KR20200018572A - 시험관 내에서 Ｔ 세포 내 표적 유전자를 녹아웃시키는 방법 및 그 방법에 이용되는 ｃｒＲＮＡ - Google Patents

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주오한 펭
리안준 션
웨이캉 타오
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지앙수 헨그루이 메디슨 컴퍼니 리미티드
샹하이 헨그루이 파마수티컬 컴퍼니 리미티드
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Abstract

CRISPR-Cas9 시스템에 기초하여 시험관 내에서 T 세포 내 표적 유전자를 녹아웃시키는 방법이 제공된다. 또한, 표적 유전자인 TRAC, B2M 및 PD1을 표적으로 하는 crRNA, crRNA 및 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA를 연결시킴으로써 형성되는 sgRNA, Case9 단백질, 올리고디옥시리보핵산(N-올리고) 또는 이리 DNA 단편을 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 T 세포 내 TCR, B2M 및/또는 PD1 유전자를 녹아웃시키는 데 이용된다. 또한, 본 발명의 방법에 따라 수득된 녹아웃된 유전자를 갖는 T 세포 및 이의 용도가 제공된다.

Description

시험관 내에서 Ｔ 세포 내 표적 유전자를 녹아웃시키는 방법 및 그 방법에 이용되는 ｃｒＲＮＡ
본 발명은 생물 의약품(biological medicine)의 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 시험관 내(in vitro)에서 T 세포 내 표적 유전자를 녹아웃(knocking out)시키는 방법, 그 방법에 이용되는 crRNA, 그 방법에 의해 수득되는 T 세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
생체 외(ex vivo)에서 생성된 자가 항원-특이적 T 세포의 이식을 포함하는 입양 세포 치료법(adoptive cell therapy, ACT)은 바이러스 감염 및 암 치료에 유망한 전략이다. 입양 세포 치료법에 이용되는 T 세포는 항원-특이적 T 세포의 증폭에 의해 또는 유전적으로 설계된 T 세포의 방향 전환(redirection)에 의해 생성될 수 있다(Park, Rosenberg et al. Trends Biotechnol. 2011, 29(11): 550-557).
CART는 T 세포의 표적화(targeting), 살상 활성(killing activity) 및 지속성(persistence)을 향상시키기 위하여 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)를 분리된 T 세포 내로 유전적으로 삽입함으로써 수득되며, 종양 세포 표면 항원의 인식은 MHC 제한으로부터 독립적이다. CAR은 T 세포 수용체의 세포 외 항원 결합 부위, 막관통 부위 및 세포 내 신호 전달 부위(예컨대, CD3ζ 및 공동 자극 분자)로 구성된다. 세포 외 항원 결합 부위는 힌지(hinge)를 통해 단일클론 항체의 중쇄 가변 영역(VH)에 결합된 경쇄 가변 영역(VL)로 구성되어, 특정 종양 항원을 인식할 수 있는 단일 사슬 가변 단편(single chain fragment variable, scFv)을 형성한다. 관련된 임상 시험은 CAR이 다른 치료에 반응하지 않는 림프종 환자에게 더 나은 치료 효과를 가짐을 보여주었다. 펜실베니아 대학교(University of Pennsylvania)의 Carl June이 실시한 CART-19에 대한 연구에서는 75명의 백혈병 환자(성인 및 아동을 포함) 중 45명이 CART 세포를 이용한 치료 후 완전 관해(remission)를 보인 것으로 나타났다.
하지만, 기존의 CART 치료법은 전형적으로 종양 환자로부터의 자가 림프구를 활용한다. 이러한 림프구는 시험관 내에서 변형, 배양, 활성화 및 증식된 후, 환자에게 다시 돌아간다. 사이토카인 폭풍(cytokine storm)과 같은 부작용 외에도, 세 가지 주요한 문제점이 있다: 첫째로, CART 치료는 림프구의 수가 적거나 질이 떨어지는 병이 진행된(advanced) 환자에게는 적용할 수 없고; 둘째로, 고형 종양에서 CART 치료법의 효능은 아마도 면역억제 체크포인트(immunosuppression checkpoint)의 신호전달 경로의 영향으로 인해 초래된 종양 조직 내 면역 세포의 형편없는 생존율 및 낮은 활성 때문에 여전히 유효하지 않으며; 마지막으로, CART는 개인 맞춤 치료이기 때문에 비용이 높고 환자의 부담이 증가한다. 따라서, 동종이계(allogeneic) 기원으로부터 유래하는 범용성 CAR-T 세포(universal CAR-T cells, UCART)의 개발은 CART 치료법의 적용을 촉진할 것이다.
초기 단계에서, 유전자 녹아웃은 상동 재조합을 통해 또는 RNAi 기술에 의해 벡터를 표적화함으로써 수행될 수 있었지만, 이 두 기술은 복잡한 조작 및 낮은 효율과 같은 문제를 가지고 있다. 셀렉티스(Cellectis) 회사는 TALEN 기술에 의해 개발된 동종이계의 CAR-T 치료법 UCART19를 이용하여 TCRα 유전자(GVHD를 감소시킴) 및 CD52 유전자(세포로 하여금 알렘투주맙(Alemtuzumab)에 저항성을 갖게 함)를 방향성있게 녹아웃시킴으로써 재발된 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocyte leukemia: ALL)을 앓고 있는 아동 환자 여러 명을 성공적으로 치료하였다. 하지만, 셀렉티스에 의해 제안된 TALEN을 통해 TCR을 녹아웃시킬 때는 복잡한 제작 및 대규모의 서열화 공정이 필요하다. 현재, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR-연관, CRISPR-Cas9)는 특정 DNA 서열을 인식함으로써 유전자 편집을 달성하고, 이는 TALEN보다 더 간편하고 효율적이다.
현재, CN104395463A, CN105518146A 및 CN106191062A에서 언급된 바와 같은 CRISPR/Cas9 시스템에 기반한 유전자 녹아웃의 예가 있다. 하지만, 표적 유전자의 낮은 녹아웃율, 여러 형질감염 또는 형질전환 공정의 필요성, 복잡한 운용, T 세포의 심한 손상, 또는 높은 오프-타겟 비율(off-target rate)과 같은 해결되어야 할 일부 문제들이 여전히 남아 있다. 따라서, CRISPR/Cas9 시스템뿐만 아니라 crRNA에 기반하여 TCR 유전자를 더 정확하게 녹아웃시키는 방법을 최적화할 필요가 여전히 있다.
본 발명의 목적은 종래 기술의 면역 요법에 존재하는 문제점을 극복하고, CRISPR/Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 TCR을 녹아웃시킴으로써 TCR-음성 T 세포를 제작하는 방법을 제공하며, 그 방법에 의해 수득되는 TCR-음성 T 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 TCR- 및 PD1-(또는 B2M-) 이중 음성 T 세포를 제공하고, 이를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 TCR-, B2M- 및 PD1- 삼중 음성 T 세포를 제공하고, 이를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 위의 TCR 음성 T 세포, TCR- 및 PD-1-(또는 B2M-) 이중 음성 T 세포와 TCR/B2M/PD1 삼중 음성 T 세포는 자성 비드를 이용함으로써 분류되고, 종양의 입양 세포 면역요법 등에 사용된다.
제1 구현예에서, 시험관 내에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은
1) T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 표적으로 하는 sgRNA를 Cas9 단백질과 각각 접촉시켜 단백질-RNA 복합체(RNP)를 형성하는 단계;
2) 상기 RNP를 올리고디옥시리보핵산(N-올리고) 또는 이리(milt) DNA 단편과 혼합하고, 수득된 혼합물을 T 세포 내로 형질전환시키는 단계
를 포함하며, 여기에서 sgRNA는 Cas9 단백질을 표적 유전자의 상응하는 표적 서열로 가이드하고 표적 서열과 혼성화(hybridize)함으로써 표적 유전자가 절단되고, 표적 유전자의 절단 효율은 75%를 초과한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 시험관 내에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃시키는 방법에서, 표적 유전자는 TRAC, TRBC, B2M 및 PD1 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, sgRNA는 표적 유전자의 코딩 서열 또는 표적 유전자의 발현을 위한 조절 서열을 표적화하한다.
