KR20230090337A - Crispr 유형 v 시스템을 위한 dna-함유 폴리뉴클레오티드 및 가이드, 및 그의 제조 및 사용 방법 - Google Patents

Crispr 유형 v 시스템을 위한 dna-함유 폴리뉴클레오티드 및 가이드, 및 그의 제조 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 유형 V CRISPR 시스템에서 사용하기 위한 가이드를 제공하며, 여기서 이러한 가이드는 리보뉴클레오티드 염기 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 함유한다. 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 함유하는 CRISPR Cas12 가이드 뿐만 아니라 유형 V CRISPR-Cas12 단백질과 이러한 가이드의 핵단백질 복합체가 또한 기재된다. 또한 데옥시리보뉴클레오티드-함유 폴리뉴클레오티드 및 가이드를 제조하고 사용하는 방법과, 핵단백질 복합체를 제조하고 사용하는 방법이 개시되어 있다. 또한 CAR-발현 세포를 생산하기 위해 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 세포를 조작하는 방법; 및 입양 세포 요법에서의 이러한 CAR-발현 세포의 용도가 개시되어 있다.

Description

CRISPR 유형 V 시스템을 위한 DNA-함유 폴리뉴클레오티드 및 가이드, 및 그의 제조 및 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 8월 5일에 출원된 미국 가출원 번호 63/229,870, 2020년 12월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 63/127,648, 및 2020년 10월 19일에 출원된 미국 가출원 번호 63/093,459를 우선권 주장하며, 이들 모두는 본원에 참조로 포함된다.
연방 정부의 지원을 받는 연구 또는 개발에 관한 설명서
적용 가능하지 않음.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2021년 10월 15일에 생성된, 상기 ASCII 카피는 CBI039.30_ST25.txt로 명명되고 그 크기가 165 킬로바이트이다.
기술 분야
본 개시내용은 일반적으로 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 시스템에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 CRISPR-Cas12 시스템에서 사용하기 위한 CRISPR 폴리뉴클레오티드 및 가이드에 관한 것이며, 여기서 CRISPR 폴리뉴클레오티드 및 Cas12 가이드는 리보뉴클레오티드 염기 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하도록 설계된다. 본 개시내용은 추가로, 설계된 CRISPR Cas12 가이드 및 CRISPR-Cas12 단백질을 포함하는 Cas12 가이드/핵단백질 복합체, 및 이러한 Cas12 가이드/핵단백질 복합체를 사용하는 변형된 세포의 생산에 관한 것이다. 본 개시내용은 추가로 CRISPR 폴리뉴클레오티드, Cas12 가이드 및 Cas12 가이드/핵단백질 복합체를 함유하는 조성물, 및 이를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다. 더 나아가, 본 개시내용은, 예를 들어, 암 치료를 위한 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 세포의 생성에 있어서, 본 개시내용의 Cas12 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 변형된 세포의 생산 및 치료적 용도에 관한 것이다.
클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 및 CRISPR-연합 (Cas) 단백질 시스템은 많은 원핵생물 (박테리아 및 고세균)의 게놈에서 발견된다. 이러한 시스템은 원핵생물에서 외부 침입자 (예를 들어, 바이러스, 박테리오파지)에 대항한 적응 면역을 제공한다. 이러한 방식으로, CRISPR 시스템은 외부 침입자로부터 원핵생물을 방어하는데 도움이 되는 일종의 면역 시스템으로서 기능한다. 예를 들어, 문헌 [Barrangou et al. (Science, 2007, 315:1709-1712); Makarova et al. (Nature Reviews Microbiology, 2011, 9:467-477); Garneau et al. (Nature, 2010, 468:67-71); Sapranauskas et al. (Nucleic Acids Research, 2011, 39:9275-9282); Koonin et al. (Curr . Opin . Microbiol ., 2017, 37:67-78); Shmakov et al. (Nat. Rev. Microbiol., 2017, 15(3):169-182); Makarova et al. (Nat. Rev. Microbiol ., 2020, 18:67-83)]을 참조한다.
CRISPR-Cas 면역 체계에는 (1) 획득, (2) 발현 및 (3) 간섭의 3가지 주요 단계가 있다. 획득은 침입 바이러스 및 플라스미드의 게놈을 절단하고 게놈 DNA의 세그먼트 (프로토스페이서라고 함)를 숙주 유기체의 CRISPR 로커스에 통합하는 것을 수반한다. 숙주 게놈에 통합되는 세그먼트는 스페이서로서 공지되어 있으며, 동일한 (또는 충분히 관련된) 바이러스 또는 플라스미드에 의한 후속 공격으로부터의 보호를 매개한다. 발현은 각각 단일 스페이서 서열을 함유하는 짧은 성숙한 CRISPR RNA를 생산하기 위한 CRISPR 로커스의 전사 및 후속 효소적 프로세싱을 수반한다. 간섭은 CRISPR RNA가 Cas 단백질과 연합하여 이펙터 복합체를 형성한 후에 유도되며, 이는 이어서 외래 유전 요소 내의 상보적 프로토스페이서를 표적으로 하여 핵산 분해를 유도한다.
천연 숙주 내의 다양한 CRISPR-Cas 시스템은 DNA 표적화 (클래스 1 유형 I; 클래스 2 유형 II 및 V), RNA 표적화 (클래스 2 유형 VI), 및 공동 DNA 및 RNA 표적화 (클래스 1 유형 III)가 가능하다. 예를 들어, 문헌 [Makarova et al. (Nat. Rev. Microbiol ., 2015, 13:722-736); Shmakov et al. (Nat. Rev. Microbiol ., 2017, 15:169-182); Abudayyeh et al. (Science, 2016, 353:1-17); and Makarova et al. (The CRISPR Journal, 2018, 1:325-336)]을 참조한다.
유형 V 시스템은, 예를 들어, V-A, V-B, V-C, V-D, V-E, V-F, V-G, V-H, V-I, V-J, V-K 및 V-U를 포함한 여러 상이한 하위유형으로 분류된다. 예를 들어, 문헌 [Makarova et al. (Nat. Rev. Microbiol ., 2020, 18:67-83) and Pausch et al. (Science, 2020, 369(6501):333-337)]을 참조한다. V-A 하위유형은 Cas12a 단백질 (이전에는 Cpf1로서 공지됨)을 코딩한다. Cas12a는 Cas9의 각각의 도메인과 상동인 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 가지고 있지만, Cas9 단백질에 존재하는 HNH 뉴클레아제 도메인이 결여된다.
유형 V 시스템은 파르쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium) GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) MC2017 (Lb3 Cpf1), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus) (BpCpf1), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium) GW2011_GWA_33_10 (PeCpf1), 아시다미노코쿠스 종(Acidaminococcus sp .) BV3L6 (AsCpf1), 포르피로모나스 마카카에(Porphyromonas macacae) (PmCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 (LbCpf1), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis) (PcCpf1), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens) (PdCpf1), 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi) 237 (MbCpf1), 스미텔라 종(Smithella sp .) SC_K08D17 (SsCpf1), 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai) (LiCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020 (Lb2Cpf1), 프란시스셀라 노비시다(Franciscella novicida) U112 (FnCpf1), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus methanoplasma termitum) (CMtCpf1), 및 유박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens) (EeCpf1)를 포함한 여러 박테리아에서 확인되었다.
