CN116234828A - 抗可变muc1*抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了用于癌症的诊断、治疗或预防的抗体或其片段，其中所述抗体特异性结合PSMGFR肽(SEQ ID NO:2)或所述肽的片段。
Description
发明背景
1.技术领域
本申请涉及人、人源化和非人抗MUC1*抗体及其制备和使用方法。本申请还涉及使用以切割酶转染或转导的免疫细胞用于癌症的治疗。本发明还涉及使用以CAR和另一蛋白质转染或转导的免疫细胞用于癌症的治疗。
2.背景技术
我们先前发现，MUC1(SEQ ID NO:1)跨膜蛋白的切割形式是一种生长因子受体，其驱动所有人类癌症中超过75％的癌症的生长。MUC1的切割形式，我们称之为MUC1*(发音为muk 1star)，是一种强大的生长因子受体。切割并释放MUC1的细胞外结构域的大部分暴露用于激活配体二聚NME1、NME6、NME7、NME7AB、NME7-X1或NME8的结合位点。它是癌症药物的理想靶标，因为它在所有癌症中超过75％的癌症上异常表达并且可能在甚至更高百分比的转移性癌症上过表达(Mahanta等人(2008)A Minimal Fragment of MUC1 Mediates Growthof Cancer Cells.PLoS ONE 3(4):e2054.doi:10.1371/journal.pone.0002054；Fessler等人(2009),“MUC1*is a determinant of trastuzumab(Herceptin)resistance inbreast cancer cells”,Breast Cancer Res Treat.118(1):113-124)。在MUC1切割之后，其细胞外结构域的大部分从细胞表面脱落。剩余的部分具有截短的细胞外结构域，所述截短的细胞外结构域包含称为PSMGFR(SEQ ID NO:2)的初级生长因子受体序列的大部分或全部。
抗体越来越多地被用于治疗人类疾病。在历史上将非人物种中生成的抗体用作人的治疗剂，诸如马抗体。最近，对抗体进行工程化或选择，使得它们大部分或全部包含人序列，以避免对外来抗体的普遍性排斥。将非人抗体的识别片段工程化为人抗体的过程通常称为‘人源化’。用于替换人抗体序列的非人序列的量决定了将它们称为嵌合的、人源化的还是完全人的。
存在能够生成人源化或完全人抗体的替代技术。这些策略涉及筛选人抗体或抗体片段的文库以及鉴别结合靶抗原的那些，而不是用抗原使动物免疫。另一种方法是将抗体的可变区工程化为抗体样分子。另一种方法涉及使人源化动物免疫。本发明还旨在涵盖这些与本发明人已经确定结合MUC1*的细胞外结构域的抗体的识别片段一起使用的方法。
除了用抗体治疗患者之外，最近癌症免疫疗法还被证明在治疗血液癌症中有效。一种称为CAR T(嵌合抗原受体T细胞)疗法的癌症免疫疗法将T细胞工程化，使得其表达具有识别肿瘤抗原的细胞外结构域、跨膜结构域以及包含T细胞信号传导和共刺激组分的细胞质尾的嵌合受体(Dai H,Wang Y,Lu X,Han W.(2016)Chimeric Antigen ReceptorsModified T cells for Cancer Therapy.J Natl Cancer Inst.108(7):djv439)。这种受体由识别肿瘤抗原的单链抗体片段(scFv)构成，所述单链抗体片段连接至T细胞跨膜结构域、信号传导结构域和共刺激结构域。在受体与癌症相关抗原结合之后，传递了信号，导致T细胞激活、增殖以及癌细胞的靶向杀伤。在实践过程中，将T细胞从患者或供体中分离出来，并用CAR转导，扩增，然后注射回患者体内。如果来自供体，则可能对免疫细胞进行突变或工程化，使得它们不在接受者体内诱导移植物抗宿主病。当CAR T细胞结合癌细胞上的抗原时，CAR T细胞攻击癌细胞，然后扩增所述T细胞群体。
迄今为止，CAR T疗法在治疗血液癌症方面已经非常成功，但尚未显示出针对人的实体瘤的功效。因为大多数血液癌症是B细胞恶性肿瘤，所以CAR T细胞刚好可以消除患者的所有B细胞，而不对患者造成严重伤害。在实体瘤中没有B细胞等效物。大多数肿瘤相关抗原也在正常组织上表达；它们只是在癌性组织中的表达水平更高。因此，挑战是开发一种识别与正常组织相比在肿瘤环境中有些不同的肿瘤相关抗原上的表位的抗体。为了进一步最小化正常组织的脱肿瘤(off-tumor)/在靶(on-target)杀伤的风险，抗体应识别癌性组织并且与癌性组织的结合应是正常组织的至少两倍。如果癌症选择性不那么强的抗体在肿瘤部位处被诱导性地表达，则它们可以被治疗性地使用。
另一种并入癌症选择性抗体的癌症疗法为双特异性T细胞衔接器(Engager)，也称为BiTE。BiTE方法试图消除脱肿瘤/在靶效应的CAR T相关风险。与CAR T不同，BiTE是双特异性抗体，其与常规基于抗体的疗法相比，不会带来任何更大的风险。然而，与结合并阻断癌抗原的典型抗癌抗体不同，BiTE被设计成结合肿瘤细胞上的抗原，并同时结合免疫细胞(诸如T细胞)上的抗原。通过这种方式，BiTE将T细胞募集到肿瘤。BiTE是工程化蛋白质，其同时结合癌症相关抗原和T细胞表面蛋白(诸如CD3-ε)。BiTE是通过将结合T细胞抗原的抗体(像抗CD3-ε)的scFv遗传上连接至结合癌症抗原的治疗性单克隆抗体的scFv所制成的抗体(Patrick A.Baeuerle和Carsten Reinhardt(2009)Bispecific T cell engagingantibodies for cancer therapy.Cancer Res.69(12):4941-4944)。BiTE技术的缺点是，与CAR T细胞不同，它们不在患者体内扩增，因此持久性有限。
又一并入癌症选择性抗体的癌症疗法是抗体药物缀合物(也称为ADC)技术。在这种情况下，毒素或毒素的前体连接至癌症选择性抗体。与使用CD8阳性T细胞的自然杀伤来杀伤癌细胞的CAR T细胞不同，ADC为肿瘤带来毒性有效载荷(payload)。ADC的缺点包括可能将毒性有效载荷递送给正常细胞，并且大多数ADC需要与细胞表面分子结合，然后细胞表面分子在结合后内化，其中导致细胞死亡需要大约10,000个表面分子。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种非人、人或人源化抗MUC1*抗体、或抗体片段、或抗体样蛋白，其结合缺乏串联重复结构域的MUC1同种型或切割产物的细胞外结构域上的区域。非人、人或人源化抗MUC1*抗体或抗体片段或抗体样蛋白可以特异性结合
(i)MUC1的PSMGFR区；
(ii)PSMGFR肽；
(iii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)(SEQ ID NO:3)的肽
(iv)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)(SEQ ID NO:4)的肽
(v)具有氨基酸序列
NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)(SEQ ID NO:5)的肽
(vi)具有氨基酸序列
ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)(SEQ ID NO:6)的肽
(vii)具有氨基酸序列
SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)(SEQ ID NO:7)的肽
(viii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)(SEQ ID NO:8)的肽
(ix)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)(SEQ ID NO:9)的肽
(x)具有氨基酸序列
FPFSAQSGA(SEQ ID NO:10)的肽。
非人、人或人源化抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM。人或人源化抗体片段或抗体样蛋白可以是scFv或scFv-Fc。
如上文中的鼠、骆驼科动物、人或人源化抗体、抗体片段或抗体样蛋白可以包含衍生自小鼠单克隆MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11抗体的重链可变区和轻链可变区，并且与小鼠单克隆MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11抗体具有至少80％、90％、或95％、或98％序列同一性。CDR1和CDR2的重链可变区可以与本申请中的序列表中示出的特别指出的抗体重链可变区序列具有至少90％、或95％、或98％序列同一性，并且CDR1和CDR2的轻链可变区可以与本申请中的序列表部分中示出的特别指出的抗体重链可变区序列具有至少90％、或95％、或98％序列同一性。CDR3的重链可变区可以与本申请中的序列表中示出的特别指出的抗体重链可变区序列具有至少80％、或85％、或90％序列同一性，并且CDR3的轻链可变区可以与本申请中的序列表部分中示出的特别指出的抗体重链可变区序列具有至少80％、或85％、或90％序列同一性。
根据上文的鼠、骆驼科动物、人或人源化抗体、抗体片段或抗体样蛋白可以在重链可变区和轻链可变区中包含互补决定区(CDR)，所述互补决定区与本申请中的序列表部分中示出的特别指出的抗体重链CDR1、CDR2或CDR3区和轻链CDR1、CDR2或CDR3区序列具有至少90％、或95％、或98％序列同一性。
在另一方面，本发明涉及一种抗MUC1*细胞外结构域抗体或抗N-10抗体，其可以是上文所述的任一抗体，包含由与人源化κ轻链或人源化λ轻链配对的人源化IgG2重链或人源化IgG1重链表示的序列。人源化IgG2重链可以是SEQ ID NO:55，人源化IgG1重链可以是SEQID NO:58，人源化κ轻链可以是SEQ ID NO:110，并且人源化λ轻链可以是SEQ ID NO:114，或者与其具有90％、95％或98％序列同一性的序列。
在另一方面，本发明涉及一种抗MUC1*细胞外结构域抗体或抗N-10抗体，其可以是上文所述的任一抗体，包含由与人κ轻链或人λ轻链配对的人IgG2重链或人IgG1重链表示的序列。人IgG2重链可以是SEQ ID NO:55，人IgG1重链可以是SEQ ID NO:58，人κ轻链可以是SEQ ID NO:110，并且人λ轻链可以是SEQ ID NO:114，或者与其具有90％、95％或98％序列同一性的序列。
在另一方面，本发明涉及一种抗MUC1*细胞外结构域抗体或抗N-10抗体，其包含由与人源化λ轻链和人源化κ轻链配对的人源化IgG1重链、人源化IgG2重链表示的人源化MNC2的序列。
在另一方面，本发明涉及一种抗MUC1*细胞外结构域抗体或抗N-10抗体，其包含由与人源化λ轻链或人源化κ轻链配对的人源化IgG1重链或人源化IgG2重链表示的人源化MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的序列。
在另一方面，本发明涉及一种“像”MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的抗体，因为它们与衍生自PSMGFR肽的肽子集结合的模式相同或非常相似，也不识别线性表位，竞争性地抑制NME1或NME7AB与MUC1*的结合，识别通过由MMP9切割所产生的MUC1跨膜切割产物或含有与MNE6、MNC2、MN18G12、MN20A10、MN25E6、MN28F9、MN5C6F3、MN3C2B1和MN1E4 CDR共有序列具有至少80％同源性的CDR序列。
在另一方面，本发明涉及一种抗体，其结合缺乏串联重复结构域的MUC1(其可以是切割产物)的细胞外结构域。在本发明的一个方面，抗体结合具有序列QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)的肽。在本发明的一个方面，抗体结合具有序列ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)的肽。在本发明的一个方面，抗体结合具有序列SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)的肽。在本发明的一个方面，抗体结合具有序列FPFSAQSGA(N-36)的肽。此类抗体的实例包括但不限于单克隆抗体MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11。这些抗体的重链和轻链互补决定区序列在本申请中的序列表部分中示出。
在本发明的一个方面，将这些抗体中的一种或多种施用于被诊断为患有癌症或处于发展癌症的风险中的患者。抗体可以是人或人源化的。抗体可以是鼠或骆驼科动物的。抗体可以是二价或单价的。抗体可以是抗体中的一种的片段，包括单链片段scFv。抗体或抗体片段可以被直接施用于患者或并入多特异性抗体样分子、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接器BiTE或抗体药物缀合物ADC中。抗体或抗体片段可以并入T细胞受体TCR中。抗体或抗体片段的序列可以并入嵌合抗原受体“CAR”或其它类似实体中，然后离体引入免疫细胞，然后施用于被诊断为患有癌症或处于发展癌症的风险中的患者。免疫细胞(其可以是T细胞或自然杀伤细胞)可以来源于供体或患者。在一个方面，免疫细胞衍生自已被引导以在体外分化成所述免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，免疫细胞衍生自已被引导以在体外分化成所述免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，含有抗体序列的CAR在干细胞中表达，然后干细胞可以分化成免疫细胞。在一种情况下，免疫细胞是T细胞。在另一情况下，免疫细胞是NK细胞。在一个方面，抗体或含有抗体序列的CAR可以从诱导型启动子表达。在一种情况下，抗体或CAR在T细胞或其它免疫细胞激活之后表达。在一种情况下，本发明的抗体或CAR从NFAT应答元件表达。在另一情况下，对靶肿瘤细胞的CAR识别激活免疫细胞，导致细胞因子(诸如IL-12或IL-18)的NFAT诱导型表达或检查点抑制剂(诸如PD1抑制剂或PDL-1抑制剂)的表达。在又一方面，对靶肿瘤细胞的CAR识别激活免疫细胞，导致含有第二抗体的序列的第二CAR的NFAT诱导型表达。
在另一方面，本发明涉及根据上文的结合N-10肽的鼠、骆驼科动物、人、人源化抗MUC1*抗体、或抗体片段、或抗体样蛋白，其抑制NME蛋白与MUC1*的结合。NME可以是NME1、NME6、NME7AB、NME7-X1、NME7或NME8。
在又一方面，本发明涉及一种单链可变片段(scFv)，其包含通过接头连接的重链和轻链可变区，还包含结合MUC1*细胞外结构域的抗体的CDR。CDR可以衍生自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11。scFv可以是具有SEQ ID NO:233、235或237(MNE6)；SEQ ID NO:238-243、654-655或5017-5020(MNC2)；SEQID NO:1574-1581或5001-5012(20A10)；SEQ ID NO:1573或1813(3C2B1)；SEQ ID NO:1385或1815(5C6F3)；SEQ ID NO:1599或1601(25E6)的那些。
在再一方面，本发明涉及一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含结合缺乏串联重复序列的MUC1的细胞外结构域的scFv或人源化可变区、接头分子、跨膜结构域和细胞质结构域。单链抗体片段可以结合
(i)MUC1的PSMGFR区；
(ii)PSMGFR肽；
(iii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)(SEQ ID NO:3)的肽
(iv)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)(SEQ ID NO:4)的肽
(v)具有氨基酸序列
NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)(SEQ ID NO:5)的肽
(vi)具有氨基酸序列
ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)(SEQ ID NO:6)的肽
(vii)具有氨基酸序列
SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)(SEQ ID NO:7)的肽
(viii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)(SEQ ID NO:8)的肽
(ix)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)(SEQ ID NO:9)的肽
(x)具有氨基酸序列
FPFSAQSGA(N-36)(SEQ ID NO:10)的肽。
在如上文所述的CAR中，可以在CAR的细胞外结构域中使用上文所示和所述的任一可变区的部分或其组合。CAR还包含跨膜区和细胞质尾，所述细胞质尾包含发出免疫系统激活信号的序列基序。细胞外结构域可以包含MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11的鼠、骆驼科动物、人、非人或人源化单链抗体片段。可以制备单链抗体片段的额外抗体包括但不限于像MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11的单克隆抗体，因为它们与衍生自PSMGFR肽的肽子集结合的模式相同或非常相似，可能不识别线性表位，或者竞争性地抑制NME1或NME7AB与MUC1*的结合，或者识别通过由MMP9切割产生的MUC1跨膜切割产物或含有与MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11 CDR共有序列具有至少80％同源性的CDR序列。
在如上文所述的CAR中，细胞外结构域可以包括以下的鼠、骆驼科动物、人、非人或人源化单链抗体片段：MNE6 scFv，如SEQ ID NO:233、235或237所示；MNC2 scFv(SEQ IDNO:239、241、243、655或5017-5020)；20A10 scFv，如SEQ ID NO:1575、1577、1579、1581或5001-5012所示；3C2B1 scFv，如SEQ ID NO:1573或1813所示；5C6F3 scFv，如SEQ ID NO:1385或1815所示；或25E6 scFv，如SEQ ID NO:1599或1601所示。
在将抗体人源化的过程中，必须对序列进行注释以鉴别不同的功能区，诸如互补决定区(CDR)、框架区和恒定区。各种计算机程序可供使用，所述计算机程序将某些序列分配给CDR、框架区和恒定区。根据所使用的程序，一个区结束并且下一个区开始的确切位置可能有几个氨基酸的差异。通常，人源化单链构建体scFv含有通过中间框架区支持的重链和轻链CDR，其中重链和轻链通过柔性接头连接。根据所使用的注释程序，分配给框架区IV的序列可能延伸到恒定区中。在一些情况下，框架区IV的延伸可以为scFv提供更高的稳定性。在这里，我们提供本发明的人源化scFv的序列，其中轻链框架区IV的长度可以变化。例如，在一些情况下，框架区IV的C末端以氨基酸R、T结束。在其它情况下，它仅以R结束。还在其它情况下，省略了末端R和T。在此处描述的CAR中，细胞外结构域可以包括具有长度可变的框架区IV的鼠、骆驼科动物、人、非人或人源化单链抗体片段，如MNE6 scFv(SEQ ID NO:5014或5016)、MNC2 scFv(SEQ ID NO:5018或5020)、或20A10 scFv(SEQ ID NO:5002、5004、5006、5008、5010或5012)、或25E6 scFv(SEQ ID NO:5030或5032)所示。
在此处描述的任何CAR中，细胞质尾可以包含信号传导序列基序和共刺激结构域中的一个或多个，包括但不限于CD3-ζ、CD3-ζ-1XX CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5或CD7。此外，细胞内信号传导结构域的序列可以含有减弱信号的突变以改善持久性或改善对低抗原密度肿瘤细胞的杀伤。细胞质尾可以包含信号传导序列基序和共刺激序列基序CD3-ζ、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5或CD7中的一个或多个。CAR的跨膜和细胞外铰链区可能或可能不衍生自相邻共刺激结构域的序列。例如，包含4-1BB共刺激结构域的CAR可能具有衍生自CD8或CD28的跨膜和铰链区。在另一实例中，包含CD28共刺激结构域的CAR可能具有衍生自CD28的跨膜和铰链区。在上文所述的任何CAR中，细胞质尾可以包含减弱信号传导的缺失或突变。三种基于免疫受体酪氨酸的激活基序(也称为ITAM)中的一种或多种中的此类缺失或突变增加携带CAR的细胞的持久性并降低它们的分化，如通过CD62L+CD45RA-群体的增加所测量的。此类突变包括但不限于突变成抑制磷酸化和信号传导的酪氨酸(Salter等人,2018)。在另一方面，缺失了一个或两个ITAM，仅留下一个或两个ITAM(Feucht等人2019)。在另一方面，所包含的一个或多个ITAM的位置移动到靠近共刺激结构域的位置。针对CAR的持久性增加的合适的ITAM配置包括但不限于1XX、X2X、XX3、12X和23X，其中数字1、2或3是指ITAM1、ITAM2或ITAM3，并且X是指所述ITAM的缺失。在优选的实施方案中，ITAM1是CAR构建体中所包含的唯一功能性ITAM，也称为1XX。在上文所述的任何CAR中，CD3-ζ的ITAM可以缺失或突变以抑制或减弱信号传导。在上文所述的任何CAR中，细胞质尾的CD3可以包含ITAM(包括称为1XX的那些)中的或ITAM的缺失或突变(Feucht等人2019；SEQ ID NO:1796-1797)。在上文所述的任何CAR中，T细胞可以被工程化成过表达c-Jun，作为抑制T细胞耗竭的方法(Lynn等人2019)。上文所述的CAR构建体可以在T细胞、NK细胞、树突细胞或其它免疫细胞中表达，所述细胞可以是自体的或同种异体的。同种异体细胞可以来源于人干细胞。
在上文所述的任何CAR中，CAR可以包含单链抗体片段scFv，所述单链抗体片段scFv包含衍生自以下的序列：抗体MNE6，其包括但不限于SEQ ID NO:12-13和65-66、56-57、107-108、341-342、391-394；抗体MNC2，其包括但不限于SEQ ID NO:118-119和168-169、144-145和194-195、654-655、1788-1789；抗体20A10，其包括但不限于SEQ ID NO:988-989和1004-1005、1574-1581、5001-5012、1677、1687；抗体3C2B1，其包括但不限于SEQ ID NO:1820-1823、1572-1573、1812-1813；抗体5C6F3，其包括但不限于SEQ ID NO:1816-1819、1384-1385、1814-1815；抗体25E6，其包括但不限于SEQ ID NO:1020-1021、1036-1037、1598-1601，其中CAR铰链和跨膜序列可以衍生自CD8(SEQ ID NO:346和SEQ ID NO:364)或CD28(SEQ ID NO:350和SEQ ID NO:368)，还包含共刺激结构域，其可以是41BB(SEQ ID NO:659)或CD28(SEQ ID NO:378)，并且CD3-ζ信号传导结构域可以衍生自SEQ ID NO:661或可以包含突变，包括称为1XX的突变(SEQ ID NO:1796-1797)。
在上文所述的任何CAR中，序列可以是CAR MNE6 CD28/CD3z(SEQ ID NO:298)；CARMNE6 4-1BB/CD3z(SEQ ID NO:301)；CAR MNE6 OX40/CD3z(SEQ ID NO:617)；CARMNE6CD28/4-1BB/CD3z(SEQ ID NO:304)；CAR MNE6 CD28/OX40/CD3z(SEQ ID NO:619)；CARMNC2 CD3z(SEQ ID NO:607)；CAR MNC2CD8铰链/跨膜CD28/CD3z(SEQ ID NO:609)；CARMNC2 CD8铰链/跨膜4-1BB/CD3z(SEQ ID NO:611和SEQ ID NO:719)；CAR MNC2 CD8铰链/跨膜4-1BB/1XX(SEQ ID NO:1619和SEQ ID NO:1621)；CAR MNC2 CD8铰链/跨膜CD28/1XX(SEQID NO:1623和SEQ ID NO:1625)；CAR MNC2 CD28铰链/跨膜CD28/1XX(SEQ ID NO:5042和SEQ ID NO:5044)；CAR MNC2 OX40/CD3z(SEQ ID NO:613)；CAR MNC2 CD28/4-1BB/CD3z(SEQ ID NO:307)；CAR MNC2 CD28/OX40/CD3z(SEQ ID NO:615)；CAR 20A10 CD8铰链/跨膜4-1BB/CD3z(SEQ ID NO:1583和SEQ ID NO:1585)；CAR 20A10CD8铰链/跨膜CD28/CD3z(SEQID NO:1587和SEQ ID NO:1589)；CAR 20A10 CD8铰链/跨膜4-1BB/1XX(SEQ ID NO:1591和SEQ ID NO:1593)；CAR 20A10 CD8铰链/跨膜CD28/1XX(SEQ ID NO:1595和SEQ ID NO:1597)；CAR 20A10 CD28铰链/跨膜CD28/CD3z(SEQ ID NO:5022和SEQ ID NO:5024)；CAR20A10 CD28铰链/跨膜CD28/1XX(SEQ ID NO:5026和SEQ ID NO:5028)；或CAR MNC34-1BB/CD3z(SEQ ID NO:601)。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少两种具有被转染到同一细胞中的不同细胞外结构域单元的CAR，所述细胞可以是免疫细胞，所述免疫细胞可以来源于需要治疗癌症的患者。第二CAR的表达可以是诱导型的并且通过第一CAR对靶标的识别来驱动。编码第二CAR的核酸可以连接至诱导型启动子。第二CAR的表达可以通过当免疫细胞对靶肿瘤细胞产生免疫应答时特异性发生的事件来诱导。CAR中的一种或两种的抗体片段可以将细胞引导至MUC1*阳性肿瘤。第一CAR和第二CAR的抗体片段可以结合当MUC1被两种不同的切割酶切割时所产生的MUC1*。当第一CAR的抗体片段衔接或结合肿瘤上的MUC1或MUC1*时，可以诱导通过诱导型启动子的第二CAR的表达。实现它的一种方式是在NFAT蛋白被表达或易位到细胞核时或之后不久诱导第二CAR的表达。例如，将衍生自NFAT启动子区的序列置于第二CAR的基因上游。以这种方式，当结合NFAT蛋白的启动子的转录因子以足以结合NFAT蛋白并诱导NFAT蛋白转录的浓度存在时，它们还将结合被工程化在用于第二CAR转录的序列前面的相同启动子。NFAT蛋白可以是NFAT1(也称为NFATc2)、NFAT2(也称为NFATc或NFATc1)、NFAT3(也称为NFATc4)、NFAT4(也称为NFATc3)或NFAT5。在本发明的一个方面，NFAT是NFATc1、NFATc3或NFATc2。在本发明的一个方面，NFAT是NFAT2，也称为NFATc1。SEQID NO:646示出了NFAT2的上游转录调控区的核酸序列。第二CAR的识别单元可以是抗体片段或肽，其中识别单元可以结合NME7、PD-1、PDL-1或检查点抑制剂。
至少两个CAR可以具有一个不具有肿瘤抗原靶向识别单元的CAR和另一个具有肿瘤抗原靶向识别单元的CAR。在本发明的另一方面，细胞外结构域识别单元中的一个可以结合MUC1*细胞外结构域。在本发明的另一方面，细胞外结构域识别单元中的一个可以是抗体片段，并且另一个是肽，其可以缺乏跨膜和信号传导基序；肽可以是单链抗体片段或抗体。在本发明的另一方面，识别单元中的一个可以结合PD-1或PDL-1。在本发明的另一方面，一个细胞外结构域识别单元是选自以下的抗MUC1*抗体、抗体片段或scFv：MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11。另一个识别单元可以是CAR或者可以是抗NME7抗体。
在另一方面，本发明涉及一种细胞，其包含具有细胞外结构域的CAR，所述细胞外结构域结合缺乏串联重复序列的MUC1分子的细胞外结构域。在另一方面，本发明涉及一种细胞，其包含具有细胞外结构域的CAR，所述细胞外结构域结合MUC1*转染或转导的细胞。包含CAR的细胞可以是免疫系统细胞，优选T细胞、自然杀伤细胞(NK)、树突细胞或肥大细胞。
在另一方面，本发明涉及一种工程化的抗体样蛋白。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗对象的疾病的方法，所述方法包括向罹患所述疾病的人施用根据上述任一权利要求所述的抗体，其中所述对象异常表达MUC1。所述疾病可以是癌症，诸如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌或食道癌。
在另一方面，本发明涉及一种抗体、抗体片段或包含衍生自抗体的可变结构域片段的scFv，其结合缺乏串联重复结构域的MUC1同种型或切割产物的细胞外结构域。在优选的实施方案中，抗体或抗体片段结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，但不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)。可变结构域片段可以衍生自小鼠单克隆抗体MNE6(SEQ ID NO:13和66)、或人源化MNE6(SEQ ID NO:39和94)、或MNE6 scFv(SEQ ID NO:233、235和237)。或者，可变结构域片段可以衍生自小鼠单克隆抗体MNC2(SEQ ID NO:119和169)、或人源化MNC2(SEQ ID NO:145和195)、或MNC2 scFv(SEQ ID NO:239、241和243)。或者，可变结构域可以衍生自单克隆抗体MN18G12、MN20A10、MN25E6、MN28F9、MN5C6F3、MN3C2B1或MN1E4。这些抗体的重链和轻链互补决定区序列也在本文序列表中示出。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗被诊断为患有MUC1或MUC1*阳性癌症、怀疑患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的人的方法，所述方法涉及向所述人施用有效量的上文所述的抗体、抗体片段或scFv，其中物种可以是鼠、骆驼科动物、人或人源化的。
在另一方面，本发明涉及一种多肽，其包含至少两个不同的scFv序列，其中scFv序列中的一个是结合缺乏串联重复结构域的MUC1同种型或切割产物的细胞外结构域的序列。多肽可以结合
(i)MUC1的PSMGFR区；
(ii)PSMGFR肽；
(iii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)(SEQ ID NO:3)的肽
(iv)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)(SEQ ID NO:4)的肽
(v)具有氨基酸序列
NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)(SEQ ID NO:5)的肽
(vi)具有氨基酸序列
ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)(SEQ ID NO:6)的肽
(vii)具有氨基酸序列
SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)(SEQ ID NO:7)的肽
(viii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)(SEQ ID NO:8)的肽
(ix)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)(SEQ ID NO:9)的肽
(x)具有氨基酸序列
FPFSAQSGA(N-36)(SEQ ID NO:10)的肽。
在另一方面，本发明涉及一种检测异常表达MUC1*的细胞的存在的方法，所述方法包括使细胞或组织的样品与上文所述的抗体、抗体片段或scFv-Fc接触以及检测是否存在抗体、抗体片段或scFv-Fc与细胞的结合。细胞可以是癌细胞。
在另一方面，本发明涉及一种用于测试对象的癌症是否适合用包含本发明的抗体(抗体可以是鼠、骆驼科动物、人或人源化的)或其片段或抗体MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的可变区的一部分的组合物进行治疗的方法，所述方法包括以下步骤：在体外、离体或在体内使患者的身体标本与抗体接触，以及确定与正常组织或标本相比，患者表现出MUC1*的异常表达，以及得出患者的癌症将有益地响应于用包含抗体或其片段的剂进行的治疗的结论。这些诊断中使用的抗体可以与显像剂缀合。
在另一方面，本发明涉及一种治疗罹患疾病的对象的方法，所述方法包括将免疫细胞(其可以是来自对象或来自供体的T细胞或NK细胞)暴露于MUC1*肽，其中通过多轮成熟，T细胞或NK细胞发展出MUC1*特异性受体，产生适应性T细胞或NK细胞，以及将适应性细胞扩增并施用于被诊断为患有MUC1*阳性癌症、怀疑患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的供体患者。MUC1*肽选自：
(i)MUC1的PSMGFR区；
(ii)PSMGFR肽；
(iii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)的肽
(iv)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)的肽
(v)具有氨基酸序列
NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)的肽
(vi)具有氨基酸序列
ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)的肽
(vii)具有氨基酸序列
SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)的肽
(viii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)的肽
(ix)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)的肽
(x)具有氨基酸序列
FPFSAQSGA(N-36)的肽。
在本发明的一个方面，施用于患者以用于治疗或预防MUC1或MUC1*阳性癌症的抗体是针对其能够结合PSMGFR的N-10肽来选择的。抗体可以单独地、呈单价抗体、呈scFv来施用，或者可以将抗体片段并入到CAR、BiTE或ADC中。
在本发明的另一方面，施用于患者以用于治疗或预防MUC1或MUC1*阳性癌症的抗体是针对其能够结合QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)肽来选择的，其中结合需要FPFSAQSGA(N-36)序列的存在。抗体可以单独地、呈单价抗体、呈scFv来施用，或者可以将抗体片段并入到CAR、BiTE或ADC中。
在本发明的一个方面，施用于患者以用于治疗或预防MUC1或MUC1*阳性癌症的抗体是针对其不能识别MUC1或MUC1*的线性表位来选择的。抗体可以单独地、呈单价抗体、呈scFv来施用，或者可以将抗体片段并入到CAR、BiTE或ADC中。
在本发明的一个方面，施用于患者以用于治疗或预防MUC1或MUC1*阳性癌症的抗体是针对其能够识别已经被MMP9切割的MUC1跨膜切割产物来选择的。抗体可以单独、呈抗体、呈单价抗体、呈scFv、双特异性抗体、多特异性抗体来施用，或者可以将抗体片段并入到BiTE、ADC或可以在免疫细胞中表达的CAR中。
在本发明的一个方面，施用于患者以用于治疗或预防MUC1或MUC1*阳性癌症的抗体是针对其能够竞争性地抑制NME7AB或NME7-X1与缺乏串联重复序列的MUC1的细胞外结构域的结合来选择的。抗体可以单独、呈抗体、呈单价抗体、呈scFv、双特异性抗体、多特异性抗体来施用，或者可以将抗体片段并入到BiTE、ADC或可以在免疫细胞中表达的CAR中。
在另一方面，本发明涉及一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括向患者施用抗体、抗体片段、BiTE、ADC或在上文任何免疫细胞中表达的CAR与检查点抑制剂的组合。
在上文方法中，可以使用以下示出的任何抗体或其可变区：MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11。
在上文方法中，可以使用以下示出的任何可变区：
(i)抗MUC1*细胞外结构域抗体或抗N-10抗体，其包含由与人源化κ轻链或人源化λ轻链配对的人源化IgG2重链或人源化IgG1重链表示的人源化MN-E6的序列；
(ii)(i)的抗体，其中人源化IgG2重链是SEQ ID NO:53，人源化IgG1重链是SEQ IDNO:57，人源化κ轻链是SEQ ID NO:108，并且人源化λ轻链是SEQ ID NO:112，或者与其具有90％、95％或98％序列同一性的序列；
(iii)抗MUC1*细胞外结构域抗体或抗N-10抗体，其包含由与人源化λ轻链和人源化κ轻链配对的人源化IgG1重链、人源化IgG2重链表示的人源化MN-C2的序列；
(iv)(iii)的抗体，其中人源化IgG1重链MN-C2(SEQ ID NO:159)或IgG2重链(SEQID NO:164)与λ轻链(SEQ ID NO:219)或κ轻链(SEQ ID NO:213)配对，或与其具有90％、95％或98％序列同一性的序列；
在上文方法中，在CAR中，细胞外结构域可以包含MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的人源化单链抗体片段。细胞外结构域可以包含如SEQ ID NO:233、235或237所示的MN-E6 scFv、MN-C2 scFv(SEQ ID NO:239、241或243)的人源化单链抗体片段。在CAR中，细胞质尾可以包含信号传导序列基序和共刺激结构域中的一个或多个，包括但不限于CD3-ζ-1XX、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5或CD7和CD3-ζ或变体1XX、X2X、XX3、12X或23X。此外，细胞内信号传导结构域的序列可以含有减弱信号的突变以改善持久性或靶细胞杀伤。
上文方法可以包括将两个具有不同的细胞外结构域单元的CAR转染到同一细胞中。细胞外结构域识别单元中的一个可以结合MUC1*细胞外结构域。细胞外结构域识别单元中的一个可以结合PD-1。细胞外结构域识别单元中的一个可以是抗体片段，并且另一个可以是肽或抗MUC1*抗体片段。
所述方法可以包括用编码CAR的质粒和编码从诱导型启动子表达的非CAR物质的质粒转染或转导的免疫细胞。非CAR物质可以从诱导型启动子表达，所述诱导型启动子通过激活的免疫细胞的元件激活。非CAR物质可以从NFAT诱导型启动子表达。NFAT可以是NFATc1、NFATc3或NFATc2。切割酶可以是MMP2、MMP3、MMP9、MMP13、MMP14、MMP16、ADAM10、ADAM17或ADAM28，或其催化活性片段。非CAR物质可以是细胞因子。细胞因子可以是IL-7、IL-12、IL-15或IL-18。
本发明涉及一种抗体或其片段，其用于癌症的诊断、治疗或预防，其中所述抗体特异性结合PSMGFR肽(SEQ ID NO:2)或所述肽的片段。
抗体结合N-10肽(SEQ ID NO:3)、N-19肽(SEQ ID NO:4)、N-23肽(SEQ ID NO:5)、N-26肽(SEQ ID NO:6)、N-30肽(SEQ ID NO:7)、N-10/C-5肽(SEQ ID NO:8)、N-19/C-5肽(SEQ ID NO:9)或C-5肽(SEQ ID NO:825)。
抗体与包含在N-26序列ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)内的构象表位SVSDV(SEQ ID NO:1751)和FPFSA(SEQ ID NO:1747)的肽相互作用，其中FPFS(SEQ ID NO:1747)的突变或缺失破坏抗体或其片段与N-26肽的结合。
抗体与包含在N-19序列ASRYNLT ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:4)内的构象表位ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)、SVSDV(SEQ ID NO:1751)和FPFSA(SEQ ID NO:1747)的肽相互作用，其中ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)的突变或缺失破坏抗体或其片段与N-26肽的结合。
抗体不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)。
抗体结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，但不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)。
抗体抑制NME7AB与MUC1*之间的相互作用。
抗体抑制NME7AB与PSMGFR肽(SEQ ID NO:2)之间的相互作用。
抗体抑制NME7AB与N-10肽(SEQ ID NO:3)、N-19肽(SEQ ID NO:4)、N-23肽(SEQ IDNO:5)、N-26肽(SEQ ID NO:6)、N-30肽(SEQ ID NO:7)、N-10/C-5肽(SEQ ID NO:8)、N-19/C-5肽(SEQ ID NO:9)或C-5肽(SEQ ID NO:825)之间的相互作用。
抗体识别MUC1跨膜酶促切割产物。
在上文中，切割酶为MMP14或MMP9、或所述酶的催化活性片段。
抗体结合PSMGFR(SEQ ID NO:2)或其片段，其中PSMGFR(SEQ ID NO:2)内氨基酸序列的存在诱导抗体与PSMGFR的结合。
结合构象诱导肽的氨基酸序列存在于N-10肽(SEQ ID NO:3)中。
抗体不结合结合构象诱导肽序列的线性形式，其中肽的线性形式为变性形式。
结合构象诱导肽序列在N-26肽序列ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)中，其中FPFS(SEQ ID NO:1747)的突变或缺失破坏抗体或其片段与N-26肽的结合。
结合构象诱导肽序列位于N-19序列ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:4)内，其中ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)的突变或缺失破坏抗体或其片段与N-19肽的结合。
结合诱导肽序列可以位于N-26序列ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)内，其中FPFS(SEQ ID NO:1747)内的突变或缺失破坏抗体或其片段与PSMGFR的结合。
抗体可以具有共有序列。
重链CDR1包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为F或I，第2位为T，第3位为F，第4位为S，第5位为T、G或R，第6位为Y，第7位为A、G或T，第8位为M并且第9位为S；
重链CDR2包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为T，第2位为I或S，第3位为I或S，第5位为G或R，第6位为G或A，第9位为T或I，第10位为Y，第11位为Y，第12位为P或S并且第13-17位为DSVKG；
重链CDR3包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第2位为G、L或N，第4位为G或T，第7位为Y，第12位为D或E，第14位为A并且第15位为Y；
轻链CDR1包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为K或R，第2位为A或S，第3位为S，第4位为K或Q，第5位为S，第6位为L或V，第7位为L，第10位为T或S，第15位为Y并且第16位为I、L或M；
轻链CDR2包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为L、或W、或S，第2位为A或T，第3位为S，第4位为N或T，第5位为L或R，第6位为E或A并且第7位为S；并且
轻链CDR3包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为Q，第2位为H或Q，第3位为S、Q或R，第4位为R、S或Y，第5位为E、L或S，第6位为L或S，第7位为P或S，第8位为F或L并且第9位为T。
一种抗体，其结合在具有N-26序列ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)的肽内的构象表位，其中FPFS(SEQ ID NO:1747)、SVSDV(SEQ ID NO:1751)或ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)内的突变或缺失破坏抗体或其片段与PSMGFR的结合。
抗体可以具有另一共有序列，
其中
重链CDR1包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为F或I，第2位为T或A，第3位为F，第4位为S，第5位为T、G或R，第6位为Y或F，第7位为A、G或T，第8位为M并且第9位为S；
重链CDR2包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为T或A，第2位为I或S，第3位为I或S，第4位为N、S、T或G，第5位为G或R，第6位为G或A，第7位为G、T或D，第8位为Y、K、H或S，第9位为T或I，第10位为Y或F，第11位为Y，第12位为P或S，并且第13位为D，第14位为S或T，第15位为V或L并且第16-17位为KG；
重链CDR3包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第2位为G、L或N，第3位为G、T或Y，第4位为G或T，第7位为Y，第10位为Y、A或G，第11位为M、D或F，第12位为D或E并且第14-15位为AY；
轻链CDR1包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为K或R，第2位为A或S，第3位为S或R，第8位为S、Y、I或V，第10位为T或S，第12位为G、S、D或Q，第13位为V、Y、K或N，第14位为N、S或T，第15位为Y或F并且第16位为I、L或M；
轻链CDR2包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第2位为A、T或V，第3位为S，第4位为N、T或K，第5位为L或R，第6位为E、A、F或D并且第7位为S；并且
轻链CDR3包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为Q、F或W，第2位为H或Q，第4位为R、S、T、Y或N，第5位为E、L、S或H，第6位为L、S、V、D或Y，第7位为P或S并且第9位为T。
上述抗体可以是MNC2，具有
重链CDR1包含共有序列FTFSGYAMS；
重链CDR2包含共有序列TISSGGTYIYYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列-LGGDNYYEYFDV--；
轻链CDR1包含共有序列RASKS--VSTSGYSYMH；
轻链CDR2包含共有序列LASNLES；并且
轻链CDR3包含共有序列QHSRELPFT。
MNE6，具有
重链CDR1包含共有序列FTFSRYGMS；
重链CDR2包含共有序列TISGGGTYIYYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列DNYGRNYDYGMDY--；
轻链CDR1包含共有序列-------SATSSVSYIH；
轻链CDR2包含共有序列STSNLAS；并且
轻链CDR3包含共有序列QQRSSSPFT。
B2，具有
重链CDR1包含共有序列FAFSTFAMS；
重链CDR2包含共有序列AISNGGGYTYYPDTLKG；
重链CDR3包含共有序列----RYYDLYFDL--；
轻链CDR1包含共有序列RSSQNIV-HSNGNTYLE；
轻链CDR2包含共有序列KVSNRFS；并且
轻链CDR3包含共有序列FQDSHVPLT。
B7，具有
重链CDR1包含共有序列FTFSRYGMS；
重链CDR2包含共有序列TISSGGTYIYYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列DNYGSSYDYAMDY--；
轻链CDR1包含共有序列RSSQTIV-HSNGNTYLE；
轻链CDR2包含共有序列KVSNRFS；并且
轻链CDR3包含共有序列FQDSHVPLT。
B9，具有
重链CDR1包含共有序列FTFSRYGMS；
重链CDR2包含共有序列TISSGGTYIYYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列DNYGSSYDYAMDY--；
轻链CDR1包含共有序列-------SASSSVSYMH；
轻链CDR2包含共有序列TTSNLAS；并且
轻链CDR3包含共有序列QQRSSYPF-。
8C7F3，具有
重链CDR1包含共有序列FTFSTYAMS；
重链CDR2包含共有序列AISNGGGYTYYPDSLKG；
重链CDR3包含共有序列----RYYDHYFDY--；
轻链CDR1包含共有序列--RASESVATYGNNFMQ；
轻链CDR2包含共有序列LASTLDS；并且
轻链CDR3包含共有序列QQNNEDPPT。
H11，具有
重链CDR1包含共有序列FAFSTFAMS；
重链CDR2包含共有序列AISNGGGYTYYPDTLKG；
重链CDR3包含共有序列----RYYDLYFDL--；
轻链CDR1包含共有序列RSSQNIV-HSNGNTYLE；
轻链CDR2包含共有序列KVSNRFS；并且
轻链CDR3包含共有序列FQDSHVPLT。
B12，具有
重链CDR1包含共有序列SYGVH；
重链CDR2包含共有序列VIWPGGSTNYNSTLMSRM；
重链CDR3包含共有序列DRTPRVGAWFAY；并且
轻链CDR1包含共有序列RASESVATYGNNFMQ；
轻链CDR2包含共有序列LASTLDS；并且
轻链CDR3包含共有序列QQNNEDPPT。
20A10，具有
重链CDR1包含共有序列FTFSTYAMS；
重链CDR2包含共有序列-SIGRAGSTYYSDSVKG；
重链CDR3包含共有序列---GPIYNDYDEFAY；
轻链CDR1包含共有序列KSSQSVLYSSNQKNYLA；
轻链CDR2包含共有序列WASTRES；并且
轻链CDR3包含共有序列HQYLSSLT。
3C2B1，具有
重链CDR1包含共有序列ITFSTYTMS；
重链CDR2包含共有序列TISTGGDKTYYSDSVKG；
重链CDR3包含共有序列-GTTAMYYYAMDY；
轻链CDR1包含共有序列RASKS---ISTSDYNYIH；
轻链CDR2包含共有序列LASNLES；并且
轻链CDR3包含共有序列QHSRELPLT。
在另一方面，本发明涉及一种抗体或其片段，其用于癌症的诊断、治疗或预防，所述诊断、治疗或预防需要PSMGFR(SEQ ID NO:2)的抗体结合构象诱导肽ASRYNLT(SEQ IDNO:1745)的存在。抗体可以是25E6，具有
重链CDR1包含共有序列FTFSSYGMS；
重链CDR2包含共有序列TISNGGRHTFYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列QTGTEGWFAY；
轻链CDR1包含共有序列KSSQSLLDSDGKTYLN；
轻链CDR2包含共有序列LVSKLDS_；并且
轻链CDR3包含共有序列WQGTHFPQT。
在另一方面，本发明涉及一种抗体或其片段，其用于癌症的诊断、治疗或预防，所述诊断、治疗或预防需要PSMGFR(SEQ ID NO:2)的抗体结合构象诱导肽SVSDV(SEQ ID NO:1761)的存在。抗体可以是5C6F3，具有
重链CDR1包含共有序列FTFSTYAMS；
重链CDR2包含共有序列AISNGGGYTYYPDSLKG；
重链CDR3包含共有序列RYYDHYFDY；
轻链CDR1包含共有序列RSSQTIVHSNGNTYLE；
轻链CDR2包含共有序列KVSNRFS；并且
轻链CDR3包含共有序列FQDSHVPLT。
根据所有上文的抗体或其片段可以是鼠、骆驼科动物、人或人源化的。抗体片段可以是scFv或scFv-Fc，其可变区可为鼠、骆驼科动物、人或人源化的。
在另一方面，本发明涉及一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含上文的抗体片段，并且还可以包含共刺激结构域中的突变或者CD3-ζ信号传导结构域的ITAM中的一个或两个的突变或缺失。酪氨酸可以在CD28或4-1BB中是突变的。CD3-ζ可以含有单个ITAM，诸如仅ITAM1(也称为1XX)、ITAM2(也称为X2X)或ITAM3(也称为XX3)。在另一方面，CD3-ζ可以含有两个ITAM，其中ITAM的位置可以移动到更靠近的位置，诸如12X或23X(Feucht等人2019)。在又一方面，一个或两个ITAM的酪氨酸可以突变以减弱信号传导。在优选的实施方案中，CD3-ζ结构域是1XX。1XX突变的实例包括SEQ ID NO:1796-1797中举例说明的那些。
在另一方面，本发明涉及一种免疫细胞，其包含上文的CAR。免疫细胞可以是T细胞、NK细胞、树突细胞或肥大细胞。在一个方面，免疫细胞衍生自已被引导以在体外分化成所述免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，含有抗体序列的CAR在干细胞中表达，然后干细胞可以分化成免疫细胞。
在另一方面，本发明涉及一种细胞组合物，其在细胞中表达，所述细胞组合物包含上文的CAR和具有生物识别单元的第二实体，所述生物识别单元的特异性与CAR的特异性不同。第二实体可以结合PD-1、PDL-1或其它检查点抑制剂、或NME7、或细胞因子诸如IL-12或IL-18或c-Jun。
在又一方面，本发明涉及一种免疫细胞，其被工程化成表达编码上文的CAR的核酸和编码如前述权利要求中任一项所述的第二实体的核酸，其中第二实体从诱导型启动子表达。第二实体可以从诱导型启动子表达，所述诱导型启动子通过激活的免疫细胞的元件被激活。第二实体可以从NFAT诱导型启动子表达。NFAT可以是NFATc1、NFATc3或NFATc2。第二实体可以是细胞因子，诸如IL-7、IL-15或IL-18。可以将编码第二实体的核酸插入到Foxp3启动子或增强子区中，其中细胞因子是IL-18。细胞因子可以从NFAT诱导型启动子表达。
在另一方面，本发明涉及一种BiTE构建体，其包含上文的抗体片段。
在又一方面，本发明涉及一种抗体药物缀合物(ADC)，其包含上文的抗体或抗体片段。
本发明涉及一种抗体或其片段，其特异性地：
(i)结合PSMGFR(SEQ ID NO:2)和N-10(SEQ ID NO:3)；并且
不结合全长MUC1；
(ii)不结合C-10(SEQ ID NO:825)；
(iii)竞争性地抑制NME1或NME7AB与MUC1*细胞外结构域或PSMGFR肽的结合；
(iv)识别通过切割酶切割所生成的MUC1*；
(v)识别构象表位，但不识别线性表位；或
(vi)通过对组织的免疫组织化学而具有癌症选择性。
可以满足标准(i)-(vi)中的四个。可以满足标准(i)-(vi)中的五个。可以满足标准(i)-(vi)中的六个。至少可以满足标准(vi)。切割酶可以是MMP-9。
在所有上文情况中，癌症可以是乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胃癌或食道癌。
本发明还涉及一种通过向有需要的癌症患者施用本文所公开的抗体和片段来诊断、治疗或预防癌症的方法，所述癌症患者已被鉴别为异常表达MUC1以及表达截短的MUC1，诸如MUC1*。
本发明的这些和其它目的将从本发明的以下描述、所附的参考附图和所附的权利要求中得到更充分的理解。
附图说明
本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的附图。在提出请求并支付必要费用后，专利局将提供具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本。
从下文给出的详细描述和附图将更全面地理解本发明，所述详细描述和附图仅以说明的方式给出并且因此不限制本发明，并且其中；
图1A-1D显示用二价‘bv’抗MUC1*抗体、单价‘mv’或Fab NM23-H1二聚体或NME7-AB处理的MUC1*阳性细胞的细胞生长测定图。二价抗MUC1*抗体刺激癌细胞的生长，而单价Fab抑制生长(图1A-1B)。经典的钟形曲线指示配体诱导的二聚化刺激生长。二聚体NM23-H1(又名NME1)刺激MUC1*阳性癌细胞的生长，但是抑制MUC1表达的siRNA消除了它的作用(图1C)。NME7-AB还刺激MUC1*阳性细胞的生长(图1D)。
图2A-2I显示ELISA测定的结果。MUC1*肽PSMGFR、从N末端减10个氨基酸的PSMGFR(又名N-10)或从C末端减10个氨基酸的PSMGFR(又名C-10)被固定在板上，并且测定了以下结合：NME7-AB(图2A)、MNC2单克隆抗体(图2B)、MNE6单克隆抗体(图2C)或二聚体NME1(图2D)。这些测定显示，NME1、NME7-AB和单克隆抗体MNC2和MNE6全部都需要MUC1*细胞外结构域的前10个膜近侧氨基酸以结合。MUC1*肽从N末端减10个氨基酸的PSMGFR(又名N-10)或从C末端减10个氨基酸的PSMGFR(又名C-10)被固定在板上，并且测定了以下结合：MNC3(图2E)和MNC8(图2F)。图2G显示PSMGFR肽的氨基酸序列。图2H显示N-10肽的氨基酸序列。图2I显示C-10肽的氨基酸序列。
图3A-3C显示竞争性ELISA测定的结果。PSMGFR MUC1*肽被固定在板上，并且二聚体NM23-H1(又名NME1)单独添加或在添加了MNE6抗体之后添加(图3A)。进行了相同的实验，其中NM23-H7、NME7-A单独添加B或在添加了MNE6之后添加(图3B)。结果显示，MNE6竞争性地抑制MUC1*激活配体NME1和NME7的结合。在类似的实验中(图3C)，PSMGFR或从N末端减10个氨基酸的PSMGFR(又名N-10)被固定在板上。然后添加二聚体NM23-H1。然后测试抗MUC1*抗体MNE6、MNC2、MNC3或MNC8的竞争NM23-H1的能力。结果显示，尽管所有三种抗体都结合PSMGFR肽，但是MNE6和MNC2竞争性地抑制MUC1*激活配体的结合。
图4A-4F显示特异性结合MUC1*阳性癌细胞和MUC1*转染细胞，但不结合MUC1*或MUC1阴性细胞的抗MUC1*抗体huMNC2scFv的FACS扫描。ZR-75-1(又名1500)MUC1*阳性乳腺癌细胞用1.5ug/ml人源化MNC2的1:2或1:10稀释液染色。两次洗涤之后，细胞用二抗，1:200(图4A)、1:50(图4B)或1:10(图4C)的抗Penta-His抗体与Alexa 488的缀合物(Qiagen)染色，以检测huMNC2 scFv上的6x His标签。图4A显示huMNC2与ZR-75-1乳腺癌细胞的结合，其中以1:200稀释度添加二抗。图4B显示huMNC2与ZR-75-1乳腺癌细胞的结合，其中以1:50稀释度添加二抗。图4C显示huMNC2与ZR-75-1乳腺癌细胞的结合，其中以1:10稀释度添加二抗。流式细胞术分析揭示细胞子集的浓度依赖性偏移，指示特异性结合，这在不存在MNC2scFv的情况下看不见(图4A-4C)。图4D显示用空载体单细胞克隆#8转染的MUC1阴性HCT-116结肠癌细胞的抗MUC1*抗体MNE6染色。图4E显示用MUC1*单细胞克隆#10转染的HCT-116结肠癌细胞的抗MUC1*抗体MNE6染色。图4F显示ZR-75-1(又名1500)MUC1*阳性乳腺癌细胞的抗MUC1*抗体MNE6染色。如FACS扫描显示，MNC2和MNE6仅染色MUC1*阳性细胞，而不染色MUC1或MUC1*阴性细胞。
图5显示在其中表面用MUC1*PSMGFR肽或对照肽涂覆的ELISA的图。然后根据标准方法，将人源化MNC2 scFv与表面一起孵育、洗涤并且检测。ELISA显示，huMNC2 scFv结合MUC1*肽，EC-50为约333nM。
图6A-6B显示通过MUC1*抗体可变区片段人源化MNC2 scFv的癌细胞生长抑制的图。hMNC2 scFv有效抑制ZR-75-1(又名1500)MUC1*阳性乳腺癌细胞(图6A)和T47D MUC1*阳性乳腺癌细胞(图6B)的生长，其中EC-50与体外ELISA大致相同。
图7A-7B显示免疫受损的小鼠的肿瘤生长的图，所述小鼠已经植入了人肿瘤，然后用抗MUC1*抗体MNE6 Fab或模拟治疗进行治疗。植入90天雌激素颗粒的雌性nu/nu小鼠被植入600万个已与Matrigel50/50混合的T47D人乳腺癌细胞。选择携带为至少150mm3并且肿瘤体积连续三次增加的肿瘤的小鼠进行治疗。动物每周两次皮下注射80mg/kg MNE6 Fab，并且对符合相同选择标准的相同数目的小鼠注射单独媒介物(图7A)。雄性NOD/SCID小鼠被植入600万个已与Matrigel 50/50混合的DU-145人前列腺癌细胞。选择携带为至少150mm3并且肿瘤体积连续三次增加的肿瘤的小鼠进行治疗。动物每48小时皮下注射160mg/kg MNE6Fab，并且对符合相同选择标准的相同数目的小鼠注射单独媒介物(图7B)。两名研究人员每周两次独立的测量肿瘤并记录。统计值通过独立的统计员盲法计算，每个统计值给予P值0.0001。抗MUC1*Fab抑制乳腺癌生长和前列腺癌生长。治疗对体重、骨髓细胞类型或数目没有影响。
图8显示在其中表面固定有PSMGFR肽、从N-末端减10个氨基酸的PSMGFR或从C-末端减10个氨基酸的PSMGFR的ELISA的图。huMNE6 scFv-Fc结合PSMGFR肽和PSMGFR N-10肽，但不结合PSMGFR C-10肽。亲本MNE6抗体和人源化MNE6需要PSMGFR的C-末端10个氨基酸以便结合。
图9A-9B显示在其中测定板表面固定有PSMGFR肽、从N-末端减10个氨基酸的PSMGFR或从C-末端减10个氨基酸的PSMGFR的ELISA的图。然后测定了MNC3抗体变体与各种MUC1*肽的结合。图9A显示纯化的小鼠单克隆MNC3抗体；并且图9B显示人源化MNC3 scFv-Fc。ELISA显示与PSMGFR肽以及与某些缺失肽的结合。
图10A-10J。图10A-10B是乳腺癌组织阵列的照片。图10A用识别MUC1-FL(全长)的VU4H5染色；图10B用识别癌性MUC1*的小鼠单克隆抗体MNC2染色。在自动染色(ClarientDiagnostics)之后，使用合并强度得分和分布得分的Allred评分方法对组织染色进行评分。图10C-10F是颜色编码图，其显示针对每个患者组织的MUC1全长染色计算的得分。图10G-10J是颜色编码图，其显示针对每个患者组织的MUC1*染色计算的得分。
图11A-11J。图11A-11B是乳腺癌组织阵列的照片。图11A用识别MUC1-FL(全长)的VU4H5染色；图11B用识别癌性MUC1*的小鼠单克隆抗体MNC2染色。在自动染色(ClarientDiagnostics)之后，使用合并强度得分和分布得分的Allred评分方法对组织染色进行评分。图11C-11F是颜色编码图，其显示针对每个患者组织的MUC1全长染色计算的得分。图11G-11J是颜色编码图，其显示针对每个患者组织的MUC1*染色计算的得分。
图12A-12H显示用2.5ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc生物素化抗MUC1*抗体染色，然后用链霉抗生物素蛋白HRP二抗染色的正常乳房和乳腺癌组织的照片。图12A是正常乳房组织。图12B-12D是患者的乳腺癌组织，如图所示。图12E-12H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图13A-13F显示用2.5ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc生物素化抗MUC1*抗体染色，然后用链霉抗生物素蛋白HRP二抗染色的正常乳房和乳腺癌组织的照片。图13A是正常乳房组织。图13B-13C是患者的乳腺癌组织，如图所示。图13D-13F是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图14A-14H显示用10ug/mL的MNE6抗MUC1*抗体染色，然后用兔抗小鼠HRP二抗染色的乳腺癌组织的照片。图14A-14D是患者#300的乳腺癌组织。图14E-14H是转移患者#291的乳腺癌组织。
图15A-15F显示用2.5ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc生物素化抗MUC1*抗体染色，然后用链霉抗生物素蛋白HRP二抗染色的正常肺和肺癌组织的照片。图15A是正常肺组织。图15B-15C是患者的肺癌组织，如图所示。图15D-15F是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图16A-16F显示用2.5ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc生物素化抗MUC1*抗体染色，然后用链霉抗生物素蛋白HRP二抗染色的正常肺和肺癌组织的照片。图16A是正常肺组织。图16B-16C是患者的肺癌组织，如图所示。图16D-16F是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图17A-17F显示用25ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc生物素化抗MUC1*抗体染色，然后用链霉抗生物素蛋白HRP二抗染色的正常肺和肺癌组织的照片。图17A是正常肺组织。图17B-17C是患者的肺癌组织，如图所示。图17D-17F是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图18A-18F显示用25ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc生物素化抗MUC1*抗体染色，然后用链霉抗生物素蛋白HRP二抗染色的正常肺和肺癌组织的照片。图18A是正常肺组织。图18B-18C是患者的肺癌组织，如图所示。图18D-18F是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图19A-19D显示用5ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc生物素化抗MUC1*抗体染色，然后用链霉抗生物素蛋白HRP二抗染色的正常小肠和癌性小肠组织的照片。图19A是正常小肠组织。图19B是患者的小肠癌，如图所示。图19C-19D是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图20A-20H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的正常小肠组织的照片。图20A-20D是正常小肠组织。图20E-20H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图21A-21H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的癌性小肠组织的照片。图21A-21D是患者的癌性小肠组织，如图所示。图21E-21H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图22A-22H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的癌性小肠组织的照片。图22A-22D是患者的癌性小肠组织，如图所示。图22E-22H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图23A-23H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的正常结肠组织的照片。图23A-23D是正常结肠。图23E-23H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图24A-24H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的结肠癌组织的照片。图24A-24D是转移患者的结肠癌组织，如图所示。图24E-24H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图25A-25H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的结肠癌组织的照片。图25A-25D是2级患者的结肠癌组织，如图所示。图25E-25H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图26A-26H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的结肠癌组织的照片。图26A-26D是转移患者的结肠癌组织，如图所示。图26E-26H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图27A-27H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的前列腺癌组织的照片。图27A-27D是患者的前列腺癌组织，如图所示。图27E-27H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图28A-28H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的前列腺癌组织的照片。图28A-28D是患者的前列腺癌组织，如图所示。图28E-28H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图29A-29H显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的前列腺癌组织的照片。图29A-29D是患者的前列腺癌组织，如图所示。图29E-29H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
图30A-30F显示用抗MUC1*抗体huMNC2scFv染色的三阴性乳腺癌阵列的照片。显示的第一个得分是Allred得分，并且第二个是肿瘤等级。评分为零、弱、中或强的阵列的百分比被绘制为饼形图。图30A显示抗MUC1*抗体染色得分的饼形图。图30B显示用抗体染色的阵列的照片。图30C-30D显示阵列的两个乳腺癌标本的放大照片。图30E-30F显示由方框标出的标本部分的放大更多的照片。
图31A-31F显示用抗MUC1*抗体huMNC2scFv染色的卵巢癌阵列的照片。显示的第一个得分是Allred得分，并且第二个是肿瘤等级。评分为零、弱、中或强的阵列的百分比被绘制为饼形图。图31A显示抗MUC1*抗体染色得分的饼形图。图31B显示用抗体染色的阵列的照片。图31C-31D显示阵列的两个乳腺癌标本的放大照片。图31E-31F显示由方框标出的标本部分的放大更多的照片。
图32A-32F显示用抗MUC1*抗体huMNC2scFv染色的胰腺癌阵列的照片。显示的第一个得分是Allred得分，并且第二个是肿瘤等级。评分为零、弱、中或强的阵列的百分比被绘制为饼形图。图32A显示抗MUC1*抗体染色得分的饼形图。图32B显示用抗体染色的阵列的照片。图32C-32D显示阵列的两个乳腺癌标本的放大照片。图32E-32F显示由方框标出的标本部分的放大更多的照片。
图33A-33F显示用抗MUC1*抗体huMNC2scFv染色的肺癌阵列的照片。显示的第一个得分是Allred得分，并且第二个是肿瘤等级。评分为零、弱、中或强的阵列的百分比被绘制为饼形图。图33A显示抗MUC1*抗体染色得分的饼形图。图33B显示用抗体染色的阵列的照片。图33C-33D显示阵列的两个乳腺癌标本的放大照片。图33E-33F显示由方框标出的标本部分的放大更多的照片。
图34A-34I显示用抗MUC1*抗体huMNC2scFv染色的正常组织的照片。
图35A-35D显示不表达MUC1、MUC1*或全长MUC1的细胞的FACS扫描，其中用MNC2或VU4H5探测细胞。图35A显示用抗体MNC2探测的MUC1阴性HCT-116结肠癌细胞。图35B显示已经用MUC1*转染的HCT细胞，其中细胞外结构域正是PSMGFR肽的序列，其中用抗体MNC2探测细胞。图35C显示HCT-MUC1-18细胞，其是用全长MUC1转染的HCT细胞的切割抗性单细胞克隆，在本文中也称为HCT-MUC1-41TR，并且用抗体MNC2探测细胞。图35D显示用抗体VU4H5探测的HCT-MUC1-18细胞，所述抗体是识别全长MUC1中数百个串联重复表位的抗体。如从图中可以看出的那样，MNC2识别在全长MUC1中不可接近的异位表位。
图36A-36D显示HCT-116细胞的蛋白质印迹和对应的FAC分析，所述细胞是MUC1阴性结肠癌细胞系，然后用MUC1*或全长MUC1稳定转染这些细胞。显示的单细胞克隆是HCT-MUC1-41TR和HCT-MUC1*。图36A显示亲本细胞系HCT-116、HCT-MUC1-41TR和HCT-MUC1*的蛋白质印迹，其中已经用仅识别切割的MUC1的兔多克隆抗体SDIX探测了凝胶。在加载有HCT-MUC1*的泳道6中可以容易地看到介于25与35kDa之间的可见谱带，而在泳道4和5中仅有一条淡淡的谱带，显示在HCT-MUC1-41Tr细胞中仅有少量的MUC1被切割。加载到泳道2和3中的亲本细胞系HCT-116中不存在切割的MUC1。图36B是用识别全长MUC1的串联重复序列的小鼠单克隆抗体VU4H5探测的蛋白质印迹。如可以看出的那样，仅HCT-MUC1-41TR含有全长MUC1。图36C显示FACS扫描，其显示HCT-MUC1*对仅结合MUC1*并且基本上完全不结合全长MUC1的SDIX呈95.7％阳性。图36D显示FACS扫描，其显示HCT-MUC1-41TR细胞对全长MUC1呈95％阳性，并且对切割形式MUC1*呈仅约11％阳性。
图37A-37C显示评估MNC2识别被MMP9切割之后的全长MUC1的能力的蛋白质印迹和FACS分析的条形图。图37A显示HCT-MUC1-18细胞的蛋白质印迹，所述细胞是切割抗性细胞系，向其中添加了切割酶MMP9。使细胞裂解物级分在凝胶上跑胶，并且用多克隆抗PSMGFR抗体探测。照片显示，MMP9以剂量依赖性方式将MUC1切割成MUC1*，即约25kDa的物质。图37B显示同一实验的条件培养基的蛋白质印迹。照片显示以剂量依赖性方式添加切割酶MMP9增加了串联重复结构域向条件培养基中的释放。图37C显示实验的FACS分析。这些图显示，以剂量依赖性方式添加MMP9增加了抗MUC1*抗体MNC2对切割产物的识别，并且降低了对含有串联重复结构域的全长MUC1的识别。
图38显示将用全长MUC1转染的HCT细胞的切割抗性单细胞克隆HCT-MUC1-18细胞(此处标记为HCT-18)以不同量的催化活性ADAM17或MMP14处理的蛋白质印迹的照片。从条件培养基中免疫沉淀出全长MUC1的脱落MUC1串联重复结构域，然后在凝胶上跑胶，然后用结合串联重复表位的VU4H5探测。如可以看出的那样，MMP14同样有效地切割全长MUC1并且将含有细胞外结构域的串联重复序列脱落到条件培养基中。切割酶ADAM17不切割MUC1。
图39A-39B显示用抗MUC1*单克隆抗体MNC3、MNC2、MNE6或同种型对照抗体染色的人骨髓的人CD34+造血干细胞的荧光激活细胞分选(FACS)测量结果。FACS测定的直方图和显示数据的条形图显示，骨髓的MUC1*阳性细胞被一种抗MUC1*抗体MNC3识别，但不被MNE6或MNC2识别。所有三种抗体都结合PSMGFR肽。这些抗体的特异性的巨大差异表明MNC3识别当MUC1被不同于MMP9的酶切割时产生的MUC1*样形式。
图40A-40G显示用MNC3或MNE6探测的造血干细胞的FACS分析的细节。图40A显示总骨髓细胞的FACS散点图。图40B显示CD34+细胞的FACS散点图。图40C显示CD34+细胞的FACS直方图。图40D显示用MNC3或MNE6染色的最早的造血干细胞(CD34+/CD38-)的FACS散点图。图40E显示实验的直方图。图40F显示相对于MNE6的MNC3与CD34+/CD38-细胞的结合的叠加直方图。图40G显示所述FACS实验的条形图。
图41A-42H显示用多克隆抗PSMGFR抗体SDIX、MNE6或MNC2探测的CD34+/CD38-/lo造血干细胞的FACS分析的细节。图41A显示CD34+/CD38-/lo细胞群体的FACS散点图。图41E显示详细分析的表。图41B显示用抗PSMGFR多克隆抗体SDIX探测的CD34+/CD38-/lo细胞群体的FACS散点图。图41F显示详细分析的表。图41C显示用MNE6探测的CD34+/CD38-/lo细胞群体的FACS散点图。图41G显示详细分析的表。图41D显示用MNC2探测的CD34+/CD38-/lo细胞群体的FACS散点图。图41H显示详细分析的表。
图42A-42H显示已经用抗MUC1*抗体MNC2、MNE6、MNC3或MNC8的Fab处理过的DU145前列腺癌细胞或T47D乳腺癌细胞的照片。图像显示，癌症特异性抗体MNC2和MNE6有效杀伤前列腺癌细胞和乳腺癌细胞，而单克隆抗体MNC3和MNC8则不能。
图43显示比较在不同细胞系中表达的多种切割酶的表达的PCR实验的图，其中值已经归一化成在乳腺癌细胞系T47D中表达的那些。所比较的细胞系是前列腺癌细胞系DU145(HCT-MUC1-41TR，它是用细胞外结构域在41个串联重复单元之后被截短并且没有被切割成MUC1*形式的MUC1转染的MUC1阴性结肠癌细胞系)、T47D乳腺癌细胞系和CD34+骨髓细胞。
图43显示PCR实验的图，在所述实验中，在表达全长MUC1的细胞系DU145前列腺癌细胞HCT116+MUC1FL(也称为HCT-MUC1-18)、T47D乳腺癌细胞和骨髓的CD34+造血干细胞中测量了各种切割酶的表达水平。倍数表达是相对于T47D乳腺癌细胞中每种切割酶的表达量(设定为1)。
图44显示图43的PCR实验的表，但Y轴最大值设定为5。
图45A-45P显示CAR T共培养测定的照片，在所述测定中，CAR的靶向抗体片段是huMNC2scFv，其中CAR44具有CD8跨膜结构域，之后是41BB-3ζ并且CAR50具有CD4跨膜结构域，之后是41BB-3ζ。靶癌细胞是：HCT-FLR，其是用MUC1*45转染的HCT-116细胞；和HCT-MUC1-41TR，其是稳定的单细胞克隆HCT-116细胞系，它表达细胞外结构域在41个串联重复序列之后被截短并且自己没有被切割成MUC1*形式的MUC1。在与CAR T细胞共培养之前，HCT-MUC1-41TR癌细胞还与用MMP9或ADAM17转染的细胞的条件培养基一起孵育。MMP9或ADAM17表达细胞的条件培养基同样与作为那些切割酶的激活剂的APMA一起孵育。显示的图像是4X明视野图像和其显示用红色CMTMR亲脂性染料染色的癌细胞的荧光图像的叠加。图45A、45E、45I、45M显示与未转导的人T细胞共培养的细胞的照片。图45B、45F、45J、45N显示与在MOI 10下用抗MUC1*CAR44转导的人T细胞共培养的细胞的照片。图45C、45G、45K、45O显示与在MOI 10下用抗MUC1*CAR50转导的人T细胞共培养的细胞的照片。图45D、45H、45L、45P显示与在MOI50(这样增加转导效率)下的用抗MUC1*CAR44转导的人T细胞共培养的细胞的照片。图45B、45C、45D显示，CAR44和CAR50转导的T细胞都识别在这些癌细胞中表达的MUC1*，与它们结合，诱导聚集并杀伤许多癌细胞。图45F、45G、45H显示，CAR44和CAR50转导的T细胞都不识别在HCT-MUC1-41TR癌细胞中表达的全长MUC1。不存在T细胞诱导的聚集，并且癌细胞的数目也没有减少。图45J、45K、45L显示，激活的MMP9将全长MUC1切割成MUC1*形式，所述形式被CAR44和CAR50转导的T细胞识别。存在清晰可见的CAR T细胞诱导的聚集，并且癌细胞由于被杀伤而数目减少。图45N、45O、45P显示，激活的ADAM17没有切割MUC1或在MNC2无法识别的位置切割它。huMNC2-CAR44和huMNC2-CAR50转导的T细胞都不识别这些癌细胞。
图46A-46T显示CAR T共培养测定的照片，在所述测定中，CAR的靶向抗体片段是MNC2 scFv，其中CAR44具有CD8跨膜结构域，之后是41BB-3ζ并且CAR50具有CD4跨膜结构域，之后是41BB-3ζ。靶癌细胞是乳腺癌T47D细胞，在与MNC2-CAR T细胞共培养之前，这些细胞还与用MMP2、MMP9或ADAM17转染的细胞的条件培养基一起孵育。在一些情况下，MMP2和MMP9表达细胞的条件培养基同样与作为这些切割酶的激活剂的APMA一起孵育。显示的图像是4X明视野图像和其显示用红色CMTMR亲脂性染料染色的癌细胞的荧光图像的叠加。如可以看出的那样，MNC2-CAR T细胞仅结合并攻击表达切割形式MUC1*的靶癌细胞。
图47A-47I显示与抗MUC1*CAR T细胞共培养的癌细胞的照片，其中一些癌细胞在与CAR T细胞共培养之前与激活的MMP9一起预孵育。图47A-47C中所示的癌细胞是已经被稳定转染成表达MUC1*的MUC1阴性结肠癌细胞系HCT-116。图47D-47F中所示的癌细胞是表达高水平的全长MUC1和MUC1*的MUC1阳性乳腺癌细胞系T47D。图47G-47I中所示的癌细胞是与激活的MMP9一起预孵育的MUC1阳性乳腺癌细胞系T47D。图47A、47D和47G中所示的细胞与未转导的人T细胞一起共培养并且是对照。图47B、47E和47H中所示的细胞与在MOI 10下用huMNC2-CAR44转导的人T细胞一起共培养，其中MOI表示感染复数，并且MOI越高，在T细胞上表达的CAR越多。图47C、47F和47I中所示的细胞与在MOI 50下用huMNC2-CAR44转导的人T细胞一起共培养。如从照片中可以看出的那样，CAR44 T细胞结合靶MUC1*阳性癌细胞，包围并杀伤它们。将图47I的照片与其它照片进行比较，可以看出，当靶向CAR头的抗体识别MUC1*时，与MMP9一起预孵育的细胞变得更容易被CAR T杀伤。它还证明，被MMP9切割的MUC1被huMNC2scFv识别。
图48显示T47D乳腺癌细胞与未转导的T细胞(作为对照)或huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物在45小时的时间段内的xCelligence图。在癌细胞生长18小时之后，将催化亚基(catalytic sub-unit)MMP9添加到一些细胞中。在25小时，添加T细胞。如可以看出的那样，当T47D细胞与切割酶MMP9一起预孵育时，huMNC2-CAR44 T细胞杀伤大大提高。在xCelligence系统中，将贴壁的靶癌细胞铺板到电极阵列板上。贴壁细胞使电极绝缘并增加阻抗。贴壁癌细胞的数目与阻抗成正比。T细胞不是贴壁的，并且对阻抗没有贡献。因此，递增的阻抗反映了癌细胞的生长，并且递减的阻抗反映了癌细胞的杀伤。
图49显示DU145前列腺癌细胞与未转导的T细胞(作为对照)或huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物在45小时的时间段内的xCelligence图。在癌细胞生长18小时之后，将催化亚基MMP9添加到一些细胞中。在25小时，添加T细胞。如可以看出的那样，huMNC2-CAR44 T细胞杀伤不受与切割酶MMP9一起预孵育的影响。DU145癌细胞表达量显著较低的MUC1，其包括全长形式以及MUC1*。全长MUC1的较低密度不在空间上阻碍T细胞接近膜近端MUC1*。
图50显示PCR实验的条形图，所述实验测量由一组细胞系和原代细胞(包括正常细胞以及癌细胞)表达的MUC1的量。
图51A-51B显示ELISA测定的条形图，所述测定测量在与正常细胞或HCT-MUC1*癌细胞一起共培养72小时之后，huMNC2-CAR44人T细胞所分泌的干扰素γ(IFN-g)的量。图51A显示CAR44 T细胞与靶细胞的比率为1:1的实验结果。图51B显示CAR44 T细胞与靶细胞的比率为0.5:1的实验结果。
图52A-52B显示ELISA测定的条形图，所述测定测量在与正常细胞或HCT-MUC1*癌细胞一起共培养72小时之后，huMNC2-CAR44人T细胞所分泌的白介素-2(IL-2)的量。图52A显示CAR44 T细胞与靶细胞的比率为1:1的实验结果。图52B显示CAR44 T细胞与靶细胞的比率为0.5:1的实验结果。
图53A-53J显示在与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活标志物相对于死标志物的FACS分析的条形图和正常细胞相对于癌细胞的照片。图53A.1显示在HCT-MUC1*癌细胞与huMNC2-CAR44T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53A.2和图53A.3显示图53A.1中描述的实验的照片。图53B.1显示在MCF-12A正常乳房细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53B.2和图53B.3显示图53B.1中描述的实验的照片。图53C.1显示在THLE-3正常肝细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53C.2和图53C.3显示图53C.1中描述的实验的照片。图53D.1显示在T/G HA-HSMC正常心脏细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53D.2和图53D.3显示图53D.1中描述的实验的照片。图53E.1显示在Hs1.Tes正常睾丸细胞与huMNC2-CAR44T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53E.2和图53E.3显示图53E.1中描述的实验的照片。图53F.1显示在HEK-293MUC1阴性细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53F.2和图53F.3显示图53F.1中描述的实验的照片。图53G.1显示在HRCE正常肾细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53G.2和图53G.3显示图53G.1中描述的实验的照片。图53H.1显示在CCD-18Lu正常肺细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53H.2和图53H.3显示图53H.1中描述的实验的照片。图53I.1显示在HBEC-5i正常脑细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53I.2和图53I.3显示图53I.1中描述的实验的照片。图53J.1显示在Hs.738.St/Int正常胃和肠细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，活细胞相对于死细胞的FACS分析的条形图。图53J.2和图53J.3显示图53J.1中描述的实验的照片。
图54显示乳腺癌组织阵列的照片，在所述阵列中对于每个患者，有原发肿瘤的标本加上所述患者的转移瘤的标本。如从图中可以看出的那样，大多数情况下，转移瘤比原发肿瘤表达更多的MUC1*。
图55A-55H显示huMNC2-CAR44 T细胞对MUC1*阳性DU145前列腺癌细胞的细胞毒性作用，如通过多种测定所测量。图55A是未转导的T细胞与前列腺癌细胞一起共培养的荧光照片，其中颗粒酶B用红色荧光团染色。图55B显示DAPI和颗粒酶B的合并。图55C是huMNC2-CAR44 T细胞与前列腺癌细胞一起共培养的荧光照片，其中颗粒酶B用红色荧光团染色。图55D显示DAPI和颗粒酶B的合并。图55E是针对与癌细胞一起孵育的未转导的T细胞的荧光标记的颗粒酶B的FACS扫描。图55F是FACS扫描，其显示与癌细胞一起孵育的huMNC2-CAR44 T细胞的荧光标记的颗粒酶B的正增加。图55G是平均荧光强度的图。图55H是xCELLigence扫描，其跟踪huMNC2-CAR44 T细胞(蓝色迹线)而不是未转导的T细胞(绿色)对DU145癌细胞的实时杀伤。
图56A-56H显示huMNC2-CAR44 T细胞对MUC1*阳性CAPAN-2胰腺癌细胞的细胞毒性作用，如通过多种测定所测量。图56A是未转导的T细胞与胰腺癌细胞一起共培养的荧光照片，其中颗粒酶B用红色荧光团染色。图56B显示DAPI和颗粒酶B的合并。图56C是huMNC2-CAR44 T细胞与胰腺癌细胞一起共培养的荧光照片，其中颗粒酶B用红色荧光团染色。图56D显示DAPI和颗粒酶B的合并。图56E是针对与癌细胞一起孵育的未转导的T细胞的荧光标记的颗粒酶B的FACS扫描。图56F是FACS扫描，其显示与癌细胞一起孵育的huMNC2-CAR44 T细胞的荧光标记的颗粒酶B的正增加。图56G是平均荧光强度的图。图56H是xCELLigence扫描，其跟踪huMNC2-CAR44 T细胞(蓝色迹线)而不是未转导的T细胞(绿色)对CAPAN-2癌细胞的实时杀伤。
图57A-57C显示xCELLigence扫描，其跟踪huMNC2-CAR44 T细胞对MUC1*阳性癌细胞而不是MUC1*阴性细胞的实时杀伤。图57A显示huMNC2-CAR44 T细胞有效杀伤已经用MUC1*稳定转染的HCT结肠癌细胞。图57B显示huMNC2-CAR44 T细胞对已经用全长MUC1稳定转染的MUC1阴性癌细胞HCT-MUC1-41TR几乎没有影响。在此细胞系中，仅约10％的细胞将MUC1切割成MUC1*。图57C显示，huMNC2-CAR44 T细胞对MUC1阴性结肠癌细胞系HCT-116细胞没有影响。
图58A-58F显示NOD/SCID/GAMMA小鼠在IVIS仪器中的照片，所述仪器测量在小鼠未用任何物质、用PBS、用未转导的人T细胞或用huMNC2-CAR44 T细胞处理之后，肿瘤细胞的光子发射。将小鼠皮下注射荧光素酶阳性的HCT-MUC1*肿瘤细胞。在拍摄IVIS照片前十(10)分钟，向小鼠的腹膜内(ip)空间中注射荧光素酶底物虫荧光素。图58A显示仅用磷酸盐缓冲盐水PBS处理的荷瘤小鼠。图58B显示仅用未转导的T细胞处理的荷瘤小鼠。图58C显示已经用单剂量的huMNC2-CAR44 T细胞处理的荷瘤小鼠。图58D显示图像的色标。图58E显示实验的Kaplan-Meier存活率曲线。图58F显示详细列出了在处死之后，从小鼠血液中分离出的人T细胞的分子构成的表。
图59A-59C显示NOD/SCID/GAMMA小鼠在IVIS仪器中的照片，所述仪器测量在小鼠未用任何物质、用PBS或用huMNC2-CAR44 T细胞处理之后，肿瘤细胞的光子发射。将小鼠皮下注射T47D-wt乳腺癌细胞或T47D+更多MUC1*(其为混合的细胞群体，其中95％的细胞是用更多MUC1*稳定转染的T47D细胞)。T47D-wt和T47D加更多MUC1*细胞均被制成荧光素酶阳性。在拍摄IVIS照片前十(10)分钟，向小鼠的腹膜内(ip)空间中注射荧光素酶底物虫荧光素。图59A显示仅用磷酸盐缓冲盐水PBS处理的荷瘤小鼠。图59B显示已经用两(2)剂huMNC2-CAR44 T细胞治疗的T47D-wt荷瘤小鼠。图T90.1C显示已经用两(2)剂huMNC2-CAR44 T细胞治疗的T47D-MUC1*荷瘤小鼠。
图60A-60C显示NOD/SCID/GAMMA小鼠在IVIS仪器中的照片，所述仪器测量在小鼠未用任何物质、用PBS、用未转导的T细胞或用huMNC2-CAR44 T细胞处理之后，肿瘤细胞的光子发射。将小鼠皮下注射70％ T47D-wt乳腺癌细胞和30％用更多MUC1*转染的T47D细胞的混合群体。两种细胞类型均被制成荧光素酶阳性。在拍摄IVIS照片前十(10)分钟，向小鼠的腹膜内(ip)空间中注射荧光素酶底物虫荧光素。图60A显示仅用磷酸盐缓冲盐水PBS处理的荷瘤小鼠。图60B显示仅用未转导的T细胞处理的荷瘤小鼠。图60C显示已经用两(2)剂huMNC2-CAR44 T细胞治疗的荷瘤小鼠。
图61A-61J显示在IVIS仪器上拍摄的小鼠的荧光照片。在第0天向NSG(NOD/SCID/GAMMA)免疫受损的小鼠的侧腹中皮下注射500K人BT-20细胞，所述细胞是MUC1*阳性三阴性乳腺癌细胞系。癌细胞已用荧光素酶稳定转染。使肿瘤移植。在IVIS测量之后的第6天，将动物一次性注射1000万个用huMNC2-scFv-CAR44转导的人T细胞或未转导的T细胞。肿瘤内注射500万个T细胞，并且尾部静脉中注射500万个。在IVIS照相之前10分钟，将小鼠IP注射虫荧光素，虫荧光素在被荧光素酶切割之后发出荧光，因此使肿瘤细胞发出荧光。图61A、61D、61G显示用huMNC2-scFv-CAR44 T细胞处理的小鼠的照片，所述细胞在施用之前24小时通过与4μm附接了合成MUC1*PSMGFR肽的珠粒一起共培养24小时来预刺激：方案1。图61B、61E、61H显示用huMNC2-scFv-CAR44 T细胞处理的小鼠的照片，所述细胞在施用之前24小时通过与MUC1*阳性癌细胞一起两次共培养，持续24小时来预刺激：方案2。图61C、61F、61I显示用未转导的人T细胞处理的小鼠的照片。图61J是将以光子/秒为单位的荧光与颜色相关联的色标。
图62A-62M显示在IVIS仪器上拍摄的小鼠的荧光照片。在第0天向NSG(NOD/SCID/GAMMA)免疫受损的小鼠的腹膜腔(IP)中注射500K人SKOV-3细胞，所述细胞是MUC1*阳性卵巢癌细胞系。癌细胞已用荧光素酶稳定转染。使肿瘤移植。第4天，向动物的腹膜内空间中注射10M用huMNC2-scFv-CAR44转导的人T细胞、未转导的T细胞或PBS。第11天，再次注射动物，不同的是将一半细胞注射到尾部静脉中，并且另一半IP注射。第3、7、10和15天，通过IVIS对动物进行成像。在IVIS照相之前10分钟，将小鼠IP注射虫荧光素，虫荧光素在被荧光素酶切割之后发出荧光，因此使肿瘤细胞发出荧光。图62A、62D、62G和62J显示用huMNC2-scFv-CAR44T细胞处理的小鼠的照片，所述细胞在施用之前24小时通过与1μm附接了合成MUC1*PSMGFR肽的珠粒一起共培养24小时来预刺激：图62B、62E、62H和62K显示用未转导的人T细胞处理的小鼠的照片。图62C、62F、62I和62L显示用PBS处理的小鼠的照片。图62A、62B和62C是在CAR T、T细胞或PBS施用之前第3天拍摄的IVIS图像。图62D、62E和62F显示第7天，即处理之后四(4)天动物的IVIS图像。图62G、62H和62I显示第10天动物的IVIS图像。图62J、62K和62L显示第15天动物的IVIS图像。图62M是将以光子/秒为单位的荧光与颜色相关联的IVIS色标。
图63显示ELISA结合测定的图，在所述测定中，测试了各种单克隆抗体结合PSMGFR肽、N-10、C-10、N+20/C-27或N+9/C-9肽的能力，其中抗体浓度为10ug/mL或1ug/mL。需注意，已证明具有癌症特异性的抗MUC1*单克隆抗体C2和E6结合PSMGFR肽，如果失去10个N-末端氨基酸仍然结合，但如果失去第10个或9个C-末端氨基酸，则不结合。
图64A-64B显示ELISA结合测定的图。测试的抗体来源于用PSMGFR肽免疫的动物。第一个选择标准是确认抗体结合免疫PSMGFR肽。图64A显示所选抗体的ELISA的图，对所述抗体进行进一步测试以确定它们结合PSMGFR肽、N-10、C-10、N+20/C-27或N+9/C-9肽的能力。除18B4之外的所有抗体都能够结合N-10肽。18B4识别N+20/C-27但不识别N-10肽，意味其同源表位位于GTINVHDVET序列内。除20A10和C2之外的所有抗体都显示与C-10和N+9/C-9肽的一些结合，显示20A10和C2都需要10个膜近端氨基酸以便结合。需要10个膜近端氨基酸以便结合的C2已被证明具有癌症特异性。图64B显示各种肽的序列。ELISA图中每种抗体的条的颜色都被颜色编码，以匹配那个抗体的推导同源序列或其一部分。
图65A-65B显示ELISA结合测定的图，在所述测定中，测试了各种单克隆抗体结合PSMGFR肽、N-10、C-10、N+20/C-27或N+9/C-9肽的能力。测试的抗体来源于用N+20/C-27肽免疫的动物。第一个选择标准是确认抗体结合免疫N+20/C-27肽。图65A显示ELISA结合测定的图，所述测定测试每种抗体结合各种肽的能力。尽管这些抗体是针对N+20/C-27肽而产生的，但除45C11之外的所有抗体仍然结合PSMGFR肽。45C11的结合很弱，但演绎推理显示，同源表位必须位于SNIKFRPGSVV序列内。1E4能够结合N+20/C-27肽、PSMGFR和N-10肽，与其表位必须位于QFNQYKTE序列内的想法一致。图65B显示各种肽的序列。ELISA图中每种抗体的条的颜色都被颜色编码，以匹配那个抗体的推导同源序列或其一部分。
图66A-66B显示ELISA结合测定的图，在所述测定中，测试了各种单克隆抗体结合PSMGFR肽、N-10、C-10、N+20/C-27或N+9/C-9肽的能力。测试的抗体来源于用N+9/C-9肽免疫的动物。第一个选择标准是确认抗体结合免疫N+9/C-9肽。图66A显示ELISA测定的图。除39H5之外的所有抗体都仅结合免疫肽N+9/C-9。39H5显示与PSMGFR和N-10肽的结合非常弱，与其同源表位的至少一部分必须位于QFNQYKTE序列内的想法一致。图66B显示各种肽的序列。ELISA图中每种抗体的条的颜色都被颜色编码，以匹配那个抗体的推导同源序列或其一部分。
图67A-67D显示ELISA测定的结果，所述测定进一步限定MUC1或MUC1*细胞外结构域内的抗体表位。此图中显示的抗体全部都是通过用PSMGFR肽对动物进行免疫而生成的。结合测定测试了抗体结合肽N-19、N-26、N-30、N-10/C-5、N-19/C-5、PSMGFR、N-10和C-10的能力，这些肽是PSMGFR肽的所有子集并且编号指回PSMGFR肽。图67A显示各种抗体与各种肽的结合。图67B显示已在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR肽的序列。图67C显示PSMGFR衍生的子集肽的序列。图67D显示包含抗体识别所必需的表位的全部或一部分的序列。
图68A-68D显示ELISA测定的结果，所述测定进一步限定MUC1或MUC1*细胞外结构域内的抗体表位。此图中显示的抗体全部都是通过用N+20/C-27肽对动物进行免疫而生成的。结合测定测试了抗体结合肽N-19、N-26、N-30、N-10/C-5、N-19/C-5、PSMGFR、N-10和C-10的能力，这些肽是PSMGFR肽的所有子集并且编号指回PSMGFR肽。图68A显示各种抗体与各种肽的结合。图68B显示已在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR肽的序列。图68C显示PSMGFR衍生的子集肽的序列。图68D显示包含抗体识别所必需的表位的全部或一部分的序列。
图69A-69D显示ELISA测定的结果，所述测定进一步限定MUC1或MUC1*细胞外结构域内的抗体表位。此图中显示的抗体全部都是通过用N+9/C-9肽对动物进行免疫而生成的。结合测定测试了抗体结合肽N-19、N-26、N-30、N-10/C-5、N-19/C-5、PSMGFR、N-10和C-10的能力，这些肽是PSMGFR肽的所有子集并且编号指回PSMGFR肽。图69A显示各种抗体与各种肽的结合。图69B显示已在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR肽的序列。图69C显示PSMGFR衍生的子集肽的序列。图69D显示包含抗体识别所必需的表位的全部或一部分的序列。
图70A-70B显示ELISA置换测定的图。在此实验中，多孔板涂覆有PSMGFR肽。在图70A中，使重组NME7AB结合表面固定的PSMGFR肽。添加各种抗体，之后进行洗涤步骤。通过检测NME7AB上的标签来测量在抗体竞争之后仍然附接至涂覆PSMGFR的板的NME7AB的量。作为对照，还测试了抗NME7AB抗体从PSMGFR置换NME7AB的能力。如从图中可以看出的那样，抗体MNC2、MNE6、20A10、3C2B1和5C6F3从与PSMGFR肽的结合置换NME7AB，这是抗体具有癌症特异性的指标。图70B显示，这些抗体结合的MUC1*细胞外结构域内的表位是序列SVSDVPFPFSAQSGA，其中如果氨基酸FPFS不存在或突变，则MNC2、MNE6、20A10、3C2B1的结合被破坏，并且如果SVSDV不存在或突变，则5C6F3的结合被破坏。
图71A-71H显示测试了抗体结合全长MUC1或MUC1*中的线性表位的能力的蛋白质印迹的照片。图71A-71D显示对抗体结合MUC1阴性细胞系HCT-116或工程化细胞系HCT-MUC1-18(其为表达全长MUC1的切割抗性克隆)或HCT-MUC1*(其被工程化成仅表达其细胞外结构域中的PSMGFR序列)的能力的测试。图71E-71H显示对抗体结合乳腺癌细胞系T47D或1500(又名ZR-75-1)的能力的测试。图71A和图71E显示针对PSMGFR肽而产生的单克隆抗体MNC2，其结合PSMGFR肽的N-10变体但不结合C-10变体。图71B和图71F显示针对PSMGFR肽而产生的单克隆抗体MNE6，其结合PSMGFR肽的N-10变体但不结合C-10变体。图71C和图71G显示针对PSMGFR肽而产生并结合PSMGFR肽的多克隆抗体SDIX。图71D和图71H显示结合全长MUC1的串联重复序列的可商购获得的单克隆抗体VU4H5。如可以看出的那样，MNC2和MNE6都不结合MUC1物质的线性表位。
图72A-72P显示测试了抗体结合全长MUC1或MUC1*中的线性表位的能力的蛋白质印迹的照片。所有这些抗体都是针对PSMGFR肽而产生的并且结合PSMGFR肽。图72A-72H显示对抗体结合MUC1阴性细胞系HCT-116或工程化细胞系HCT-MUC1-18(其为表达全长MUC1的切割抗性克隆)或HCT-MUC1*(其被工程化成仅表达其细胞外结构域中的PSMGFR序列)的能力的测试。图72I-72P显示对抗体结合乳腺癌细胞系T47D或1500(又名ZR-75-1)的能力的测试。图72A和图72I显示20A10。图72B和图72J显示25E6。图72C和图72K显示18B4。图72D和图72L显示18G12。图72E和图72M显示28F9。图72F和图72N显示3C2B1。图72G和图72O显示5C6F3。图72H和图72P显示5C6F3，其中印迹已暴露较长的一段时间以提供更易看见的MUC1*特异性谱带。如可以看出的那样，抗体25E6、18B4和在一定程度上的5C6F3识别线性表位，但20A10、3C2B1、18G12和28F9不识别。
图73A-73J显示测试了抗体结合全长MUC1或MUC1*中的线性表位的能力的蛋白质印迹的照片。所有这些抗体都是针对PSMGFR肽的N+20/C-27变体而产生的并且结合N+20/C-27肽。图73A-73E显示对抗体结合MUC1阴性细胞系HCT-116或工程化细胞系HCT-MUC1-18(其为表达全长MUC1的切割抗性克隆)或HCT-MUC1*(其被工程化成仅表达其细胞外结构域中的PSMGFR序列)的能力的测试。图73F-73J显示对抗体结合乳腺癌细胞系T47D或1500(又名ZR-75-1)的能力的测试。图73A和图73F显示1E4。图73B和图73G显示45C11。图73C和图73H显示31A1。图73D和图73I显示32C1。图73E和图73J显示29H1。如可以看出的那样，抗体31A1和32C1识别线性表位。
图74A-74H显示测试了抗体结合全长MUC1或MUC1*中的线性表位的能力的蛋白质印迹的照片。所有这些抗体都是针对PSMGFR肽的N+9/C-9变体而产生的并且结合N+9/C-9肽。图74A-74D显示对抗体结合MUC1阴性细胞系HCT-116或工程化细胞系HCT-MUC1-18(其为表达全长MUC1的切割抗性克隆)或HCT-MUC1*(其被工程化成仅表达其细胞外结构域中的PSMGFR序列)的能力的测试。图74E-74H显示对抗体结合乳腺癌细胞系T47D或1500(又名ZR-75-1)的能力的测试。图74A和图74E显示8A9。图74B和图74F显示17H6。图74C和图74G显示3C5。图74D和图74H显示39H5。
图75A-75P显示FACS分析的图。将表达全长MUC1的HCT-MUC1-18细胞与催化活性MMP9或MMP2一起孵育24小时，与本发明抗体一起孵育，然后通过FACS进行分析以查看抗体是否结合MUC1的MMP9或MMP2切割形式。需注意，每张图的第一个条形显示在不存在切割的情况下，没有抗体结合全长MUC1。每个条形图用那个测定中使用的抗体的名称及其同源表位标记。图从右到左的顺序对应于抗体的同源表位离细胞表面的距离。图75A显示抗体1E4。图75B显示抗体28F9。图75C显示抗体18G12。图75D显示抗体25E6。图75E显示抗体20A10。图75F显示抗体3C5。图75G显示抗体29H1。图75H显示抗体32C1。图75I显示抗体31A1。图75J显示抗体18B4。图75K显示抗体45C11。图75L显示抗体8A9。图75M显示抗体17H6。
图75N显示抗体39H5。图75O显示抗体3C2B1。图75P显示抗体5C6F3。
图76A-76J显示参考抗体MNC2(“C2”)和VU4H5与MUC1阴性细胞系HCT-116、用MUC1*转染的HCT(“HCT-MUC1*”)、用全长MUC1转染的HCT的切割抗性单细胞克隆(“HCT-MUC1-18”)的结合以及MNC2与乳腺癌细胞系T47D或乳腺癌细胞系1500(也称为ZR-75-1)的FACS分析的图。MNC2结合MUC1*的细胞外结构域上的异位结合位点结合，在PSMGFR序列的膜近端部分内。MNC2结合位点仅在切割和释放包含串联重复结构域的细胞外结构域的大部分之后才可供使用。VU4H5结合串联重复结构域中的数百个重复表位。图76A-76E显示结合百分比，并且图76F-76J显示平均荧光强度或MFI。