또한, 본 발명의 시험관 내에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃시키는 방법에서, sgRNA는 5'에서 3' 방향으로 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA에 연결된 17 - 20 nt 길이의 표적 유전자를 표적으로 하는 crRNA로 구성되며, 여기에서 crRNA는 바람직하게는 길이가 17 nt이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 시험관 내에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃시키는 방법에서, 올리고디옥시리보핵산은 100 - 250 bp 길이를 갖는 이중-가닥 DNA 또는 100 - 250 nt 길이의 단일-가닥 DNA이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 시험관 내에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃시키는 방법에서, TRAC 유전자를 표적으로 하는 crRNA는 서열번호 1 - 12로 표시되는 crRNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고, B2M 유전자를 표적으로 하는 crRNA의 서열은 서열번호 13으로 표시되며, PD1 유전자를 표적으로 하는 crRNA는 서열번호 14 - 16으로 표시되는 crRNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 시험관 내에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃시키는 방법에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래하는 Cas9 단백질이고, 이의 서열은 서열번호 18로 표시된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 시험관 내에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃시키는 방법에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유하는 Cas9 단백질이고, Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA의 서열은 서열번호 17로 표시된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 시험관 내에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃시키는 방법에서, T 세포는 보조 T 세포(helper T cell), 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 기억 T 세포(memory T cell), 조절 T 세포(regulatory T cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), γδT 세포, CAR-T 세포 및 TCR-T 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 녹아웃된 표적 유전자를 갖는 T 세포를 추가로 제공하며, 여기에서 T 세포는 상술한 방법에 의해 수득된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 유전자를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 crRNA를 추가로 제공하며, 여기에서 crRNA는 서열번호 1 - 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 표적 유전자의 코딩 서열 또는 표적 유전자의 발현을 위한 조절 서열을 표적으로 하는 본 발명에서 표적 유전자를 녹아웃하기 위해 사용되는 crRNA가 제공되며, 여기에서 표적 유전자는 TRAC, TRBC, B2M 및 PD1 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 표적 유전자를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 crRNA가 제공되며, 여기에서 표적 유전자는 TRAC 유전자이고, crRNA는 서열번호 1 - 12로 표시되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 표적 유전자를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 crRNA가 제공되며, 여기에서 표적 유전자는 B2M 유전자이고, crRNA의 서열은 서열번호 13에 제시되어 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에서 표적 유전자를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 crRNA가 제공되며, 표적 유전자는 PD1 유전자이고, crRNA는 서열번호 14 - 16으로 표시되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 표적 유전자를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 sgRNA를 제공하며, sgRNA는 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA에 연결된 crRNA로 구성되고, 여기에서 crRNA는 서열번호 1 - 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 표적 유전자를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 sgRNA가 제공되며, 여기에서 표적 유전자는 TRAC, TRBC, B2M 및 PD1 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 표적 유전자 TRAC를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 sgRNA가 제공되며, 여기에서 sgRNA는 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA에 연결된 crRNA로 구성되고, crRNA는 서열번호 1 - 12로 표시되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 표적 유전자 B2M을 녹아웃시키는데 사용하기 위한 sgRNA가 제공되며, 여기에서 sgRNA는 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA에 연결된 crRNA로 구성되고, crRNA는 서열번호 13에 제시되어 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 표적 유전자 PD-1을 녹아웃시키는데 사용하기 위한 sgRNA가 제공되며, 여기에서 sgRNA는 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA에 연결된 crRNA로 구성되고, crRNA는 서열번호 14 - 16으로 표시되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 표적 유전자를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 sgRNA가 제공되며, 여기에서 Cas9 단백질은 서열번호 18의 아미노산을 갖는 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래하는 Cas9 단백질이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 표적 유전자를 녹아웃시키는데 사용하기 위한 sgRNA가 제공되며, 여기에서 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA의 서열은 서열번호 17에 제시되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 녹아웃 키트를 제공하며, 여기에서 키트는:
a: 상술한 바와 같은 하나 이상의 crRNA(들) 또는 상술한 바와 같은 하나 이상의 sgRNA(들);
b: Cas9 단백질;
c: 올리고디옥시리보핵산 또는 이리 DNA 단편
을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 유전자를 녹아웃시키는데 사용되는 키트에서, 올리고디옥시리보핵산은 100 - 250 bp 길이의 이중 가닥 DNA 또는 100 - 250 nt 길이의 단일 가닥 DNA이다다.
바람직한 구현예에서, 유전자를 녹아웃시키는데 사용되는 키트에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래하는 Cas9 단백질이고, Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA의 서열은 서열번호 17으로 표시된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 항-종양제의 제조를 위한 본 발명의 녹아웃된 유전자를 포함하는 T 세포의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 또한 바이러스 또는 세균으로 인해 야기되는 감염성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 녹아웃된 유전자를 포함한 T 세포의 용도를 제공한다.
일부 구현예에서, TCR, B2M 또는 PD1은 설계된 crRNA 및 방법을 이용함으로써 효과적으로 녹아웃된다. TCR 및 B2M 및/또는 PD1 유전자의 녹아웃을 이용한 CART 세포의 시험관 내 살상 활성은 TCR, B2M 및/또는 PD1 유전자의 녹아웃으로 인한 영향을 받지 않는다.
도 1은 상이한 전달 시스템의 녹아웃 효율의 비교를 나타낸 것이다. 결과는 RNP 전달 방식이 Jurkat 세포 내 유전자를 녹아웃시키는데 높은 효율을 가짐을 나타낸다.
도 2A-2B는 T 세포 내 유전자를 녹아웃시키는 데 있어서의 CRISPR-Cas9 기반 시스템의 효율에 대한 N-올리고(N-oligo)의 효과를 나타낸 것이다. 도 2A는 T 세포 내 유전자를 녹아웃시키는 데 있어서의 효율의 비교를 나타낸 것이고; 도 2B는 CART 세포 내 유전자를 녹아웃시키는 데 있어서의 효율의 비교를 나타낸 것이다.
도 3은 T 세포 내 유전자 녹아웃의 효율에 대한 이리 DNA 단편의 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 B2M 유전자 녹아웃의 효율의 검출을 나타낸 것이다.
도 5는 PD1 유전자 녹아웃에 대한 선별된 crRNA의 효과의 검출을 나타낸 것이다.
도 6A-6B는 RNP 및 N-올리고 또는 이리 DNA에 의해 초래된 유전자 돌연변이의 분석을 나타낸 것이다. 도 6A는 TRAC에 대한 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 6B는 B2M에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7A-7C는 RNP 오프 타겟 비율을 분석한 것을 나타낸 것이다. 도 7A는 TRAC 유전자의 오프-타겟 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이고, 도 7B는 B2M 유전자의 오프-타겟 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이며, 도 7C는 PD1 유전자의 오프-타겟 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8A-8B는 녹아웃된 TRAC 유전자를 갖는 T 세포 내 CD25 및 CD69의 활성화의 분석을 나타낸 것이다. 도 8A는 CD69 활성화의 비교를 나타낸 것이고, 도 8B는 CD25 활성화의 비교를 나타낸 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 내 표적 유전자를 변경하는 방법을 제공한다.
본원에 기재된 연구는 CRISPR/Cas 시스템의 대립 유전자(allele) 표적화 접근법의 이용이 돌연변이 세포를 최대 80%의 효율로 생성함을 보여준다. 특히, 본원에 기재된 작업은 놀랍게도 그리고 예기치 않게, 유용한 RNA 가이드 서열뿐만 아니라 특정 유전자(예를 들어, TRAC, TRBC, B2M, PD1)를 표적화하기에 적합한 특정 가이드 서열을 구체적으로 확인하는 방법을 제공하는 다중 가이드 전략을 보여준다.