CRISPR-Cas 시스템은 특이적 핵산 서열을 결실, 삽입, 돌연변이 또는 치환함으로써 부위-지정 게놈 편집을 위한 강력한 도구를 제공한다. 변경은 유전자- 또는 위치-특이적일 수 있다. 게놈 편집은 부위-지정 뉴클레아제, 예컨대 Cas 단백질 및 그의 동족 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표적 핵산을 커팅함으로써 변경을 위한 부위를 생성할 수 있다. 특정 경우에, 절단은 표적 DNA 서열 내에 이중-가닥 파손부 (DSB)를 도입할 수 있다. DSB는, 예를 들어, 비상동 단부 연결 (NHEJ), 미세 상동성-매개 단부 연결 (MMEJ), 또는 상동성-지향 복구 (HDR)에 의해 복구될 수 있다. HDR은 복구를 위한 템플릿의 존재에 의존한다. 이러한 게놈 편집의 일부 예에서, 공여자 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부분이 파손부에 삽입될 수 있다.
본 개시내용은 유형 V CRISPR-Cas 시스템에서 사용하기 위한 새로운 폴리뉴클레오티드 및 가이드의 발견에 기초하며, 이러한 폴리뉴클레오티드 및 가이드는 리보뉴클레오티드 염기 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함한다. 개시된 가이드는 유형 V CRISPR-Cas 단백질, 예컨대 Cas12a와 복합체 형성될 때, 강력한 온-표적 편집 및 감소된 오프-표적 게놈 편집이 가능하다.
이러한 게놈 편집 프로세스는 치료적 적용에 유용한 유전적으로 변형된 세포를 생성하는데 특히 유용한다. 예를 들어, 이러한 게놈 편집 프로세스를 통해, 면역 세포 (예컨대 T 세포)가 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 이러한 CAR-발현 세포는, 예를 들어, 입양 면역요법에서 유용하며, 여기서 CAR-발현 면역 세포, 예컨대 T-세포 (CAR-T 세포)는 CAR에 의해 인식된 표적 항원 (예를 들어, 외래 항원 또는 암-연관 항원)을 발현하는 세포를 표적으로 하기 위해 환자에게 주입될 수 있다.
본 개시내용의 비-제한적 실시양태는 하기와 같은 것을 포함한다.
[1] 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역; 및 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 활성화 영역을 포함하는 CRISPR 가이드 분자로서, 여기서 상기 CRISPR 가이드 분자는 리보뉴클레오티드 염기 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인 CRISPR 가이드 분자.
[2] CRISPR 가이드 분자가 활성화 영역, 표적화 영역, 또는 둘 다에 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [1]의 CRISPR 가이드 분자.
[3] CRISPR 가이드 분자가 이노신, 데옥시-이노신, 데옥시-우라실, 크산토신, C3 스페이서, 5-메틸 dC, 5-히드록시부틸-2'-데옥시우리딘, 5-니트로인돌, 5-메틸 이소-데옥시시토신, 이소 데옥시구아노신, 데옥시우리딘 및 이소 데옥시시티딘으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기 유사체를 추가로 포함하는 것인, [1]의 CRISPR 가이드 분자.
[4] CRISPR 가이드 분자가 하나 이상의 무염기 부위를 추가로 포함하는 것인, [1]의 CRISPR 가이드 분자.
[5] CRISPR 가이드 분자가 RNA 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGUCUCUCAGCUGGUACAC를 포함하는 CRISPR 가이드 분자 - 여기서 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기로 대체되고, 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체됨 - ; 및 RNA 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAGUGGGGGUGAAUUCAGUGU를 포함하는 CRISPR 가이드 분자 - 여기서 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기로 대체되고, 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체됨 -로부터 선택되는 것인, [1]의 CRISPR 가이드 분자.
[6] CRISPR 가이드 분자 내의 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양이 CRISPR 가이드 분자의 전체 크기의 백분율로서 50% 이하인, [5]의 CRISPR 가이드 분자.
[7] CRISPR 가이드 분자 내의 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양이 가이드 분자의 전체 크기의 백분율로서 25% 이하인, [6]의 CRISPR 가이드 분자.
[8] 표적화 영역 내의 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양이 표적화 영역의 전체 크기의 백분율로서 25% 이하인, [5]의 CRISPR 가이드 분자.
[9] 표적화 영역 내의 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양이 표적화 영역의 전체 크기의 백분율로서 5% 이하인, [8]의 CRISPR 가이드 분자.
[10] 활성화 영역 내의 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양이 활성화 영역의 전체 크기의 백분율로서 50% 이하인, [5]의 CRISPR 가이드 분자.
[11] 활성화 영역 내의 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양이 활성화 영역의 전체 크기의 백분율로서 25% 이하인, [10]의 CRISPR 가이드 분자.
[12] CRISPR 가이드 분자가, 표적 핵산 서열과 결합하고 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 RNA-단독 CRISPR 가이드 분자와 비교 시 감소된 오프-표적 활성을 갖는 것인, [5]의 CRISPR 가이드 분자.
[13] 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [5]의 CRISPR 가이드 분자.
[14] 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40 중 15개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [13]의 CRISPR 가이드 분자.
[15] 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40 중 12개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [14]의 CRISPR 가이드 분자.
[16] CRISPR 가이드 분자가 RNA 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU를 포함하는 활성화 영역을 함유하며, 여기서 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기로 대체되고, 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체되는 것인, [2]의 CRISPR 가이드 분자.
[17] 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 및 19 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [16]의 CRISPR 가이드 분자.
[18] 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 및 19 중 10개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [17]의 CRISPR 가이드 분자.
[19] 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 및 19 중 8개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [18]의 CRISPR 가이드 분자.
[20] CRISPR 가이드 분자가 RNA 서열 GAGUCUCUCAGCUGGUACAC를 포함하는 표적화 영역을 함유하며, 여기서 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기로 대체되고, 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체되는 것인, [2]의 CRISPR 가이드 분자.
[21] 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [20]의 CRISPR 가이드 분자.
[22] 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 5개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [21]의 CRISPR 가이드 분자.
[23] 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 3개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [22]의 CRISPR 가이드 분자.
[24] CRISPR 가이드 분자가 RNA 서열 AGUGGGGGUGAAUUCAGUGU를 포함하는 표적화 영역을 함유하며, 여기서 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기로 대체되고, 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체되는 것인, [2]의 CRISPR 가이드 분자.
[25] 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [24]의 CRISPR 가이드 분자.
[26] 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 5개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [25]의 CRISPR 가이드 분자.
[27] 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 3개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [26]의 CRISPR 가이드 분자.
[28] CRISPR 가이드 분자가 서열 TAAUUUCUACUCUTGUAGAUGAGUCUCUCAGCUGGUACAC를 포함하며, 여기서 서열 내의 위치 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 13, 16, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 및 39는 리보뉴클레오티드 염기를 포함하고, 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 21, 31, 및 40은 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [5]의 CRISPR 가이드 분자.
[29] CRISPR 가이드 분자가 서열 TAAUUUCUACUCUTGUAGAUAGUGGGGGUGAAUUCAGUGT를 포함하며, 여기서 서열 내의 위치 2, 4, 5, 6, 8, 9, 11, 13, 16, 17, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 및 39는 리보뉴클레오티드 염기를 포함하고, 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 19, 21, 31, 및 40은 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [5]의 CRISPR 가이드 분자.