图77A-77N显示参考抗体MNC2(“C2”)与一组MUC1*阳性的癌细胞系的结合的FACS分析的图，MDA-MB-231除外，其表达MUC1和MUC1*水平很低，经常用作阴性对照。MNC2结合MUC1*的细胞外结构域上的异位结合位点结合，在PSMGFR序列的膜近端部分内。MNC2结合位点仅在切割和释放包含串联重复结构域的细胞外结构域的大部分之后才可供使用。图77A-77G显示结合百分比，并且图77H-77N显示平均荧光强度或MFI。图77A和77H显示抗体与肺癌细胞系NCI-H292的结合。图77B和77I显示抗体与肺癌细胞系NCI-H1975的结合。图77C和77J显示抗体与卵巢癌细胞系SKOV-3的结合。图77D和77K显示抗体与胰腺癌细胞系HPAF-II的结合。图77E和77L显示抗体与胰腺癌细胞系Capan-1的结合。图77F和77M显示抗体与前列腺癌细胞系DU145的结合。图77G和77N显示抗体与乳腺癌细胞系MDA-MB-231的结合，所述细胞系几乎呈MUC1和MUC1*阴性。
图78A-78C显示已在N-末端和C-末端延伸或缺失的基础PSMGFR序列的彩色编码示意图。针对肽的子集测试了本发明抗体以进一步细化每种抗体结合的表位或每种抗体结合的表位内的关键氨基酸。图78A是肽的各种子集的比对示意图。图78B列出与每个颜色编码序列结合的抗体。图78C列出每种抗体识别的癌细胞系。
图79A-79I显示由对结合T47D乳腺癌细胞的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图79A-79D是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图79E-79H是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图79A和图79E显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图79B和图79F显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图79C和图79G显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图79D和图79H还显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图79I显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。图79A、图79E显示，20A10识别存在于T47D乳腺癌细胞上的MUC1*。图79D、图79H显示，3C2B1识别存在于T47D乳腺癌细胞上的MUC1*。图79D、图79H显示，5C6F3识别存在于T47D乳腺癌细胞上的MUC1*。
图80A-80I显示由对结合1500(也称为ZR-75-1)乳腺癌细胞的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图80A-80C是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图80D-80F是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图80A、图80E、图80D和图80H显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图80B和图80F显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图80C和图80G显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图80I显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。图80A、图80E显示，抗体20A10识别存在于1500(又名ZR-75-1)乳腺癌细胞上的MUC1*。图80D、图80H显示，抗体3C2B1识别存在于1500(又名ZR-75-1)乳腺癌细胞上的MUC1*。图80D、图80H显示，抗体5C6F3识别存在于1500(又名ZR-75-1)乳腺癌细胞上的MUC1*。
图81A-81G显示由对结合NCI-H292肺癌细胞的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图81A-81C是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图81D-81F是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图81A和图81D显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图81B和图81E显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图81C和图81F显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图81G显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。图81A、图81D显示，抗体20A10识别存在于H292肺癌细胞上的MUC1*。
图82A-82G显示由对结合NCI-H1975肺癌细胞的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图82A-82C是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图82D-82F是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图82A和图82D显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图82B和图82E显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图82C和图82F显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图82G显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。图82A、图82D显示，抗体20A10识别存在于H1975肺癌细胞上的MUC1*。
图83A-83G显示由对结合SKOV-3卵巢癌细胞的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图83A-83C是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图83D-83F是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图83A和图83D显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图83B和图83E显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图83C和图83F显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图83G显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。图83A、图83D显示，抗体20A10识别存在于SKOV-3卵巢癌细胞上的MUC1*。
图84A-84G显示由对结合DU145前列腺癌细胞的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图84A-84C是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图84D-84F是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图84A和图84D显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图84B和图84E显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图84C和图84F显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图84G显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。图84A、图84E显示，抗体20A10识别存在于DU145前列腺癌细胞上的MUC1*。图84D、图84H显示，抗体3C2B1识别存在于DU145前列腺癌细胞上的MUC1*。图84D、图84H显示，抗体5C6F3识别存在于DU145前列腺癌细胞上的MUC1*。
图85A-85G显示由对结合HPAF-II胰腺癌细胞的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图85A-85C是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图85D-85F是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图85A和图85D显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图85B和图85E显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图85C和图85F显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图85G显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。图85A、图85D显示，抗体20A10识别存在于HPAF II胰腺癌细胞上的MUC1*。
图86A-86G显示由对结合Capan-1胰腺癌细胞的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图86A-86C是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图86D-86F是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图86A和图86D显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图86B和图86E显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图86C和图86F显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图86G显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。
图87A-87G显示由对结合MDA-MB-231乳腺癌细胞(它们几乎呈MUC1阴性)的每种抗体及其在N-末端延伸的PSMGFR序列内的相应同源序列的FACS分析所得到的彩色编码图。图87A-87C是显示每种抗体所识别的细胞百分比的FACS图。图87D-87F是显示每种抗体的平均荧光强度MFI的FACS图。图87A和图87D显示通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图87B和图87E显示通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图87C和图87F显示通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体的FACS图。图87G显示在N-末端延伸了20个氨基酸的PSMGFR序列。
图88A-88L显示正常肝组织标本的照片，每个标本都来自相同的供体但用本发明的不同抗体染色。图88A-88F显示整个组织核心。图88G-88L显示组织的特定区域的40X放大。组织从右到左排列，其中最靠近膜(也就是说PSMGFR肽的最C-末端部分)结合的抗体在右侧，而结合MUC1细胞外结构域的最N-末端部分、甚至超出PSMGFR区的抗体在左侧。如从图中可以看出的那样，最具有癌症特异性的抗体是结合PSMGFR序列的最膜近端部分的抗体，而结合最远端的N-末端部分的抗体失去了癌症特异性，结合PSMGFR之外的表位的那些抗体失去所有癌症特异性。如可以看出的那样，图88F和88L显示，结合包含序列FPFS或PFPFSAQSGA的全部或一部分的MUC1*细胞外结构域的部分的抗体3C2B1不结合正常肝。
图89A-89H显示用本发明的不同抗体染色的正常心脏组织标本的照片。图89A-89D显示整个组织核心。图89E-89HL显示组织的特定区域的40X放大。图89A和图89E显示用MNC2-scFv染色。图89B和图89F显示用MNE6染色。图89C和图89G显示用20A10染色。图89D和图89H显示用3C2B1染色。这些抗体结合包含序列FPFS或PFPFSAQSGA的全部或一部分的表位。所有这些抗体全部能够结合PSMGFR肽，结合N-10肽但不结合C-10肽。此外，这些抗体破坏NME7AB与MUC1*细胞外结构域的结合，如通过PSMGFR肽举例说明。此外，当切割酶是MMP9时，这些抗体识别MUC1切割产物。如从图中可以看出的那样，这些抗体显示不结合正常心脏组织。图89A、图89E显示，参考抗体MNC2不结合正常心脏组织。图89B、图89F显示参考抗体MNE6不结合正常心脏组织。图89C、图89G显示抗体20A10不结合正常心脏组织。图89D、图89H显示抗体3C2B1不结合正常心脏组织。
图90A-90D显示用本发明的不同抗体染色的正常心脏组织标本的照片。图90A-90B显示整个组织核心。图90C-90D显示组织的特定区域的40X放大。图90A和图90C显示用MNC3染色。图90B和图90D显示用25E6染色。这些抗体结合包含序列ASRYNLT的全部或一部分的表位。这些抗体全部能够结合PSMGFR肽，结合N-10肽但同样结合C-10肽。如可以看出的那样，这些抗体不具有癌症特异性，并且显示出与正常心脏组织的一些结合。
图91A-91B显示用本发明抗体1E4染色的正常心脏组织标本的照片。图91A显示整个组织核心。图91B显示组织的特定区域的40X放大。抗体1E4结合包含序列QFNQYKTEA的全部或一部分的表位。抗体1E4可以结合N-10肽，但同样结合C-10肽。如从图中可以看出的那样，1E4结合正常心脏组织。如可以看出的那样，这些抗体不具有癌症特异性，并且显示出与正常心脏组织的一些结合。
图92A-92H显示用本发明的不同抗体染色的正常心脏组织标本的照片。图92A-92D显示整个组织核心。图92E-92HL显示组织的特定区域的40X放大。图92A和图92E显示用18B4染色。图92B和图92F显示用31A1染色。图92C和图92G显示用32C1染色。图92D和图92H显示用29H1染色。这些抗体结合包含序列GTINVHDVET的全部或一部分的表位，其为PSMGFR肽的最N-末端部分。这些抗体都不能结合N-10肽。如从图中可以看出的那样，除18B4之外的所有这些抗体都显示与正常心脏组织的结合。
图93A-93D显示用本发明的抗体染色的正常心脏组织标本的照片。图93A-93B显示整个组织核心。图93C-93D显示组织的特定区域的40X放大。图93A和图93C显示用抗体8A9染色。图93B和图93D显示用抗体17H6染色。两种抗体均结合PSMGFR区域之外的表位，并且包含序列VQLTLAFRE的全部或一部分。如从图中可以看出的那样，两种抗体均显示出与正常心脏组织的强结合。
图94A-94B显示用本发明抗体45C11染色的正常心脏组织标本的照片。图94A显示整个组织核心。图94B显示组织的特定区域的40X放大。抗体45C11结合PSMGFR区域之外的表位，并且包含序列SNIKFRPGSVV的全部或一部分。抗体45C11不可结合N-10肽。如从图中可以看出的那样，45C11强结合正常心脏组织。
图95A-95H显示用本发明的不同抗体染色的正常肝组织标本的照片。图95A-95D显示整个组织核心。图95E-95HL显示组织的特定区域的40X放大。图95A和图95E显示用参考抗体MNC2-scFv染色。图95B和图95F显示用参考抗体MNE6染色。图95C和图95G显示用20A10染色。图95D和图95H显示用3C2B1染色。这些抗体结合包含序列FPFS或PFPFSAQSGA的全部或一部分的表位。所有这些抗体全部能够结合PSMGFR肽，结合N-10肽但不结合C-10肽。此外，这些抗体破坏NME7AB与MUC1*细胞外结构域的结合，如通过PSMGFR肽举例说明。此外，当切割酶是MMP9时，这些抗体识别MUC1切割产物。如从图中可以看出的那样，这些抗体显示不结合正常肝组织。
图96A-96D显示用本发明的不同抗体染色的正常肝组织标本的照片。图96A-96B显示整个组织核心。图96C-96D显示组织的特定区域的40X放大。图96A和图96C显示用MNC3染色。图96B和图96D显示用25E6染色。这些抗体结合包含序列ASRYNLT的全部或一部分的表位。这些抗体全部能够结合PSMGFR肽，结合N-10肽但同样结合C-10肽。如可以看出的那样，这些抗体不具有癌症特异性，并且显示出与正常肝组织的一些结合。
图97A-97B显示用本发明抗体1E4染色的正常肝组织标本的照片。图97A显示整个组织核心。图97B显示组织的特定区域的40X放大。抗体1E4结合包含序列QFNQYKTEA的全部或一部分的表位。抗体1E4可以结合N-10肽，但同样结合C-10肽。如从图中可以看出的那样，1E4结合正常肝组织。
图98A-98H显示用本发明的不同抗体染色的正常肝组织标本的照片。图98A-98D显示整个组织核心。图98E-98H显示组织的特定区域的40X放大。图98A和图98E显示用18B4染色。图98B和图98F显示用31A1染色。图98C和图98G显示用32C1染色。图98D和图98H显示用29H1染色。这些抗体结合包含序列GTINVHDVET的全部或一部分的表位，其为PSMGFR肽的最N-末端部分。这些抗体都不能结合N-10肽。如从图中可以看出的那样，32C1显示出与正常肝的一些结合，而29H1显示出与正常肝组织的极强结合。
图99A-99D显示用本发明的抗体染色的正常肝组织标本的照片。图99A-99B显示整个组织核心。图99C-99D显示组织的特定区域的40X放大。图99A和图99C显示用抗体8A9染色。图99B和图99D显示用抗体17H6染色。两种抗体均结合PSMGFR区域之外的表位，并且包含序列VQLTLAFRE的全部或一部分。如从图中可以看出的那样，8A9显示与正常肝组织的强结合。17H6是弱抗体并且可能它在本研究中没有以足够高的浓度使用。
图100A-100B显示用本发明抗体45C11染色的正常肝组织标本的照片。图100A显示整个组织核心。图100B显示组织的特定区域的40X放大。抗体45C11结合PSMGFR区域之外的表位，并且包含序列SNIKFRPGSVV的全部或一部分。抗体45C11不可结合N-10肽。如从图中可以看出的那样，45C11强结合正常肝组织。
图101A-101H显示用本发明的不同抗体染色的正常肺组织标本的照片。图101A-101D显示整个组织核心。图101E-101H显示组织的特定区域的40X放大。图101A和图101E显示用MNC2-scFv染色。图101B和图101F显示用MNE6染色。图101C和图101G显示用20A10染色。图101D和图101H显示用3C2B1染色。这些抗体结合包含序列FPFS或PFPFSAQSGA的全部或一部分的表位。所有这些抗体全部能够结合PSMGFR肽，结合N-10肽但不结合C-10肽。此外，这些抗体破坏NME7AB与MUC1*细胞外结构域的结合，如通过PSMGFR肽举例说明。此外，当切割酶是MMP9时，这些抗体识别MUC1切割产物。如从图中可以看出的那样，这些抗体显示不结合正常肺组织。
图102A-102D显示用本发明的不同抗体染色的正常肺组织标本的照片。图102A-102B显示整个组织核心。图102C-102D显示组织的特定区域的40X放大。图102A和图102C显示用MNC3染色。图102B和图102D显示用25E6染色。这些抗体结合包含序列ASRYNLT的全部或一部分的表位。这些抗体全部能够结合PSMGFR肽，结合N-10肽但同样结合C-10肽。如可以看出的那样，这些抗体不具有癌症特异性，并且显示出与正常肺组织的一些结合。
图103A-103B显示用本发明抗体1E4染色的正常肺组织标本的照片。图103A显示整个组织核心。图103B显示组织的特定区域的40X放大。抗体1E4结合包含序列QFNQYKTEA的全部或一部分的表位。抗体1E4可以结合N-10肽，但同样结合C-10肽。
图104A-104H显示用本发明的不同抗体染色的正常肺组织标本的照片。图104A-104D显示整个组织核心。图104E-104H显示组织的特定区域的40X放大。图104A和图104E显示用18B4染色。图104B和图104F显示用31A1染色。图104C和图104G显示用32C1染色。图104D和图104H显示用29H1染色。这些抗体结合包含序列GTINVHDVET的全部或一部分的表位，其为PSMGFR肽的最N-末端部分。这些抗体都不能结合N-10肽。如从图中可以看出的那样，所有这些抗体显示与正常肺组织的强结合。
图105A-105D显示用本发明的抗体染色的正常肺组织标本的照片。图105A-105B显示整个组织核心。图105C-105D显示组织的特定区域的40X放大。图105A和图105C显示用抗体8A9染色。图105B和图105D显示用抗体17H6染色。两种抗体均结合PSMGFR区域之外的表位，并且包含序列VQLTLAFRE的全部或一部分。如从图中可以看出的那样，8A9显示与正常肺组织的强结合。17H6是弱抗体并且可能它在本研究中没有以足够高的浓度使用。
图106A-106B显示用本发明抗体45C11染色的正常肺组织标本的照片。图106A显示整个组织核心。图106B显示组织的特定区域的40X放大。抗体45C11结合PSMGFR区域之外的表位，并且包含序列SNIKFRPGSVV的全部或一部分。抗体45C11不可结合N-10肽。如从图中可以看出的那样，45C11结合正常肺组织。
图107A-107H显示用本发明的不同抗体染色的正常骨髓组织标本的照片。图107A-107D显示整个组织核心。图107E-107H显示组织的特定区域的40X放大。图107A和图107E显示用MNC2-scFv染色。图107B和图107F显示用MNE6染色。图107C和图107G显示用20A10染色。图107D和图107H显示用3C2B1染色。这些抗体结合包含序列FPFS或PFPFSAQSGA的全部或一部分的表位。所有这些抗体全部能够结合PSMGFR肽，结合N-10肽但不结合C-10肽。此外，这些抗体破坏NME7AB与MUC1*细胞外结构域的结合，如通过PSMGFR肽举例说明。此外，当切割酶是MMP9时，这些抗体识别MUC1切割产物。如从图中可以看出的那样，这些抗体显示不结合正常骨髓组织。
图108A-108D显示用本发明的不同抗体染色的正常骨髓组织标本的照片。图108A-108B显示整个组织核心。图108C-108D显示组织的特定区域的40X放大。图108A和图108C显示用MNC3染色。图108B和图108D显示用25E6染色。这些抗体结合包含序列ASRYNLT的全部或一部分的表位。这些抗体全部能够结合PSMGFR肽，结合N-10肽但同样结合C-10肽。
图109A-109B显示用本发明抗体1E4染色的正常骨髓组织标本的照片。图109A显示整个组织核心。图109B显示组织的特定区域的40X放大。抗体1E4结合包含序列QFNQYKTEA的全部或一部分的表位。抗体1E4可以结合N-10肽，但同样结合C-10肽。1E4结合正常骨髓。
图110A-110H显示用本发明的不同抗体染色的正常骨髓组织标本的照片。图110A-110D显示整个组织核心。图110E-110H显示组织的特定区域的40X放大。图110A和图110E显示用18B4染色。图110B和图110F显示用31A1染色。图110C和图110G显示用32C1染色。图110D和图110H显示用29H1染色。这些抗体结合包含序列GTINVHDVET的全部或一部分的表位，其为PSMGFR肽的最N-末端部分。这些抗体都不能结合N-10肽。如从图中可以看出的那样，所有这些抗体显示与正常骨髓组织的强结合。
图111A-111D显示用本发明的抗体染色的正常骨髓组织标本的照片。图111A-111B显示整个组织核心。图111C-111D显示组织的特定区域的40X放大。图111A和图111C显示用抗体8A9染色。图111B和图111D显示用抗体17H6染色。两种抗体均结合PSMGFR区域之外的表位，并且包含序列VQLTLAFRE的全部或一部分。如从图中可以看出的那样，8A9显示与正常骨髓组织的强结合。17H6是弱抗体并且可能它在本研究中没有以足够高的浓度使用。
图112A-112B显示用本发明抗体45C11染色的正常骨髓组织标本的照片。图112A显示整个组织核心。图112B显示组织的特定区域的40X放大。抗体45C11结合PSMGFR区域之外的表位，并且包含序列SNIKFRPGSVV的全部或一部分。抗体45C11不可结合N-10肽。如从图中可以看出的那样，45C11结合正常骨髓组织。
图113A-113C显示用0.25ug/mL的抗PSMGFR抗体20A10染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图113A显示组织微阵列的照片。图113B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图113C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图114A-114X显示用0.25ug/mL的抗PSMGFR抗体20A10染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图114A和图114E是肾上腺。图114B和图114F是乳房。图114C和图114G是输卵管。图114D和图114H是肾。图114I和图114M是心肌。图114J和图114N是肝。图114K和图114O是肺。图114L和图114P是输尿管。图114Q和图114U是眼睛。图114R和图114V是大脑皮质。图114S和图114W是骨髓。图114T和图114X是骨骼肌。
图115A-115C显示用0.25ug/mL的抗PSMGFR抗体20A10染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图115A显示组织微阵列的照片。图115B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图115C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图116A-116F显示用0.25ug/mL的抗PSMGFR抗体20A10染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图116A和图116D是2级浸润性导管癌的照片。图116B和图116E是2级浸润性导管癌的照片。图116C和图116F是2级浸润性导管癌的照片。
图117A-117C显示用0.25ug/mL的抗PSMGFR抗体20A10染色的胰腺癌组织阵列PA805c的照片、阵列图和描述。图117A显示组织微阵列的照片。图117B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图117C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图118A-118F显示用0.25ug/mL的抗PSMGFR抗体20A10染色的胰腺癌组织阵列PA805c的特定组织的照片，放大至6X和20X。图118A和图118D是2级乳头状腺癌的照片。图118B和图118E是2-3级导管癌的照片。图118C和图118F是3级浸润性腺癌的照片。
图119A-119C显示用0.25ug/mL的抗PSMGFR抗体20A10染色的食道癌组织阵列BC001113的照片、阵列图和描述。图119A显示组织微阵列的照片。图119B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图119C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图120A-120F显示用0.25ug/mL的抗PSMGFR抗体20A10染色的食道癌组织阵列BC001113的特定组织的照片，放大至6X和20X。图120A和图120D是位置A1处的标本的照片。图120B和图120E是位置A7处的标本的照片。图120C和图120F是位置A8处的标本的照片。
图121A-121C显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图121A显示组织微阵列的照片。图121B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图121C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图122A-122X显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图122A和图122E是肾上腺。图122B和图122F是乳房。图122C和图122G是输卵管。图122D和图122H是肾。图122I和图122M是心肌。图122J和图122N是肝。图122K和图122O是肺。图122L和图122P是输尿管。图122Q和图122U是眼睛。图122R和图122V是大脑皮质。图122S和图122W是骨髓。图122T和图122X是骨骼肌。
图123A-123C显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图123A显示组织微阵列的照片。图123B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图123C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图124A-124F显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图124A和图124D是2级腺癌的照片。图124B和图124E是2级腺癌的照片。图124C和图124F是2级腺癌的照片。
图125A-125C显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图125A显示组织微阵列的照片。图125B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图125C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图126A-126F显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图126A和图126D是2级浸润性导管癌的照片。图126B和图126E是2级浸润性导管癌的照片。图126C和图126F是2级浸润性癌的照片。
图127A-127C显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图127A显示组织微阵列的照片。图127B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图127C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图128A-128X显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图128A和图128E是肾上腺。图128B和图128F是乳房。图128C和图128G是输卵管。图128D和图128H是肾。图128I和图128M是心肌。图128J和图128N是肝。图128K和图128O是肺。图128L和图128P是输尿管。图128Q和图128U是眼睛。图128R和图128V是大脑皮质。图128S和图128W是骨髓。图128T和图128X是骨骼肌。
图129A-129C显示用1-20ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图129A显示组织微阵列的照片。图129B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图129C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图130A-130F显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图130A和图130D是2级腺癌的照片。图130B和图130E是2级腺癌的照片。图130C和图130F是2级腺癌的照片。
图131A-131C显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图131A显示组织微阵列的照片。图131B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图131C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图132A-132F显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图132A和图132D是2级浸润性导管癌的照片。图132B和图132E是2级浸润性导管癌的照片。图132C和图132F是2级浸润性癌的照片。
图133A-133C显示用10ug/mL的抗PSMGFR抗体18B4染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图133A显示组织微阵列的照片。图133B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图133C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图134A-134X显示用10ug/mL的抗PSMGFR抗体18B4染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图134A和图134E是肾上腺。图134B和图134F是乳房。图134C和图134G是输卵管。图134D和图134H是肾。图134I和图134M是心肌。图134J和图134N是肝。图134K和图134O是肺。图134L和图134P是输尿管。图134Q和图134U是眼睛。图134R和图134V是大脑皮质。图134S和图134W是骨髓。图134T和图134X是骨骼肌。
图135A-135C显示用10ug/mL的抗PSMGFR抗体18B4染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图135A显示组织微阵列的照片。图135B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图135C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图136A-136F显示用10ug/mL的抗PSMGFR抗体18B4染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图136A和图136D是2级浸润性导管癌的照片。图136B和图136E是2级浸润性导管癌的照片。图136C和图136F是2级浸润性导管癌的照片。
图137A-137C显示用10ug/mL的抗PSMGFR抗体18B4染色的食道癌组织阵列BC001113的照片、阵列图和描述。图137A显示组织微阵列的照片。图137B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图137C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图138A-138F显示用10ug/mL的抗PSMGFR抗体18B4染色的食道癌组织阵列BC001113的特定组织的照片，放大至6X和20X。图138A和图138D是位置A1处的标本的照片。图138B和图138E是位置A7处的标本的照片。图138B和图138F是位置A8处的标本的照片。
图139A-139C显示用10ug/mL的抗PSMGFR抗体18G12染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图139A显示组织微阵列的照片。图139B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图139C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图140A-140X显示用10ug/mL的抗PSMGFR抗体18G12染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图140A和图140E是肾上腺。图140B和图140F是乳房。图140C和图140G是输卵管。图140D和图140H是肾。图140I和图140M是心肌。图140J和图140N是肝。图140K和图140O是肺。图140L和图140P是输尿管。图140Q和图140U是眼睛。图140R和图140V是大脑皮质。图140S和图140W是骨髓。图140T和图140X是骨骼肌。
图141A-141C显示用15ug/mL的抗PSMGFR抗体18G12染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图141A显示组织微阵列的照片。图141B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图141C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图142A-142F显示用15ug/mL的抗PSMGFR抗体18G12染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图142A和图142D是2级浸润性导管癌的照片。图142B和图142E是2级浸润性导管癌的照片。图142C和图142F是2级浸润性导管癌的照片。
图143A-143C显示用15ug/mL的抗PSMGFR抗体18G12染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图143A显示组织微阵列的照片。图143B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图143C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图144A-144F显示用15ug/mL的抗PSMGFR抗体18G12染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图144A和图144D是2级腺癌的照片。图144B和图144E是2级腺癌的照片。图144C和图144F是具有淋巴结受累的2-3级腺癌的照片。
图145A-145C显示用30ug/mL的抗PSMGFR抗体18G12染色的食道癌组织阵列BC001113的照片、阵列图和描述。图145A显示组织微阵列的照片。图145B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图145C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图146A-146F显示用30ug/mL的抗PSMGFR抗体18G12染色的食道癌组织阵列BC001113的特定组织的照片，放大至6X和20X。图146A和图146D是位置A1处的标本的照片。图146B和图146E是位置A7处的标本的照片。图146C和图146F是位置A8处的标本的照片。
图147A-147C显示用5.0ug/mL的抗PSMGFR抗体25E6染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图147A显示组织微阵列的照片。图147B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图147C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图148A-148X显示用5.0ug/mL的抗PSMGFR抗体25E6染色的FDA正常组织阵列1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图148A和图148E是肾上腺。图148B和图148F是乳房。图148C和图148G是输卵管。图148D和图148H是肾。图148I和图148M是心肌。图148J和图148N是肝。图148K和图148O是肺。图148L和图148P是输尿管。图148Q和图148U是眼睛。图148R和图148V是大脑皮质。图148S和图148W是骨髓。图148T和图148X是骨骼肌。
图149A-149C显示用5.0ug/mL的抗PSMGFR抗体25E6染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图149A显示组织微阵列的照片。图149B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图149C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图150A-150F显示用5.0ug/mL的抗PSMGFR抗体25E6染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图150A和图150D是2级浸润性导管癌的照片。图150B和图150E是2级浸润性导管癌的照片。图150C和图150F是2级浸润性导管癌的照片。
图151A-151C显示用5.0ug/mL的抗PSMGFR抗体25E6染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图151A显示组织微阵列的照片。图151B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图151C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图152A-152F显示用5.0ug/mL的抗PSMGFR抗体25E6染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图152A和图152D是2级腺癌的照片。图152B和图152E是1级腺癌的照片。图152C和图152F是1级腺癌的照片。
图153A-153C显示用15.0ug/mL的抗PSMGFR抗体28F9染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图153A显示组织微阵列的照片。图153B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图153C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图154A-154X显示用15.0ug/mL的抗PSMGFR抗体28F9染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图154A和图154E是肾上腺。图154B和图154F是乳房。图154C和图154G是输卵管。图154D和图154H是肾。图154I和图154M是心肌。图154J和图154N是肝。图154K和图154O是肺。图154L和图154P是输尿管。图154Q和图154U是眼睛。图154R和图154V是大脑皮质。图154S和图154W是骨髓。图154T和图154X是骨骼肌。
图155A-155C显示用15.0ug/mL的抗PSMGFR抗体28F9染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图155A显示组织微阵列的照片。图155B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图155C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图156A-156F显示用15.0ug/mL的抗PSMGFR抗体28F9染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图156A和图156D是2级浸润性导管癌的照片。图156B和图156E是2级浸润性导管癌的照片。图156C和图156F是2级浸润性导管癌的照片。
图157A-157C显示用7.5ug/mL的N+20/C-27抗体1E4染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图157A显示组织微阵列的照片。图157B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图157C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图158A-158X显示用7.5ug/mL的N+20/C-27抗体1E4染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图158A和图158E是肾上腺。图158B和图158F是乳房。图158C和图158G是输卵管。图158D和图158H是肾。图158I和图158M是心肌。图158J和图158N是肝。图158K和图158O是肺。图158L和图158P是输尿管。图158Q和图158U是眼睛。图158R和图158V是大脑皮质。图158S和图158W是骨髓。图158T和图158X是骨骼肌。
图159A-159C显示用10.0ug/mL的N+20/C-27抗体1E4染色的乳腺癌组织阵列BR1007的照片、阵列图和描述。图159A显示组织微阵列的照片。图159B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图159C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图160A-160F显示用10.0ug/mL的N+20/C-27抗体1E4染色的乳腺癌组织阵列BR1007的特定组织的照片，放大至6X和20X。图160A和图160D是具有阳性淋巴结的2级浸润性导管癌的照片。图160B和图160E是2级浸润性导管癌的照片。图160C和图160F是2级浸润性导管癌的照片。
图161A-161C显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体29H1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图161A显示组织微阵列的照片。图161B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图161C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图162A-162X显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体29H1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图162A和图162E是肾上腺。图162B和图162F是乳房。图162C和图162G是输卵管。图162D和图162H是肾。图162I和图162M是心肌。图162J和图162N是肝。图162K和图162O是肺。图162L和图162P是输尿管。图162Q和图162U是眼睛。图162R和图162V是大脑皮质。图162S和图162W是骨髓。图162T和图162X是骨骼肌。
图163A-163C显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体29H1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图163A显示组织微阵列的照片。图163B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图163C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图164A-164F显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体29H1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图164A和图164D是2级浸润性导管癌的照片。图164B和图164E是2级浸润性导管癌的照片。图164C和图164F是2级浸润性导管癌的照片。
图165A-165C显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体29H1染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图165A显示组织微阵列的照片。图165B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图165C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图166A-166F显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体29H1染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图166A和图166D是2级腺癌的照片。图166B和图166E是2级腺癌的照片。图166C和图166F是3级腺癌的照片。
图167A-167C显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体31A1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图167A显示组织微阵列的照片。图167B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图167C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图168A-168X显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体31A1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图168A和图168E是肾上腺。图168B和图168F是乳房。图168C和图168G是输卵管。图168D和图168H是肾。图168I和图168M是心肌。图168J和图168N是肝。图168K和图168O是肺。图168L和图168P是输尿管。图168Q和图168U是眼睛。图168R和图168V是大脑皮质。图168S和图168W是骨髓。图168T和图168X是骨骼肌。
图169A-169C显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体31A1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图169A显示组织微阵列的照片。图169B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图169C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图170A-170F显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体31A1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图170A和图170D是2级浸润性导管癌的照片。图170B和图170E是2级浸润性导管癌的照片。图170C和图170F是2级浸润性导管癌的照片。
图171A-171C显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体31A1染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图171A显示组织微阵列的照片。图171B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图171C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图172A-172F显示用0.5ug/mL的N+20/C-27抗体31A1染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图172A和图172D是1级腺癌的照片。图172B和图172E是2级腺癌的照片。图172C和图172F是3级腺癌的照片。
图173A-173C显示用0.25ug/mL的N+20/C-27抗体32C1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图173A显示组织微阵列的照片。图173B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图173C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图174A-174X显示用0.25ug/mL的N+20/C-27抗体32C1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图174A和图174E是肾上腺。图174B和图174F是乳房。图174C和图174G是输卵管。图174D和图174H是肾。图174I和图174M是心肌。图174J和图174N是肝。图174K和图174O是肺。图174L和图174P是输尿管。图174Q和图174U是眼睛。图174R和图174V是大脑皮质。图174S和图174W是骨髓。图174T和图174X是骨骼肌。
图175A-175C显示用5.0ug/mL的N+20/C-27抗体32C1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片、阵列图和描述。图175A显示组织微阵列的照片。图175B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图175C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图176A-176F显示用5.0ug/mL的N+20/C-27抗体32C1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片，放大至6X和20X。图176A和图176D是2级浸润性导管癌的照片。图176B和图176E是2级浸润性导管癌的照片。图176C和图176F是2级浸润性导管癌的照片。
图177A-177C显示用1.0ug/mL的N+20/C-27抗体32C1染色的食道癌组织阵列ES1001的照片、阵列图和描述。图177A显示组织微阵列的照片。图177B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图177C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图178A-178F显示用1.0ug/mL的N+20/C-27抗体32C1染色的食道癌组织阵列BC001113的特定组织的照片，放大至6X和20X。图178A和图178D是鳞状细胞癌的照片。图178B和图178E是腺癌的照片。图178C和图178F是鳞状细胞癌的照片。
图179A-179C显示用12.5ug/mL的N+20/C-27抗体45C11染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图179A显示组织微阵列的照片。图179B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图179C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图180A-180X显示用12.5ug/mL的N+20/C-27抗体45C11染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图180A和图180E是肾上腺。图180B和图180F是乳房。图180C和图180G是输卵管。图180D和图180H是肾。图180I和图180M是心肌。图180J和图180N是肝。图180K和图180O是肺。图180L和图180P是输尿管。图180Q和图180U是眼睛。图180R和图180V是大脑皮质。图180S和图180W是骨髓。图180T和图180X是骨骼肌。
图181A-181C显示用10.0ug/mL的N+20/C-27抗体45C11染色的乳腺癌组织阵列BR1007的照片、阵列图和描述。图181A显示组织微阵列的照片。图181B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图181C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图182A-182F显示用10.0ug/mL的N+20/C-27抗体45C11染色的乳腺癌组织阵列BR1007的特定组织的照片，放大至6X和20X。图182A和图182D是具有阳性淋巴结的2级浸润性导管癌的照片。图182B和图182E是2级浸润性导管癌的照片。图182C和图182F是2级浸润性导管癌的照片。
图183A-183C显示用12.5ug/mL的N+20/C-27抗体45C11染色的胰腺癌组织阵列PA805c的照片、阵列图和描述。图183A显示组织微阵列的照片。图183B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图183C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图184A-184F显示用12.5ug/mL的N+20/C-27抗体45C11染色的胰腺癌组织阵列PA805c的特定组织的照片，放大至6X和20X。图184A和图184D是2级乳头状腺癌的照片。图184B和图184E是2-3级导管癌的照片。图184C和图184F是3级浸润性腺癌的照片。
图185A-185C显示用10.0ug/mL的N+9/C-9抗体3C5染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图185A显示组织微阵列的照片。图185B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图185C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图186A-186X显示用10.0ug/mL的N+9/C-9抗体3C5染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图186A和图186E是肾上腺。图186B和图186F是乳房。图186C和图186G是输卵管。图186D和图186H是肾。图186I和图186M是心肌。图186J和图186N是肝。图186K和图186O是肺。图186L和图186P是输尿管。图186Q和图186U是眼睛。图186R和图186V是大脑皮质。图186S和图186W是骨髓。图186T和图186X是骨骼肌。
图187A-187C显示用10.0ug/mL的N+9/C-9抗体3C5染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图187A显示组织微阵列的照片。图187B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图187C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图188A-188F显示用10.0ug/mL的N+9/C-9抗体3C5染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图188A和图188D是2级腺癌的照片。图188B和图188E是2级腺癌的照片。图188C和图188F是具有淋巴结受累的2-3级腺癌的照片。
图189A-189C显示用15.0ug/mL的N+9/C-9抗体8A9染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图189A显示组织微阵列的照片。图189B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图189C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图190A-190X显示用15.0ug/mL的N+9/C-9抗体8A9染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图190A和图190E是肾上腺。图190B和图190F是乳房。图190C和图190G是输卵管。图190D和图190H是肾。图190I和图190M是心肌。图190J和图190N是肝。图190K和图190O是肺。图190L和图190P是输尿管。图190Q和图190U是眼睛。图190R和图190V是大脑皮质。图190S和图190W是骨髓。图190T和图190X是骨骼肌。
图191A-191C显示用15.0ug/mL的N+9/C-9抗体8A9染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图191A显示组织微阵列的照片。图191B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图191C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图192A-192F显示用15.0ug/mL的N+9/C-9抗体8A9染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图192A和图192D是2级腺癌的照片。图192B和图192E是2级腺癌的照片。图192C和图192F是2级腺癌的照片。
图193A-193C显示用30.0ug/mL的N+9/C-9抗体17H6染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图193A显示组织微阵列的照片。图193B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。
图193C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图194A-194X显示用30.0ug/mL的N+9/C-9抗体17H6染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图194A和图194E是肾上腺。图194B和图194F是乳房。图194C和图194G是输卵管。图194D和图194H是肾。图194I和图194M是心肌。图194J和图194N是肝。图194K和图194O是肺。图194L和图194P是输尿管。图194Q和图194U是眼睛。图194R和图194V是大脑皮质。图194S和图194W是骨髓。图194T和图194X是骨骼肌。
图195A-195C显示用30.0ug/mL的N+9/C-9抗体17H6染色的胰腺癌组织阵列PA805c的照片、阵列图和描述。图195A显示组织微阵列的照片。图195B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图195C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图196A-196F显示用30.0ug/mL的N+9/C-9抗体17H6染色的胰腺癌组织阵列PA805c的特定组织的照片，放大至6X和20X。图196A和图196D是2级乳头状腺癌的照片。图196B和图196E是具有淋巴结受累的2-3级导管癌的照片。图196C和图196F是3级浸润性腺癌的照片。
图197A-197C显示用5.0ug/mL的N+9/C-9抗体39H5染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片、阵列图和描述。图197A显示组织微阵列的照片。图197B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图197C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图198A-198X显示用5.0ug/mL的N+9/C-9抗体39H5染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，放大至6X和20X。图198A和图198E是肾上腺。图198B和图198F是乳房。图198C和图198G是输卵管。图198D和图198H是肾。图198I和图198M是心肌。图198J和图198N是肝。图198K和图198O是肺。图198L和图198P是输尿管。图198Q和图198U是眼睛。图198R和图198V是大脑皮质。图198S和图198W是骨髓。图198T和图198X是骨骼肌。
图199A-199C显示用5.0ug/mL的N+9/C-9抗体39H5染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片、阵列图和描述。图199A显示组织微阵列的照片。图199B显示带有缩写的组织描述词的阵列图。图199C详细描述了具有非识别性供体数据的组织微阵列。
图200A-200F显示用5.0ug/mL的N+9/C-9抗体39H5染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片，放大至6X和20X。图200A和图200D是2级腺癌的照片。图200B和图200E是2级腺癌的照片。图200C和图200F是2级腺癌的照片。
图201A-201C显示ELISA测定的图，所述测定确定通过用PSMGFR肽免疫动物所生成的另一组抗体的结合。图201A显示与PSMGFR肽的结合。图201B显示与N-10肽的结合。图201C显示与C-10肽的结合。如可以看出的那样，没有抗体结合C-10肽。F3、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11全部都结合PSMGFR肽和N-10肽。
图202A-202C显示用单克隆抗体1E4、单克隆抗体18B4或多克隆抗PSMGFR抗体SDIX染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片。18B4结合PSMGFR肽的最N-末端部分的GTINVHDVET表位，而1E4抗体结合紧邻18B4表位并且在其C-末端的QFNQYKTEA表位。
图203A-203F显示胰腺癌阵列PA1003的位置A2处的组织标本的放大图像。图203A和图203B显示用抗体1E4染色的标本。图203C和图203D显示用抗体18B4染色的标本。图203E和图203F显示用多克隆抗体SDIX染色的标本。
图204A-204D显示胰腺阵列PA1003的位置D4处的组织标本的放大图像。图204A和图204B显示用抗体18B4染色的标本。图204C和图204D显示用多克隆抗体SDIX染色的标本。
图205A-205D显示胰腺癌阵列PA1003的位置E1处的组织标本的放大图像。图205A和图205B显示用抗体18B4染色的标本。图205C和图205D显示用多克隆抗体SDIX染色的标本。
图206A-206D显示胰腺癌阵列PA1003的位置C3处的组织标本的放大图像。图206A和图206B显示用抗体1E4染色的标本。图206C和图206D显示用多克隆抗体SDIX染色的标本。
图207A-207D显示胰腺癌阵列PA1003的位置D1处的组织标本的放大图像。图207A和图207B显示用抗体1E4染色的标本。图207C和图207D显示用多克隆抗体SDIX染色的标本。
图208A-208C显示胰腺癌阵列PA1003的照片。图208A显示用多克隆抗体SDIX染色的标本。图208B显示用抗体20A10染色的标本。图208C显示用抗体29H1染色的标本。
图209A-209D显示用各种抗体染色的食道癌阵列ES1001的照片。图209A显示用多克隆抗体SDIX染色的阵列。图209B显示用抗体20A10染色的阵列。图209C显示用抗体29H1染色的阵列。图209D显示用抗体31A1染色的阵列。
图210A-210C显示用各种抗体染色的胰腺癌阵列PA1003的照片。图210A显示用多克隆抗体SDIX染色的阵列。图210B显示用抗体20A10染色的阵列。图210C显示用抗体29H1染色的阵列。
图211A-211C显示ELISA实验的图，所述实验测量分泌到MUC1*阳性癌细胞与huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物的条件培养基中的IL-18的量，其中细胞还携带NFAT诱导型IL-18。图211A显示分泌到T47D乳腺癌细胞与未转导的人T细胞的共培养物的上清液中的IL-18的图。图211B显示分泌到T47D乳腺癌细胞与huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物的上清液中的IL-18的图，huMNC2-CAR44 T细胞还携带NFAT诱导型IL-18基因，其插入到Foxp3增强子的一部分中。图211C显示分泌到T47D乳腺癌细胞与huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物的上清液中的IL-18的图，huMNC2-CAR44 T细胞还携带NFAT诱导型IL-18基因，其插入到IL-2增强子的一部分中。
图212A-212X显示掺杂有不同百分比的被工程化成表达更多MUC1*的T47D细胞(绿色)的T47D乳腺癌细胞(红色)的照片。靶癌细胞与具有NFAT诱导型IL-18的huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养，其中IL-18基因插入到Foxp3增强子/启动子或IL-2增强子/启动子中。图212A-212C、212I-212K和212Q-212S显示与未转导的T细胞一起共培养的癌细胞。图212D-212F、212L-212N和212T-212V显示与NFAT诱导型IL-18基因插入到Foxp3增强子/启动子中的hiMNC2-CAR44 T细胞一起共培养的癌细胞。图212G-212H、212O-212P和212W-212X显示与NFAT诱导型IL-18基因插入到IL-2增强子/启动子中的hiMNC2-CAR44 T细胞一起共培养的癌细胞。
图213A-213B显示ELISA实验的图，其中测量了与MUC1*阳性癌细胞或MUC1阴性非癌性细胞一起共培养的具有NFAT诱导型IL-18基因(其插入到Foxp3增强子或启动子中)的huMNC1-CAR44T细胞的分泌到条件培养基中的IL-18的水平。图213A显示与T47D乳腺癌细胞一起共培养的具有NFAT诱导型IL-18的huMNC2-CAR44T细胞的IL-18分泌，其中所述群体已掺杂有5％、10％或30％的用甚至更多MUC1*转染的T47D细胞。图213B显示与非癌性的MUC1阴性HEK293细胞一起共培养的具有NFAT诱导型IL-18的huMNC2-CAR44 T细胞的IL-18分泌，其中所述细胞群体已掺杂有5％、10％或30％的用更多MUC1*转染的T47D细胞。
图214A-214X显示T47D乳腺癌细胞(红色)或非癌性HEK293细胞(也是红色)的照片，其中两种细胞类型都掺杂有不同百分比的被工程化成表达更多MUC1*的T47D细胞(绿色)。这些靶癌细胞与具有NFAT诱导型IL-18的huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养，其中IL-18基因插入到Foxp3增强子/启动子中。图214A-214F显示没有掺杂被工程化成表达高MUC1*密度的T47D细胞的T47D细胞或HEK293细胞。图214G-214L显示掺杂有5％的被工程化成表达高MUC1*密度的T47D细胞的T47D细胞或HEK293细胞。图214M-214R显示掺杂有10％的被工程化成表达高MUC1*密度的T47D细胞的T47D细胞或HEK293细胞。图214S-214X显示掺杂有30％的被工程化成表达高MUC1*密度的T47D细胞的T47D细胞或HEK293细胞。图214A-B、GH、M-N和S-T显示T47D乳腺癌细胞。图214C-F、I-L、O-R和U-X显示HEK293细胞。如从图中可以看出的那样，IL-18的诱导分泌导致低MUC1*密度T47D细胞被杀伤，但不诱导MUC1*阴性HEK293细胞的非特异性杀伤。
图215A-215C显示重链CDR的共有序列，其中针对结合PSMGFR和N-末端延伸的PSMGFR肽中相同表位的每组抗体生成了共有序列。图215A显示重链CDR1的共有序列。图215B显示重链CDR2的共有序列。图215C显示重链CDR3的共有序列。
图216A-216C显示轻链CDR的共有序列，其中针对结合PSMGFR和N-末端延伸的PSMGFR肽中相同表位的每组抗体生成了共有序列。图216A显示轻链CDR1的共有序列。图216B显示轻链CDR2的共有序列。图216C显示轻链CDR3的共有序列。
图217显示双特异性抗体和其它双特异性免疫治疗剂的替代形式，分为五个主要类别：BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白和BsAb缀合物。重链以深蓝色、深粉色和深绿色显示，并且对应的轻链以相同颜色的浅色阴影显示。连接肽接头由黑色细线显示，并且工程化的二硫键由绿色细线表示。每个免疫球蛋白的近似分子量显示为假设约12.5kDa。已进入临床测试的BsAb形式突出显示(*)。为了解释这个图的描述中对颜色的引用，读者可以参考文章的网络版本，Spiess等人Molecular Immunology 67,95-106(2015)，其内容以引用的方式整体并入，特别是参考关于Spiess等人的图1的描述，以及对各种制造和使用双特异性抗体片段的方法的其它描述。
图218显示通过IVIS仪器测量的肿瘤体积的图，其中肿瘤细胞被遗传修饰成表达荧光素酶。在镇静的动物中测量光发射前10分钟注射底物虫荧光素。在实验的第1天，将动物被皮下注射250,000个人乳房肿瘤细胞。肿瘤是异质性的，包含两种不同的肿瘤细胞类型。第一个肿瘤细胞群体是T47D-wt，是一种表达全长MUC1和生长因子受体形式MUC1*的乳腺癌细胞系，我们将其工程化成表达mCherry荧光。第二个肿瘤细胞群体是相同的T47D乳腺癌细胞，不同的是它们被稳定转导以表达甚至更多MUC1*和GFP荧光，此处称为T47D-MUC1*。在此实验中，将动物植入T47D-wt加T47D-MUC1*，其中T47D-MUC1*的群体占肿瘤群体的30％、15％或7.5％。然后向动物一次性注射PBS、huMNC2-41BB-3z CAR T细胞(4-1BB)、huMNC2-CD28-3z CAR T细胞(CD28)或huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞(CD28-1XX或1XX)。将CAR T细胞以10:1、5:1或1:1的效应子与靶标的比率(E:T)注射到尾部静脉中。
图219A-219B显示IVIS照片和IVIS肿瘤体积测量的图。图219A显示植入肿瘤的小鼠的照片，在肿瘤中30％的癌细胞群体是T47D-MUC1*，此处称为高抗原表达细胞。以10:1的CAR T与肿瘤细胞的比率施用各种CAR T细胞，其中植入了250,000个肿瘤细胞，并在5天后向动物注射2,500,000个CAR T细胞。图219B显示按天通过IVIS测量的肿瘤体积的图。如可以看出的那样，注射huMNC2-CD28-1XX的动物的肿瘤比用huMNC2-4-1BB-3z或huMNC2-CD28-3z处理的动物小得多，后者是相同的CAR T，不同的是CD3-ζ结构域中没有1XX突变。
图220A-220T显示以10:1的CAR T与肿瘤的比率处理的30％肿瘤的IVIS图。这里显示的是每只单个动物的图，而不是处理组的平均结果。
图221A-221B显示IVIS照片和IVIS肿瘤体积测量的图。图221A显示植入肿瘤的小鼠的照片，在肿瘤中30％的癌细胞群体是T47D-MUC1*，此处称为高抗原表达细胞。以1:1的CAR T与肿瘤细胞的比率施用各种CAR T细胞，其中植入了250,000个肿瘤细胞，并在5天后向动物注射250,000个CAR T细胞。图221B显示按天通过IVIS测量的肿瘤体积的图。如可以看出的那样，注射huMNC2-CD28-1XX的动物的肿瘤比用huMNC2-4-1BB-3z或huMNC2-CD28-3z处理的动物小得多，后者是相同的CAR T，不同的是CD3-ζ结构域中没有1XX突变。然而，随着CAR T细胞剂量的降低，即使是huMNC2-CD28-1XX处理组的肿瘤也开始再次生长。
图222A-222T显示以1:1的CAR T与肿瘤的比率处理的30％肿瘤的IVIS图。这里显示的是每只单个动物的图，而不是处理组的平均结果。
图223A-223B显示IVIS照片和IVIS肿瘤体积测量的图。图223A显示植入肿瘤的小鼠的照片，在肿瘤中7.5％的癌细胞群体是T47D-MUC1*，此处称为高抗原表达细胞。以10:1的CAR T与肿瘤细胞的比率施用各种CAR T细胞，其中植入了250,000个肿瘤细胞，并在5天后向动物注射2,500,000个CAR T细胞。图223B显示按天通过IVIS测量的肿瘤体积的图。如可以看出的那样，注射huMNC2-CD28-1XX的动物的肿瘤比用huMNC2-4-1BB-3z或huMNC2-CD28-3z处理的动物小得多，后者是相同的CAR T，不同的是CD3-ζ结构域中没有1XX突变。然而，即使是huMNC2-CD28-1XX处理组的肿瘤也开始再次生长，这与小百分比的高抗原表达肿瘤细胞阻碍其余肿瘤的杀伤的观点一致。
图224A-224T显示以10:1的CAR T与肿瘤的比率处理的7.5％肿瘤的IVIS图。这里显示的是每只单个动物的图，而不是处理组的平均结果。
图225A-225B显示IVIS照片和IVIS肿瘤体积测量的图。图225A显示植入肿瘤的小鼠的照片，在肿瘤中7.5％的癌细胞群体是T47D-MUC1*，此处称为高抗原表达细胞。以1:1的CAR T与肿瘤细胞的比率施用各种CAR T细胞，其中植入了250,000个肿瘤细胞，并在5天后向动物注射250,000个CAR T细胞。图225B显示按天通过IVIS测量的肿瘤体积的图。如可以看出的那样，注射huMNC2-CD28-1XX的动物的肿瘤比用huMNC2-4-1BB-3z或huMNC2-CD28-3z处理的动物小，后者是相同的CAR T，不同的是CD3-ζ结构域中没有1XX突变。然而，在低抗原密度且极低剂量的CAR T细胞下，即使是huMNC2-CD28-1XX处理组的肿瘤也开始再次生长。
图226A-226T显示以1:1的CAR T与肿瘤的比率处理的7.5％肿瘤的IVIS图。这里显示的是每只单个动物的图，而不是处理组的平均结果。
图227显示从处死后的测试动物的脾收集的CD3阳性人T细胞的列表。在此表中，从植入肿瘤的小鼠中分离出的细胞包含30％T47D-MUC1*，并以10:1的比率用CAR T细胞处理。如可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠肿瘤较小，但CAR T细胞和CD8阳性杀伤T细胞的数目较多。TIM3、LAG3和PD-1是T细胞耗竭的分子标志物。这个表显示，从动物收集的huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞表达较低水平的耗竭标志物，这与CD3-ζ中的1XX突变增加CART细胞体内持久性的观点一致。
图228显示从处死后的测试动物的脾收集的CD3阳性人T细胞的列表。在此表中，从植入肿瘤的小鼠中分离出的细胞包含30％T47D-MUC1*，并以1:1的比率用CAR T细胞处理。如可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠肿瘤较小，但CAR T细胞和CD8阳性杀伤T细胞的数目较多。TIM3、LAG3和PD-1是T细胞耗竭的分子标志物。这个表显示，从动物收集的huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞表达较低水平的耗竭标志物，这与CD3-ζ中的1XX突变增加CART细胞体内持久性的观点一致。
图229显示从处死后的测试动物的血液收集的CD3阳性人T细胞的列表。在此表中，从植入肿瘤的小鼠中分离出的细胞包含30％T47D-MUC1*，并以1:1的比率用CAR T细胞处理。如可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠肿瘤较小，但CAR T细胞和CD8阳性杀伤T细胞的数目较多，并且T细胞耗竭标志物水平较低。
图230显示从处死后的测试动物的脾收集的CD3阳性人T细胞的列表。在此表中，从植入肿瘤的小鼠中分离出的细胞包含7.5％T47D-MUC1*，并以10:1的比率用CAR T细胞处理。如可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠肿瘤较小，但CAR T细胞和CD8阳性杀伤T细胞的数目较多。TIM3、LAG3和PD-1是T细胞耗竭的分子标志物。这个表显示，从动物收集的huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞表达较低水平的耗竭标志物，这与CD3-ζ中的1XX突变增加CAR T细胞体内持久性的观点一致。
图231显示从处死后的测试动物的血液收集的CD3阳性人T细胞的列表。在此表中，从植入肿瘤的小鼠中分离出的细胞包含7.5％T47D-MUC1*，并以10:1的比率用CAR T细胞处理。如可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠肿瘤较小，但CAR T细胞和CD8阳性杀伤T细胞的数目较多。TIM3、LAG3和PD-1是T细胞耗竭的分子标志物。这个表显示，从动物收集的huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞表达较低水平的耗竭标志物，这与CD3-ζ中的1XX突变增加CAR T细胞体内持久性的观点一致。
图232显示从处死后的测试动物的脾收集的CD3阳性人T细胞的列表。在此表中，从植入肿瘤的小鼠中分离出的细胞包含7.5％T47D-MUC1*，并以1:1的比率用CAR T细胞处理。如可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠肿瘤较小，但CAR T细胞和CD8阳性杀伤T细胞的数目较多。TIM3、LAG3和PD-1是T细胞耗竭的分子标志物。这个表显示，从动物收集的huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞表达较低水平的耗竭标志物，这与CD3-ζ中的1XX突变增加CART细胞体内持久性的观点一致。
图233显示从处死后的测试动物的血液收集的CD3阳性人T细胞的列表。在此表中，从植入肿瘤的小鼠中分离出的细胞包含7.5％T47D-MUC1*，并以1:1的比率用CAR T细胞处理。如可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠肿瘤较小，但CAR T细胞和CD8阳性杀伤T细胞的数目较多。TIM3、LAG3和PD-1是T细胞耗竭的分子标志物。这个表显示，从动物收集的huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞表达较低水平的耗竭标志物，这与CD3-ζ中的1XX突变增加CAR T细胞体内持久性的观点一致。
图234A-234U显示从测试动物切除的肿瘤的照片并以克为单位显示它们的重量。从植入由30％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞和70％T47D-wt低抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除肿瘤。以10:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理动物。
图235A-235N2显示从植入由30％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞和70％ T47D-wt低抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除的解离肿瘤的放大照片。以10:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理动物。显示的是明视野图像和荧光图像的叠加，其中红色荧光mCherry显示低抗原密度细胞，而绿色荧光GFP显示低抗原密度细胞。图235A-235J显示从仅用PBS处理的对照动物切除的肿瘤细胞。图235K-235T显示从用huMNC2-41BB-3z CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图235U-235D2显示从用huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图235E2-235N2显示从用huMNC2-CD28-3z CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。
图236A-236U显示从测试动物切除的肿瘤的照片并以克为单位显示它们的重量。从植入由30％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞和70％T47D-wt低抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除肿瘤。以1:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理动物。图236A-236E显示从用PBS模拟处理的动物切除的肿瘤。图236F-236J显示从用huMNC2-41BB-3z处理的动物切除的肿瘤。图236K-236O显示从用huMNC2-CD28-1XX处理的动物切除的肿瘤。图236P-236T显示从用huMNC2-CD28-3z处理的动物中切除的肿瘤。图236U显示从测试动物切除的肿瘤的重量的条形图。
图237A-237D2显示从植入由30％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞和70％ T47D-wt低抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除的解离肿瘤的放大照片。以1:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理动物。显示的是明视野图像和荧光图像的叠加，其中红色荧光mCherry显示低抗原密度细胞，而绿色荧光GFP显示低抗原密度细胞。图237A-237J显示从仅用PBS处理的对照动物切除的肿瘤细胞。图237K-237T显示从用huMNC2-41BB-3z CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图237U-237D2显示从用huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图237E2-237N2显示从用huMNC2-CD28-3z CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。
图238A-238T显示从测试动物切除的肿瘤的照片并以克为单位显示它们的重量。从植入由7.5％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞和92.5％ T47D-wt低抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除肿瘤。以10:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理动物。
图239A-239M2显示从植入由7.5％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞和92.5％ T47D-wt低抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除的解离肿瘤的放大照片。以10:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理动物。显示的是明视野图像和荧光图像的叠加，其中红色荧光mCherry显示低抗原密度细胞，而绿色荧光GFP显示低抗原密度细胞。图239A-239J显示从用PBS模拟处理的动物切除的肿瘤细胞。图239K-239T显示从用huMNC2-41BB-3z CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图239U-239C2显示从用huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图239D2-239M2显示从用huMNC2-CD28-3z CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。
图240A-240O显示从测试动物切除的肿瘤的照片并以克为单位显示它们的重量。从植入由7.5％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞和92.5％ T47D-wt低抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除肿瘤。以1:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理动物。
图241A-241D2显示从植入由7.5％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞和92.5％ T47D-wt低抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除的解离肿瘤的放大照片。以1:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理动物。显示的是明视野图像和荧光图像的叠加，其中红色荧光mCherry显示低抗原密度细胞，而绿色荧光GFP显示低抗原密度细胞。图241A-241J显示从仅用PBS处理对照动物切除的肿瘤细胞。图241K-241T显示从用huMNC2-41BB-3z CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图241U-241D2显示从用huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图241E2-241N2显示从用huMNC2-CD28-3z CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。
图242A-242R显示活动物的照片，其中IVIS测量肿瘤体积，mCherry检测肿瘤内的低抗原细胞，并且GFP检测肿瘤内的高抗原细胞。处死后照片显示切除的肿瘤和肿瘤重量的图。还显示了GFP阳性高抗原肿瘤细胞的图。活GFP照片和高抗原细胞的FACS测量的图均显示，huMNC2-CD28-1XX杀伤了所有高抗原细胞和大多数低抗原细胞，即使肿瘤中高抗原细胞的水平最低并且CAR T的剂量非常低亦如此。
图243A-243F显示在两个不同时间点拍摄的照片。在这里，IVIS照片测量肿瘤体积，mCherry荧光照片测量低抗原细胞，并且GFP荧光照片测量高抗原细胞。在这种情况下，将动物植入由30％高抗原密度细胞(GFP+)和70％低抗原密度细胞(mCherry+)构成的肿瘤。动物以10:1或1:1的CAR T与肿瘤细胞的比率给予单剂量的CAR T细胞。
图244显示随时间推移的IVIS肿瘤体积测量结果的图。箭头指示拍摄活动物的荧光照片、mCherry和GFP的时间点。在这种情况下，将动物植入由30％高抗原密度细胞(GFP+)和70％低抗原密度细胞(mCherry+)构成的肿瘤。动物以10:1或1:1的CAR T与肿瘤细胞的比率给予单剂量的CAR T细胞。
图245显示两个时间点之间的肿瘤体积的IVIS测量结果、低抗原细胞的生长速率的mCherry测量结果和高抗原细胞的生长速率的GFP测量结果的图。如可以看出的那样，在高CAR T剂量下，在用huMNC2-41BB-3z或huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠中，高抗原密度细胞(GFP)的数目没有随时间推移而增加。然而，在低CAR T剂量下，一些用huMNC2-41BB-3z处理的小鼠显示出高抗原密度细胞的生长的增加，而用huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠则没有。更重要的是，在高或低CAR T剂量下，用huMNC2-41BB-3z处理的小鼠显示低抗原密度细胞的生长的增加，而在用huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠中，低抗原密度细胞的生长更受控制。
图246A-246B显示IVIS照片和IVIS肿瘤体积测量的图。图246A显示植入肿瘤的小鼠的照片，在肿瘤中15％的癌细胞群体是T47D-MUC1*，此处称为高抗原表达细胞。以10:1的CAR T与肿瘤细胞的比率施用各种CAR T细胞，其中植入了250,000个肿瘤细胞，并在5天后向动物注射2,500,000个CAR T细胞。图246B显示按天通过IVIS测量的肿瘤体积的图。在此实验中，在第52天，将红色轮廓的动物植入250,000个以上的100％高抗原密度肿瘤细胞。绿色轮廓的动物接受了2,500,000个CAR T细胞的额外剂量。
图247A-247T显示IVIS测量的每只单个动物的肿瘤生长的图。红色箭头指示注射更多肿瘤细胞，并且绿色箭头指示注射2,500,000个额外CAR T细胞。如可以看出的那样，注射额外肿瘤细胞不增加用huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞处理的动物的肿瘤生长。然而，注射额外肿瘤细胞增加用huMNC2-CD28-3z或huMNC2-41BB-3z CAR T细胞处理的动物肿瘤生长。此结果与具有CD3z的1XX突变的CAR T细胞延长体内CAR T细胞持久性一致。还可以看出，注射额外的CAR T细胞抑制了所有组中一些动物的肿瘤细胞。这与肿瘤复发并不归因于肿瘤逃逸的观点一致，因为新鲜的CAR T细胞仍然识别肿瘤细胞并杀伤它们。
图248A-247D显示实验策略的卡通图，其中将动物植入包含带有两种不同荧光标记的两种细胞类型的异源肿瘤。将动物植入携带mCherry并且发出红色荧光的T47D乳腺癌细胞，还植入T47D细胞，这些细胞被工程化成表达甚至更多MUC1*并且携带GFP，使它们发出绿色荧光。图248A显示植入肿瘤的动物的卡通图，其中30％的肿瘤表达高水平的MUC1*，并且那些肿瘤细胞发出绿色荧光。图248B显示植入肿瘤的动物的卡通图，其中15％的肿瘤表达高水平的MUC1*，并且那些肿瘤细胞发出绿色荧光。图248C显示植入肿瘤的动物的卡通图，其中7.5％的肿瘤表达高水平的MUC1*，并且那些肿瘤细胞发出绿色荧光。图248D列出了这些实验中使用的变量。
图249A-247F显示实验策略和数据的卡通图。图249A显示出现在正常上皮细胞上的全长MUC1的卡通图。图249B显示用huMNC2-scFv-Fc染色的四个组织标本。图249C显示描绘表达高(30％-左)或低(7.5％-右)百分比的高MUC1*表达肿瘤细胞的异质性肿瘤的漫画。图249D显示验证植入之前异质性肿瘤的百分比的流式细胞术。图249E显示在IVIS仪器上针对植入了30％高MUC1*细胞并以10:1(上)或1:1(下)的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物测量的生物发光的条形图。图249F显示在IVIS仪器上针对植入了7.5％高MUC1*细胞并以10:1(上)或1:1(下)的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物测量的生物发光的条形图。
图250A-250F显示在IVIS仪器上针对植入了30％高MUC1*细胞或7.5％高MUC1*肿瘤并且以各种效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物测量的肿瘤的生物发光的条形图。图250A显示植入肿瘤的动物的IVIS图，其中30％的肿瘤表达高水平的MUC1*并且其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理。图250B显示效应子与靶标的比率为5:1的IVIS图。图250C显示效应子与靶标的比率为1:1的IVIS图。图250D显示植入肿瘤的动物的IVIS图，其中7.5％的肿瘤表达高水平的MUC1*并且其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理。图250E显示效应子与靶标的比率为5:1的IVIS图。图250F显示效应子与靶标的比率为1:1的IVIS图。
图251A-251D显示在IVIS仪器上针对植入了30％高MUC1*细胞或7.5％高MUC1*肿瘤并且以10:1或1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物测量的肿瘤的生物发光的照片。图251A显示植入肿瘤的动物的IVIS照片，其中30％的肿瘤表达高水平的MUC1*并且其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理。图250B显示效应子与靶标的比率为1:1的IVIS照片。图251C显示植入肿瘤的动物的IVIS照片，其中7.5％的肿瘤表达高水平的MUC1*并且其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用CAR T细胞处理。图250D显示效应子与靶标的比率为1:1的IVIS照片。
图252A-252D显示从植入由30％或7.5％ T47D-MUC1*高抗原密度细胞构成的肿瘤的动物切除的解离肿瘤的放大照片，剩余细胞是低抗原密度细胞。以10:1或1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理动物。显示的是明视野图像和荧光图像的叠加，其中红色荧光mCherry显示低抗原密度细胞，而绿色荧光GFP显示低抗原密度细胞。图252A显示从植入30％高抗原密度肿瘤并以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图252B显示从植入30％高抗原密度肿瘤并以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图252C显示从植入7.5％高抗原密度肿瘤并以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。图252D显示从植入7.5％高抗原密度肿瘤并以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物切除的肿瘤细胞。
253A-253H显示实验策略和数据的卡通图。图253A显示出现在正常上皮细胞上的全长MUC1的卡通图。图253B显示用huMNC2-scFv-Fc染色的四个组织标本。图253C显示描绘表达高或低百分比的高MUC1*表达肿瘤细胞的异质性肿瘤的漫画。图253D显示验证15％的肿瘤细胞在植入前表达高水平的MUC1*的流式细胞术。图253E显示在IVIS仪器上针对植入了15％高MUC1*细胞并以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物测量的生物发光的条形图。图253F显示针植入15％高抗原密度肿瘤并以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T处理的动物的切除肿瘤的免疫荧光照片。图253G显示在IVIS仪器上针对植入了15％高MUC1*细胞并以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物测量的生物发光的条形图。图253H显示针植入15％高抗原密度肿瘤并以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T处理的动物的切除肿瘤的免疫荧光照片。
图254A-254B显示在IVIS仪器上针对植入15％高MUC1*细胞并以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物测量的生物发光的条形图。图254A显示以10:1的效应子与靶标的比率处理的动物的图。图254B显示以1:1的效应子与靶标的比率处理的动物的图。
图255A-255B显示在IVIS仪器上针对植入15％高MUC1*细胞并以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理的动物测量的肿瘤的生物发光照片。图255A显示以10:1的效应子与靶标的比率处理的动物的照片。图255B显示以1:1的效应子与靶标的比率处理的动物的照片。
图256A-256B显示切除肿瘤的荧光照片，其以红色显示mCherry阳性、低抗原密度细胞且以绿色显示GFP阳性、高抗原密度细胞。动物全部都植入肿瘤细胞的混合物，所述肿瘤细胞在植入之前是15％高MUC1*表达细胞。图256A显示以10:1的效应子与靶标的比率处理的动物的照片。图256B显示以1:1的效应子与靶标的比率处理的动物的照片。
图257显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了切除肿瘤的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图258显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了切除肿瘤的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入15％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图259显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了切除肿瘤的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图260显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了切除肿瘤的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以5:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图261显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了切除肿瘤的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以5:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图262显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了切除肿瘤的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图263显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了切除肿瘤的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入15％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图264显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了切除肿瘤的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图265显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图266显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入15％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图267显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图268显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以5:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图269显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入15％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以5:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图270显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以5:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图271显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图272显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入15％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图273显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了处理过的动物的切除脾的细胞是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图274显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图275显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入15％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图276显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以10:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图277显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以5:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图278显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入15％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以5:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图279显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以5:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图280显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入30％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图281显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入15％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图282显示流式细胞术的结果的表，在流式细胞术中测定了治疗过的动物的血液是否存在人T细胞和CAR T细胞，然后对这些细胞进行枚举并分析其是否存在T细胞耗竭的标志物。这里显示的是对从植入7.5％高抗原表达细胞的肿瘤的动物切除的肿瘤的分析，其中动物以1:1的效应子与靶标的比率用各种CAR T细胞处理。当检测到CAR T细胞的数目少于25时，数目显示为红色，并且对这少数细胞的进一步分析提出怀疑。