CRISPR 시스템은 본 발명에 의해 제공되는 방법 및 조성물에 유용하며, 이러한 시스템은 또한 국제공개번호 WO 2013142578 A1 및 WO 2013098244 A1에 기재된 것을 포함하며, 이는 본원에 그 전체가 참조로서 포함된다.
세포 내 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하기 위한 예시적 방법은 폴리뉴클레오티드 서열을 CRISPR(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부) 서열-관련 단백질(Cas) 및 하나 또는 두 개의 리보핵산과 접촉시켜 RNP를 형성하는 단계를 포함하며, 여기에서 리보핵산은 Cas 단백질을 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 표적 모티프로 가이드하여 표적 모티프와 혼성화시키고, 여기에서 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열은 절단되며, RNP로 형질전환된 세포의 변경 효율은 75% 이상이다.
표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하기 위한 임의의 수단이 본 발명에서 고려되며, 상기 수단은 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 이용함으로써 당업자에게 쉽게 이용 가능하다. 세포 내 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 변경할 수 있는 임의의 CRISPR/Cas 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 CRISPR/Cas 시스템은 다양한 Cas 단백질을 이용할 수 있다(Haft et al. PLoS Comput Biol. 2005; 1(6) e60). PLoS Comput Biol. 2005; 1(6) e60). 이러한 Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템이 RNA 결합 단백질, 엔도뉴클레아제(endonuclease) 및 엑소뉴클레아제(exonuclease), 헬리카제(helicase) 및 폴리머라제(polymerase)를 포함하는 세포 내 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 변경할 수 있게 한다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 타입 I 시스템이다. 일부 구현예에서, CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR 타입 II 시스템이다.
본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 세포 내 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 임의의 목적을 위하여 세포 내 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열(들)을 변경하는 것을 고려한다. 일부 구현예에서, 세포 내 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 돌연변이 세포를 생산하기 위해 변경된다.
본원에서 예시적인 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 단백질 또는 이의 기능적 부분(functional portion)일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 임의의 세균 종으로부터 유래하는 Cas9 단백질 또는 이의 기능적 부분이다. Cas9 단백질은 타입 II CRISPR 시스템의 구성원이며, 이는 전형적으로 트랜스-암호화된 소형 RNA(trans-encoded small RNA, tracrRNA), 내인성 리보뉴클레아제 3(rnc) 및 Case9 단백질을 포함한다.
CrRNA(CRISPR-유래 RNA) 및 tracrRNA(전사-활성화 RNA)는 sgRNA(단일 가이드 RNA)를 수득하기 위해 유전적으로 조작되고 함께 연결된다. 최종적으로, 복합체가 sgRNA-발현 서열에 의해 형성되고, Cas9는 세포 내로 형질전환되어 표적 유전자가 녹아웃될 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 변경은 표적 유전자의 일부 원하지 않는 폴리뉴클레오티드 서열을 원하는 서열로 교정한다. 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열 내에서 임의의 유형의 돌연변이 또는 오류를 교정하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 결실로 인하여 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 잃어버린 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 데 이용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 또한 표적 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 삽입 돌연변이로 인해 초래된 일부 뉴클레오티드 서열을 삭제 또는 절단하는 데 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 부정확한 뉴클레오티드 서열을 정확한 뉴클레오티드 서열로 대체하는 데(예를 들어, 표적 유전자, 즉 SNP의 폴리뉴클레오티드 서열의 기능적 돌연변이로 인해 손상된 기능을 회복하기 위하여) 이용될 수 있다.
본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 종래의 CRISPR/Cas 시스템과 비교할 때, 예기치 않게도 표적 유전자를 높은 효율로 절단할 수 있다. 특정 구현예에서, 표적 유전자의 절단 효율은 적어도 약 5%이다. 특정 구현예에서, 표적 유전자의 절단 효율은 적어도 약 10%이다. 특정 구현예에서, 표적 유전자의 절단 효율은 약 10% 내지 약 80%이다. 특정 구현예에서, 표적 유전자의 절단 효율은 약 30% 내지 약 80%이다. 특정 구현예에서, 표적 유전자의 절단 효율은 약 50% 내지 약 80%이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 절단 효율은 약 75% 이상 또는 약 80% 이상이다.
일부 구현예에서, 표적 유전자는 게놈이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 인간 게놈이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 포유류 게놈이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자는 척추동물 게놈이다.
본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 표적 유전자 내 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 일부를 녹아웃시키기 위한 다양한 응용 분야에 적용될 수 있다. 예를 들어, 세포 내 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃시키는 것은 연구 목적을 위해 시험관 내에서 수행될 수 있다. 생체 외 목적을 위해, 세포 내 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 녹아웃시키는 것은 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열(들)의 발현과 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 데 적용 가능하다(예를 들어, 생체 외에서 세포 내 돌연변이 대립 유전자(들)를 녹아웃시키고, 녹아웃된 돌연변이 대립 유전자(들)를 갖는 세포를 대상체(subject) 내로 도입함).
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명을 쉽게 이해하기 위하여, 특정 기술 및 과학 용어를 구체적으로 아래에 정의하였다. 본원에서 명시적으로 달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 기타 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다.
I. 용어
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "접촉하는(contacting)"(즉, 폴리뉴클레오티드 서열을 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부-연관(Cas) 단백질 및/또는 리보핵산과 접촉시키는 것)은 세포 내 Cas 단백질 및/또는 리보핵산을 시험관 내에서 함께 항온처리하는 것(예를 들어, 배양시 세포에 Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 첨가하는 것) 또는 생체 외에서 세포를 접촉시키는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 개시된 바와 같이 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 Cas 단백질 및/또는 리보핵산과 접촉시키는 단계는 임의의 적합한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 부착 또는 현탁 배양으로 처리될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이 Cas 단백질 및/또는 리보핵산과 접촉되는 세포는 또한 성장 인자 또는 다른 분화제와 같은 다른 제제 또는 환경과 동시에 또는 후속적으로 접촉하여 세포를 추가로 안정화시키거나 분화시킬 수 있는 것으로 이해된다.
분리된 세포에 적용되는 바와 같이, 용어 "처리하는(treating)" 등은 세포를 임의의 종류의 공정 또는 조건에 놓이게 하거나 세포에 대하여 임의의 종류의 조작 또는 절차를 수행하는 것을 포함한다. 대상체에 적용되는 바와 같이, 용어는 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열이 본원에 기재된 방법에 따라 생체 외에서 변경된 세포를 개체에게 제공하는 것을 지칭한다. 개체는 전형적으로 질병을 앓고 있거나 상해를 입었거나, 또는 평균적인 집단 구성원에 비해 질병을 앓을 위험이 더 높으며, 그러한 주의(attention), 돌봄(care) 또는 관리(management)가 필요하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는(treating)"은 유효량의 본원에 기재된 방법에 따라 생체 외에서 변경된 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 세포를 대상체에 투여하여, 대상체가 질병의 적어도 하나의 증상의 감소 또는 질병의 개선, 예를 들어 유익하거나 바람직한 임상적 결과를 나타내는 것을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상적 결과는, 검출 가능 여부와 관계없이, 하나 이상의 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병의 안정화된 상태(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 연기, 질병 상태의 개선 또는 경감 및 (부분 또는 전체 여부와 관계없이) 관해를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 치료는 치료 없이 예상되는 생존과 비교하여 생존 연장을 지칭할 수 있다. 따라서, 당업자는 치료가 질병 상태를 개선시킬 수 있지만 질병에 대환 완전한 치료는 아닐 수 있음을 인지한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “치료”는 예방을 포함한다. 대안적으로, 치료는 질병의 진행이 늦춰지거나 중단되는 경우에 “효과적”인 것으로 간주된다. “치료”는 또한 치료 없이 예상되는 생존과 비교하여 생존 연장을 지칭할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상은 폴리뉴클레오티드 서열의 발현과 관련된 장애로 이미 진단받은 대상뿐만 아니라, 유전적 감수성 또는 기타 요인으로 인하여 이러한 장애가 발생할 가능성이 있는 대상 또한 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이 세포"는 원래 유전자형과는 상이한 생성된 유전자형을 갖는 세포를 지칭한다. 일부 실시예에서, "돌연변이 세포"는 예를 들어, 정상적으로 기능하는 유전자가 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 변경될 때 돌연변이 표현형을 나타낸다. 다른 실시예에서, "돌연변이 세포"는 예를 들어, 돌연변이된 유전자형이 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 교정될 때 야생형 표현형을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 내 표적 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 유전적 돌연변이를 교정 또는 복구하기 위해(예를 들어, 세포의 정상 유전자형을 회복시키기 위해) 변경된다. 일부 구현예에서, 세포 내 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열(들)은 유전적 돌연변이를 유도하기 위해(예를 들어, 유전자 또는 게놈 요소의 기능을 파괴하기 위해) 변경된다.
