije od 200 mikrolitara/injekcija CD-1 miševima u intervalima od dve nedelje. Četiri dana nakon poslednje injekcije, splenociti imunizovanih miševa su fuzionisani u prisustvu polietilen glikola (PEG 1500) sa linijom mijeloma SP2.0 i kultivisani u prisustvu medija za selekciju koji sadrži hipoksantin, aminopterin i timidin na 37°C u atmosferi koji sadrže 5% CO2. Supernatanti iz kulture hibridoma (500 klonova) pregledani su na reaktivnost sa ćelijama CLB70 primenom protočne citometrije.

[0033] U skupu analiziranih hibridoma neočekivano su identifikovane dve linije koje su proizvele monoklonska antitela sa vrlo velikim afinitetom prema limfomima B-ćelija pasa (CLB70). Ova antitela su nazvana B5 i E11, a hibridomi koji ih proizvode - IITD PAN B5 i IITD PAN E11. Ovi hibridomi su deponovani u skladu sa Budimpeštanskim ugovorom u DSMZ (German kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura) pod sledećim pristupnim brojevima: DSM ACC3287 (linija IITD PAN B5) i DSM ACC3288 (linija IITD PAN E11).

[0034] mRNK su izolovane iz izabranih hibridoma koji proizvode antitela od interesa, a koja su, nakon transkripcije u cDNK primenom standardnih metoda molekularne biologije, pojačana oligonukleotidnim prajmerima sekvenci komplementarnih regionima:

Vk(5'-CCAGTTCCGAGCTCGTGCTCACCCAGTATACA)

i VH(5'-AGGTCCAGCTGCTCGAGTCTGG) i

CH5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC

i Ck5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG

mišjeg imunoglobulina. Dobijeni fragmenti cDNK su klonirani i sekvencirani primenom Sanger postupka. Slike 1 i 2 pokazuju DNK sekvence koje kodiraju teški lanac VH i laki lanac Vk varijabilnog regiona imunoglobulina B5 i E11. Kabat nomenklatura je korišćena za pozicioniranje aminokiselina koje odgovaraju varijabilnim regionima imunoglobulina.

Hipervarijabilni regioni u aminokiselinskoj sekvenci dati su podebljanim slovima, a CDR-1, -2, -3 su opisani u skladu s tim.

Primer 2. Analiza reaktivnosti antitela na B5 i E11 sa površinskim antigenima prisutnim na odabranim psećim i humanim ćelijskim linijama protočnom citofluorimetrijom.

[0035] Biotinilovana antitela B5 i E11 ili biotinilovana mišja antitela anti-DNP kontrole u količini od 1,5 mikrograma na 100 mikrolitara puferskog fiziološkog rastvora (PBS) dopunjenog sa 2% fetalnog goveđeg seruma (FBS) inkubirani su suspenzijama 10<5>ćelija naznačenih na Sl.3 led 30 minuta. Posle ispiranja nevezanih antitela sa PBS 2% FBS, ćelije su inkubirane u 100 mikrolitara po uzorku sa fluorescentnim konjugatom streptavidina sa fikoeritrinom (Streptavidin PE, eBioscience) razblaženom 1:1000. Citofluorimetrija je izvedena pomoću uređaja BD Calibur. Rezultati su prikazani kao histogrami (siva ispuna) koji se odnose na fluorescenciju ćelija obojenih kontrolnim antitelom (bez ispune). Ove analize su pokazale da su antigeni prepoznati od antitela B5 i E11 prisutni na površini psećih (CLBL1 i CLB70) i humanih (Raji) linija B-ćelijskih limfoma, koji su, dokumentovano u drugim publikacijama, izrazili haplotip MHC II DRB antigeni; međutim, antigeni su odsutni na psećim (GL-1) i humanim (Jurkat) T-ćelijskim linijama i psećoj liniji mastocitoma (NL-1). Linija psećih GL-1 sa B i T limfocitnim markerima, ali bez MHC antigena klase II, loše komunicira sa B5 antitelom i uopšte ne komunicira sa E11.

Primer 3. Analiza reaktivnosti antitela na B5 i E11 sa uzorcima krvi i biopsijama limfnih čvorova pasa.