图283A-283L显示MUC1*阳性乳腺癌细胞T47D与人T细胞的培养物的照片，向所述癌细胞中添加了各种浓度的双特异性抗体20A10-OKT3-BiTE。20A10是人源化抗MUC1*抗体，并且OKT3是结合人T细胞上存在的CD3的抗体。如从图中可以看出的那样，双特异性抗体的添加介导T细胞和癌细胞的连接，此处被视为细胞聚集。在图283A中，双特异性抗体的浓度为1,000ng/mL。在图283B中，浓度为333ng/mL。在图283C中，浓度为111ng/mL。在图283D中，浓度为37ng/mL。在图283E中，浓度为12.3ng/mL。在图283F中，浓度为4.1ng/mL。在图283G中，浓度为1.3ng/mL。在图283H中，浓度为0.4ng/mL。在图283I中，浓度为0.15ng/mL。在图283J中，浓度为0.05ng/mL。图283K是对照孔，在所述孔中存在T细胞和癌细胞，但未添加双特异性抗体。图283L是对照孔，在所述孔中将双特异性抗体添加至癌细胞，但不存在T细胞。
图284A-284L显示MUC1*阳性乳腺癌细胞T47D与人T细胞的培养物的照片，向所述癌细胞中添加了各种浓度的双特异性抗体20A10-12F6-BiTE。20A10是人源化抗MUC1*抗体，并且12F6是结合人T细胞上存在的CD3的抗体。如从图中可以看出的那样，双特异性抗体的添加介导T细胞和癌细胞的连接，此处被视为细胞聚集。在图284A中，双特异性抗体的浓度为1,000ng/mL。在图284B中，浓度为333ng/mL。在图284C中，浓度为111ng/mL。在图284D中，浓度为37ng/mL。在图284E中，浓度为12.3ng/mL。在图284F中，浓度为4.1ng/mL。在图284G中，浓度为1.3ng/mL。在图284H中，浓度为0.4ng/mL。在图284I中，浓度为0.15ng/mL。在图284J中，浓度为0.05ng/mL。图284K是对照孔，在所述孔中存在T细胞和癌细胞，但未添加双特异性抗体。图284L是对照孔，在所述孔中将双特异性抗体添加至癌细胞，但不存在T细胞。
图285A-285L显示HCT-MUC1*转导的癌细胞与人T细胞的培养物的照片，向所述癌细胞中添加了各种浓度的双特异性抗体20A10-OKT3-BiTE。20A10是人源化抗MUC1*抗体，并且OKT3是结合人T细胞上存在的CD3的抗体。如从图中可以看出的那样，双特异性抗体的添加介导T细胞和癌细胞的连接，此处被视为细胞聚集。在图285A中，双特异性抗体的浓度为1,000ng/mL。在图285B中，浓度为333ng/mL。在图285C中，浓度为111ng/mL。在图285D中，浓度为37ng/mL。在图285E中，浓度为12.3ng/mL。在图285F中，浓度为4.1ng/mL。在图285G中，浓度为1.3ng/mL。在图285H中，浓度为0.4ng/mL。在图285I中，浓度为0.15ng/mL。在图285J中，浓度为0.05ng/mL。图285K是对照孔，在所述孔中存在T细胞和癌细胞，但未添加双特异性抗体。图285L是对照孔，在所述孔中将双特异性抗体添加至癌细胞，但不存在T细胞。
图286A-286L显示HCT-MUC1*转导的癌细胞与人T细胞的培养物的照片，向所述癌细胞中添加了各种浓度的双特异性抗体20A10-12F6-BiTE。20A10是人源化抗MUC1*抗体，并且12F6是结合人T细胞上存在的CD3的抗体。如从图中可以看出的那样，双特异性抗体的添加介导T细胞和癌细胞的连接，此处被视为细胞聚集。在图286A中，双特异性抗体的浓度为1,000ng/mL。在图286B中，浓度为333ng/mL。在图286C中，浓度为111ng/mL。在图286D中，浓度为37ng/mL。在图286E中，浓度为12.3ng/mL。在图286F中，浓度为4.1ng/mL。在图286G中，浓度为1.3ng/mL。在图286H中，浓度为0.4ng/mL。在图286I中，浓度为0.15ng/mL。在图286J中，浓度为0.05ng/mL。图286K是对照孔，在所述孔中存在T细胞和癌细胞，但未添加双特异性抗体。图286L是对照孔，在所述孔中将双特异性抗体添加至癌细胞，但不存在T细胞。
具体实施方式
在本申请中，“一个(a)”和“一种(an)”用于指单个和多个对象两者。
如本文所用，有时简单地说，将多肽指示为被“转导或转染”到细胞中。在这些情况下，应理解，编码多肽序列的核酸被转导或转染到细胞中，因为多肽不可能被转导或转染到细胞中。
如本文所用，有时当提及注射到动物体内的细胞的数目时或以其它方式在上下文中提及细胞的数目时，“M”是指数百万，并且“K”是指数千。
如本文所用，使用了各种单克隆抗体的可互换的命名，诸如“MNC2”，其可与“C2”、“Min-C2”和“MNC2”互换；“MNE6”，其可与“E6”、“Min-E6”和“MNE6”互换；“MNC3”，其可与“C3”、“Min-C3”和“MNC3”互换；和“MNC8”，其可与“C8”、“Min-C8”和“MNC8”互换。本文提供的单克隆抗体遵循相同的惯例。
如本文所用，置于抗体构建体之前的“h”或“hu”是人源化的简写。
如本文所用，术语“抗体样”意指这样的分子，其可以被工程化，使得其含有抗体的部分但不是自然界中天然存在的抗体。实例包括但不限于CAR(嵌合抗原受体)T细胞技术和
技术。CAR技术使用与T细胞的一部分融合的抗体表位，使得身体的免疫系统被引导以攻击特定的靶蛋白或细胞。/>
技术由作为合成人Fab的集合的“抗体样”文库组成，然后针对合成人Fab与靶蛋白的肽表位的结合进行筛选。然后可以将选定的Fab区工程化成支架或框架，使得它们类似于抗体。
如本文所用，“PSMGFR”是由SEQ ID NO:2识别的MUC1生长因子受体的一级序列的缩写，并且因此不与六个氨基酸的序列混淆。“PSMGFR肽”或“PSMGFR区”是指并入MUC1生长因子受体的一级序列(SEQ ID NO:2)的肽或区域。
如本文所用，“MUC1*”细胞外结构域主要由PSMGFR序列(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:2))定义。因为MUC1切割的确切位点取决于剪切它的酶，并且切割酶根据细胞类型、组织类型或细胞的演化时间而有所不同，所以MUC1*细胞外结构域的确切序列可能在N-末端有所不同。
其它剪切的氨基酸序列可以包括SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:620)；或SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:621)。
如本文所用，术语“PSMGFR”是如GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:2)所示的MUC1生长因子受体的一级序列的首字母缩写词。就这一点而言，如在“N-10PSMGFR”或简写为“N-10”、“N-15PSMGFR”或简写为“N-15”、或“N-20PSMGFR”或简写为“N-20”中的“N-数字”是指PSMGFR的N-末端缺失的氨基酸残基的数目。同样，如在“C-10PSMGFR”或简写为“C-10”、“C-15PSMGFR”或简写为“C-15”、或“C-20PSMGFR”或简写为“C-20”中的“C-数字”是指PSMGFR的C-末端缺失的氨基酸残基的数目。缺失和添加的混合也是可能的。例如，N+20/C-27是指野生型MUC1的肽片段，在所述片段中PSMGFR的N-末端添加了20个氨基酸，并且C-末端缺失了27个氨基酸。
如本文所用，“MUC1*的细胞外结构域”是指MUC1蛋白的缺乏串联重复结构域的细胞外部分。在大多数情况下，MUC1*是切割产物，其中MUC1*部分由缺乏串联重复序列的短细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质尾组成。切割MUC1的精确位置尚不清楚，可能是因为它似乎可以被多于一种酶切割。MUC1*的细胞外结构域将包括PSMGFR序列的大部分，但可能具有额外的10-20个N-末端氨基酸。
如本文所用，“序列同一性”意指特定多肽或核酸的序列与参考核酸或氨基酸序列的使得同源肽的功能与参考肽或核酸相同的同源性。这种同源性可以与参考肽非常接近，使得有时两个序列可能90％、95％或98％相同，但在结合或其它生物活性方面具有相同的功能。
如本文所用，“MUC1阳性”细胞是指表达MUC1、MUC1-Y或MUC1-Z或其它MUC1变体的基因的细胞。
如本文所用，“MUC1阴性”细胞是指不表达MUC1基因的细胞。
如本文所用，“MUC1*阳性”细胞是指表达MUC1基因的细胞，其中基因的表达蛋白是缺乏串联重复序列的跨膜蛋白，这可能是翻译后修饰、切割、替代拼接或用缺乏串联重复序列的MUC1蛋白转染或转导细胞的结果。
如本文所用，“MUC1*阴性”细胞是指可表达或可不表达MUC1基因但不表达缺乏串联重复序列的MUC1跨膜蛋白的细胞。
如本文所用，“MUC1阳性”癌细胞是指过表达MUC1基因、以异常模式表达MUC1的癌细胞，其中其表达不限于顶端边界和/或表达缺乏串联重复序列的MUC1。
如本文所用，“MUC1阴性”癌细胞是指可表达或可不表达MUC1基因但不过表达MUC1或不过表达缺乏串联重复序列的MUC1跨膜蛋白的癌细胞。
如本文所用，“MUC1*阳性”癌细胞是指过表达缺乏串联重复序列的MUC1跨膜蛋白的癌细胞。
如本文所用，“MUC1*阴性”癌细胞是指可表达或可不表达MUC1基因但不过表达缺乏串联重复序列的MUC1跨膜蛋白的癌细胞。
如本文所用，“构象表位”是指需要以特定三维结构或构象存在以便抗体结合的肽序列。然而，抗体在肽序列处于三维结构或构象时结合，而在呈线性时不结合。用于确定抗体是结合线性延伸段(stretch)还是结合构象表位的常用技术是使用抗体探测变性蛋白质印迹。通过变性凝胶的行进将蛋白质和肽线性化。在变性蛋白质印迹中不起作用但识别天然靶标的抗体，例如在完整细胞上表达的抗体，被确定为识别构象表位。如本文所用，抗体实际上可能或可能不结合“构象表位”，但是需要“构象表位”序列的存在来呈现三维结构，以使得癌细胞上的MUC1*区能够被对癌症治疗具有特异性的抗体结合。因此，构象表位是诱导抗体与癌细胞上的MUC1*区结合的氨基酸序列。因此，可以使用术语“构象诱导肽序列”，其指示肽序列存在于较大的肽中，不是作为结合位点，而是通过形成促进抗体与较大的肽结合的三维结构来诱导抗体与较大肽的结合。
用于治疗或预防癌症的MUC1*抗体(抗PSMGFR)
我们发现，MUC1(SEQ ID NO:1)跨膜蛋白的切割形式是一种生长因子受体，其驱动所有人类实体瘤癌症中超过75％的癌症的生长。MUC1的切割形式，我们称之为MUC1*(发音为muk 1star)，是一种强大的生长因子受体。酶促切割释放MUC1细胞外结构域的大部分。它是包含截短的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质尾的剩余部分，称为MUC1*。切割并释放MUC1的细胞外结构域的大部分暴露用于激活配体二聚NME1、NME6、NME8、NME7AB、NME7-X1或NME7的结合位点。细胞生长测定显示，配体诱导的MUC1*细胞外结构域二聚化促进了生长(图1A-1D)。用二价‘bv’抗MUC1*抗体、单价‘mv’或Fab NM23-H1二聚体或NME7-AB处理MUC1*阳性细胞。二价抗MUC1*抗体刺激癌细胞的生长，而单价Fab抑制生长。经典的钟形曲线指示配体诱导的二聚化刺激生长。二聚体NM23-H1(又名NME1)刺激MUC1*阳性癌细胞的生长，但是抑制MUC1表达的siRNA消除了它的作用(图1C)。NME7-AB还刺激MUC1*阳性细胞的生长(图1D)。
MUC1*是癌症药物的优异的靶标，因为它在所有癌症中超过75％的癌症上异常表达并且可能在甚至更高百分比的转移性癌症上过表达。在MUC1切割之后，其细胞外结构域的大部分从细胞表面脱落。剩余的部分具有截短的细胞外结构域，所述截短的细胞外结构域至少包含初级生长因子受体序列PSMGFR(SEQ ID NO:2)。结合PSMGFR序列的抗体，并且尤其是竞争性地抑制激活配体(诸如NME蛋白，包括NME1、NME6、NME8、NME7AB、NME7-X1和NME7)的结合的那些，是理想的治疗剂，并且可以用于治疗或预防MUC1阳性或MUC1*阳性癌症，形式为独立的抗体、抗体片段或其可变区片段，将其并入多特异性抗体样分子、双特异性抗体、抗体-药物缀合物或嵌合抗原受体(还称为CAR)中，然后转染或转导到免疫细胞中，然后施用于患者。治疗性抗MUC1*抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、抗体模拟物、工程化抗体样分子、完整抗体或抗体片段。抗体片段的实例包括但不限于Fab、scFv和scFv-Fc。人或人源化抗体优选用于治疗或预防癌症。在这些抗体样分子中的任一种中，可以引入突变以防止或最小化二聚体形成。单价或双特异性抗MUC1*抗体是优选的，因为MUC1*功能通过配体诱导的二聚化激活。典型的结合测定显示，NME1和NME7AB结合MUC1*的PSMGFR肽部分(图2A、2D)。此外，它们显示，这些激活生长因子结合MUC1*的膜近端部分，因为如果缺少10个C-末端氨基酸，它们便不结合PSMGFR肽。类似地，当且仅当存在10个C-末端氨基酸时，抗MUC1*抗体MNC2和MNE6才结合PSMGFR肽(图2B、2C)。抗体MNC3和MNC8结合与MNC2和MNE6不同的表位，因为它们不依赖于PSMGFR肽的10个C-末端氨基酸的存在(图2E、2F)。抗体MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11抗体以及本发明的其它抗体或衍生自它们的片段可以施用于患者以用于治疗或预防癌症，呈独立的抗体或并入BiTE、ADC、多特异性抗体样分子、双特异性抗体(具有或不具有FC区或Fc区的一部分)、双-scFv、二-scFv、串联二-scFv、双抗体(diabody)、三抗体(triabody)、三体(tribody)、四抗体(tetrabody)和其它多价和多特异性的抗体样分子中。抗体或抗体片段可以是鼠、人、人源化的、骆驼科动物、兔或其它非人物种。
BiTE或嵌合抗原受体也称为CAR，其被转导到免疫细胞中。MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11抗体以及其它竞争性地抑制NME1和NME7AB的结合的抗MUC1*抗体是优选的。抗体或抗体片段可以是鼠、人、人源化的、骆驼科动物、兔或其它非人物种。
可以基于特定标准选择用作独立的抗体治疗剂或用于整合到BiTE、CAR、ADC或任何多特异性抗体样分子中的治疗性抗MUC1*抗体。可以使用在动物体内生成单克隆抗体的典型方法来生成亲本抗体。替代地，它们可以通过筛选抗体或抗体片段文库来选择，包括但不限于Beckman美国专利号9,944,719B2中描述的策略，所述专利的筛选抗体的方法的描述以引用的方式并入本文。适合治疗性使用的抗体是基于它们能够结合MUC1*肽来选择的，可以是：
(i)MUC1的PSMGFR区；
(ii)PSMGFR肽；
(iii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-10)的肽
(iv)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-19)的肽
(v)具有氨基酸序列
NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-23)的肽
(vi)具有氨基酸序列
ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(N-26)的肽
(vii)具有氨基酸序列
SVSDVPFPFSAQSGA(N-30)的肽
(viii)具有氨基酸序列
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-10/C-5)的肽
(ix)具有氨基酸序列
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(N-19/C-5)的肽或
(x)具有氨基酸序列
FPFSAQSGA(N-36)的肽。
然后可以通过进行额外的筛选来进一步选择以此方式生成或选择的所得抗体或抗体片段。例如，抗体或抗体片段基于它们能够结合MUC1*阳性癌细胞或组织但不结合MUC1阴性癌细胞或正常组织而变得更为优选。此外，如果抗MUC1*抗体或抗体片段结合干细胞或祖细胞，则它们可能会被取消选择作为抗癌治疗剂。抗MUC1*抗体或抗体片段如果具有竞争性地抑制激活配体(诸如NME7AB或NME7-X1)与MUC1*结合的能力，则它们变得更为优选。图3A-3C显示，MNE6和MNC2竞争性地抑制激活配体NME1和NME7与MUC1*的结合。
用于选择抗MUC1*抗体以用于治疗被诊断患有MUC1阳性癌症、处于发展MUC1阳性癌症的风险中或怀疑患有MUC1阳性癌症的患者的方法包括以下选择抗体或抗体片段的步骤中的一个或多个，所述抗体或抗体片段：1)结合PSMGFR肽；2)结合N-10PSMGFR肽；3)选择性结合癌细胞；4)不结合C-10PSMGFR肽；且5)竞争性地抑制二聚体NME1或NME7-AB与PSMGFR肽的结合。例如，图3A-3C显示，单克隆MNE6和MNC2满足所有五个标准，而单克隆MNC3和MNC8不竞争性地抑制激活配体NME1和NME7的结合(图3C)。回想一下，MUC1*生长因子受体是通过配体诱导的其细胞外结构域的二聚化激活的。因此，理想的抗体治疗剂，如果用作直接的独立的抗体治疗剂，则不应使MUC1*细胞外结构域二聚化。对于这种治疗形式，就这一点而言合适的抗体包括单价抗体(诸如在美洲驼马和骆驼中生成的那些)、Fab、scFv、单结构域抗体(sdAb)、scFv-Fc，只要Fc部分被构建成使得其不同源二聚化即可。
FACS扫描显示，抗MUC1*抗体MNC2和MNE6特异性结合MUC1*阳性实体瘤癌细胞和MUC1*转染细胞，但不结合MUC1*阴性或MUC1阴性细胞。在一个实例中，人源化MNC2 scFv显示结合MUC1*阳性乳腺癌细胞ZR-75-1(又名1500)(图4A-4C)。MNE6显示，当且仅当用MUC1*转染时，才结合MUC1阴性HCT-116结肠癌细胞。MNE6还结合MUC1*阳性癌细胞，诸如MUC1*阳性乳腺癌细胞ZR-75-1(又名1500)(图4D-4F)。结合测定，诸如ELISA、免疫荧光等，全部都确认了MNC2和MNE6结合PSMGFR肽和活MUC1阳性癌细胞。人源化抗MUC1*抗体是基于它们也能够结合PSMGFR肽或MUC1阳性癌细胞来选择的。图5显示，人源化MNC2scFv以高亲和力结合MUC1*肽PSMGFR，EC-50为约333nM。人源化MNC2 scFv，如Fab，有效抑制MUC1*阳性癌细胞的生长，如图6A、6B中的一个实例所示。与亲本抗体一样，人源化scFv显示出相同的结合模式。huMNE6-scFv结合PSMGFR肽，结合N-10肽但不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)(图8)。然而，不太适合于治疗癌症的鼠或人源化MNC3-scFv结合PSMGFR肽，结合N-10肽并且结合我们已知激活配体NME7AB结合的表位C-10肽(图9)。
MNE6和MNC2的Fab或衍生自它们的可比的单链可变区在体外和体内有效抑制MUC1*阳性癌症的生长。在若干个实例中，抗MUC1*抗体的Fab在体内抑制了人MUC1*阳性癌症的生长。在一种情况下，将免疫受损的小鼠植入人乳房肿瘤，然后在肿瘤移植之后，用MNE6Fab进行处理。图7A显示，MNE6 Fab有效抑制了MUC1*阳性乳腺癌的生长。植入90天雌激素颗粒的雌性nu/nu小鼠被植入600万个已与Matrigel 50/50混合的T47D人乳腺癌细胞。选择携带为至少150mm3并且肿瘤体积连续三次增加的肿瘤的小鼠进行治疗。动物每周两次皮下注射80mg/kg MNE6 Fab，并且对符合相同选择标准的相同数目的小鼠注射单独媒介物(图7A)。
在另一方面，MNE6显示出阻止前列腺癌的生长。图7B显示，MNE6 Fab有效抑制了MUC1*阳性前列腺癌的生长。雄性NOD/SCID小鼠被植入600万个已与Matrigel 50/50混合的DU-145人前列腺癌细胞。选择携带为至少150mm^3并且肿瘤体积连续三次增加的肿瘤的小鼠进行治疗。动物每48小时皮下注射160mg/kg MNE6 Fab，并且对符合相同选择标准的相同数目的小鼠注射单独媒介物(图7B)。两名研究人员每周两次独立的测量肿瘤并记录。统计值通过独立的统计员盲法计算，每个统计值给予P值0.0001。抗MUC1*Fab抑制乳腺癌生长和前列腺癌生长。治疗对体重、骨髓细胞类型或数目没有影响。MNE6 Fab有效抑制了肿瘤的生长，而对照组的肿瘤继续生长直至处死。没有观察到或检测到治疗的副作用。
MNE6和MNC2的重组形式被构建为与Fab一样是单体的。在这种情况下，MNE6是人源化的，并且MNC2是人源化的。本领域技术人员已知有许多用于人源化抗体的方法。除了人源化之外，还可以筛选人抗体或抗体片段的文库，以鉴别结合PSMGFR的其它完全人抗体。
对人源化MNE6可变区的单链(称为scFv)进行遗传工程化，使得它连接到抗体的Fc部分(SEQ ID NO:256和257)。Fc区赋予抗体片段用作治疗剂的某些益处。抗体的Fc部分募集补体，通常意指它可以募集免疫系统的其它方面，并且因此增强抗肿瘤应答，而不仅仅是抑制靶标。Fc部分的添加还增加了抗体片段的半衰期(Czajkowsky DM,Hu J,Shao Z和Pleass RJ.(2012)Fc-fusion proteins:new developments and futureperspectives.EMBO Mol Med.4(10):1015-1028)。然而，抗体的Fc部分同源二聚化，这在基于抗MUC1*抗体的治疗剂的情况下并不是最佳的，因为配体诱导的MUC1*受体的二聚化刺激生长。因此，对于抗MUC1*抗癌治疗剂来说，抵抗二聚体形成的Fc区的突变是优选的。进行了铰链区的缺失和Fc区中使Fc突变体对二聚化具有抗性的其它突变，并且其可以用作治疗剂。
人或人源化MNE6抗体或抗体片段、Fab、MNE6 scFv或hu MNE6scFv-Fcmut是有效的抗癌剂，其可以施用于被诊断患有MUC1或MUC1*阳性癌症、怀疑患有MUC1或MUC1*阳性癌症或处于发展MUC1或MUC1*阳性癌症的风险中的人。
人源化
对于治疗性使用来说，结合MUC1*的细胞外结构域的人源化抗体或抗体片段或完全人抗体是优选的。本文针对人源化抗体所述的技术只是本领域技术人员已知的多种方法中的几种。本发明并不意味着受用于将抗体人源化的技术的限制。
人源化是在不改变结合特异性和亲和力的情况下，用人区域替换治疗性抗体(通常是小鼠单克隆抗体)的非人区域的过程。人源化的主要目标是降低治疗性单克隆抗体当施用于人时的免疫原性。三种不同类型的人源化是可能的。首先，通过将抗体的非人恒定区替换为人恒定区来制备嵌合抗体。这种抗体将含有小鼠Fab区，并且将含有约80-90％的人序列。其次，通过将小鼠CDR区(负责结合特异性)移植到人抗体的可变区，替换人CDR(CDR移植方法)来制备人源化抗体。这种抗体将含有约90-95％的人序列。再次也是最后，可以通过噬菌体展示(此时筛选人抗体、抗体样分子或抗体片段的文库以选择抗原特异性人抗体)或通过使表达人抗体的转基因小鼠免疫来产生完全的人抗体(100％人序列)。
将抗体人源化的一般技术大致实施如下。在宿主动物中，通常是在小鼠中生成单克隆抗体。然后筛选单克隆抗体与靶标结合的亲和力和特异性。一旦鉴别了具有所需效应和所需特征的单克隆抗体，便对其进行测序。然后将动物生成的抗体的序列与许多人抗体的序列进行比对，以找到与动物抗体的序列最同源的人抗体。采用生物化学技术将人抗体序列和动物抗体序列粘贴在一起。通常，将非人CDR移植到与非人抗体具有最高同源性的人抗体中。这个过程可以生成许多候选人源化抗体，需要对它们进行测试以鉴别哪种或哪些抗体具有所需亲和力和特异性。
一旦生成了人抗体或人源化抗体，它可以被进一步修饰以用作Fab片段、完全抗体或抗体样实体，诸如含有可变区的单链分子，诸如scFv或scFv-Fc。在一些情况下，希望使抗体或抗体样分子的Fc区发生突变，使得其不二聚化。
除了将人序列引入非人物种所生成的抗体中的方法之外，还可以通过本领域技术人员已知的多种方法获得完全人抗体，包括用抗原的肽片段筛选人抗体文库。可以通过用具有PSMGFR N-10肽的序列的肽筛选人抗体文库或抗体片段文库来生成功能类似于MNE6或MNC2、20A10或本发明的其它抗体的完全人抗体。在另一种方法中，人抗体是在遗传修饰的小鼠中生成的。人源化抗MUC1*抗体或抗体片段是基于小鼠单克隆抗体MNE6、MNC2、20A10、3C2B1、5C6F3和25E6的序列生成的。在本发明的一个方面，被诊断患有MUC1*阳性癌症的患者用有效量的包含MNC2(SEQ ID NO:118-119和168-169)、MNE6(SEQ ID NO:12-13和65-66)、20A10(SEQ ID NO:988-989和1004-1005)、3C2B1(SEQ ID NO:1820-1821和1822-1823)、5C6F3(SEQ ID NO:1816-1817和1818-1819)、25E6(SEQ ID NO:1020-1021和1036-1037)、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的序列的鼠或骆驼科动物抗体或抗体片段治疗。在本发明的另一方面，被诊断患有MUC1*阳性癌症的患者用有效量的包含MNE6(SEQ ID NO:56-57和107-108、或341-342、或391-392、或393-394)或MNC2(SEQ ID NO:144-145和194-195、或654-655、或239-249、或5017-5020)、20A10(SEQ ID NO:1576-1581或5001-5012)、3C2B1(SEQ ID NO:1820-1823或1812-1813)、5C6F3(SEQ ID NO:1816-1819或1814-1815)、25E6(SEQ ID NO:1020-1021和1036-1037或1600-1601)、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的序列的人或人源化抗体或抗体片段治疗。在优选的实施方案中，被诊断患有MUC1*阳性癌症的患者用有效量的包含MNC2(SEQ ID NO:654-655)、MNE6(SEQ ID NO:341-342)、20A10(SEQ ID NO:1580-1581)、3C2B1(SEQ ID NO:1812-1813)、5C6F3(SEQ ID NO:1814-1815)、25E6(SEQ ID NO:1600-1601)的序列的人源化抗体或抗体片段治疗。在本发明的另一方面，被诊断患有MUC1*阳性癌症的患者用有效量的诸如MNC2(SEQ ID NO:239、241、243、396或5018-5020)、MNE6(SEQ ID NO:)、20A10(SEQ ID NO:1574-1581或SEQ ID NO:5001-5012)、3C2B1(SEQ IDNO:1813)、5C6F3(SEQ ID NO:1815)、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的抗体的人源化单价形式治疗，其中单价意指对应的Fab片段、对应的scFv或对应的scFv-Fc融合物。在优选的实施方案中，被诊断患有MUC1*阳性癌症的患者用有效量的MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的人源化scFv或单体人源化scFv-Fc治疗。由于MUC1*生长因子受体通过配体诱导的其细胞外结构域的二聚化来激活，并且因为抗体的Fc部分同源二聚化，所以优选的是包含Fc部分的构建体使用突变的Fc区，从而防止或最小化二聚化。
结合MUC1*受体的细胞外结构域的PSMGFR(SEQ ID NO:2)肽，并且更具体地结合N-10肽的抗体是有效治疗或预防MUC1*阳性癌症的有效抗癌治疗剂。它们已显示抑制激活配体二聚体NME1(SEQ ID NO:1781)和NME7AB(SEQ ID NO:827)与MUC1*细胞外结构域的结合。结合PSMGFR序列的抗MUC1*抗体抑制MUC1*阳性癌细胞的生长，特别是当它们抑制配体诱导的受体二聚化时。抗MUC1*抗体的Fab已被证明阻止动物的肿瘤生长。因此，结合MUC1*细胞外结构域的抗体或抗体片段将有益于治疗其中癌性组织表达MUC1*的癌症。
结合MUC1*的PSMGFR区或结合合成PSMGFR肽的抗体是优选的。特别优选的是结合N-10肽但不结合C-10肽的抗体。还更优选的是结合N-26肽的抗体，其中PFPFS序列(SEQ IDNO:1747)的突变或缺失破坏抗体或其片段与N-26肽的结合。我们已经鉴别出若干种结合MUC1*细胞外结构域的单克隆抗体。在这个组中有小鼠单克隆抗体MNC2(SEQ ID NO:118-131、144-158、163-164、168-181、194-209)、MNE6(SEQ ID NO:12-25、39-59、65-78、93-114)、20A10(SEQ ID NO:988-1019、1574-1597、1659-1666)、3C2B1(SEQ ID NO:1386-1413、1572-1573)、5C6F3(SEQ ID NO:1356-1385)、25E6(SEQ ID NO:1020-1051、1598-1617、1667-1674)、18G12(SEQ ID NO:956-987)、28F9(SEQ ID NO:1052-1083)、1E4(SEQ ID NO:1116-1227)、B12(SEQ ID NO:1414-1431、1733-1742)、B2(SEQ ID NO:1432-1459)、B7(SEQID NO:1460-1487)、B9 SEQ ID NO:1544-1571)、8C7F3(SEQ ID NO:1488-1515)或H11(SEQID NO:1516-1543)，对其可变区进行测序并且给出为MNE6(SEQ ID NO:12-13和65-66)、MNC2(SEQ ID NO:118-119和168-169)。这些抗体的CDR构成抗体的识别单元，并且是小鼠抗体的最重要部分，其在移植到人抗体中时应该保留。每个小鼠单克隆的CDR的序列如下，重链序列之后是轻链：MNE6 CDR1(SEQ ID NO:16-17和69-70)CDR2(SEQ ID NO:20-21和73-74)CDR3(SEQ ID NO:24-25和77-78)、MNC2 CDR1(SEQ ID NO:122-123和172-173)CDR2(SEQID NO:126-127和176-177)CDR3(SEQ ID NO:130-131和180-181)、20A10 CDR1(SEQ ID NO:991-992和1008-1009)CDR2(SEQ ID NO:996-997和1012-1013)CDR3(SEQ ID NO:1000-1001和1016-1017)、3C2B1 CDR1(SEQ ID NO:1388-1389和1402-1403)CDR2(SEQ ID NO:1392-1393和1406-1407)CDR3(SEQ ID NO:1396-1397和1410-1411)、5C6F3 CDR1(SEQ ID NO:1358-1359和1372-1373)CDR2(SEQ ID NO:1362-1363和1376-1377)CDR3(SEQ ID NO:1366-1367和1380-1381)和25E6CDR1(SEQ ID NO:1024-1025和1040-1041)CDR2(SEQ ID NO:1028-1029和1044-1045)CDR3(SEQ ID NO:1032-1033和1048-1049)。在一些情况下，还从小鼠序列导入框架区的通过建模被认为对CDR的3维结构来说是重要的部分。
单克隆抗体MNE6、MNC2、20A10、3C2B1和25E6对出现在癌细胞上的MUC1*具有较大亲和力。单克隆抗体MNC3和MNC8对出现在干细胞上的MUC1*具有较大亲和力。
对所有七种抗体进行人源化，所述过程已得到每种抗体的若干种人源化形式。将衍生自小鼠抗体的可变区的CDR生化移植到同源人抗体可变区序列中。通过将小鼠CDR移植到同源人抗体的可变区中来生成MNE6(SEQ ID NO:38-39和93-94)、MNC2(SEQ ID NO:144-145和194-195)、20A10(SEQ ID NO:1576-1581和5001-5012)、3C2B1(SEQ ID NO:1812-1813)、5C6F3(SEQ ID NO:1814-1815)、25E6(SEQ ID NO:1600-1601)、MNC3(SEQ ID NO:439-440和486-487)和MNC8(SEQ ID NO:525-526和543-544)的人源化可变区。然后将人源化重链可变构建体融合到人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO:58-59)或人IgG2重链恒定区(SEQID NO:54-55)的恒定区中，然后将所述恒定区与融合到人κ链(SEQ ID NO:109-110)或人λ链(SEQ ID NO:113-114)恒定区的人源化轻链可变构建体配对。其它IgG同种型可以用作恒定区，包括IgG3或IgG4。
生成了进入到IgG2重链(SEQ ID NO:52-53)和IgG1重链(SEQ ID NO:56-57)中的人源化MNE6可变区、进入到与λ轻链(SEQ ID NO:111-112和216-219)或κ链(SEQ ID NO:107-108和210-213)配对的IgG1重链(SEQ ID NO:157-158)或IgG2重链(SEQ ID NO:163-164)中的人源化MNC2可变区以及人源化MNC3(SEQ ID NO:455-456、453-454和500-501、502-503)和MNC8(SEQ ID NO:541-542、539-540和579-580、581-582)抗体的实例。哪个IgG恒定区与人源化可变区融合取决于所需效应，因为每个同种型都有其自身的特征活性。人恒定区的同种型是基于诸如是否需要抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)的因素来选择的，但是还可能取决于基于细胞的蛋白质表达系统中生成的抗体的产量。在优选的实施方案中，将人源化抗MUC1*抗体或抗体片段施用于被诊断患有MUC1阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的人。
一种用于测试和选择最可用于治疗患有癌症或处于发展癌症风险中的人的人源化抗MUC1*抗体的方法是测试它们抑制激活配体与MUC1*细胞外结构域结合的能力。二聚体NME1可以结合MUC1*细胞外结构域并使其二聚化，并且从而刺激癌细胞生长。因此，与NME1竞争结合MUC1*细胞外结构域的抗体和抗体片段是抗癌剂。NME7AB是MUC1*的另一种激活配体。在一些情况下，优选的是鉴别阻断NME7或NME7-X1的NME7AB截短或切割产物与MUC1*细胞外结构域结合的抗体。与NME7和NME7变体竞争结合MUC1*细胞外结构域的抗体和抗体片段作为抗癌治疗剂是有效的。这些抗体包括但不限于MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11以及这些抗体及其人源化型式的单链型式，诸如scFv。其它NME蛋白也结合MUC1或MUC1*，包括NME1、NME6和NME8。与这些蛋白质竞争结合MUC1*的抗体也可以用作治疗剂。在优选的实施方案中，将鼠、骆驼科动物、人或人源化抗MUC1*抗体或抗体片段施用于被诊断患有MUC1阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的人。在更优选的实施方案中，将衍生自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的人源化序列的单链抗体片段或单体scFv-Fc融合物施用于被诊断患有MUC1阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的人。
得到单价抗体或抗体样蛋白的单链可变片段、scFv或其它形式也是可用的。在一些情况下，需要防止MUC1*细胞外结构域的二聚化。单链可变片段、Fab和其它单价抗体样蛋白已显示有效结合MUC1*的细胞外结构域并阻断MUC1*二聚化。这些单链可变片段、Fab和其它单价抗体样分子在体外和用人MUC1阳性癌细胞异种移植的动物体内有效阻断癌症生长。因此，人源化单链可变片段或单价抗MUC1*抗体或抗体样分子作为抗癌治疗剂将是非常有效的。因此，结合MUC1*细胞外结构域或PSMGFR肽的此类人源化单链抗体、Fab和其它单价抗体样分子可用作抗癌治疗剂。通过将结合MUC1*的细胞外结构域或结合PSMGFR肽的抗体的非人CDR移植到同源可变区人抗体的框架中生成抗MUC1*单链可变片段。然后将所得人源化重链和轻链可变区经由合适的接头彼此连接，其中接头应是柔性的并且其长度允许重链与轻链结合但阻碍一个分子的重链与另一分子的轻链结合。例如，接头为约10-15个残基。优选地，接头包括[(甘氨酸)4(丝氨酸)1]3(SEQ ID NO:401-402)，但不限于此序列，因为其它序列也是可能的。
在一个方面，将MNE6(SEQ ID NO:38-39和93-94)、MNC2(SEQ ID NO:144-145和194-195)或本发明的其它抗体的人源化可变区生化移植到经由接头连接重链和轻链的构建体中。生成了包含MNE6和MNC2可变区的人源化序列的人源化单链抗MUC1*抗体的实例。生成了若干人源化MNE6单链蛋白(SEQ ID NO:232-237、397-398)。生成了若干人源化MNC2单链蛋白(SEQ ID NO:238-243、395-396、654-655、5017-5018、5019-5020)。生成了若干人源化20A10单链蛋白(SEQ ID NO:1576-1581和5001-5012)。生成了若干人源化3C2B1单链蛋白(SEQ ID NO:1812-1813)。生成了若干人源化5C6F3单链蛋白(SEQ ID NO:1814-1815)。生成了若干人源化25E6单链蛋白(SEQ ID NO:1600-1601)。在优选的实施方案中，将人源化抗MUC1*抗体片段，包括可变片段，衍生自MNE6 scFv、MNC2 scFv、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11 scFv的scFv抗体片段(其可以并入不同的治疗形式中，包括CAR、双特异性抗体、BiTE、抗体药物缀合物)施用于被诊断患有MUC1阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的人。
本发明的一个方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、怀疑患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中向患者施用有效量的含有MNE6、MNC2、或20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的单体形式的剂，其中抗体可变片段部分是人是或被人源化的，并且其中抗体样蛋白的Fc部分(如果存在的话)突变，使得它抵抗二聚体形成。
CAR T和癌症免疫疗法技术
在本发明的另一方面，使用若干不同的嵌合抗原受体‘CAR’策略，将抗MUC1*抗体片段的单链部分的一些或全部生化融合到免疫系统分子上。想法是将抗体的识别部分(通常呈单链可变片段)融合到具有跨膜结构域和细胞质尾的免疫系统分子，从而能够传递激活免疫系统的信号，例如激活免疫细胞以杀伤识别单元所识别的细胞。识别单元可以是抗体片段、单链可变片段、scFv或肽。在一个方面，CAR的细胞外结构域的识别部分包含MNE6(SEQ ID NO:12-13和65-66、56-57和107-108、38-39和93-94、341-342、391-394)、MNC2(SEQID NO:118-119和168-169或144-145和194-195、654-655、239-243或5017-5020)、20A10(SEQ ID NO:988-989和1004-1005或1574-1581、1677、1687或5001-5012)、3C2B1(SEQ IDNO:1386-1413或1820-1823、1572-1573或1812-1813)、5C6F3(SEQ ID NO:1816-1819或1384-1385或1814-1815)、25E6(SEQ ID NO:1020-1021或1036-1037或1598-1601)、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的人、人源化或非人可变区的序列。这些是本发明的鼠或人源化抗体或它们的单链片段scFv(其可以并入CAR、BiTE或ADC中)的实例。在另一方面，识别单元包含单链可变片段的序列。给出了单链构建体的实例。生成了若干人源化MNE6单链蛋白scFv(SEQ ID NO:232-237)。生成了若干人源化MNC2单链蛋白scFv(SEQ ID NO:238-243、654-655或5017-5020)。生成了若干人源化20A10单链蛋白scFv(SEQ ID NO:1576-1581、1677、1687和5001-5012)。人源化单链蛋白还来衍生自3C2B1(SEQ ID NO:1812-1813)、5C6F3(SEQ ID NO:1814-1815)和25E6(SEQ ID NO:1600-1601)。CAR的细胞外铰链可以衍生自多种蛋白质，包括CD8(SEQ ID NO:345-346)、CD4(SEQ ID NO:347-348)或CD28(SEQ ID NO:349-350)。CAR的跨膜区还可以衍生自CD3-ζ(SEQ ID NO:361-362)、CD8(SEQID NO:363-364)、CD4(SEQ ID NO:365-366)、CD28(SEQ ID NO:367-368)、4-1BB(SEQ IDNO:369-370)、OX40(SEQ ID NO:371-372)、抗体结构域或其它跨膜区，包括近端细胞质共刺激结构域的跨膜区，诸如CD28、4-1BB等。CAR的细胞质尾可以包含一个或多个发出免疫系统激活信号的基序。细胞质信号传导基序(有时称为共刺激结构域)的群组包括但不限于CD27、CD28(SEQ ID NO:377-378)、4-1BB(SEQ ID NO:379-380)、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5、CD7和Fc受体γ结构域。信号传导结构域可以是CD3-ζ(SEQ ID NO:373-374或375-376)或修饰的CD3-ζ(称为1XX)(SEQ ID NO:1796-1797)。最小的CAR可以具有CD3-ζ或Fc受体γ结构域，然后在细胞质尾串联上述结构域中的一个或两个。在一个方面，细胞质尾包含CD3-ζ或其突变体(诸如1XX)加共刺激结构域(诸如CD28、4-1BB和/或OX40)。在另一方面，CD3-ζ的一个或两个ITAM缺失或突变以减慢信号传导，从而增加免疫细胞的持久性并减少其分化。
靶向MUC1*的CAR的细胞外结构域识别单元可以包含任何非人、人源化或人抗体的可变区，所述抗体能够结合PSMGFR肽(SEQ ID NO:2)或更优选地N-10肽(SEQ ID NO:3)的至少12个连续氨基酸，还更优选地，能够结合N-10肽(SEQ ID NO:3)但不能够结合C-10肽(SEQID NO:825)。在一个方面，CAR的靶向MUC1*的部分包含非人、人源化或人MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的可变区。在优选的实施方案中，CAR的靶向MUC1*的部分包含非人、人源化或人MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6的可变区。以鼠或人源化的形式并入CAR中的本发明的几种抗体的实例给出为MNE6(SEQ ID NO:297-298、300-301、303-304、1626-1633和5045-5048)、MNC2(SEQ ID NO:306-307、608-611、718-719、1618-1625、5041-5044和1784-1785)、20A10(SEQ ID NO:1582-1597、5021-5028、1798-1799、1692、1699和1706)和25E6(SEQ ID NO:1602-1617、5033-5040)。类似地，衍生自3C2B1(SEQ ID NO:1572-1573或1812-1813)或5C6F3(SEQ ID NO:1384-1385或1814-1815)的单链抗体可以替代上文列出的任一CAR的单链抗体片段。在人源化过程中，抗体CDR可以插入到许多不同的框架区中；作为演示，我们生成了三种型式的人源化20A10，它们仅在框架区有所不同。将这些并入到CAR(SEQ ID NO:1675、1678、1685)中，当转导到人T细胞时，CAR能够识别表达靶标MUC1*的细胞并杀伤它们。在一个方面，CAR的细胞外结构域识别单元基本上包含人源化MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11单链可变片段scFv。识别结构域(其通常是抗体片段)可以融合到细胞外区域(通常称为铰链)。铰链可以衍生自多种细胞外区域或肽，包括但不限于CD8(SEQ ID NO:345-346)、CD4(SEQ ID NO:347-348)或CD28(SEQ ID NO:349-350)的铰链区。CAR的跨膜区可以衍生自许多蛋白质跨膜结构域，包括但不限于CD8(SEQ ID NO:363-364)，或者可以是CD3-ζ(SEQ ID NO:361-362)、CD4(SEQ ID NO:365-366)、CD28(SEQID NO:367-368)、41BB(SEQ ID NO:369-370)、OX40(SEQ ID NO:371-372)或其它跨膜区的跨膜结构域。具有靶向MUC1*细胞外结构域的抗体片段的CAR的细胞质结构域可以包含选自包含免疫系统共刺激细胞质结构域和细胞质信号传导结构域的组的一个或多个。免疫系统共刺激结构域的群组包括但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5、CD7和Fc受体γ结构域(SEQ ID NO:373-382)。免疫系统信号传导结构域的群组包括但不限于CD3-ζ(SEQ ID NO:373-376)和CD3-ζ-1XX(SEQ ID NO:1796-1797)。CD3-ζ信号传导结构域可以是野生型，或者可以含有三个ITAM中的一个或两个的缺失或突变。在一个方面，CD3-ζ结构域仅含有一个功能性ITAM。在优选的实施方案中，ITAM是ITAM1，也称为CD3-ζ的1XX变体。
所描述的CAR可以转染或转导到免疫系统的细胞中。在优选的实施方案中，靶向MUC1*的CAR转染或转导到T细胞或NK细胞中。免疫细胞可以是自体的或同种异体的。在一个方面，T细胞是CD3+ T细胞，其可以呈CD8或CD4阳性。在另一情况下，它是树突细胞。在另一情况下，它是B细胞。在另一情况下，它是肥大细胞。在另一情况下，它是自然杀手(NK)细胞。在另一方面，免疫细胞衍生自已被引导以在体外分化成所述免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，含有抗体序列的CAR在干细胞中表达，然后干细胞可以分化成免疫细胞。在一种情况下，免疫细胞是T细胞。在另一情况下，免疫细胞是NK细胞。细胞可以来自患者或来自供体。如果来自供体，它可以被工程化成去除触发排斥的分子。用本发明的CAR转染或转导的细胞可以离体或体外扩增，然后施用于患者。施用途径选自含有但不限于骨髓移植、静脉内注射、原位注射或移植的组。在优选的实施方案中，将靶向MUC1*的CAR施用于被诊断患有MUC1阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的人。
有许多可能的抗MUC1*CAR构建体可以转导到T细胞或其它免疫细胞中，以便治疗或预防MUC1*阳性癌症。CAR由模块构成，并且一些模块的身份相对不重要，而其它模块的身份至关重要。我们和其它人已经证明，细胞内信号传导分子(诸如CD3-ζ(SEQ ID NO:373-376)、CD28(SEQ ID NO:377-378)和41BB(SEQ ID NO:379-380))单独或以组合方式刺激免疫细胞扩增、细胞因子选择和免疫细胞介导的对所靶向的肿瘤细胞的杀伤(PulèMA,Straathof KC,Dotti G,Heslop HE,Rooney CM和Brenner MK(2005)A chimeric T cellantigen receptor that augments cytokine release and supports clonal expansionof primary human T cells.Mol Ther.12(5):933-941；Hombach AA,Heiders J,Foppe M,Chmielewski M和Abken H.(2012)OX40 costimulation by a chimeric antigenreceptor abrogates CD28 and IL-2induced IL-10secretion by redirected CD4(+)Tcells.Oncoimmunology.1(4):458-466；Kowolik CM,Topp MS,Gonzalez S,Pfeiffer T,Olivares S,Gonzalez N,Smith DD,Forman SJ,Jensen MC和Cooper LJ.(2006)CD28costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptorenhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferredT cells.Cancer Res.66(22):10995-11004；Loskog A,Giandomenico V,Rossig C,PuleM,Dotti G和Brenner MK.(2006)Addition of the CD28 signaling domain to chimericT cell receptors enhances chimeric T cell resistance to T regulatorycells.Leukemia.20(10):1819-1828；Milone MC,Fish JD,Carpenito C,Carroll RG,Binder GK,Teachey D,Samanta M,Lakhal M,Gloss B,Danet-Desnoyers G,Campana D,Riley JL,Grupp SA和June CH.(2009)Chimeric receptors containing CD137 signaltransduction domains mediate enhanced survival of T cells and increasedantileukemic efficacy in vivo.Mol Ther.17(8):1453-1464；Song DG,Ye Q,CarpenitoC,Poussin M,Wang LP,Ji C,Figini M,June CH,Coukos G,Powell DJ Jr.(2011)In vivopersistence,tumor localization,and antitumor activity of CAR-engineered Tcells is enhanced by costimulatory signaling through CD137(4-1BB).CancerRes.71(13):4617-4627)。本发明的抗体包括但不限于MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的片段，也可以并入到具有突变的细胞质尾(诸如一个或多个ITAM的酪氨酸突变或缺失)的CAR中。在上述任一CAR中，细胞质尾可以包括减弱信号传导的突变或缺失，从而增加持久性并降低宿主细胞分化。此类突变包括但不限于突变成抑制磷酸化和信号传导的酪氨酸(Salter等人,2018)。在上文所述的任一CAR中，CD3-ζ的ITAM可以突变成抑制或减弱信号传导(Feucht等人2019)。在上文所述的任一CAR中，细胞质尾的CD3-ζ可以包含ITAM的突变或缺失，包括称为1XX(SEQ ID NO:1796-1797)的那些。在另一方面，缺失了一个或两个ITAM，仅留下一个或两个ITAM(Feucht等人2019)。在另一方面，所包含的一个或多个ITAM的位置移动到靠近共刺激结构域的位置。针对CAR的持久性增加的合适的ITAM配置包括但不限于1XX、X2X、XX3、12X和23X，其中数字1、2或3是指ITAM1、ITAM2或ITAM3，并且X是指所述ITAM的缺失。在优选的实施方案中，ITAM1是CAR构建体中所包含的唯一功能性ITAM，也称为1XX。并入具有CD3-ζ的ITAM的1XX突变的CAR中的本发明抗体的实例在以下序列中给出：MNC2(SEQ ID NO:1618-1625、5041-5044和1784-1785)、MNE6(SEQ ID NO:1626-1633和5045-5048)、20A10(SEQ ID NO:1590-1597、5021-5028和1798-1799)、25E6(SEQ ID NO:1610-1617和5037-5040)。CAR的跨膜和细胞外铰链区可能或可能不衍生自相邻共刺激结构域的序列。例如，包含4-1BB共刺激结构域的CAR可能具有衍生自CD8或CD28的跨膜和铰链区。在另一实例中，包含CD28共刺激结构域的CAR可能具有衍生自CD28的跨膜和铰链区。并入具有CD3-ζ的ITAM的1XX突变的CAR中的本发明抗体(其具有CD28共刺激结构域以及衍生自CD28的跨膜区和铰链区)的实例在以下序列中给出：MNC2(SEQ ID NO:5041-5044和1784-1785)、MNE6(SEQ ID NO:5045-5048)、20A10(SEQ ID NO:5025-5028、1798-1799、1692、1699和1706)、25E6(SEQ ID NO:5037-5040)。在此处描述的任何CAR中，细胞质区可以包含信号传导序列基序和共刺激结构域中的一个或多个，包括但不限于CD3-ζ、CD3-ζ-1XX、CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、ICAm-1、LFA-1、ICOS、CD2、CD5或CD7。此外，细胞内信号传导结构域的序列可以含有减弱信号的突变(诸如CD3-ζ-1XX(SEQ ID NO:1796-1797))以改善持久性或靶细胞杀伤。信号传导结构域CD3-ζ可以是野生型，或者可以含有一个或两个ITAM的突变或缺失。在优选的实施方案中，ITAM 2和3缺失或失活，留下单个ITAM，其为ITAM1，也称为1XX构建体。
在本发明的一个方面，CAR的铰链区和跨膜区衍生自CD8(SEQ ID NO:301、719、1675或1605)。在本发明的另一方面，CAR的铰链区和跨膜区衍生自CD28(SEQ ID NO:5048、5044、5024或5036)。在本发明的一个方面，共刺激结构域是CD28(SEQ ID NO:298、609、1589、1609)。在本发明的另一方面，共刺激结构域是4-1BB(SEQ ID NO:301、719、1585或1605)。在优选的实施方案中，作为CAR的靶向头的抗体片段结合缺乏串联重复结构域的MUC1的细胞外结构域。在更优选的实施方案中，作为CAR的靶向头的抗体片段结合含有35个最膜近端氨基酸的MUC1*细胞外结构域的区，在此也称为N-10(SEQ ID NO:3)。在又一更优选的实施方案中，作为CAR的靶向头的抗体片段结合N-10(SEQ ID NO:3)但不结合C-10(SEQID NO:825)。在又一更优选的实施方案中，作为CAR的靶向头的抗体片段结合N-10(SEQ IDNO:3)，不结合C-10(SEQ ID NO:825)，并且不结合线性表位，也就是说在标准蛋白质印迹中不起作用，或与NME7AB竞争结合N-10肽(SEQ ID NO:3)。在此处描述的CAR中，细胞外结构域可以包括具有长度可变的轻链的框架区IV的鼠、骆驼科动物、人、非人或人源化单链抗体片段，如MNE6 scFv(SEQ ID NO:5014或5016)、MNC2 scFv(SEQ ID NO:5018或5020)或20A10scFv(SEQ ID NO 5002、5004、5006、5008、5010或5012)、25E6 scFv(SEQ ID NO:5030或5032)所示。在上文所述的任一CAR中，单链抗体片段的轻链的框架区IV可以缺失末端氨基酸R和T或仅缺失T。我们注意到，可以将抗体的CDR插入到许多不同框架区的背景中。例如，将20A10 CDR插入三组不同的框架区(SEQ ID NO:1692、1699和1706)中，并且它们全部能够在转导到T细胞中时发挥作用。在上文所述的任何CAR中，T细胞可以被工程化成过表达c-Jun，作为抑制T细胞耗竭的方法(Lynn等人2019)。可以在CAR和本发明的其它组合物的基因上游使用多种启动子，包括使用CRISPR、Sleeping Beauty或用于定点插入基因的类似技术插入到细胞中天然存在的启动子(诸如TRAC基因座)中。常用的启动子是CMV启动子或微型CMV(SEQ ID NO:1634)、最小IL-2启动子(SEQ ID NO:1635)或最小启动子minip(SEQ IDNO:1636)。
将包括称为MNE6或MNC2的单克隆抗MUC1*抗体的可变结构域的单链抗体片段工程化成一组CAR。然后将靶向MUC1*的CAR单独地或以组合方式转导到免疫细胞中。当用呈递MUC1*肽的表面、用MUC1*转染的抗原呈递细胞或MUC1*阳性癌细胞挑战时，用靶向MUC1*的CAR转导的免疫细胞引发免疫应答，包括释放细胞因子、杀伤靶向的细胞和免疫细胞扩增。
例如，编码CAR的基因和本文所述的激活的T细胞诱导的基因可以使用病毒来病毒转导至免疫细胞中，或者插入到细胞启动子或增强子之一下游的区域中，诸如TRAC(T细胞受体α链)基因座。可以使用病毒递送系统和病毒载体，包括但不限于逆转录病毒(包括γ-逆转录病毒)、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、溶瘤病毒、HF10、T-Vec等。除病毒转导之外，CAR和本文所述的激活的T细胞诱导的基因还可以使用诸如CRISPR技术、CRISPR-Cas9和CRISPR-CPF1、TALEN、Sleeping Beauty转座子系统和SB100X的方法直接拼接到受体细胞的基因组中。
类似地，除CD3-ζ身份之外，构成CAR的非靶向部分的分子的身份，诸如细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域的膜近端部分，对于靶向MUC1*的CAR的功能来说不是必需的。例如，细胞外结构域、跨膜结构域和细胞质结构域的膜近端部分可以包含CD8、CD4、CD28或通用抗体结构域的一部分，诸如Fc、CH2CH3或CH3。此外，CAR的非靶向部分可以是这些分子或其它家族成员中的一种或多种的一部分的复合物。然而，CD3-ζ的身份至关重要，因为突变(诸如称为1XX或CD3-ζ-1XX的那些)极大地影响CAR T细胞的体内持久性。表达细胞质尾包括CD3-ζ-1XX的CAR的CAR T细胞在体内具有延长的活性，因为它们不像含有野生型CD3-ζ的细胞那样迅速耗竭。此外，我们发现，具有1XX信号传导结构域的CAR对特征为低抗原密度的细胞更有效。具有低抗原密度的癌细胞可能包含异质性肿瘤的亚群。具有低抗原密度的癌细胞可能是可导致癌症复发的早期癌细胞的特征。此外，治疗时的肿瘤可能包含表达低水平的特定癌症抗原的癌细胞。
因此，在一个实施方案中，被诊断患有癌症或处于发展癌症或癌症复发的风险中的患者用表达包含1XX信号传导结构域的CAR的免疫细胞治疗。在一个方面，患者被诊断患有MUC1*癌症或处于发展所述癌症的风险中。在优选的实施方案中，CAR的识别单元包含结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，但不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)的抗体片段。在更优选的实施方案中，抗体片段衍生自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3或25E6。
在另一实施方案中，被诊断患有包含表达低水平的靶向抗原的肿瘤细胞的癌症或被诊断患有早期癌症的患者或者已接受治疗但仍具有残余肿瘤细胞并且处于癌症复发的风险中的患者用表达包含1XX信号传导结构域的CAR的免疫细胞治疗，从而使得CAR T细胞能够杀伤高和低抗原密度癌细胞。在一个方面，患者被诊断患有MUC1*癌症或处于发展所述癌症的风险中。在优选的实施方案中，CAR的识别单元包含结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，但不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)的抗体片段。在更优选的实施方案中，抗体片段衍生自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3或25E6。
在本发明的另一方面，被诊断患有癌症或处于发展癌症或癌症复发的风险中的患者用表达具有野生型CD3-ζ的CAR的免疫细胞治疗并且还用表达具有突变CD3-ζ(诸如CD3-ζ-1XX)的CAR的免疫细胞治疗。以这种方式，肿瘤被表达具有完整CD3-ζ信号的CAR的免疫细胞攻击，从而有效杀死高抗原表达细胞，但这些免疫细胞过早耗竭，而表达具有突变CD3-ζ(诸如CD3-ζ-1XX)的CAR的细胞在患者体内持续时间更长，并且杀死可能导致肿瘤复发的低抗原表达细胞。在一个方面，患者被诊断患有MUC1*癌症或处于发展所述癌症的风险中。在优选的实施方案中，CAR的识别单元包含结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，但不结合C-10肽(SEQID NO:825)的抗体片段。在更优选的实施方案中，抗体片段衍生自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3或25E6。在一个方面，患者用其中CAR具有野生型CD3-ζ信号传导结构域的CART细胞治疗，其中CAR选自包含以下的组：MNC2 CAR(SEQ ID NO:306-307、608-611、718-719)、MNE6 CAR(SEQ ID NO:297-298、300-301、303-304)、20A10 CAR(SEQ ID NO:1582-1589、5021-5024)、25E6 CAR(1602-1609、5033-5036)、包含衍生自3C2B1的抗体片段的CAR(其中信号传导结构域是野生型CD3-ζ)和包含衍生自5C6F3的抗体片段的CAR(其中信号传导结构域是野生型CD3-ζ)。在另一方面，患者用其中CAR具有CD3-ζ-1XX信号传导结构域的CAR T细胞治疗，其中CAR选自包含以下的组：MNC2 CAR(SEQ ID NO:1618-1625、5041-5044、1784-1785)、MNE6 CAR(SEQ ID NO:1626-1633、5045-5048)、20A10 CAR(SEQ ID NO:1590-1597、5025-5028、1798-1799)、25E6 CAR(SEQ IDNO:1610-1617、5037-5040)、包含衍生自3C2B1的抗体片段的CAR(其中信号传导结构域是CD3-ζ-1XX)和包含衍生自5C6F3的抗体片段的CAR(其中信号传导结构域是CD3-ζ-1XX)。在另一方面，患者用表达具有野生型CD3-ζ信号传导结构域的CAR和具有1XX信号传导结构域的CAR的免疫细胞治疗。
我们已经证明，携带CD3-ζ的1XX突变的CAR T细胞在预防肿瘤复发方面比具有野生型CD3-ζ的CAR T细胞更有效。图218显示通过IVIS仪器测量的肿瘤体积的图，其中肿瘤细胞被遗传修饰成表达荧光素酶。在镇静的动物中测量光发射前10分钟注射底物虫荧光素。在实验的第1天，将动物被皮下注射250,000个人乳房肿瘤细胞。肿瘤是异质性的，包含两种不同的肿瘤细胞类型。第一个肿瘤细胞群体是T47D-wt，是一种表达全长MUC1和生长因子受体形式MUC1*的乳腺癌细胞系，我们将其工程化成表达mCherry荧光。第二个肿瘤细胞群体是相同的T47D乳腺癌细胞，不同的是它们被稳定转导以表达甚至更多MUC1*和GFP荧光，此处称为T47D-MUC1*。在此实验中，将动物植入T47D-wt加T47D-MUC1*，其中T47D-MUC1*的群体占肿瘤群体的30％、15％或7.5％。然后向动物一次性注射PBS、huMNC2-41BB-3z CAR T细胞(4-1BB)、huMNC2-CD28-3z CAR T细胞(CD28)或huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞(CD28-1XX或1XX)。将CAR T细胞以10:1、5:1或1:1的效应子与靶标的比率(E:T)注射到尾部静脉中。如从这些图中可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX优于huMNC2-CD28-3z和huMNC2-41BB-3z，并且差异在具有低抗原密度的肿瘤中和当以低CAR T细胞剂量治疗时更明显。在此处描述的后续实验中，明显的是，1XX CAR T细胞不仅在体内持续时间更长并避免T细胞耗竭，而且它们在杀伤低抗原密度肿瘤细胞方面更有效，这是行业中公认的问题并且将导致癌症复发。图219A-219B显示IVIS照片和IVIS肿瘤体积测量的图。图219A显示植入肿瘤的小鼠的照片，在肿瘤中30％的癌细胞群体是T47D-MUC1*，此处称为高抗原表达细胞。以10:1的CAR T与肿瘤细胞的比率施用各种CAR T细胞，其中植入了250,000个肿瘤细胞，并在5天后向动物注射2,500,000个CAR T细胞。图219B显示按天通过IVIS测量的肿瘤体积的图。如可以看出的那样，注射huMNC2-CD28-1XX的动物的肿瘤比用huMNC2-4-1BB-3z或huMNC2-CD28-3z处理的动物小得多，后者是相同的CAR T，不同的是CD3-ζ结构域中没有1XX突变。图220A-220T显示以10:1的CAR T与肿瘤的比率处理的30％肿瘤的IVIS图。这里显示的是每只单个动物的图，而不是处理组的平均结果。图221A-221B和图222A-222T显示基本上相同的实验，除了CAR T细胞剂量较低，单次注射仅施用250,000个CAR T细胞。如可以看出的那样，注射huMNC2-CD28-1XX的动物的肿瘤比用huMNC2-4-1BB-3z或huMNC2-CD28-3z处理的动物小得多，后者是相同的CAR T，不同的是CD3-ζ结构域中没有1XX突变。然而，随着CAR T细胞剂量的降低，即使是huMNC2-CD28-1XX处理组的肿瘤也开始再次生长，尽管速度更慢。
在这些接下来的实验中(图223-图226)，我们证明了，在植入其中仅7.5％的肿瘤表达高抗原密度的肿瘤的动物中，标准CAR T细胞杀死肿瘤更困难。然而，具有CD3-ζ的1XX突变的相同CAR T细胞在杀伤肿瘤和抑制肿瘤复发方面仍然非常有效。在效应子与靶标的比率为10:1的中等CAR T细胞剂量下，huMNC2-41BB-3z和huMNC2-CD28-3z显示一定的长期杀伤，huMNC2-CD28-1XX超过了它们。然而，在低抗原密度(这是对早期癌细胞和残留的抗性癌细胞的模拟)和低CAR T细胞剂量(效应子与靶标的比率为1:1)的情况下，huMNC2-41BB-3z和huMNC2-CD28-3z并不比对照PBS好，而huMNC2-CD28-1XX继续杀伤肿瘤。
在第69天与第90天之间处死动物。图227-233显示从处死后的测试动物的脾和血液收集的CD3阳性人T细胞的列表。如可以看出的那样，huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠，肿瘤较小，与用具有野生型CD3-ζ的CAR T细胞处理的动物相比，留存的活CAR T细胞和CD8阳性杀手T细胞的数目更多。还可以看出，从用huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞处理的动物取回的细胞中，T细胞耗竭的分子标志物TIM3、LAG3和PD-1大大减少或不存在。此结果与CD3-ζ的1XX突变在体内增加CAR T细胞持久性的观点一致。
处死之后，切除肿瘤并同样进行分析。对切除的肿瘤拍照并称重(图234、图236、图238、图240)，记录重量。然后酶促解离肿瘤，并且拍摄荧光照片以表征和量化导致肿瘤复发的细胞。回想一下，肿瘤是呈GFP阳性的高抗原表达细胞和呈mCherry阳性的低抗原密度细胞的异质性群体。残余的肿瘤的红色和绿色荧光照片显示，当肿瘤具有高百分比的高抗原密度细胞和高CAR T细胞剂量时，所有CAR T细胞都能够杀伤表达高水平靶抗原的肿瘤细胞。然而，肿瘤复发主要归因于标准CAR T细胞不容易杀伤的低抗原密度细胞的生长。当肿瘤由低百分比的高抗原细胞构成并且CAR T细胞剂量低时，标准CAR T细胞没有比注射PBS的对照更好。然而，具有CD3-ζ结构域的1XX突变的CAR T细胞相当好地杀伤低抗原密度细胞，从而大大抑制肿瘤复发(图235、图237、图239、图241)。
图242显示了活动物的荧光成像的照片。在两个不同时间点拍摄的荧光照片显示，对于植入中等百分比的高抗原细胞并且用具有野生型CD3-ζ的CAR或具有1XX突变的CAR处理的动物，与用具有CD3-1XX的CAR处理的动物相比，低抗原密度细胞的生长速度在用具有野生型CD3-ζ的CAR处理的动物中更快。在低CAR T细胞剂量下，标准CAR显示低抗原密度肿瘤细胞和高抗原密度肿瘤细胞的生长速度均较快。这与以下观点一致，即具有野生型CD3-ζ的CAR在杀伤低抗原密度细胞方面不如具有1XX的CAR有效，并且在CAR T细胞的数目较少的情况下，标准CAR比具有CD3-ζ的1XX突变的CAR耗竭得更快(图242、图243、图244、图245)。
在另一实验中，我们在第52天向小鼠注射了250,000个高抗原密度肿瘤细胞或2,500,000个以上的CAR T细胞。如图246和图247中可以看出的那样，注射额外肿瘤细胞不增加用huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞处理的动物的肿瘤生长。然而，注射额外肿瘤细胞增加用huMNC2-CD28-3z或huMNC2-41BB-3z CAR T细胞处理的动物肿瘤生长。此结果与具有CD3z的1XX突变的CAR T细胞延长体内CAR T细胞持久性一致。还可以看出，注射额外的CAR T细胞抑制了所有组中一些动物的肿瘤细胞。这与肿瘤复发并不归因于肿瘤逃逸的观点一致，因为新鲜的CAR T细胞仍然识别肿瘤细胞并杀伤它们。
癌症治疗的显著问题是肿瘤细胞表达低水平的肿瘤相关抗原，特别是关于细胞疗法，其中迄今为止，对肿瘤细胞的杀伤依赖于肿瘤细胞的抗原密度。表达低水平的靶抗原的肿瘤细胞逃避CAR T细胞以及工程化的CAR NK细胞。基本上所有实体瘤都是异质性的并且包含表达不同水平的靶抗原的细胞。为了进一步研究这个问题并开发能够检测和杀伤表达低水平的靶抗原的肿瘤细胞的疗法，我们设计了一种用于制备由高抗原表达细胞和低抗原表达细胞构成的异质性肿瘤的策略，其中两种不同的细胞类型都携带荧光标记，所述荧光标记可以在体内以及在处死测试动物之后离体被检测到(参见图248-图256)。如图249和图250的IVIS图中可以看出的那样，当用10:1的高剂量的CAR T细胞处理时，具有标准CD3z信号传导结构域或具有1XX突变的CAR杀伤表达高水平的抗原的肿瘤细胞。然而，对于具有标准CD3-z结构域的CAR，植入表达低百分比的高抗原表达细胞的肿瘤细胞的动物在处理和未处理之间的差异减弱，即使当CAR T细胞的剂量很高时亦如此。此结果表明，具有突变的CD3-z信号传导结构域(如1XX)的CAR检测表达低百分比的高抗原表达细胞的肿瘤细胞的能力增强。图251显示，在植入250,000个肿瘤细胞，然后用2.5M个CAR T细胞或250,000个CART细胞处理一次的动物中，肿瘤复发，并且用携带标准CD3z的CAR处理的动物的复发的时间和程度大于携带具有1XX突变的CD3z的动物。在mCherry波长和GFP波长下对切除的肿瘤进行荧光拍摄。如图252中可以看出的那样，用huMNC2-CD28-1XX处理的动物的肿瘤的肿瘤复发最小。此外，所述图显示，肿瘤复发以标准CAR T细胞遗漏的低抗原表达细胞为主。如图253和图256中可以看出的那样，当表达低百分比的高抗原表达细胞的肿瘤与用低剂量CART细胞处理相结合时，CAR T细胞耗竭加上低抗原细胞逃逸的组合驱动了肿瘤抗性。我们注意到，对于标记为15％高抗原密度的肿瘤，流式细胞术显示存在大量的肿瘤细胞簇，据报道这会导致体内肿瘤生长的速率较快。
当CD3-ζ信号传导结构域突变以减慢信号传导时，抗MUC1*CAR T细胞持续更长时间并且避免T细胞耗竭，如在突变一些酪氨酸中，例如我们对huMNC2-CD28-1XX进行的那样，参见图257-图282中的表。通过流式细胞术，针对人CAR T细胞的存在及其耗竭标志物表达，对测试动物的切除肿瘤进行了分析。值得注意的是，即使在高抗原密度肿瘤中，诸如30％的细胞表达高水平的抗原(在这种情况下为MUC1*)，其中动物用10:1CAR T细胞比肿瘤细胞的高效应子与靶标的比率处理，用具有CD3z突变(在这种情况下为1XX)的抗MUC1*CAR T处理的小鼠的肿瘤中CAR T细胞的数目显著较高。如图257的表中可以看出的那样，用huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠在切除的肿瘤中具有平均1,516个CAR T细胞，相比之下，huMNC2-41BB-3z处理的小鼠具有仅196个CAR T细胞并且huMNC2-CD28-3z处理的小鼠具有395个CART细胞。在huMNC2-CD28-1XX处理的小鼠中，CAR T细胞表达的耗竭标志物的百分比最低。这意味着，对于具有显著量的高抗原表达细胞和高剂量的CAR T细胞的肿瘤，突变的CD3z(如1XX突变)使CAR T细胞在能够识别肿瘤细胞并且还能够避免耗竭方面具有优势。通过观察这些相同的30％高抗原表达肿瘤评估了具有或不具有突变CD3z的CAR之间CAR T细胞持久性的比较，但其中动物用低剂量的CAR T细胞处理：250,000个CAR T细胞和250,000个肿瘤细胞，即1:1的比率。图262的表显示，在CAR T细胞注射之后的约70-90天之后，以低剂量施用于动物的具有标准CD3z信号传导结构域的CAR在其肿瘤中几乎没有可测量的CAR T细胞。这些数据表明，在低CAR T剂量下，CAR T细胞需要更努力地工作并更快地耗竭。相比之下，用低剂量的针对250,000个植入的肿瘤细胞的250,000个huMNC2-CD28-1XX CAR T细胞处理的动物在处死当天的肿瘤中有平均1,444个CAR T细胞，这与用高剂量的huMNC2-CD28-1XXCAR T细胞处理的动物大致相同。此结果显示，突变的CD3z信号传导结构域抵抗T细胞耗竭。
然而，观察植入仅具有7.5％的高抗原表达水平的肿瘤但用高剂量的CAR T细胞(针对250,000个植入的肿瘤细胞的2.5M个CAR T细胞)处理的动物的切除肿瘤显示，减慢CD3-z的信号传导的突变还可以做其它事情。因此，在抗原密度低但CAR T细胞剂量高的情况下，CAR T细胞由于抗原分子的数目较少而发出的信号较少，并且因此不会耗竭。出乎意料的是，如图259的表中可以看出的那样，如果用具有野生型CD3z的CAR处理，则从用10:1高剂量的CAR T细胞处理的动物切除的7.5％高抗原表达肿瘤在它们的肿瘤中仍然没有显著数目的CAR T细胞。用huMNC2-CD28-1XX处理的动物的肿瘤在切除的肿瘤中具有平均1,555个CAR T细胞，相比之下，huMNC2-41BB-3z处理的小鼠的肿瘤中仅具有167个，并且huMNC2-CD28-3z处理的小鼠的肿瘤中仅具有275个。此结果有力地表明，出乎意料地，具有1XX突变的CD3z或类似突变的信号传导结构域的CAR T细胞识别和杀伤表达低水平的靶抗原的肿瘤细胞的能力增强。
类似地，当也用低剂量的CAR T细胞处理动物时，标准CAR T细胞不识别或杀伤表达低百分比(7.5％)的高抗原表达细胞的肿瘤。图264的表显示，在在植入仅7.5％高抗原表达细胞的用低剂量的CAR T细胞(250,000个CAR T细胞和250,000个肿瘤细胞，1:1比率)处理的小鼠中，仅用huMNC2-CD28-1XX处理的动物的肿瘤中具有可测量的CAR T细胞，平均841个，并且那些CAR T细胞显示几乎没有耗竭迹象。
当分析动物脾的细胞时获得了类似的结果(图265-图273)。一个惊人的实例显示于图273中。对从植入时携带7.5％的高抗原表达细胞的肿瘤动物切除的脾的分析显示，仅用huMNC2-CD28-1XX处理的动物的脾具有可检测的CAR T细胞，其中它们的肿瘤中有平均1,413个CAR T细胞。
当通过流式细胞术分析处理的动物的血液时，也观察到趋势，如图274-图282中所示。
这些实验证明，抗MUC1*CAR T细胞杀伤MUC1*阳性肿瘤细胞，并且当CAR并入突变的CD3z结构域(诸如具有1XX突变的结构域)时，杀伤增强。实验还显示了意想不到的结果，具有1XX CD3z结构域的CAR T细胞识别和杀伤表达低水平的靶抗原的肿瘤细胞的能力增强。因此，携带1XX的CAR T细胞，包括但不限于识别MUC1*的CAR，提高了对实体瘤癌症的杀伤，其中肿瘤比血癌更具有异质性。另外，携带1XX的CAR T细胞，包括但不限于识别MUC1*的CAR，在预防肿瘤复发方面远优于标准CAR T细胞。
本发明的一个方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中向患者施用有效量的用靶向MUC1*的CAR转导的免疫细胞。在本发明的另一方面，免疫细胞是从患者分离的T细胞，所述细胞然后用CAR转导，其中CAR的靶向头结合MUC1*，并且在转导的T细胞扩增之后，将CART细胞以有效量施用于患者。在本发明的又一方面，免疫细胞是从患者分离的T细胞，所述细胞然后用CAR转导，其中CAR的靶向头包含MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的一部分，并且在转导的T细胞任选的扩增之后，将CAR T细胞以有效量施用于患者。在本发明的另一方面，将MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3或25E6的抗体片段并入自然杀伤细胞或NK细胞的嵌合抗原受体中。
抗MUC1*靶向抗体的特异性
如这些实验所证明的，CAR的关键部分是将免疫细胞引导至肿瘤细胞的抗体片段。如我们将在下一节中显示的那样，MNE6、MNC2、20A10、3C2B1和5C6F3对在肿瘤细胞上表达的MUC1*的形式具有高度特异性。CAR的下一个最重要的部分是携带免疫系统共刺激结构域和信号传导结构域CD3-ζ或其变体的细胞质尾。这些结构域的身份调节免疫应答的程度但不影响特异性。如图所示，CAR的跨膜部分的身份是最不重要的。似乎只要跨膜部分具有一定的柔韧性并且足够长以允许抗体片段到达其在肿瘤细胞上的同源受体，就足够了。包含MNE6靶向抗体片段以及细胞内共刺激结构域41BB和CD3-ζ但具有各种不同的细胞外、跨膜和短细胞质尾的CAR全部都起作用，因为它们在刺激宿主T细胞扩增的同时特异性杀伤靶向的细胞。
证明抗体特异性的最准确方法是与癌性组织标本相比测试正常人组织标本上的抗体。MNC2和MNE6先前显示特异性结合MUC1或MUC1*阳性癌细胞。使用若干抗MUC1或MUC1*抗体对若干乳房肿瘤阵列进行了测定。基本上，涉及来自1,200多名不同乳腺癌患者的乳腺癌组织标本的连续切片的研究显示，乳腺癌组织中剩余的全长MUC1非常少。绝大多数表达的MUC1是MUC1*并被MNC2染色。分析通过Clarient Diagnostics进行，并且组织染色使用Allred方法进行评分。例如，图10显示用VU4H5(结合串联重复序列的可商购获得的抗MUC1抗体)或结合MUC1*的MNC2染色的乳腺癌组织阵列的连续切片。图10和11是用识别MUC1-FL(全长)的VU4H5或识别癌性MUC1*的MNC2染色的乳腺癌组织阵列的照片。使用合并强度得分和分布得分的Allred评分方法对组织染色进行评分。在组织阵列的照片下方是显示结果的彩色编码图。如可以看出的那样，用VU4H5染色的阵列非常淡，并且许多组织根本不染色，尽管公开报道了MUC1在所有乳腺癌中的超过96％中异常表达，如通过基于核酸的诊断所证明。相比之下，用MNC2染色的阵列非常深(图中的红色相对于黄色或白色)。此外，许多组织根本没有被抗全长MUC1染色，但被MNC2染色得很深(参见图中的绿色框)。类似地，我们用人源化MNE6 scFv-Fc对正常或癌性乳房组织进行染色。将抗体片段生物素酰化，因此可以通过基于链霉抗生物素蛋白的二抗对它进行可视化。如图12中可以看出的那样，hMNE6 scFv-Fc不染色正常乳房组织，但染色癌性乳房组织。此外，染色的强度和均匀性随着患者的肿瘤等级和/或转移等级而增加(图12-13)。类似地，hMNE6 scFv-Fc不染色正常肺组织，但染色肺癌组织(图14-18)，并且染色的强度和分布随着肿瘤等级或转移等级的增加而增加。图19显示用5ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc生物素化抗MUC1*抗体染色，然后用链霉抗生物素蛋白HRP二抗染色的正常小肠和癌性小肠组织的照片。A)是正常小肠组织。B)是患者的小肠癌，如图所示。C、D是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图20显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的正常小肠组织的照片。A-D是正常小肠组织。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图21显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的癌性小肠组织的照片。A-D是患者的癌性小肠组织，如图所示。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图22显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的癌性小肠组织的照片。A-D是患者的癌性小肠组织，如图所示。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图23显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的正常结肠组织的照片。A-D是正常结肠。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图24显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的结肠癌组织的照片。A-D是转移患者的结肠癌组织，如图所示。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图25显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的结肠癌组织的照片。A-D是2级患者的结肠癌组织，如图所示。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图26显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的结肠癌组织的照片。A-D是转移患者的结肠癌组织，如图所示。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图27显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的前列腺癌组织的照片。A-D是患者的前列腺癌组织，如图所示。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图28显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的前列腺癌组织的照片。A-D是患者的前列腺癌组织，如图所示。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。图29显示用50ug/mL的人源化MNE6-scFv-Fc抗MUC1*抗体染色，然后用山羊抗人HRP二抗染色的前列腺癌组织的照片。A-D是患者的前列腺癌组织，如图所示。E-H是用单独二抗染色的对应的系列切片的照片。
本发明的一个方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中标本从患者癌症获得并且测试了其与结合PSMGFR SEQ ID NO:2、或更特异性地结合N-10肽(SEQ ID NO:3)、或更特异性地结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，但不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)的抗体的反应性。所述患者然后用来自抗体的scFv、scFv-Fc或包含抗体可变片段的CAR T治疗，所述抗体与其癌症标本反应或可以选自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11。本发明的另一方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中标本从患者癌症获得并且测试了其与MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的反应性；然后所述患者用与其癌症标本反应的抗体、抗体片段、scFv、scFv-Fc-mut、BiTE或包含抗体的一部分的CAR T治疗。
正如我们先前报道的，驱动肿瘤生长的生长因子受体是跨膜切割产物MUC1*而不是全长MUC1。激活MUC1*的生长因子结合仅在MUC1的串联重复部分的切割和释放之后才暴露的异位位点。本发明的抗体与激活生长因子一样，不可以结合全长MUC1。FACS分析清楚地显示，抗MUC1*抗体MNC2不能结合HCT-116，MUC1阴性细胞(图35A)，如果用MUC1*转染它们，则与这些细胞牢固结合(图35B)，但不结合用全长MUC1转染的HCT细胞结合(图35C)。可商购获得的抗串联重复抗体VU4H5清楚地识别全长MUC1(图35D)。
我们发现，MUC1可以被多于一种切割酶切割成MUC1*，并且切割位点影响其折叠并因此影响哪种单克隆抗体能够识别MUC1*的哪种形式。不同的癌细胞或癌性组织表达不同的切割酶。我们在不同的癌细胞系上测试了各种切割酶抑制剂并且发现，抑制一种癌细胞系中的MUC1切割的抑制剂不抑制其在另一种癌细胞系中的切割。类似地，PCR实验显示，切割酶在不同细胞或细胞系中以不同水平表达。例如，骨髓的造血干细胞表达被单克隆抗体MNC3识别，但不被MNE6或MNC2识别的MUC1*(图39)。DU145前列腺癌细胞和T47D乳腺癌细胞的生长受MNC2和MNE6的Fab的抑制，但不受MNC3或MNC8的Fab的抑制，指示癌细胞系表达被MNE6和MNC2识别但不被MNC3或MNC8识别的MUC1*(图42)。PCR实验显示，骨髓的CD34阳性细胞表达的MMP2是T47D乳腺癌细胞的约2,500倍多并且ADAM28是其约350倍多，而DU145前列腺癌细胞表达的ADAM TS16是T47D乳腺癌细胞的约2,000倍多，MMP14是其约400倍多并且MMP1是其约100倍多(图43和图44)。相反，T47D乳腺癌细胞表达的MMP9是骨髓细胞的约80倍多，并且是DU145前列腺癌细胞的约两倍。测试了各种切割酶抑制剂在不同种类的癌细胞中抑制切割的能力。
使用靶向MUC1*的细胞外结构域的抗体、抗体片段和CAR的一般策略
在本发明的一个方面，将第二因子和CAR转导到同一T细胞中，第二因子可以是切割酶、抗体、细胞因子或第二CAR。在本发明的另一方面，第二因子在诱导型启动子上，使得当CAR接合靶向的癌细胞时，其表达被激活。在一些情况下，第二因子的表达受诱导型启动子的控制。在本发明的一方面，当免疫细胞被激活时，例如当它识别或接合其靶标时，诱导第二因子的表达。在一个实例中，T细胞用第二因子转染或转导，当T细胞识别靶癌细胞时，诱导第二因子的表达。实现它的一种方式是在NFAT蛋白被表达或易位到细胞核时或之后不久诱导第二因子的表达。例如，将衍生自NFAT启动子区的序列置于第二因子的基因上游。以这种方式，当结合NFAT蛋白的启动子的转录因子以足以结合NFAT蛋白并诱导其转录的浓度存在时，它们还将结合被工程化在用于第二因子转录的序列前面的相同启动子。NFAT蛋白可以是NFAT1(也称为NFATc2)、NFAT2(也称为NFATc或NFATc1)、NFAT3(也称为NFATc4)、NFAT4(也称为NFATc3)或NFAT5。在本发明的一个方面，NFAT是NFATc1、NFATc3或NFATc2。在本发明的一个方面，NFAT是NFAT2，也称为NFATc1。SEQ ID NO:646示出了NFAT2的上游转录调控区的核酸序列。NFAT基因的启动子序列可以包括例如SEQ ID NO:781-783或SEQ IDNO:815的核酸序列，但可以看出，第二因子的表达的最佳序列或最小序列可以通过制备启动子的片段、延伸或突变并关于第二因子的表达测试启动子的强度来获得。在本发明的一个方面，NFAT2的转录调控区被工程化在编码第二因子的基因的上游，其为切割酶MMP9(SEQID NO:647)或MMP9的催化亚基(SEQ ID NO:648)。在本发明的一个方面，NFAT是NFATc3并且NFATc3的启动子序列包括来自SEQ ID NO:816的核酸序列。在本发明的一个方面，NFATc3的转录调控区被工程化在编码第二因子的基因的上游，此处的实例是MMP9。在本发明的另一方面，NFAT是NFATc2。SEQ ID NO:817-818显示NFATc2的上游转录调控区的核酸序列。在本发明的一个方面，NFATc2的转录调控区被工程化在编码第二因子的基因的上游，其可以是切割酶MMP9(SEQ ID NO:647)或MMP9的催化亚基(SEQ ID NO:648)。
另一种用于当T细胞或CAR T细胞被激活时诱导第二因子的表达的方法是使第二因子的基因在NFAT蛋白本身结合第二因子并诱导第二因子的转录的诱导型启动子上。在这种情况下，NFAT应答元件(NFAT RE)可以位于第二因子或第二因子片段的基因的上游。NFAT可以单独或作为复合物的一部分结合其在第二因子上游的应答元件。NFAT蛋白可以是NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4或NFAT5。在优选的实施方案中，NFAT蛋白是NFAT2，又名NFATc1，又名NFATc。将第二因子或其片段的基因克隆到NFAT-应答元件(SEQ ID NO:649)的下游，它可以是应答元件(SEQ ID NO:650)和诱导NFAT蛋白表达第二因子的CMV最小启动子(mCMV)(SEQ ID NO:651)的重复序列。NFAT应答元件可以包括NFAT共有序列的核酸序列(SEQ ID NO:804)。NFAT应答元件可以包括例如SEQ ID NO:805-814的核酸序列，但可以看出，第二因子的表达的最佳序列或最小序列可以通过制备应答元件核酸的片段、延伸或突变并关于第二因子的表达测试应答元件的强度来获得。Foxp3的增强子区还含有2079至2098在120-bp内的NFAT应答元件(SEQ ID NO:821)。NFAT应答元件可以包括核酸NFAT共有序列(5'-cattttttccat-3')(SEQ ID NO:819)或(5'-tttttcca-3')(SEQ ID NO:820)，NFATc1与其(Xu等人,Closely related T-memory stem cells correlate with in vivoexpansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7and IL-15,Blood 2014123:3750-3759)或其重复序列特异性结合。NFAT应答元件还可以被核酸间隔序列分开。其它NFAT应答元件可能存在并且可能进一步被发现，并且本领域技术人员当被指引确定NFAT应答元件时可能通过至少鉴于如SEQ ID NO:804-814所示的应答性元件(尽管仅作为实例)进行分子生物测定以获得它来实现。在本发明的一个方面，在NFAT-应答元件和CMV最小启动子下游的切割酶是MMP9(SEQ ID NO:652)。在本发明的另一方面，切割酶是MMP9(SEQ IDNO:653)的催化亚基。
因为NFAT 1-4受钙调磷酸酶途径调节，患者中可能出现的潜在毒性可以通过用免疫抑制剂(诸如FK506、环孢菌素、环孢菌素A或他克莫司(Tacrolimus))治疗来停止，所述免疫抑制剂阻断钙调磷酸酶活性并抑制NFAT向细胞核的易位。用诱导型启动子上的切割酶转导或转染的T细胞还可以用识别癌细胞上的蛋白质或分子的CAR转染或转染。在一特定实例中，切割酶是能够切割全长MUC1的酶，并且CAR携带将其引导至癌细胞表面上的MUC1*的抗体片段。
为了确定哪些切割酶切割癌细胞上的MUC1，我们测试了一系列MMP和ADAM酶抑制剂。这些实验指示MMP9是癌细胞中重要的切割酶。为了确认MMP9切割癌细胞上的MUC1，我们用具有41个串联重复结构域的全长MUC1的模拟物(HCT-MUC1-41TR)转染HCT-116MUC1阴性结肠癌细胞。通过单细胞克隆，我们能够建立这种细胞系，其中MUC1仅最低限度地被切割成MUC1*。图36A-36D显示蛋白质印迹和FACS分析，其显示HCT-MUC1-41TR对全长MUC1呈95％阳性而对切割形式MUC1*呈仅5-10％阳性。将HCT-MUC1-41TR细胞与不同浓度的MMP9一起孵育，然后通过免疫荧光进行测定以测量MNC2单克隆抗体与所得细胞的结合。如图37A-37C中可以看出的那样，随着添加到细胞中的MMP9浓度增加，MNC2的结合增加。这些实验显示，MMP9将MUC1切割成被MNC2识别的形式。我们进行的人癌症组织阵列研究(图30A-30F、图31A-31F、图32A-32F、图33A-33F)显示，MNC2识别癌性组织上存在但健康细胞或组织上不存在的切割的MUC1的形式(图34A-34I)。重要的是，MNC2不识别在健康骨髓造血干细胞上表达的切割的MUC1的形式(图39-41)。
在本发明的一个方面，用将免疫细胞靶向肿瘤的CAR和切割酶转导免疫细胞。CAR和切割酶可以在同一质粒或两个不同质粒上编码。在一个方面，切割酶在诱导型启动子上。在另一方面，切割酶的表达由免疫细胞被激活时表达的蛋白质诱导。在一种情况下，切割酶的表达是NFAT蛋白诱导。在另一方面，切割酶的表达由NFATc1诱导。在另一方面，当一种NFAT蛋白结合插入在切割酶或其催化活性片段的基因上游的NFAT应答元件时，切割酶的表达被诱导。在一个方面，切割酶是MMP9或具有催化活性的MMP9片段。
在本发明的一个方面，切割酶是MMP9(SEQ ID NO:643)。一些切割酶天然表达为需要被激活的酶原。这可以通过生物化学手段，通过表达激活切割酶的辅酶或通过以工程化激活形式的酶来实现。本发明预期通过共表达切割酶及其激活因子来克服这个问题。在本发明的一个方面，切割酶是MMP9并且共激活因子是MMP3。在本发明的另一方面，切割酶以已经具有活性的形式，例如通过表达仍具有催化功能的切割酶片段来表达。在一种情况下，切割酶是具有催化活性的MMP9片段。MMP9催化片段的一个实例给出为SEQ ID NO:645。
必须由MMP3激活的MMP9在大部分实体瘤中过表达。此外已知，MNC2抗MUC1*单克隆抗体识别被MMP9切割之后的MUC1。用MNC2-scFv探测了图30-33中显示的各种乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌和肺癌组织阵列，进一步指示这些癌症中的MUC1被MMP9切割。为了了解MMP9对肿瘤的切割是否增加T细胞对肿瘤的接近，我们使用表达全长MUC1的细胞系HCT-MUC1-41TR、高表达全长MUC1和MUC1*的乳腺癌细胞系和用MUC1*45转染的MUC1阴性细胞系进行了一系列实验。我们用MMP9和激活MMP9的MMP3转染细胞。我们取这些细胞的上清液，其含有激活的MMP9，并且将其添加到各种细胞中，然后将细胞与用抗MUC1*CAR的T细胞huMNC2-CAR44一起共培养。结果是，与未与MUC1切割酶一起孵育的对照细胞相比，CAR T细胞对靶向的MUC1/MUC1*阳性癌细胞的杀伤大大增加。
APMA是激活MMP的生化物质。我们使用了APMA以及我们用MMP9或ADAM17转染的细胞的条件培养基，以了解这些切割酶中的任一种是否切割仅表达全长MUC1的HCT-MUC1-41TR细胞系上的MUC1。作为对照，我们还测试了HCT-MUC1*细胞上的酶。MUC1和MUC1*表达细胞用红色染料CMTMR染色。将用抗MUC1*CAR、CAR44或CAR50转导的人T细胞与癌细胞一起共培养。未转导的T细胞用作对照(图45A-45P)。如图45B、图45C和图45D中可以看出的那样，抗MUC1*CAR T细胞有效识别并聚集HCT-MUC1*癌细胞，这是T细胞激活和杀伤的迹象。然而，在含有全长MUC1表达细胞HCT-MUC1-41TR的孔中看不到CAR T细胞诱导的聚集(图45F、图45G和图45H)。然而，与激活的MMP9一起孵育的细胞显示CAR T细胞诱导的聚集显著增加(图45J、图45K和图45L)，指示MMP9将全长MUC1切割成被MNC2单克隆抗体识别并且更具体地被huMNC2-scFv识别的MUC1*形式。ADAM17没有明显效果。ADAM17要么不切割MUC1，要么在不被MNC2识别的位置切割它，这更有可能(图45N-45P)。
我们进行了相同的实验，这次使用T47D乳腺癌细胞，其使用抗MUC1*CAR T细胞难以杀伤，推测是因为它们表达高水平的全长MUC1以及MUC1*(图46A-46T)。如图46B、46C和46D中可以看出的那样，抗MUC1*CAR44和CAR50对T47D癌细胞几乎没有影响。仅在图46D中，其为在T细胞中CAR表达水平最高的CAR44，我们才看到少量CAR T细胞诱导的聚集。然而，激活的MMP2(图46J、46K、46L)或激活的MMP9(图46R、46S、46T)的存在显示CAR T细胞识别、聚集和杀伤的显著增加，显示全长MUC1的切割增加T细胞对癌细胞的接近。为确保添加APMA不会通过一些其它机制诱导切割或抗MUC1*CAR T识别，我们制备了具有MMP9的催化活性形式并将其添加到T47D细胞中，然后将这些细胞与MNC2-CAR44 T细胞一起共培养(图47A-47I)。如从图中可以看出的那样，MNC2-CAR T细胞识别并聚集用MUC1*转染的细胞(图47B-47C)，较差地聚集表达全长MUC1和MUC1*的T47D乳腺癌细胞(图47E-47F)，但在添加催化活性MMP9之后牢固地结合并聚集T47D细胞(图47H-47I)。此结果支持MNC2不识别全长MUC1但识别生长因子受体MUC1*的主张。需注意，在此细胞系上表达的全长MUC1可能在空间上阻碍CAR T细胞在细胞膜附近的结合。
在另一实例中，将T47D MUC1阳性肿瘤细胞与100ng/mL或500ng/mL的MMP9的重组催化结构域(Enzo Life Sciences,Inc.,Farmingdale,NY)一起孵育。蛋白质印迹分析显示，MUC1/MUC1*阳性癌细胞经历了MUC1向MUC1*的广泛切割。在另一实例中，将T47D乳腺癌细胞与人重组MMP9催化结构域蛋白一起预孵育，然后与抗MUC1*CAR44 T细胞一起共培养。在测量作为时间的函数的阻抗的xCelligence仪器上实时监测CAR44 T细胞对T47D细胞的特异性杀伤。此分析使用在其上铺板有癌细胞的电极阵列。贴壁的癌细胞使电极绝缘并随着它们的生长导致阻抗增加。相反地，T细胞不贴壁并保持悬浮，因此不使阻抗增加或降低。但是，如果T细胞或CAR T细胞杀伤电极板上的癌细胞，则癌细胞在死亡时成球并上浮，导致阻抗降低。MMP9催化结构域的添加显著增加了对T47D癌细胞的杀伤。图48显示了T47D乳腺癌细胞与未转导的T细胞(作为对照)或huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物在45小时的时间段内的xCelligence图。在癌细胞生长18小时之后，将催化亚基MMP9添加到一些细胞中。在25小时，添加T细胞。如可以看出的那样，当T47D细胞与切割酶MMP9一起预孵育时，huMNC2-CAR44 T细胞杀伤大大提高。在xCelligence系统中，将贴壁的靶癌细胞铺板到电极阵列板上。贴壁细胞使电极绝缘并增加阻抗。贴壁癌细胞的数目与阻抗成正比。T细胞不是贴壁的，并且对阻抗没有贡献。因此，递增的阻抗反映了癌细胞的生长，并且递减的阻抗反映了癌细胞的杀伤。前列腺癌细胞系DU145表达MUC1和MUC1*，但表达水平远低于T47D细胞。在存在或不存在切割酶的情况下，DU145细胞被抗MUC1*CAR T细胞有效杀伤。
图49显示了DU145前列腺癌细胞与未转导的T细胞(作为对照)或huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物在45小时的时间段内的xCelligence图。在癌细胞生长18小时之后，将催化亚基MMP9添加到一些细胞中。在25小时，添加T细胞。如可以看出的那样，huMNC2-CAR44 T细胞对低密度MUC1/MUC1*阳性癌细胞的杀伤不受与切割酶MMP9一起预孵育的影响。DU145癌细胞表达量显著较低的MUC1，其包括全长形式以及MUC1*。全长MUC1的较低密度不在空间上阻碍T细胞接近膜近端MUC1*。DU145细胞代表早期癌症，其表达全长和切割的MUC1，但水平较低，使得T细胞接近在空间上不受阻碍。T47D细胞代表中期癌症，其表达高水平的MUC1和MUC1*的，其中全长MUC1的密度在空间上阻碍T细胞对肿瘤的接近。HCT-MUC1*细胞是用MUC1*45稳定转染的MUC1阴性细胞系，并且它们代表晚期癌细胞。重要的是，被MMP9切割成MUC1*的MUC1被抗MUC1*抗体MNC2(其为CAR的靶向头)识别。免疫细胞对癌细胞表面上的肿瘤抗原的接近可能由于庞大的细胞外结构域蛋白质或其它阻隔元件(也称为肿瘤微环境)的存在而在空间上受到阻碍。前述为可以延伸以提高靶向其它肿瘤抗原的CAR T疗法的功效的实例。在本发明的一个方面，用包含靶向肿瘤抗原的抗体片段的CAR和切割酶转染或转导免疫细胞。在本发明的另一方面，用包含靶向肿瘤抗原的抗体片段的CAR和将肿瘤抗原切割成由CAR的抗体片段识别的形式的切割酶转染或转导免疫细胞。在一个方面，用包含靶向肿瘤抗原的抗体片段的CAR和将肿瘤抗原切割成由CAR的抗体片段识别的形式的切割酶转染或转导免疫细胞，其中CAR的抗体片段识别MUC1*细胞外结构域并且切割酶将MUC1切割成MUC1*。在一个方面，免疫细胞，可以是T细胞或NK细胞，用CAR和切割酶转染或转导，所述CAR包含衍生自MNC2、MNE6、MNC3或MNC8的抗体片段，所述切割酶选自包含MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP16、ADAM9、ADAM10、ADAM17、ADAM 19、ADAMTS16、ADAM28或其催化活性片段的组。在本发明的一个方面，免疫细胞衍生自已被引导以在体外分化成免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，含有抗体序列的CAR在干细胞中表达，然后干细胞可以分化成免疫细胞。在一种情况下，免疫细胞是T细胞。在另一情况下，免疫细胞是NK细胞。