일부 구현예에서, 변경은 삽입-결실이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "삽입-결실(indel)"은 삽입, 결실 또는 이의 조합으로 인해 초래되는 돌연변이를 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 게놈 서열의 코딩 영역에서의 삽입-결실은, 삽입-결실의 길이가 3의 배수가 아닌 한, 프레임시프트(frameshift) 돌연변이를 초래할 것이다. 일부 구현예에서, 변경은 점 돌연변이(point mutation)이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "점 돌연변이"는 뉴클레오티드 중 하나의 치환을 지칭한다. 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템은 표적 폴리뉴클레오티드 서열 내 임의의 길이의 삽입-결실 또는 점 돌연변이를 유도하는 데 이용될 수 있다.
"올리고디옥시리보핵산" 또는 "N-올리고"는 RNP 전달 시스템이 유전자를 녹아웃시키는 데 이용될 때, RNP와 함께 세포 내로 형질전환된 무작위(random) 서열을 갖는 디옥시리보핵산 단편을 지칭한다. 바람직하게는, 이는 100-250 bp 길이의 이중 가닥 DNA 또는 100-250 nt 길이의 단일 가닥 DNA이다.
"이리 DNA 단편"은 연어 정자 DNA를 함유하는 용액을 기계적으로 전단(shearing)하여 이리 DNA를 절단함으로써 수득되는 소분자 단편을 지칭한다. 예를 들어, 1% 연어 정자 DNA 용액은 7-게이지 바늘로 반복적으로 두들겨 DNA를 소분자로 절단하고, 분취하여 저장한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, “녹아웃"은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능을 방해하는 방식으로 표적 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 결실시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 녹아웃은 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 기능적 도메인에(예를 들어, DNA 결합 도메인에) 삽입-결실을 유도하여 표적 유전자 폴리뉴클레오티드 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 본원에 기재된 세부 사항에 기초하여, 당업자는 본 발명의 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 표적 폴리뉴클레오티드 또는 이의 일부를 녹아웃시키는 방법을 쉽게 이해할 것이다.
일부 구현예에서, 표적 유전자의 절단은 표적 유전자의 발현의 감소를 초래한다. 용어 "감소된"은 일반적으로 통계적으로 유의하게 감소된 양을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 하지만, 의심의 여지를 없애기 위해, "감소된"은 참조 수준(reference level)과 비교하여 적어도 10% 감소된, 예를 들어 적어도 약 20% 감소된, 또는 적어도 약 30% 감소된, 또는 적어도 약 40% 감소된, 또는 적어도 약 50% 감소된, 또는 적어도 약 60% 감소된, 또는 적어도 약 70% 감소된, 또는 적어도 약 75% 감소된, 또는 적어도 약 80% 감소된, 또는 적어도 약 90% 감소된, 또는 100% 이하의 감소(즉, 참조 샘플과 비교하여 부재(absent) 수준), 또는 참조 수준과 비교하여 10% 내지 100% 사이의 임의의 감소를 의미한다.
용어 "통계적으로 유의한(statistically significant)" 또는 "유의하게(significantly)"는 통계적 유의성을 지칭하며, 일반적으로 마커의 정상 농도 또는 더 낮은 농도 미만의 2 표준 편차(two standard deviation, 2SD)를 의미한다. 이 용어는 차이가 있다는 통계적 증거를 지칭한다. 이는 귀무가설(null hypothesis)이 실제로 참인 경우, 귀무가설을 기각하기로 결정할 확률로 정의된다. 결정은 종종 p 값을 사용하여 이루어진다.
일부 구현예에서, 표적 유전자의 절단은 동형접합(homozygous) 표적 유전자의 절단이다. 일부 구현예에서, 표적 유전자의 절단은 하이브리드(hybrid) 표적 유전자의 절단이다.
Cas9 단백질(CRISPR-관련 엔도뉴클레아제 Cas9/Csn1로도 알려져 있음)은 1368개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드이다. Cas9 단백질의 예시적 아미노산 서열은 서열번호 18번으로 표시된다. Cas9는 crRNA에 비-상보적인 표적 DNA를 절단하는 RuvC-유사 도메인(잔기 7-22, 759-766 및 982-989), 및 crRNA에 상보적인 표적 DNA를 절단하는 HNH 뉴클레아제 도메인(잔기 810-872)을 포함하는, 두 개의 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다.
T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)는 주조직 적합 복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC) 상의 특정 항원 펩티드를 제시하는 이종-이량체(hetero-dimeric) 단백질 수용체이다. 면역계에서, pMHC 복합체에 대한 항원-특이적 TCR의 결합은 T 세포와 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cell, APC) 간의 직접적인 물리적 접촉을 촉발한 후, T 세포 상의 다른 세포막 표면의 분자가 APC 상의 분자와 상호 작용한다. 이는 일련의 차후의 세포 신호전달 및 다른 생리학적 반응을 초래하여, 상이한 항원-특이적 T 세포가 그것의 표적 세포에 대해 면역 효과를 발휘할 수 있게 한다.
TCR은 알파 사슬/베타 사슬 또는 감마 사슬/델타 사슬의 이종이량체의 형태로 세포막 표면상에 존재하는 당단백질이다. T 세포의 95%의 TCR 이종이량체가 알파 및 베타 사슬로 구성되는 반면, T 세포의 5%는 감마 및 델타 사슬로 구성되는 TCR을 갖는다. 본래의 αβ 이종이량체 TCR은 알파 사슬 및 베타 사슬을 가지며, 알파 사슬 및 베타 사슬은 αβ 이종이량체 TCR의 서브 유닛을 구성한다. 대체로, 알파 및 베타 사슬 각각은 가변 영역(variable region), 연결 영역(junction region) 및 불변 영역(constant region)을 포함하고, 베타 사슬은 또한 전형적으로 가변 영역과 연결 영역 사이에 짧은 다양성 영역(diversity region)을 함유하지만, 다양성 영역은 종종 연결 영역의 일부로서 간주된다. 각각의 가변 영역은 3개의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)인 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하며, 이는 프레임워크(framework) 영역 사이에 배치된다. CDR 영역은 pMHC 복합체에 대한 TCR의 결합을 결정하며, 여기에서 CDR3은 가변 영역 및 연결 영역에 의해 재조합적으로 형성되고, 초가변 영역(hypervariable region)으로 일컬어 진다. TCR의 알파 및 베타 사슬은 일반적으로 두 “도메인”, 즉 가변 도메인 및 불변 도메인을 가지는 것으로 간주되고, 가변 도메인은 연결 영역에 연결된 가변 영역으로 구성된다. TCR의 불변 도메인 서열은 국제 면역유전학 정보 시스템(International Immunogenetics Information System, IMGT)의 공공 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 예를 들어, TCR 분자의 α 사슬의 불변 도메인 서열은 “TRAC*01”이고, TCR 분자의 β 사슬의 불변 도메인 서열은 “TRBC1* 01" 또는 "TRBC2*01"이다. 또한, TCR의 알파 및 베타 사슬은 또한 막관통 및 세포질 영역을 함유하며, 여기에서 세포질 영역은 매우 짧다.