[0036] Dobijene suspenzije mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC) (Tabela 1) ili iz biopsija limfnih čvorova (Tabela 2) pasa sa dijagnostikovanim limfomima ili uvećanim kao rezultat potvrđene infekcije Borrelia burgdorferi obojene su kao u Primeru 2 i podvrgnute FACS citofluorimetrija. Procenat PBMC sa reaktivnošću B5 i E11 mAb bio je najveći za slučajeve limfoma B-ćelija i bio je tri od tri analizirana za B5 mAb, odnosno dva od tri za E1 mAb (Tabela 1). Međutim, nije prijavljena reaktivnost nijednog antitela za uzorke zdravih pasa, pasa zaraženih Borrelia burgdorferi ili dijagnostikovanih T-ćelijskim limfomima.

Procenat ćelija limfnih čvorova sa specifičnom fluorescentnošću, iznad fluorescencije izotipa (> 15% pozitivnih ćelija), sumiran je u Tabeli 2, posebno za svakog psa. Za 13 pacijenata sa potvrđenim limfomima B-ćelija, 11 (84,6%) i 12 (92,3%) pokazali su reaktivnost sa antitelima na B5, odnosno E11. Među psima sa limfomima T-ćelija, ove vrednosti su bile 1 u 5 sa B5 mAb (20%) i 0 u 5 sa E11 mAb. Za 5 analiziranih limfoma mešovitog fenotipa B/T-ćelija, 5 (100%) je bilo pozitivno na B5 mAb i 4 (80%) na E11 mAb. Tabela 3 procenjuje nivo ekspresije antigena prepoznatih od B5 i E11 mAb. Pokazano je da su najveći srednji intenzitet fluorescencije (MFI) od 539 i 294 pokazali mešani limfomi B/T-ćelija i B-ćelija obojeni antitelom B5, respektivno. Za antitela na E11, ove vrednosti su bile 308 i 162. MFI za limfome T-ćelija bio je 23, odnosno 15 za antitela na B5 i E11. Vrednosti MFI za PBMC kod zdravih pasa ili pacijenata sa Lajmskom bolešću nisu prelazile 10,5.

Primer 4. Identifikacija antigena prepoznatih od B5 i E11 antitela.

[0037] Na osnovu sekvenciranja imunoprecipitiranih proteina iz CLBL1 linijskih lizata pomoću masene spektrometrije, antigeni dimeri klase II histokompatibilnosti, DLA-DR, privremeno su unapred izabrani kao specifično vezani za B5 i E11 antitela. Da bi se potvrdila ova identifikacija, humana linija fetalnog karcinoma (HEK293) transfektovana je genskim konstruktima koji kodiraju pseće DLA-DRα i DLA-DRβ histokompatibilne lance histokompatibilnosti u pcDNK3 ekspresijskom vektoru ili kontrolišu prazni vektor ekspresije. Ukratko, 3 µg prečišćene plazmidne DNK inkubirano je sa Metafecten Pro reagensom (Biontex) prema protokolu proizvođača, a zatim je smeša DNK/Metafecten Pro uvedena u 2 x 10<5>ćelija HEK293 kultivisanih na ploči sa 12 udubljenja u 1 ml OptiMEM medija (Life Technologies). 24 sata nakon transfekcije, ćelije su analizirane FACS citofluorimetrijom koristeći B5 i E11 antitela kako je opisano u Primeru 2. Slika 4a prikazuje primernu, reprezentativnu FACS analizu ćelija nakon transfekcije. Ćelije transfektovane pojedinačnim kontrolnim konstruktima (pcDNK3) ili kodirajuće bilo DLA-DRα ili DLA-DRβ lance nisu obojile fluorescentnim konjugatima antitela B5 i E11, dok je za oba antitela demonstrirano bojenje u slučaju ko-transfekcije ćelija HEK293 konstruktima kodiranje za DLA-DRα i DLA-DRβ lance.