[30] 활성화 영역이 20개 염기 길이이고, 20개-뉴클레오티드 활성화 영역 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 및 19 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [2]의 CRISPR 가이드 분자.
[31] 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 및 19 중 10개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [30]의 CRISPR 가이드 분자.
[32] 서열 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 및 19 중 8개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [31]의 CRISPR 가이드 분자.
[33] 표적화 영역이 20개 염기 길이이고, 20개-뉴클레오티드 표적화 영역 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [2]의 CRISPR 가이드 분자.
[34] 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 5개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [33]의 CRISPR 가이드 분자.
[35] 서열 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 3개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인, [34]의 CRISPR 가이드 분자.
[36] [1]-[35] 중 어느 하나의 CRISPR 가이드 분자; 및 Cas12 단백질을 포함하는, CRISPR 핵산/단백질 조성물.
[37] CRISPR 가이드 분자가 Cas12 단백질과 복합체를 이루는 것인, [36]의 CRISPR 핵산/단백질 조성물.
[38] Cas12 단백질이 Cas12a 단백질인, [36]의 CRISPR 핵산/단백질 조성물.
[39] Cas12 단백질이 C-말단에, 서열식별번호(SEQ ID NO): 479-490으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 링커- 및 NLS-함유 서열을 포함하는 것인, [36]-[38] 중 어느 하나의 CRISPR 핵산/단백질 조성물.
[40] 링커- 및 NLS-함유 서열이 서열식별번호: 483, 485, 487 및 489로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, [39]의 CRISPR 핵산/단백질 조성물.
[41] [1]-[35] 중 어느 하나의 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 세포.
[42] Cas12 단백질을 추가로 포함하는 [41]의 세포.
[43] Cas12 단백질이 Cas12a 단백질인, [42]의 세포.
[44] Cas12 단백질이 C-말단에, 서열식별번호: 479-490으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 링커- 및 NLS-함유 서열을 포함하는 것인, [42] 또는 [43]의 세포.
[45] 링커- 및 NLS-함유 서열이 서열식별번호: 483, 485, 487 및 489로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, [44]의 세포.
[46] CRISPR 가이드 분자가 Cas12 단백질과 복합체를 이루는 것인, [42]-[45] 중 어느 하나의 세포.
[47] 세포가 원핵 세포 또는 진핵 세포인, [41]-[46] 중 어느 하나의 세포.
[48] 세포가 단세포 진핵 유기체, 진핵 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물로부터의 세포, 조류 세포, 진균 세포, 동물 세포, 무척추동물로부터의 세포, 척추동물로부터의 세포, 포유동물로부터의 세포, 줄기 세포 및 전구 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 진핵 세포인, [47]의 세포.
[49] 세포가 림프구, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, T 세포 수용체 (TCR) 세포, TCR-조작된 CAR-T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), CAR TIL, 수지상 세포 (DC), CAR-DC, 대식세포, CAR-대식세포 (CAR-M), 자연 살해 (NK) 세포, 또는 CAR-NK 세포인, [48]의 세포.
[50] 세포가 CAR-T 세포인, [49]의 세포.
[51] 공여자 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, [41]-[50] 중 어느 하나의 세포.
[52] 제1 표적 핵산 서열을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제1 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 제1 CRISPR 가이드 분자는 [1]-[35] 중 어느 하나의 CRISPR 가이드 분자를 포함하고, 제1 CRISPR 가이드 분자의 표적화 영역은 제1 표적 핵산 서열과 혼성화할 수 있고, 핵단백질 복합체는 제1 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인, 표적 핵산 서열을 절단하는 방법.
[53] 공여자 폴리뉴클레오티드를 제공하는 단계를 추가로 포함하는, [52]의 방법.
[54] 표적 핵산 서열이 절단되어 절단 부위를 제공하는 것이며, 상기 표적 핵산 서열을 변형시키는 단계를 추가로 포함하는 [53]의 방법.
[55] 변형 단계가 절단 부위에 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 삽입하는 것을 포함하는 것인, [54]의 방법.
[56] 변형 단계가 절단 부위에서 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시키는 것을 포함하는 것인, [54]의 방법.
[57] 표적 핵산 서열이 세포 내에 있는 것인, [55]의 방법.
[58] 세포가 진핵 세포를 포함하는 것인, [57]의 방법.
[59] 공여자 폴리뉴클레오티드가 CAR 발현 벡터를 포함하는 것인, [58]의 방법.
[60] 바이러스 벡터를 사용하여 CAR 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 [59]의 방법.
[61] 상기 도입 단계가 형질도입을 포함하는 것인, [60]의 방법.
[62] 그 결과로 생성된 세포가 림프구, CAR-T 세포, TCR 세포, TCR-조작된 CAR-T 세포, TIL, CAR TIL, 수지상 세포, CAR-DC, 대식세포, CAR-M, NK 세포 또는 CAR-NK 세포를 포함하는 것인, [57]-[61] 중 어느 하나의 방법.
[63] 제1 표적 핵산 서열이 TRAC; TRBV; 베타-2 마이크로글로불린 (B2M); PD1; PD-L1; CTLA-4; LAG-3; TIGIT; TIM3; HLA-E; HLA-A; HLA-B; HLA-C; HLA-DRA; ADAM17; BTLA; CD160; SIGLEC10; 2B4; LAIR1; CD52; CD96; VSIR; VISTA; KIR2DL1; KIR2DL2; KIR2DL3; CEACAM1; CBLB; CISH; IL-1R8; AHR; 아데노신 2A 수용체; GMCSF; VISTA; CII2A; 및 NKG2A로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 표적 유전자 내에 있는 것인, [52]-[62] 중 어느 하나의 방법.
[64] CAR 발현 벡터가 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 CAR을 코딩하는 것인, [59]-[61] 중 어느 하나의 방법.
[65] CAR 발현 벡터가 힌지 영역, 막횡단 영역, 및 하나 이상의 세포내 신호전달 영역을 추가로 코딩하는 것인, [64]의 방법.
[66] 세포외 리간드-결합 도메인이 이뮤노글로불린 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 것인, [64] 또는 [65]의 방법.
[67] scFv가 CD37, CD38, CD47, CD73, CD4, CS1, PD-L1, NGFR, ENPP3, PSCA, CD79B, TACI, VEGFR2, B7-H3, B7-H6, B-세포 성숙 항원 (BCMA), CD123, CD138, CD171/L1CAM, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD70, CD371, CEA, 클라우딘(Claudin) 18.1, 클라우딘 18.2, CSPG4, EFGRvIII, EpCAM, EphA2, 표피 성장 인자 수용체, ErbB, ErbB2 (HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, 글리피칸 3, IL-11Rα, IL-13Rα2, IL13 수용체 알파, 루이스Y/LeY, 메소텔린, MUC1, MUC16, NKG2D 리간드, PD1, PSMA, ROR-1, SLAMF7, TAG72, ULBP 및 MICA/B 단백질, VEGF2 및 WT1로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 표적과 결합할 수 있는 것인, [66]의 방법.
[68] scFv가 BCMA, CD19, CD20, CD22, CD47, CD371, ROR-1, EphA2, MUC16, 글리피칸 3, PSCA 및 클라우딘 18.2로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 표적과 결합할 수 있는 것인, [67]의 방법.