베타-2 마이크로글로불린으로도 알려져 있는 B2M은 MHC 클래스 I 분자의 경쇄이며, 따라서 MHC의 필수적인 부분이다. 인간에서, B2M은 15번 염색체상에 위치하는 b2m 유전자에 의해 암호화되며, 6번 염색체상에 위치하는 유전자군으로서 다른 MHC 유전자와 마주하고 있다. 인간으로부터 유래하는 단백질은 119개의 아미노산으로 구성되며, 11,800 달톤의 분자량을 갖는다. β-2 마이크로글로불린이 결핍된 쥣과 모델은 B2M이 세포 표면상에 MHC 클래스 I을 발현시키기 위해 그리고 펩티드-결합 틈새(peptide-bonding cleft)의 안정성을 위해 필요하다는 것을 보여주었다.
"PD-1" 또는 "PD1"은 50 - 55 kDa의 제 I형 막관통 수용체이며, 이는 활성화-유도된 아폽토시스로 고통받는 T 세포에서 원래 확인되었다. PD-1은 T 세포, B 세포 및 대식세포 상에서 발현된다. PD-1의 리간드는 B7 패밀리, PD-L1(B7-H1) 및 PD-L2(B7-DC)에 속한다.
PD-1은 면역글로불린(Ig) 슈퍼패밀리에 속하며, 세포 외 영역 내에 단일 IgV-유사 도메인을 함유한다. PD-1 세포질 도메인은 두 개의 티로신을 함유하며, 막에 더 가까운 것은 티로신(마우스 PD-1의 VAYEEL)은 면역수용체 티로신의 억제 모티프(inhibitory motif of the immunoreceptor tyrosine, ITIM) 내에 위치한다. PD-1 상의 ITIM은 이 분자가 세포질성 포스파타제(cytosolic phosphatase)를 동원(recruiting)함으로써 항원 수용체의 신호전달을 약화시키는 작용을 하는 것을 예측한다. 인간 및 쥣과 PD-1 단백질은 약 60%의 아미노산 동일성(identity)을 공유하며, 4개의 잠재적으로 보존된 N-글리코실화 부위 및 Ig-V 도메인을 규정하는 잔기가 존재한다. 카복시-말단 티로신(인간 및 마우스의 TEYATI) 주변의 세포질성 ITIM 및 ITIM-유사 모티프는 또한 인간과 쥣과의 상동유전자(orthologue) 사이에 보존된다.
II. 실시예 및 시험예
본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 설명되지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다.
본 발명의 실시예 또는 시험예에서 특정 조건이 구체적으로 명시되지 않은 실험 방법은 일반적으로 종래의 조건에 따라 또는 제조사가 권장하는 조건에 따라 수행되었다. 공급원이 구체적으로 명시되지 않은 시약은 일상적으로 시중에서 구입하였다.
실시예
실시예 1: PBMC 추출
감기 및 열 증상이 없는 건강한 지원자를 모집한 후, 사전 동의서에 서명하도록 하였다. 전문 의료진이 혈액 100 ml를 정맥에서 BD 항응고제 튜브 내로 채혈하였다. 혈액을 동량의 PBS 완충액(2% 소태아 혈청을 함유)과 혼합하였다. 피콜 완충액(GE Healthcare) 15 ml를 PBMC 분리 튜브인 셉메이트-50(Sepmate-50, STEMCELL Technology) 내로 첨가한 후, 혈액 및 PBS의 혼합물을 첨가하였다. 원심 분리 후에, 펠릿을 PBS에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 계수하고, 현탁액 10 ㎕에 0.1% 트리판 블루 10 ㎕를 첨가하고, 혼합한 후, 세포 수 및 생존율을 계산하였다.
실시예 2: T 세포의 정제
PBMC를 300 g에서 5분간 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 상당량의 PBS 완충액(2 mM EDTA 및 1% 소태아 혈청을 함유)을 첨가한 다음, 세포를 재현탁시키고, 세포 밀도를 5 × 107/ml로 조정하였다. 인간 T 세포를 스템셀 테크놀로지사(STEMCELL Technology)로부터 입수 가능한 이지셉TM 인간 T 세포 농축 키트(EasySepTM Human T Cell Enrichment Kit)를 이용하여 정제하였다. 우선, 혼합제(Cocktail)를 50 ㎕l/ml로 PBMC 현탁액에 첨가하고, 잘 혼합한 후, 실온에서 10분간 방치하였다. 그런 다음, 이지셉TM D 자철석 입자(EasySepTM D Magnetite Particles)를 50 ㎕/ml로 첨가하고, 잘 혼합한 후, 실온에서 5분간 방치하였다. 세포 현탁액을 5 ml 유동 튜브에 첨가하고, 자기 극(magnetic pole)에 5분간 방치하였다. 세포 현탁액을 빠르게 옮겨 붓고, PBS 완충액을 유동 튜브 내로 첨가하여 재현탁시킨 후, 이를 3번 반복하였다. 수득된 세포 현탁액을 300 g에서 5분간 원심 분리하고, 상청액을 버리고, 세포 펠렛을 론자(LONZA)로부터 입수 가능한 VIVO-15 배지에 재현탁시키고, 밀도를 1 × 106/ml로 조정한 후, rIL-2(R&D)를 첨가하여 농도를 100 IU/ml로 맞추었다. 그런 다음, 37℃의 세포 배양 인큐베이터에서 배양하였다.
실시예 3: T 세포 활성화
항-CD3/항-CD28 자성 비드(Life Technology)를 PBS 완충액(2 mM EDTA 및 1% 소태아 혈청 함유)에 재현탁시킨 다음, 자기 극에 2분간 방치한 후, 상청액을 버렸다. 위의 과정을 4번 반복하였다. 자성 비드를 세척한 다음, 정제된 T 세포 내로 1:1의 비율로 첨가하고, 혼합한 후, 37℃에서 3일간 배양하였다. 3일 후에, 자성 비드를 제거한 후, 표적 세포를 피펫으로 여러 번 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 자기 극에 놓고 2분간 방치한 후, 튜브 벽 상의 자성 비드를 버렸다.
실시예 4: CAR 바이러스를 이용한 T 세포의 감염
CAR 렌티바이러스 플라스미드의 제작:
CD19 CAR의 외부에서 내부로의 구조는 CD19 scFv, 힌지 구조, 막관통 구조, 4-1BB 및 CD3z이다. 발현 벡터는 CD19 CAR 및 벡터 pHR-CAR로 제작하였다. 렌티바이러스 플라스미드 pHR-CAR 및 두 보조 플라스미드인 dR8.91 및 pCMV-VSV-G를 티안젠(Tiangen)으로부터 입수 가능한 플라스미드 추출 맥시 키트(Plasmid Extraction maxi Kit)를 이용하여 추출하였다.
CAR 렌티바이러스의 패키징 및 농도:
형질감염 하루 전에 293T 세포(ATCC로부터 구입)를 75 cm2 배양 접시 상에 과성장시키고, 각각의 배양 접시별 배양 배지 15 ml를 이용하여 1:3의 비율로 계대하였다. Lipo3000의 절차에 따라 형질감염을 수행하였다. 형질감염 시스템은 다음과 같다:
Figure pct00001
시스템 1을 시스템 2와 잘 혼합하고, 5분간 방치하고 다시 혼합한 다음, 다시 10분간 방치하였다. 293T 세포를 조심스럽게 첨가하였다. 6시간 후, 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 48시간 후, 배양 배지를 수집하고, 4℃에 보관하였다. 새로운 배지 15 ml를 다시 첨가하고, 24시간 후에 상청액을 수집하였다. 수득된 바이러스 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시키고, 초원심 분리 튜브에 첨가하였다. 튜브를 50,000 g, 4℃에서 2시간 45분 동안 원심 분리시키고, 상청액을 조심스럽게 완전히 제거한 후, 육안으로 보이는 흰색의 바이러스 펠렛을 상청액 부피의 1%의 부피로 PBS 완충액을 이용해 재현탁시켰다. 재현탁시킨 바이러스를 4℃에서 약 30분간 용해시켰다. 완전히 용해된 후, 분취하여 -80℃의 냉동고에 저장하였다.