在本发明的一个方面，向被诊断患有癌症或处于发展癌症的风险中的人施用足量的用CAR和切割酶转导的免疫细胞。在本发明的另一方面，向被诊断患有癌症或处于发展癌症的风险中的人施用足量的用CAR和切割酶转导的免疫细胞，其中切割酶在诱导型启动子上，所述诱导型启动子被免疫细胞被激活时所表达的蛋白质激活。在本发明的另一方面，向被诊断患有癌症或处于发展癌症的风险中的人施用足量的用CAR和切割酶转导的免疫细胞，其中切割酶在诱导型启动子上，所述诱导型启动子被一种或多种NFAT激活。在一种情况下，NFAT是NFATc1。在另一方面，NFAT是NFATc3。在另一方面，NFAT是NFATc2。在上述任何情况下，CAR的细胞外结构域包含抗MUC1*抗体的片段。在一个方面，抗MUC1*抗体是MNC2scFv或MNC2scFv的人源化形式。在另一方面，抗MUC1*抗体是MNE6scFv或MNE6scFv的人源化形式。在上述任何情况下，免疫细胞可以是T细胞、NK细胞、肥大细胞或树突细胞。在一个方面，免疫细胞衍生自已被引导以在体外分化成所述免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，含有抗体序列的CAR在干细胞中表达，然后干细胞可以分化成免疫细胞。在一种情况下，免疫细胞是T细胞。在另一情况下，免疫细胞是NK细胞。
不旨在将本发明限于一种或两种使切割酶的表达被激活的T细胞诱导的具体方法。我们通过构建在NFAT启动子序列的下游或在NFAT应答元件的一个或多个重复序列的上游具有切割酶的质粒，证明了切割酶仅在T细胞激活时才特异性表达。在本发明的另一方面，通过构建将切割酶基因插入在IL-2启动子序列的下游或IL-2应答元件的下游的质粒，然后将质粒插入到免疫细胞中诱导了切割酶的表达。在本发明的另一方面，通过构建将切割酶基因插入在钙调磷酸酶启动子序列的下游或钙调磷酸酶应答元件的下游的质粒，然后将该质粒插入到免疫细胞，然后施用于患者以用于癌症的治疗或预防来诱导切割酶的表达。还有药物诱导质粒，其可以用于诱导切割酶的表达或用于停止由激活的T细胞的元件诱导的表达。这些药物诱导系统可以包括四环素诱导系统、Tet-on、Tet-off、四环素应答元件、多西环素(doxycycline)、他莫昔芬(tamoxifen)诱导系统、蜕皮激素诱导系统等。
不旨在将本发明限于用于编码CAR或诱导型切割酶的质粒中的一种或两种特定启动子。如本领域技术人员已知的，许多启动子可以互换，包括SV40、PGK1、Ubc、CAG、TRE、UAS、Ac5、多角体、CaMKIIa、GAL1、GAL10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、H1和U6。由庞大的细胞表面蛋白(诸如MUC1-FL)引起的CAR T细胞接近的空间位阻问题的另一种解决方案是增加由T细胞表达的CAR的接头区的长度。在标准设计CAR中，跨膜部分与抗体片段之间的细胞外接头区的长度为约45-50个氨基酸。我们制备了长臂CAR，在其中，细胞外接头的长度从约50个氨基酸延长到217-290个氨基酸。共培养测定显示，细胞外接头较长的CAR对靶癌细胞上的肿瘤相关抗原的接近更好。
BiTE、双特异性抗体和具有多特异性的抗体样分子
可以将本发明的抗体并入包含至少两个结合臂的分子中，其中至少两个结合不同的抗原。已经描述了多特异性抗体样分子的若干实例(Brinkmann和Kontermann,MABS,Vol.9,No.2,182-212(2017)；Spiess等人Molecular Immunology 67,95-106(2015))，这些参考文献以引用的方式整体但特别是关于制备双特异性抗体和双特异性抗体片段的公开并入本文。还应理解，各种术语，诸如本申请的图217和本文引用的Spiess等人的图1中发现的“CrossMab”、“DutaMab”，是技术性术语，并且应在本文所引用的Spiess等人或Brinkmann和Kondermann中所提供的描述的上下文内进行解释。
可以将本发明的抗体的可变区或其片段并入分子形式中，其中一个分子能够同时结合至少两种不同的抗原。这些各种抗体样分子的稳定性可以通过引入半胱氨酸以便形成二硫键来增加。本发明的抗体以及各种抗体样分子(其可以具有多特异性)的稳定性可以通过引入突变来增加，如Beckman,US9708388B2中更充分地描述，所述参考文献以引用的方式整体但特别是关于制备双特异性抗体和双特异性或多特异性抗体片段的公开内容并入本文。本发明考虑将本发明抗体的可变区或其片段与具有其它结合特异性的其它抗体或其片段的组合并入到多种抗体样形式中，包括但不限于以下。在可能的抗体样形式中有双特异性抗体，它可能或可能不包含Fc区。含有至少一个Fc区的双特异性抗体将具有更高的分子量和延长的体内半衰期。在双特异性含Fc的抗体的变型中，衍生自具有其它结合特异性的抗体的可变区或其片段被附加到IgG支架的N-末端或C-末端，以产生四价、多特异性抗体样分子。可以并入到scFv中的具有不同结合特异性的抗体的可变区或其片段的组合可以附加到IgG支架或其它支架，以产生多价、多特异性抗体样分子。可以将本发明的抗体并入微型抗体中，其中scFv被融合到CH3部分的C-末端或抗体Fc区的铰链区。二价(或双价)单链可变片段(二-scFv、双-scFv)可以通过连接两个scFv来工程化。这可以通过产生具有两个VH和两个VL区的单个肽链来完成，产生串联scFv。另一种可能性是产生带有接头肽的scFv，接头肽太短以至于两个可变区无法折叠在一起(约五个氨基酸)，迫使scFv二聚化。这种类型被称为双抗体。已证明双抗体的解离常数是对应的scFv的1/40，意味它们对其靶标具有更高亲和力。因此，双抗体药物的剂量可以比其它治疗性抗体低得多，并且能够在体内高度特异性靶向肿瘤。较短的接头(一个或两个氨基酸)和任选添加二硫键仍然导致形成三聚体，即所谓的三抗体或三体。还产生了四抗体和更高阶的多聚体。与双抗体相比，它们对靶标表现出更高的亲和力。
双特异性抗体样分子的其它形式是双特异性串联二-scFv和双特异性T细胞衔接器，称为BiTE(BiTE抗体构建体)。BiTE是在约55000道尔顿的单肽链上由不同抗体的两个scFv组成的融合蛋白。通常，一个结合臂结合T细胞上的分子，诸如CD3受体，并且另一结合臂通过肿瘤特异性分子(诸如异常表达的MUC1*)结合肿瘤细胞。所有这些形式都可以由本发明抗体的一各或多个可变片段构成，对至少两种不同的抗原具有特异性，生成多价且多特异性抗体样分子。在一个方面，衍生自第一抗体的可变结构域片段结合第一表面上的第一抗原并且衍生自第二抗体的可变结构域片段结合第二表面上的第二抗原，其中至少一个表面可以是细胞表面。在本发明的另一方面，至少一个构成多价、多特异性抗体样分子的可变结构域片段结合不与表面缔合的抗原。在一个方面，不与表面缔合的抗原是细胞因子。
作为本发明的抗体如何并入双特异性抗体中的实例，我们使用杵臼(knob-in-hole)，也称为KIH(Spiess等人Molecular Immunology67,95-106(2015))形式构建了双特异性抗体。在此实例中，抗体的第一臂是人源化抗MUC1*抗体20A10，也称为hu20A10，具有14616个框架区；抗体的第二臂是抗CD3抗体OKT3或12F6，其两者均结合人T细胞上的相同表位。所得双特异性抗体在此处被称为20A10-OKT3-BiTE和20A10-12F6-BiTE。在功能演示中，将双特异性抗体以不同浓度添加到培养的细胞中，其中存在人T细胞和MUC1*阳性癌细胞两者。在一种情况下，癌细胞是T47D乳腺癌细胞，并且在另一情况下，转导MUC1*阴性细胞系HCT-116结肠癌细胞以表达MUC1*，称为HCT-MUC1*。如从图283A-283L、图284A-284L、图285A-285L和图286A-286L中所示的照片中可以看出的那样，添加任一双特异性抗体介导T细胞和MUC1*阳性癌细胞连接在一起，如通过双特异性剂量依赖性细胞聚集所证明的。进行了两个对照实验。在一个对照中，没有添加双特异性抗体，但存在T细胞和MUC1*癌细胞。没有观察到聚集。在另一对照中，将双特异性抗体添加至MUC1*阳性癌细胞，但不存在T细胞。这些数据证明，本发明的抗MUC1*抗体可以很容易地并入双特异性形式中。在这些实例中，双特异性抗体的第二臂是识别T细胞上的CD3的抗体。然而，不旨在将本发明限于一个臂结合MUC1*且另一臂结合T细胞的双特异性抗体。本领域技术人员可以容易地将双特异性抗体的第二臂替代为结合NK细胞或癌细胞上的另一受体的抗体以实现增加的亲和力。由于MNC2结合与20A10相同的表位，显然，本领域技术人员可以容易地用MNC2或人源化MNC2替代20A10。在本发明的一个方面，被诊断患有MUC1*阳性癌症或处于发展MUC1*阳性癌症的风险中的人用有效量的同时结合MUC1*阳性癌细胞和人T细胞的双特异性抗体治疗。在本发明的另一方面，双特异性抗体是hu20A10-OKT3-BiTE。在本发明的另一方面，双特异性抗体是hu20A10-12F6-BiTE。在本发明的另一方面，双特异性抗体是huMNC2-OKT3-BiTE。在本发明的另一方面，双特异性抗体是huMNC2-12F6-BiTE。
本发明的另一方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中向患者施用有效量的此处描述的多价、多特异性抗体样分子之一，其中可变结构域或其片段中的至少一种衍生自结合PSMGFR(SEQ ID NO:2)，或更具体地结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，或更具体地结合N-19肽(SEQ ID NO:4)、或N-23肽(SEQ ID NO:5)、或N-26肽(SEQ ID NO:6)、或N-30肽(SEQ ID NO:7)，或仍更具体地结合PSMGFR肽片段的抗体，其中所述结合取决于氨基酸FPFSAQSGA(SEQID NO:10)的存在。在一种情况下，结合MUC1*的抗体可变片段包含MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的一部分。在一种情况下，结合MUC1*的构成多价、多特异性抗体样分子的抗体可变片段中的至少一个包含MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11中的一部分和至少一个结合免疫细胞上的抗原的其它抗体可变片段，所述免疫细胞可以是T细胞或NK细胞。
本发明的另一方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中向患者施用有效量的BiTE，其中BiTE的一个抗体可变片段结合T细胞表面抗原，并且BiTE的另一抗体可变片段结合PSMGFR(SEQ ID NO:2)，或更具体地结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，或更具体结合N-19肽(SEQ ID NO:4)、或N-23肽(SEQ ID NO:5)、或N-26肽(SEQ ID NO:6)、或N-30肽(SEQ ID NO:7)，或仍更具体地结合PSMGFR肽片段，其中所述结合取决于氨基酸FPFSAQSGA(SEQ ID NO:10)的存在。在一种情况下，结合MUC1*的BiTE的抗体可变片段包含MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的一部分。
在本发明的另一方面，将包含PSMGFR(SEQ ID NO:2)或大部分或全部N-10肽的MUC1*肽用于过继性T细胞方法。在这种情况下，将患者的T细胞暴露于MUC1*肽，并且通过多轮成熟，T细胞发展MUC1*特异性受体。然后将适应的T细胞扩增并施用于被诊断患有MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的供体患者。
还制备了一系列CAR，其具有MNC2和人源化MNC2作为CAR的细胞外靶向头。将这些CAR的构建体插入到质粒中，然后将质粒插入到慢病毒载体中。然后用携带MNC2 CAR和huMNC2 CAR的慢病毒载体转导人T细胞。生成了作为小鼠序列或人源化的MNC2-scFv-CAR。在本发明的一个方面，CAR包含huMNC2-scFv-短铰链区-跨膜结构域，其衍生自CD8-短细胞内碎片(piece)-4-1BB-3ζ。在另一方面，跨膜结构域衍生自CD4跨膜序列。在另一方面，细胞内共刺激结构域是CD28-3ζ。在另一方面，细胞内共刺激结构域是CD28-4-1BB-3ζ。
有多种方法用于评估T细胞是否识别靶细胞并且在建立(mounting)免疫应答的过程中。T细胞在识别靶标或外来细胞时聚集。这可以用肉眼或在低倍率下很容易地看到。当与靶癌细胞一起共培养时出现CAR T细胞聚集是以下的一种量度：a)它们是否将细胞识别为靶细胞；以及b)它们是否被激活以攻击靶向的细胞，在这种情况下细胞是癌细胞。图45-47显示与不具有CAR的人T细胞或者用huMNC2-scFv-CAR44或用huMNC2-scFv-CAR50转导的人T细胞一起共培养的MUC1*阳性T47D乳腺癌细胞的照片，所述乳腺癌细胞用mCherry稳定转染或者用CMTMR染色，所以是红色的。CAR T细胞是透明的。如可以看出的那样，当T细胞不携带CAR时，没有T细胞诱导的癌细胞聚集。然而，当T细胞携带靶向MUC1*的CAR时，MUC1*阳性癌细胞显著聚集。
在T细胞识别和聚集靶细胞之后，它们过表达穿孔素和颗粒酶B。这两种分子一起激活靶向的细胞中的细胞死亡途径。据认为，穿孔素在靶细胞中形成一个孔，T细胞将颗粒酶B注入孔中，然后激活凋亡蛋白酶，导致靶细胞裂解。图55和图56显示结合靶MUC1*阳性前列腺癌和胰腺癌细胞并注入颗粒酶B的huMNC2-scFV-CAR44 T细胞。
T细胞是否已识别靶细胞并被激活以杀伤细胞的另一量度是细胞因子、干扰素γ(IFN-g)和白介素-2(IL-2)通过T细胞的上调和分泌。CAR T细胞的激活，如荣国IFN-g和IL-2分泌所证明的，可以很容易地在体外测量。将CAR T细胞与靶细胞一起共培养，并且在孵育期之后，通过ELISA测定条件培养基以检测分泌的IFN-g和IL-2。为了确定CAR的靶向头是huMNC2或huMNE6的CAR T细胞的癌症特异性，用huMNC2-CAR44 T细胞和huMNE6-CAR44 T细胞与MUC1*阳性癌细胞和正常细胞的共培养物进行这些实验。表1详述了测试的MUC1阳性正常细胞或原代细胞。
表1：正常细胞系和原代细胞
图50是测试的各种细胞系的PCR测量结果的图，其中测量了MUC1的mRNA水平。在这些测定中测试的癌细胞系是HCT-MUC1*和T47D乳腺癌细胞。将这些细胞与huMNC2-CAR44人T细胞一起共培养。huMNC2-CAR44 T细胞与癌细胞的共培养诱导CAR T细胞分泌大量的IFN-g和IL-2到周围培养基中，但与MUC1阳性正常细胞的共培养不诱导细胞因子的分泌(图51和图52)。除测试CAR T细胞的IFN-g和IL-2分泌外，还测定了正常细胞的细胞死亡的迹象，如果抗体靶向头不是极为癌症特异性的，则CAR T细胞可能诱导正常细胞的细胞死亡。在与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养之后，将细胞与细胞死亡标志物一起孵育，然后通过FACS进行测定。huMNC2-CAR44 T细胞不诱导正常细胞中的细胞死亡(图53A-53J)。
除FACS分析之外，许多研究人员现在使用xCELLigence仪器来测量对癌细胞的CART杀伤。FACS不是跟踪T细胞诱导的细胞杀伤的最佳方法，因为T细胞会裂解靶细胞。通过FACS难以测量死细胞，因为它们作为细胞碎片被排除在外，所以必须推断细胞杀伤的量并且通过各种方法确定缺少的细胞是T细胞还是癌细胞。
xCELLigence仪器使用在其上铺板有癌细胞的电极阵列。贴壁的癌细胞使电极绝缘并因此随着它们的生长导致阻抗增加。相反地，T细胞不贴壁并保持悬浮，因此不帮助使阻抗增加的电极绝缘。但是，如果T细胞或CAR T细胞杀伤电极板上的癌细胞，则癌细胞在死亡时成球并上浮，导致阻抗降低。xCELLigence仪器测量作为时间的函数的阻抗，这与癌细胞杀伤有关。此外，电极板还具有观察窗口。当CAR T细胞有效杀伤吸附的靶癌细胞时，阻抗降低，但还可以看到板表面上没有留下癌细胞。
图55A-55H显示huMNC2-CAR44 T细胞对MUC1*阳性DU145前列腺癌细胞的细胞毒性作用，如通过多种测定所测量。图55A是未转导的T细胞与前列腺癌细胞一起共培养的荧光照片，其中颗粒酶B用红色荧光团染色。图55C是huMNC2-CAR44 T细胞与前列腺癌细胞一起共培养的荧光照片，其中颗粒酶B用红色荧光团染色。图55D是DAPI和颗粒酶B的合并。图55E是针对与癌细胞一起孵育的未转导的T细胞的荧光标记的颗粒酶B的FACS扫描。图55F是FACS扫描，其显示与癌细胞一起孵育的huMNC2-CAR44 T细胞的荧光标记的颗粒酶B的正增加。图55G是平均荧光强度的图。图55H是xCELLigence扫描，其跟踪huMNC2-CAR44 T细胞(蓝色迹线)而不是未转导的T细胞(绿色)对DU145癌细胞的实时杀伤。图56A-56H显示huMNC2-CAR44 T细胞对MUC1*阳性CAPAN-2胰腺癌细胞的细胞毒性作用，如通过多种测定所测量。图56A是未转导的T细胞与胰腺癌细胞一起共培养的荧光照片，其中颗粒酶B用红色荧光团染色。图56B是DAPI和颗粒酶B的合并。图56C是huMNC2-CAR44 T细胞与胰腺癌细胞一起共培养的荧光照片，其中颗粒酶B用红色荧光团染色。图56D是DAPI和颗粒酶B的合并。图56E是针对与癌细胞一起孵育的未转导的T细胞的荧光标记的颗粒酶B的FACS扫描。图56F是FACS扫描，其显示与癌细胞一起孵育的huMNC2-CAR44 T细胞的荧光标记的颗粒酶B的正增加。图56G是平均荧光强度的图。
图56H是xCELLigence扫描，其跟踪huMNC2-CAR44 T细胞(蓝色迹线)而不是未转导的T细胞(绿色)对CAPAN-2癌细胞的实时杀伤。图57A-57C显示xCELLigence扫描，其跟踪huMNC2-CAR44 T细胞对MUC1*阳性癌细胞而不是MUC1*阴性细胞的实时杀伤。图57A显示huMNC2-CAR44 T细胞有效杀伤已经用MUC1*稳定转染的HCT结肠癌细胞。图57B显示huMNC2-CAR44 T细胞对已经用全长MUC1稳定转染的MUC1阴性癌细胞HCT-MUC1-41TR几乎没有影响。在此细胞系中，仅约10％的细胞将MUC1切割成MUC1*。图57C显示，huMNC2-CAR44 T细胞对MUC1阴性结肠癌细胞系HCT-116细胞没有影响。
这些数据证明，用抗体片段靶向头是MNC2的CAR转导的T细胞有效地杀伤MUC1*阳性癌细胞。这些数据明确显示，转导到人T细胞中的huMNC2-scFV-CAR44有效地杀伤MUC1*阳性癌细胞。因为我们和其它人现在已经证明，CAR T功能的最重要的方面是靶向抗体片段，因此用任何具有抗体片段MNC2-scFV或huMNC2-scFV的CAR转导的免疫细胞或T细胞将具有类似的针对MUC1或MUC1*阳性肿瘤的功效。例如，将scFv连接到跨膜部分的铰链区可以是任何柔性接头。细胞内共刺激结构域可以是CD28-3ζ、CD28-4-1BB-3ζ或免疫细胞共刺激结构域的任何组合。
图61显示了测试huMNC2-scFv-CAR44转导的人T细胞抑制动物的肿瘤生长的能力的实验，所述细胞是珠子刺激的(方案1)或癌细胞刺激的(方案2)。将用荧光素酶稳定转染的人癌细胞注射到11与15周龄之间的雌性NOD/SCID/GAMMA(NSG)小鼠体内。将500,000个BT-20乳腺癌细胞皮下注射到后胁中。通过向动物注射虫荧光素，然后使用IVIS仪器对荧光癌细胞进行成像，来验证肿瘤移植。植入后第5天拍摄的IVIS图像显示存在肿瘤细胞。在IVIS测量之后的第6天，将动物一次性注射1000万个用huMNC2-scFv-CAR44转导的人T细胞或未转导的T细胞。肿瘤内注射500万个T细胞，并且尾部静脉中注射500万个。在IVIS照相之前10分钟，将小鼠IP注射虫荧光素，虫荧光素在被荧光素酶切割之后发出荧光，因此使肿瘤细胞发出荧光。图61A、61D、61G显示用huMNC2-scFv-CAR44 T细胞处理的小鼠的照片，所述细胞在施用之前24小时通过与4μm附接了合成MUC1*PSMGFR肽的珠粒一起共培养24小时来预刺激，“方案1”。图61B、61E、61H显示用huMNC2-scFv-CAR44 T细胞处理的小鼠的照片，所述细胞在施用之前24小时通过与MUC1*阳性癌细胞一起两次共培养，持续24小时来预刺激，“方案2”。如图61中可以看出的那样，肽-珠子刺激的huMNC2-CAR44 T细胞抑制肿瘤生长由于通过与肝癌细胞一起孵育来预刺激的细胞，肝癌细胞有可能污染靶细胞并且使肿瘤体积增加。
还测试了huMNC2-scFv-CAR44转导的人T细胞抑制动物的肿瘤生长的能力，所述细胞是珠子刺激的(方案1)或癌细胞刺激的(方案2)。将用荧光素酶稳定转染的人癌细胞注射到11与15周龄之间的雌性NOD/SCID/GAMMA(NSG)小鼠体内。在另一实验中，将500,000个BT-20MUC1*阳性三阴性乳腺癌细胞皮下注射到后胁中。通过向动物注射虫荧光素，然后使用IVIS仪器对荧光癌细胞进行成像，来验证肿瘤移植。植入后第6天拍摄的IVIS图像显示存在肿瘤细胞。第6天，在IVIS成像之后，将10M huMNC2-scFv-CAR44 T细胞施用于动物。5M的CART细胞通过肿瘤内注射来施用，并且另外5M通过尾部静脉注射来施用。对照组通过相同的施用途径注射相同数目的未转导的T细胞。在第6、8和12天取得肿瘤负荷的IVIS测量结果。如图61A-61J中可以看出的那样，与对照组相比，用huMNC2-CAR44 T细胞处理的两组小鼠均显示肿瘤负荷降低。
还测试了huMNC2-scFv-CAR44转导的人T细胞抑制动物的卵巢癌生长的能力的实验，所述细胞是珠子刺激的(方案1)。将用荧光素酶稳定转染的人SKOV-3MUC1*阳性卵巢癌细胞注射到11与15周龄之间的雌性NOD/SCID/GAMMA(NSG)小鼠体内。在一项实验中，将500,000个SKOV-3癌细胞注射到腹腔内以模拟人的转移性卵巢癌。通过向动物注射虫荧光素，然后使用IVIS仪器对荧光癌细胞进行成像，来验证肿瘤移植。植入后第3天拍摄的IVIS图像显示存在肿瘤细胞。在第4天和第11天，在肿瘤植入之后，将10M个huMNC2-scFv-CAR44 T细胞IP施用至动物。在第4天，IP注射CAR T细胞。在第11天，将一半的CAR T细胞注射到腹腔内，并且将另一半注射到尾部静脉中。对照组通过相同的施用途径注射相同数目的未转导的T细胞或相同体积的PBS。在第7天、第10天和第15天取得肿瘤负荷的后续IVIS测量结果。如图62A-62L中可以看出的那样，对照小鼠的肿瘤生长速度比huMNC2-CAR44 T细胞处理的小鼠快得多。图62M显示将光子/秒与颜色相关联的IVIS颜色条。
本发明的一个方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中向患者施用有效量的抗体、抗体片段，其可以并入到BiTE、双特异性抗体、多特异性抗体、ADC或在免疫细胞中表达的CAR中，其中抗体或其片段衍生自本发明的抗体。在优选的实施方案中，抗体或其片段衍生自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3或25E6。
本发明的一个方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中向患者施用有效量的用靶向MUC1*的CAR转导的免疫细胞，其中CAR选自MNE6-CD8-CD28-3z(SEQ ID NO:297-298)、MNE6-CD4-CD28-3z(SEQ ID NO:748-749)、MNE6-CD8-41BB-3z(SEQ ID NO:300-301)、MNE6-CD4-41BB-3z(SEQ ID NO:750-751)、MNE6-CD8-CD28-41BB-3z(SEQ ID NO:303-304)、MNE6-CD4-CD28-41BB-3z(SEQ ID NO:754-755)、MNE6scFv-Fc-8-41BB-CD3z(SEQ ID NO:310-311)、MNE6scFv-IgD-Fc-8-41BB-CD3z(SEQ ID NO:770-771)、MNE6scFv-FcH-8-41BB-CD3z(SEQ ID NO:315-316)、MNE6scFv-IgD-FcH-8-41BB-CD3z(SEQ ID NO:772-773)、MNE6scFv-Fc-4-41BB-CD3z(SEQ ID NO:318-319)、MNE6scFv-FcH-4-41BB-CD3z(SEQ ID NO:321-322)、MNE6scFv-IgD-8-41BB-CD3z(SEQ ID NO:323-324)、MNE6scFv-IgD-4-41BB-CD3z(SEQID NO:327-328)、MNE6scFv-X4-8-41BB-CD3z(SEQ ID NO:330-331)、MNE6scFv-X4-4-41BB-CD3z(SEQ ID NO:333-334)、MNE6scFv-8-4-41BB-CD3z(SEQ ID NO:336-337)或前述CAR中的任一种，其中MNE6被衍生自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的片段替换。本发明的另一方面是一种用于治疗被诊断患有癌症、疑似患有处于发展癌症的风险中的患者的方法，其中向患者施用有效量的用前述CAR中的一种转导的免疫细胞，其中MNE6被包含对癌症抗原具有特异性的抗体可变结构域片段的肽替换。在上文方法中的任一种中，免疫细胞可以是T细胞并且还可以进一步从待治疗的患者分离。替代地，免疫细胞可以是T细胞，是从供体分离的。在又一方面，免疫细胞衍生自已被引导在体外分化成所述免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，含有抗体序列的CAR在干细胞中表达，然后干细胞可以分化成免疫细胞。在一种情况下，免疫细胞是T细胞。在另一情况下，免疫细胞是NK细胞。
本发明的另一方面是一种用于治疗被诊断患有MUC1阳性或MUC1*阳性癌症、疑似患有所述癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者的方法，其中向患者施用有效量的用靶向MUC1*的CAR转导的免疫细胞。在优选的实施方案中，CAR可以包含单链抗体片段scFv，其包含衍生自以下的序列：抗体MNC2，诸如MNC2-scFv(SEQ ID NO:239、241、243或654-655)；抗体20A10，诸如SEQ ID NO:1574-1581或5001-5012；抗体3C2B1，诸如SEQ ID NO:1572-1573，其可以是人源化的，例如在SEQ ID NO:1812-1813中；或抗体5C6F3，诸如SEQ ID NO:1384-1385，其可以是人源化的，例如在SEQ ID NO:1814-1815中；或抗体25E6，诸如SEQ IDNO:1598-1599或1600-1601，其中铰链和跨膜序列可以衍生自CD8(SEQ ID NO:346和SEQ IDNO:364)或CD28(SEQ ID NO:350和SEQ ID NO:368)，还包含共刺激结构域，其可以是41BB(SEQ ID NO:659)或CD28(SEQ ID NO:378)，并且CD3-ζ信号传导结构域可以衍生自(SEQ IDNO:661)或可以含有突变，包括称为1XX的那些(SEQ ID NO:1796-1797)。
其它MUC1切割位点
已知除癌细胞之外，MUC1在一些健康细胞上被切割成生长因子受体形式MUC1*。例如，MUC1在健康的干细胞和祖细胞上被切割成MUC1*。大部分骨髓细胞呈MUC1*阳性。一部分肠细胞呈MUC1*阳性。
发明人已经发现，MUC1可以在彼此相对靠近的不同位置处被切割，但是切割的位置改变细胞外结构域的剩余部分的折叠。因此，可以鉴定结合在第一位置切割的MUC1*但不结合在第二个位置切割的MUC1*的单克隆抗体。此发现在2013年8月14日提交的WO2014/028668中公开，其内容以引用的方式整体并入本文。我们鉴定了一组抗MUC1*单克隆抗体，它们结合在癌细胞上出现的MUC1*，但不结合干细胞和祖细胞上出现的MUC1*。相反地，我们鉴定了第二组单克隆抗体，它们结合干细胞和祖细胞但不结合癌细胞。一种用于鉴定干细胞特异性抗体的方法如下：将单克隆杂交瘤的上清液分别吸附到2个多孔板上。将作为非贴壁细胞的干细胞放入一个板中，并且将贴壁的癌细胞放入相同板中。孵育期之后，冲洗并倒转各板。如果非贴壁干细胞粘在板上，那么具体孔中的单克隆抗体识别干细胞，并且将不识别癌细胞。未捕获干细胞的抗体或捕获癌细胞的抗体被鉴定为癌症特异性抗体。FACS分析已证实此方法有效。
抗体MNE6和MNC2是癌症特异性抗体的实例。抗体MNC3和MNC8是干细胞特异性抗体的实例。尽管两组抗体都能够结合具有PSMGFR序列的肽，但是FACS分析显示，抗MUC1*多克隆抗体和MNC3结合MUC1*阳性骨髓细胞，但MNE6不结合。MUC1*多克隆抗体是通过用PSMGFR肽使兔子免疫所生成的。类似地，MNC3结合肠隐窝的干细胞，但MNE6不结合。相反地，MNE6抗体结合癌性组织，而干细胞特异性MNC3不结合。竞争ELISA实验指示，PSMGFR肽的C-末端10个氨基酸是MNE6和MNC2结合所需的，但不是MNC3和MNC8所需的。因此，另一种用于鉴定癌症特异性抗体的方法是用具有PSMGFR肽的序列减去10个N-末端氨基酸的肽进行免疫，或使用所述肽针对癌症特异性抗体或抗体片段进行筛选。结合具有PSMGFR肽的序列减去N-末端10个氨基酸的肽(本文称为N-10肽)但不结合具有PSMGFR肽的序列减去C-末端10个氨基酸的肽(C-10肽)的抗体是在治疗或预防癌症中使用的癌症特异性抗体。
MUC1的细胞外结构域还在干细胞和一些祖细胞上被切割，其中二聚体形式的配体NME1或NME7激活切割的MUC1促进生长和多能性并抑制分化。切割之后保留的MUC1的跨膜部分称为MUC1*，并且细胞外结构域基本上包含MUC1生长因子受体(PSMGFR)序列的一级序列。然而，切割的确切位点可能根据细胞类型、组织类型或特定人表达或过度表达的切割酶而有所不同。除我们先前鉴定的留下包含大部分或全部PSMGFR(SEQ ID NO:2)的MUC1*的跨膜部分的切割位点之外，其它切割位点可能导致延伸的MUC1*，其包含大部分或全部
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:620)；或
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:621)。
为了测试此假设，并且确定针对N-末端延伸的PSMGFR的抗体是否将生成比结合PSMGFR的抗体多的癌症特异性抗体，我们通过用以下肽进行免疫生成了单克隆抗体：
(PSMGFR)
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:2)，
(N+20/C-27)
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTE(SEQ ID NO:822)，或
(N+9/C-9)
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVP(SEQ ID NO:824)。
从用相同肽进行免疫所生成的单克隆抗体还可以显示对相同癌性组织标本的反应性的差异。这些结果指示，单克隆抗体识别截短的MUC1细胞外结构域的不同构象，所述构象是通过用不同长度的肽进行免疫，模拟不同的切割位点，或从宿主动物的不同位点处的切割所产生的。识别不同切割位点构象的抗体可以是癌症亚型特异性或患者特异性的，这取决于它们的肿瘤表达哪种切割酶。在本发明的一个方面，被诊断患有某种类型的癌症的患者用本发明的抗体治疗，所述抗体识别切割的MUC1，其中所述抗体对已知通常由癌症亚型表达的特定酶的切割具有特异性。在另一方面，分析了患者肿瘤以确定他或她的肿瘤表达哪种酶，然后将识别被那种酶切割的MUC1的抗体施用于患者以治疗他们的癌症。抗体的形式可以是CAR、BiTE、ADC、双特异性抗体(具有或不具有FC区或Fc区的一部分)、双-scFv、二-scFv、串联二-scFv、双抗体、三抗体、三体、四抗体和其它多价且多特异性的抗体样分子。
我们先前报道了，它是介导肿瘤生长的MUC1跨膜切割产物(称为MUC1*(muk1star))而不是全长MUC1(Mahanta等人2008)。MUC1*是通过其短细胞外结构域的配体诱导二聚化而激活的生长因子受体(图1A)。MUC1*细胞外结构域的二聚化激活MAP激酶信号传导级联并刺激癌细胞的生长和存活(Fessler等人2009)。使MUC1*细胞外结构域二聚化的二价抗体刺激癌细胞生长，而不可二聚化的相同抗体的单价Fab抑制癌细胞生长。我们在体外(图1B)和体内(图7A-7B)证明了这一点。
然后我们鉴定了二聚化和激活MUC1*生长因子受体功能的天然配体。NME1的二聚体结合并二聚化MUC1*细胞外结构域且刺激生长(图1C和Smagghe等人2013)。NME1可以关闭其生长因子特性。NME1由MUC1*阳性细胞分泌。二聚体NME1结合MUC1*以刺激生长。然而，随着细胞群体生长，越来越多的NME1从细胞中分泌出来。在高浓度下，NME1二聚体多聚化并形成六聚体，它们不结合MUC1*，但可能结合一些未知的受体，因为添加NME1六聚体关闭生长。NME1为成人形式。初期形式是NME7AB(Carter等人2016)。每个NME7AB单体具有两个MUC1*结合位点，所以作为单体，它使MUC1*二聚化(图1D)，刺激生长并且不能自行关闭。在发育中的胚胎中，BRD4关闭NME7，并且其辅助因子JMJD6打开自我调控形式NME1。然而，在癌症中，应在成人生活中被沉默的NME7再次异常表达，这使得MUC1*生长因子受体具有组成型活性。
在体外，NME1(SEQ ID NO:4)和NME7AB(SEQ ID NO:827)结合MUC1*细胞外结构域的PSMGFR部分。两种生长因子均可以结合PSMGFR肽(SEQ ID NO:2)，即使10个N-末端氨基酸缺失(在本文中称为N-10(SEQ ID NO:3))亦如此。然而，如果10个膜近端氨基酸缺失(图2A-2D)(在本文中称为C-10(SEQ ID NO:825))，则NME1和NME7AB均不可以结合PSMGFR肽。概括地说，NME1和NME7AB结合的表位包括10个膜近端氨基酸的全部或一部分：PFPFSAQSGA(SEQ IDNO:1743)。我们测试了通过用PSMGFR肽进行免疫而在动物体内生成的各种抗体，以确定它们识别癌细胞但不识别健康细胞的能力。其中最具有癌症选择性的是MNC2和MNE6单克隆抗MUC1*抗体。用PSMGFR肽使动物免疫所生成的另外两种单克隆抗体是MNC3和MNC8。尽管MNC2、MNE6、MNC3和MNC8全部都结合PSMGFR肽，但与NME1和NME7AB一样，MNC2和MNE6与N-10肽强结合，但不与C-10肽结合(图2B-2C)。事实上，MNC2和MNE6竞争性地抑制NME1和NME7AB与PSMGFR的结合(图3A-3C)。相反地，MNC3和MNC8结合C-10肽，不太好地结合N-10肽，并且不与NME1和NME7AB竞争结合MUC1*肽，包括PSMGFR(图2E-2F)。MNC3和MNC8的癌症特异性远低于MNC2和MNE6。MNC3和MNC8识别干细胞和祖细胞，诸如造血干细胞，而MNC2和MNE6则不识别(图39-41)。因为造血干细胞是血细胞的祖细胞，所以使癌症治疗剂也靶向如此重要的正常细胞类型将是一个问题。
因为MUC1*是通过MUC1的酶促切割所生成的，所以我们研究了哪些切割酶将MUC1切割成MUC1*，以及我们是否可以鉴定出识别由第一切割酶生成的MUC1*但不识别由第二切割酶生成的MUC1*的抗体。我们发现，MNC2和MNE6识别通过MMP9切割MUC1而不是通过其它酶(诸如MMP2)的切割所生成的MUC1*(图37和图75)。我们注意到，MMP9在癌症中过表达，并且是预后不良的预测因子(vant Veer等人2002；Dufour等人2011)，并且与转移有关(Owyong等人,2019)，而MMP2在骨髓中表达。一种结合通过第一酶切割而不是通过第二酶切割所生成的MUC1*的抗体表明，所述抗体识别构象表位而不是线性表位。
我们推断，大多数癌症特异性抗体将是特征为以下大多数或全部的一些组合的抗体：
(i)抗体结合PSMGFR肽；
抗体不结合全长MUC1；
(ii)抗体结合N-10；
(iii)抗体不结合C-10；
(iv)抗体竞争性地抑制NME1或NME7AB与MUC1*细胞外结构域或PSMGFR肽的结合；
(v)抗体识别通过MMP9的切割所生成的MUC1*；
(vi)抗体识别构象表位而不是线性表位。
MNC2和MNE6是癌症特异性的。
我们的实验显示，MNC2和MNE6：a)结合肿瘤细胞；b)单价形式在体外和体内阻断肿瘤生长；c)对正常组织的结合极少甚至没有，而对广泛的肿瘤组织具有很强的结合力；d)当并入CAR T细胞时，MNC2和MNE6定向CAR T细胞不识别全长MUC1并且不杀伤仅表达全长MUC1的细胞；e)MNC2和MNE6定向CAR T细胞聚集然后杀伤表达MUC1*的肿瘤细胞；以及f)MNC2和MNE6识别被MMP9切割的MUC1切割产物。
MNC2定向CAR T细胞不识别MUC1*阳性的正常健康细胞。将一组正常细胞系以及原代细胞与huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养。分析正常细胞群体以确定MNC2定向CAR T细胞是否杀伤它们。分析CAR T细胞以查看与MUC1阳性正常细胞的共培养是否激活CAR T细胞的杀伤功能，如通过IL-2或干扰素γ的分泌所测量的。如图50-52所示，MNC2定向CAR T细胞不杀伤正常细胞，也没有细胞因子分泌，指示T细胞激活。此外，还分析了超过2,000个人组织标本。结果显示，MNC2和MNE6均未显示与正常组织的任何显著结合，但显示对大量癌性组织的强烈染色。例如，MNC2染色了93％的乳腺癌标本、83％的卵巢癌标本、78％的胰腺癌标本和71％的肺癌标本。此外，患者匹配的原发性肿瘤(图54)和随后的转移显示，MNC2反应性MUC1*的量随着肿瘤进展和转移而增加。概括地说，MNC2是高度癌症特异性抗体。
MNC2和MNE6的表征
我们的黄金标准，癌症特异性抗体MNC2和MNE6：1)结合N-10肽但不结合C-10肽；2)与NME7AB和二聚体NME1竞争PSMGFR肽的C-末端附近的相同结合位点，所述结合位点是细胞上MUC1*的膜近端部分；3)在蛋白质印迹测定中不起作用，指示它们识别构象而不是线性表位；4)识别MMP9切割MUC1时所生成的MUC1*；5)在模型细胞系以及癌细胞系中，不结合全长MUC1，而是仅结合切割形式MUC1*；6)与正常组织几乎没有结合，但强烈地染色多种肿瘤组织；以及7)在其互补决定区(CDR)中共享一些共有序列。
为了鉴定其它具有高度癌症特异性的抗体，如MNC2和MNE6，我们对新抗体进行了一组七(7)项表征实验：1)表位结合测定；2)功能测定，诸如从与MUC1*肽PSMGFR或N-10的结合置换激活生长因子NME7AB或二聚体NME1的能力；3)蛋白质印迹，确定抗体是否识别线性表位与构象表位，在这种情况下抗体在蛋白质印迹中不起作用；4)结合测定，查看抗体是否识别依赖于MMP9切割的切割MUC1；5)FACS分析，测量抗体识别MUC1*阳性细胞而非全长MUC1的能力；和FACS分析，测量抗体识别MUC1/MUC1*阳性癌细胞的能力；6)对正常组织与癌性组织的免疫组织化学IHC测定，确定真正的癌症特异性；以及7)比对抗体序列，确定抗体的子集是否共享共有序列，从而可以预测其癌症特异性或缺乏癌症特异性。
通过用衍生自缺乏串联重复序列的MUC1的肽使动物免疫来产生单克隆抗体。这些抗体包括PSMGFR和在PSMGFR的N-末端延伸的肽。免疫肽是：
PSMGFR(SEQ ID NO:2)
N+9/C-9(9个氨基酸添加到N-末端并且从C-末端缺失9个氨基酸)(SEQ ID NO:824)
N+20/C-27(20个氨基酸添加到N-末端并且从C-末端缺失27个氨基酸)(SEQ IDNO:823)。
然后测试这些单克隆抗体以确定哪些满足上文引用的七(7)个表征标准，我们推断这将鉴定出最具有癌症特异性的抗体。
表位结合测定
进行ELISA测定以确定除识别它们的免疫肽之外，它们是否识别PSMGFR、N-10或C-10。此外，还测试了它们结合N+20/C-27、N+9/C-9的能力。我们首先对我们的一组参考抗体MNC2、MNE6(我们已知其为癌症特异性的)加上MNC3(我们已知其识别干细胞和祖细胞)进行了ELISA测定(图63A-63B)。参考抗体都不结合N+20/C-27肽。MNC2和MNE6不可结合具有27、10或9个C-末端缺失的PSMGFR肽，但是，MNC3结合C-10和N+9/C-9肽。
对本发明的抗体进行了相同的ELISA测定(图64-66和图201)。通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体的结合模式如图64A-64B所示。需注意，仅20A10完全匹配MNC2和MNE6的结合概况。25E6、28F9和18G12全部都能够结合N-10肽。18B4是唯一针对PSMGFR肽而产生的抗体，其需要肽的10个最N-末端氨基酸。ELISA图中每种抗体的条的颜色都被颜色编码，以匹配那个抗体的推导同源序列或其一部分。此外，通过ELISA测定了另一组抗体(图201)。在这个组中，B12、B2、B7、B9、8C7F3和H11结合PSMGFR肽，结合N-10肽，但不结合C-10肽(图201)。通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体的结合模式如图65A-65B所示。尽管这些抗体是针对N+20/C-27肽而产生的，但除45C11之外的所有抗体仍然结合PSMGFR肽，尽管是在PSMGFR的N-末端部分。45C11的结合很弱，但演绎推理显示，所有或一部分同源表位必须位于SNIKFRPGSVV(SEQ ID NO:1744)内。
在通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体中，8A9和17H6不结合PSMGFR肽，所以必须结合9个额外的N-末端氨基酸。抗体3C5和39H5似乎结合PSMGFR肽的10个最N-末端氨基酸。
为了进一步细化每个抗体结合的表位，合成了衍生自PSMGFR序列的一系列较小肽：N-30(SEQ ID NO:7)、N-26(SEQ ID NO:6)、N-19(SEQ ID NO:4)、N-10/C-5(SEQ ID NO:8)、N-19/C-5(SEQ ID NO:9)。在ELISA测定中测试了每种抗体结合细化的这组肽加上PSMGFR、N-10和C-10肽的能力(图67-69)。
在图67A-67D中，测定了通过用PSMGFR肽进行免疫所生成的抗体。如从图中可以看出的那样，基本上在PSMGFR肽的中间的氨基酸ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)对于28F9、18G12、25E6和MNC3抗体的结合是重要的或必需的。构成PSMGFR肽的最N-末端部分的氨基酸GTINVHDVET(SEQ ID NO:1746)对于18B4抗体的结合是重要的或必需的。氨基酸FPFS(SEQID NO:1747)对于20A10、MNC2和MNE6的结合是重要的或必需的。我们注意到，这三种抗体识别构象表位，而不是线性表位。因为FPFS序列中的脯氨酸显著改变了PSMGFR肽的附近部分的构象，所以也有可能的是，抗体不直接结合这四个氨基酸，但不存在脯氨酸改变剩余肽的折叠，使得20A10、MNC2和MNE6结合的构象不再存在。
在图68A-68D中，测定了通过用N+20/C-27肽进行免疫所生成的抗体。如从图中可以看出的那样，构成PSMGFR肽的最N-末端部分的氨基酸GTINVHDVET对于29H1、32C1和31A1抗体的结合是重要的或必需的。作为在PSMGFR肽的N-末端且在PSMGFR肽外部的20个额外氨基酸的氨基酸SNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(SEQ ID NO:1748)对于抗体45C11的结合是重要的或必需的。然而，重新参照图65，抗体45C11不能结合N+9/C-9肽，因此我们断定，在SNIKFRPGSVV序列内的氨基酸对于45C11的结合是必需的。仍在序列PSMGFR内的氨基酸QFNQYKTEA(SEQ ID NO:1749)对于抗体1E4的结合是重要的或必需的。
在图69A-69D中，测定了通过用N+9/C-9肽进行免疫所生成的抗体。如从图中可以看出的那样，构成PSMGFR肽的最N-末端部分的氨基酸GTINVHDVET对于39H5和3C5抗体的结合是重要的或必需的。如从图中可以看出的那样，作为在PSMGFR肽的N-末端且在PSMGFR肽外部的9个额外氨基酸的氨基酸VQLTLAFRE(SEQ IDNO:1750)对于抗体17H6和8A9的结合是重要的或必需的。因为17H6和8A9抗体不结合图中显示的任何较小肽，所以参照图66A-66C，其显示这两种抗体仅结合在PSMGFR的N-末端的具有9个额外氨基酸的肽。
以下表2列出了本发明的抗体及其同源表位。
置换与MUC1*细胞外结构域肽PSMGFR结合的NME7AB的能力
我们先前报道了，二聚体NME1使MUC1*细胞外结构域二聚化并刺激生长。单体NME7AB具有两个MUC1*结合位点，使得作为单体，它使MUC1*二聚化并介导癌细胞生长。我们发现，NME1和NME7AB可以结合MUC1*细胞外结构域。在体外，NME1和NME7AB结合PSMGFR肽，即使10个N-末端氨基酸缺失(在本文中称为N-10(SEQ ID NO:3))亦如此。然而，如果10个膜近端氨基酸缺失(在本文中称为C-10(SEQ ID NO:825))，则NME1和NME7AB均不可以结合PSMGFR肽。概括地说，NME1和NME7AB结合的表位包括10个膜近端氨基酸的全部或一部分：PFPFSAQSGA(SEQ ID NO:1743)。我们测试了通过用PSMGFR肽进行免疫而在动物体内生成的各种抗体，以确定它们识别癌细胞但不识别健康细胞的能力。其中最具有癌症选择性的是MNC2和MNE6单克隆抗MUC1*抗体。用PSMGFR肽使动物免疫所生成的另外两种单克隆抗体是MNC3和MNC8。尽管MNC2、MNE6、MNC3和MNC8全部都结合PSMGFR肽，但与NME1和NME7AB一样，MNC2和MNE6与N-10肽强结合，但不与C-10肽结合。事实上，MNC2和MNE6竞争性地抑制NME1和NME7AB与PSMGFR的结合。相反地，MNC3和MNC8能够结合C-10肽，不太好地结合N-10肽，并且不与NME1和NME7AB竞争结合MUC1*肽，包括PSMGFR(图70)。MNC3和MNC8的癌症特异性低于MNC2和MNE6。MNC3和MNC8识别干细胞和祖细胞，诸如造血干细胞，而MNC2和MNE6则不识别。因为造血干细胞是血细胞的祖细胞，所以使癌症治疗剂也靶向如此重要的正常细胞类型将是一个问题。
在这项实验中，测试了本发明的抗体从与PSMGFR肽的结合置换NME7AB的能力。在此实验中，多孔板涂覆有PSMGFR肽。使重组NME7AB结合表面固定的PSMGFR肽。接着是洗涤步骤。添加各种抗体，之后进行洗涤步骤。通过检测NME7AB上的标签来测量在抗体竞争之后仍然附接至涂覆PSMGFR的板的NME7AB的量。作为对照，还测试了抗NME7AB抗体从PSMGFR置换NME7AB的能力。图70显示ELISA置换测定的图。条形图是颜色编码的，以指示每个抗体结合的同源表位。如从图中可以看出的那样，结合PSMGFR的更C-末端部分的抗体最有效破坏癌胚生长因子NME7AB与MUC1*细胞外结构域或PSMGFR肽的结合。根据其同源表位，破坏NME7AB与PSMGFR结合的效力的排序如下：FPFS＞ASRYNLT＞QFNQYKTEA＞GTINVHDVET。结合PSMGFR肽的外部的表位的抗体诸如45C11、8A9和17H6不与NME7AB竞争结合。
确定线性与构象同源表位的蛋白质印迹测定
对抗体进行测试以确定它们是否识别线性表位或构象表位。当使用变性凝胶时，只有识别线性表位的抗体才在蛋白质印迹中发挥作用。为了比较，测试了已知抗体结合MUC1阴性癌细胞系HCT-116、用全长MUC1转染的HCT的切割抗性克隆HCT-MUC1-18和用MUC1*转染的HCT的能力，其中细胞外结构域仅包含PSMGFR序列。为了比较而测试的抗体是MNC2和MNE6(已知其仅识别构象表位)、SDIX(其为针对PSMGFR而产生的多克隆抗体)和VU4H5(其为识别全长MUC1的串联重复序列的可商购获得的单克隆抗体)(图71A-71D)。如可以看出的那样，MNC2和MNE6都不识别MUC1或MUC1*特异性线性表位。图71A和71E显示，抗体20A10也不识别MUC1或MUC1*特异性线性表位。SDIX多克隆抗体识别HCT-MUC1*，但不识别全长MUC1，并且VU4H5仅识别全长MUC1。还测试了这些相同的抗体在两种乳腺癌细胞系1500(又名Zr-75-1)和T47D细胞的蛋白质印迹中的作用，并且显示相同的结合模式(图71E-71H)。
针对PSMGFR肽产生的抗体在蛋白质印迹中以相同方式进行测试(图72A-72P)。如可以看出的那样，抗体25E6和18B4识别线性表位，但20A10(图72A；72I)、3C2B1(图72F；72N)、5C6F3(图72G；72O)、18G12和28F9不识别，表明它们结合构象表位。针对N+20/C-27肽而产生的抗体在蛋白质印迹中以相同方式进行测试(图73A-73J)。如可以看出的那样，抗体31A1和32C1识别线性表位。抗体1E4和45C11可能识别构象表位。针对N+9/C-9肽而产生的抗体在蛋白质印迹中以相同方式进行测试(图74A-74H)。如可以看出的那样，这些抗体都不识别线性MUC1或MUC1*特异性表位。这些抗体可能识别构象表位。然而，另一种解释是，在蛋白质印迹中缺乏结合意味着它们不特异性识别MUC1或MUC1切割产物，或者此测定中使用的浓度不足。
对MMP9切割之后的MUC1切割产物的识别
我们先前证明了，MNC2识别当全长MUC1被基质金属蛋白酶9(MMP9)切割时所生成的MUC1*(图37)。MMP9由肿瘤组织表达，并且是乳腺癌的预后不良的预测因子(vant Veer等人2002；Dufour等人2011)。MMP9还与转移有关(Owyong等人2019)。还记得，MNC2竞争性地抑制癌胚生长因子NME7AB与MUC1*细胞外结构域的结合(图3)。因此结果是，激活MUC1*的生长和存活功能的癌胚生长因子也识别通过MMP9切割所生成的MUC1*。然后结果是，大多数癌症特异性抗体是识别MUC1被MMP9切割成MUC1*时所形成的构象表位的抗体。
测试了通过用PSMGFR、N+20/C-27或N+9/C-9进行免疫所生成的抗体识别被MMP9切割之后的MUC1的能力。为此，我们用全长MUC1转染MUC1阴性结肠癌细胞系HCT-116，并且分离出切割抗性的单细胞克隆；这种切割抗性细胞系称为HCT-MUC1-18。向HCT-MUC1-18细胞中添加催化活性的MMP9或MMP2。将以一定浓度范围添加的酶与细胞一起孵育24小时。然后将所得细胞与各种抗体一起孵育并且通过FACS进行分析以确定哪些结合通过MMP9切割所生成的MUC1切割产物(图75A-75N)。需注意，每张图的第一个条形显示在不存在切割的情况下，没有抗体结合全长MUC1。每个条形图用那个测定中使用的抗体的名称及其同源表位标记。图从右到左的顺序对应于抗体的同源表位离细胞表面的距离。结合PSMGFR肽内更C-末端表位的抗体诸如20A10(图75E)、3C2B1(图75O)和5C6F3(图75P)显示与MMP9而不是MMP2切割之后的MUC1切割产物的结合的浓度依赖性增加。结合在MUC1的PSMGFR部分外部的SNIKFRPGSVV表位的抗体45C11不识别MMP9或MMP2切割之后的MUC1切割产物(图75K)。类似地，抗体8A9和17H6结合也在PSMGFR序列外部的VQLTLAFRE表位，并且它们不结合MMP9或MMP2切割的MUC1。此结果与MMP9切割MUC1使得剩余跨膜切割产物的细胞外结构域基本上包含PSMGFR肽的氨基酸的想法一致。对于最大程度的癌症特异性，抗体应识别当MMP9切割MUC1时所产生的MUC1切割产物的构象表位。在图75A-75N所示的抗体中，只有20A10识别通过MMP9切割所产生的MUC1切割产物，并且在蛋白质印迹中也不起作用，指示它识别构象表位，像MNC2和MNE6一样。MUC1的大规模串联重复结构域的切割和释放暴露MUC1*上的异位结合位点；除构象表位之外，线性表位也将暴露。
与一组癌细胞系的结合的FACS分析
对参考抗体以及本发明的新抗体进行了荧光激活细胞分选FACS。进行了对参考抗体MNC2(“C2”)和VU4H5与MUC1阴性细胞系HCT-116、用MUC1*转染的HCT(“HCT-MUC1*”)、用全长MUC1转染的HCT的切割抗性单细胞克隆(“HCT-MUC1-18”)的结合以及MNC2与乳腺癌细胞系T47D或乳腺癌细胞系1500(也称为ZR-75-1)的FACS分析(图76A-76J)。此分析显示，MNC2结合MUC1*的细胞外结构域上的异位结合位点，所述位点仅在切割和释放包含串联重复结构域的细胞外结构域的大部分之后才可供使用。VU4H5结合全长MUC1的串联重复结构域中的数百个重复表位并且不结合MUC1*。虽然我们已知，癌细胞系表达全长MUC1和MUC1*，但迄今为止，针对全长MUC1的抗体尚未显示出治疗价值。Stimuvax、ImMucin、IMGN242、SAR566658、PankoMab和AS1402全部都是结合全长MUC1的抗体并且全部都未能在临床试验中显示出功效。MUC1*，而不是全长MUC1，是介导癌细胞的生长(Mahanta等人2008)及其对化疗剂的抗性(Fessler等人2009)的有效的生长因子受体。这些研究显示，全长MUC1没有肿瘤促进活性。此外，IHC研究显示，随着肿瘤阶段增加，MUC1*的量随着全长MUC1的量减少而增加(图54)。事实上，用乳腺癌的组织微阵列的研究显示，几乎30％的乳腺癌标本没有可检测的全长MUC1，相比之下只有5％的乳腺癌标本对MUC1*呈阴性(图10-11)。对于靶向全长MUC1的疗法需要考虑的点是，如果表达全长MUC1的细胞被消除，那么仅仅富集肿瘤群体的更具毒性的MUC1*生长因子受体表达细胞，这将使癌症恶化。
通过FACS分析参考抗体MNC2(“C2”)结合一组癌细胞系的能力，所述细胞系全部呈MUC1*阳性，MDA-MB-231除外，其表达MUC1和MUC1*水平很低，经常用作阴性对照。(图77A-77N)。用MNC2探测的癌细胞组包括T47D和1500乳腺癌细胞、NCI-H292和NCI-H1975肺癌细胞、SKOV-3卵巢癌细胞、HPAF-II和Capan-1胰腺癌细胞、DU145前列腺癌细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞，它们几乎呈MUC1和MUC1*阴性。MNC2稳健地识别多种癌细胞系。我们注意到，虽然MNC2识别HPAF-II胰腺细胞，但它同样不识别另一种胰腺细胞系Capan-1。类似地，MNC2不很好地识别前列腺癌细胞系DU145。在IHC组织研究中，我们发现，MNC2识别了大约57％的前列腺癌组织和78％的胰腺组织，尽管具有显著的肿瘤异质性。
图78A-78C显示已在N-末端和C-末端延伸或缺失的PSMGFR序列的彩色编码示意图。针对肽的子集测试了本发明抗体以进一步细化每种抗体结合的表位或每种抗体结合的表位内的关键氨基酸。图78A是肽的各种子集的比对示意图。图78B列出与每个颜色编码序列结合的抗体。图78C列出每种抗体识别的癌细胞系。
图80-87显示FACS分析的图，其中比较了本发明的抗体特异性识别不同类型癌细胞的能力。测量了被识别的细胞百分比以及平均荧光强度MFI。仅考虑这些FACS实验，它们显示，只有识别PSMGFR肽的抗体能够识别癌细胞系。结合在PSMGFR序列外部的表位结合的抗体不特异性识别这些癌细胞系。
确定真正的癌症特异性的正常与癌性组织的IHC组织研究
对组织微阵列“TMA”的免疫组织化学IHC组织研究是比对单个癌细胞系的FACS分析更严格的对抗体的癌症特异性的测试。癌细胞系是数十年来在实验室中扩增的来自单个患者的单个细胞。细胞系是有限的，因为它们不代表人群的横断面。此外，在体外培养细胞系数十年之后，它可能看起来不再像原始细胞。而且，没有真正的正常细胞系以供比较，因为它们必须永生。组织研究提供更多信息，因为每个组织微阵列包含多个供体的组织，并且细胞处于其自然环境中，无需在非生理条件下培养多年。此外，组织提供关于肿瘤异质性的信息以及关于正常的表达模式的信息。使用本发明的每种抗体探测正常组织微阵列，FDA正常阵列MNO1021。此外，还使用抗体探测一组癌性组织阵列。在一些情况下，在有限数目的癌性组织阵列上测试了对正常组织(尤其是关键器官，诸如心脏或肺)显示强染色的抗体，因为它们与正常组织的交叉反应性将它们从考虑为抗癌治疗剂中排除。
图113-200显示本发明的每种抗体的正常TMA相对于癌性TMA的IHC染色的照片。
图113-120显示用抗体20A10探测的组织研究的照片。回想一下，20A10结合PSMGFR肽，结合N-10肽但不结合C-10肽。细化的表位作图(epitope mapping)显示，与MNC2和MNE6一样，20A10的结合取决于PSMGFR肽中存在的氨基酸FPFS。20A10结合MUC1*细胞外结构域的最膜近端部分。FDA正常组织阵列MNO1021的概况如图113所示。图114A-114X显示20A10对正常组织几乎没有交叉反应性。我们注意到，MNC2、MNE6和20A10全部都与MUC1*反应，MUC1*在末端乳腺导管的内腔边缘、输卵管的内腔边缘、约10％的正常肾远端集合导管的内腔边缘和输尿管的内腔边缘上表达。因为染色严格限于导管和腺体的子集的内腔边缘，所以这些抗体被认为作为治疗剂是安全的，因为导管和腺体内部免受血液携带的大实体(诸如抗体或CAR T细胞)的影响。重要的是，MNC2、MNE6和20A10未显示关键器官(诸如心脏、肺和脑)的染色。形成鲜明对比的是，20A10与MNC2和MNE6一样，与癌性组织稳健结合。20A10几乎将BR1141乳腺癌阵列的所有标本染色(图115-116)。除对乳腺癌组织的稳健染色之外，染色还是膜染色，指示20A10识别MUC1*的细胞外部分，这对于有效的基于抗体的抗癌治疗剂来说是关键的。20A10还显示对胰腺癌组织(图117-118)和食道癌组织(图119-120)的稳健和膜性染色。概括地说，20A10显示出很高的癌症特异性，并且作为抗癌治疗剂，因为正常组织与癌性组织的染色之间在染色的位置和强度方面存在巨大差异，所以提供了很大的治疗窗口。
抗MUC1*抗体3C2B1是与MNC2、MNE6和20A10一样结合N-10但不结合C-10的抗体。更细化的表位作图显示，与这三种其它高度癌症特异性抗体一样，3C2B1需要FPFS序列以便与MUC1*细胞外结构域肽结合。图121显示FDA正常阵列MNO1021的照片。图122A-122X显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片，如可以看出的那样，3C2B1不与任何关键的正常器官结合。图123显示用1-20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片。图124显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片。图125显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片。图126A-126F显示用20ug/mL的抗PSMGFR抗体3C2B1染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的放大照片。如从图中可以看出的那样，3C2B1稳健染色乳腺癌组织。
抗MUC1*抗体5C6F3结合N-10肽，结合C-10肽，但是结合一定程度地降低。其同源表位包含序列SVSDV(SEQ ID NO:1751)中的全部或一些。图127显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的FDA正常组织阵列MNO1021的照片。图128显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的FDA正常组织阵列MNO1021的特定组织的照片。图129显示用1-20ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的胰腺癌组织阵列PA1003的照片。图130显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的胰腺癌组织阵列PA1003的特定组织的照片。图131显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的乳腺癌组织阵列BR1141的照片。图132显示用1ug/mL的抗PSMGFR抗体5C6F3染色的乳腺癌组织阵列BR1141的特定组织的照片。如从图中可以看出的那样，5C6F3是高亲和力抗体，其具有很高的癌症特异性并且除肾上腺(可能是组织的人工制品)之外，不显示出与正常组织的结合。
与结合MUC1*细胞外结构域的最膜近端部分的20A10相比，18B4在作为PSMGFR序列的最远端部分的GTINVHDVET序列内结合。与抗体MNC2、MNE6或20A10不同，18B4不可结合N-10肽，但结合C-10肽。图133-134显示抗体18B4与正常组织的结合。与20A10相反，抗体18B4显示与多种正常组织的强结合(图134)，包括肺(图134K)。图135-138显示乳腺癌组织和食管癌组织的18B4染色。由于18B4与正常组织的强结合，此抗体的癌症特异性较低。
图139-144显示PSMGFR抗体18G12与正常组织、乳腺癌组织和食道癌组织的结合。18G12能够结合N-10肽，但同样能够结合C-10肽。18G12结合在PSMGFR肽内的ASRYNLT表位。抗体18G12结合许多正常肾集合导管的内腔边缘(图140D)，结合正常心肌(图140I)以及正常骨骼肌(图140X)。然而，存在明显的癌症特异性，因为18G12与癌性组织的结合比与少数正常组织的结合强得多。此外，18G12染色整个癌性组织，而不仅仅是不同地方的内腔边缘。图141-146显示乳腺癌组织、胰腺癌组织和食管癌组织的18G12染色。正常组织与癌组织的染色之间的对比清楚地证明了癌症特异性。
图147-148显示PSMGFR抗体25E6与正常组织的结合。25E6能够结合N-10肽，但同样能够结合C-10肽。25E6结合在PSMGFR肽内的ASRYNLT表位。与MNC2、MNE6和20A10一样，抗体25E6结合末端乳腺导管的内腔边缘、输卵管的内腔边缘、正常肾远端集合导管的子集的内腔边缘和输尿管的内腔边缘。与MNC2、MNE6和20A10不同，25E6结合(尽管非常弱)正常心肌(图148I)以及正常骨骼肌(图148X)。然而，存在明显的癌症特异性，因为25E6与癌性组织的结合比与少数正常组织的结合强得多。此外，25E6染色整个癌性组织，而不仅仅是不同地方的内腔边缘。图149-152显示乳腺癌组织和胰腺癌组织的25E6染色。正常组织与癌组织的染色之间的对比清楚地证明了癌症特异性。
图153-156显示PSMGFR抗体28F9与正常组织和乳腺癌组织的结合。28F9能够结合N-10肽，但同样能够结合C-10肽。28F9结合在PSMGFR肽内的ASRYNLT表位。与MNC2、MNE6和20A10一样，抗体25E6结合末端乳腺导管的内腔边缘、输卵管的内腔边缘、正常肾远端集合导管的子集的内腔边缘和输尿管的内腔边缘。图155-156显示乳腺癌组织的28F9染色。
图157-158显示N+20/C-27抗体1E4与正常组织的结合。1E4能够结合N-10肽，但同样能够结合C-10肽。1E4结合在PSMGFR序列内的QFNQYKTEA序列。对整个正常组织微阵列的检查(图157A)显示，抗体1E4结合许多正常组织，包括脑、小脑、所有3个肝样本、胰腺、甲状旁腺、脊髓和骨骼肌。放大图像显示，1E4也染色心脏染色(图158I)。乳腺癌阵列的1E4染色(图159-160)显示，存在一定的癌症特异性。
图161-162显示N+20/C-27抗体29H1与正常组织的结合。29H1在GTINVHDVET序列内结合，所述序列是PSMGFR序列的最远端部分。与抗体MNC2、MNE6或20A10不同，29H1不可结合N-10肽，但结合C-10肽。对整个正常组织微阵列的检查(图157A)显示，即使浓度低至0.5ug/mL，抗体29H1也强染色多种正常组织，包括脑、心脏、肝和肺。乳腺癌阵列的29H1染色(图163-164)和胰腺癌组织阵列的染色(图165-166)显示不存在癌症特异性。
抗体31A1与29H1类似，因为它们都是在GTINVHDVET(SEQ ID NO:1746)序列内结合的N+20/C-27抗体，所述序列是PSMGFR序列的最远端部分。与抗体MNC2、MNE6或20A10不同，31A1和29H1都不可结合N-10肽，但结合C-10肽。对整个正常组织微阵列的检查和放大图像(图167-168)显示，即使浓度低至0.5ug/mL，抗体31A1也强染色多种正常组织，包括脑、心脏、肺、脾、骨髓和骨骼肌。使用31A1对乳腺癌阵列进行染色(图169-170)。在一定浓度范围内使用31A1对胰腺癌组织阵列进行染色(图171-172)。这些图显示，31A1的癌症特异性不足。
抗体32C1与29H1和31A1类似，因为它们都是在GTINVHDVET序列内结合的N+20/C-27抗体，所述序列是PSMGFR序列的最远端部分。与抗体MNC2、MNE6或20A10不同，32C1、31A1或29H1都不可结合N-10肽，但都结合C-10肽。对整个正常组织微阵列的检查和放大图像(图173-174)显示，即使浓度低至0.25ug/mL，抗体32C1也强染色多种正常组织，包括脑、心脏、肺、肝、脾和骨髓。还使用32C1探测乳腺癌阵列(图175-176)。在一定浓度范围内使用32C1对食管癌组织阵列进行染色(图177-178)。合起来看，这些图显示，32C1的癌症特异性不足。
抗体45C11是结合表位SNIKFRPGSVV(SEQ ID NO:1744)的N+20/C-27抗体，所述表位是N-末端在PSMGFR序列外部的20个氨基酸。45C11不结合N-10肽。将正常组织阵列FDAMNO1021用12.5ug/mL的45C11染色(图179-180)。如从图中可以看出的那样，45C11显示与许多正常组织的强结合，包括脑、心脏、肺、肝、脾、骨骼肌和骨髓。在一定浓度范围内使用45C11对乳腺癌组织阵列进行染色(图181-182)。还使用45C11对胰腺癌组织阵列进行染色(图183-184)。合起来看，这些图显示，45C11没有癌症特异性。
抗体3C5是结合表位GTINVHDVET的N+9/C-9抗体。与结合此表位的其它抗体(诸如32C1、29H1和31A1)一样，它们结合PSMGFR序列的最远端(即最N-末端)部分。与抗体MNC2、MNE6或20A10不同，3C5、32C1、31A1或29H1都不可结合N-10肽，但都结合C-10肽。对整个正常组织微阵列的检查(其中3C5以10ug/mL使用)和放大图像(图185-186)显示，抗体3C5强染色一些正常组织，包括脑、心脏、肾上腺和骨髓。还以10ug/mL使用3C5探测胰腺癌阵列(图187-188)。合起来看，这些图显示，3C5没有癌症特异性。
抗体8A9是结合在PSMGFR序列外部的表位VQLTLAFRE的N+9/C-9抗体。抗体8A9不能结合N-10肽。将正常组织阵列FDA MNO1021用8A9染色(图189-190)。如从图中可以看出的那样，与同样结合超过PSMGFR序列的N-末端的表位的抗体45C11一样，抗体8A9显示与许多正常组织的强结合，包括肾上腺、脑、心脏、肺、肝、脾、骨骼肌和骨髓。用抗体8A9染色的胰腺癌阵列显示与胰腺癌组织子集的弱结合(图191-192)。合起来看，这些图显示，8A9没有癌症特异性。
抗体17H6是结合在PSMGFR序列外部的表位VQLTLAFRE的N+9/C-9抗体。使用17H6对正常组织阵列MNO1021进行染色。对整个正常组织微阵列的检查和放大图像(图193-194)显示，抗体17H6染色一些正常组织，包括脑、心脏、肾上腺、骨髓和骨骼肌。使用17H6探测胰腺癌阵列，并且其显示与大多数胰腺癌组织的弱结合(图195-196)。然而，17H6与关键器官的若干正常组织的结合显示，17H6几乎没有癌症特异性。
抗体39H5是弱结合完整PSMGFR肽，但不显著结合任何子集肽的N+9/C-9抗体。39H5可结合GTINVHDVET，其是PSMGFR序列的最远端部分。对整个正常组织微阵列的检查和放大图像(图197-198)显示，抗体39H5染色一些正常组织，包括脑、心脏、肝和骨髓。使用39H5探测胰腺癌阵列(图199-200)。尽管39H5染色很大一部分胰腺癌标本，但考虑到39H5染色了正常组织，39H5几乎没有癌症特异性。
FACS分析的总结
使用细胞系确定抗体的癌症特异性是困难的，因为这些细胞是数十年前从单个患者的肿瘤获得的，然后在培养物中增殖了数十年。即使患者的肿瘤在某一点上是异质的，数十年的体外培养也基本上使细胞系成为单细胞克隆。通过FACS对本发明的抗体进行了测定，以确定它们是否结合MUC1或MUC1*阳性癌细胞但不结合MUC1阴性细胞。这些实验的结果显示在图76-87中。非常清楚的是，结合在PSMGFR序列外部和N-末端的MUC1序列的表位的抗体没有显示癌症特异性。现在参考平均荧光强度(MFI)的读数，似乎在PSMGFR序列的非常N-末端具有同源表位的抗体(诸如结合GTINVHDVET内的表位的那些)显示癌症特异性远低于识别更C-末端表位的抗体。例如，不结合C-10肽的抗体MNC2与几乎每个MUC1*阳性细胞系都强结合(图76-77)。然而，更仔细的检查显示，MNC2与肺癌细胞系NCI-H1975的结合比NCI-H292强得多。类似地，MNC2与胰腺细胞系HPAF-II的结合比Capan-1或前列腺癌细胞系DU145好得多。PCR测量结果显示，切割酶的表达水平在一组癌细胞系中变化很大(图43和图44)。MUC1*细胞外结构域的折叠可能根据剪切它的切割酶而变化很大，从而有可能解释单个抗体识别的癌细胞系之间的差异。各种细胞系的抗体识别的这种变化(即使在癌症亚型中也是如此)在图中是显而易见的。
IHC数据的总结
对真实组织(包括正常组织和癌性组织)的IHC分析比对培养细胞系的研究提供更多信息，这在FACS分析中是必需的。首先在一定浓度范围内测试每种抗体以确定最佳浓度。增加抗体浓度，直到基质也被染色，这指示非特异性背景结合。然后认为特定抗体的最佳浓度刚好低于抗体染色基质的浓度。
IHC组织研究的概述如图88-112所示。在这里，我们专注于抗体与关键器官组织的结合，因为与某些正常组织的结合可能消除抗体的治疗用途。在这些图中，根据同源表位将抗体分组。从组织研究中可以明显看出，表位离细胞膜越远，它与正常组织上正常MUC1的结合就越多。例如，识别特定表位的代表性抗体与正常心脏组织的结合如图88A-88L所示。如图所示，结合PSMGFR肽N-末端的表位(诸如在SNIKFRPGSVV或VQLTLAFRE内的表位)的抗体显示与正常心脏强结合，使得它们不可在治疗剂中使用。此外，与PSMGFR的更N-末端部分结合的抗体(诸如29H1)也显示与正常心脏的结合。与正常组织结合最少并且与癌性组织结合最强的抗体结合FPFS或PFPFSAQSGA内的表位。一些结合在ASRYNLT部分内的表位的抗体也可能适合作为治疗剂。这些抗体和其它识别相同表位的抗体作为抗癌治疗剂是理想的，因为它们具有很大的治疗窗口，意味着由于与正常组织的结合低且副作用低，可以在足够高以有效杀伤肿瘤细胞的抗体的水平的情况下向患者给药。还显示本发明的抗体与其它关键组织结合或不结合的更详细的照片。图89-94显示每种抗体与正常心脏组织结合的放大照片，其中根据结合的表位对抗体进行了分类。图95-100显示每种抗体与正常肝组织结合的放大照片，其中根据结合的表位对抗体进行了分类。图101-106显示每种抗体与正常肺组织结合的放大照片，其中根据结合的表位对抗体进行了分类。图107-112显示每种抗体与正常骨髓结合的放大照片，其中根据结合的表位对抗体进行了分类。
IHC研究(图88-图200)的结果总结于表3中。
表3：抗体与正常组织的交叉反应性的总结
从表中可以清楚地看出，离抗体结合的细胞膜越远，非特异性结合越多。尽管这些抗体是通过用PSMGFR肽、N+20/C-27肽或C+9/C-9肽进行免疫所生成的，但是通过用延伸的肽进行免疫所生成的一些抗体仍然在PSMGFR序列内结合，每种抗体的表位结合的细节参见图63-69。如果将抗体并入适当的治疗形式，则可以容忍与正常组织的一些结合。例如，细胞疗法，诸如CAR T，通过血液运送并且遇到生理屏障，包括固有层和血脑屏障，屏障限制细胞接近导管和腺体的内腔边缘。与癌性组织更强结合但显示与正常组织的一定结合的其它抗体，如果是局部施用的或者如果通过并入双特异性抗体中来增强癌症特异性，也可能是安全并且有用的治疗剂。然而，与许多正常器官或没有物理屏障的重要器官的广泛抗体结合可能对于患者是致命的。
与正常组织几乎不结合的最具癌症特异性的抗体是MNC2、MNE6、20A10、3C2B1和25E6。理想的抗体治疗剂是不染色正常组织但是稳健染色癌细胞的抗体。不幸的是，癌症抗原也在正常组织上表达，所以正常组织零染色是不可能的。目的是鉴定出这样的抗体，它与肿瘤组织的结合比正常组织强得多，并且结合非关键正常组织结合或者以在生理上不可能在完整器官中的方式与它们结合。例如，CAR T细胞由血液携带，并且固有层是它们到达导管或腺体的内腔边缘的屏障。类似地，血脑屏障阻止大分子(如抗体)从血液传送到脑中。抗体作为治疗剂的有用性还取决于治疗剂的形式。如前所述，基于细胞的疗法具有天然屏障，其防止CAR T细胞进入一些正常组织。基于抗体药物缀合物(ADC)的疗法有时依赖于局部的癌症特异性分子以激活连接至抗体的毒素，最小化裸抗体是否结合某个正常组织的重要性。在另一实例中，抗体和基于抗体的治疗剂可以局部施用，包括腹膜内施用，以最大化对肿瘤细胞的影响，同时最小化它们对正常组织的影响。在另一实例中，如果将不完全是癌症特异性的抗体并入双特异性抗体(称为BiTE，即双特异性T细胞衔接器)中，则可以使抗体更具癌症特异性，在双特异性抗体中，分子的第一侧结合第一癌症抗原，并且分子的第二侧结合第二抗原，第二抗原可以是组织特异性抗原、另一癌症特异性抗原或甚至细胞(诸如T细胞)上的抗原。在另一实例中，可以将较低癌症特异性抗体并入基于细胞的疗法中，其中抗体的表达仅在细胞识别肿瘤后才被诱导。在一个方面，CAR T细胞可以表达识别第一抗原的第一CAR(所述识别诱导第二抗体的表达)或并入第二抗体的CAR。在一个方面，细胞表达由癌症特异性抗体片段引导的CAR，并且第二抗体或表达第二抗体的CAR被诱导以在NFAT诱导型系统中表达。在一个方面，编码第二抗体或第二CAR的核酸在NFAT应答元件的下游。可以将NFAT诱导型基因插入到Foxp3增强子或启动子中。
图202显示胰腺癌组织的照片，每个照片来自不同的患者。如可以看出的那样，1E4的染色模式与18B4和多克隆抗体SDIX的染色模式有很大不同。18B4和SDIX抗体是通过用相同的肽(PSMGFR)对动物进行免疫所生成的，而1E4抗体是通过用不同的肽(N+20)进行免疫所生成的。图203-207显示从此阵列中选择的组织的放大图像，突出显示了这些抗体之间的差异。图208比较多克隆抗体SDIX与单克隆抗体20A10的染色，这两种抗体均通过用PSMGFR肽进行免疫所生成。还显示通过用N+20肽进行免疫所生成的抗体29H1的染色模式的差异。虽然抗体染色较浅，但是抗体29H1比SDIX多克隆抗体或20A10识别更多的胰腺癌组织标本。图209显示，食管癌被结合具有延伸的N-末端的MUC1*肽的抗体(诸如抗体29H1和抗体31A1)更好地识别。类似地，图210显示，前列腺癌被结合具有延伸的N-末端的MUC1*肽的抗体(诸如抗体29H1)更好地识别。
下文表4显示确定各种单克隆抗体的癌症特异性的测试标准的总结。
表4：癌症特异性测试标准
总之，我们发现，与PSMGFR序列N-末端的序列结合的抗体没有癌症特异性。此外，抗体结合的细胞膜越近，抗体的癌症特异性越高。更重要的是，测试标准1-4甚至1-5提供了一组快速、多重且廉价的测试，其可以对成百上千个不纯的杂交瘤克隆上清液进行，以鉴定对MUC1*的癌症特异性形式的具有高度选择性的抗体。
满足测试标准
在优选的实施方案中，基于满足表4中列出的七(7)个标准中的四(4)个选择抗体以用于治疗、预防或诊断MUC1*阳性癌症。在更优选的实施方案中，基于满足表4中列出的七(7)个标准中的五(5)个选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。在更优选的实施方案中，基于满足表4中列出的七(7)个标准中的六(6)个选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。在更优选的实施方案中，基于满足表4中列出的所有七(7)个标准，选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。可以将由于满足表4中列出的标准中的四个或更多个而被选择适合作为MUC1*阳性癌症的治疗的抗体部分或全部并入若干治疗形式。在本发明的一个方面，将抗体或抗体片段并入CAR，然后所述CAR在免疫细胞(其可以是T细胞)中表达，然后施用于已被诊断患有MUC1*阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者。在本发明的另一方面，抗体片段可以是scFv，将其并入BiTE中，然后施用于已被诊断患有MUC1*阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者。在本发明的另一方面，抗体片段可以是scFv，将其并入双特异性抗体中，然后施用于已被诊断患有MUC1*阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者。在本发明的另一方面，抗体或抗体片段与毒素或ADC(抗体药物缀合物)缀合，然后施用于已被诊断患有MUC1*阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者。
结合N-10
我们已经证明，缺乏串联重复序列并且具有PSMGFR序列的45个氨基酸的细胞外结构域的MUC1跨膜蛋白足以起到生长因子受体的作用并且赋予细胞致癌特征(Mahanta等人2008)。结合PSMGFR肽或跨膜MUC1切割产物的一部分的抗体可以是癌症特异性的，但也可能结合干细胞或祖细胞。结合N-10肽的抗体更具癌症特异性。在优选的实施方案中，基于抗体能够结合N-10肽选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。
不结合C-10
我们已经证明，MUC1细胞外结构域含有异位结合位点，所述位点仅在可能由于替代拼接变体或细胞外结构域的切割和释放而发生的串联重复结构域缺失时才暴露。癌症特异性抗体MNC2和MNE6将不结合全长MUC1，但当MUC1被切割并且串联重复结构域脱落时结合剩余部分。如果缺乏串联重复序列，例如，如果MUC1阴性细胞被缺乏串联重复序列的工程化MUC1转染或转导，特别是如果细胞外结构域包含PSMGFR，则MNC2和MNE6将结合MUC1*样蛋白。因此，当串联重复结构域缺失或被除去时，MNC2和MNE6结合的异位位点暴露。MNC2和MNE6都需要MUC1*细胞外结构域的10个膜近端氨基酸以便结合；它们不结合C-10肽。这意味着，MNC2和MNE6的异位结合位点在PSMGFR的10个C-末端氨基酸PFPFSAQSGA内或包含其全部或一部分。在优选的实施方案中，基于抗体不能结合C-10肽选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。在优选的实施方案中，基于抗体能够结合N-10肽并且抗体不能结合C-10肽选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。
与NME7AB或NME7-X1竞争结合MUC1*阳性细胞、PSMGFR肽或N-10肽我们已经证明，癌症特异性抗体MNC2和MNE6结合包含PSMGFR肽的10个C-末端氨基酸PFPFSAQSGA的全部或一部分的异位表位。我们已经证明，生长因子二聚体NME1和NME7AB同样结合包含PSMGFR肽的10个C-末端氨基酸的全部或一部分的异位表位。MNC2和MNE6与二聚体NME1或NME7AB竞争结合PSMGFR肽和N-10肽。在优选的实施方案中，基于抗体能够破坏NME1、NME7AB或NME7-X1与PSMGFR肽、N-10肽或MUC1*阳性癌细胞表面的结合来选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。
识别构象表位而不是线性表位
癌症特异性抗体将是基于它们能够结合缺乏串联重复序列的MUC1并且它们不能结合全长MUC1来选择的。很多时候，当MUC1被切割酶切割并且串联重复结构域从细胞表面释放时，生成MUC1*。串联重复结构域的切割和释放也可能暴露正常组织上存在的MUC1*样切割产物的一部分。然而，识别构象表位而不是线性表位的抗体更具选择性。可以通过多种方式鉴定识别构象表位而不是线性表位的抗体。具体地说，识别构象表位的抗体在变性蛋白质印迹分析中不起作用。在优选的实施方案中，基于抗体能够识别构象表位选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。
识别通过MMP9或其它肿瘤相关切割酶切割所生成的MUC1*
MUC1*截短的细胞外结构域的折叠或构象根据切割MUC1的酶而不同。切割的MUC1*或MUC1*样切割产物可以起到正常健康组织上的生长因子受体的作用。多于一种切割酶能够将MUC1切割成MUC1*样形式。第一酶的切割所产生的构象或折叠可能与第二酶切割所产生的构象或折叠不同。对此的支持可以在本申请中找到并且在图39-41中示出。这些图显示，尽管结合PSMGFR的多克隆抗体识别造血干细胞上的切割的MUC1，但是一些结合PSMGFR肽的单克隆抗体可以结合造血干细胞上的这种MUC1*样形式结合，而其它则不能。例如，MNC3易于识别造血干细胞上MUC1的这种切割形式，但MNC2和MNE6不识别。我们已知，MNC2和MNE6识别通过MMP9切割所产生的MUC1*，但当它被MMP2切割时不识别。MNC2和MNE6是癌症特异性的，而MNC3不是，因为它识别干细胞和祖细胞。我们还已知，MMP9在癌症中过表达。制造造血干细胞的骨髓表达的MMP2是MMP9的几乎2,500倍(图65)。MMP14是另一种将MUC1切割成MUC1*生长因子受体形式的酶(图38)。在本发明的一个方面，基于抗体能够识别MMP14切割MUC1时所生成的MUC1切割产物选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。在优选的实施方案中，基于抗体能够识别MMP9切割MUC1时所生成的MUC1切割产物选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。在优选的实施方案中，基于抗体能够识别MMP9切割MUC1时所生成的MUC1切割产物并且还识别构象表位选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。
比正常细胞更多地结合癌细胞
鉴定癌症特异性抗体的传统方法涉及针对一组不同的癌细胞系测试一组抗体，以及通过FACS、IF、免疫沉淀或其它方法确定抗体是否结合癌细胞。尽管这种方法是传统的，但它是连续且耗时的，并且因此限制了对大量单克隆抗体克隆的分析，而这是寻找适合于癌症治疗或诊断的理想抗体所必需的。此外，没有真正的正常细胞系，并且正常原代细胞的选择是有限的。上文呈现的选择标准提供了一种用于鉴定对MUC1*阳性癌症具有特异性的单克隆抗体克隆的快速、多重的方法。对于许多选择标准，可以使用杂交瘤上清液。这提供了优于用于鉴定对MUC1*阳性癌症具有特异性的抗体的现有技术方法的巨大优势。从使用不纯的杂交瘤上清液进行的测定选择抗体的能力意味着，可以在数百或数千个克隆上快速地且成本非常低地进行大部分选择。诸如FACS分析和IHC组织研究的方法需要使用纯化的抗体，从而将可以测试的克隆的数目限制在数十个，甚至不到数百个。
然而，基于能够结合癌细胞或癌细胞类型或结合被工程化成表达某一抗原的细胞选择抗体对于抗体选择来说是重要的。在优选的实施方案中，基于抗体能够结合MUC1*阳性癌细胞选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。
比正常组织更多地结合肿瘤组织
癌性组织相对于正常组织的免疫组织化学(IHC)组织研究是比FACS分析更严格的对抗体的癌症特异性的测试。癌细胞系是数十年来在实验室中扩增的来自单个患者的单个细胞并且不代表人群的横断面。此外，细胞系的分析对实际肿瘤的异质性未知。组织研究需要纯化的抗体，非常昂贵，耗时并且需要熟练的病理学家分析每个染色的组织标本。然而，来自正常组织相对于癌性组织的组织的抗体染色可以揭示哪些抗体不可以用作治疗剂或诊断剂，因为它们与正常组织有交叉反应性。我们用数千个人正常组织或在癌性组织(跨若干癌症亚型)对多种抗体的系统研究显示，结合N-10但不结合C-10的抗体破坏NME1或NME7AB或NME7-X1与PSMGFR肽、N-10肽或MUC1*阳性癌细胞表面的结合，识别构象表位，并且识别通过MMP9切割所产生的构象表位是最具癌症特异性的。
在优选的实施方案中，基于抗体结合MUC1*阳性肿瘤组织的能力是其结合正常组织的至少2倍选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。在优选的实施方案中，基于抗体结合MUC1*阳性肿瘤组织的能力是其结合正常组织的至少5倍选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。在优选的实施方案中，基于抗体结合MUC1*阳性肿瘤组织的能力是其结合正常组织的至少10倍选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断。
结合细化表位的抗体
在优选的实施方案中，将结合包含序列QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA的肽的抗体或其片段并入抗癌治疗剂或诊断剂中以用于诊断、治疗或预防MUC1*阳性癌症。
在更优选的实施方案中，将结合包含序列ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA的肽的抗体或其片段并入抗癌治疗剂或诊断剂中以用于诊断、治疗或预防MUC1*阳性癌症。
在更优选的实施方案中，将结合包含序列SDVSVSDVPFPFSAQSGA的肽的抗体或其片段并入抗癌治疗剂或诊断剂中以用于诊断、治疗或预防MUC1*阳性癌症。
在更优选的实施方案中，将结合包含序列SVSDV的肽的抗体或其片段并入抗癌治疗剂或诊断剂中以用于诊断、治疗或预防MUC1*阳性癌症。
在更优选的实施方案中，将结合包含序列PFPFSAQSGA的一些或全部的肽的抗体或其片段并入抗癌治疗剂或诊断剂中以用于诊断、治疗或预防MUC1*阳性癌症。作为抗癌治疗，将选定的抗体或其片段并入CAR、BiTE、ADC或双特异性抗体中，然后施用于被诊断患有MUC1*阳性癌症或处于发展所述癌症的风险中的患者。
共有序列
本发明的抗体根据同源表位进行分类。它们相应重链CDR的序列如表5所示。它们相应轻链CDR的序列如表6所示。计算机生成了每个表位特异性抗体组的CDR1、CDR2和CDR3的共有序列。图215和图216显示CDR共有序列如何随着抗体同源表位的位置从PSMGFR的膜近端部分向更远端部分移动而变化。
如在表5和表6中可以看出的那样，结合在PSMGFR肽的10个膜近端(C-末端)部分内的表位的抗体的CDR1和CDR2的序列紧密连接至共有序列。
表5：重链CDR
表6：轻链CDR
尽管MNC2的重链CDR1是FTFSGYAMS，氨基酸从左到右编号为1到9，但是结合PSMGFR的那部分的其它抗体的共有序列是：第1位为F或I，第2位为T，第3位为F，第4位为S，第5位为T、G或R，第6位为Y，第7位为A、G或T，第8位为M并且第9位为S。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR1具有至少90％同一性的重链CDR1选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为F或I，第2位为T，第3位为F，第4位为S，第5位为T、G或R，第6位为Y，第7位为A、G或T，第8位为M并且第9位为S。
尽管MNC2的重链CDR2是TISSGGTYIYYPDSVKG，氨基酸从左到右编号为1到17，但是结合PSMGFR的那部分的其它抗体的共有序列是：第1位为T，第2位为I或S，第3位为I或S，第5位为G或R，第6位为G或A，第9位为T或I，第10位为Y，第11位为Y，第12位为P或S并且第13-17位为DSVKG。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR2具有至少90％同一性的重链CDR2选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为T，第2位为I或S，第3位为I或S，第5位为G或R，第6位为G或A，第9位为T或I，第10位为Y，第11位为Y，第12位为P或S并且第13-17位为DSVKG。
尽管MNC2的重链CDR3是–LGGDNYYEYFDV--，氨基酸从左到右编号为1到15，但是结合PSMGFR的那部分的其它抗体的共有序列是：第2位为G、L或N，第4位为G或T，第7位为Y，第12位为D或E，第14位为A并且第15位为Y。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR3具有至少90％同一性的重链CDR3选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第2位为G、L或N，第4位为G或T，第7位为Y，第12位为D或E，第14位为A并且第15位为Y。
尽管MNC2的轻链CDR1是RASKS--VSTSGYSYMH，氨基酸从左到右编号为1到17，但是结合PSMGFR的那部分的其它抗体的共有序列是：第1位为K或R，第2位为A或S，第3位为S，第4位为K或Q，第5位为S，第6位为V，第7位为L，第10位为T或S，第15位为Y并且第16位为I、L或M。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR1具有至少90％同一性的轻链CDR1选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为K或R，第2位为A或S，第3位为S，第4位为K或Q，第5位为S，第6位为L或V，第7位为L，第10位为T或S，第15位为Y并且第16位为I、L或M。
尽管MNC2的轻链CDR2是LASNLES，氨基酸从左到右编号为1到7，但是结合PSMGFR的那部分的其它抗体的共有序列是：第1位为L、或W、或S，第2位为A或T，第3位为S，第4位为N或T，第5位为L或R，第6位为E或A并且第7位为S。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR2具有至少90％同一性的轻链CDR2选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为L、或W、或S，第2位为A或T，第3位为S，第4位为N或T，第5位为L或R，第6位为E或A并且第7位为S。
尽管MNC2的轻链CDR3是QHSRELPFT，氨基酸从左到右编号为1到9，但是结合PSMGFR的那部分的其它抗体的共有序列是：第1位为Q，第2位为H或Q，第3位为S、Q或R，第4位为R、S或Y，第5位为E、L或S，第6位为L或S，第7位为P或S，第8位为F或L并且第9位为T。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR3具有至少90％同一性的轻链CDR3选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为Q，第2位为H或Q，第3位为S、Q或R，第4位为R、S或Y，第5位为E、L或S，第6位为L或S，第7位为P或S，第8位为F或L并且第9位为T。
生成了另一组抗体并且测试了所得克隆结合PSMGFR、N-10和C-10肽的能力。选择结合PSMGFR和N-10肽但不结合C-10肽的抗体克隆。对这些抗体进行测序。表7显示癌症特异性抗体MNC2、MNE6、20A10、3C2B1加上新抗体B2、B7、8C7F3、H11和B9的重链CDR的序列。表8显示癌症特异性抗体MNC2、MNE6、20A10、3C2B1加上新抗体B2、B7、8C7F3、H11和B9的轻链CDR的序列。生成了重链和轻链CRD的共有序列，并且如表7和表8所示。尽管抗体5C6F3和25E6在IHC组织研究中显示出很强的癌症特异性，并且它们都结合PSMGFR和N-10肽，但不结合C-10肽，但是表位作图显示它们结合在MNC2、MNE6、20A10和3C2B1结合的表位的稍N-末端的表位。为此，针对MNC2、MNE6、20A10、3C2B1生成了共有序列，并且针对结合N-10但不结合C-10的所有抗体生成了新抗体加上共有序列。
如在表7和表8中可以看出的那样，需要结合PSMGFR肽的10个膜近端(C-末端)氨基酸的抗体的CDR1、CDR2和CDR3的序列紧密连接至常见的共有序列。
表7：因为不能结合C-10肽而共享更广泛表位的抗体的重链CDR
表8：因为不能结合C-10肽而共享更广泛表位的抗体的轻链CDR
尽管MNC2的重链CDR1是FTFSGYAMS，氨基酸从左到右编号为1到9，但是MNC2、MNE6、20A10、3C2B1和新抗体B2、B7、8C7F3、H11和B9的共有序列是：第1位为F或I，第2位为T或A，第3位为F，第4位为S，第5位为T、G或R，第6位为Y或F，第7位为A、G或T，第8位为M并且第9位为S。第2位和第6位加下划线的氨基酸是单独针对癌症特异性抗体MNC2、MNE6、20A10、3C2B1所生成的共有序列的唯一附加变体。
如在表7中可以看出的那样，将抗体5C6F3和25E6纳入到共有序列的生成中不会以任何方式改变描述癌症特异性抗MUC1*抗体的CDR1重链的共有序列。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR1具有至少90％同一性的重链CDR1选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为F或I，第2位为T或A，第3位为F，第4位为S，第5位为T、G或R，第6位为Y或F，第7位为A、G或T，第8位为M并且第9位为S。
尽管MNC2的重链CDR2是TISSGGTYIYYPDSVKG，氨基酸从左到右编号为1到17，但是MNC2、MNE6、20A10、3C2B1和新抗体B2、B7、8C7F3、H11和B9的共有序列是：
第1位为T或A，第2位为I或S，第3位为I或S，第4位为N、S、T或G，第5位为G或R，第6位为G或A，第7位为G、T或D，第8位为Y、K或S，第9位为T或I，第10位为Y，第11位为Y，第12位为P或S，并且第13位为D，第14位为S或T，第15位为V或L并且第16-17位为KG。加下划线的氨基酸指示此更具包容性的共有序列与单独针对MNC2、MNE6、20A10和3C2B1生成的共有序列有何不同。在重链CDR2的17个氨基酸中，所有九种抗体的共有序列与四种初始癌症特异性抗体的共有序列仅相差4个氨基酸。需注意，4个变体中有2个是同源变化，T为S，并且L为V，它们通常不显著影响蛋白质的结构或特异性。
如在表7中可以看出的那样，将抗体5C6F3和25E6纳入到重链CDR2的共有序列的生成中仅通过添加两个其它可能的氨基酸改变了共有序列：第8位可能的H和第10位可能的F，以获得描述癌症特异性抗MUC1*抗体的重链CDR2。我们注意到，第10位Y到F的变化是同源变化，其通常不显著影响蛋白质的结构或特异性。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR2具有至少90％同一性的重链CDR2选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为T或A，第2位为I或S，第3位为I或S，第4位为N、S、T或G，第5位为G或R，第6位为G或A，第7位为G、T或D，第8位为Y、K、H或S，第9位为T或I，第10位为Y或F，第11位为Y，第12位为P或S，并且第13位为D，第14位为S或T，第15位为V或L并且第16-17位为KG。
尽管MNC2的重链CDR3是LGGDNYYEYFDV，氨基酸从左到右编号为2到13，但是MNC2、MNE6、20A10、3C2B1和新抗体B2、B7、8C7F3、H11和B9的共有序列是：
第2位为G、L或N，第3位为G、T或Y，第4位为G或T，第5位为A、D、P、R或S，第6位为Y、M、I或S，第7位为Y，第8位为D、Y或N，第9位为E、D、Y、L或H，第10位为Y、A或G，第11位为M、D或F，第12位为D或E，第13位为V、F、Y或L并且第14-15位为AY。加下划线的氨基酸指示此更具包容性的共有序列与单独针对MNC2、MNE6、20A10和3C2B1生成的共有序列有何不同。在重链CDR3的15个氨基酸中，所有九种抗体的共有序列与四种初始癌症特异性抗体的共有序列相差7个氨基酸，第6位有7个取代中的3个。为此，我们断定，可以改变第6位的氨基酸而不改变抗体的特异性。
对纳入抗体5C6F3和25E6所生成的共有序列的分析突出显示了在所有十一种抗体中哪些氨基酸是保守的。为此，我们优选的重链CDR3的共有序列限定了在第2、3、4、7、10、11、12、14和15位的氨基酸，其中对于11种抗体，在这些位置有3个或更少的变体。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR3具有至少90％同一性的重链CDR3选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第2位为G、L或N，第3位为G、T或Y，第4位为G或T，第7位为Y，第10位为Y、A或G，第11位为M、D或F，第12位为D或E并且第14-15位为AY。
尽管MNC2的轻链CDR1是RASKS--VSTSGYSYMH，氨基酸从左到右编号为1到17，但是MNC2、MNE6、20A10、3C2B1和新抗体B2、B7、8C7F3、H11和B9的共有序列是：
第1位为K或R，第2位为A或S，第3位为S或R，第4位为K、Q或A，第5位为S、N或T，第6位为V、I、E或K，第7位为L、V或S，第8位为S、Y、I或V，第9位为A、S或H，第10位为T或S，第11位为N、S或Y，第12位为G、S、D或Q，第13位为V、Y、K或N，第14位为N、S或T，第15位为Y或F，第16位I、L或M并且第17位为H、A、E或Q。加下划线的氨基酸指示此更具包容性的共有序列与单独针对MNC2、MNE6、20A10和3C2B1生成的共有序列有何不同。在轻链CDR1的17个氨基酸中，所有九种抗体的共有序列与四种初始癌症特异性抗体的共有序列相差13个氨基酸。13个取代中有4个是同源取代，其通常不显著改变蛋白质的结构或特异性。在剩余的9个取代中，1个在第4位，1个在第5位，3个在第6位，1个在第7位，1个在第11位并且2个在第17位。纳入5种新抗体不改变第1、2、3、8、9、10、12、13、14、15或16位的氨基酸，同源取代除外。为此，我们断定，定义MUC1*癌症特异性抗体的轻链CDR1的保守共有序列包含上面针对第1、2、3、8、10、12、13、14、15和16位给出的氨基酸。
对用所有抗体(包括5C6F3和25E6)生成的共有序列的分析进一步改变了轻链CDR1的共有序列，氨基酸取代如下：第6位为L；第9位为D；第11位为D并且第17位为N。我们注意到，这些取代全都不在对于四种初始癌症特异性抗体加上五种新抗体来说不变的位置。因此，我们断定，定义与癌症特异性抗体具有至少90％同一性的轻链CDR1的保守共有序列包含上文在第1、2、3、8、10、12、13、14、15和16位定义的氨基酸。
在优选的实施方案中，基于具有与以下CDR1具有至少90％同一性的轻链CDR1选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为K或R，第2位为A或S，第3位为S或R，第8位为S、Y、I或V，第10位为T或S，第12位为G、S、D或Q，第13位为V、Y、K或N，第14位为N、S或T，第15位为Y或F并且第16位为I、L或M。
尽管MNC2的轻链CDR2是LASNLES，氨基酸从左到右编号为1到7，但是MNC2、MNE6、20A10、3C2B1和新抗体B2、B7、8C7F3、H11和B9的共有序列是：第1位为L、W、S、T或K，第2位为A、T或V，第3位为S，第4位为N或T，第5位为L或R，第6位为E、A、F或D并且第7位为S。加下划线的氨基酸指示此更具包容性的共有序列与单独针对MNC2、MNE6、20A10和3C2B1生成的共有序列有何不同。
在优选的实施方案中，基于具有与在指定位置处包含以下氨基酸的CDR2具有至少90％同一性的轻链CDR2选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为L、W、S、T或K，第2位为A、T或V，第3位为S，第4位为N或T，第5位为L或R，第6位为E、A、F或D并且第7位为S。在7个位置中，纳入五种新抗体引入了5个取代，其中只有2个不是同源取代。
对用所有抗体(包括5C6F3和25E6)生成的共有序列的分析进一步改变了轻链CDR2的共有序列，氨基酸取代如下：第4位为K，其为与N同源的取代。
在优选的实施方案中，基于具有与以下CDR2具有至少90％同一性的轻链CDR2选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第2位为A、T或V，第3位为S，第4位为N、T或K，第5位为L或R，第6位为E、A、F或D并且第7位为S。
尽管MNC2的轻链CDR3是QHSRELPFT，氨基酸从左到右编号为1到9，但是MNC2、MNE6、20A10、3C2B1和新抗体B2、B7、8C7F3、H11和B9的共有序列是：第1位为Q或F，第2位为H或Q，第3位为S、Q、R、D或N，第4位为R、S、Y或N，第5位为E、L、S或H，第6位为L、S、V、D或Y，第7位为P或S，第8位为F、L或P并且第9位为T。加下划线的氨基酸指示此更具包容性的共有序列与单独针对MNC2、MNE6、20A10和3C2B1生成的共有序列有何不同。
对用所有抗体(包括5C6F3和25E6)生成的共有序列的分析进一步改变了轻链CDR2的共有序列，氨基酸取代如下：第1位为W；第3位为G；第4位为T；第5位为F；第8位为Q。
在优选的实施方案中，基于具有与以下CDR2具有至少90％同一性的轻链CDR3选择抗体以用于癌症的治疗、预防或诊断：第1位为Q、F或W，第2位为H或Q，第4位为R、S、T、Y或N，第5位为E、L、S或H，第6位为L、S、V、D或Y，第7位为P或S并且第9位为T。
使用靶向MUC1*的细胞外结构域的抗体、抗体片段和CAR的其它一般策略
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少两种转染到同一免疫细胞中的不同质粒，其中第一质粒编码包含结合肿瘤抗原的抗体片段、scFv或肽的CAR，并且第二质粒编码不为CAR的基因，其中不为CAR的基因从诱导型启动子表达，所述诱导型启动子通过激活的免疫细胞的元件激活。在一个方面，免疫细胞是T细胞或NK细胞。在一个方面，免疫细胞衍生自已被引导以在体外分化成所述免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，含有抗体序列的CAR在干细胞中表达，然后干细胞可以分化成免疫细胞。在一个方面，CAR包含结合MUC1*的细胞外结构域的抗体片段、scFv或肽。在一个方面，CAR包含衍生自MNC2、MNE6、20A10、3C2B1、5C6F3、25E6、18G12、28F9、1E4、B12、B2、B7、B9、8C7F3或H11的scFv。在一个方面，非CAR物质是切割酶。在一个方面，切割酶是MMP2、MMP3、MMP9、MMP13、MMP14、MMP16、ADAM10、ADAM17、ADAM28或其催化活性片段。在另一方面，非CAR物质是细胞因子。在一个方面，细胞因子是IL-7。在一个方面，细胞因子是IL-15。在一个方面，细胞因子是IL-12。在一个方面，细胞因子是IL-18。给出了激活的IL-18的序列(SEQ ID NO:1637-1638)。给出了嵌入在Foxp3增强子区中的NFAT诱导型IL-18的两个实例(SEQ ID NO:1639-1640)。给出了嵌入在IL-2增强子区中的NFAT诱导型IL-18的两个实例(SEQ ID NO:1641-1642)。在一种情况下，有三(3)个NFAT应答元件，并且在其它情况下，有六(6)个NFAT应答元件。可以改变NFAT应答元件的数目，以得到所需量的在CAR T细胞识别靶标时表达的IL-18。并入到具有诱导型IL-18的CARS中的本发明抗体的实例显示为：在具有4-1BB或CD28共刺激结构域加诱导型IL-18(SEQ ID NO:1643-1646)或还具有1XX突变的CD3-ζ(SEQ ID NOS:1647-1650)的CAR中的鼠或人MNC2；在具有4-1BB或CD28共刺激结构域加诱导型IL-18(SEQ ID NO:1651-1654)或还具有1XX突变的CD3-ζ(SEQ ID NO:1655-1658)的CAR中的鼠或人MNE6；在具有4-1BB或CD28共刺激结构域加诱导型IL-18(SEQ ID NO:1659-1662)或还具有1XX突变的CD3-ζ(SEQID NO:1663-1666)的CAR中的鼠或人20A10；在具有4-1BB或CD28共刺激结构域加诱导型IL-18(SEQ ID NO:1667-1670)或还具有1XX突变的CD3-ζ(SEQ ID NO:1671-1674)的CAR中的鼠或人25E6。在另一方面，细胞因子是IL-7和IL-15。在一种情况下，非CAR物质的表达是由激活的免疫细胞的元件诱导的。在一个方面，激活的免疫细胞的元件是NFAT。在一个方面，NFAT是NFATc1、NFATc3或NFATc2。已知细胞因子IL-7、IL-15、IL-12和IL-18促进T细胞持久性。在本发明的一个方面，将上文所述的免疫细胞施用于患者以用于癌症的治疗或预防。在本发明的一个方面，癌症是MUC1阳性癌症或MUC1*阳性癌症。
除制备同样诱导切割酶表达的CAR T细胞之外，我们还制备了同样诱导IL-18的局部和瞬时表达的CAR T细胞。报道的许多基于T细胞的诱导型系统将待诱导表达的基因插入到IL-2启动子或增强子中。我们将IL-2启动子/增强子的诱导型表达与Foxp3增强子的一部分的诱导型表达进行了比较。在此特定实例中，用huMNC2-CAR44和NFAT诱导型IL-18转导人T细胞，其中将Il-18基因插入到IL-2启动子或Foxp3增强子区中。本领域已知，具有第二诱导型因子的CAR T的主要问题在于，第二因子是渗漏的，意味着第二因子的显著表达在没有CAR T细胞的激活的情况下发生。现有的诱导型系统的另一问题是，CAR T细胞被激活与第二因子被诱导之间的时间长度通常很长，使得当第二因子被表达时，分泌第二因子的细胞可能离肿瘤很远。