[0038] Koristeći tehniku vestern blota na proteinskim lizatima iz ćelija transfektovanih gore opisanim genskim konstrukcijama, pokazano je da antitela B5 i E11 prepoznaju DLA-DRαβ dimer sa molekularnom masom od 55 kD, ali ne prepoznaju pojedinačne DLA-DRα ili DLA -DRβ lanci (Slika 4b). Dalje, prikazana je reaktivnost oba antitela u Vestern blotu sa lizatima iz linija B-ćelijskih limfoma (CLBL1 i CLB70), ali ne i sa lizatima iz B-ćelijske linije (GL-1) kojima nedostaju DLA-DR antigeni, kao ni sa lizatima iz PBMC mononuklearnih ćelija periferne krvi, Sl.4b. Štaviše, utvrđeno je da su epitopi prepoznati od antitela B5 i E11 konformacioni, jer je tretman proteinskih lizata sa 6 M rastvorom uree ili njihovo ključanje na temperaturama iznad 70°C ukidao interakciju antitela i antigena.

1

[0039] Primer 5. DLA-DR i s-DLA-DR ELISA na ćelijskim lizatima i telesnim tečnostima ELISA ploče (Maxisorp, Nunc) presvučene su rastvorom E11 antitela na 2 µg/ml PBS na 4°C tokom 12 sati. Nakon blokiranja ploče sa 1% rastvorom kazeina u TBS puferu (50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 150 mM NaCl) sa 0,05% deterdženta Tween-20 tokom 1 sata na 37°C, ploče su inkubirane sa rastvorima za ispitivanje (ćelija lizata, krvnog seruma) tokom 1 sata na 37°C, zatim isprani 3 puta sa TBS+0,05% Tween-20 i inkubirani sa biotiniliranim B5 antitelom (1,5 µg/ml) tokom 1 sata na 37°C. Posle tri puta pranja, kao što je gore opisano, ploče su inkubirane sa konjugatom streptavidin peroksidaze hrena (1:1000, eBioscience) tokom 1 sata na 37°C, nakon čega je usledila obojena reakcija dodavanjem TMB supstrata. Tabela 4 pokazuje da lizati iz ćelija koje izražavaju DLA-DR antigene histokompatibilnosti pokazuju približno 40 puta veću specifičnu apsorbanciju ELISA u odnosu na kontrolne ćelije, a da serumi krvi pasa sa limfomom pokazuju u proseku dvostruko veću specifičnu apsorbanciju u odnosu na kontrolu. Slika 5 prikazuje rezultate ELISA testa sa lizatima iz biopsija limfnih čvorova kod zdravih pasa i pacijenata sa B-ćelijskim, T-ćelijskim i B/T limfomima. Više od 85% lizata obolelih pasa daje pozitivan rezultat.

Primer 6. Analiza citotoksičnosti koja zavisi od komplementa za antitela B5 i E11 protiv psećeg limfoma CLBL1.

[0040] Pseće CLBL-1 ćelije limfoma (2 x 10<5>) su inkubirane sa B5 ili E11 antitelima u koncentraciji od 1 µg/100 µl tokom 1 sata na ledu u RPMI medijumu bez seruma. Posle centrifugiranja ćelija (300 x g tokom 5 minuta) i ispiranja antitelima (5 ml RPMI medijuma), ćelije su suspendovane u 1 ml RPMI medijuma dopunjenog sa 50 µl netoksičnog zečjeg komplementa (Sigma). Ćelije sa komplementom su inkubirane 40 minuta u vodenom kupatilu od 37°C uz periodično mešanje uzorka na svakih 10 minuta. Posle inkubacije, ćelije su centrifugirane (300 x g tokom 5 minuta), isprane sa PBS+2% FBS i vitalnost je ispitana inkubacijom sa propidijum jodidom (50 ng/ml) u FACS citofluorimetičkom testu. Mrtve i žive ćelije su takođe prebrojane u Burkerovoj komori korišćenjem bojenja tripan plavom bojom. Tabela 5 pokazuje da antitela B5 i E11, ali ne i mišje kontrolno antitelo istog izotipa kao B5 i E11, pokazuju citotoksični efekat zavisan od komplementa.

Primer 7. Konstruktivni postupak i analiza specifičnosti mišjeg i psećeg himernog antitela (cEll) na osnovu sekvenci koje koriste promenljive regione mišjeg E11 antitela.

[0041] Molekuli mRNK koji kodiraju promenljive regione teškog i lakog lanca izolovani su iz E11 hibridoma korišćenjem Trizol reagensa (Thermofisher Scientific). Brza reakcija transkripcije mRNK u cDNK izvedena je upotrebom enzima MMLV reverzne transkriptaze korišćenjem oligonukleotidnih prajmera komplementarnih 3' delovima teškog lanca VH5'-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC ili lakog lanca VL5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG varijabilni regioni mišjih imunoglobulina. Dobijeni PCR proizvodi su klonirani TA postupkom u pGEM T-laki vektor (Promega) i sekvencirani.