CAR 렌티바이러스를 이용한 T 세포의 감염:
인간 1차 T 세포를 항-CD3/항-CD28 자성 비드로 활성화시키고, 1일 후에 세포를 재현탁시키고, 자기 극에서 2분 동안 방치한 후, 세포 현탁액을 취하여 세포 계수를 실시하였다. 약 1 × 107 세포를 300 g에서 5분간 원심 분리시키고, 배지를 버린 후, 새로운 배지 1 ml를 첨가하여 세포를 재현탁시켰다. 농축된 렌티바이러스를 첨가하여 MOI를 5로 조절한 후, 잘 혼합하였다. 튜브를 2,000 g, 32℃에서 90분간 원심 분리시키고, 상청액을 버리고, 새로운 배지(100 IU/ml rIL-2)를 첨가하여 세포 밀도를 1 × 106 세포/ml로 조절한 후, 세포를 재현탁시키고, 새로 분리한 항-CD3/항-CD28 자성 비드를 첨가하였다. 37℃의 배양기 내에서 배양을 계속하였다. CAR-T 세포를 수득하였다.
실시예 5: TCR, B2M, PD1 유전자의 녹아웃
(1) crRNA의 설계
적절한 표적 영역을 TRAC, B2M 및 PD1의 뉴클레오티드 서열에 기초하여 선택하고, 17 - 20 nt 길이의 crRNA를 설계하였다. 본원에 이용된 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA와 crRNA를 연결시킴으로써 sgRNA를 형성하였다. 높은 녹아웃 효율 및 낮은 오프-타겟 비율을 가진 crRNA를 실험에 의해 선별하였다. 선택된 crRNA의 서열은 다음과 같다.
[표 1]
표적 유전자에 대한 crRNA
Figure pct00002
Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes)(Cas9 Nuclease NLS, S. Pyogenes, BioLabs)으로부터 유래되며, 상응하는 tracrRNA 서열(서열번호 17)은 다음과 같다:
Figure pct00003
본원에 이용되는 Cas9 단백질(NLS를 포함)의 아미노산 서열(서열번호 18)은 다음과 같다:
Figure pct00004
상술된 Case9 단백질에 상응하는 tracrRNA에 연결되고, 표 1에 나타낸 crRNA로 구성된 sgRNA를 제조하였으며, 여기에서 crRNA는 tracrRNA의 5' 말단에 위치하였다.
(2) sgRNA의 시험관 내 전사
sgRNA 주형의 PCR 증폭을 우선 수행하였다:
Figure pct00005
그런 다음, PCR 생성물을 회수하였다.
일반 DNA 생성물 정제 키트 Dp214의 매뉴얼(The Manual for Regular DNA Product Purification Kit Dp214)은 티안젠(Tiangen)으로부터 입수 가능하였으며, 참조로서 사용하였다. 시험관 내 sgRNA 전사를 위한 DNA를 수득하였다. sgRNA를 앰비온(Ambion)으로부터 입수 가능한 시험관 내 전사 키트인 메가숏스크립트TM 키트(MEGAshortscriptTM 키트, Cat# AM1354)를 이용하여 전사시켰다. 앰비온 메가클리어TM 키트(MEGAclearTM Kit, cat#AM1908)의 매뉴얼을 참조로서 사용하였다. 수득된 sgRNA를 분광광도계 및 변성 아가로스 겔 전기영동법에 의해 정제 및 검출한 후, 이들 모두가 적격이었고 사용을 위해 즉시 분취하였다.
(3) TRAC 유전자를 CRISPR-Cas9의 전기천공법을 통해 T 세포 내에서 녹아웃시켰다:
주로 론자(LONZA) 4D 전기천공 기구를 사용하여 수득된 CAR-T 세포를 전기-형질전환시켰으며(이 방법은 또한 1차 T 세포를 녹아웃시키는 데 적용됨), 사용된 키트는 P3 1차 세포 4D-뉴클레오펙터TM X(P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X) 키트였다.
우선, 전기천공 시스템을 제조하였다. 뉴클레오펙터 완충액 10 ㎕, Cas9 단백질 30 ㎍(약 9 ㎍/㎕) 및 sgRNA 4 ㎍를 혼합하고, 실온에서 10분간 항온처리하였다. CAR-T 세포를 3일 동안 활성화시킨 다음, 항-CD3/항-CD28 자성 비드를 자기 극을 통해 제거하였다. 튜브당 5 × 106 세포를 취하고, 300 g에서 5분간 원심 분리시켜 상청액을 완전히 제거하였다. 항온처리된 전기천공 시스템을 세포 펠릿에 첨가하고, 뉴클레오펙터 완충액 72 ㎕ 및 보충 완충액 18 ㎕를 추가로 첨가하고, 잘 혼합한 후, 론자-4D 전기천공법 기구 내에 배치된 론자 전기천공 큐벳 100 ㎕에 첨가한 다음, E0-115 절차에 따라 전기천공법을 수행하였다. 전기천공이 완료된 후, 전기천공 큐벳을 실온에서 5분간 세워두었다. 전기천공 큐벳으로부터 예열된 VIVO-15 배지 내로 세포를 옮기고, 세포 밀도를 1 × 106 세포/ml로 조정한 후, 37℃에서 배양하였다.
실시예 6: TCR-음성 세포의 선별
CRISPR-Cas9을 이용하여 CAR-T 세포로부터 TRAC를 녹아웃시킨 후, CAR-T 세포를 10일까지 배양하고, TCR-음성 세포를 농축하였다. 우선, 모든 세포를 300 g에서 5분간 원심 분리하고, PBS 완충액(2 mM EDTA 및 1% 소태아 혈청 함유)으로 두 번 세척하였다. 세포 밀도를 1 × 107 세포/ml로 조정한 다음, 비오틴(Biotin)-TCR 항체(독일의 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec)에서 구입)를 100 ㎕/ml로 첨가하고, 4℃에서 10분 동안 암소(darkness)에서 항온처리하였다. PBS 완충액으로 한 번 세척한 후, 세포 밀도를 1 × 107 세포/ml로 조절하고, 안티-비오틴 마이크로비드(Anti-Biotin Microbeads)를 50 ㎕/ml로 첨가한 다음, 4℃에서 15 동안 암소에 방치하였다. PBS 완충액으로 한 번 세척한 후, 세포를 완충액 500 ㎕에 재현탁시켰다. LD 컬럼(밀테니 바이오텍으로부터 구입)을 자기 극에 놓고, PBS 완충액 2 ml로 한 번 헹구었다. 그런 다음, 세포 현탁액 500 ㎕를 첨가하고, 표적 세포를 LD 컬럼에 통과시킨 후, LD 컬럼의 바닥으로부터 수집하였다. 세포 현탁액을 모두 통과시켰을 때, PBS 완충액 2 ml를 LD 칼럼에 로딩한 후, 이를 두 번 반복하였다. 수집된 세포 현탁액을 300 g에서 5분간 원심 분리하고, 예열된 배지에 재현탁시켰다.
시험예
시험예 1: TRAC의 CRISPR-Cas9-기반 녹아웃을 위해 가장 최적화된 crRNA를 선택하였다.
실시예 5에 나타낸 바와 같이 TRAC를 위해 설계된 crRNA 서열을 시험에서 비교하였다. sgRNA를 시험관 내 전사 후에 수득한 다음, Cas9 단백질을 활성화된 1차 T 세포 내로 전기천공시켰다. 48시간 후에 TCR 단백질의 세포 외 발현을 유세포 분석기로 검출하였다. 그 결과에 따르면, crRNA는 모두 TRAC 유전자를 다양한 정도로 녹아웃시킬 수 있고, 그 중에서 crRNA-11이 최고의 녹아웃 효율을 발휘하는 것으로 나타났다.