[69] scFv가 BCMA와 결합할 수 있는 것인, [68]의 방법.
[70] scFv가 CD371과 결합할 수 있는 것인, [68]의 방법.
[71] 세포 내의 제2 표적 핵산 서열을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제2 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제2 CRISPR 가이드 분자는 제1 CRISPR 가이드 분자와 상이한 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 [1]-[35] 중 어느 하나의 CRISPR 가이드 분자를 포함하고, 제2 CRISPR 가이드 분자의 표적화 영역은 제2 표적 핵산 서열과 혼성화할 수 있고, 핵단백질 복합체는 제2 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인, [57]-[62] 및 [64]-[70] 중 어느 하나의 방법.
[72] 상기 제1 및 제2 표적 핵산 서열이 TRAC; TRBV 단백질; 베타-2 마이크로글로불린 (B2M); PD1; PD-L1; CTLA-4; LAG-3; TIGIT; TIM3; HLA-E; HLA-A; HLA-B; HLA-C; HLA-DRA; ADAM17; BTLA; CD160; SIGLEC10; 2B4; LAIR1; CD52; CD96; VSIR; VISTA; KIR2DL1; KIR2DL2; KIR2DL3; CEACAM1; CBLB; CISH; IL-1R8; AHR; 아데노신 2A 수용체; GMCSF; VISTA; CII2A; 및 NKG2A로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 표적 유전자 내에 각각 독립적으로 존재하는 것인, [71]의 방법.
[73] 공여자 폴리뉴클레오티드가 CAR 발현 벡터를 포함하며, 여기서 CAR은 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하고, 여기서 세포외 리간드-결합 도메인은 scFv를 포함하는 것인, [71] 또는 [72]의 방법.
[74] scFv가 BCMA와 결합할 수 있는 것인, [73]의 방법.
[75] scFv가 CD371과 결합할 수 있는 것인, [73]의 방법.
[76] 상기 제1 표적 핵산 서열이 TRAC 단백질을 코딩하는 유전자 내에 있고, 상기 제2 표적 핵산 서열이 PD1 단백질을 코딩하는 유전자 내에 있는 것인, [72]의 방법.
[77] 상기 제1 표적 핵산 서열이 TRAC 단백질을 코딩하는 유전자 내에 있고, 상기 제2 표적 핵산 서열이 B2M 단백질을 코딩하는 유전자 내에 있는 것인, [72]의 방법.
[78] B2M-HLA-E 융합 구축물을 포함하는 제2 공여자 폴리뉴클레오티드를 세포에 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 B2M-HLA-E 융합 구축물을 포함하는 제2 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분은 제2 표적 핵산 서열의 절단 부위에 삽입되고; B2M-HLA-E 융합 구축물은 N-말단에서부터 C-말단으로, B2M 분비 신호, HLA-G 펩티드 신호 서열, 제1 링커 서열, B2M 서열, 제2 링커 서열, 및 HLA-E 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인, [77]의 방법.
[79] 항-BCMA scFv가 서열식별번호: 474의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 서열식별번호: 475의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인, [69] 또는 [74]의 방법.
[80] scFv가 VH와 VL 사이에 링커를 추가로 포함하는 것인, [79]의 방법.
[81] 링커가 서열식별번호: 476의 아미노산 서열을 포함하는 것인, [80]의 방법.
[82] 상기 scFv가 서열식별번호: 477의 아미노산 서열을 포함하는 것인, [81]의 방법.
[83] CAR이 VH 및 VL을 포함하는 scFv; 막횡단 도메인; 공동-자극 도메인; 및 활성화 도메인을 포함하는 것인, [64] 또는 [73]의 방법.
[84] 막횡단 도메인이 T 세포 수용체 α 쇄, T 세포 수용체 β 쇄, CD3ζ 쇄, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154 또는 GITR로부터 유래된 막횡단 도메인인, [83]의 방법.
[85] 막횡단 도메인이 CD8로부터 유래된 막횡단 도메인을 포함하는 것인, [84]의 방법.
[86] 공동-자극 도메인이 CD28, 4-1BB, GITR, ICOS-1, CD27, OX-40 또는 DAP10으로부터 유래된 공동-자극 도메인인, [83]의 방법.
[87] 공동-자극 도메인이 4-1BB 공동-자극 도메인을 포함하는 것인, [86]의 방법.
[88] 활성화 도메인이 CD3ζ 활성화 도메인을 포함하는 것인, [83]의 방법.
[89] 막횡단 도메인이 CD8로부터 유래된 막횡단 도메인을 포함하고, 공동-자극 도메인이 4-1BB 공동-자극 도메인을 포함하고, 활성화 도메인이 CD3ζ 활성화 도메인을 포함하는 것인, [83]의 방법.
[90] VH가 서열식별번호: 474의 아미노산 서열을 포함하고, VL이 서열식별번호: 475의 아미노산 서열을 포함하는 것인, [83]의 방법.
[91] 상기 CAR 발현 벡터 내의 CAR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 5' 단부에 리더 서열을 갖는 것인, [59]-[62], [64]-[70], [73]-[75] 및 [78]-[90] 중 어느 하나의 방법.
[92] 리더 서열이 서열식별번호: 478의 핵산 서열을 포함하는 것인, [91]의 방법.
[93] CAR 발현 벡터가 프로모터를 포함하는 것인, [91]의 방법.
[94] 프로모터가 MND 프로모터를 포함하는 것인, [93]의 방법.
[95] Cas12 단백질이 C-말단에, 서열식별번호: 479-490으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 링커- 및 NLS-함유 서열을 포함하는 것인, [52]-[94] 중 어느 하나의 방법.
[96] 링커- 및 NLS-함유 서열이 서열식별번호: 483, 485, 487, 및 489로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, [95]의 방법.
[97] [57]-[96] 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 세포.
[98] [59]-[96] 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 CAR-T 세포.
[99] 상기 CAR-T 세포가 동종이계 CAR-T 세포인, [98]의 CAR-T 세포.
[100] 상기 CAR-T 세포가 자가 CAR-T 세포인, [98]의 CAR-T 세포.
[101] T-림프구를 세포로서 사용하여 [59]-[96] 중 어느 하나의 방법을 수행하는 것을 포함하는, CAR-T 세포를 생산하는 방법.
[102] 입양 세포 요법의 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 [57]-[96] 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
[103] 입양 세포 요법의 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 [59]-[96] 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 CAR-T 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
[104] BCMA-양성 암 세포를 [69], [74] 및 [90] 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 CAR-T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, BCMA-양성 암 세포를 사멸시키는 방법.
[105] BCMA-양성 암 세포가 다발성 골수종 암 세포를 포함하는 것인, [104]의 방법.
[106] 다발성 골수종 암 세포가 인간 세포를 포함하는 것인, [105]의 방법.
[107] 접촉 단계가 종양내인 것인, [104]의 방법.