图211A-211C显示ELISA实验的图，所述实验测量分泌到huMNC2-CAR44 T细胞(其还携带NFAT诱导型IL-18)与MUC1*阳性癌细胞的共培养物的条件培养基中的IL-18的量。作为诱导不同水平的IL-18表达的方法，我们将CAR T细胞与癌细胞一起共培养，掺杂了递增量的细胞，这些细胞被工程化成表达甚至更多MUC1*。在这些图中，我们显示了野生型或者掺杂5％、10％或30％的表达更多MUC1*的T47D细胞的T47D癌细胞。图211A显示分泌到T47D乳腺癌细胞与未转导的人T细胞的共培养物的上清液中的IL-18的图。图211B显示分泌到T47D乳腺癌细胞与huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物的上清液中的IL-18的图，huMNC2-CAR44 T细胞还携带NFAT诱导型IL-18基因，其插入到Foxp3增强子的一部分中。图211C显示分泌到T47D乳腺癌细胞与huMNC2-CAR44 T细胞的共培养物的上清液中的IL-18的图，huMNC2-CAR44 T细胞还携带NFAT诱导型IL-18基因，其插入到IL-2增强子的一部分中。如从图中可以看出的那样，Foxp3系统诱导IL-18的快速且稳健的表达，其比IL-2启动子中相同构建体的表达显著更快且更高。在此实例中，将IL-18基因插入在六(6)个NFAT应答元件的下游，但是可以通过使用较少数目的应答元件来减弱第二因子的量，或者通过增加NFAT反应的数目来增加其量。
据报道，IL-18增加CAR T细胞在体内的持久性。然而，我们观察到意想不到的结果。以剂量依赖的方式，IL-18的分泌增加了CAR T细胞对低抗原密度细胞的杀伤。我们对T47D-wt细胞(红色：mCherry)和那些被转导以表达更多MUC1*的T47D(绿色：GFP)进行了差异标记。图212A-212X显示掺杂有不同百分比的被工程化成表达更多MUC1*的T47D细胞(绿色)的T47D乳腺癌细胞(红色)的照片。靶癌细胞与具有NFAT诱导型IL-18的huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养，其中IL-18基因插入到Foxp3增强子/启动子或IL-2增强子/启动子中。图212A-212C、212I-212K和212Q-212S显示与未转导的T细胞一起共培养的癌细胞。图212D-212F、212L-212N和212T-212V显示与NFAT诱导型IL-18基因插入到Foxp3增强子/启动子中的hiMNC2-CAR44 T细胞一起共培养的癌细胞。图212G-212H、212O-212P和212W-212X显示与NFAT诱导型IL-18基因插入到IL-2增强子/启动子中的hiMNC2-CAR44 T细胞一起共培养的癌细胞。如从图中可以看出的那样，低抗原密度T47D-wt型细胞(红色)当掺杂较高百分比的表达更多MUC1*并因此分泌更多IL-18的细胞时被杀伤。实验显示，这不仅仅是旁观者效应，因为从IL-2启动子表达IL-18的的细胞表达IL-18的水平低得多，即使它们掺杂了30％的表达更多MUC1*的细胞，也仍不杀伤低抗原密度细胞。
然后我们证明了，CAR T介导的杀伤对CAR T特异性抗原具有特异性。我们进行了类似的实验，其中将对照MUC1/MUC1*阴性细胞掺杂了5％、10％或30％的表达更多MUC1*的T47D细胞，并且与MUC1*特异性CAR T细胞一起共培养。图213A-213B显示ELISA实验的图，其中测量了与MUC1*阳性癌细胞或MUC1阴性非癌性细胞一起共培养的具有NFAT诱导型IL-18基因(其插入到Foxp3增强子或启动子中)的huMNC1-CAR44 T细胞的分泌到条件培养基中的IL-18的水平。图213A显示与T47D乳腺癌细胞一起共培养的具有NFAT诱导型IL-18的huMNC2-CAR44 T细胞的IL-18分泌，其中所述群体已掺杂有5％、10％或30％的用甚至更多MUC1*转染的T47D细胞。图213B显示与非癌性的MUC1阴性HEK293细胞一起共培养的具有NFAT诱导型IL-18的huMNC2-CAR44 T细胞的IL-18分泌，其中所述细胞群体已掺杂有5％、10％或30％的用更多MUC1*转染的T47D细胞。如从图中可以看出的那样，分泌到培养基中的IL-18的量可归因于群体掺杂的MUC1*阳性细胞。实验的时程荧光照片显示，即使掺杂了显著百分比的高抗原密度MUC1*阳性细胞，MUC1阴性细胞也不被靶向MUC1*的CAR T细胞杀伤。图214A-214X显示T47D乳腺癌细胞(红色)或非癌性HEK293细胞(也是红色)的照片，其中两种细胞类型都掺杂有不同百分比的被工程化成表达更多MUC1*的T47D细胞(绿色)。这些靶癌细胞与具有NFAT诱导型IL-18的huMNC2-CAR44 T细胞一起共培养，其中IL-18基因插入到Foxp3增强子/启动子中。图214A-214F显示没有掺杂被工程化成表达高MUC1*密度的T47D细胞的T47D细胞或HEK293细胞。图214G-214L显示掺杂有5％的被工程化成表达高MUC1*密度的T47D细胞的T47D细胞或HEK293细胞。图214M-214R显示掺杂有10％的被工程化成表达高MUC1*密度的T47D细胞的T47D细胞或HEK293细胞。图214S-214X显示掺杂有30％的被工程化成表达高MUC1*密度的T47D细胞的T47D细胞或HEK293细胞。图214A-B、GH、M-N和S-T显示T47D乳腺癌细胞。图214C-F、I-L、O-R和U-X显示HEK293细胞。如从图中可以看出的那样，IL-18的诱导分泌导致低MUC1*密度T47D细胞被杀伤，但不诱导MUC1*阴性HEK293细胞的非特异性杀伤。合起来看，这些结果显示，Foxp3系统是第二因子的诱导型表达的优良系统，并且尤其可用于CAR T系统中。此外，我们展示了意想不到的结果，IL-18增加对低抗原密度细胞的杀伤，而没有杀死附近MUC1/MUC1*阴性细胞的不良影响。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，其包含至少两种转染到同一免疫细胞中的不同质粒，其中第一质粒编码包含结合B细胞表面上抗原的细胞外结构域的抗体片段、scFv或肽的CAR，并且另一质粒编码不为CAR的基因，其中不为CAR的基因从诱导型启动子表达，所述诱导型启动子通过激活的免疫细胞的元件激活。在一个方面，免疫细胞是T细胞或NK细胞。在一个方面，免疫细胞衍生自已被引导以在体外分化成所述免疫细胞类型的干细胞。在另一方面，含有抗体序列的CAR在干细胞中表达，然后干细胞可以分化成免疫细胞。在一个方面，CAR包含结合CD19的抗体片段、scFv或肽。在另一方面，抗体片段、scFv或肽结合B细胞或B细胞前体的表面抗原，或结合CD19、CD20、CD22、BCMA、CD30、CD138、CD123、CD33或LeY抗原。在一个方面，非CAR物质是切割酶。在另一方面，非CAR物质是细胞因子。在一个方面，细胞因子是IL-7。在一个方面，细胞因子是IL-15。在另一方面，细胞因子是IL-7和IL-15。在一种情况下，非CAR物质的表达是由激活的免疫细胞的元件诱导的。在一个方面，激活的免疫细胞的元件是NFAT。在一个方面，NFAT是NFATc1、NFATc3或NFATc2。不为CAR，其中不为CAR的基因从诱导型启动子表达，其中表达通过激活的免疫细胞的元件诱导。在一个方面，将用组合物转染或转导的免疫细胞施用于患者以用于癌症的治疗或预防。在一种情况下，癌症是白血病、淋巴瘤或血癌。
本发明不旨在受用于插入包含编码CAR或其编码的激活的T细胞诱导型蛋白或肽的序列的基因或质粒的特定方法或技术的限制。例如，可以使用病毒将编码本文所述的CAR和激活的T细胞诱导基因的基因病毒转导到免疫细胞中，这可能或可能不导致CAR基因整合到受体细胞的基因组中。病毒递送系统和病毒载体包括但不限于逆转录病毒(包括γ-逆转录病毒)、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、溶瘤病毒、HF10、T-Vec等。除病毒转导之外，CAR和本文所述的激活的T细胞诱导的基因还可以使用诸如CRISPR技术、CRISPR-Cas9和CRISPR-CPF1、TALEN、Sleeping Beauty转座子系统和SB 100X的方法直接拼接到受体细胞的基因组中。
大体积细胞表面蛋白(诸如MUC1-FL)也可引起BiTE的空间位阻问题。BiTE是一种双头双特异性抗体，其中一个头结合T细胞，并且另一个头结合肿瘤相关抗原。以这种方式，BiTE将T细胞和肿瘤细胞连接在一起。结合T细胞的抗体应该是激活T细胞的抗体，诸如针对CD3或CD28的抗体。为了解决位阻问题，T细胞特异性抗体与肿瘤特异性抗体之间的接头被加长。
在本发明的另一个方面，将抗-MUC1*单链分子与切割酶或切割酶的催化活性片段融合。在本发明的一个方面，切割酶是MMP9(SEQ ID NO:643)。在本发明的另一方面，酶是MMP9的催化活性片段(SEQ ID NO:645)。在一些情况下，选择CAR的抗体片段是因为其能够识别被特异性切割酶切割时的MUC1*。在一个实施方案中，切割酶是MMP9、MMP3、MMP14、MMP2、ADAM17、ADAM TS16和/或ADAM28。在一个实施方案中，抗体或抗体片段结合具有以下序列的肽：(PSMGFR)
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA、(PSMGFR N-10)
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA或(PSMGFRN+20)
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA。在另一实施方案中，将切割酶MMP9和MMP3转导到T细胞中，所述T细胞还用具有作为MNC2片段的抗体片段的CAR转导。
在许多情况下，希望切割酶仅在免疫细胞识别实体瘤上的肿瘤相关靶标之后才表达。以这种方式，切割酶将不在全身自由移动，切割MUC1、MUC16或其它蛋白质，其中它们的切割实际上促进癌症。然而，有些癌症在物理上可以直接应用化疗剂、CAR T细胞和其它抗癌剂。例如，脑癌、前列腺癌和卵巢癌的多种类型全部都显示将抗癌剂直接应用于癌症局部附近的益处。CAR T细胞已被直接注射到胶质母细胞瘤患者的脑和/或脑脊髓液中。辐射已被引导到前列腺区域以治疗前列腺癌，包括已经转移的那些。热化疗剂已直接注射到腹腔中以用于治疗卵巢癌。在这些和其它情况下，在癌症在物理上可以直接应用化疗剂的情况下，在存在或不存在另一抗癌剂的情况下施用切割酶，所述另一抗癌剂可以是CAR T细胞、被工程化成识别肿瘤相关抗原的免疫细胞、BiTE、ADC、生物制剂或标准化疗剂。虽然卵巢癌可以转移到身体的任何地方，但它通常停留在腹部，因为它蔓延到邻近的器官，诸如肠、肝和胃。这使得卵巢癌成为通过施用切割酶与其它抗癌剂(包括基于铂的药物，诸如卡铂(Paraplatin)或顺铂)，和/或紫杉烷，诸如紫杉醇(Taxol)或多西紫杉醇(Taxotere))的组合来提高抗癌剂的效果的理想的测试用例。Alkeran(美法仑)、Avastin(贝伐珠单抗)、卡铂、Clafen(环磷酰胺)和Cytoxan全部都被批准用于治疗卵巢癌。正在测试以用于治疗卵巢癌的其它疗法包括靶向MUC1、MUC16和如本文所述的MUC1*的剂。
除MMP9之外或代替MMP9，可以使用其它切割酶。例如，MMP14已显示有效地将MUC1切割成MUC1*(图38)。在本发明的一个方面，MMP14在同样被工程化成表达CAR的免疫细胞中表达。在一种情况下，CAR是抗MUC1*CAR。例如，它可以是MNC2-CAR44转导的T细胞。在本发明的另一方面，在肿瘤位置或通过i.v将MMP14直接施用于患者。
在本发明的另一方面，癌症是卵巢癌，并且将MMP9或MMP14与抗癌剂一起直接注射到腹部区域中，抗癌剂可以是化疗剂、生物制剂、抗MUC1*CAR T或抗MUC16 CAR T。
除局部施用切割酶之外，考虑了单独或从免疫细胞分泌的+iv施用，免疫细胞可以是CAR T细胞，其进一步可以从诱导型启动子表达。
在进行与本发明相关的实验中使用的方法
1.免疫细胞的慢病毒产生和病毒转导
使用HEK293或HEK293T细胞(ATCC)产生慢病毒。在转染前一天，将各板(6孔板)涂覆聚D-赖氨酸并接种细胞，使得细胞密度在转染时达到90-95％，并且在5％ CO2气氛中培养。第二天，根据制造商的说明，用Lipofectamine 3000(life technologies)和
I减血清培养基转染细胞(使用0.75ug慢病毒表达载体和2.25ug pPACKH1包装混合物)。孵育6h之后，更换培养基，并且在24小时和48小时之后收获含有慢病毒的培养基。用Lenti-X浓缩器(Clontech)浓缩慢病毒，并且使用Lenti-X p@4Rapid Titer Kit(Clontech)计算滴度。将慢病毒以一次性等分试样在-80C下储存。
用包含CAR的构建体转导免疫细胞
将人T细胞(如果冷冻)解冻并且在100-200个单位的IL-2和20ml TexMACS培养基中预温热，并且通过离心沉淀。将细胞重悬于10ml培养基中，并在37℃、5％ CO2下以1x106个细胞/ml在具有抗CD3/抗CD28珠(TransAct试剂盒)的完全培养基中培养。
培养4天之后，对细胞进行计数，并且将450ul细胞悬浮液以大约1x106个细胞/ml的密度放置于24孔板的单个孔中。使细胞沉降。从每个孔的顶部小心地取出150ul。向每个孔中添加慢病毒载体的适当稀释液，在普通TexMACS培养基中稀释，与硫酸鱼精蛋白一起至最终浓度10ug/ml，150ul体积，最终总体积为450ul/孔并孵育24h。取出转导的细胞，通过离心沉淀，并且重悬于新鲜培养基中，调整细胞密度，使其不超过1.0x106个细胞/ml。转导的T细胞可以扩增并冷冻或直接使用。通常，在用IL-2和TransAct培养基激活之后第7天与第20天之间使用或冷冻转导的T细胞。
2.比较存在或不存在外源性切割酶时的抗MUC1*CAR T细胞活性
用huMNC2-CAR44或huMNC2-CAR50转导人T细胞(ALLCELLS)。CAR44是huMNC2-scFv-CD8-CD8(跨膜-41BB-3z)。CAR50与CAR44相同，不同的是CAR50具有鼠MNC2-scFv和CD4跨膜结构域。将CAR T细胞与已使用CMTMR染成红色的靶细胞和非靶细胞一起孵育18小时。当T细胞识别靶细胞时，它们聚集靶细胞并开始杀伤它们。如图45-47中可以看出的那样，CAR T细胞有效聚集并杀伤靶MUC1*阳性癌细胞。图45显示与被转导成表达MUC1*的HCT-116细胞(“HCT-MUC1*”)或与用全长MUC1转导的HCT-116细胞(“HCT-MUC1-41TR”)一起共培养的huMNC2-CAR44或huMNC2-CAR50 T细胞。回想一下，MNC2识别仅在切割和释放MUC1串联重复结构域之后才显示的异位表位。huMNC2-CAR44和huMNC2-CAR50 T细胞都不识别表达全长MUC1的细胞(图45F-45H)。然而，当添加MMP9加上激活因子APMA时，CAR T细胞识别细胞，聚集并杀伤它们(图45J-45L)。添加切割酶ADAM-17不影响任一CAR T细胞对全长MUC1的识别(图45N-45P)。原因可能是ADAM-17不切割MUC1，或者切割产物不被MNC2识别。进行了类似的实验(图46)，其显示MMP2在切割MUC1时仅微弱有效，或者MMP2切割产物仅被MNC2微弱地识别。图47显示huMNC2-CAR44识别HCT-MUC1*细胞、T47D-wt乳腺癌细胞和添加MMP9的T47D细胞之间的对比，推测MMP9将全长MUC1切割成MNC2可识别的MUC1*。
3.给予MUC1*阳性癌细胞“死亡之吻”的CAR T细胞的共聚焦成像。
用huMNC2-CAR44转导，与MUC1*阳性DU145前列腺癌细胞一起共培养24小时的人T细胞的共聚焦图像显示CAR T细胞将颗粒酶插入到靶癌细胞。图55显示与前列腺癌细胞一起共培养时分泌颗粒酶B的huMNC2-CAR44 T的荧光图像，显示CAR T细胞的颗粒酶B的表达增加的FACS分析以及显示靶前列腺癌细胞实际上被杀伤的xCELLigence实验。
5.通过FACS分析对CAR T细胞诱导的对MUC1*阳性癌细胞杀伤的分析
我们已经证明了huMNC2-CAR44 T细胞对T47D MUC1*阳性乳腺癌细胞的杀伤作用，其中乳腺癌细胞用递增量的额外MUC1*转染。huMNC2-CAR44 T细胞的杀伤作用随着细胞上表达的靶MUC1*的量的增加而增加。
使用人IFN-γELISA试剂盒(Biolegend)测量培养基中的IFN-γ分泌。将各板涂覆抗IFN-γ抗体(捕获抗体，1X在涂覆缓冲液中)。在4℃下孵育过夜之后，将板用PBS-T洗涤4次，并且添加封闭溶液以封闭孔中剩余的结合位点。在RT(以500rpm摇动)1h之后，将板用PBS-T洗涤4次，并且添加条件培养基(CM)和IFN-γ标准品。在RT下摇动2h之后，将板用PBS-T洗涤4次，并且添加检测抗体(1x)。在RT下摇动1h之后，将板用PBS-T洗涤4次，并且添加在抗生物素蛋白-HRP(1x)。在RT下摇动30min之后，将板用PBS-T洗涤5次(每次洗涤浸泡1min)，并且添加TMB底物溶液。20min之后，通过添加终止溶液来终止反应，并且在终止的15min内在450nm下读取吸光度(减去在570nm下的吸光度)。
6.通过xCELLigence对CAR T细胞诱导的对MUC1*阳性癌细胞杀伤的分析
除FACS分析之外，许多研究人员现在使用xCELLigence仪器来测量对癌细胞的CART杀伤。xCELLigence仪器使用在其上铺板有癌细胞的电极阵列。贴壁的癌细胞使电极绝缘并因此随着它们的生长导致阻抗增加。相反地，T细胞不贴壁并保持悬浮，因此不帮助使阻抗增加的电极绝缘。但是，如果T细胞或CAR T细胞杀伤电极板上的癌细胞，则癌细胞在死亡时成球并上浮，导致阻抗降低。xCELLigence仪器测量作为时间的函数的阻抗，这与癌细胞杀伤有关。此外，电极板还具有观察窗口。当CAR T细胞有效杀伤吸附的靶癌细胞时，阻抗降低，但还可以看到板表面上没有留下癌细胞。
在大多数XCELLigence实验中，将5,000个癌细胞铺板到96孔电极阵列板的每个孔中。使细胞贴壁并生长24小时。然后以0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1和有时20:1的效应子与靶标比率(E:T)添加CAR T细胞。当实际转导效率为40％时，E:T比率假定将CAR 100％转导至T细胞中。
xCELLigence仪器记录作为时间的函数的阻抗，并且实验可以进行长达7天。
图48、图49、图55H、图56H、图57A-57C全部都显示在xCELLigence仪器上进行的CART和癌细胞实验的结果。
7.在携带人肿瘤的小鼠中的抗MUC1*CAR T细胞疗法
将8-12周龄之间的雌性NOD/SCID/GAMMA(NSG)小鼠植入500,000个人癌细胞，其中癌细胞先前已用荧光素酶稳定转染。携带荧光素酶阳性细胞的小鼠可以在成像之前注射酶底物虫荧光素，从而使癌细胞发出荧光。在IVIS仪器上，在注射虫荧光素之后10-15分钟内，对活小鼠体内的癌细胞进行成像。读出是每秒通量或光子数。使肿瘤移植，直到通过IVIS可以清晰地看见肿瘤。
图58A-58F显示在IVIS仪器上拍摄的小鼠的荧光照片。在IVIS照相之前10分钟，将小鼠腹膜内(IP)注射虫荧光素，虫荧光素在被荧光素酶切割之后发出荧光，因此使肿瘤细胞发出荧光。在第0天，将NSG(NOD/SCID/GAMMA)免疫受损小鼠在侧腹皮下植入500,000个用荧光素酶稳定转染的人MUC1*阳性癌细胞。使肿瘤移植。在IVIS测量之后第7天，将动物尾部静脉注射PBS、1000万个未转导的人T细胞或8.5M个huMNC2-scFv-CAR44 T细胞。如从图中可以看出的那样，由于肿瘤负荷过大，必须在第20天处死对照小鼠(图58A-58B)。huMNC2-CAR44 T细胞处理的小鼠在单次CAR T细胞注射之后，直到第100天将它们处死时仍无肿瘤(图58C)。图58E显示Kaplan-Meier存活曲线，其证明由抗MUC1*抗体引导的T细胞疗法的功效。图58F显示总结处死之后从测试动物收集的人T细胞的特征的表。起始Car T细胞群体是50％ CD4阳性辅助T细胞和50％ CD8阳性杀手T细胞。如从表中可以看出的那样，CAR T处理组中CD8阳性细胞的百分比增加，指示那个组的细胞在体内扩增，这是功效的指标。我们还注意到，在处理组中，CAR T细胞表达更高水平的PD1，这是T细胞耗竭的标志。
在另一动物实验中，将NSG小鼠在侧腹中皮下植入500,000个肿瘤细胞，然后在第7天和第14天再次注射盐水溶液、PBS或10M个huMNC2-CAR44 T细胞(图59A-59C)。在此实验中，肿瘤细胞上表达的MUC1*的量不同。在一种情况下，植入的肿瘤细胞是T47D野生型(图59B)。在另一情况下，T47D细胞掺杂了95％的T47D细胞，所述细胞被转染成表达甚至更多MUC1*(图59C)。如可以看出的那样，包含表达更多MUC1*的细胞的肿瘤被更快地消除并且没有复发。在类似的实验中，肿瘤细胞掺杂了相对少量的表达更多MUC1*的细胞。图60A-60C显示植入掺杂了30％被转染以表达更多MUC1*的T47D细胞的T47D-wt乳腺癌细胞的NSG小鼠。如可以看到的那样，即使是一小部分表达高水平MUC1*的细胞也足以触发CAR T细胞介导的对整个肿瘤的杀伤。天然存在的肿瘤是异质性的，并且包含高抗原表达细胞和低抗原表达细胞。此实验指示，huMNC2-CAR44 T细胞有效根除天然存在的肿瘤。
图61A-61J显示在IVIS仪器上拍摄的小鼠的荧光照片。在第0天向NSG(NOD/SCID/GAMMA)免疫受损的小鼠的侧腹中皮下注射500K人BT-20细胞，所述细胞是MUC1*阳性三阴性乳腺癌细胞系。癌细胞已用荧光素酶稳定转染。使肿瘤移植。在IVIS测量之后的第6天，将动物一次性注射1000万个用huMNC2-scFv-CAR44转导的人T细胞或未转导的T细胞。肿瘤内注射500万个T细胞，并且尾部静脉中注射500万个。在IVIS照相之前10分钟，向小鼠IP注射虫荧光素。在一种情况下，首先将huMNC2-CAR44 T细胞与附接PSMGFR肽的珠子一起孵育，以预刺激T细胞，并且在图中标记为方案1。在方案2中，用活肿瘤细胞预刺激huMNC2-CAR44 T细胞，从而有可能将更多肿瘤细胞注入动物的循环中。
图62A-62M显示在IVIS仪器上拍摄的小鼠的荧光照片。在第0天向NSG(NOD/SCID/GAMMA)免疫受损的小鼠的腹膜腔(IP)中注射500K人SKOV-3细胞，所述细胞是MUC1*阳性卵巢癌细胞系。癌细胞已用荧光素酶稳定转染。使肿瘤移植。在IVIS测量之后的第3天，向动物IP注射10M个用huMNC2-CAR44 T细胞转导的人T细胞、未转导的T细胞或PBS。在第7天再次对动物进行IVIS成像。在IVIS照相之前10分钟，向小鼠IP注射虫荧光素。如从图中可以看出的那样，直到第15天，抗MUC1*CAR T细胞有效地减小卵巢肿瘤体积。
9.NFAT诱导的IL-18序列和克隆
在pGL4-14 3xNFAT中克隆IL18:
用CD8前导序列合成激活的IL18(SEQ ID NO:1644)。用XhoI和HindIII限制性酶(New England Biolabs)消化pGL4-14 3xIL2 NFAT和pGL4-14 3xFoxP3 NFAT。使用Gibson组装克隆试剂盒(New England Biolab)组装纯化的质粒和合成的IL18序列。所得构建体(pGL4-14 3xIL2NFAT-IL18和pGL4-14 3xFoxP3NFAT-IL18)含有3个重复的NFAT应答元件(IL2或FoxP3)，然后是最小启动子(mCMV：SEQ ID NO:1634)和具有CD8前导序列的IL18(SEQID NO:1752-1753)。
在pCDNA载体中用IL18克隆MNC2 CAR：
使用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)，从先前制备的载体扩增MNC2 CAR序列：5'-agggagacccaagctggctagttaagcttggatggccttaccagtgaccgccttgc-3'(SEQ ID NO:1754)和5'-taggccagagaaatgttctggcattatcagcgagggggcagggcctgc-3'(SEQ ID NO:1755)。
使用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)，从pGL4-143xNFAT-IL18扩增包含NFAT应答元件的IL18序列：5'-tgccagaacatttctctgg-3'(SEQ ID NO:1756)和5'-acagtcgaggctgatcagcgggtttaaacttatcagtcctcgttctgcacgg-3'(SEQ ID NO:1757)。使用Gibson组装克隆试剂盒(New England Biolab)组装纯化的PCR片段和消化的pCDNA 3.1V5(ThermoFisherscientific)以产生构建体pCDNA MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18和pCDNA MNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18。
在慢病毒载体中克隆MNC2 CAR-NFAT-IL18：
使用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)，从pCDNA MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18和pCDNA MNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18扩增MNC2 CAR-NFAT-IL18序列：5'-atgcaggccctgccccctcgctgataagtttaaactgccagaacatttctctggcctaac-3'(SEQ ID NO:1758)和5'-accggagcgatcgcagatccttcgcggccgcttatcagtcctcgttctgcacggtgaac-3'(SEQ ID NO:1759)。使用Gibson组装克隆试剂盒(New England Biolab)组装纯化的PCR片段和消化的pCDH DualHygro(System Biosciences,CA)以产生构建体pCDH MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18和pCDHMNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18。
用MSCV启动子产生慢病毒载体
使用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)，从pCDH-MSCV-MCS-EF1a-GFP(SystemBiosciences)扩增MSCV启动子序列：5'-attgcactagttgaaagaccccacctgtagg-3'(SED IDNO:1760)和5'-aatgctctagaatacgggtatccagg-3'(SEQ ID NO:1761)。用SpeI和XbaI限制性酶(New England Biolabs)消化之后，将纯化的片段克隆到用相同限制性酶消化的pCDHCMV MCS(System Bioscience)中，以产生构建体pCDH MSCV MCS。
在pCDH MSCV MCS中克隆MNC2 CAR-NFAT-IL18：
使用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)，从pCDNA MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18扩增MNC2 CAR-IL2NFAT-IL18序列：5'-atagcgaattcgtaccgagggccaccatgg-3'(SEQ ID NO:1762)和5'-taggcctcccaccgtacacgcctaggtaccacgccttctgtatg-3'(SEQ ID NO:1763)。使用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)，从pCDNA MNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18扩增MNC2CAR-IL2NFAT-IL18序列：5'-atagcgaattcgtaccgagggccaccatgg-3'(SEQ ID NO:1762)和5'-taggcctcccaccgtacacgcctaggtacctctgcagtaaatgg-3'(SEQ ID NO:1764)。用EcoRI和KpnI限制性酶(New England Biolabs)消化之后，将纯化的片段克隆到用相同限制性酶消化的pCDH MSCV MCS中，以产生构建体pCDH MSCV MNC2CAR-3xIL2NFAT-IL18和pCDH MSCVMNC2CAR-3xFoxP3NFAT-IL18。
6xNFAT应答元件的克隆：
合成6xNFAT(IL2和FoxP3)应答元件，然后是不同的最小启动子：mCMV(SEQ ID NO:1634)、mIL2P(SEQ ID NO:1635)和miniP(SEQ ID NO:1636)。合成了总共六(6)个序列：SEQID NO:1768-1779。
使用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增6xNFAT序列：5'-tgccagaacatttctctgg-3'(SEQ ID NO:1756)和5'-taaggccatggtggctagc-3'(SEQ ID NO:1765)。使用Gibson组装克隆试剂盒(New England Biolab)组装纯化的PCR片段和消化的(KpnI和XhoI)pCDNA MNC2CAR 3XNFAT IL18以产生具有6x NFAT应答元件(代替3x NFAT应答元件)的构建体。
使用以下引物，通过聚合酶链反应(PCR)，从上文产生的pCDNA载体扩增6xNFAT序列：5'-aataagtttaaactgccagaacatttctctgg-3'(SEQ ID NO:1766)和5'-atatagcggccgcttatcagtcctcgttctgcacgg-3'(SEQ ID NO:1767)。用PmeI和NotI限制性酶(New EnglandBiolabs)消化之后，将纯化的片段克隆到用相同限制性酶消化的pCDH MSCV MNC2CAR中，以产生构建体pCDH MSCV MNC2CAR-6xIL2NFAT-IL18和pCDH MSCV MNC2CAR-6xFoxP3NFAT-IL18。对于每个构建体，测试了3个最小启动子。
序列表自由文本
关于除a、g、c、t以外的核苷酸符号的使用，它们遵循WIPO标准ST.25，附录2，表1中所示的约定，其中k表示t或g；n表示a、c、t或g；m表示a或c；r表示a或g；s表示c或g；w表示a或t；并且y表示c或t。
MUC1受体
(粘蛋白1前体，Genbank登录号：P15941)
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAAASANL(SEQ ID NO:1)
PSMGFR
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:2)
N-10肽
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:3)
N-19
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:4)
N-23
NLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:5)
N-26
ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)
N-30
SVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:7)
N-10/C-5
QFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(SEQ ID NO:8)
N-19/C-5
ASRYNLTISDVSVSDVPFPFS(SEQ ID NO:9)
N-36
FPFSAQSGA(SEQ ID NO:10)
小鼠E6重链可变区序列：
(DNA)
gaggtgaaggtggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagggataactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(SEQ IDNO:12)
(氨基酸)
EVKVVESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFSRYGMSWVRQTPGKRLEWVATISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:13)
小鼠E6重链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
gaggtgaaggtggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctct(SEQ ID NO:14)
(氨基酸)
EVKVVESGGDLVKPGGSLKLSCVVSGFTFS(SEQ ID NO:15)
小鼠E6重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
ggattcactttcagtagatatggcatgtct(SEQ ID NO:16)
(氨基酸)
RYGMS(SEQ ID NO:17)
小鼠E6重链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
tgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:18)
(氨基酸)
WVRQTPGKRLEWVA(SEQ ID NO:19)
小鼠E6重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaagggg(SEQ ID NO:20)
(氨基酸)
TISGGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:21)
小鼠E6重链可变框架区3(FWR3)酸序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagg(SEQ ID NO:22)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYHCTR(SEQ ID NO:23)
小鼠E6重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)gataactacggtaggaactacgactacggtatggactac(SEQ ID NO:24)
(氨基酸)
DNYGRNYDYGMDY(SEQ ID NO:25)
来自IGHV3-21*03的人源化E6重链可变区序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ IDNO:38)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:39)人源化E6重链可变框架区1(FWR1)酸序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt(SEQ ID NO:40)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:41)
人源化E6重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
aggtatggcatgagc(SEQ ID NO:42)
(氨基酸)
RYGMS(SEQ ID NO:43)
人源化E6重链可变框架区2(FWR2)酸序列：
(DNA)
tgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctca(SEQ ID NO:44)
(氨基酸)
WVRQAPGKRLEWVS(SEQ ID NO:45)
人源化E6重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggc(SEQ ID NO:46)
(氨基酸)
TISGGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:47)
人源化E6重链可变框架区3(FWR3)酸序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccaga(SEQ ID NO:48)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR(SEQ ID NO:49)人源化E6重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
gataactatggccgcaactatgattatggcatggattat(SEQ ID NO:50)
(氨基酸)
DNYGRNYDYGMDY(SEQ ID NO:51)
通过Genescript合成的人源化E6 IgG2重链：
(DNA)
gaattctaagcttgggccaccatggaactggggctccgctgggttttccttgttgctattttagaaggtgtccagtgtgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaagtttaaactctaga(SEQ ID NO:52)
(氨基酸)
EF*AWATMELGLRWVFLVAILEGVQCEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**V*TLX(SEQ ID NO:53)人IgG2重链恒定区序列：
(DNA)
gcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag(SEQ ID NO:54)
(氨基酸)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:55)
人源化E6 IgG1重链序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacccactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtcccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQ ID NO:56)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNPLYLQMNSLRAEDTAVYYCPRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:57)
人IgG1重链恒定区序列：
(DNA)
gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQ ID NO:58)
(氨基酸)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:59)
小鼠E6轻链可变区序列：
(DNA)
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa(SEQ ID NO:65)
(氨基酸)
QIVLTQSPAIMSASPGEEVTLTCSATSSVSYIHWFQQRPGTSPKLWIYSTSNLASGVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSSPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:66)
小鼠E6轻链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgc(SEQ ID NO:67)
(氨基酸)
QIVLTQSPAIMSASPGEEVTLTC(SEQ ID NO:68)
小鼠E6轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGTGCCACCTCAAGTGTAAGTTACATACAC(SEQ ID NO:69)
(氨基酸)
SATSSVSYIH(SEQ ID NO:70)
小鼠E6轻链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
tggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttat(SEQ ID NO:71)
(氨基酸)
WFQQRPGTSPKLWIY(SEQ ID NO:72)
小鼠E6轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
agcacatccaacctggcttct(SEQ ID NO:73)
(氨基酸)
STSNLAS(SEQ ID NO:74)
小鼠E6轻链可变框架区3(FWR3)序列：
(DNA)
ggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgc(SEQ ID NO:75)
(氨基酸)
GVPVRFSGSGYGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID NO:76)小鼠E6轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cagcaaaggagtagttccccattcacg(SEQ ID NO:77)
(氨基酸)
QQRSSSPFT(SEQ ID NO:78)
来自IGKV3-11*02的人源化E6轻链可变区序列：
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa(SEQ ID NO:93)
(氨基酸)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:94)
人源化E6轻链可变框架区1(FWR1)酸序列：
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgc(SEQ ID NO:95)
(氨基酸)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLTC(SEQ ID NO:96)
人源化E6轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agcgccaccagcagtgttagctacatccac(SEQ ID NO:97)
(氨基酸)
SATSSVSYIH(SEQ ID NO:98)
人源化E6重轻可变框架区2(FWR2)酸序列：
(DNA)
tggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctat(SEQ ID NO:99)
(氨基酸)
WYQQRPGQSPRLLIY(SEQ ID NO:100)
人源化E6轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
agcacctccaacctggccagc(SEQ ID NO:101)
(氨基酸)
STSNLAS(SEQ ID NO:102)
人源化E6轻链可变框架区3(FWR3)酸序列：
(DNA)
ggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgt(SEQ ID NO:103)
(氨基酸)
GIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO:104)
人源化E6轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cagcagcgtagcagctcccctttcacc(SEQ ID NO:105)
(氨基酸)
QQRSSSPFT(SEQ ID NO:106)
通过Genescript合成的人源化E6κ轻链：
(DNA)
gaattctaagcttgggccaccatggaagccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactggagaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaaggacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaagtttaaactctaga(SEQ ID NO:107)
(氨基酸)
EF*AWATMEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**V*TLX(SEQ ID NO:108)
人κ轻链恒定区序列：
(DNA)
aggacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag(SEQ ID NO:109)
(氨基酸)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:110)
人源化E6λ轻链序列：
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaa(SEQ ID NO:111)
(氨基酸)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS**(SEQ IDNO:112)
人源化λ轻链恒定区序列：
(DNA)
ggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaa(SEQ ID NO:113)
(氨基酸)
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS**(SEQ ID NO:114)
小鼠C2重链可变区序列：
(DNA)
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtggctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctccgccaaaacgacacccccatctgtctat(SEQ ID NO:118)
(氨基酸)
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEYFDVWGAGTTVTVSSAKTTPPSVY(SEQ ID NO:119)
小鼠C2重链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
gaggtccagctggaggagtcagggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagt(SEQ ID NO:120)
(氨基酸)
EVQLEESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:121)
小鼠C2重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
ggctatgccatgtct(SEQ ID NO:122)
(氨基酸)
GYAMS(SEQ ID NO:123)
小鼠C2重链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
tgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:124)
(氨基酸)
WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:125)
小鼠C2重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accattagtagtggtggtacttatatctactatccagacagtgtgaagggg(SEQ ID NO:126)
(氨基酸)
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:127)
小鼠C2重链可变框架区3(FWR3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccatgtattactgtgcaaga(SEQ ID NO:128)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCAR(SEQ ID NO:129)
小鼠C2重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cttgggggggataattactacgaatacttcgatgtc(SEQ ID NO:130)
(氨基酸)
LGGDNYYEYFDV(SEQ ID NO:131)
衍生自IGHV3-21*04的人源化：
人源化C2重链可变区序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctcc(SEQ IDNO:144)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:145)
人源化C2重链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt(SEQ ID NO:146)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:147)
人源化C2重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
ggctatgccatgagc(SEQ ID NO:148)
(氨基酸)
GYAMS(SEQ ID NO:149)
人源化C2重链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaa(SEQ ID NO:150)(氨基酸)
WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:151)
人源化C2重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggc(SEQ ID NO:152)
(氨基酸)
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:153)
人源化C2重链可变框架区3(FWR3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga(SEQ ID NO:154)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:155)
人源化C2重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cttgggggggataattactacgaatacttcgatgtc(SEQ ID NO:156)
(氨基酸)
LGGDNYYEYFDV(SEQ ID NO:157)
人源化C2 IgG1重链序列
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQ ID NO:157)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:158)
人源化C2 IgG2重链序列
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaa(SEQ ID NO:163)
(氨基酸)EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:164)
小鼠C2轻链可变区序列：
(DNA)
gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttccgttcacgttcggaggggggaccaagctggagataaaacgggctgatgctgcaccaactgtatcc(SEQ ID NO:168)
(氨基酸)
DIVITQSTASLGVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPFTFGGGTKLEIKRADAAPTVS(SEQ ID NO:169)
小鼠C2轻链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
gacattgtgatcacacagtctacagcttccttaggtgtatctctggggcagagggccaccatctcatgc(SEQ ID NO:170)
(氨基酸)
DIVITQSTASLGVSLGQRATISC(SEQ ID NO:171)
小鼠C2轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcac(SEQ ID NO:172)
(氨基酸)
RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:173)
小鼠C2轻链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
tggtaccaacagagaccaggacagccacccaaactcctcatctat(SEQ ID NO:174)
(氨基酸)
WYQQRPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:175)
小鼠C2轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
cttgcatccaacctagaatc(SEQ ID NO:176)
(氨基酸)
LASNLES(SEQ ID NO:177)
小鼠C2轻链可变框架区3(FWR3)序列：
(DNA)
tggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgt(SEQ ID NO:178)
(氨基酸)
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ ID NO:179)
小鼠C2轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cagcacagtagggagcttccgttcacg(SEQ ID NO:180)
(氨基酸)
QHSRELPFT(SEQ ID NO:181)
衍生自IGKV7-3*01的人源化
人源化C2轻链可变区序列：
(DNA)gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQ ID NO:194)
(氨基酸)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:195)
人源化C2轻链可变框架区1(FWR1)酸序列：
(DNA)
gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgc(SEQ ID NO:196)
(氨基酸)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC(SEQ ID NO:197)
人源化C2轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcac(SEQ ID NO:198)
(氨基酸)
RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:199)
人源化C2重轻可变框架区2(FWR2)酸序列：
(DNA)
tggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttac(SEQ ID NO:200)
(氨基酸)
WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:201)
人源化C2轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
ctggcatccaatctggagagc(SEQ ID NO:202)
(氨基酸)
LASNLES(SEQ ID NO:203)
人源化C2轻链可变框架区3(FWR3)酸序列：
(DNA)
ggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgt(SEQ ID NO:204)
(氨基酸)
GVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYC(SEQ ID NO:205)
人源化C2轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cagcacagtagggagctgcctttcaca(SEQ ID NO:206)
(氨基酸)
QHSRELPFT(SEQ ID NO:207)
人源化C2轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
ctgcagagtaagaattttcctcccaca(SEQ ID NO:208)
(氨基酸)
LQSKNFPPT(SEQ ID NO:209)
鼠Igκ链前导序列
(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgac(SEQID NO:222)
(氨基酸)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGD(SEQ ID NO:223)
白介素-2(IL-2)前导序列
(DNA)
atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt(SEQ IDNO:224)
(氨基酸)
MYRMQLLSCIALSLALVTNS(SEQ ID NO:225)
CD33前导序列
(DNA)
atgcctcttctgcttctgcttcctctgctttgggctggagctcttgct(SEQ ID NO:226)
(氨基酸)
MPLLLLLPLLWAGALA(SEQ ID NO:227)
IGHV3-21*03前导序列
(DNA)
atggaactggggctccgctgggttttccttgttgctattttagaaggtgtccagtgt(SEQ ID NO:228)
(氨基酸)
MELGLRWVFLVAILEGVQC(SEQ ID NO:229)
IGHV3-11*02前导序列
(DNA)
atggaagccccagcgcagcttctcttcctcctgctactctggctcccagataccactgga(SEQ IDNO:230)
(氨基酸)
MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG(SEQ ID NO:231)
人源化E6单链GS3
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa(SEQ ID NO:232)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:233)
人源化E6单链IgG1noC
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa(SEQID NO:234)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:235)
人源化E6单链X4(接头为IgG1和IgG2修饰铰链区)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccggaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa(SEQ ID NO:236)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:237)
人源化C2单链GS3
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQID NO:238)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:239)
人源化C2单链IgG1noC
(DNA)
Gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQ ID NO:240)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:241)
人源化C2单链X4(接头为IgG1和IgG2修饰铰链区)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccggacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQ ID NO:242)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:243)
人源化C3单链GS3
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcttccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQ IDNO:244)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:245)
人源化C3单链X4(接头为IgG1和IgG2修饰铰链区)
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgataaaacccatactaaaccgccaaaaccggcgccggaactgctgggtggtcctggtaccggtactggtggtccgactattaaacctccgaaacctccgaaacctgctccgaacctgctgggtggtccggatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcttccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQ ID NO:248)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSDKTHTKPPKPAPELLGGPGTGTGGPTIKPPKPPKPAPNLLGGPDIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:249)
人源化C8单链GS3(接头为[Gly4Ser1]3)
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQ ID NO:250)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:251)
pSECTag2 E6 scFV-FC
(DNA)
atggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaagagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQID NO:256)
(氨基酸)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:257)
人IgG1 Fc序列：
(DNA)
gagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQ ID NO:272)
(氨基酸)
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:273)
人IgG1 CH2-CH3结构域序列：
(DNA)
ccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQ ID NO:274)
(氨基酸)
PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:275)
人IgG1 CH3结构域序列：
(DNA)
gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQ ID NO:276)
(氨基酸)
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:277)
CAR-T E6 CD8/CD8/CD28/CD3z序列：
N-CD8ls-huMNE6scFv-CD8ecd片段-CD8跨膜-CD28-CD3ζ-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa
(SEQ ID NO:297)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:298)
CAR-T E6 CD8/CD8/4-1BB/CD3z序列：
N-CD8ls-huMNE6scFv-CD8ecd片段-CD8跨膜-4-1BB-CD3ζ-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa
(SEQ ID NO:300)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**
(SEQ ID NO:301)
CAR-T E6 CD8/CD8/CD28/4-1BB/CD3z序列：
N-CD8ls-huMNE6scFv-CD8ecd片段-CD8跨膜-CD28-4-1BB-CD3ζ-C
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggccagaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtccaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa
(SEQ ID NO:303)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:304)
CAR-T C2 CD8/CD8/CD28/4-1BB/CD3z序列：
N-CD8ls-huMNC2scFv-CD8ecd片段-CD8跨膜-CD28-4-1BB-CD3ζ-C
(DNA)
atggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtccaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQ ID NO:306)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ IDNO:307)
CAR中的人源化E6 scFV序列：
(DNA)
gaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaa(SEQ ID NO:341)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:342)
CD8前导序列：
(DNA)
atggccctgcccgtgaccgctttgctgctccccctggcgctgctgctgcacgccgccaggcca(SEQID NO:343)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:344)
CD8铰链结构域序列：
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgat(SEQ IDNO:345)
(氨基酸)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD(SEQ ID NO:346)
CD4铰链结构域序列：
(DNA)
tcgggacaggtcctgctggaatccaacatcaaggttctgcccacatggtccaccccggtgcagcca(SEQ ID NO:347)
(氨基酸)
SGQVLLESNIKVLPTWSTPVQP(SEQ ID NO:348)
CD28铰链结构域序列：
(DNA)
aaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagccc(SEQ ID NO:349)
(氨基酸)
KHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:350)
CD3ζ跨膜结构域序列：
(DNA)
ctctgctacctgctggatggaatcctcttcatctatggtgtcattctcactgccttgttcctg(SEQID NO:361)
(氨基酸)
LCYLLDGILFIYGVILTALFL(SEQ ID NO:362)
CD8跨膜结构域序列：
(DNA)
atctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactg c(SEQ ID NO:363)
(氨基酸)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:364)
CD4跨膜结构域序列：
(DNA)
atggccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttc(SEQ ID NO:365)
(氨基酸)
MALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF(SEQ ID NO:366)
CD28跨膜结构域序列：
(DNA)
ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg(SEQ ID NO:367)
(氨基酸)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:368)
4-1BB跨膜结构域序列：
(DNA)
atcatctccttctttcttgcgctgacgtcgactgcgttgctcttcctgctgttcttcctcacgctccgtttctctgttgtt(SEQ ID NO:369)
(氨基酸)
IISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVV(SEQ ID NO:370)
OX40跨膜结构域序列：
(DNA)
gttgccgccatcctgggcctgggcctggtgctggggctgctgggccccctggccatcctgctggccctgtacctgctc(SEQ ID NO:371)
(氨基酸)
VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL(SEQ ID NO:372)
CD3ζ结构域序列：
(DNA)
cgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacgg(SEQ ID NO:373)
(氨基酸)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:374)
CD3ζ结构域变体序列：
(DNA)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc(SEQ ID NO:375)
(氨基酸)
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:376)
CD28结构域序列：
(DNA)
agaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcc(SEQ ID NO:377)
(氨基酸)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:378)
4-1BB结构域序列：
(DNA)
aaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactg(SEQ ID NO:379)
(氨基酸)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:380)
人源化E6 scFV(VH-VL)序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaa(SEQ ID NO:391)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO:392)
人源化E6 scFV(VL-VH)序列：
(DNA)
gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc(SEQ ID NO:393)
(氨基酸)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:394)
人源化C2 scFV(VH-VL)序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQID NO:395)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:396)
人源化E6 scFV(VL-VH)序列：
(DNA)
gacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctcc(SEQID NO:397)
(氨基酸)
DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:398)
G4S1接头序列：
(DNA)
ggcggtggcggatcc(SEQ ID NO:399)
(氨基酸)
GGGGS(SEQ ID NO:400)
[G4S1]x3接头序列：
(DNA)
ggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcc(SEQ ID NO:401)
(氨基酸)
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:402)
8aa GS接头序列：
(DNA)
ggcggttccggcggtggatccgga(SEQ ID NO:403)
(氨基酸)
GGSGGGSG(SEQ ID NO:404)
12aa GS接头序列：
(DNA)
ggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccgga(SEQ ID NO:405)
(氨基酸)
GGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:406)
13aa GS接头序列：
(DNA)
ggcggtggatccggcggtggcggatccggcggtggatcc(SEQ ID NO:407)
(氨基酸)
GGGSGGGGSGGGS(SEQ ID NO:408)
22aa GS接头序列：
(DNA)
ggcggtggaagcggcggtggcggatccggcagcggcggaagcggcggtggcggatccggcggtgga(SEQ ID NO:409)
(氨基酸)
GGGSGGGGSGSGGSGGGGSGGG(SEQ ID NO:4110)
24aa GS接头序列：
(DNA)ggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccggaggcggttccggcggtggatccggcggtggcggatccgga(SEQ ID NO:411)
(氨基酸)
GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSG(SEQ ID NO:412)
小鼠C3重链可变区序列：
(DNA)
caggtccagctgcagcagtctgggcctgagctggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttccggctacagattcactgattatgctatgaactgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtggattggagttattagtactttctctggtaatacaaacttcaaccagaagtttaagggcaaggccacaatgactgtagacaaatcctccagcacagcctatatggaacttgccagattgacatctgaggattctgccatgtattactgtgcaagatcggattactacggcccatactttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ ID NO:413)
(氨基酸)
QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSGYRFTDYAMNWVKQSHAKSLEWIGVISTFSGNTNFNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAMYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:414)小鼠C3重链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
caggtccagctgcagcagtctgggcctgagctggtgaggcctggggtctcagtgaagatttcctgcaagggttccggctacagattcact(SEQ ID NO:415)
(氨基酸)
QVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSGYRFT(SEQ ID NO:416)小鼠C3重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
gattatgctatgaac(SEQ ID NO:417)
(氨基酸)
DYAMN(SEQ ID NO:418)
小鼠C3重链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
tgggtgaagcagagtcatgcaaagagtctagagtggattgga(SEQ ID NO:419)
(氨基酸)
WVKQSHAKSLEWIG(SEQ ID NO:420)
小鼠C3重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
gttattagtactttctctggtaatacaaacttcaaccagaagtttaagggc(SEQ ID NO:421)
(氨基酸)
VISTFSGNTNFNQKFKG(SEQ ID NO:422)
小鼠C3重链可变框架区3(FWR3)酸序列：
(DNA)
aaggccacaatgactgtagacaaatcctccagcacagcctatatggaacttgccagattgacatctgaggattctgccatgtattactgtgcaaga(SEQ ID NO:423)
(氨基酸)
KATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAMYYCAR(SEQ ID NO:424)小鼠C3重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
tcggattactacggcccatactttgactac(SEQ ID NO:425)
(氨基酸)
SDYYGPYFDY(SEQ ID NO:426)
来自IGHV1-18*04的人源化C3重链可变区序列：
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagc(SEQ ID NO:439)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:440)人源化C3重链可变框架区1(FWR1)酸序列：
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttacc(SEQ ID NO:441)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT(SEQ ID NO:442)
人源化C3重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
gactacgccatgaac(SEQ ID NO:443)
(氨基酸)
DYAMN(SEQ ID NO:444)
人源化C3重链可变框架区2(FWR2)酸序列：
(DNA)
tgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatggga(SEQ ID NO:445)
(氨基酸)
WVRQAPGQGLEWMG(SEQ ID NO:446)
人源化C3重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
gtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggc(SEQ ID NO:447)
(氨基酸)
VISTFSGNTNFNQKFKG(SEQ ID NO:448)
人源化C3重链可变框架区3(FWR3)酸序列：
(DNA)
agagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgaga(SEQ ID NO:449)
(氨基酸)
RVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO:450)
人源化C3重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
agcgactactacggcccatacttcgactac(SEQ ID NO:451)
(氨基酸)
SDYYGPYFDY(SEQ ID NO:452)
人源化C3 IgG1重链序列
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQ IDNO:453)
(氨基酸)QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:454)
人源化C3 IgG2重链序列
(DNA)
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccgactacgccatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggagtgatcagcaccttcagcggtaacacaaacttcaaccagaagttcaagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagaagcgactactacggcccatacttcgactactggggccagggcaccaccctgaccgtgtccagcgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaa(SEQ ID NO:455)
(氨基酸)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYAMNWVRQAPGQGLEWMGVISTFSGNTNFNQKFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDYYGPYFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:456)
小鼠C3轻链可变区序列：
(DNA)
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaccattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcaacagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaaggttcacatgttccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa(SEQ ID NO:458)
(氨基酸)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:459)
小鼠C3轻链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgc(SEQ ID NO:460)
(氨基酸)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:461)
小鼠C3轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agatctagtcagaccattgtacatagtaatggaaacacctatttagaa(SEQ ID NO:462)
(氨基酸)
RSSQTIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:463)
小鼠C3轻链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
tggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctac(SEQ ID NO:464)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:465)
小鼠C3轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
aaagtttccaaccgattttct(SEQ ID NO:466)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:467)
小鼠C3轻链可变框架区3(FWR3)序列：
(DNA)
ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcaacagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgc(SEQ ID NO:468)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:469)
小鼠C3轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
tttcaaggttcacatgttccattcacg(SEQ ID NO:470)
(氨基酸)
FQGSHVPFT(SEQ ID NO:471)
来自IGKV2-29*03的人源化C3轻链可变区序列：
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcttccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQ ID NO:486)
(氨基酸)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:487)
人源化C3轻链可变框架区1(FWR1)酸序列：
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgc(SEQ ID NO:488)
(氨基酸)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC(SEQ ID NO:489)
人源化C3轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
ggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggag(SEQ ID NO:490)
(氨基酸)
RSSQTIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:491)
人源化C3轻链可变框架区2(FWR2)酸序列：
(DNA)
tggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctat(SEQ ID NO:492)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPQLLIY(SEQ ID NO:493)
人源化C3轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
aaggtttccaaccggttctct(SEQ ID NO:494)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:495)
人源化C3轻链可变框架区3(FWR3)酸序列：
(DNA)
ggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgc(SEQ ID NO:496)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC(SEQ ID NO:497)人源化C3轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
ttccaaggtagccacgtgcctttcacc(SEQ ID NO:498)
(氨基酸)
FQGSHVPFT(SEQ ID NO:499)
人源化C3λ轻链序列
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcttccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaa(SEQ ID NO:500)
(氨基酸)DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRTGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS**(SEQ ID NO:501)
人源化C3κ轻链
(DNA)
gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagaccattgtccatagtaatggaaacacctatttggagtggtacctgcagaagccaggccagtctccacagctcctgatctataaggtttccaaccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtcagggacagatttcacactgaaaatcagccgggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcttccaaggtagccacgtgcctttcaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaa(SEQ ID NO:502)
(氨基酸)
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPFTFGGGTKVEIKRTTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**(SEQ ID NO:503)
小鼠C8重链可变区序列
(DNA)
gaagtgatggtcgtggaaagcggcggtggtctggtaaagccggggggatcccttaagctttcttgcgccgcatccgggttcacgttctccggctatgccatgtcctgggtccgacagactcccgaaaagcgcttggaatgggtggccactatctcctccggggggacgtacatctactaccccgacagtgtgaaaggaagatttacaatatctcgcgacaacgcaaaaaataccttgtatcttcaaatgagctccctgcggtcagaggacactgccatgtactattgcgcccgcctgggcggcgacaattactatgagtat(SEQ ID NO:505)
(氨基酸)
EVMVVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSGYAMSWVRQTPEKRLEWVATISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARLGGDNYYEY(SEQ ID NO:506)
小鼠C8重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
ggctatgccatgtcc(SEQ ID NO:507)
(氨基酸)
GYAMS(SEQ ID NO:508)
小鼠C8重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
actatctcctccggggggacgtacatctactaccccgacagtgtgaaagga(SEQ ID NO:509)
(氨基酸)
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:510)
小鼠C8重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
ctgggcggcgacaattactatgagtat(SEQ ID NO:511)
(氨基酸)
LGGDNYYEY(SEQ ID NO:512)
来自IGHV3-21*04的人源化C8重链可变区序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctcc(SEQ ID NO:525)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO:526)
人源化C8重链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt(SEQ ID NO:527)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:528)
人源化C8重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
ggctatgccatgagc(SEQ ID NO:529)
(氨基酸)
GYAMS(SEQ ID NO:530)
人源化C8重链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
tgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctca(SEQ ID NO:531)
(氨基酸)
WVRQAPGKGLEWVS(SEQ ID NO:532)
人源化C8重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggc(SEQ ID NO:533)
(氨基酸)
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:534)
人源化C8重链可变框架区3(FWR3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaga(SEQ ID NO:535)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:536)
人源化C8重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
ctgggcggcgataactattatgaatat(SEQ ID NO:537)
(氨基酸)
LGGDNYYEY(SEQ ID NO:538)
人源化C8 IgG1重链序列
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgacagtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatgataa(SEQ ID NO:539)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:540)
人源化C8 IgG2重链序列
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccctgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagactgggcggcgataactattatgaatattggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccagctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatagtaa(SEQ ID NO:541)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYWGKGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK**(SEQ ID NO:542)
小鼠C8轻链可变区序列
(DNA)
gacatcgtcattacgcagacccctgccagtcttgccgtttctctgggccagagggccactatcagttacagggcgagtaagtctgtgagtaccagcggctatagttacatgcattggaaccagcagaaaccgggacagccaccacgcctgcttatttatctggtgtctaatcttgagtccggggtgcccgccaggttcagcggcagcggctctgggaccgacttcacactcaacattcatccagtggaagaagaggacgctgctacatactactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaa(SEQ ID NO:543)
(氨基酸)
DIVITQTPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSE(SEQ ID NO:544)
小鼠C8轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agggcgagtaagtctgtgagtaccagcggctatagttacatgcat(SEQ ID NO:545)
(氨基酸)
RASKSVSTSGYSYMH(SEQ ID NO:546)
小鼠C8轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
ctggtgtctaatcttgagtcc(SEQ ID NO:547)
(氨基酸)
LVSNLES(SEQ ID NO:548)
小鼠C8轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
caacacattcgggaactgaccaggagtgaa(SEQ ID NO:549)
(氨基酸)
QHIRELTRSE(SEQ ID NO:550)
来自NCBI种系z00023的人源化C8轻链可变区序列：
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQ ID NO:565)
(氨基酸)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:566)
人源化C8轻链可变框架区1(FWR1)序列：
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgc(SEQ ID NO:567)
(氨基酸)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC(SEQ ID NO:568)
人源化C8轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatg(SEQ ID NO:569)
(氨基酸)
RASKSVSTSGYSYM(SEQ ID NO:570)
人源化C8轻链可变框架区2(FWR2)序列：
(DNA)
cactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttac(SEQ ID NO:571)
(氨基酸)
HWYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:572)
人源化C8轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
ctggtgtctaacctggaatcc(SEQ ID NO:573)
(氨基酸)
LVSNLES(SEQ ID NO:574)
人源化C8轻链可变框架区3(FWR3)序列：
(DNA)
ggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgt(SEQ ID NO:575)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC(SEQ ID NO:576)
人源化C8轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
caacacattcgggaactgaccaggagtgaa(SEQ ID NO:577)
(氨基酸)
QHIRELTRSE(SEQ ID NO:578)
人源化C8λ轻链序列
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactggtcagcccaaggctgccccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatagtaa(SEQ ID NO:579)
(氨基酸)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRTGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS**(SEQ ID NO:580)
人源化C8κ轻链序列
(DNA)
gacatcgtgatgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagggccagcaagagtgttagcaccagcggctacagctacatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttacctggtgtctaacctggaatccggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcaacacattcgggaactgaccaggagtgaattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttagtaa(SEQ ID NO:581)
(氨基酸)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLVSNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHIRELTRSEFGGGTKVEIKRTTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC**(SEQ ID NO:582)
CAR-T E6 CD8序列：
(DNA)
gaggtccagctggttgagagtggcggtgggctggttaagcctggcggctccctgcggctgagctgcgccgcgagtggatttactttcagccgatatgggatgagttgggtgcggcaagctcccgggaagaggctggaatgggtctcaacaatctccggggggggcacttacatctattaccccgactcagtcaaggggagatttaccatttcacgagacaacgctaagaataccctgtatttgcagatgaattctctgagagcagaggacacagctgtttactattgtacccgcgacaactatggcaggaactacgactacggtatggactattggggacaagggacattggttacagtgagcagtggcggcgggggcagcggaggaggaggcagcggtggggggggcagcgagatagtgctcacgcagtcacccgcgactctcagtctctcacctggggaacgagctaccctgacgtgctctgctacctcctcagtgtcatatattcactggtatcagcaacggcccgggcagtcccctagattgctcatttatagtacctctaatctggcctcaggtatccctgcacgattttctggatctggttcaggttctgattacaccctcactatctctagcctggagcctgaagactttgccgtttattactgccagcagaggtctagctccccattcacctttgggagtgggaccaaggttgaaattaaaacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgctgataa(SEQ ID NO:584)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC**(SEQ ID NO:585)
CAR-T C2 CD8 CD8序列：
N-CD8ls-huMNC2scFv-CD8ecd片段-CD8跨膜-C
(DNA)
gaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgctgataa(SEQ ID NO:586)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC**(SEQ ID NO:587)
CD8/4-1BB序列
N-CD8跨膜-4-1BB-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgtgataa(SEQ ID NO:588)
(氨基酸)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL**(SEQ ID NO:589)
CD8/CD28序列
N-CD8跨膜-CD28-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcctgataa(SEQ ID NO:590)
(氨基酸)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTR KHYQPYAPPRDFAAYRS**(SEQ ID NO:591)
CD8/CD3z序列：
N-CD8跨膜-CD3ζ-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQ ID NO:592)
(氨基酸)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:593)
CD8/CD28/CD3z序列：
N-CD8跨膜-CD28-CD3ζ-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQID NO:594)
(氨基酸)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:595)
CD8/4-1BB/CD3z序列：
N-CD8跨膜-4-1BB-CD3ζ-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQ ID NO:596)
(氨基酸)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:597)
CD8/CD28/4-1BB/CD3z序列：
N-CD8跨膜-CD28-4-1BB-CD3ζ-C
(DNA)
acgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtccaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQ ID NO:598)
(氨基酸)
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:599)
CAR-T C2 CD8/CD8/CD28/CD3z序列：
N-CD8ls-huMNC2scFv-CD8ecd片段-CD8跨膜-CD28-CD3ζ-C(DNA)
atggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcagaagcaagcggtctcggctcctgcattctgattacatgaacatgaccccaagaagaccaggccccaccaggaaacattaccagccctacgctccgccacgcgacttcgctgcctaccggtcccgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQ ID NO:608)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:609)
CAR-T C2 CD8/CD8/4-1BB/CD3z序列#13：
N-CD8ls-huMNC2scFv-CD8ecd片段-CD8跨膜-4-1BB-CD3ζ-C
(DNA)
atggccttgccagtgacggccctgctgctgccattggctcttctgttgcacgctgccaggcctgaagtgcagctcgtagagagtggcgggggactggtgaagcccggtggaagcctcagactcagttgcgccgcctcaggtttcactttttcaggttacgccatgtcctgggtaagacaggcaccggggaaaggactcgagtgggtgtctactatcagctcaggaggcacttatatatattatcctgactctgtaaaaggccgatttacgatttctcgcgacaatgcaaagaactccctctacctccaaatgaacagtcttagggcagaagacactgctgtatactattgtgcacgcctcggcggcgacaactactacgagtactttgacgtgtgggggaaagggactaccgtgacagtttcaagcggaggaggtggctcaggtggaggcgggtcaggggggggaggaagtgatattgtgctcacacaatccccagcctccctggctgtgtctcccggccaacgcgctacaattacatgtcgggcctccaaaagcgtgagcaccagcggctacagctacatgcactggtatcaacagaaaccaggacaaccccccaaactgttgatttatctcgcttcaaacttggagtccggcgtgcctgcgcgcttttcagggagtgggagcggcacagattttacgctgactatcaaccccgtagaagcaaacgatacagcgaattattattgtcaacattcccgggaactcccctttacgttcggcgggggcacaaaggtcgaaattaagagaaccacgacaaccccggcccccagaccaccaacgccagcccccaccatcgccagccaacccctgtctctgagaccagaagcctgtaggcctgccgccggtggagctgtgcacacaagaggactggatttcgcctgtgatatctacatttgggccccgctcgcaggcacatgtggagtgctcctcctctccctggtgattaccctgtactgcaaaaggggccgcaaaaaactcctttacatttttaagcagccttttatgaggccagtacagacgactcaagaggaagacgggtgctcatgccgctttcctgaggaggaggaaggagggtgcgaactgcgcgttaagttctcccgatcagccgacgcgcctgcttacaagcagggccagaaccaactgtacaacgagctgaatctcggtagacgggaagagtacgacgtgttggacaaacggagaggccgcgacccagaaatgggcggcaagcctcgcaggaaaaacccccaggagggactgtacaatgagttgcagaaagataagatggcagaagcttatagcgagatcggaatgaagggggaaaggagacgagggaaaggacacgacggcctttatcagggcctgtccacagcaacaaaagatacgtatgacgccctccatatgcaggcacttccaccacggtgataa(SEQ ID NO:610)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:611)
MUC1截短的细胞外结构域序列
(氨基酸)
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:620)
MUC1截短的细胞外结构域序列
(氨基酸)
SVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRY(SEQ ID NO:621)
MUC1截短的细胞外结构域序列
(氨基酸)
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQY(SEQ ID NO:622)
MUC1截短的细胞外结构域序列
(氨基酸)
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTIN(SEQ ID NO:623)
引物
attctaagcttgggccaccatggaactg(SEQ ID NO:624)
tctagagtttaaacttactatttacccggagacagggagag(SEQ ID NO:625)
agtatggcccagccggccgaggtgcagctggtggagtctgg(SEQ ID NO:626)
tagaaggcacagtcgaggctgatcag(SEQ ID NO:627)
attctaagcttgggccaccatggaagc(SEQ ID NO:628)
tctagagtttaaacttactaacactctcccctgttgaagc(SEQ ID NO:629)
agtatggcccagccggccgaaattgtgttgacacagtctccag(SEQ ID NO:630)
tagaaggcacagtcgaggctgatcag(SEQ ID NO:631)
actgtcatatggaggtgcagctggtggagtctg(SEQ ID NO:632)
actgtctcgagtttaatttccactttggtgccgctgc(SEQ ID NO:633)
actgtcatatggaggtgcagctggtggagtctg(SEQ ID NO:634)
actgtaccggttttaatttccactttggtgccgctgc(SEQ ID NO:635)
cttcttcctcaggagcaagctcaccgtgg(SEQ ID NO:636)
gagccgtcggagtccagc(SEQ ID NO:637)
gcacctgaactcctgggg(SEQ ID NO:638)
tttaatttccactttggtgccg(SEQ ID NO:639)
cgcggctagcttaagcttggtaccgagggcca(SEQ ID NO:640)
cgcggcggccgcctgatcagcgggtttaaacttatc(SEQ ID NO:641)
MMP9
(DNA)
atgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgattacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:642)
(氨基酸)
MSLWQPLVLVLLVLGCCFAAPRQRQSTLVLFPGDLRTNLTDRQLAEEYLYRYGYTRVAEMRGESKSLGPALLLLQKQLSLPETGELDSATLKAMRTPRCGVPDLGRFQTFEGDLKWHHHNITYWIQNYSEDLPRAVIDDAFARAFALWSAVTPLTFTRVYSRDADIVIQFGVAEHGDGYPFDGKDGLLAHAFPPGPGIQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFGNADGAACHFPFIFEGRSYSACTTDGRSDGLPWCSTTANYDTDDRFGFCPSERLYTQDGNADGKPCQFPFIFQGQSYSACTTDGRSDGYRWCATTANYDRDKLFGFCPTRADSTVMGGNSAGELCVFPFTFLGKEYSTCTSEGRGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHALGLDHSSVPEALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPEPRPPTTTTPQPTAPPTVCPTGPPTVHPSERPTAGPTGPPSAGPTGPPTAGPSTATTVPLSPVDDACNVNIFDAIAEIGNQLYLFKDGKYWRFSEGRGSRPQGPFLIADKWPALPRKLDSVFEERLSKKLFFFSGRQVWVYTGASVLGPRRLDKLGLGADVAQVTGALRSGRGKMLLFSGRRLWRFDVKAQMVDPRSASEVDRMFPGVPLDTHDVFQYREKAYFCQDRFYWRVSSRSELNQVDQVGYVTYDILQCPEDDYKDDDDK**(SEQ ID NO:643)
MMP9催化结构域
(DNA)
atgttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgattacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:644)
(氨基酸)
MFQTFEGDLKWHHHNITYWIQNYSEDLPRAVIDDAFARAFALWSAVTPLTFTRVYSRDADIVIQFGVAEHGDGYPFDGKDGLLAHAFPPGPGIQGDAHFDDDELWSLGKGVVVPTRFGNADGAACHFPFIFEGRSYSACTTDGRSDGLPWCSTTANYDTDDRFGFCPSERLYTQDGNADGKPCQFPFIFQGQSYSACTTDGRSDGYRWCATTANYDRDKLFGFCPTRADSTVMGGNSAGELCVFPFTFLGKEYSTCTSEGRGDGRLWCATTSNFDSDKKWGFCPDQGYSLFLVAAHEFGHALGLDHSSVPEALMYPMYRFTEGPPLHKDDVNGIRHLYGPRPEPDYKDDDDK**(SEQ ID NO:645)
NFATc1启动子(NFATc1P)
(DNA)
aggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacagagccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagagg(SEQ ID NO:646)
NFATc1P-MMP9
(DNA)
aggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacagagccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggtctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgatta caaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:647)
NFATc1P-MMP9cat
(DNA)
aggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacagagccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggtctagagccaccatgttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgattacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:648)
NFAT应答元件
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgt(SEQ ID NO:649)
NFAT应答元件重复序列
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgt(SEQ ID NO:650)
CMV最小启动子
(DNA)
aggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatc(SEQ IDNO:651)
NFATREmCMV-MMP9
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactcaggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatctctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgattacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:652)
NFATREmCMV-MMP9cat
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactcaggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatctctagagccaccatgttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctg attacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:653)
C2 scFv
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQID NO:654)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:655)
CD8跨膜结构域
(DNA)
atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc(SEQ ID NO:656)
(氨基酸)
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:657)
4-1BB结构域
(DNA)
aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg(SEQ ID NO:658)
(氨基酸)
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:659)
CD3ζ结构域
(DNA)
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc(SEQ ID NO:660)
(氨基酸)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO:661)
CAR-T C2 CD8/CD8/4-1BB/CD3z#44
N-CD8ls-huMNC2scFv-CD8ecd片段-CD8跨膜-4-1BB-CD3ζ-C
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactacaacaacccctgcccccagacctcctaccccagcccctacaattgccagccagcctctgagcctgaggcccgaggcttgtagacctgctgctggcggagccgtgcacaccagaggactggatttcgcctgcgacatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa(SEQ ID NO:718)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:719)
NFATc1P2-MMP9
(DNA)
caggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacaggccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggctccgaactcgccggcggagtcgccgcgccagatcccagcagcagggcgcggaagcttctctcgacattcgtttctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgattacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:774)
NFATc1P2-MMP9cat
(DNA)
caggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacaggccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggctccgaactcgccggcggagtcgccgcgccagatcccagcagcagggcgcggaagcttctctcgacattcgtttctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgattacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:775)
NFAT应答元件2
(DNA)
aagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgtt(SEQ ID NO:776)
NFAT应答元件2重复序列
(DNA)
aagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgtt(SEQ ID NO:777)
CMV最小启动子2
(DNA)
taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagc(SEQ ID NO:778)
NFATRE2mCMV2-MMP9
(DNA)
aagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctctcgacattcgtttctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctgcccccagacagcgccagtccacccttgtgctcttccctggagacctgagaaccaatctcaccgacaggcagctggcagaggaatacctgtaccgctatggttacactcgggtggcagagatgcgtggagagtcgaaatctctggggcctgcgctgctgcttctccagaagcaactgtccctgcccgagaccggtgagctggatagcgccacgctgaaggccatgcgaaccccacggtgcggggtcccagacctgggcagattccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgagccacggcctccaaccaccaccacaccgcagcccacggctcccccgacggtctgccccaccggaccccccactgtccacccctcagagcgccccacagctggccccacaggtcccccctcagctggccccacaggtccccccactgctggcccttctacggccactactgtgcctttgagtccggtggacgatgcctgcaacgtgaacatcttcgacgccatcgcggagattgggaaccagctgtatttgttcaaggatgggaagtactggcgattctctgagggcagggggagccggccgcagggccccttccttatcgccgacaagtggcccgcgctgccccgcaagctggactcggtctttgaggagcggctctccaagaagcttttcttcttctctgggcgccaggtgtgggtgtacacaggcgcgtcggtgctgggcccgaggcgtctggacaagctgggcctgggagccgacgtggcccaggtgaccggggccctccggagtggcagggggaagatgctgctgttcagcgggcggcgcctctggaggttcgacgtgaaggcgcagatggtggatccccggagcgccagcgaggtggaccggatgttccccggggtgcctttggacacgcacgacgtcttccagtaccgagagaaagcctatttctgccaggaccgcttctactggcgcgtgagttcccggagtgagttgaaccaggtggaccaagtgggctacgtgacctatgacatcctgcagtgccctgaggacgattacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:779)
NFATRE2mCMV2-MMP9cat
(DNA)
aagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcgagctctcgacattcgtttctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcgacggtgatggggggcaactcggcgggggagctgtgcgtcttccccttcactttcctgggtaaggagtactcgacctgtaccagcgagggccgcggagatgggcgcctctggtgcgctaccacctcgaactttgacagcgacaagaagtggggcttctgcccggaccaaggatacagtttgttcctcgtggcggcgcatgagttcggccacgcgctgggcttagatcattcctcagtgccggaggcgctcatgtaccctatgtaccgcttcactgaggggccccccttgcataaggacgacgtgaatggcatccggcacctctatggtcctcgccctgaacctgattacaaggatgacgacgataagtgataa(SEQ ID NO:780)
NFATc1启动子片段(P1)
(DNA)
aggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacagagccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggctccgaactcgccggcggagtcgccgcgccagatcccagcagcagggcgcgg(SEQ ID NO:781)
NFATc1启动子片段(P2)
(DNA)
aggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacagagccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagagg(SEQ ID NO:782)
NFATc1启动子片段(P3)
(DNA)
caggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacaggccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggctccgaactcgccggcggagtcgccgcgccagatcccagcagcagggcgcgg(SEQ ID NO:783)
pNFAT-MMP9cat-1gBLOCK序列
(DNA)
aagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctctcgacattcgtttctagagccaccatgagcctctggcagcccctggtcctggtgctcctggtgctgggctgctgctttgctttccaaacctttgagggcgacctcaagtggcaccaccacaacatcacctattggatccaaaactactcggaagacttgccgcgggcggtgattgacgacgcctttgcccgcgccttcgcactgtggagcgcggtgacgccgctcaccttcactcgcgtgtacagccgggacgcagacatcgtcatccagtttggtgtcgcggagcacggagacgggtatcccttcgacgggaaggacgggctcctggcacacgcctttcctcctggccccggcattcagggagacgcccatttcgacgatgacgagttgtggtccctgggcaagggcgtcgtggttccaactcggtttggaaacgcagatggcgcggcctgccacttccccttcatcttcgagggccgctcctactctgcctgcaccaccgacggtcgctccgacggcttgccctggtgcagtaccacggccaactacgacaccgacgaccggtttggcttctgccccagcgagagactctacacccaggacggcaatgctgatgggaaaccctgccagtttccattcatcttccaaggccaatcctactccgcctgcaccacggacggtcgctccgacggctaccgctggtgcgccaccaccgccaactacgaccgggacaagctcttcggcttctgcccgacccgagctgactcg(SEQ ID NO:784)
NFAT共有序列：
(A/T)GGAAA(A/N)(A/T/C)N(SEQ ID NO:804)
当前NFAT RE(来自System Biosciences)。所述序列来自小鼠IL2启动子
(DNA)
aagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgtt(SEQ ID NO:805)
小鼠IL2启动子(绿色突出显示的是所使用的NFAT RE，黄色突出显示的是起始密码子)
(DNA)
aactagagacatataaaataacaccaacatccttagatacaacccttcctgagaatttattggacatcatactctttttaaaaagcataataaacatcaagacacttacacaaaatatgttaaattaaatttaaaacaacaacgacaaaatagtacctcaagctcaacaagcattttaggtgtccttagcttactatttctctggctaactgtatgaagccatctatcaccctgtgtgcaattagctcattgtgtagataagaaggtaaaaccatcttgaaacaggaaaccaatatccttcctgtctaatcaacaaatctaaaagatttattcttttcatctatctcctcttgcgtttgtccaccacaacaggctgcttacaggttcaggatggttttgacaaagagaacattttcatgagttacttttgtgtctccaccccaaagaggaaaatttgtttcatacagaaggcgttcattgtatgaattaaaactgccacctaagtgtgggctaacccgaccaagagggatttcacctaaatccattcagtcagtgtatgggggtttaaagaaattccagagagtcatcagaagaggaaaaacaaaaggtaatgctttctgccacacaggtagactctttgaaaatatgtgtaatatgtaaaacatcgtgacacccccatattatttttccagcattaacagtataaattgcctcccatgctgaagagctgcctatcacccttgctaatcactcctcacagtgacctcaagtcctgcaggcatgtacagcatgcagctcgcatcctgtgtcac(SEQ ID NO:806)
NFAT RE(来自PRomega)所述序列来自人IL2启动子
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgt(SEQ ID NO:807)
来自ET-1启动子的可能的NFAT RE
(DNA)
tccagggaaaatcggagtagaacaagagggatg(SEQ ID NO:808)
来自ET-1启动子的可能的NFAT RE
(DNA)
actgttggaaaacgtaaacacgttattaaacggt(SEQ ID NO:809)
来自人CD3γ的可能的NFAT RE
(DNA)
tccttaacggaaaaacaaaa(SEQ ID NO:810)
来自人CD3γ的可能的NFAT RE
(DNA)
aaaggaaaaagtatatgttc(SEQ ID NO:811)
来自人IL3启动子的可能的NFAT RE
(DNA)
atgccatggaaagggtg(SEQ ID NO:812)
来自人GPC6的可能的NFAT RE
(DNA)
aaggggaaatgttgagtctaga(SEQ ID NO:813)
来自人生长激素释放激素的可能的NFAT RE
(DNA)
AACTTGGAAAAGCATAG(SEQ ID NO:814)
大NFATc1启动子
(DNA)
ttatgccgtctagaggagacatactttctactcaaagctacacacatagactacaacgatgggaaaagacgacacaccaacagcgacttcaggaaagctggagtggctgctaatgttagacaaaataggctttttaaaaaaggttttattaaagaggaatgtttcgtaatgataaaagcactaatctgtgagaaagatacaacaatgataaacatacgtgcagctaataagagagctccaaaatctatgaagcaaaaactcacagaatgaggggagaagcagttctacaacagagaatggggacttcgatactccactttcaataatggatacaacaaccaggcagataacaaggcaacagaaggcctgaacaacagtataaaccaattagacctaccagatatctatagctagcacactccacccaacgacagcagaatacacattcttctcaagcgcacaagtaacatcctccaggatgggccatgttctaggccatcaaacaaactcaggtggtttgaggccagaggcctctcttttaaccaccacactagggccttcggaggaggcaagcagagagttgtcaaagaggccctcaggactgggtgcagtggctcatgactgtaatcccagcactttagaaggctgaggcacaaggatcttttgagctcaggagttcaagaaatgagcacttatccactgggcgcggtggctcacgccagtaatccagcactttgggaggcttaggcgggcggatcaagaggtcagaagctcaagaccagcctgaccaacatggtgaaaccccgtctctactaaaagtacaaaaattagccgggcgtggtggcgcacacctgtaatcccagctacttgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccgggaggtggaggttgcagtgagtggagatcacaccattgcaccccagcctgggcaacagagcgagactccgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaagaaagaaaaagaaaaaaaaagtgagcatgtattttgccagagtctggagattagaattaaattagcaaaccagaattatagaaaaagctatttacttttaagtaaacagctgagatttttttttttaagtcagtgtgaatgaagctcacagccatggttggagctgagaaagaaggatttccctttagttatgcacctgtgtcagcaccttctgactttccttctaaagtctggggtgttcctgaggatccgtaagtttggggttcagggtttctacagcatgctgttacttgtgaaacatctctttaaccatgtcccagagttgcccaggagtttaagaccagcctgagcaacatagcaagacctcatctcaacaacaacaaaaattagaaataaattagccaggtgtggtgacatgtgcctgtagtcccagctactcagaaggctgaggcatgaggatcacttgggcccaggaagttggggctgcagggagccctgttcatgccgctgcactccagcctgcaagacagagcagaaaaaaagaatcaggatcctgggcagagggaggagaggggaccggggtccagcaagcacttggggattgactgaatggcgttggggagagatgactccaaagtcctggagtgggtgagaatgactgcgagtggcttttaggtggggaggttcctgcctggccactccgggaggggacgtggggctgaagggtatcaggtgccgtgctgagcagtttggccttgatcctaatgccctggacacacgtctagggtaggaaagttgactgatccattggtgatctgagtttttagacatggtggtagtccatgaggtgggtgttcatgctaagagtttagacagggaaacctatgaagcccttagcaaccctccagggaaggggcgtggttaaagagatgtttcataagtaacagcatggtatagaaactctgaaccccaaatgtatgggtcctcaggaacaccccagactttagaaggaaagtcagaaggtgctgacacgggtgtataactaaagggaaatccttctttctcagctccaaccatggctgtgaggttcattcacactgacttaaaaaaaaaaatctcagtttacttaaaagtaaatagctttttctataattctggtttgctaatttaatcctagtctccagaccctggctaaataaatgcccatttctccagatggtctcaagagtctctggacatcgtgggggcccttccctgttggttggaaggtgcctcaggaagaagggggtggattctgagttgagtcaaaacctcaaagacccctgatgggaaaagctctcaagtgaccaccgctgtgggccagaatgcaaaactgcaggaacagaacattcgcaggaacagaacacagtcgtattaagtgattttcccgagcaggaagtggcatctggcctgcggttcagtagggggaggaaagggtgggcgcacctgcccctggctggcgcacctgccaggtagccccacgcggcaccgcgtgtgccgagcgcccctgaggatggaaagccccacgcggggcaggtggcacccaccctccgaagacgggacgggatggagcgttgagcttcggggcagctccggcccggcccgcgctggagacgcccgcatctgccaggatggcgtctcatagccctggtgctcacacatgacgccaggaagccccagcaacagtgaccgcccaggctctagaaaatattggacggggtggatgaacacccaagtgcgctccaggagaagggatttggcaccccaaggggcttttaaaacggtaagcttctaggggtgtctttgcccccaataatccatagaaacaacagtcatctaaaaatagtcttgttttctgtcctaagctccttttaactttgttagtcatcaccaatcctaaaataaaacccgtgtaacgtctcccctagtagcggctataaacaaacctacgaggaggcaggaggaagaggaaaggggcgcagggcgctcggggagcagagccgggggcccgcggtggccgcagaggccgggccggggcgcagaggccgggcgagctggccgcgctctgggccgccgcctccggaactccctgcgcctggcgcgcggccaccgtggtcccggcaacggcattaaacagagggaaacagacccgggattccgtcacccgggcggggggataaggacggctttgagagcagacaggaaaagggagcttttctgcatggggtgaaaaaattatttattgaaggaggaggaggcggcagcggaggaaggggaggggcgggaggaggaggaagagccggccgcccccgccccggccccggctcctcaggagccaagggcagcctcgccaggtcggtcccgggctcgaggaccgcggctggggtcgaggggctcagtctcccacgtgaccggctgggcgcgccccgccagacccggcctcgggattccctcctcccggcgagtctccgcccgccccgtcctggaggtggggagaaggagggcggggcgggggggacggaaactctccccgccaaatcctggccccaggcctggggacactcgcggcgggaagatttggaggggaggggagggggaggggcgtgggggcgcggcctcgctggagtccccctgaccccccgacccccgcccaccggcctgggcgtcctcccgcggcccctcctcccctcccggcgcccggtgctctggggcgcgtgccacgcctggctcggcgccgtaggggcccccgcaggtagagacccctggaaatggcctcgacgccgcaggagcgaggcggccaccaccccgctaatccgggcacgtctctccaggccgaggcctgcggtggaaaagccggggttccatttgtgctgagtcggggcggccgaatggagccaggcctcgggacgcgggacggacgggctctggccgcgcaccttcgcgggctctgcagcgcccgaccgcctcccccggcagggaggaggcgcttgtggggggcacccacggggcacagtgatccctgggggtctgcggacctcctgggccccgcagcagacacgagtttagcctttgggtttagtttaaatcacataagggtgtcgtgcaatcgatttatggtttctacacaccagacactttaacctccaaccccccccatccaaagccaacaagaaaatgcggtgccgtgttggcagctgagctgcgcccgaagagacgcagggagacgtaagagaggaaagtgtgagtggccggggggcctccccccgtcagaagtcgcgcagtcgcgcccataaaacgccccctccgggcggctagggcaggtgagcgcgtccccgggcctccccacgccggcccctgccacaggccgtctaggtcgagcagatatttacagaataaaaatgacaataactcgacgtcccgggacggccacgcaatctgttagtaatttagcgggatgggaatttcctttctagggcctgccagtgaagcgcttttccaaatttccacagcgggggaagcctgcgattttacataatgacttcagcatgccgggctttctcgacacccctccccggcccccggcccccgccccccgccccttttccagcagggccgggctccctccggacacccgcgtggactcaggcgtcccgtctggcccgttcgcccccgtttcccccgccagccccagcgcccccctgcccggcccccggattccccgttcccgcccctacgcccccatcccctccccgtgcgcccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcccccctccccgtgcgccccccctccccgggcgcccccctccccgggcgccccccctccccgtgcgcccccccctccccgtgcgccccccctccccgtgcgcgccccgcctcttgcgcccctgcccccaggcgagcggctgccgcggcgcggggaggggcgggcgctcggcgactcgtccccggggccccgcgcgggcccgggcagcaggggcgtgatgtcacggcagggagggggcgcgggagccgccgggccggcggggaggcgggggaggtgttttccagctttaaaaaggcaggaggcagagcgcggccctgcgtcagagcgagactcagaggctccgaactcgccggcggagtcgccgcgccagatcccagcagcagggcgcgggcaccggggcgcgggcagggctcggagccaccgcgcaggtcctagggccgcggccgggccccgccacgcgcgcacacgcccctcgatg(SEQ ID NO:815)
NFATc3启动子序列
(DNA)
gcagccaggcagggtgggcgcgcgtagggggcggggccgggcgcgcggcagggcgcgagagcgcacccgcggcggcggtggcggcgactgtgggggggcggcggggaacattggctaagccgacagtggaggcttaggcaccggtggcgggcggctgcggttcctggtgctgctcggcgcgcggccagctttcggaacggaacgctcggcgtcgcgggccccgcccggaaagtttgccgtggagtcgcgacctcttggcccgcgcggcccggcatgaagcggcgttgaggagctgctgccgccgcttgccgctgccgccgccgccgcctgaggaggagctgcagcaccctgggccacgccg(SEQ ID NO:816)
NFATc2启动子序列1
(DNA)
cagagagaggctgcgttcagactggggcactgccatcccctccgcatcatggggtctgtggaccaaggtaactgactctcgatcccttccagccttttccgctcgctcctcccggccctttcctgctgctcccgtcccgggcagcactttcagctcccggcagaggtcggtgcgggaggcctggggaccccgctcgccctcggcgcacaggtagcggggcccgcggaggggcgcccgcgccccggccagggaagggacacttgggaaggcgactttggacaactttacgcgggggcagggaagtgtcccaggccgggattccctaggccagtctgtcgggaggattttcctctccacgggacaccgggagggattctcgctactaaccgctggctgtttaaccgtttcagcactcggcttttgacagcaa(SEQ ID NO:817)
NFATc2启动子序列2
(DNA)
catcatggggtctgtggaccaaggtaactgactctcgatcccttccagccttttccgctcgctc(SEQID NO:818)
共有NFATc1应答元件
(DNA)
cattttttccat(SEQ ID NO:819)
共有NFATc1应答元件
(DNA)
tttttcca(SEQ ID NO:820)
Foxp3增强子区内所含的NFAT应答元件
(DNA)
acttgaaaatgagataaatgttcacctatgttggcttctagtctcttttatggcttcattttttccatttactatagaggttaagagtgtgggtactggagccagactgtctgggacaa(SEQ ID NO:821)
N+20
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQID NO:822)
N+20/C-27
SNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTE(SEQ ID NO:823)
N+9/C-9
VQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVP(SEQ ID NO:824)
C-10
GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDV(SEQ ID NO:825)NME7-AB
(DNA)atggaaaaaacgctggccctgattaaaccggatgcaatctccaaagctggcgaaattatcgaaattatcaacaaagcgggtttcaccatcacgaaactgaaaatgatgatgctgagccgtaaagaagccctggattttcatgtcgaccaccagtctcgcccgtttttcaatgaactgattcaattcatcaccacgggtccgattatcgcaatggaaattctgcgtgatgacgctatctgcgaatggaaacgcctgctgggcccggcaaactcaggtgttgcgcgtaccgatgccagtgaatccattcgcgctctgtttggcaccgatggtatccgtaatgcagcacatggtccggactcattcgcatcggcagctcgtgaaatggaactgtttttcccgagctctggcggttgcggtccggcaaacaccgccaaatttaccaattgtacgtgctgtattgtcaaaccgcacgcagtgtcagaaggcctgctgggtaaaattctgatggcaatccgtgatgctggctttgaaatctcggccatgcagatgttcaacatggaccgcgttaacgtcgaagaattctacgaagtttacaaaggcgtggttaccgaatatcacgatatggttacggaaatgtactccggtccgtgcgtcgcgatggaaattcagcaaaacaatgccaccaaaacgtttcgtgaattctgtggtccggcagatccggaaatcgcacgtcatctgcgtccgggtaccctgcgcgcaatttttggtaaaacgaaaatccagaacgctgtgcactgtaccgatctgccggaagacggtctgctggaagttcaatactttttcaaaattctggataatctcgagcaccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO:826)
NME7AB
(氨基酸)
MEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNLEHHHHHH(SEQ ID NO:827)人NME7 x1
(DNA)
atgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataatctcgagcaccaccaccaccaccactga(SEQ ID NO:828)
(氨基酸)
MMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDNLEHHHHHH*(SEQ ID NO:829)小鼠抗体17H6重链：DNA序列
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATTACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAAGAAAGGCACTTGAGTGGTTGGGTTTTATTAGAAACAAAGCTAATGGTTACACAGCAGAGTACAGTGCGTCTGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATGTTTCCCAAAACCTCCTCTATCTTCAAATGAACATCCTGAGAGCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAAAGATTACTACGGTAGTAACCCTGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:830)
小鼠抗体17H6重链：氨基酸序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMSWVRQPPRKALEWLGFIRNKANGYTAEYSASVKGRFTISRDVSQNLLYLQMNILRAEDSATYYCAKDYYGSNPAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:831)
小鼠17H6重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACT(SEQ ID NO:832)
(氨基酸)
EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFT(SEQ ID NO:833)
小鼠17H6重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
GATTACTACATGAGC(SEQ ID NO:834)
(氨基酸)
DYYMS(SEQ ID NO:835)
小鼠17H6重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACT(SEQ ID NO:836)
(氨基酸)
WVRQPPRKALEWLG(SEQ ID NO:837)
小鼠17H6重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
TTTATTAGAAACAAAGCTAATGGTTACACAGCAGAGTACAGTGCGTCTGTGAAGGGT(SEQ ID NO:838)
(氨基酸)
FIRNKANGYTAEYSASVKG(SEQ ID NO:839)
小鼠17H6重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
CGGTTCACCATCTCCAGAGATGTTTCCCAAAACCTCCTCTATCTTCAAATGAACATCCTGAGAGCTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAAA(SEQ ID NO:840)
(氨基酸)
RFTISRDVSQNLLYLQMNILRAEDSATYYCAK(SEQ ID NO:841)
小鼠17H6重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
GATTACTACGGTAGTAACCCTGCCTGGTTTGCTTAC(SEQ ID NO:842)
(氨基酸)
DYYGSNPAWFAY(SEQ ID NO:1)
小鼠17H6重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:843)(氨基酸)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1)
小鼠抗体17H6轻链：DNA序列
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGCCTGTGAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAACAGTGATATTTTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAGTGGAAACACCTTTTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCTGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGATAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTTTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:844)
小鼠抗体17H6轻链：氨基酸序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLPVRLLVLMFWIPASNSDILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSSGNTFLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGIDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:845)
小鼠17H6轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATATTTTGATGACCCAGACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:846)
(氨基酸)
DILMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:847)
小鼠17H6轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAGTGGAAACACCTTTTTAGAA(SEQ ID NO:848)
(氨基酸)
RSSQSIVHSSGNTFLE(SEQ ID NO:849)
小鼠17H6轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTACCTGCAGAAACCTGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTAC(SEQ ID NO:850)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:851)
小鼠17H6轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT(SEQ ID NO:852)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:853)
小鼠17H6轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGATAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGC(SEQ ID NO:854)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGIDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:855)
小鼠17H6轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TTTCAAGGTTCACATGTTCCTTTCACG(SEQ ID NO:856)
(氨基酸)
FQGSHVPFT(SEQ ID NO:857)
小鼠17H6轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:858)
(氨基酸)
FGSGTKLEIK(SEQ ID NO:859)
小鼠抗体39H5重链：DNA序列
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGTTGGTGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAGACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTTTGTGTTAGAGGTATCCACGGCTACGTGGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:860)
小鼠抗体39H5重链：氨基酸序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MAWVWTLLFLMAAAQSAQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYVGDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRGIHGYVDYWGQGTTLTVSS(SEQ IDNO:861)
小鼠抗体39H5重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACA(SEQ ID NO:862)
(氨基酸)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT(SEQ ID NO:863)
小鼠抗体39H5重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AACTATGGAATGAAC(SEQ ID NO:864)
(氨基酸)
NYGMN(SEQ ID NO:865)
小鼠抗体39H5重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGC(SEQ ID NO:866)
(氨基酸)
WVKQAPGKGLKWMG(SEQ ID NO:867)
小鼠抗体39H5重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
TGGATAAACACCTACACTGGAGAGCCAACATATGTTGGTGACTTCAAGGGA(SEQ ID NO:868)
(氨基酸)
WINTYTGEPTYVGDFKG(SEQ ID NO:869)
小鼠抗体39H5重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
CGGTTTGCCTTCTCTTTGGAGACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTTTGTGTTAGA(SEQ ID NO:870)
(氨基酸)
RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVR(SEQ ID NO:871)
小鼠抗体39H5重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
GGTATCCACGGCTACGTGGACTAC(SEQ ID NO:872)
(氨基酸)
GIHGYVDY(SEQ ID NO:873)
小鼠抗体39H5重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:874)
(氨基酸)
WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:875)
小鼠抗体39H5轻链：DNA序列
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGAAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:876)
小鼠抗体39H5轻链：氨基酸序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHRNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHLPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:877)
小鼠抗体39H5轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:878)
(氨基酸)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:879)
小鼠抗体39H5轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGAAATGGAAACACCTATTTAGAA(SEQ ID NO:880)
(氨基酸)
RSSQSIVHRNGNTYLE(SEQ ID NO:881)
小鼠抗体39H5轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTAC(SEQ ID NO:882)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:883)
小鼠抗体39H5轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT(SEQ ID NO:884)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:885)
小鼠抗体39H5轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGC(SEQ ID NO:886)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:887)
小鼠抗体39H5轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TTTCAAGGTTCACATCTTCCGTGGACG(SEQ ID NO:888)
(氨基酸)
FQGSHLPWT(SEQ ID NO:889)
小鼠抗体39H5轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:890)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:891)
抗体3C5重链：DNA序列
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTGTTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTGCCCAAGCACAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACAAACTATGGAATGAACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACCTACACTGGAAAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAGACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGAGGGGGACTAGATGGTTACTACGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:892)
抗体3C5重链：氨基酸序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MAWVWTLLFLMAAAQSAQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGKPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARGGLDGYYGYWGQGTTLTVSS(SEQ IDNO:893)
小鼠抗体3C5重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGGTATACCTTCACA(SEQ ID NO:894)
(氨基酸)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFT(SEQ ID NO:895)
小鼠抗体3C5重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AACTATGGAATGAAC(SEQ ID NO:896)
(氨基酸)
NYGMN(SEQ ID NO:897)
小鼠抗体3C5重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGC(SEQ ID NO:898)
(氨基酸)
WVKQAPGKGLKWMG(SEQ ID NO:899)
小鼠抗体3C5重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
TGGATAAACACCTACACTGGAAAGCCAACATATGCTGATGACTTCAAGGGA(SEQ ID NO:900)
(氨基酸)
WINTYTGKPTYADDFKG(SEQ ID NO:901)
小鼠抗体3C5重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
CGGTTTGCCTTCTCTTTGGAGACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCAAGA(SEQ ID NO:902)
(氨基酸)
RFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCAR(SEQ ID NO:903)
小鼠抗体3C5重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
GGGGGACTAGATGGTTACTACGGCTAC(SEQ ID NO:904)
(氨基酸)
GGLDGYYGY(SEQ ID NO:905)
小鼠抗体3C5重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:906)
(氨基酸)
WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:907)
抗体3C5轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGCTAGTGCTCTCGATTCAGGAAACCAACGGTGATGTTGTGATGGCTCAGACCCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAATCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTAAAGGAAAGACATATTTGAATTGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGAATCTGGAGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATTTGGGAGTTTATTACTGCTTGCAAACTACACATTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:908)
抗体3C5轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MSPAQFLFLLVLSIQETNGDVVMAQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLHSKGKTYLNWLLQRPGQSPKLLIYLVSKLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCLQTTHFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:909)
小鼠抗体3C5轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTGTGATGGCTCAGACCCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:910)
(氨基酸)
DVVMAQTPLTLSVTIGQPASISC(SEQ ID NO:911)
小鼠抗体39H5轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AAATCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTAAAGGAAAGACATATTTGAAT(SEQ ID NO:912)
(氨基酸)
KSSQSLLHSKGKTYLN(SEQ ID NO:913)
小鼠抗体3C5轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTTATTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTAATCTAT(SEQ ID NO:914)
(氨基酸)
WLLQRPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:915)
小鼠抗体3C5轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
CTGGTGTCTAAACTGGAATCT(SEQ ID NO:916)
(氨基酸)
LVSKLES(SEQ ID NO:917)
小鼠抗体3C5轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGAGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAAGATTTGGGAGTTTATTACTGC(SEQ ID NO:918)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:919)
小鼠抗体3C5轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TTGCAAACTACACATTTTCCGTGGACG(SEQ ID NO:920)
(氨基酸)
LQTTHFPWT(SEQ ID NO:921)
小鼠抗体3C5轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:922)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:923)
小鼠抗体8A9重链：DNA序列(420bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATTTTCCTTGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAGGTGGAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACTGATCACTACATGAGCTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGAAAGGCACTTGAGTGGTTGGGATTTATTAGAAACAAAGCTAATGGTTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGTCGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAAAACCCTGAGAACTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAGACCTTCTGACTGGGACTCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:924)
小鼠抗体8A9重链：氨基酸序列(140aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLWLNWIFLVTLLNGIQCEVELVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDHYMSWVRQPPGKALEWLGFIRNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSQSILYLQMKTLRTEDSATYYCARPSDWDSWFAYWGQGTLVTVSA(SEQID NO:925)
小鼠抗体8A9重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GAGGTGGAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGTTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCACT(SEQ ID NO:926)
(氨基酸)
EVELVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFT(SEQ ID NO:927)
小鼠抗体8A9重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
GATCACTACATGAGC(SEQ ID NO:928)
(氨基酸)
DHYMS(SEQ ID NO:929)
小鼠抗体8A9重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTCCGCCAGCCTCCAGGAAAGGCACTTGAGTGGTTGGGA(SEQ ID NO:930)
(氨基酸)
WVRQPPGKALEWLG(SEQ ID NO:931)
小鼠抗体8A9重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
TTTATTAGAAACAAAGCTAATGGTTACACAACAGAGTACAGTGCATCTGTGAAGGGT(SEQ ID NO:932)
(氨基酸)
FIRNKANGYTTEYSASVKG(SEQ ID NO:933)
小鼠抗体8A9重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
CGGTTCACCATCTCCAGAGATAATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAAAACCCTGAGAACTGAGGACAGTGCCACTTATTACTGTGCAAGA(SEQ ID NO:934)
(氨基酸)
RFTISRDNSQSILYLQMKTLRTEDSATYYCAR(SEQ ID NO:935)
小鼠抗体8A9重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
CCTTCTGACTGGGACTCCTGGTTTGCTTAC(SEQ ID NO:936)
(氨基酸)
PSDWDSWFAY(SEQ ID NO:937)
小鼠抗体8A9重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:938)
(氨基酸)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:939)
小鼠抗体8A9轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGTGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGCAACACCTATTTAGATTGGTACTTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAGAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGACTTTATTACTGTTTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGGCGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:940)
小鼠抗体8A9轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLDWYLQKPGQSPKLLIYRVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYYCFQGSHVPWAFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:941)
小鼠抗体8A9轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGTGATCAAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:942)
(氨基酸)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:943)
小鼠抗体8A9轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGCAACACCTATTTAGAT(SEQ ID NO:944)
(氨基酸)
RSSQSIVHSNGNTYLD(SEQ ID NO:945)
小鼠抗体8A9轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTACTTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTAC(SEQ ID NO:946)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:947)
小鼠抗体8A9轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AGAGTTTCCAACCGATTTTCT(SEQ ID NO:948)
(氨基酸)
RVSNRFS(SEQ ID NO:949)
小鼠抗体8A9轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGACTTTATTACTGT(SEQ ID NO:950)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGLYYC(SEQ ID NO:951)
小鼠抗体8A9轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TTTCAAGGTTCACATGTTCCGTGGGCG(SEQ ID NO:952)
(氨基酸)
FQGSHVPWA(SEQ ID NO:953)
小鼠抗体8A9轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:954)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:955)
小鼠抗体18G12重链：DNA序列(399bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTCGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCGGCTACTTTTTGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGGGGGATTAATCCTGACAATGGTGGTATTGACTTCAATGAGAAGTTCAGGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACATTACTAATAGGGAACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:956)
小鼠抗体18G12重链：氨基酸序列(133aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MGWSYIILFLVATATGVHSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTGYFLYWVKQRPGQGLEWIGGINPDNGGIDFNEKFRNKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTLLIGNYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:957)
小鼠抗体18G12重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
CAGGTCCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACC(SEQ ID NO:958)
(氨基酸)
QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT(SEQ ID NO:959)
小鼠抗体18G12重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
GGCTACTTTTTGTAC(SEQ ID NO:960)
(氨基酸)
GYFLY(SEQ ID NO:961)
小鼠抗体18G12重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGG(SEQ ID NO:962)
(氨基酸)
WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID NO:963)
小鼠抗体18G12重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
GGGATTAATCCTGACAATGGTGGTATTGACTTCAATGAGAAGTTCAGGAAC(SEQ ID NO:964)
(氨基酸)
GINPDNGGIDFNEKFRN(SEQ ID NO:965)
小鼠抗体18G12重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
AAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACATTA(SEQ ID NO:966)
(氨基酸)
KATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTL(SEQ ID NO:967)
小鼠抗体18G12重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
CTAATAGGGAACTAT(SEQ ID NO:968)
(氨基酸)
LIGNY(SEQ ID NO:969)
小鼠抗体18G12重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:970)
(氨基酸)
WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:971)
小鼠抗体18G12轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAATGGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTAACCATTGGACAGCCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTGATGGAAAGACATATTTGATTTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTTTGCTGTCAAGGTACACATTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCATGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:972)
小鼠抗体18G12轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLIWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCCQGTHFPWTFGGGTMLEIK(SEQ ID NO:973)
小鼠抗体18G12轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTAACCATTGGACAGCCAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:974)
(氨基酸)
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC(SEQ ID NO:975)
小鼠抗体18G12轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AAGTCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTGATGGAAAGACATATTTGATT(SEQ ID NO:976)
(氨基酸)
KSSQSLLHSDGKTYLI(SEQ ID NO:977)
小鼠抗体18G12轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTAT(SEQ ID NO:978)
(氨基酸)
WLLQRPGQSPKRLIY(SEQ ID NO:979)
小鼠抗体18G12轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
CTGGTGTCTAAACTGGACTCT(SEQ ID NO:980)
(氨基酸)
LVSKLDS(SEQ ID NO:981)
小鼠抗体18G12轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTTTGC(SEQ ID NO:982)
(氨基酸)
GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:983)
小鼠抗体18G12轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TGTCAAGGTACACATTTTCCGTGGACG(SEQ ID NO:984)
(氨基酸)
CQGTHFPWT(SEQ ID NO:985)
小鼠抗体18G12轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCATGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:986)
(氨基酸)
FGGGTMLEIK(SEQ ID NO:987)
小鼠抗体20A10重链：DNA序列(417bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAACTTCGGGTTCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTGGTCGTGCTGGTTCCACCTACTATTCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCCGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCTAGAGGCCCGATCTACAATGATTACGACGAGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:988)
小鼠抗体20A10重链：氨基酸序列(139aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MNFGFSLIFLVLVLKGVQCEVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWIRQTPEKRLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSA(SEQID NO:989)
小鼠抗体20A10重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGT(SEQ ID NO:990)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:991)
小鼠抗体20A10重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
ACCTATGCCATGTCT(SEQ ID NO:992)
(氨基酸)
TYAMS(SEQ ID NO:993)
小鼠抗体20A10重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGATTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCA(SEQ ID NO:994)
(氨基酸)
WIRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:995)
小鼠抗体20A10重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
TCCATTGGTCGTGCTGGTTCCACCTACTATTCAGACAGTGTGAAGGGC(SEQ ID NO:996)
(氨基酸)
SIGRAGSTYYSDSVKG(SEQ ID NO:997)
小鼠抗体20A10重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
CGATTCACCATCTCCAGAGATAATGTCCGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCTAGA(SEQ ID NO:998)
(氨基酸)
RFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAR(SEQ ID NO:999)
小鼠抗体20A10重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
GGCCCGATCTACAATGATTACGACGAGTTTGCTTAC(SEQ ID NO:1000)
(氨基酸)
GPIYNDYDEFAY(SEQ ID NO:1001)
小鼠抗体20A10重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1002)
(氨基酸)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1003)
小鼠抗体20A10轻链：DNA序列(396bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGAATCACAGACTCAGGTCTTCCTCTCCCTGCTGCTCTGGGTATCTGGTACCTGTGGGAACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGTAAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGTCATCAATACCTCTCCTCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:1004)
小鼠抗体20A10轻链：氨基酸序列(132aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MESQTQVFLSLLLWVSGTCGNIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1005)
小鼠抗体20A10轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
AACATTATGATGACACAGTCGCCATCATCTCTGGCTGTGTCTGCAGGAGAAAAGGTCACTATGAGCTGT(SEQ ID NO:1006)
(氨基酸)
NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSC(SEQ ID NO:1007)
小鼠抗体20A10轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AAGTCCAGTCAAAGTGTTTTATACAGTTCAAATCAGAAGAACTATTTGGCC(SEQ ID NO:1008)
(氨基酸)
KSSQSVLYSSNQKNYLA(SEQ ID NO:1009)
小鼠抗体20A10轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTAC(SEQ ID NO:1010)
(氨基酸)
WYQQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:1011)
小鼠抗体20A10轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
TGGGCATCCACTAGGGAATCT(SEQ ID NO:1012)
(氨基酸)
WASTRES(SEQ ID NO:1013)
小鼠抗体20A10轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGTGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTT
TACTCTTACCATCAGCAGTGTACAAGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT(SEQ ID NO:1014)
(氨基酸)
GVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC(SEQ ID NO:1015)
小鼠抗体20A10轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
CATCAATACCTCTCCTCGCTCACG(SEQ ID NO:1016)
(氨基酸)
HQYLSSLT(SEQ ID NO:1017)
小鼠抗体20A10轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:1018)
(氨基酸)
FGAGTKLELK(SEQ ID NO:1019)
小鼠抗体25E6重链：DNA序列(414bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAACTTCGGGCTCAGCTTGATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGTTTCACTTTCAGTAGTTATGGAATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTAATGGTGGTAGACACACCTTCTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTTGAGGACACAGCCATGTATTTATGTGTAAGACAGACTGGGACGGAGGGCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1020)
小鼠抗体25E6重链：氨基酸序列(138aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MNFGLSLIFLALILKGVQCEVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVRQTPDKRLEWVATISNGGRHTFYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYLCVRQTGTEGWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ IDNO:1021)
小鼠抗体25E6重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGTTTCACTTTCAGT(SEQ ID NO:1022)
(氨基酸)
EVQLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:1023)
小鼠抗体25E6重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGTTATGGAATGTCT(SEQ ID NO:1024)
(氨基酸)
SYGMS(SEQ ID NO:1025)
小鼠抗体25E6重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCA(SEQ ID NO:1026)
(氨基酸)
WVRQTPDKRLEWVA(SEQ ID NO:1027)
小鼠抗体25E6重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
ACCATTAGTAATGGTGGTAGACACACCTTCTATCCAGACAGTGTGAAGGGG(SEQ ID NO:1028)
(氨基酸)
TISNGGRHTFYPDSVKG(SEQ ID NO:1029)
小鼠抗体25E6重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
CGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTATCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTTATGTGTAAGA(SEQ ID NO:1030)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYLCVR(SEQ ID NO:1031)
小鼠抗体25E6重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
CAGACTGGGACGGAGGGCTGGTTTGCTTAC(SEQ ID NO:1032)
(氨基酸)
QTGTEGWFAY(SEQ ID NO:1033)
小鼠抗体25E6重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1034)
(氨基酸)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1035)
小鼠抗体25E6轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCTCAGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1036)
小鼠抗体25E6轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPQTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1037)
小鼠抗体25E6轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:1038)
(氨基酸)
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC(SEQ ID NO:1039)
小鼠抗体25E6轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAAT(SEQ ID NO:1040)
(氨基酸)
KSSQSLLDSDGKTYLN(SEQ ID NO:1041)
小鼠抗体25E6轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTAT(SEQ ID NO:1042)
(氨基酸)
WLLQRPGQSPKRLIY(SEQ ID NO:1043)
小鼠抗体25E6轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
CTGGTGTCTAAACTGGACTCT(SEQ ID NO:1044)
(氨基酸)
LVSKLDS(SEQ ID NO:1045)
小鼠抗体25E6轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGC(SEQ ID NO:1046)
(氨基酸)
GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:1047)
小鼠抗体25E6轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TGGCAAGGTACACATTTTCCTCAGACG(SEQ ID NO:1048)
(氨基酸)
WQGTHFPQT(SEQ ID NO:1049)
小鼠抗体25E6轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1050)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1051)
小鼠抗体28F9重链：DNA序列(399bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGGATGGAGCTATATCATCCTCTTTTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGCAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCGGCTACTTTTTGTACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGGGGAATTCATCCTAGCAATGGTGATACTGACTTCAATGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACACTGACTGTAGACATATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACATTACTAATAGGGGTCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1052)
小鼠抗体28F9重链：氨基酸序列(133aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MGWSYIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVQPGASVKLSCKASGYTFTGYFLYWVKQRPGHGLEWIGGIHPSNGDTDFNEKFKNKATLTVDISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTLLIGVYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1053)