시험예 2: 상이한 전달 시스템의 비교 분석
3개의 전달 시스템은 각각 플라스미드, mRNA 및 RNP(단백질-RNA 복합체)였고, crRNA는 TRAC를 표적으로 하도록 설계되었으며, 맥시 플라스미드 추출을 실시예 4에 따라 수행하였다. Cas9 mRNA의 시험관 내 전사를 위해, T7 프로모터를 함유하는 DNA 템플릿을 T7 프라이머를 이용한 PCR에 의해 먼저 수득한 다음, 앰비온(Ambion)으로부터 입수 가능한 T7 시험관 내 전사 키트(in vitro Transcription Kit)를 이용한 시험관 내 전사에 의해 Cas9 mRNA를 수득하였다. sgRNA 및 Cas9 단백질 복합체를 실시예 5에 나타낸 바와 같은 방식으로 수득하였다. 5×106 Jurkat 세포를 원심 분리하고 상청액을 버렸다. 전기천공법 시스템 네온 MPK5000(Electroporation System Neon MPK5000, Invitrogen) 상에서 세 가지 상이한 전달 물질을 각각 이용하여 전기천공법을 실시하였다. 48시간 후에 0.5 × 106 세포를 취하여 PBS 완충액으로 두 번 세척하고, 완충액 100 ㎕로 재현탁시킨 다음, PE-TCR 항체(eBioscience) 10 ㎕를 첨가하고, 잘 혼합한 후, 4℃에서 30분 동안 항온처리하였다. PBS 완충액을 사용하여 한 번 세척한 후, 세포를 완충액 500 ㎕로 재현탁시키고, 유세포 분석기의 TCR 검출 채널로 로딩하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
시험예 3: 무작위 N-올리고 또는 이리 DNA는 TRAC를 녹아웃시키는 데 있어서 CRISPR-Cas9의 효율을 증가시킨다.
RNP 전달 시스템을 유전자를 녹아웃시키는 데 이용할 때, RNP를 N-올리고(올리고디옥시리보핵산) 또는 이리 DNA의 무작위 서열과 잘 혼합하고, 전기천공법에 의해 동시에 형질전환시켰다.
N-올리고의 예시적 서열은 다음과 같다:
Figure pct00006
실시예 5(3)에 기초하여, N-올리고 DNA의 100 - 200 nM을 RNP 복합체에 추가적으로 첨가하였으며, 이때 N-올리고 DNA는 PAGE 등급이었다. TRAC를 녹아웃시키는데 있어서 CRISPR-Cas9의 효율에 대한 N-올리고의 효과를 도 2A 내지 도 2B에 나타내었다. 그 결과에 따르면, N-올리고는 T 세포 및 CAR-T 세포 모두에서 TRAC 유전자를 녹아웃시키는 데 있어서 CRISPR-Cas9의 효율을 효과적으로 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 5(3)에 기초하여, 이리 DNA 단편의 100 - 200 nM를 RNP 복합체에 추가적으로 첨가하고, TRAC를 녹아웃시키는 데 있어서의 효율에 대한 이리 DNA 단편의 효과를 도 3에 나타내었다. 그 결과에 따르면, 이리 DNA 단편은 TRAC 유전자를 녹아웃시키는 효율을 증가시키고, 그 효율이 N-올리고의 효율보다 높은 것으로 나타났다.
시험예 4: T 세포에서 B2M , PD1을 녹아웃시키는 효율의 검출
마찬가지로, crRNA의 수를 설계하고, 비교 실험 후에 B2M 유전자를 녹아웃시키기 위해 최고 녹아웃 효율 및 최저 오프-타겟 비율을 가진 crRNA를 선택하였다. 실시예 5(3)에 기재된 바와 같은 방법에 기초하여, RNP 전달 시스템 및 N-올리고를 이용하여 T 세포에서 B2M 및/또는 PD1 유전자를 녹아웃시켰다.
B2M 단백질의 경우, B2M 유전자의 발현이 세포막 상의 HLA-ABC의 디스플레이(display)와 밀접하게 관련이 있기 때문에, APC-HLA-ABC 항체(eBioscience)를 사용하여 B2M 유전자 녹아웃 효율을 검출하였다. 그 결과에 따르면(도 4에 나타냄), B2M 유전자 녹아웃 효율은 80%를 초과하는 것으로 나타났다.
PD1 유전자의 경우, RNP 및 N-올리고의 혼합물을 이용하여 세포를 48시간 동안 전기천공하고, 1×106 세포를 취하여 PBS 완충액으로 두 번 세척한 후, 상청액을 완전히 흡입시켰다. T7E1 실험을 진아트® 게놈 절단 검출 키트(GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kit, Thermo Fisher)의 매뉴얼에 따라 수행하였고, 그 결과에 따르면(도 5에 나타냄), PD1에 대하여 선택된 3개의 crRNA는 모두 PD1 유전자를 효과적으로 녹아웃시킬 수 있으며, 녹아웃 효율은 모두 80%를 초과하는 것으로 나타났다.
시험예 5: CRISPR-Cas9에 의해 초래된 유전자 돌연변이의 분석
프라이머를 먼저 TRAC, B2M 및 PD1 유전자의 표적 부위 근처에 설계하였다. CRISPR-Cas9 시스템에 기초하여 RNP+N-올리고 또는 이리 DNA 단편을 이용하여 T 세포에서 TRAC, B2M 및 PD1을 녹아웃시키고, 1×106의 정상 T 세포 및 유전자가 녹아웃된 T 세포 둘 다로부터 게놈 DNA를 각각 추출하였다. 수득된 PCR 생성물 DNA 단편을 T-평활 말단(T-Blunt end)(pEASY-Blunt Simple Cloning Kit, Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.)을 가진 벡터에 연결시킨 다음, 수득된 벡터를 암피실린-내성 고체 플레이트 상에 도말된 TOP10 컴피턴트(competent) 세포 내로 형질전환시켰다. 다음날, 수득된 클론을 서열분석하고, 플레이트당 적어도 30개의 클론을 서열분석하였다. 수득된 서열분석 결과를 야생형 서열에 정렬하고, 그 결과(도 6A 내지 도 6B에 나타낸 바와 같이, PD1 돌연변이에 대한 결과는 도시되지 않음) CRISPR-Cas9는 crRNA에 상응하는 게놈 DNA 부위의 3개의 유전자에서 각각 유전자 돌연변이를 초래하는 것으로 나타났다.
시험예 6: 오프 - 타겟의 분석
가능한 오프-타겟 부위는 설계된 crRNA에 기초하여, http://crispr.mit.edu/에서 예측하였다. TRAC, B2M 및 PD1에 대하여 8 또는 9개의 잠재적 오프-타겟 부위(OT1-OT9)를 각각 선택하였다. 프라이머는 PCR 증폭 및 서열분석을 위해 이들 잠재적 오프-타겟 부위에 대하여 설계하였다. 세포에서 녹아웃된 게놈 DNA의 오프-타겟 부위 및 대조군(표적 유전자 TRAC, B2M 또는 PD1)에 대한 피크 맵핑(peak mapping) 서열분석 결과를 웹사이트 https://tide.nki.nl/상의 TIDE에 의해 정렬하였고, 그 결과는 도 7A 내지 도 7C에 나타낸 바와 같이, 선택된 crRNA 및 녹아웃 방법의 오프-타겟 비율은 극히 낮은 것으로 나타났다.