[108] 세포 내의 제1 표적 핵산 서열을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제1 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키며, 여기서 제1 CRISPR 가이드 분자는 [1]-[35] 중 어느 하나의 CRISPR 가이드 분자를 포함하고, 여기서 제1 CRISPR 가이드 분자의 표적화 영역은 제1 표적 핵산 서열과 혼성화할 수 있고, 핵단백질 복합체는 제1 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인 단계; 세포 내의 제2 표적 핵산 서열을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제2 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키며, 여기서 제2 CRISPR 가이드 분자는 제1 CRISPR 가이드 분자와 상이한 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 [1]-[35] 중 어느 하나의 CRISPR 가이드 분자를 포함하고, 제2 CRISPR 가이드 분자의 표적화 영역은 제2 표적 핵산 서열과 혼성화할 수 있고, 핵단백질 복합체는 제2 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인 단계; 및 CAR 발현 벡터를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드를 상기 세포에 제공하며, 여기서 상기 CAR 발현 벡터를 함유하는 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분은 상기 제1 표적 핵산 서열 내의 절단 부위에 삽입될 수 있고, 여기서 CAR은 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 것인 단계를 포함하는, CAR-발현 세포를 생산하는 방법.
[109] CAR 발현 벡터를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드가 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 도입되는 것인, [108]의 방법.
[110] CAR 발현 벡터가 힌지 영역, 막횡단 영역 및 하나 이상의 세포내 신호전달 영역을 추가로 코딩하는 것인, [108]의 방법.
[111] 상기 제1 표적 핵산 서열이 TRAC 단백질을 코딩하는 유전자 내에 있고, 상기 제2 표적 핵산 서열이 PD1 단백질을 코딩하는 유전자 내에 있는 것인, [108]-[110] 중 어느 하나의 방법.
[112] 상기 제1 표적 핵산 서열이 TRAC 단백질을 코딩하는 유전자 내에 있고, 상기 제2 표적 핵산 서열이 B2M 단백질을 코딩하는 유전자 내에 있는 것인, [108]-[110] 중 어느 하나의 방법.
[113] 세포외 리간드-결합 도메인이 이뮤노글로불린 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 것인, [108]-[112] 중 어느 하나의 방법.
[114] scFv가 BCMA와 결합할 수 있는 것인, [113]의 방법.
[115] scFv가 CD371과 결합할 수 있는 것인, [113]의 방법.
[116] 항-BCMA scFv가 서열식별번호: 474의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 서열식별번호: 475의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 것인, [114]의 방법.
[117] scFv가 VH와 VL 사이에 링커를 추가로 포함하는 것인, [116]의 방법.
[118] 링커가 서열식별번호: 476의 아미노산 서열을 포함하는 것인, [117]의 방법.
[119] 상기 scFv가 서열식별번호: 477의 아미노산 서열을 포함하는 것인, [114]의 방법.
[120] B2M-HLA-E 융합 구축물을 포함하는 제2 공여자 폴리뉴클레오티드를 상기 세포에 제공하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 B2M-HLA-E 융합 구축물을 포함하는 제2 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분은 제2 표적 핵산 서열의 절단 부위에 삽입될 수 있고; B2M-HLA-E 융합 구축물은 N-말단에서부터 C-말단으로, B2M 분비 신호, HLA-G 펩티드 신호 서열, 제1 링커 서열, B2M 서열, 제2 링커 서열, 및 HLA-E 서열을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 것인, [108]-[119] 중 어느 하나의 방법.
[121] CAR이: VH 및 VL을 포함하는 scFv; 막횡단 도메인; 공동-자극 도메인; 및 활성화 도메인을 포함하는 것인, [108]-[120] 중 어느 하나의 방법.
[122] 막횡단 도메인이 T 세포 수용체 α 쇄, T 세포 수용체 β 쇄, CD3ζ 쇄, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 또는 GITR로부터 유래된 막횡단 도메인을 포함하는 것인, [121]의 방법.
[123] 막횡단 도메인이 CD8로부터 유래된 막횡단 도메인을 포함하는 것인, [122]의 방법.
[124] 공동-자극 도메인이 CD28, 4-1BB, GITR, ICOS-1, CD27, OX-40 또는 DAP10으로부터 유래된 공동-자극 도메인을 포함하는 것인, [121]의 방법.
[125] 공동-자극 도메인이 4-1BB 공동-자극 도메인을 포함하는 것인, [124]의 방법.
[126] 활성화 도메인이 CD3ζ 활성화 도메인을 포함하는 것인, [121]의 방법.
[127] 막횡단 도메인이 CD8로부터 유래된 막횡단 도메인을 포함하고, 공동-자극 도메인이 4-1BB 공동-자극 도메인을 포함하고, 활성화 도메인이 CD3ζ 활성화 도메인을 포함하는 것인, [121]의 방법.
[128] CAR-발현 세포가 CAR-T 세포인, [108]-[127] 중 어느 하나의 방법.
[129] CAR-T 세포가 동종이계 CAR-T 세포인, [128]의 방법.
[130] CAR-T 세포가 자가 CAR-T 세포인, [128]의 방법.
[131] 제1 CRISPR 가이드 분자와 복합체 형성된 Cas12 단백질 및/또는 제2 CRISPR 가이드 분자와 복합체 형성된 Cas12 단백질이 C-말단에, 서열식별번호: 479-490으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 링커- 및 NLS-함유 서열을 포함하는 것인, [108]-[130] 중 어느 하나의 방법.
[132] 제1 CRISPR 가이드 분자와 복합체 형성된 Cas12 단백질 및/또는 제2 CRISPR 가이드 분자와 복합체 형성된 Cas12 단백질이 서열식별번호: 483, 485, 487, 및 489로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인, [131]의 방법.
[133] 제2 공여자 폴리뉴클레오티드가 B2M-HLA-E 융합 구축물의 N-말단에 P2A 서열을 추가로 포함하는 것인, [78]의 방법.
[134] 제2 공여자 폴리뉴클레오티드가 B2M-HLA-E 융합 구축물 서열의 N-말단에 P2A 서열을 추가로 포함하는 것인, [120]의 방법.