小鼠抗体28F9重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGGCTGAACTGGTGCAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACC(SEQ ID NO:1054)
(氨基酸)
QVQLQQPGAELVQPGASVKLSCKASGYTFT(SEQ ID NO:1055)
小鼠抗体28F9重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
GGCTACTTTTTGTAC(SEQ ID NO:1056)
(氨基酸)
GYFLY(SEQ ID NO:1057)
小鼠抗体28F9重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACATGGCCTTGAGTGGATTGGG(SEQ ID NO:1058)
(氨基酸)
WVKQRPGHGLEWIG(SEQ ID NO:1059)
小鼠抗体28F9重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
GGAATTCATCCTAGCAATGGTGATACTGACTTCAATGAGAAGTTCAAGAAC(SEQ ID NO:1060)
(氨基酸)
GIHPSNGDTDFNEKFKN(SEQ ID NO:1061)
小鼠抗体28F9重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
AAGGCCACACTGACTGTAGACATATCCTCCAGCACTGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTACATTA(SEQ ID NO:1062)
(氨基酸)
KATLTVDISSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTL(SEQ ID NO:1063)
小鼠抗体28F9重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
CTAATAGGGGTCTAC(SEQ ID NO:1064)
(氨基酸)
LIGVY(SEQ ID NO:1065)
小鼠抗体28F9重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1066)
(氨基酸)
WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1067)
小鼠抗体28F9轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTTTCTGTTAGTGCTCTGGATTCGGGAAACCAACGGTGATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTGATGGAAAGACATATTTGATTTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACCGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTTTGCTGTCAAGGTACACATTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCATGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1068)
小鼠抗体28F9轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MSPAQFLFLLVLWIRETNGDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLHSDGKTYLIWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCCQGTHFPWTFGGGTMLEIK(SEQ ID NO:1069)
小鼠抗体28F9轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:1070)
(氨基酸)
DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISC(SEQ ID NO:1071)
小鼠抗体28F9轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AAGTCAAGTCAGAGCCTCTTACATAGTGATGGAAAGACATATTTGATT(SEQ ID NO:1072)
(氨基酸)
KSSQSLLHSDGKTYLI(SEQ ID NO:1073)
小鼠抗体28F9轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTAT(SEQ ID NO:1074)
(氨基酸)
WLLQRPGQSPKRLIY(SEQ ID NO:1075)
小鼠抗体28F9轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
CTGGTGTCTAAACTGGACTCT(SEQ ID NO:1076)
(氨基酸)
LVSKLDS(SEQ ID NO:1077)
小鼠抗体28F9轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGAGTCCCTGACAGGTTCACCGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTTTTGC(SEQ ID NO:1078)
(氨基酸)
GVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:1079)
小鼠抗体28F9轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TGTCAAGGTACACATTTTCCGTGGACG(SEQ ID NO:1080)
(氨基酸)
CQGTHFPWT(SEQ ID NO:1081)
小鼠抗体28F9轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCATGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1082)
(氨基酸)
FGGGTMLEIK(SEQ ID NO:1083)
小鼠抗体18B4重链：DNA序列(411bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAAGTGAAACTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGATCCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAATGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGAAGCACAGCTAATATTCATACAACATACTATGCTGAGTCTGTCCAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTGAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTATTGTACCCCATTACTCTACGGATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1084)
小鼠抗体18B4重链：氨基酸序列(137aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MYLGLNYVFIVFLLNGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFNDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSTANIHTTYYAESVQGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTPLLYGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ IDNO:1085)
小鼠抗体18B4重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GAAGTGAAACTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGATCCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAAT(SEQ ID NO:1086)
(氨基酸)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFN(SEQ ID NO:1087)
小鼠抗体18B4重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
GACGCCTGGATGGAC(SEQ ID NO:1088)
(氨基酸)
DAWMD(SEQ ID NO:1089)
小鼠抗体18B4重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCT(SEQ ID NO:1090)
(氨基酸)
WVRQSPEKGLEWVA(SEQ ID NO:1091)
小鼠抗体18B4重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
GAAATTAGAAGCACAGCTAATATTCATACAACATACTATGCTGAGTCTGTCCAAGGG(SEQ ID NO:1092)
(氨基酸)
EIRSTANIHTTYYAESVQG(SEQ ID NO:1093)
小鼠抗体18B4重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
AGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTGAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTATTGTACCCCA(SEQ ID NO:1094)
(氨基酸)
RFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTP(SEQ ID NO:1095)
小鼠抗体18B4重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TTACTCTACGGATTTGCTTAC(SEQ ID NO:1096)
(氨基酸)
LLYGFAY(SEQ ID NO:1097)
小鼠抗体18B4重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1098)
(氨基酸)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1099)
小鼠抗体18B4轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGAACTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGCACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCTACAAAGTTTCCAGCCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAATACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:1100)
小鼠抗体18B4轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRTSQSLVHSNGNTYLHWHLQKPGQSPKVLIYKVSSRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQNTHVPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1101)
小鼠抗体18B4轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTGTGATGACCCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:1102)
(氨基酸)
DVVMTQSPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:1103)
小鼠抗体18B4轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGAACTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACAT(SEQ ID NO:1104)
(氨基酸)
RTSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO:1105)
小鼠抗体18B4轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGCACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGGTCCTGATCTAC(SEQ ID NO:1106)
(氨基酸)
WHLQKPGQSPKVLIY(SEQ ID NO:1107)
小鼠抗体18B4轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AAAGTTTCCAGCCGATTTTCT(SEQ ID NO:1108)
(氨基酸)
KVSSRFS(SEQ ID NO:1109)
小鼠抗体18B4轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCGGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGC(SEQ ID NO:1110)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:1111)
小鼠抗体18B4轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TCTCAAAATACACATGTTCCGTACACG(SEQ ID NO:1112)
(氨基酸)
SQNTHVPYT(SEQ ID NO:1113)
小鼠抗体18B4轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:1114)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1115)
小鼠抗体IE4重链：DNA序列(408bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGAATGGCCTTGTATCTTTCTCTTCCTCCTGTCAGTAACTGAAGGTGTCCACTCCCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGTAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGTACCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATAGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGTAAAGCCACACTGACTGCAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTTTTTCTGTGCAAGAGGTAACCACGCCTCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1116)
小鼠抗体IE4重链：氨基酸序列(136aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MEWPCIFLFLLSVTEGVHSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSTYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDSDTNYNGKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVFFCARGNHASMDYWGQGTSVTVSS(SEQ IDNO:1117)
小鼠抗体IE4重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGTCCTCAGTGAAGATTTCCTGTAAGGCTTCTGGCTATGCATTCAGT(SEQ ID NO:1118)
(氨基酸)
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFS(SEQ ID NO:1119)
小鼠抗体IE4重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
ACCTACTGGATGAAC(SEQ ID NO:1200)
(氨基酸)
TYWMN(SEQ ID NO:1201)
小鼠抗体IE4重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAGGGTCTTGAGTGGATTGGA(SEQ ID NO:1202)
(氨基酸)
WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID NO:1203)
小鼠抗体IE4重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
CAGATTTATCCTGGAGATAGTGATACTAACTACAATGGAAAGTTCAAGGGT(SEQ ID NO:1204)
(氨基酸)
QIYPGDSDTNYNGKFKG(SEQ ID NO:1205)
小鼠抗体IE4重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
AAAGCCACACTGACTGCAGACAAGTCCTCCAACACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTAACATCTGAGGACTCTGCGGTCTTTTTCTGTGCAAGA(SEQ ID NO:1206)
(氨基酸)
KATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVFFCAR(SEQ ID NO:1207)
小鼠抗体IE4重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
GGTAACCACGCCTCTATGGACTAC(SEQ ID NO:1208)
(氨基酸)
GNHASMDY(SEQ ID NO:1209)
小鼠抗体IE4重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1210)
(氨基酸)
WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1211)
小鼠抗体IE4轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAAAACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1212)
小鼠抗体IE4轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQKTHVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1213)
小鼠抗体IE4轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:1214)
(氨基酸)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:1215)
小鼠抗体IE4轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACAT(SEQ ID NO:1216)
(氨基酸)
RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO:1217)
小鼠抗体IE4轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTAC(SEQ ID NO:1218)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:1219)
小鼠抗体IE4轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT(SEQ ID NO:1220)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:1221)
小鼠抗体IE4轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGC(SEQ ID NO:1222)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:1223)
小鼠抗体IE4轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TCTCAAAAAACACATGTTCCGTGGACG(SEQ ID NO:1224)
(氨基酸)
SQKTHVPWT(SEQ ID NO:1225)
小鼠抗体IE4轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1226)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1227)
小鼠抗体29H1重链：DNA序列(411bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGTACTTGGGACTGAACTATGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAATGGTGTCCAGAGTGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGTGACGCCTGGATGGACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAATGGGTTGCTGAAATTAGAAGCAAAGCTACTAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCCCCCTACTTTACGGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1228)
小鼠抗体29H1重链：氨基酸序列(137aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MYLGLNYVFIVFLLNGVQSEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKATNHATYYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTPLLYGFAYWGQGTLVTVSA(SEQ IDNO:1229)
小鼠抗体29H1重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTACAACCTGGAGGATCCATGAAACTCTCTTGTGCTGCCTCTGGATTCACTTTTAGT(SEQ ID NO:1230)
(氨基酸)
EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:1231)
小鼠抗体29H1重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
GACGCCTGGATGGAC(SEQ ID NO:1232)
(氨基酸)
DAWMD(SEQ ID NO:1233)
小鼠抗体29H1重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAATGGGTTGCT(SEQ ID NO:1234)
(氨基酸)
WVRQSPEKGLEWVA(SEQ ID NO:1235)
小鼠抗体29H1重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
GAAATTAGAAGCAAAGCTACTAATCATGCAACATACTATGCTGAGTCTGTGAAAGGG(SEQ ID NO:1236)
(氨基酸)
EIRSKATNHATYYAESVKG(SEQ ID NO:1237)
小鼠抗体29H1重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
AGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAGCTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCCCC(SEQ ID NO:1238)
(氨基酸)
RFTISRDDSKSSVYLQMNSLRAEDTGIYYCTP(SEQ ID NO:1239)
小鼠抗体29H1重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
CTACTTTACGGGTTTGCTTAC(SEQ ID NO:1240)
(氨基酸)
LLYGFAY(SEQ ID NO:1241)
小鼠抗体29H1重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1242)
(氨基酸)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1243)
小鼠抗体29H1轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTGGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGACACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAAGGGCAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAACTACACATGTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1244)
小鼠抗体29H1轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSGQSLVHSNGHTYLHWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSRADFTLKISRVEAEDLGVYFCSQTTHVPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1245)
小鼠抗体29H1轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:1246)
(氨基酸)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:1247)
小鼠抗体29H1轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGATCTGGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGACACACCTATTTACAT(SEQ ID NO:1248)
(氨基酸)
RSGQSLVHSNGHTYLH(SEQ ID NO:1249)
小鼠抗体29H1轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTAC(SEQ ID NO:1250)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPRLLIY(SEQ ID NO:1251)
小鼠抗体29H1轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT(SEQ ID NO:1252)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:1253)
小鼠抗体29H1轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAAGGGCAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGC(SEQ ID NO:1254)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSRADFTLKISRVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:1255)
小鼠抗体29H1轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TCTCAAACTACACATGTTCCGTGGACG(SEQ ID NO:1256)
(氨基酸)
SQTTHVPWT(SEQ ID NO:1257)
小鼠抗体29H1轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1258)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1259)
小鼠抗体31A1重链：DNA序列(399bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGGAAAGGCACTGGATCTTTCTCTTCCTGTTTTCAGTAACTGCAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAGCTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGAGCCTACATTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1260)
小鼠抗体31A1重链：氨基酸序列(133aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MERHWIFLFLFSVTAGVHSQVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTEYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARAYIDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1261)
小鼠抗体31A1重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
CAGGTCCAGCTTCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACT(SEQ ID NO:1262)
(氨基酸)
QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFT(SEQ ID NO:1263)
小鼠抗体31A1重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGCTACTGGATGCAC(SEQ ID NO:1264)
(氨基酸)
SYWMH(SEQ ID NO:1265)
小鼠抗体31A1重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGA(SEQ ID NO:1266)
(氨基酸)
WVKQRPGQGLEWIG(SEQ ID NO:1267)
小鼠抗体31A1重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
TACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGAC(SEQ ID NO:1268)
(氨基酸)
YINPSTGYTEYNQKFKD(SEQ ID NO:1269)
小鼠抗体31A1重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
AAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGA(SEQ ID NO:1270)
(氨基酸)
KATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR(SEQ ID NO:1271)
小鼠抗体31A1重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
GCCTACATTGACTAC(SEQ ID NO:1272)
(氨基酸)
AYIDY(SEQ ID NO:1273)
小鼠抗体31A1重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1274)
(氨基酸)
WGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:1275)
小鼠抗体31A1轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCTTCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGTTTCACATTTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1276)
小鼠抗体31A1轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASFSCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQVSHFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1277)
小鼠抗体31A1轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTTTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCTTCTCTTGC(SEQ ID NO:1278)
(氨基酸)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASFSC(SEQ ID NO:1279)
小鼠抗体31A1轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAGAAATGGAAACACCTATTTAGAA(SEQ ID NO:1280)
(氨基酸)
RSSQSIVHRNGNTYLE(SEQ ID NO:1281)
小鼠抗体31A1轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTAC(SEQ ID NO:1282)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:1283)
小鼠抗体31A1轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT(SEQ ID NO:1284)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:1285)
小鼠抗体31A1轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAACAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGC(SEQ ID NO:1286)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:1287)
小鼠抗体31A1轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TTTCAAGTTTCACATTTTCCGTGGACG(SEQ ID NO:1288)
(氨基酸)
FQVSHFPWT(SEQ ID NO:1289)
小鼠抗体31A1轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1290)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1291)
小鼠抗体32C1重链：DNA序列(411bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGTACTTGGGACTGAACTGTGTATTCATAGTTTTTCTCTTAAAAGGTGTCCAGAGTGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAATCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAATTACTGGATGAACTGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCTGAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAATACATTATGCGGAGTCTGTGAAGGGGAGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGGGTCCCGGGACTGGATGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1292)
小鼠抗体32C1重链：氨基酸序列(137aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MYLGLNCVFIVFLLKGVQSEVKLEESGGGLVQSGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYAIHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRVPGLDAYWGQGTLVTVSA(SEQ IDNO:1293)
小鼠抗体32C1重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTGCAATCTGGAGGATCCATGAAACTCTCCTGTGTTGCCTCTGGATTCACTTTCAGT(SEQ ID NO:1294)
(氨基酸)
EVKLEESGGGLVQSGGSMKLSCVASGFTFS(SEQ ID NO:1295)
小鼠抗体32C1重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AATTACTGGATGAAC(SEQ ID NO:1296)
(氨基酸)
NYWMN(SEQ ID NO:1297)
小鼠抗体32C1重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTCCGCCAGTCTCCAGAGAAGGGGCTTGAGTGGGTTGCT(SEQ ID NO:1298)
(氨基酸)
WVRQSPEKGLEWVA(SEQ ID NO:1299)
小鼠抗体32C1重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
GAAATTAGATTGAAATCTAATAATTATGCAATACATTATGCGGAGTCTGTGAAGGGG(SEQ ID NO:1300)
(氨基酸)
EIRLKSNNYAIHYAESVKG(SEQ ID NO:1301)
小鼠抗体32C1重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
AGGTTCACCATCTCAAGAGATGATTCCAAAAGTAGTGTCTACCTGCAAATGAACAACTTAAGAGCTGAAGACACTGGCATTTATTACTGTACCAGG(SEQ ID NO:1302)
(氨基酸)
RFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTR(SEQ ID NO:1303)
小鼠抗体32C1重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
GTCCCGGGACTGGATGCTTAC(SEQ ID NO:1304)
(氨基酸)
VPGLDAY(SEQ ID NO:1305)
小鼠抗体32C1重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1306)
(氨基酸)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1307)
小鼠抗体32C1轻链：DNA序列(393bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGCTTCCAGCAGTGATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGTGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAATTACACATGTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAATCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:1308)
小鼠抗体32C1轻链：氨基酸序列(131aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISSVEAEDLGVYFCSQITHVPYTFGGGTNLEIK(SEQ ID NO:1309)
小鼠抗体32C1轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGC(SEQ ID NO:1310)
(氨基酸)
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:1311)
小鼠抗体32C1轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACAT(SEQ ID NO:1312)
(氨基酸)
RSSQSLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO:1313)
小鼠抗体32C1轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTAC(SEQ ID NO:1314)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:1315)
小鼠抗体32C1轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AAAGTTTCCAACCGATTTTCT(SEQ ID NO:1316)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:1317)
小鼠抗体32C1轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGTGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGC(SEQ ID NO:1318)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISSVEAEDLGVYFC(SEQ ID NO:1319)
小鼠抗体32C1轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
TCTCAAATTACACATGTTCCGTACACG(SEQ ID NO:1320)
(氨基酸)
SQITHVPYT(SEQ ID NO:1321)
小鼠抗体32C1轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGAGGGGGGACCAATCTGGAAATAAAA(SEQ ID NO:1322)
(氨基酸)
FGGGTNLEIK(SEQ ID NO:1323)
小鼠抗体45C11重链：DNA序列(423bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGACCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACACCTTTATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAATTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAAACCGTATGGTAACTACGGCTATTACTATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1324)
小鼠抗体45C11重链：氨基酸序列(141aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MKCSWVIFFLMAVVTGVNSEVQLQQSGADLVKPGASVKLSCTASGFNIKDTFMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCAKPYGNYGYYYALDYWGQGTSVTVSS(SEQID NO:1325)
小鼠抗体45C11重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGACCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAA(SEQ ID NO:1326)
(氨基酸)
EVQLQQSGADLVKPGASVKLSCTASGFNIK(SEQ ID NO:1327)
小鼠抗体45C11重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
GACACCTTTATGCAC(SEQ ID NO:1328)
(氨基酸)
DTFMH(SEQ ID NO:1329)
小鼠抗体45C11重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGA(SEQ ID NO:1330)
(氨基酸)
WVKQRPEQGLEWIG(SEQ ID NO:1331)
小鼠抗体45C11重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
AGGATTGATCCTGCGAATGGTAATACTAAATATGACCCGAAATTCCAGGGC(SEQ ID NO:1332)
(氨基酸)
RIDPANGNTKYDPKFQG(SEQ ID NO:1333)
小鼠抗体45C11重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
AAGGCCACTATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAAA(SEQ ID NO:1334)
(氨基酸)
KATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCAK(SEQ ID NO:1335)
小鼠抗体45C11重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
CCGTATGGTAACTACGGCTATTACTATGCTTTGGACTAC(SEQ ID NO:1336)
(氨基酸)
PYGNYGYYYALDY(SEQ ID NO:1337)
小鼠抗体45C11重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO:1338)
(氨基酸)
WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1339)
小鼠抗体45C11轻链：DNA序列(381bp)
信号序列-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
ATGAGGTTCCAGGTTCAGGTTCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGATATCAGGTGCCCAGTGTGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTGCAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATAATGAATTCCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1340)
小鼠抗体45C11轻链：氨基酸序列(127aa)
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
MRFQVQVLGLLLLWISGAQCDVQITQSPSYLAASPGETITINCRASKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1341)
小鼠抗体45C11轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
GATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGC(SEQ ID NO:1342)
(氨基酸)
DVQITQSPSYLAASPGETITINC(SEQ ID NO:1343)
小鼠抗体45C11轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
AGGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCC(SEQ ID NO:1344)
(氨基酸)
RASKSISKYLA(SEQ ID NO:1345)
小鼠抗体45C11轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
TGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTAC(SEQ ID NO:1346)
(氨基酸)
WYQEKPGKTNKLLIY(SEQ ID NO:1347)
小鼠抗体45C11轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
TCTGGATCCACTTTGCAATCT(SEQ ID NO:1348)
(氨基酸)
SGSTLQS(SEQ ID NO:1349)
小鼠抗体45C11轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
GGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGT(SEQ ID NO:1350)
(氨基酸)
GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYC(SEQ ID NO:1351)
小鼠抗体45C11轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
CAACAGCATAATGAATTCCCGTGGACG(SEQ ID NO:1352)
(氨基酸)
QQHNEFPWT(SEQ ID NO:1353)
小鼠抗体45C11轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
TTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA(SEQ ID NO:1354)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1355)
小鼠抗体5C6F3重链序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
(DNA)
Gaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtacctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcagccattagtaatggtggtggttacacctactatccagacagtctgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccacgtattactgtgcaagacgttactatgatcactactttgactactggggccaaggcaccgctctcacggtctcctca(SEQ ID NO:1816)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVAAISNGGGYTYYPDSLKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTATYYCARRYYDHYFDYWGQGTALTVSS(SEQ ID NO:1817)
小鼠5C6F3重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
Gaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagt(SEQ ID NO:1356)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:1357)
小鼠5C6F3重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
acctatgccatgtct(SEQ ID NO:1358)
(氨基酸)
TYAMS(SEQ ID NO:1359)
小鼠5C6F3重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:1360)
(氨基酸)
WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:1361)
小鼠5C6F3重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
gccattagtaatggtggtggttacacctactatccagacagtctgaagggg(SEQ ID NO:1362)
(氨基酸)
AISNGGGYTYYPDSLKG(SEQ ID NO:1363)
小鼠5C6F3重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccacgtattactgtgcaaga(SEQ ID NO:1364)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTATYYCAR(SEQ ID NO:1365)
小鼠5C6F3重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cgttactatgatcactactttgactac(SEQ ID NO:1366)
(氨基酸)
RYYDHYFDY(SEQ ID NO:1367)
小鼠5C6F3重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
tggggccaaggcaccgctctcacggtctcctca(SEQ ID NO:1368)
(氨基酸)
WGQGTALTVSS(SEQ ID NO:1369)
小鼠抗体5C6F3轻链序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
(DNA)
Gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaccattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagggtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaagattcacatgttcctctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(SEQ ID NO:1818)
(氨基酸)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQDSHVPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1819)
小鼠5C6F3轻链可变框架1(FR1)序列：
(DNA)
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgc(SEQ ID NO:1370)
(氨基酸)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:1371)
小鼠5C6F3轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agatctagtcagaccattgtacatagtaatggaaacacctatttagaa(SEQ ID NO:1372)
(氨基酸)
RSSQTIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:1373)
小鼠5C6F3轻链可变框架2(FR2)序列：
(DNA)
tggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctac(SEQ ID NO:1374)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:1375)
小鼠5C6F3轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
aaagtttccaaccgattttct(SEQ ID NO:1376)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:1377)
小鼠5C6F3轻链可变框架3(FR3)序列：
(DNA)
ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagggtggaggctgaggatctgggagtttattactgc(SEQ ID NO:1378)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:1379)
小鼠5C6F3轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
tttcaagattcacatgttcctctcacg(SEQ ID NO:1380)
(氨基酸)
FQDSHVPLT(SEQ ID NO:1381)
小鼠5C6F3轻链可变框架4(FR4)序列：
(DNA)
ttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(SEQ ID NO:1382)
(氨基酸)
FGAGTKLELK(SEQ ID NO:1383)
mu5C6F3 scFv序列
(DNA)
gaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtacctatgccatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcagccattagtaatggtggtggttacacctactatccagacagtctgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccacgtattactgtgcaagacgttactatgatcactactttgactactggggccaaggcaccgctctcacggtctcctcaggtggcggaggatctggcggaggtggaagcggcggaggcggatccgatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaccattgtacatagtaatggaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagggtggaggctgaggatctgggagtttattactgctttcaagattcacatgttcctctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(SEQ ID NO:1384)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVAAISNGGGYTYYPDSLKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTATYYCARRYYDHYFDYWGQGTALTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQDSHVPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1385)
3C2B1
小鼠抗体3C2B1重链序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
(DNA)
Gaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggaatcactttcagtacctataccatgtcgtgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtactggtggtgataaaacctactattcagacagtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaacctgtacctccaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccttgtattactgtgcaaggggaaccacggctatgtattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(SEQ IDNO:1820)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGITFSTYTMSWVRQTPEKRLEWVATISTGGDKTYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARGTTAMYYYAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1821)
小鼠3C2B1重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
gaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggaatcactttcagt(SEQ ID NO:1386)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGITFS(SEQ ID NO:1387)
小鼠3C2B1重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
acctataccatgtcg(SEQ ID NO:1388)
(氨基酸)
TYTMS(SEQ ID NO:1389)
小鼠3C2B1重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:1390)
(氨基酸)
WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:1391)
小鼠3C2B1重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accattagtactggtggtgataaaacctactattcagacagtgtgaagggt(SEQ ID NO:1392)
(氨基酸)
TISTGGDKTYYSDSVKG(SEQ ID NO:1393)
小鼠3C2B1重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaacctgtacctccaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccttgtattactgtgcaagg(SEQ ID NO:1394)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCAR(SEQ ID NO:1395)
小鼠3C2B1重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
ggaaccacggctatgtattactatgctatggactac(SEQ ID NO:1396)
(氨基酸)
GTTAMYYYAMDY(SEQ ID NO:1397)
小鼠3C2B1重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
tggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:1398)
(氨基酸)
WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1399)
小鼠抗体3C2B1轻链序列
信号肽-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
(DNA)
gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtatcagtacatctgactataattatattcactggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatCTTGCATCCAACCTAGAATCTgggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaagaagatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttcctctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(SEQ ID NO:1822)
(氨基酸)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSISTSDYNYIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1823)
小鼠3C2B1轻链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatgc(SEQ ID NO:1400)
(氨基酸)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:1401)
小鼠3C2B1轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agggccagcaaaagtatcagtacatctgactataattatattcac(SEQ ID NO:1402)
(氨基酸)
RASKSISTSDYNYIH(SEQ ID NO:1403)
小鼠3C2B1轻链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctat(SEQ ID NO:1404)
(氨基酸)
WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:1405)
小鼠3C2B1轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
CTTGCATCCAACCTAGAATCT(SEQ ID NO:1406)
(氨基酸)
LASNLES(SEQ ID NO:1407)
小鼠3C2B1轻链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
gggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaagaagatgctgcaacctattactgt(SEQ ID NO:1408)
(氨基酸)
GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC(SEQ ID NO:1409)
小鼠3C2B1轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cagcacagtagggagcttcctctcacg(SEQ ID NO:1410)
(氨基酸)
QHSRELPLT(SEQ ID NO:1411)
小鼠3C2B1轻链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
ttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(SEQ ID NO:1412)
(氨基酸)
FGAGTKLELK(SEQ ID NO:1413)
小鼠B12重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
Caggcgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacttgcactgtctctgggttttcattaacc(SEQ ID NO:1414)
(氨基酸)
QAQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLT(SEQ ID NO:1415)
小鼠B12重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agctatggtgtacac(SEQ ID NO:1416)
(氨基酸)
SYGVH(SEQ ID NO:1417)
小鼠B12重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctggga(SEQ ID NO:1418)
(氨基酸)
WVRQPPGKGLEWLG(SEQ ID NO:1419)
小鼠B12重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
gtaatatggcctggtggaagcacaaattataattcgactctcatgtccagaatg(SEQ ID NO:1420)
(氨基酸)
VIWPGGSTNYNSTLMSRM(SEQ ID NO:1421)
小鼠B12重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
cggatcatcaaagacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaattgatgacacagccatgtactactgtgccaga(SEQ ID NO:1422)
(氨基酸)
RIIKDNSKSQVFLKMNSLQIDDTAMYYCAR(SEQ ID NO:1423)
小鼠B12重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
gatcggacacctcgggtgggggcctggtttgcttac(SEQ ID NO:1424)
(氨基酸)
DRTPRVGAWFAY(SEQ ID NO:1425)
小鼠B12重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
tggggccaagggactctggtcactgtctctgcag(SEQ ID NO:1426)
(氨基酸)
WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1427)
小鼠B12轻链可变框架1(FR1)序列：
(DNA)
atcattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgc(SEQ ID NO:1428)
(氨基酸)
IIVLTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:1429)
小鼠B12轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agagccagtgagagtgttgctacttatggcaataattttatgcag(SEQ ID NO:1430)(氨基酸)
RASESVATYGNNFMQ(SEQ ID NO:1431)
小鼠B2重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
gaagtggtgctggtggagtctgggggaggcttagtggagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagcctctggattcgctttcagt(SEQ ID NO:1432)
(氨基酸)
EVVLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFAFS(SEQ ID NO:1433)
小鼠B2重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
acctttgccatgtct(SEQ ID NO:1434)
(氨基酸)
TFAMS(SEQ ID NO:1435)
小鼠B2重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tggattcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:1436)
(氨基酸)
WIRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:1437)
小鼠B2重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
gccattagtaatggtggtggttacacctactatccagacactctgaagggg(SEQ ID NO:1438)
(氨基酸)
AISNGGGYTYYPDTLKG(SEQ ID NO:1439)
小鼠B2重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
cgattctccatctccagagacaatgccaagaataccctgtacctgcaaatgagtagtctgaggtctgaggacacggccgtgtattactgtgcaaga(SEQ ID NO:1440)
(氨基酸)
RFSISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:1441)
小鼠B2重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cgctactatgatctctactttgactta(SEQ ID NO:1442)
(氨基酸)
RYYDLYFDL(SEQ ID NO:1443)
小鼠B2重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
Tggggccgaggcacctctctcatagtctcctca(SEQ ID NO:1444)
(氨基酸)
WGRGTSLIVSS(SEQ ID NO:1445)
小鼠B2轻链可变框架1(FR1)序列：
(DNA)
gatattctgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatttcttgc(SEQ ID NO:1446)
(氨基酸)
DILMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:1447)
小鼠B2轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agatctagtcagaacattgtacatagtaatggaaacacctatttagaa(SEQ ID NO:1448)
(氨基酸)
RSSQNIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:1449)
小鼠B2轻链可变框架2(FR2)序列：
(DNA)
tggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctac(SEQ ID NO:1450)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:1451)
小鼠B2轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
aaagtttccaaccgattttct(SEQ ID NO:1452)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:1453)
小鼠B2轻链可变框架3(FR3)序列：
(DNA)
ggggtccccgacaggttcagtggtagtgggtcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgc(SEQ ID NO:1454)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:1455)
小鼠B2轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
tttcaagattcacatgttcctctcacg(SEQ ID NO:1456)
(氨基酸)
FQDSHVPLT(SEQ ID NO:1457)
小鼠B2轻链可变框架4(FR4)序列：
(DNA)
ttcggtgctgggaccaggctggagctgaaa(SEQ ID NO:1458)
(氨基酸)
FGAGTRLELK(SEQ ID NO:1459)
小鼠B7重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
gaggtgcaggtggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagt(SEQ ID NO:1460)
(氨基酸)
EVQVVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:1461)
小鼠B7重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agatatggcatgtct(SEQ ID NO:1462)
(氨基酸)
RYGMS(SEQ ID NO:1463)
小鼠B7重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:1464)
(氨基酸)
WVRQTPDKRLEWVA(SEQ ID NO:1465)
小鼠B7重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaagggg(SEQ ID NO:1466)
(氨基酸)
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:1467)
小鼠B7重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagg(SEQ ID NO:1468)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR(SEQ ID NO:1469)
小鼠B7重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
gataactacggtagtagctacgactatgctatggactac(SEQ ID NO:1470)
(氨基酸)
DNYGSSYDYAMDY(SEQ ID NO:1471)
小鼠B7重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
tggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca(SEQ ID NO:1472)
(氨基酸)
WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1473)
小鼠B7轻链可变框架1(FR1)序列：
(DNA)
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgc(SEQ ID NO:1474)
(氨基酸)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:1475)
小鼠B7轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agatctagtcagaccattgtacatagtaatggaaacacctatttagaa(SEQ ID NO:1476)
(氨基酸)
RSSQTIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:1477)
小鼠B7轻链可变框架2(FR2)序列：
(DNA)
tggtacctgcaaaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctac(SEQ ID NO:1478)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:1479)
小鼠B7轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
aaagtttccaaccgattttct(SEQ ID NO:1480)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:1481)
小鼠B7轻链可变框架3(FR3)序列：
(DNA)
ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagggtggaggctgaggatctgggagtttattactgc(SEQ ID NO:1482)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:1483)
小鼠B7轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
tttcaagattcacatgttcctctcacg(SEQ ID NO:1484)
(氨基酸)
FQDSHVPLT(SEQ ID NO:1485)
小鼠B7轻链可变框架4(FR4)序列：
(DNA)
ttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(SEQ ID NO:1486)
(氨基酸)
FGAGTKLELK(SEQ ID NO:1487)
小鼠8C7F3重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
gaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagt(SEQ ID NO:1488)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:1489)
小鼠8C7F3重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
acctatgccatgtct(SEQ ID NO:1490)
(氨基酸)
TYAMS(SEQ ID NO:1491)
小鼠8C7F3重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:1492)
(氨基酸)
WVRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:1493)
小鼠8C7F3重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
gccattagtaatggtggtggttacacctactatccagacagtctgaagggg(SEQ ID NO:1494)
(氨基酸)
AISNGGGYTYYPDSLKG(SEQ ID NO:1495)
小鼠8C7F3重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccacgtattactgtgcaaga(SEQ ID NO:1496)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTATYYCAR(SEQ ID NO:1497)小鼠8C7F3重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cgttactatgatcactactttgactac(SEQ ID NO:1498)
(氨基酸)
RYYDHYFDY(SEQ ID NO:1499)
小鼠8C7F3重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
tggggccaaggcaccgctctcacggtctcctca(SEQ ID NO:1500)
(氨基酸)
WGQGTALTVSS(SEQ ID NO:1501)
小鼠8C7F3轻链可变框架1(FR1)序列：
(DNA)
atcattgtgctgacccaatctccagcttctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatatcctgc(SEQ ID NO:1502)
(氨基酸)
IIVLTQSPASLAVSLGQRATISC(SEQ ID NO:1503)
小鼠8C7F3轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agagccagtgagagtgttgctacttatggcaataattttatgcag(SEQ ID NO:1504)
(氨基酸)
RASESVATYGNNFMQ(SEQ ID NO:1505)
小鼠8C7F3轻链可变框架2(FR2)序列：
(DNA)
tggtatcagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctat(SEQ ID NO:1506)
(氨基酸)
WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:1507)
小鼠8C7F3轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
cttgcatccaccctagattct(SEQ ID NO:1508)
(氨基酸)
LASTLDS(SEQ ID NO:1509)
小鼠8C7F3轻链可变框架3(FR3)序列：
(DNA)
ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccattgatcctgtggaggctgatgatgctgcaacctattactgt(SEQ ID NO:1510)
(氨基酸)
GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:1511)
小鼠8C7F3轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cagcaaaataatgaggatcctccgacg(SEQ ID NO:1512)
(氨基酸)
QQNNEDPPT(SEQ ID NO:1513)
小鼠8C7F3轻链可变框架4(FR4)序列：
(DNA)
ttcggtggaggcaccaagctggaaatcaag(SEQ ID NO:1514)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1515)
小鼠H11重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
gaagtggtgctggtggagtctgggggaggcttagtggagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagcctctggattcgcttttagt(SEQ ID NO:1516)
(氨基酸)
EVVLVESGGGLVEPGGSLKLSCVASGFAFS(SEQ ID NO:1517)
小鼠H11重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
acctttgccatgtct(SEQ ID NO:1518)
(氨基酸)
TFAMS(SEQ ID NO:1519)
小鼠H11重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tggattcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:1520)
(氨基酸)
WIRQTPEKRLEWVA(SEQ ID NO:1521)
小鼠H11重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
gccattagtaatggtggtggttacacttactatccagacactctgaagggg(SEQ ID NO:1522)
(氨基酸)
AISNGGGYTYYPDTLKG(SEQ ID NO:1523)
小鼠H11重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaataccctgtacctgcaaatgagtagtctgaggtctgaggacacggccgtgtattactgtgcaaga(SEQ ID NO:1524)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:1525)
小鼠H11重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cgctactatgatctctactttgactta(SEQ ID NO:1526)
(氨基酸)
RYYDLYFDL(SEQ ID NO:1527)
小鼠H11重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
tggggccaaggcacctctctcatagtctcctca(SEQ ID NO:1528)
(氨基酸)
WGQGTSLIVSS(SEQ ID NO:1529)
小鼠H11轻链可变框架1(FR1)序列：
(DNA)
gatattctgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatttcttgc(SEQ ID NO:1530)
(氨基酸)
DILMTQTPLSLPVSLGDQASISC(SEQ ID NO:1531)
小鼠H11轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agatctagtcagaacattgtacatagtaatggaaacacctatttagaa(SEQ ID NO:1532)
(氨基酸)
RSSQNIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO:1533)
小鼠H11轻链可变框架2(FR2)序列：
(DNA)
tggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctac(SEQ ID NO:1534)
(氨基酸)
WYLQKPGQSPKLLIY(SEQ ID NO:1535)
小鼠H11轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
aaagtttccaaccgattttct(SEQ ID NO:1536)
(氨基酸)
KVSNRFS(SEQ ID NO:1537)
小鼠H11轻链可变框架3(FR3)序列：
(DNA)
ggggtccccgacaggttcagtggtagtgggtcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgc(SEQ ID NO:1538)
(氨基酸)
GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC(SEQ ID NO:1539)
小鼠H11轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
tttcaagattcacatgttcctctcacg(SEQ ID NO:1540)
(氨基酸)
FQDSHVPLT(SEQ ID NO:1541)
小鼠H11轻链可变框架4(FR4)序列：
(DNA)
ttcggtgctgggaccaggctggagctgaaa(SEQ ID NO:1542)
(氨基酸)
FGAGTRLELK(SEQ ID NO:1543)
小鼠B9重链可变框架1(FW1)序列：
(DNA)
gaggtgcaggtggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagt(SEQ ID NO:1544)
(氨基酸)
EVQVVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:1545)
小鼠B9重链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agatatggcatgtct(SEQ ID NO:1546)
(氨基酸)
RYGMS(SEQ ID NO:1547)
小鼠B9重链可变框架2(FW2)序列：
(DNA)
tgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgca(SEQ ID NO:1548)
(氨基酸)
WVRQTPDKRLEWVA(SEQ ID NO:1549)
小鼠B9重链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accattagtagtggtggtacttacatctactatccagacagtgtgaagggg(SEQ ID NO:1550)
(氨基酸)
TISSGGTYIYYPDSVKG(SEQ ID NO:1551)
小鼠B9重链可变框架3(FW3)序列：
(DNA)
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgca(SEQ ID NO:1552)
(氨基酸)
RFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCAR(SEQ ID NO:1553)
小鼠B9重链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
agggataactacggtagtagctacgactatgctatggactac(SEQ ID NO:1554)
(氨基酸)
DNYGSSYDYAMDY(SEQ ID NO:1555)
小鼠B9重链可变框架4(FW4)序列：
(DNA)
tggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctct(SEQ ID NO:1556)
(氨基酸)
WGQGTSVTVSS(SEQ ID NO:1557)
小鼠B9轻链可变框架1(FR1)序列：
(DNA)
caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgc(SEQ ID NO:1558)
(氨基酸)
QIVLTQSPAIMSASPGEEVTLTC(SEQ ID NO:1559)
小鼠B9轻链可变互补决定区1(CDR1)序列：
(DNA)
agtgccagctcaagtgtaagttacatgcac(SEQ ID NO:1560)
(氨基酸)
SASSSVSYMH(SEQ ID NO:1561)
小鼠B9轻链可变框架2(FR2)序列：
(DNA)
tggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttat(SEQ ID NO:1562)
(氨基酸)
WFQQRPGTSPKLWIY(SEQ ID NO:1563)
小鼠B9轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
accacatccaacctggcttct(SEQ ID NO:1564)
(氨基酸)
TTSNLAS(SEQ ID NO:1565)
小鼠B9轻链可变框架3(FR3)序列：
(DNA)
ggagtccctgctcgcttcagtggcagtggatctgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgc(SEQ ID NO:1566)
(氨基酸)
GVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYC(SEQ ID NO:1567)
小鼠B9轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cagcaaaggagtagttacccattc(SEQ ID NO:1568)
(氨基酸)
QQRSSYPF(SEQ ID NO:1569)
小鼠B9轻链可变框架4(FR4)序列：
(DNA)
acgttcggctcggggacaaagttggaaataaaa(SEQ ID NO:1570)
(氨基酸)
TFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:1571)
mu3C2B1 scFv序列
(DNA)
Gaagtgatgctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggaatcactttcagtacctataccatgtcgtgggttcgccagactccggagaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtactggtggtgataaaacctactattcagacagtgtgaagggtcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaacctgtacctccaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggccttgtattactgtgcaaggggaaccacggctatgtattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaggtggcggaggatctggcggaggtggaagcggcggaggcggatccgacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatgcagggccagcaaaagtatcagtacatctgactataattatattcactggtaccaacagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaagaagatgctgcaacctattactgtcagcacagtagggagcttcctctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa(SEQ ID NO:1572)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGITFSTYTMSWVRQTPEKRLEWVATISTGGDKTYYSDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLRSEDTALYYCARGTTAMYYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSISTSDYNYIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1573)mu20A10 scFv全序列
(DNA)
gaagtgatgctggtggaatctggcggcggactggttaagcctggcggatctctgaagctgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctggatccggcagacccctgagaagagactggaatgggttgccagcatcggcagagccggcagcacctactacagcgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgtgcggaacatcctgtacctgcagatgagcagcctgcggagcgaggataccgccatgtactactgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggttacagtttctgctggtggcggaggatctggcggaggtggaagcggcggaggcggatccaatatcatgatgacacagagccccagcagcctggctgtgtctgctggcgagaaagtgaccatgtcctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggccagtctcctaagctgctgatctactgggccagcaccagagaaagcggcgtgcccgatagattcacaggcagcggcagcggaaccgacttcaccctgacaatcagctctgtgcaggccgaagatctggccgtgtactattgccaccagtacctgtccagcctgacctttggcgccggaacaaagctggaactgaag(SEQ ID NO:1574)
(氨基酸)
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWIRQTPEKRLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNVRNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSNIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQYLSSLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:1575)
hu20A10M scFV
(DNA)
gaggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctgggtccgacaggcccctggaaaaggccttgaatgggttgcctctatcggcagagccggcagcacctactacagcgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtcagctctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgacatcgtgatgacacagagcccttctagcctggccgtgtctctgggagagagagccacaatcagctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggacagtctcccaagctgctgatctactgggccagcaccagagaaagcggcgtgcccgatagattcacaggctctggcagcggcaccgacttcaccctgacaattagcagtctgcaggccgaggacgtggccgtgtactactgtcaccagtacctgagcagcctgacctttggcggcggaacaaaggtggaaatcaag(SEQ ID NO:1576)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLAVSLGERATISCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1577)