[0042] Fragmenti molekula mRNK koji kodiraju konstantne regione psećih imunoglobulina dobijeni su izolacijom mRNK iz leukocita periferne krvi pasa pomoću Trizol reagensa (Thermofisher Scientific), transkripcijom u cDNK i amplifikacijom pomoću PCR koristeći sledeće oligonukleotidne prajmere:

Konstantni region teškog lanca psećeg Ig (cIgH)

Konstantni region lakog lanca psećeg Ig (cIgL)

[0043] Korišćenjem ispod opisanog PCR, pojačani su regioni cDNK miši i pasa koji kodiraju varijabilne i konstantne lance imunoglobulina. Amplikoni miševa i pasa sadržavali su komplementarne regione koji su omogućavali proizvodnju himernih molekula u narednim ciklusima amplifikacije koristeći sledeće oligonukleotidne prajmere:

Varijabilni region mišjeg Ig (mIgH) teškog lanca

Laki lanac varijabilnog regiona mišjeg Ig (mIgL)

[0044] PCR reakcija primenom visoko verne KapaTaq HiFi polimeraze (Kapa Biosystems) izvedena je pod sledećim temperaturnim uslovima:

[0045] Amplifikovani fragmenti DNK klonirani su u pVitro neo vektor (Invivogen) korišćenjem BspEI i BamHI restrikcionih mesta za teški lanac i BglII i NheI za laki lanac i iskorišćavanjem prisustva pogodnih restrikcionih mesta u amplifikovanim fragmentima cDNK za imunoglobuline mišjeg i psećeg.

[0046] Aminokiselinske sekvence oba lanca rezultujućeg himernog cE11 antitela (tj. kiniziranog E11 antitela) i nukleotidne sekvence koje ih kodiraju prikazani su na Sl.6.

Štaviše, spisak sekvenci pokazuje konstantni region psećeg imunoglobulina teškog lanca i konstantni region lakog lanca psećeg imunoglobulina, koji su korišćeni za dobijanje himernog cE11 antitela.

[0047] Stvoreni konstrukti su transfektovani u ćelije CHO linije lipofekcijom Lipofektamina 2000 (Life Technologies). Posle 48 sati, supernatanti iz kultura pregledani su na antitela u interakciji sa linijama limfoma pasa (Sl.7).

1

1

1

1

1

1

2

2

2

�

2

2

�

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje se specifično vezuje za pseći DLA-DR antigen i komunicira sa ćelijama limfoma i leukemije pasa koje imaju:

A) teški lanac antitela koji sadrži CDR regione označene kao SEQ ID No.1-3, posebno koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID No.7 i laki lanac antitela koji sadrže CDR regione označene kao SEQ ID No.9-11, posebno koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID No.15 ili

B) teški lanac antitela koji sadrži CDR regione označene kao SEQ ID No.4-6, posebno koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID No.8 i laki lanac antitela koji sadrži CDR regione označene kao SEQ ID No.12-14, posebno koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu označenu kao SEQ ID No.16

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno himernim mišjim-psećim antitelom koje ima: teški lanac antitela koji sadrži konstantni region teškog lanca izveden iz psećeg imunoglobulina, naročito iz psećeg antitela, i laki lanac antitela koji sadrži konstantni region lakog lanca izveden iz psećeg imunoglobulina, posebno iz psećeg antitela.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da je proizvedeno iz hibridoma odabranim iz ćelijskih linija deponovanih u DSM pod pristupnim brojevima DSM ACC3287 i DSM ACC3288.

4. Antitelo prema patentnim zahtevima 1-3 za upotrebu u lečenju ili prevenciji leukemije, posebno pseće, ili limfoma, naročito psećeg.

5. Antitelo prema patentnim zahtevima 1-3 za upotrebu u dijagnozi leukemije, naročito pseće, ili limfoma, naročito psećeg.

6. Hibridoma izabrana iz ćelijskih linija deponovanih u DSM pod pristupnim brojevima DSM ACC3287 i DSM ACC3288.

2