일부 실시양태에서, 본 발명은 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역 및 리보뉴클레오티드 대신 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한 RNA 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU를 포함하는 활성화 영역을 포함하는 CRISPR 가이드 분자이며, 여기서 활성화 영역은 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 영역 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 및 19 중 하나 이상 (예를 들어, 10개 이하)은 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자는 이노신, 데옥시-이노신, 데옥시-우라실, 크산토신, C3 스페이서, 5-메틸 dC, 5-히드록시부틸-2'-데옥시우리딘, 5-니트로인돌, 5-메틸 이소데옥시시토신, 이소 데옥시구아노신, 데옥시우리딘, 이소-데옥시시티딘, 및 무염기 부위를 포함한 염기 변형, 및 포스포로티오에이트 변형을 포함한 백본 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, CRISPR 가이드의 표적화 영역은 B2M 유전자를 표적으로 하고 RNA 서열 AGUGGGGGUGAAUUCAGUGU를 포함하며, 여기서 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체된다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 중 하나 이상 (예를 들어, 5개 이하)은 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역은 서열식별번호: 51-133으로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 가이드는 서열식별번호: 212-231, 275-315, 및 331-350으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR 가이드는 서열식별번호: 416의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CRISPR 가이드의 표적화 영역은 TRAC 유전자를 표적으로 하고 RNA 서열 GAGUCUCUCAGCUGGUACAC를 포함하며, 여기서 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체된다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20 중 하나 이상 (예를 들어, 5개 이하)은 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역은 서열식별번호: 15-20으로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 가이드는 서열식별번호: 233-252, 317-329, 491-492, 및 508로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR 가이드 분자는 화학적 변형을 추가로 포함하며, 서열식별번호: 512-517로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CRISPR 가이드 분자는 서열식별번호: 415의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 영역은 CISH 유전자를 표적으로 하고 서열식별번호: 157-165로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 가이드는 서열식별번호: 509, 및 519-529로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화 영역은 PDCD1 유전자를 표적으로 하고 서열식별번호: 135-155로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적화 영역은 CBLB 유전자를 표적으로 하고 서열식별번호: 167-189로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있다. 일부 실시양태에서, CRISPR 가이드는 서열식별번호: 510의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 CRISPR 가이드 분자 및 Cas12 단백질을 포함하는 CRISPR 핵산/단백질 조성물이다. 일부 실시양태에서, Cas12 단백질은 C-말단에, 서열식별번호: 479-490으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 링커- 및 핵 국재화 신호 (NLS)-함유 서열을 포함하는 Cas12a 단백질이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 CRISPR 핵산/단백질 조성물을 포함하는 세포로서, 여기서 세포는 림프구, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, T 세포 수용체 (TCR) 세포, TCR-조작된 CAR-T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), CAR TIL, 수지상 세포 (DC), CAR-DC, 대식세포, CAR-대식세포 (CAR-M), 자연 살해 (NK) 세포, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC), iPSC 세포로부터 분화된 세포, 또는 CAR-NK 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 세포를 생산하는 방법이며, 이러한 방법은 세포 내의 TRAC 서열을 포함하는 제1 표적 핵산을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제1 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역; 및 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 활성화 영역을 갖는 제1 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키며, 여기서 상기 CRISPR 가이드 분자는 활성화 영역, 표적화 영역 또는 이들 둘 다에 리보뉴클레오티드 염기 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하고, 핵단백질 복합체는 제1 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인 단계; 동일한 세포 내의 B2M 서열을 포함하는 제2 표적 핵산 서열을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제2 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역; 및 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 활성화 영역을 갖는 제2 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키며, 여기서 상기 CRISPR 가이드 분자는 활성화 영역, 표적화 영역 또는 이들 둘 다에 리보뉴클레오티드 염기 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하고, 핵단백질 복합체는 제2 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인 단계; scFv, 막횡단 도메인, 공동-자극 도메인, 및 활성화 도메인을 포함하는 CAR을 코딩하는 제1 공여자 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 CAR은 제1 표적 핵산 서열 내의 절단 부위에 삽입될 수 있는 것인 단계; B2M 분비 신호, HLA-G 펩티드 신호 서열, 제1 링커 서열, B2M 서열, 제2 링커 서열, 및 HLA-E 서열을 포함하는 B2M-HLA-E 융합 구축물을 코딩하는 제2 공여자 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 B2M-HLA-E 융합 구축물은 제2 표적 핵산 서열 내의 절단 부위에 삽입될 수 있는 것인 단계; 제1 표적 핵산 서열을 절단하고 제1 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 절단 부위에 삽입하는 단계; 및 제2 표적 핵산 서열을 절단하고 제2 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 절단 부위에 삽입하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 폴리뉴클레오티드는 B2M-HLA-E 융합 구축물의 5'-단부에 P2A 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 413을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 414를 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR 내의 scFv는 CD37, CD38, CD47, CD73, CD4, CS1, PD-L1, NGFR, ENPP3, PSCA, CD79B, TACI, VEGFR2, B7-H3, B7-H6, B-세포 성숙 항원 (BCMA), CD123, CD138, CD171/L1CAM, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD70, CD371, CEA, 클라우딘 18.1, 클라우딘 18.2, CSPG4, EFGRvIII, EpCAM, EphA2, 표피 성장 인자 수용체, ErbB, ErbB2 (HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, 글리피칸 3, IL-11Rα, IL-13Rα2, IL13 수용체 알파, 루이스Y/LeY, 메소텔린, MUC1, MUC16, NKG2D 리간드, PD1, PSMA, ROR-1, SLAMF7, TAG72, ULBP 및 MICA/B 단백질, VEGF2 및 WT1로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 표적과 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, scFv는 BCMA와 결합할 수 있고, 서열식별번호: 474의 아미노산 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 서열식별번호: 475의 아미노산 서열을 포함하는 제2 가변 영역, 및 서열식별번호: 476의 아미노산 서열을 포함하는 제1 가변 영역과 제2 가변 영역 사이의 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, scFv는 서열식별번호: 477의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, CAR의 막횡단 도메인은 T 세포 수용체 α 쇄, T 세포 수용체 β 쇄, CD3ζ 쇄, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 또는 GITR로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, CAR의 공동-자극 도메인은 CD28, 4-1BB, GITR, ICOS-1, CD27, OX-40 또는 DAP10으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, CAR은 CD8로부터 유래된 막횡단 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, 및 CD3ζ 활성화 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CAR 서열을 함유하는 벡터는 서열식별번호: 478의 핵산 서열을 갖는 리더 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법에 사용되는 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질은 C-말단에, 서열식별번호: 479-490으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 링커 및 핵 국재화 신호 (NLS)-함유 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 동일한 세포 내의 제3 표적 핵산 서열을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제3 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역; 및 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 활성화 영역을 갖는 제3 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키며, 여기서 상기 CRISPR 가이드 분자는 활성화 영역, 표적화 영역 또는 이들 둘 다에 리보뉴클레오티드 염기 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하고, 핵단백질 복합체는 제3 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인 단계; 제3 표적 핵산 서열을 절단하고 절단 부위에서 제3 표적 핵산 서열로부터 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제3 표적 핵산 서열은 PDCD 유전자, CISH 유전자 및 CBLB 유전자로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, CAR-발현 세포는 T-림프구로부터 생산된 동종이계 또는 자가 CAR-T 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 생산된 CAR-발현 세포이고, 여기서 세포는 림프구, CAR-T 세포, TCR 세포, TCR-조작된 CAR-T 세포, TIL, CAR TIL, 수지상 세포, CAR-DC, 대식세포, CAR-M, iPSC 세포, iPSC 세포로부터 분화된 세포, NK 세포 또는 CAR-NK 세포로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 입양 세포 요법의 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 상기 기재된 CAR-발현 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법이다. 일부 실시양태에서, 입양 세포 요법은 BCMA-양성 암 세포, 예를 들어 다발성 골수종 암 세포를 사멸시키는 것을 포함한다.
참조로 포함
본 명세서에 인용된 모든 특허, 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별 특허, 간행물 또는 특허 출원이 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용의 특색은 특히 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 개시내용의 특색 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 개시내용의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명, 및 첨부된 도면을 참조함으로써 수득될 것이다. 본 도면은 비율에 맞게 렌더링되지 않으며 축척도 맞지 않는다. 표시기의 위치는 근사치이다.
도 1A, 도 1B, 및 도 1C는 유형 V CRISPR-Cas12a 가이드 RNA의 예를 예시한다.
도 2는 표적 폴리뉴클레오티드의 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 절단을 예시한다.
도 3A - 도 3I는 Cas12 chRDNA 가이드에서 사용하기 위한 다양한 정규 및 비-정규 뉴클레오티드를 예시한다.
도 4는 표적 폴리뉴클레오티드의 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 절단을 예시한다.