hu20A10MR scFV
(DNA)
gaggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctgggtccgacaggcccctggaaaaggccttgaatgggttgcctctatcggcagagccggcagcacctactacagcgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtcagctctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgacatcgtgatgacacagagcccttctagcctggccgtgtctctgggagagagagccacaatcagctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggacagtctcccaagctgctgatctactgggccagcaccagagaaagcggcgtgcccgatagattcacaggctctggcagcggcaccgacttcaccctgacaattagcagtctgcaggccgaggacgtggccgtgtactactgtcaccagtacctgagcagcctgacctttggcggcggaacaaaggtggaaatcaagaga(SEQ IDNO:5001)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLAVSLGERATISCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:5002)
hu20A10MRT scFV
(DNA)
gaggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctgggtccgacaggcccctggaaaaggccttgaatgggttgcctctatcggcagagccggcagcacctactacagcgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtcagctctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgacatcgtgatgacacagagcccttctagcctggccgtgtctctgggagagagagccacaatcagctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggacagtctcccaagctgctgatctactgggccagcaccagagaaagcggcgtgcccgatagattcacaggctctggcagcggcaccgacttcaccctgacaattagcagtctgcaggccgaggacgtggccgtgtactactgtcaccagtacctgagcagcctgacctttggcggcggaacaaaggtggaaatcaagagaacc(SEQID NO:5003)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLAVSLGERATISCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:5004)
hu20A10C2 scFV
(DNA)
gaggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctgggtccgacaggcccctggaaaaggccttgaatgggttgcctctatcggcagagccggcagcacctactacagcgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtcagctctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttactgggccagcaccagagaaagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcaccagtacctgagcagcctgaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacga(SEQ IDNO:1578)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1579)
hu20A10C2-R scFV
(DNA)
Gaggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctgggtccgacaggcccctggaaaaggccttgaatgggttgcctctatcggcagagccggcagcacctactacagcgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtcagctctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttactgggccagcaccagagaaagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcaccagtacctgagcagcctgaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaa(SEQ ID NO:5005)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:5006)
hu20A10C2RT scFV
(DNA)
gaggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctgggtccgacaggcccctggaaaaggccttgaatgggttgcctctatcggcagagccggcagcacctactacagcgattctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtcagctctggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttactgggccagcaccagagaaagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcaccagtacctgagcagcctgaccttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaacc(SEQID NO:5007)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:5008)
hu20A10N scFV
(DNA)
caggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctggatcagacaggcccctggcaaaggcctggaatgggtggcgtctattggcagagccggcagcacctactacagcgactctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtttctagcggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgaaattgtgctgacacagagccccgccacactgtcactttctccaggcgaaagagccacactgagctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggccaagctcctcggctgctgatctattgggccagcacaagagagagcggcatccctgccagattttctggcagcggctctggcaccgatttcaccctgaccataagcagcctggaacctgaggacttcgccgtgtattactgccaccagtacctgagcagcctgacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ IDNO:1580)
(氨基酸)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWIRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO:1581)
hu20A10N-R scFV
(DNA)
Caggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctggatcagacaggcccctggcaaaggcctggaatgggtggcgtctattggcagagccggcagcacctactacagcgactctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtttctagcggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgaaattgtgctgacacagagccccgccacactgtcactttctccaggcgaaagagccacactgagctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggccaagctcctcggctgctgatctattgggccagcacaagagagagcggcatccctgccagattttctggcagcggctctggcaccgatttcaccctgaccataagcagcctggaacctgaggacttcgccgtgtattactgccaccagtacctgagcagcctgacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaag(SEQ ID NO:5009)
(氨基酸)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWIRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:5010)
hu20A10NRT scFV
(DNA)
Caggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctggatcagacaggcccctggcaaaggcctggaatgggtggcgtctattggcagagccggcagcacctactacagcgactctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtttctagcggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgaaattgtgctgacacagagccccgccacactgtcactttctccaggcgaaagagccacactgagctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggccaagctcctcggctgctgatctattgggccagcacaagagagagcggcatccctgccagattttctggcagcggctctggcaccgatttcaccctgaccataagcagcctggaacctgaggacttcgccgtgtattactgccaccagtacctgagcagcctgacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcggacc(SEQID NO:5011)
(氨基酸)
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWIRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:5012)
huMNE6+R scFV
(DNA)
Gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaaga(SEQ ID NO:5013)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKR(SEQ ID NO:5014)
huMNE6+RT scFV
(DNA)
Gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaagaacc(SEQ ID NO:5015)
(氨基酸)
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mu20A10-CAR T-28-28-3z
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25E6
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(DNA)
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mu25E6-CAR T-8-28-3z
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MNC2-1XX
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MNE6-1XX
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(氨基酸)
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huMNE6-CAR T-8-4-1BB-3z-1XX
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muMNE6-CAR T-28-28-3z-1XX
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgaaggtggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgtagtctctggattcactttcagtagatatggcatgtcttgggttcgccagactccaggcaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtggtggcggtacttacatctactatccagacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtatcactgtacaagggataactacggtaggaactacgactacggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatcccaaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaggaggtcaccctaacctgcagtgccacctcaagtgtaagttacatacactggttccagcagaggccaggcacttctcccaaactctggatttatagcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatatgggacctcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagtagttccccattcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaaaagcacctgtgtccttctccactgttccccggccctagcaagcctttctgggtcctggtggtggtgggcggagtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggcctttatcatcttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactcctagaagacctgggcctaccagaaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgttcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggccttcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttttccagggtctcagtacagccaccaaggacaccttcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa(SEQ ID NO:5045)
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atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtaggtatggcatgagctgggtccgccaggctccagggaagaggctggagtgggtctcaaccattagtggcggaggcacctacatatactacccagactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtaccagagataactatggccgcaactatgattatggcatggattattggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctcacctgcagcgccaccagcagtgttagctacatccactggtaccaacagaggcctggccagagccccaggctcctcatctatagcacctccaacctggccagcggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggagcgactacactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcagtttattactgtcagcagcgtagcagctcccctttcacctttggcagcggcaccaaagtggaaattaaaaagcacctgtgtccttctccactgttccccggccctagcaagcctttctgggtcctggtggtggtgggcggagtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggcctttatcatcttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactcctagaagacctgggcctaccagaaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgttcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggccttcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttttccagggtctcagtacagccaccaaggacaccttcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa(SEQ ID NO:5047)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKRLEWVSTISGGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDNYGRNYDYGMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLTCSATSSVSYIHWYQQRPGQSPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGSDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSSSPFTFGSGTKVEIKKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR**(SEQ ID NO:5048)最小CMV启动子(mCMV)
(DNA)
taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccag(SEQ ID NO:1634)
最小IL2启动子(mIL2P)
cattttgacacccccataatatttttccagaattaacagtataaattgcatctcttgttcaagagttccctatcactctctttaatcactactcacagtaacctcaactcctgc(SEQ ID NO:1635)
最小启动子，miniP
(DNA)
Agagggtatataatggaagctcgacttccag(SEQ ID NO:1636)
激活的IL-18
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgtacttcggcaagctggaaagcaagctgagcgtgatccggaacctgaacgaccaggtgctgttcatcgatcagggcaacagacccctgttcgaggacatgaccgacagcgactgcagagacaacgcccctcggaccatcttcatcatcagcatgtacaaggacagccagcctagaggcatggccgtgaccatctctgtgaagtgcgagaagatcagcaccctgagctgcgagaacaagatcatcagcttcaaagagatgaacccgccggacaacatcaaggacaccaagagcgacatcatattcttccagcggagcgtgcccggccacgacaacaagatgcagtttgagagcagcagctacgagggctacttcctggcctgcgagaaagagcgggacctgttcaagctgatcctgaagaaagaggacgaactgggcgaccgcagcatcatgttcaccgtgcagaacgaggactgataa(SEQ ID NO:1637)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED**(SEQ ID NO:1638)
Foxp3-NFATc1-X3-IL-18
(DNA)
ggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcgagagacccaatgctagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgtacttcggcaagctggaaagcaagctgagcgtgatccggaacctgaacgaccaggtgctgttcatcgatcagggcaacagacccctgttcgaggacatgaccgacagcgactgcagagacaacgcccctcggaccatcttcatcatcagcatgtacaaggacagccagcctagaggcatggccgtgaccatctctgtgaagtgcgagaagatcagcaccctgagctgcgagaacaagatcatcagcttcaaagagatgaacccgccggacaacatcaaggacaccaagagcgacatcatattcttccagcggagcgtgcccggccacgacaacaagatgcagtttgagagcagcagctacgagggctacttcctggcctgcgagaaagagcgggacctgttcaagctgatcctgaagaaagaggacgaactgggcgaccgcagcatcatgttcaccgtgcagaacgaggactgataa(SEQ ID NO:1639)
Foxp3-NFATc1-X6-IL-18
(DNA)
gcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcgagagacccaatgctagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgtacttcggcaagctggaaagcaagctgagcgtgatccggaacctgaacgaccaggtgctgttcatcgatcagggcaacagacccctgttcgaggacatgaccgacagcgactgcagagacaacgcccctcggaccatcttcatcatcagcatgtacaaggacagccagcctagaggcatggccgtgaccatctctgtgaagtgcgagaagatcagcaccctgagctgcgagaacaagatcatcagcttcaaagagatgaacccgccggacaacatcaaggacaccaagagcgacatcatattcttccagcggagcgtgcccggccacgacaacaagatgcagtttgagagcagcagctacgagggctacttcctggcctgcgagaaagagcgggacctgttcaagctgatcctgaagaaagaggacgaactgggcgaccgcagcatcatgttcaccgtgcagaacgaggactgataa(SEQ ID NO:1640)
IL-2-NFATc1-X3-IL-18
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcgagagacccaatgctagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgtacttcggcaagctggaaagcaagctgagcgtgatccggaacctgaacgaccaggtgctgttcatcgatcagggcaacagacccctgttcgaggacatgaccgacagcgactgcagagacaacgcccctcggaccatcttcatcatcagcatgtacaaggacagccagcctagaggcatggccgtgaccatctctgtgaagtgcgagaagatcagcaccctgagctgcgagaacaagatcatcagcttcaaagagatgaacccgccggacaacatcaaggacaccaagagcgacatcatattcttccagcggagcgtgcccggccacgacaacaagatgcagtttgagagcagcagctacgagggctacttcctggcctgcgagaaagagcgggacctgttcaagctgatcctgaagaaagaggacgaactgggcgaccgcagcatcatgttcaccgtgcagaacgaggactgataa(SEQ ID NO:1641)
IL-2-NFATc1-X6-IL-18
(DNA)
ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagctcgagagacccaatgctagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgtacttcggcaagctggaaagcaagctgagcgtgatccggaacctgaacgaccaggtgctgttcatcgatcagggcaacagacccctgttcgaggacatgaccgacagcgactgcagagacaacgcccctcggaccatcttcatcatcagcatgtacaaggacagccagcctagaggcatggccgtgaccatctctgtgaagtgcgagaagatcagcaccctgagctgcgagaacaagatcatcagcttcaaagagatgaacccgccggacaacatcaaggacaccaagagcgacatcatattcttccagcggagcgtgcccggccacgacaacaagatgcagtttgagagcagcagctacgagggctacttcctggcctgcgagaaagagcgggacctgttcaagctgatcctgaagaaagaggacgaactgggcgaccgcagcatcatgttcaccgtgcagaacgaggactgataa(SEQ ID NO:1642)
在CD3-ζMNC2的ITAM中具有诱导型IL-18+/-1XX突变的最佳抗体
muMNC2-8-4-1BB-3z-Foxp3-NFAT-IL-18
(DNA)
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| 构建体名称： | pCDH MSCV h20A10-O CAR 41BB |
| 构建体主链： | pCDH CMV MCS(SBI) |
| 启动子 | MSCV |
| 前导序列： | 人CD8α(1-63) |
| scFv名称： | 人源化20A10-O(64-807) |
| 铰链区： | 人CD8α(808-942) |
| 跨膜结构域： | 人CD8α(943-1014) |
| 共刺激结构域： | 人41BB(1015-1140)和CD3ζ(1141-1476) |
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CD8跨膜结构域
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CD8前导序列
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CD8铰链区
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CD3 1XX
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTtCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTtCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTtCCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTtCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:1705)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCACATACGCCATGAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTTGCCTCTATCGGCAGAGCCGGCAGCACCTACTACAGCGATTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGAGGACCCATCTACAACGACTACGACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCAGCTCTGGCGGTGGCGGAagcGGAGGCGGTGGCtccGGTGGCGGAGGCagcgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcAAGAGCAGCCAGAGCGTGCTGTACTCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCtggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACAACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGACCTGGGCCTACCAGAAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTtCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTtCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTtCCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTtCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:1706)
CD8前导序列
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQID NO:1707)
h20A10-C2 scFV
GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTTAGCACATACGCCATGAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGAAAAGGCCTTGAATGGGTTGCCTCTATCGGCAGAGCCGGCAGCACCTACTACAGCGATTCTGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGAGGACCCATCTACAACGACTACGACGAGTTCGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTCAGCTCTGGCGGTGGCGGAagcGGAGGCGGTGGCtccGGTGGCGGAGGCagcgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcAAGAGCAGCCAGAGCGTGCTGTACTCCAGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCtggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacTGGGCCAGCACCAGAGAAAGCggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtCACCAGTACCTGAGCAGCCTGACCTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGA(SEQ IDNO:1708)
CD8铰链区
ACAACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGAC(SEQ IDNO:1709)
CD8跨膜区
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO:1710)
CD28
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGACCTGGGCCTACCAGAAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:1711)
CD3 1XX
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTtCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTtCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTtCCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTtCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:1712)
氨基酸
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR--
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGCGGAACCTACATATACTACCCCGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTGGGGGGGATAATTACTACGAATACTTCGATGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGATCCGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCTCCTTGGCCGTGTCTCCAGGACAGAGGGCCACCATCACCTGCAGAGCCAGTAAGAGTGTCAGTACCAGCGGATACTCCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAACCTCCTAAACTCCTGATTTACCTGGCATCCAATCTGGAGAGCGGGGTCCCAGCCAGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACCCTCACAATTAATCCTGTGGAAGCTAATGATACTGCAAATTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTGCCTTTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTACAACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAAGTTTAAACTGCCAGAACATTTCTCTGGCCTAACTGGCCGGTACCGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcCTCGAGAGACCCAATGCTAGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGTACTTCGGCAAGCTGGAAAGCAAGCTGAGCGTGATCCGGAACCTGAACGACCAGGTGCTGTTCATCGATCAGGGCAACAGACCCCTGTTCGAGGACATGACCGACAGCGACTGCAGAGACAACGCCCCTCGGACCATCTTCATCATCAGCATGTACAAGGACAGCCAGCCTAGAGGCATGGCCGTGACCATCTCTGTGAAGTGCGAGAAGATCAGCACCCTGAGCTGCGAGAACAAGATCATCAGCTTCAAAGAGATGAACCCGCCGGACAACATCAAGGACACCAAGAGCGACATCATATTCTTCCAGCGGAGCGTGCCCGGCCACGACAACAAGATGCAGTTTGAGAGCAGCAGCTACGAGGGCTACTTCCTGGCCTGCGAGAAAGAGCGGGACCTGTTCAAGCTGATCCTGAAGAAAGAGGACGAACTGGGCGACCGCAGCATCATGTTCACCGTGCAGAACGAGGACTGAtaa(SEQ ID NO:1713)
CD8前导序列
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQID NO:1714)
C2 scFV
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGCGGAACCTACATATACTACCCCGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTGGGGGGGATAATTACTACGAATACTTCGATGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGATCCGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCTCCTTGGCCGTGTCTCCAGGACAGAGGGCCACCATCACCTGCAGAGCCAGTAAGAGTGTCAGTACCAGCGGATACTCCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAACCTCCTAAACTCCTGATTTACCTGGCATCCAATCTGGAGAGCGGGGTCCCAGCCAGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACCCTCACAATTAATCCTGTGGAAGCTAATGATACTGCAAATTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTGCCTTTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACT(SEQID NO:1715)
CD8铰链区
ACAACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGAC(SEQ IDNO:1716)
CD8跨膜区
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO:1717)
41BB
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO:1718)
CD3
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ ID NO:1719)
质粒
TGATAAGTTTAAACTGCCAGAACATTTCTCTGGCCTAACTGGCCGGTACC(SEQ ID NO:1720)
6xNFAT FoxP3
GGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAGGCTTCATTTTTTCCATTTACTGCAGAactagt(SEQ ID NO:1721)
mCMV
Taggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagc(SEQ ID NO:1722)
质粒
CTCGAGAGACCCAATGCTAGCCACC(SEQ ID NO:1723)
CD8前导序列
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQID NO:1724)
IL18
TACTTCGGCAAGCTGGAAAGCAAGCTGAGCGTGATCCGGAACCTGAACGACCAGGTGCTGTTCATCGATCAGGGCAACAGACCCCTGTTCGAGGACATGACCGACAGCGACTGCAGAGACAACGCCCCTCGGACCATCTTCATCATCAGCATGTACAAGGACAGCCAGCCTAGAGGCATGGCCGTGACCATCTCTGTGAAGTGCGAGAAGATCAGCACCCTGAGCTGCGAGAACAAGATCATCAGCTTCAAAGAGATGAACCCGCCGGACAACATCAAGGACACCAAGAGCGACATCATATTCTTCCAGCGGAGCGTGCCCGGCCACGACAACAAGATGCAGTTTGAGAGCAGCAGCTACGAGGGCTACTTCCTGGCCTGCGAGAAAGAGCGGGACCTGTTCAAGCTGATCCTGAAGAAAGAGGACGAACTGGGCGACCGCAGCATCATGTTCACCGTGCAGAACGAGGACTGAtaa(SEQ ID NO:1725)
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGCGGAACCTACATATACTACCCCGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTGGGGGGGATAATTACTACGAATACTTCGATGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGATCCGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCTCCTTGGCCGTGTCTCCAGGACAGAGGGCCACCATCACCTGCAGAGCCAGTAAGAGTGTCAGTACCAGCGGATACTCCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAACCTCCTAAACTCCTGATTTACCTGGCATCCAATCTGGAGAGCGGGGTCCCAGCCAGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACCCTCACAATTAATCCTGTGGAAGCTAATGATACTGCAAATTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTGCCTTTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTACAACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGACATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGACCTGGGCCTACCAGAAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTtCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTtCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTtCCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTtCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:1726)
CD8前导序列
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQID NO:1727)
C2 scFV
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTGGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAACCATTAGTAGTGGCGGAACCTACATATACTACCCCGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGACTTGGGGGGGATAATTACTACGAATACTTCGATGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGATCCGGCGGTGGCGGATCCGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCCTCCTTGGCCGTGTCTCCAGGACAGAGGGCCACCATCACCTGCAGAGCCAGTAAGAGTGTCAGTACCAGCGGATACTCCTACATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAACCTCCTAAACTCCTGATTTACCTGGCATCCAATCTGGAGAGCGGGGTCCCAGCCAGGTTCAGCGGCAGTGGGTCTGGGACCGATTTCACCCTCACAATTAATCCTGTGGAAGCTAATGATACTGCAAATTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTGCCTTTCACATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACT(SEQID NO:1728)
CD8铰链区
ACAACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCTACCCCAGCCCCTACAATTGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCTTGTAGACCTGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGACTGGATTTCGCCTGCGAC(SEQ IDNO:1729)
CD8跨膜区
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO:1730)
CD28
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCTAGAAGACCTGGGCCTACCAGAAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:1731)
CD3 1XX
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTtCAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTtCAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTtCCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTtCGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGATAA(SEQ ID NO:1732)
小鼠B12轻链可变框架2(FR2)序列：
(DNA)
tggtatcagcagaaaccaggacagccacccaaactcctcatctat(SEQ ID NO:1733)
(氨基酸)
WYQQKPGQPPKLLIY(SEQ ID NO:1734)
小鼠B12轻链可变互补决定区2(CDR2)序列：
(DNA)
cttgcatccaccctagattct(SEQ ID NO:1735)
(氨基酸)
LASTLDS(SEQ ID NO:1736)
小鼠B12轻链可变框架3(FR3)序列：
(DNA)
ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctaggacagacttcaccctcaccattgatcctgtggaggctgatgatgctgcaacctattactgt(SEQ ID NO:1737)
(氨基酸)
GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYC(SEQ ID NO:1738)
小鼠B12轻链可变互补决定区3(CDR3)序列：
(DNA)
cagcaaaataatgaggatcctccgacg(SEQ ID NO:1739)
(氨基酸)
QQNNEDPPT(SEQ ID NO:1740)
小鼠B12轻链可变框架4(FR4)序列：
(DNA)
ttcggtggaggcaccaagctggaaatcaagg(SEQ ID NO:1741)
(氨基酸)
FGGGTKLEIK(SEQ ID NO:1742)
NME1和NME7AB结合10种膜近端氨基酸的一部分的表位
PFPFSAQSGA(SEQ ID NO:1743)
SNIKFRPGSVV(SEQ ID NO:1744)
ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)
PSMGFR的片段
GTINVHDVET(SEQ ID NO:1746)
PSMGFR的片段
FPFS(SEQ ID NO:1747)
PSMGFR的片段
SNIKFRPGSVVVQLTLAFRE(SEQ ID NO:1748)
PSMGFR的片段
QFNQYKTEA(SEQ ID NO:1749)
PSMGFR的片段
VQLTLAFRE(SEQ ID NO:1750)
PSMGFR的片段
SVSDV(SEQ ID NO:1751)
IL18序列
(DNA)
Atagaagacaccgggaccgatccagcctcgagagacccaatgctagccaccatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgtacttcggcaagctggaaagcaagctgagcgtgatccggaacctgaacgaccaggtgctgttcatcgatcagggcaacagacccctgttcgaggacatgaccgacagcgactgcagagacaacgcccctcggaccatcttcatcatcagcatgtacaaggacagccagcctagaggcatggccgtgaccatctctgtgaagtgcgagaagatcagcaccctgagctgcgagaacaagatcatcagcttcaaagagatgaacccgccggacaacatcaaggacaccaagagcgacatcatattcttccagcggagcgtgcccggccacgacaacaagatgcagtttgagagcagcagctacgagggctacttcctggcctgcgagaaagagcgggacctgttcaagctgatcctgaagaaagaggacgaactgggcgaccgcagcatcatgttcaccgtgcagaacgaggactgataaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacca(SEQ ID NO:1752)
(氨基酸)
IEDTGTDPASRDPMLATMALPVTALLLPLALLLHAARPYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED**KLGNPVLLVKPP(SEQ ID NO:1753)
引物
5'-agggagacccaagctggctagttaagcttggatggccttaccagtgaccgccttgc-3'(SEQ IDNO:1754)
引物
5'-taggccagagaaatgttctggcattatcagcgagggggcagggcctgc-3'(SEQ ID NO:1755)
5'-tgccagaacatttctctgg-3'(SEQ ID NO:1756)
5'-acagtcgaggctgatcagcgggtttaaacttatcagtcctcgttctgcacgg-3'(SEQ ID NO:1757)
5'-atgcaggccctgccccctcgctgataagtttaaactgccagaacatttctctggcctaac-3'(SEQ ID NO:1758)
5'-accggagcgatcgcagatccttcgcggccgcttatcagtcctcgttctgcacggtgaac-3'(SEQID NO:1759)
5'-attgcactagttgaaagaccccacctgtagg-3'(SED ID NO:1760)
5'-aatgctctagaatacgggtatccagg-3'(SEQ ID NO:1761)
5'-atagcgaattcgtaccgagggccaccatgg-3'(SEQ ID NO:1762)
5'-taggcctcccaccgtacacgcctaggtaccacgccttctgtatg-3'(SEQ ID NO:1763)
5'-taggcctcccaccgtacacgcctaggtacctctgcagtaaatgg-3'(SEQ ID NO:1764)
5'-taaggccatggtggctagc-3'(SEQ ID NO:1765)
5'-aataagtttaaactgccagaacatttctctgg-3'(SEQ ID NO:1766)
5'-atatagcggccgcttatcagtcctcgttctgcacgg-3'(SEQ ID NO:1767)
6x FoxP3NFAT mCMV
(DNA)
Agaacatttctctggcctaactggccggtaccggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcgagagacccaatgctagccaccatgg(SEQ ID NO:1768)
(氨基酸)
RTFLWPNWPVPASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAELVRRVRWEAYISRARLVNRQIAWRRHPRCFDLHRRHRDRSSLERPNASHHG(SEQ ID NO:1769)
6x FoxP3NFAT mIL2P
(DNA)
Agaacatttctctggcctaactggccggtaccggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaactagtcattttgacacccccataatatttttccagaattaacagtataaattgcatctcttgttcaagagttccctatcactctctttaatcactactcacagtaacctcaactcctgcctcgagagacccaatgctagccaccatgg(SEQ ID NO:1770)
(氨基酸)
RTFLWPNWPVPASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAELVILTPP*YFSRINSINCISCSRVPYHSL*SLLTVTSTPASRDPMLATMX(SEQ ID NO:1771)
6x FoxP3NFAT miniP
(DNA)
Agaacatttctctggcctaactggccggtaccggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaggcttcattttttccatttactgcagaactagtagagggtatataatggaagctcgacttccagctcgagagacccaatgctagccaccatgg(SEQ ID NO:1772)
(氨基酸)
RTFLWPNWPVPASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAEASFFPFTAELVEGI*WKLDFQLERPNASHHG(SEQ ID NO:1773)
6x IL2NFAT mCMV
(DNA)
Agaacatttctctggcctaactggccggtaccggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtactagttaggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctcgagagacccaatgctagccaccatgg(SEQ IDNO:1774)
(氨基酸)
RTFLWPNWPVPEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVLVRRVRWEAYISRARLVNRQIAWRRHPRCFDLHRRHRDRSSLERPNASHHG(SEQ ID NO:1775)
6x IL2NFAT mIL2P
(DNA)
Agaacatttctctggcctaactggccggtaccggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtactagtcattttgacacccccataatatttttccagaattaacagtataaattgcatctcttgttcaagagttccctatcactctctttaatcactactcacagtaacctcaactcctgcctcgagagacccaatgctagccaccatgg(SEQ ID NO:1776)
(氨基酸)
RTFLWPNWPVPEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVLVILTPP*YFSRINSINCISCSRVPYHSL*SLLTVTSTPASRDPMLATMX(SEQ ID NO:1777)
6x IL2NFAT miniP
(DNA)
Agaacatttctctggcctaactggccggtaccggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtactagtagagggtatataatggaagctcgacttccagctcgagagacccaatgctagccaccatgg(SEQ ID NO:1778)
(氨基酸)
RTFLWPNWPVPEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVEEKLFHTEGVLVEGI*WKLDFQLERPNASHHG(SEQ ID NO:1779)
人NME1
(DNA)
atggccaactgtgagcgtaccttcattgcgatcaaaccagatggggtccagcggggtcttgtgggagagattatcaagcgttttgagcagaaaggattccgccttgttggtctgaaattcatgcaagcttccgaagatcttctcaaggaacactacgttgacctgaaggaccgtccattctttgccggcctggtgaaatacatgcactcagggccggtagttgccatggtctgggaggggctgaatgtggtgaagacgggccgagtcatgctcggggagaccaaccctgcagactccaagcctgggaccatccgtggagacttctgcatacaagttggcaggaacattatacatggcagtgattctgtggagagtgcagagaaggagatcggcttgtggtttcaccctgaggaactggtagattacacgagctgtgctcagaactggatctatgaatga(SEQ ID NO:1780)
(氨基酸)
MANCERTFIAIKPDGVQRGLVGEIIKRFEQKGFRLVGLKFMQASEDLLKEHYVDLKDRPFFAGLVKYMHSGPVVAMVWEGLNVVKTGRVMLGETNPADSKPGTIRGDFCIQVGRNIIHGSDSVESAEKEIGLWFHPEELVDYTSCAQNWIYE-(SEQ ID NO:1781)
人NME7
(DNA)
atgaatcatagtgaaagattcgttttcattgcagagtggtatgatccaaatgcttcacttcttcgacgttatgagcttttattttacccaggggatggatctgttgaaatgcatgatgtaaagaatcatcgcacctttttaaagcggaccaaatatgataacctgcacttggaagatttatttataggcaacaaagtgaatgtcttttctcgacaactggtattaattgactatggggatcaatatacagctcgccagctgggcagtaggaaagaaaaaacgctagccctaattaaaccagatgcaatatcaaaggctggagaaataattgaaataataaacaaagctggatttactataaccaaactcaaaatgatgatgctttcaaggaaagaagcattggattttcatgtagatcaccagtcaagaccctttttcaatgagctgatccagtttattacaactggtcctattattgccatggagattttaagagatgatgctatatgtgaatggaaaagactgctgggacctgcaaactctggagtggcacgcacagatgcttctgaaagcattagagccctctttggaacagatggcataagaaatgcagcgcatggccctgattcttttgcttctgcggccagagaaatggagttgttttttccttcaagtggaggttgtgggccggcaaacactgctaaatttactaattgtacctgttgcattgttaaaccccatgctgtcagtgaaggactgttgggaaagatcctgatggctatccgagatgcaggttttgaaatctcagctatgcagatgttcaatatggatcgggttaatgttgaggaattctatgaagtttataaaggagtagtgaccgaatatcatgacatggtgacagaaatgtattctggcccttgtgtagcaatggagattcaacagaataatgctacaaagacatttcgagaattttgtggacctgctgatcctgaaattgcccggcatttacgccctggaactctcagagcaatctttggtaaaactaagatccagaatgctgttcactgtactgatctgccagaggatggcctattagaggttcaatacttcttcaagatcttggataattag(SEQ ID NO:1782)
(氨基酸)
MNHSERFVFIAEWYDPNASLLRRYELLFYPGDGSVEMHDVKNHRTFLKRTKYDNLHLEDLFIGNKVNVFSRQLVLIDYGDQYTARQLGSRKEKTLALIKPDAISKAGEIIEIINKAGFTITKLKMMMLSRKEALDFHVDHQSRPFFNELIQFITTGPIIAMEILRDDAICEWKRLLGPANSGVARTDASESIRALFGTDGIRNAAHGPDSFASAAREMELFFPSSGGCGPANTAKFTNCTCCIVKPHAVSEGLLGKILMAIRDAGFEISAMQMFNMDRVNVEEFYEVYKGVVTEYHDMVTEMYSGPCVAMEIQQNNATKTFREFCGPADPEIARHLRPGTLRAIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFKILDN-(SEQ ID NO:1783)
hC2 CD28 1XX(CD28 h/tm)
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactaagcacctgtgtccttctccactgttccccggccctagcaagcctttctgggtcctggtggtggtgggcggagtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggcctttatcatcttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactcctagaagacctgggcctaccagaaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgttcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggccttcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttttccagggtctcagtacagccaccaaggacaccttcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa(SEQ ID NO:1784)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRTKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR--(SEQ ID NO:1785)
CD8前导序列
(DNA)
Atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg(SEQID NO:1786)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:1787)
hMNC2 scFV
(DNA)
gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcctggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtggctatgccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaaccattagtagtggcggaacctacatatactaccccgactcagtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacttgggggggataattactacgaatacttcgatgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctccggcggtggcggatccggcggtggcggatccggcggtggcggatccgacattgtgctgacccagtctccagcctccttggccgtgtctccaggacagagggccaccatcacctgcagagccagtaagagtgtcagtaccagcggatactcctacatgcactggtatcagcagaaaccaggacaacctcctaaactcctgatttacctggcatccaatctggagagcggggtcccagccaggttcagcggcagtgggtctgggaccgatttcaccctcacaattaatcctgtggaagctaatgatactgcaaattattactgtcagcacagtagggagctgcctttcacattcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaact(SEQID NO:1788)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:1789)
CD28铰链区(811-855)
(DNA)
Aagcacctgtgtccttctccactgttccccggccctagcaagcct(SEQ ID NO:1790)
(氨基酸)
KHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:1791)
CD28跨膜结构域(856-936)
(DNA)
Ttctgggtcctggtggtggtgggcggagtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggcctttatcatcttctgggtg(SEQ ID NO:1792)
(氨基酸)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:1793)
CD28(937-1059)
(DNA)
Aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactcctagaagacctgggcctaccagaaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc(SEQ ID NO:1794)
(氨基酸)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:1795)
CD3ζ1XX
(DNA)
Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgttcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggccttcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttttccagggtctcagtacagccaccaaggacaccttcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa(SEQ ID NO:1796)
(氨基酸)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR--
(SEQ ID NO:1797)
h20A10N CD28 1XX(CD28 h/tm)
(DNA)
atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgcaggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctggatcagacaggcccctggcaaaggcctggaatgggtggcgtctattggcagagccggcagcacctactacagcgactctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtttctagcggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgaaattgtgctgacacagagccccgccacactgtcactttctccaggcgaaagagccacactgagctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggccaagctcctcggctgctgatctattgggccagcacaagagagagcggcatccctgccagattttctggcagcggctctggcaccgatttcaccctgaccataagcagcctggaacctgaggacttcgccgtgtattactgccaccagtacctgagcagcctgacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcggaagcacctgtgtccttctccactgttccccggccctagcaagcctttctgggtcctggtggtggtgggcggagtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggcctttatcatcttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactcctagaagacctgggcctaccagaaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgttcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggccttcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttttccagggtctcagtacagccaccaaggacaccttcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa(SEQ ID NO:1798)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWIRQAPGKGLEWVASIGRAGSTYYSDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPIYNDYDEFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCKSSQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQYLSSLTFGGGTKVEIKRKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR--(SEQ ID NO:1799)
CD8前导序列
(DNA)
Atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg(SEQID NO:1800)
(氨基酸)
MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:1801)
h20A10N scFV
(DNA)
Caggtgcagctggttgaatctggcggcggacttgtgaagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcacctttagcacatacgccatgagctggatcagacaggcccctggcaaaggcctggaatgggtggcgtctattggcagagccggcagcacctactacagcgactctgtgaagggcagattcaccatcagccgggacaacgccaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgagagccgaggacaccgccgtgtactattgtgccagaggacccatctacaacgactacgacgagttcgcctattggggccagggcacactggtcacagtttctagcggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgaaattgtgctgacacagagccccgccacactgtcactttctccaggcgaaagagccacactgagctgcaagagcagccagagcgtgctgtactccagcaaccagaagaactacctggcctggtatcagcagaagcccggccaagctcctcggctgctgatctattgggccagcacaagagagagcggcatccctgccagattttctggcagcggctctggcaccgatttcaccctgaccataagcagcctggaacctgaggacttcgccgtgtattactgccaccagtacctgagcagcctgacctttggcggaggcaccaaggtggaaatcaagcgg(SEQ IDNO:1802)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLEWVSTISSGGTYIYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLGGDNYYEYFDVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCQHSRELPFTFGGGTKVEIKRT(SEQ ID NO:1803)
CD28铰链区(811-855)
(DNA)
Aagcacctgtgtccttctccactgttccccggccctagcaagcct(SEQ ID NO:1804)
(氨基酸)
KHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:1805)
CD28跨膜结构域(856-936)
(DNA)
Ttctgggtcctggtggtggtgggcggagtgctggcctgctacagcctgctggtgaccgtggcctttatcatcttctgggtg(SEQ ID NO:1806)
(氨基酸)
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:1807)
CD28(937-1059)
(DNA)
Aggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactcctagaagacctgggcctaccagaaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc(SEQ ID NO:1808)
(氨基酸)
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:1809)
CD3ζ1XX
(DNA)
Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgttcaatgaactgcagaaagataagatggcggaggccttcagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggccttttccagggtctcagtacagccaccaaggacaccttcgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctgataa(SEQ ID NO:1810)
(氨基酸)
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLFNELQKDKMAEAFSEIGMKGERRRGKGHDGLFQGLSTATKDTFDALHMQALPPR--
(SEQ ID NO:1811)
人源化3C2B1 scFv序列
(DNA)
Gaggtgcagctggtggaatccggcggaggactcgtgaagcccggcggcagcctgcggctgagctgcgccgcttctggcatcaccttcagcacctacaccatgagctgggtcagacaggcccctggcaagggcctggaatgggtggccacaatctctacaggcggagataagacctactacagcgacagcgtgaaaggcagattcaccatctctagagataatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgaacagcctgcgggccgaggacaccgccgtgtactattgtgctagaggcacaacagccatgtactactacgccatggactactggggccagggcacaaccgtgaccgtgtccagcggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgatatcgtgctgacccagagccctgcttctctggccgtgtccccaggccagcgggccacaatcacctgtagagccagcaagtccatcagcaccagcgactacaactacatccactggtatcagcagaaacctggccaacctcctaagctgctcatctacctggccagcaacctggaaagcggcgtgcccgccagattcagcggatctggctctggcaccgacttcaccctgacaattagccccgtcgaggccgaggacgccgccacctactactgccagcacagcagagagctgcctctgacctttggcggcggaacaaaggtggaaatcaag(SEQ ID NO:1812)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGITFSTYTMSWVRQAPGKGLEWVATISTGGDKTYYSDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTTAMYYYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASKSISTSDYNYIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISPVEAEDAATYYCQHSRELPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1813)
人源化5C6F3 scFv序列
(DNA)
Gaggtgcagctggtggaaagcggcggcggactggtgaaacccggcggcagcctgagactctcttgtgccgccagcggatttacattcagcacctacgccatgagctgggtgcggcaggcccctggcaagggcctggaatgggtcgccgctatctccaacggcggaggctacacctactatcctgattctctgaagggcaggttcaccatcagcagagataacagcaagaataccctgtacctgcaaatgaactctctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgctagaagatactacgaccactacttcgactactggggccagggcacactggtgacagtgtccagcggcggtggcggaagcggaggcggtggctccggtggcggaggcagcgatatcgtgatgacccaatctcctagcagcctgagcgtgtccccaggcgagcgggccagcatcagctgtagaagctcccagaccatcgtgcacagcaacggcaacacctacctggaatggtatcagcagaaacctggccagagccccaagctgctgatctacaaggtgtctaatagattcagcggcgtgcctgatagatttagcggatctggctccggcacagacttcaccctgacaatttctggagttgaggccgaggacgtgggcgtctactactgcttccaggacagccacgtgcccctgaccttcggcggcggaacaaaggtggaaatcaag(SEQ ID NO:1814)
(氨基酸)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVAAISNGGGYTYYPDSLKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRYYDHYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPSSLSVSPGERASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYQQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISGVEAEDVGVYYCFQDSHVPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:1815)
本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文具体描述的本发明的具体实施方案的许多等同项。
Claims (71)
1.一种抗体或其片段，其用于癌症的诊断、治疗或预防，其中所述抗体特异性结合PSMGFR肽(SEQ ID NO:2)或所述肽的片段。
2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其结合N-10肽(SEQ ID NO:3)、N-19肽(SEQ IDNO:4)、N-23肽(SEQ ID NO:5)、N-26肽(SEQ ID NO:6)、N-30肽(SEQ ID NO:7)、N-10/C-5肽(SEQ ID NO:8)、N-19/C-5肽(SEQ ID NO:9)或C-5肽(SEQ ID NO:825)。
3.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其与包含在N-26序列ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)内的构象表位SVSDV(SEQ ID NO:1751)和FPSA(SEQ ID NO:1747)的肽相互作用，其中FPFS(SEQ ID NO:1747)的突变或缺失破坏所述抗体或其片段与所述N-26肽的结合。
4.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其与包含在N-19序列ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:4)内的构象表位ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)、SVSDV(SEQ ID NO:1751)和FPSA(SEQ ID NO:1747)的肽相互作用，其中ASRYNLT(SEQ IDNO:1745)的突变或缺失破坏所述抗体或其片段与所述N-26肽的结合。
5.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)。
6.根据权利要求5所述的抗体或其片段，其结合N-10肽(SEQ ID NO:3)，但不结合C-10肽(SEQ ID NO:825)。
7.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其抑制NME7AB与MUC1*之间的相互作用。
8.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其抑制NME7AB与PSMGFR肽(SEQ ID NO:2)之间的相互作用。
9.根据权利要求2所述的抗体或其片段，其抑制NME7AB与N-10肽(SEQ ID NO:3)、N-19肽(SEQ ID NO:4)、N-23肽(SEQ ID NO:5)、N-26肽(SEQ ID NO:6)、N-30肽(SEQ ID NO:7)、N-10/C-5肽(SEQ ID NO:8)、N-19/C-5肽(SEQ ID NO:9)或C-5肽(SEQ ID NO:825)之间的相互作用。
10.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中所述抗体识别MUC1跨膜酶促切割产物。
11.根据权利要求10所述的抗体或其片段，其中所述切割酶为MMP14、或MMP9、或所述酶的催化活性片段。
12.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其结合PSMGFR(SEQ ID NO:2)或其片段，其中PSMGFR(SEQ ID NO:2)内氨基酸序列的存在诱导所述抗体与所述PSMGFR的结合。
13.根据权利要求12所述的抗体，其中结合构象诱导肽的氨基酸序列存在于N-10肽(SEQ ID NO:3)中。
14.根据权利要求12所述的抗体或其片段，其不结合结合构象诱导肽序列的线性形式，其中所述肽的所述线性形式为变性形式。
15.根据权利要求14所述的抗体或其片段，其中所述结合构象诱导肽序列在所述N-26肽序列ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)中，其中FPFS(SEQ ID NO:1747)的突变或缺失破坏所述抗体或其片段与所述N-26肽的结合。
16.根据权利要求14所述的抗体或其片段，其中所述结合构象诱导肽序列位于所述N-19序列ASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:4)内，其中ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)的突变或缺失破坏所述抗体或其片段与所述N-19肽的结合。
17.一种抗体或其片段，其用于癌症的诊断、治疗或预防，其中结合诱导肽序列位于N-26序列ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)内，其中FPFS(SEQ ID NO:1747)内的突变或缺失破坏所述抗体或其片段与PSMGFR的结合。
18.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其中
重链CDR1包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为F或I，第2位为T，第3位为F，第4位为S，第5位为T、G或R，第6位为Y，第7位为A、G或T，第8位为M并且第9位为S；
重链CDR2包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为T，第2位为I或S，第3位为I或S，第5位为G或R，第6位为G或A，第9位为T或I，第10位为Y，第11位为Y，第12位为P或S并且第13-17位为DSVKG；
重链CDR3包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第2位为_G、L或N，第4位为G或T，第7位为Y，第12位为D或E，第14位为A并且第15位为Y；
轻链CDR1包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为K或R，第2位为A或S，第3位为S，第4位为K或Q，第5位为S，第6位为L或V，第7位为L，第10位为T或S，第15位为Y并且第16位为I、L或M；
轻链CDR2包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为L、或W、或S，第2位为A或T，第3位为S，第4位为N或T，第5位为L或R，第6位为E或A并且第7位为S；并且
轻链CDR3包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为Q，第2位为H或Q，第3位为S、Q或R，第4位为R、S或Y，第5位为E、L或S，第6位为L或S，第7位为P或S，第8位为F或L并且第9位为T。
19.一种抗体或其片段，其用于癌症的诊断、治疗或预防，其中结合构象诱导肽在N-26序列ISDVSVSDVPFPFSAQSGA(SEQ ID NO:6)内，其中FPFS(SEQ ID NO:1747)、SVSDV(SEQ IDNO:1751)或ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)内的突变或缺失破坏所述抗体或其片段与PSMGFR的结合。
20.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其中
其中
重链CDR1包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为F或I，第2位为T或A，第3位为F，第4位为S，第5位为T、G或R，第6位为Y或F，第7位为A、G或T，第8位为M并且第9位为S；
重链CDR2包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为T或A，第2位为I或S，第3位为I或S，第4位为N、S、T或G，第5位为G或R，第6位为G或A，第7位为G、T或D，第8位为Y、K、H或S，第9位为T或I，第10位为Y或F，第11位为Y，第12位为P或S，并且第13位为D，第14位为S或T，第15位为V或L并且第16-17位为KG；
重链CDR3包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第2位为G、L或N，第3位为G、T或Y，第4位为G或T，第7位为Y，第10位为Y、A或G，第11位为M、D或F，第12位为D或E并且第14-15位为AY；
轻链CDR1包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为K或R，第2位为A或S，第3位为S或R，第8位为S、Y、I或V，第10位为T或S，第12位为G、S、D或Q，第13位为V、Y、K或N，第14位为N、S或T，第15位为Y或F并且第16位为I、L或M；
轻链CDR2包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第2位为A、T或V，第3位为S，第4位为N、T或K，第5位为L或R，第6位为E、A、F或D并且第7位为S；并且
轻链CDR3包含与以下序列具有至少90％同一性的共有序列：第1位为Q、F或W，第2位为H或Q，第4位为R、S、T、Y或N，第5位为E、L、S或H，第6位为L、S、V、D或Y，第7位为P或S并且第9位为T。
21.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为MNC2，具有重链CDR1包含共有序列FTFSGYAMS；
重链CDR2包含共有序列TISSGGTYIYYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列-LGGDNYYEYFDV--；
轻链CDR1包含共有序列RASKS--VSTSGYSYMH；
轻链CDR2包含共有序列LASNLES；并且
轻链CDR3包含共有序列QHSRELPFT。
22.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为MNE6，具有重链CDR1包含共有序列FTFSRYGMS；
重链CDR2包含共有序列TISGGGTYIYYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列DNYGRNYDYGMDY--；
轻链CDR1包含共有序列-------SATSSVSYIH；
轻链CDR2包含共有序列STSNLAS；并且
轻链CDR3包含共有序列QQRSSSPFT。
23.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为B2，具有重链CDR1包含共有序列FAFSTFAMS；
重链CDR2包含共有序列AISNGGGYTYYPDTLKG；
重链CDR3包含共有序列----RYYDLYFDL--；
轻链CDR1包含共有序列RSSQNIV-HSNGNTYLE；
轻链CDR2包含共有序列KVSNRFS；并且
轻链CDR3包含共有序列FQDSHVPLT。
24.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为B7，具有重链CDR1包含共有序列FTFSRYGMS；
重链CDR2包含共有序列TISSGGTYIYYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列DNYGSSYDYAMDY--；
轻链CDR1包含共有序列RSSQTIV-HSNGNTYLE；
轻链CDR2包含共有序列KVSNRFS；并且
轻链CDR3包含共有序列FQDSHVPLT。
25.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为B9，具有重链CDR1包含共有序列FTFSRYGMS；
重链CDR2包含共有序列TISSGGTYIYYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列DNYGSSYDYAMDY--；
轻链CDR1包含共有序列-------SASSSVSYMH；
轻链CDR2包含共有序列TTSNLAS；并且
轻链CDR3包含共有序列QQRSSYPF-。
26.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为8C7F3，具有重链CDR1包含共有序列FTFSTYAMS；
重链CDR2包含共有序列AISNGGGYTYYPDSLKG；
重链CDR3包含共有序列----RYYDHYFDY--；
轻链CDR1包含共有序列--RASESVATYGNNFMQ；
轻链CDR2包含共有序列LASTLDS；并且
轻链CDR3包含共有序列QQNNEDPPT。
27.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为H11，具有重链CDR1包含共有序列FAFSTFAMS；
重链CDR2包含共有序列AISNGGGYTYYPDTLKG；
重链CDR3包含共有序列----RYYDLYFDL--；
轻链CDR1包含共有序列RSSQNIV-HSNGNTYLE；
轻链CDR2包含共有序列KVSNRFS；并且
轻链CDR3包含共有序列FQDSHVPLT。
28.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为B12，具有重链CDR1包含共有序列SYGVH；
重链CDR2包含共有序列VIWPGGSTNYNSTLMSRM；
重链CDR3包含共有序列DRTPRVGAWFAY；并且
轻链CDR1包含共有序列RASESVATYGNNFMQ；
轻链CDR2包含共有序列LASTLDS；并且
轻链CDR3包含共有序列QQNNEDPPT。
29.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为20A10，具有重链CDR1包含共有序列FTFSTYAMS；
重链CDR2包含共有序列-SIGRAGSTYYSDSVKG；
重链CDR3包含共有序列---GPIYNDYDEFAY；
轻链CDR1包含共有序列KSSQSVLYSSNQKNYLA；
轻链CDR2包含共有序列WASTRES；并且
轻链CDR3包含共有序列HQYLSSLT。
30.根据权利要求17所述的抗体或其片段，其为3C2B1，具有
重链CDR1包含共有序列ITFSTYTMS；
重链CDR2包含共有序列TISTGGDKTYYSDSVKG；
重链CDR3包含共有序列-GTTAMYYYAMDY；
轻链CDR1包含共有序列RASKS---ISTSDYNYIH；
轻链CDR2包含共有序列LASNLES；并且
轻链CDR3包含共有序列QHSRELPLT。
31.一种抗体或其片段，其用于癌症的诊断、治疗或预防，所述诊断、治疗或预防需要PSMGFR(SEQ ID NO:2)的抗体结合构象诱导肽ASRYNLT(SEQ ID NO:1745)的存在。
32.根据权利要求31所述的抗体或其片段，其为25E6，具有重链CDR1包含共有序列FTFSSYGMS；
重链CDR2包含共有序列TISNGGRHTFYPDSVKG；
重链CDR3包含共有序列QTGTEGWFAY；
轻链CDR1包含共有序列KSSQSLLDSDGKTYLN；
轻链CDR2包含共有序列LVSKLDS_；并且
轻链CDR3包含共有序列WQGTHFPQT。
33.一种抗体或其片段，其用于癌症的诊断、治疗或预防，所述诊断、治疗或预防需要PSMGFR(SEQ ID NO:2)的抗体结合构象诱导肽SVSDV(SEQ ID NO:1761)的存在。
34.根据权利要求33所述的抗体，其为5C6F3，具有重链CDR1包含共有序列FTFSTYAMS；
重链CDR2包含共有序列AISNGGGYTYYPDSLKG；
重链CDR3包含共有序列RYYDHYFDY；
轻链CDR1包含共有序列RSSQTIVHSNGNTYLE；
轻链CDR2包含共有序列KVSNRFS；并且
轻链CDR3包含共有序列FQDSHVPLT。
35.根据权利要求1-34所述的抗体或其片段，其为鼠、骆驼科动物、人或人源化的。
36.根据权利要求1-34所述的抗体或其片段，其中所述抗体片段为scFv或scFv-Fc，其可变区可为鼠、骆驼科动物、人或人源化的。
37.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含根据权利要求36所述的抗体片段。
38.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含根据权利要求36所述的抗体片段，还包含共刺激结构域或CD3-ζ信号传导结构域中的突变。
39.根据权利要求38所述的CAR，其中酪氨酸在CD28或4-1BB中是突变的。
40.根据权利要求38所述的CAR，其中所述CD3-ζ含有1XX突变。
41.一种免疫细胞，其包含根据权利要求37所述的CAR。
42.根据权利要求41所述的免疫细胞，其为可分化成免疫细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞或肥大细胞的干细胞。
43.一种细胞组合物，其在细胞中表达，所述细胞组合物包含根据权利要求37所述的CAR和具有生物识别单元的第二实体，所述生物识别单元的特异性与所述CAR的特异性不同。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述第二实体结合PD-1、PDL-1或其它检查点抑制剂。
45.根据权利要求43所述的组合物，其中所述第二实体结合NME7。
46.根据权利要求43所述的组合物，其中所述第二实体是细胞因子。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述细胞因子是IL-12。
48.根据权利要求46所述的组合物，其中所述细胞因子是IL-18。
49.根据权利要求43所述的组合物，其中所述第二实体是c-Jun。
50.一种免疫细胞，其被工程化成表达编码根据权利要求37所述的CAR的核酸和编码如前述权利要求中任一项所述的第二实体的核酸，其中所述第二实体从诱导型启动子表达。
51.根据权利要求50所述的免疫细胞，其中所述第二实体从诱导型启动子表达，所述诱导型启动子通过激活的免疫细胞的元件激活。
52.根据权利要求51所述的免疫细胞，其中所述第二实体从NFAT诱导型启动子表达。
53.根据权利要求52所述的免疫细胞，其中所述NFAT是NFATc1、NFATc3或NFATc2。
54.根据权利要求50所述的免疫细胞，其中所述第二实体是细胞因子。
55.根据权利要求51所述的免疫细胞，其中所述细胞因子是IL-7、IL-15或IL-18。
56.根据权利要求50所述的免疫细胞，其中编码所述第二实体的所述核酸被插入到Foxp3启动子或增强子区中。
57.根据权利要求56所述的免疫细胞，其中所述细胞因子是IL-18。
58.根据权利要求56所述的免疫细胞，其中所述细胞因子从NFAT诱导型启动子表达。
59.一种BiTE构建体，其包含根据权利要求36所述的抗体片段。
60.一种抗体药物缀合物(ADC)，其包含根据权利要求35所述的抗体或抗体片段。
61.一种抗体或其片段，其特异性结合PSMGFR(SEQ ID NO:2)和N-10(SEQ ID NO:3)；并且
(i)不结合全长MUC1；
(ii)不结合C-10(SEQ ID NO:825)；
(iii)竞争性地抑制NME1或NME7AB与MUC1*细胞外结构域或PSMGFR肽的结合；
(iv)识别通过切割酶切割所生成的MUC1*；
(v)识别构象表位，但不识别线性表位；或
(vi)通过对组织的免疫组织化学而具有癌症选择性。
62.根据权利要求61所述的抗体或其片段，其中满足标准(i)-(vi)中的四个。
63.根据权利要求61所述的抗体或其片段，其中满足标准(i)-(vi)中的五个。
64.根据权利要求61所述的抗体或其片段，其中满足标准(i)-(vi)中的六个。
65.根据权利要求61所述的抗体或其片段，其中至少满足标准(vi)。
66.根据权利要求61所述的抗体或其片段，其中切割酶是MMP-9。
67.根据权利要求1-66所述的抗体或其片段，其中所述癌症为乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、胃癌或食道癌。
68.一种治疗低抗原密度细胞瘤的方法，所述方法包括向有需要的人施用根据权利要求61所述的抗体。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述抗体在CAR中，并且其中CAR的细胞内部分是包含1xx突变的CD3ζ。
70.根据权利要求59所述的BiTe，其包含抗体20A10和针对CD3的抗体的片段。
71.根据权利要求70所述的BiTe，其为20A10-OKT3-BiTE或20A10-12F6-BiTE。
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