시험예 7: 세포의 신호전달 경로 및 살상 활성 둘 다에 대한 TCR 녹아웃 효과의 분석
CD3 항체 용액(5 ㎍/ml)을 제조하고, 96-웰 플레이트 상에 코팅하였다. 100 ㎕의 부피로 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 취하여 PBS로 두 번 세척하였다. TCR-음성 T 세포 및 정상 T 세포를 각각 첨가하였고, 세포 밀도는 1 × 106 세포/ml였다. 37℃에서 24시간 동안 항온처리한 후, 플레이트를 취하여 CD25 및 CD69에 특이적인 항체로 염색하였고, 그 결과에 따르면(도 8A 및 도 8B에 나타낸 바와 같음) TRAC 유전자가 녹아웃된 T 세포는 CD3 항체에 의해 CD25 및 CD69를 발현하도록 유도될 수 없는 것으로 나타났다. TCR(CD19에 대한)-양성 CAR-T 및 TCR-음성(예컨대, TRAC의 녹아웃) CAR-T 세포의 CD19-양성 종양 세포주 K562-CD19에 대한 살상 효과의 비교는 TCR 녹아웃이 CAR-T의 살상 효과에 유의적으로 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다.
명확한 이해를 위해, 본 발명은 도면 및 실시예의 도움으로 상세하게 설명되었지만, 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 명백하게 포함된다.
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD. 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Sequence <220> <223> crRNA-8 <400> 8 guuccuguga ugucaagc 18 <210> 9 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA-9 <400> 9 ucaaaaccug ucagugau 18 <210> 10 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA-10 <400> 10 gaauccuccu ccugaaag 18 <210> 11 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA-11 <400> 11 gguacacggc aggguca 17 <210> 12 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA-12 <400> 12 gagaaucaaa aucggugaau 20 <210> 13 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA-13 <400> 13 guagcgcgag cacagcua 18 <210> 14 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA-14 <400> 14 cgacuggcca gggcgccugu 20 <210> 15 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA-15 <400> 15 gugcuacaac ugggcugg 18 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> crRNA-16 <400> 16 ggcgcccugg ccagucgucu 20 <210> 17 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 17 guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60 ggcaccgagu cggugcuuuu 80 <210> 18 <211> 1378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of the Cas9(including NLS) protein <400> 18 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu 1045 1050 1055 Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1075 1080 1085 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1090 1095 1100 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1125 1130 1135 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1140 1145 1150 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1155 1160 1165 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys 1185 1190 1195 1200 Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1205 1210 1215 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr 1220 1225 1230 Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His 1250 1255 1260 Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1265 1270 1275 1280 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys 1285 1290 1295 His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu 1300 1305 1310 Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp 1315 1320 1325 Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp 1330 1335 1340 Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile 1345 1350 1355 1360 Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Met 1365 1370 1375 Asp Lys <210> 19 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> random N-oligo <400> 19 tcatgtggtc ggggtagcgg ctgaagcact gcacgccgta cgtcagggtg gtcacgaggg 60 tgggccaggg cacgggcagc ttgccggtgg tgcagatgaa cttcagggtc agcttgccgt 120 aggtggc 127

Claims (26)

  1. 시험관 내(in vitro)에서 T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 녹아웃(knocking out)시키는 방법으로서, 상기 방법은
    1) T 세포 내 하나 이상의 표적 유전자(들)를 표적으로 하는 sgRNA를 Cas9 단백질과 각각 접촉시켜 단백질-RNA 복합체를 형성하는 단계;
    2) 단백질-RNA 복합체를 올리고디옥시리보핵산 또는 이리(milt) DNA 단편과 혼합하고; 수득된 혼합물을 T 세포 내로 형질전환시키는 단계
    를 포함하며, 여기에서 sgRNA는 Cas9 단백질을 표적 유전자의 상응하는 표적 서열로 유도하고 표적 서열과 혼성화함으로써 표적 유전자가 절단되고, 표적 유전자의 절단 효율은 75%를 초과하는 방법
  2. 제1항에 있어서,
    표적 유전자는 TRAC, TRBC, B2M 및 PD1 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, sgRNA는 표적 유전자의 코딩 서열(coding sequence) 또는 표적 유전자의 발현을 위한 조절 서열(regulatory sequence)을 표적으로 하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    sgRNA는 5'에서 3' 방향으로 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA에 연결된 17 - 20 nt 길이의 표적 유전자를 표적으로 하는 crRNA로 구성되는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고디옥시리보핵산은 100 - 250 bp 길이를 갖는 이중 가닥 DNA 또는 100 - 250 nt 길이를 갖는 단일 가닥 DNA인 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    TRAC 유전자를 표적으로 하는 crRNA는 서열번호 1 - 12로 표시된 바와 같은 crRNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,
    B2M 유전자를 표적으로 하는 crRNA는 서열번호 13으로 표시되고, 그리고
    PD1 유전자를 표적으로 하는 crRNA는 서열번호 14 - 16으로 표시된 바와 같은 crRNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    Cas9 단백질은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터 유래되는 Cas9 단백질인 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA의 서열은 서열번호 17로 표시되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    T 세포는 보조 T 세포(helper T cell), 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 기억 T 세포(memory T cell), 조절 T 세포(regulatory T cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), γδT 세포, CAR-T 세포 및 TCR-T 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 녹아웃된 표적 유전자를 갖는 T 세포로서,
    T 세포는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 T 세포.
  10. 표적 유전자 녹아웃에 사용하기 위한 crRNA로서,
    crRNA는 서열번호 1 - 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 crRNA.
  11. 제10항에 있어서,
    표적 유전자는 TRAC, TRBC, B2M 및 PD1 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 crRNA.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    표적 유전자는 TRAC 유전자이고, crRNA는 서열번호 1 - 12로 표시되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 crRNA.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    표적 유전자는 B2M 유전자이고, crRNA의 서열은 서열번호 13으로 표시되는 것인 crRNA.
  14. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    표적 유전자는 PD1 유전자이고, crRNA는 서열번호 14 - 16으로 표시되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 crRNA.
  15. 표적 유전자의 녹아웃에 사용하기 위한 sgRNA로서,
    sgRNA는 Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA에 연결된 crRNA로 구성되고, crRNA는 서열번호 1 - 16으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 sgRNA.
  16. 제15항에 있어서,
    표적 유전자는 TRAC, TRBC, B2M 및 PD1 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 sgRNA.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    표적 유전자는 TRAC 유전자이고, crRNA는 서열번호 1 - 12로 표시되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 sgRNA.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    표적 유전자는 B2M 유전자이고, crRNA는 서열번호 13으로 표시되는 것인 sgRNA.
  19. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    표적 유전자는 PD1 유전자이고, crRNA는 서열번호 14 - 16으로 표시되는 것으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 sgRNA.
  20. 제15항에 있어서,
    Cas9 단백질은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래되는 Cas9 단백질인 것인 sgRNA.
  21. 제15항에 있어서,
    Cas9 단백질에 상응하는 tracrRNA의 서열은 서열번호 17로 표시되는 것인 sgRNA.
  22. 유전자 녹아웃에 사용하기 위한 키트로서, 상기 키트는
    a: 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 crRNA, 또는 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 sgRNA;
    b: Cas9 단백질;
    c: 올리고디옥시리보핵산 또는 이리 DNA 단편
    을 포함하는 키트.
  23. 제22항에 있어서,
    올리고디옥시리보핵산은 100 - 250 bp 길이를 갖는 이중 가닥 DNA 또는 100 - 250 nt 길이를 갖는 단일 가닥 DNA인 것인 키트.
  24. 제22항에 있어서,
    Cas9 단백질은 서열번호 18의 아미노산 서열을 갖는 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래되는 Cas9 단백질인 것인 키트.
  25. 항종양제의 제조를 위한, 제9항의 녹아웃된 표적 유전자를 갖는 T 세포의 용도.
  26. 바이러스 또는 세균에 의해 초래되는 감염성 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제9항의 녹아웃된 표적 유전자를 갖는 T 세포의 용도.
KR1020207000299A 2017-06-20 2018-06-19 시험관 내에서 Ｔ 세포 내 표적 유전자를 녹아웃시키는 방법 및 그 방법에 이용되는 ｃｒＲＮＡ KR20200018572A (ko)

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