도 5는 Cas12a crRNA 가이드를 예시한다.
도 6은 활성화 영역 및 표적 결합 서열 내의 DNA 염기를 포함하는 Cas12a chRDNA 가이드를 예시한다.
도 7은 활성화 영역 및 표적 결합 서열 내의 DNA 염기 및 화학적으로 변형된 핵산을 포함하는 Cas12a chRDNA 가이드를 예시한다.
도 8은 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 형성 및 표적 폴리뉴클레오티드의 결합을 예시한다.
도 9는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의한 표적 폴리뉴클레오티드에서의 삽입 또는 결실 (indel)의 생성을 예시한다.
도 10은 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의한 표적 폴리뉴클레오티드에서 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 예시한다.
도 11은 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의한 표적 폴리뉴클레오티드의 닉킹을 예시한다.
도 12는 2개의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 표적 폴리뉴클레오티드의 탠덤 닉킹 및 표적 폴리뉴클레오티드 내의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입을 예시한다.
도 13은 표적 결합 서열 내의 개별 DNA 염기를 갖는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 평균 정규화된 편집 비율을 예시한다.
도 14는 활성화 영역 내의 개별 DNA 염기를 갖는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 정규화된 편집 비율을 예시한다.
도 15A 및 도 15B는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 생성된 CAR-T 세포의 표현형 및 세포독성 프로파일을 예시한다.
도 16A 및 도 16B는 상이한 폴리펩티드 링커 및 핵 국재화 서열 (NLS) 구성을 갖는 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 편집 활성을 예시한다.
도 17은 상이한 폴리펩티드 링커 및 핵 국재화 서열 (NLS) 구성을 갖는 다중 유전자를 동시에 표적화할 때 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 편집 활성을 예시한다.
본원에서 사용된 전문 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위한 것이며 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "폴리뉴클레오티드"에 대한 언급은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, "벡터"에 대한 언급은 하나 이상의 벡터를 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 다른 방법 및 물질이 본 개시내용에 유용할 수 있지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기재되어 있다.
용어 "SITE-Seq®" 및 "SITE-Seq® 검정"은 단일-가이드 RNA (sgRNA)로 프로그램된 Cas9를 사용하여 생성된 게놈 DNA 내의 커트 부위의 서열을 확인하는 생화학적 방법을 지칭한다. 이러한 검정은 문헌 [Cameron, P., et al., (2017). Mapping the genomic landscape of CRISPR - Cas9 cleavage. Nature Methods, 14(6), 600-606. https :// doi . org /10.1038/ nmeth . 4284]에 완전히 기재되어 있다.
본 명세서의 교시에 비추어 볼 때, 관련 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어, 하기 표준 텍스트에 의해 교시된 바와 같이, 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 게놈학 및 재조합 폴리뉴클레오티드의 통상적인 기술을 적용할 수 있다 [Abbas et al. (Cellular and Molecular Immunology, 2017, 9th Edition, Elsevier, ISBN 978-0323479783); Butterfield et al. (Cancer Immunotherapy Principles and Practice, 2017, 1st Edition, Demos Medical, ISBN 978-1620700976); Kenneth Murphy (Janeway's Immunobiology, 2016, 9th Edition, Garland Science, ISBN 978-0815345053); Stevens et al. (Clinical Immunology and Serology: A Laboratory Perspective, 2016, 4th Edition, Davis Company, ISBN 978-0803644663); E.A. Greenfield (Antibodies: A Laboratory Manual, 2014, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-1-936113-81-1); R.I. Freshney (Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, 2016, 7th Edition, Wiley-Blackwell, ISBN 978-1118873656); C.A. Pinkert (Transgenic Animal Technology, Third Edition: A Laboratory Handbook, 2014, Elsevier, ISBN 978-0124104907); H. Hedrich (The Laboratory Mouse, 2012, Second Edition, Academic Press, ISBN 978-0123820082); Behringer et al. (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 2013, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-1936113019); McPherson et al. (PCR 2: A Practical Approach, 1995, IRL Press, ISBN 978-0199634248); J.M. Walker (Methods in Molecular Biology (Series), Humana Press, ISSN 1064-3745); Rio et al. (RNA: A Laboratory Manual, 2010, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-0879698911); Methods in Enzymology (Series), Academic Press; Green et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2012, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-1605500560); G.T. Hermanson (Bioconjugate Techniques, 2013, Third Edition, Academic Press, ISBN 978-0123822390)].
클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR) 및 관련 CRISPR-연합 단백질 (Cas 단백질)은 CRISPR-Cas 시스템을 구성한다. CRISPR-Cas 시스템의 분류는 많은 반복을 거쳤다. 문헌 [Makarova et al. (Nat. Rev. Microbiol., 2020, 18:67-83)]에서는 CRISPR-Cas 시스템의 개별 유형 및 하위유형에 특이적인 시그니처 cas 유전자를 고려한 분류 시스템을 제안하였다. 분류는 또한 다중 공유된 Cas 단백질 간의 서열 유사성, 가장 잘 보존된 Cas 단백질의 계통발생, 유전자 조직 및 CRISPR 어레이의 구조를 고려하였다. 이러한 접근 방식은 CRISPR-Cas 시스템을 클래스 1과 클래스 2의 2가지 별개의 클래스로 나누는 분류 체계를 제공하였다.
클래스 2, 유형 V, 시스템에서, crRNA 및 표적 결합은 표적 핵산 절단과 마찬가지로 Cas12를 수반한다. 예를 들어, Cas12a의 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인은 엇갈린 구성으로 표적 핵산의 양쪽 가닥을 절단하여, Cas9 절단에 의해 생성된 평활 단부와 대조적으로 5' 오버행을 생산한다. 이러한 5' 오버행은 상동 재조합 방법을 통해 DNA의 삽입을 촉진할 수 있다.
유형 V crRNA 및 표적 결합 및 절단과 연관된 다른 단백질은 Cas12b (이전에 C2c1) 및 Cas12c (이전에 C2c3)를 포함한다. Cas12b 및 Cas12c 단백질은 길이가 CRISPR 클래스 2 유형 II Cas9 및 CRISPR 클래스 2 유형 V Cas12a 단백질과 유사하며, 그 범위는 대략 1,100개 아미노산 내지 대략 1,500개 아미노산이다. C2c1 및 C2c3 단백질은 또한 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유하며 Cas12a와 유사한 아키텍처를 가지고 있다. C2c1 단백질은 표적 결합 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA를 필요로 한다는 점에서 Cas9 단백질과 유사하지만, 최적 절단 온도는 50℃이다. C2c1 단백질은 Cas12a와 유사하게 표적 서열의 5'인 AT-풍부 PAM을 표적으로 한다. 예를 들어, 문헌 [Shmakov et al. (Molecular Cell, 2015, 60(3):385-397)]을 참조한다.
CRISPR 유형 V 하위유형은 Cas12 단백질을 포함하며, 광범위한 서열과 크기의 다양성을 명확하게 보여주지만; Cas12 하위유형은 IS605-유사 트랜스포손에 의해 코딩된 TnpB 뉴클레아제로부터의 공통의 진화적 기원을 공유한다. 서열 유사성이 낮고 Cas12 단백질의 여러 독립적인 재조합 이벤트를 통한 진화 가능성으로 인해, Cas12 단백질을 각각의 하위유형으로 분류하면 여러 명명 규칙이 초래되었다. 표 1은 유형 V Cas12 단백질에 대한 분류 및 명칭 뿐만 아니라 대략적인 크기, 가이드 요구 사항, 선호하는 표적 폴리뉴클레오티드 및 대표적인 기원 유기체를 제시한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Cas12 상동체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 서열 유사성 검색 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 전형적으로, Cas12 단백질은 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 Cas12 가이드/핵단백질 복합체를 형성하기 위해 동족 Cas12 가이드와 상호작용할 수 있다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, Cas12 단백질 또는 그의 상동체는 Cas12a 단백질 또는 그의 상동체이다.
Cas12a 단백질은 파르쿠박테리아 박테리움 GWC2011_GWC2_44_17 (PbCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움 MC2017 (Lb3 Cpf1), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스 (BpCpf1), 페레그리니박테리아 박테리움 GW2011_GWA_33_10 (PeCpf1), 아시다미노코쿠스 종(Acidaminococcus spp .) BV3L6 (AsCpf1), 포르피로모나스 마카카에 (PmCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006 (LbCpf1), 포르피로모나스 크레비오리카니스 (PcCpf1), 프레보텔라 디시엔스 (PdCpf1), 모락셀라 보보쿨리 237 (MbCpf1), 스미텔라 종 SC_K08D17 (SsCpf1), 렙토스피라 이나다이 (LiCpf1), 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020 (Lb2Cpf1), 프란시스셀라 노비시다 U112 (FnCpf1), 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼 (CMtCpf1), 및 유박테리움 엘리겐스 (EeCpf1)로부터의 Cas12a를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
유형 V 시스템에서, 핵산 표적 서열 결합은 전형적으로, 핵산 표적 서열 절단과 마찬가지로 Cas12 단백질 및 crRNA를 수반한다. 유형 V 시스템에서, Cas12 단백질의 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인은 순차적인 방식으로 핵산 표적 서열의 양쪽 가닥을 절단하여 (문헌 [Swarts et al. (Mol . Cell, 2017, 66:221-233)] 참조), Cas9 단백질 절단에 의해 생성된 평활 단부와 대조되는 5' 오버행을 생산한다.
유형 V 시스템의 Cas12 단백질 절단 활성은 tracrRNA (예를 들어, 유형 V-A)와 독립적일 수 있으며; 일부 유형 V 시스템은 내부 이중체를 형성하는 스템-루프 구조를 가진 단일 crRNA만을 필요로 한다. Cas12 단백질은 스템 루프와 스템 루프에 인접한 서열, 특히 핵산 표적 서열과 혼성화하는 스페이서 서열의 5'에 있는 뉴클레오티드를 인식함으로써 서열- 및 구조-특이적 방식으로 crRNA와 결합한다. 이러한 스템-루프 구조는 전형적으로 길이가 15 내지 22개 뉴클레오티드의 범위이다. 이러한 스템-루프 이중체를 방해하는 치환은 절단 활성을 없애는 반면, 스템-루프 이중체를 방해하지 않는 다른 치환은 절단 활성을 없애지 않는다. 특정 유형 V 시스템, 예컨대 유형 V-F1, V-G, V-C, V-E (CasX), V-K, 및 V-B는 crRNA와 tracrRNA 간의 혼성화를 필요로 한다. 예를 들어, 문헌 [Yan et al. (Science, 2019, 363(6422):88-91)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은 "가이드" 및 "가이드 폴리뉴클레오티드"는 Cas 단백질과 핵단백질 복합체를 형성하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 여기서 핵단백질 복합체는 (핵산 표적 서열을 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드에 비해) 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열과 우선적으로 결합한다. 그러한 가이드는 리보뉴클레오티드 염기 (예를 들어, RNA), 데옥시리보뉴클레오티드 염기 (예를 들어, DNA), 리보뉴클레오티드 염기와 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 조합 (예를 들어, RNA/DNA), 뉴클레오티드 유사체, 변형된 뉴클레오티드 등 뿐만 아니라 합성, 자연적으로 발생하는, 및 비-자연적으로 발생하는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 포함할 수 있다. 단일-가이드 RNA (미니어처 및 말단절단된 단일-가이드 RNA 포함), crRNA, 이중-가이드 RNA (crRNA/tracrRNA 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 등이나 이에 제한되지는 않는 많은 그러한 가이드가 공지되어 있으며, 이들의 용도는 특정한 Cas 단백질에 의존한다. 예를 들어, "유형 V CRISPR-Cas12-연합 가이드"는 동족 Cas12 단백질과 특이적으로 연합하여 핵단백질 복합체를 형성하는 가이드이다.
본원에 사용된 바와 같은, "CRISPR 폴리뉴클레오티드"는 가이드 분자의 일부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, CRISPR 폴리뉴클레오티드는 표적화 영역 및/또는 활성화 영역을 포함한다.
가이드 분자와 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은 "스페이서", "스페이서 서열", "스페이서 요소" 또는 "표적화 영역"은 표적 핵산 서열과 특이적으로 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 표적화 영역은 상보적인 염기쌍 (즉, 쌍을 이룬 염기) 간의 수소 결합을 통해 표적 핵산 서열과 상호작용한다. 표적화 영역은 선택된 핵산 표적 서열과 결합한다. 일부 실시양태에서, 표적 서열은 시험관내, 생체외 (예컨대 CAR-T 세포의 생성에서) 또는 생체내 (예컨대 조성물이 대상체에게 직접 투여되는 경우) 세포의 게놈 내의 서열이다. 가이드 분자는 임의의 표적 서열을 표적으로 하기 위해 선택된 임의의 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 고유한 것들을 포함한다. 따라서, 표적화 영역은 핵산 표적-결합 서열이다. 표적화 영역은 Cas12 단백질의 부위-특이적 결합 및 핵분해 절단의 위치를 결정한다. 표적화 영역에 대한 기능적 길이의 가변성은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "활성화 영역"은 Cas12 폴리펩티드, 예컨대 Cas12a 폴리펩티드와 연합 또는 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드의 일부분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "무염기", "무염기 부위", "무염기 뉴클레오티드", "아퓨린/아피리미딘 부위" 및 "AP 부위"는 상호교환 가능하게 사용되며 퓨린 또는 피리미딘 염기가 결여된 뉴클레오티드 서열 내의 부위를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 무염기 부위는 데옥시리보스 부위를 포함한다. 다른 실시양태에서, 무염기 부위는 리보스 부위를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 무염기 부위는 변형된 백본, 예컨대 포스포로티오에이트 백본 또는 모르폴리노 백본을 포함한다. 무염기 부위는 질소 염기를 함유하지 않기 때문에 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 상보적인 질소 염기와 수소 염기쌍 결합을 형성할 수 없다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "염기 유사체", "비-정규 염기" 및 "화학적으로-변형된 염기"는 DNA 또는 RNA에서 발생하는 정규 퓨린 또는 피리미딘 염기와 구조적 유사성을 갖는 화합물을 지칭한다. 염기 유사체는 DNA 또는 RNA에서 자연적으로 발생하는 퓨린 또는 피리미딘 염기와 비교 시, 변형된 당 및/또는 변형된 핵염기를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 유사체는 이노신 또는 데옥시이노신, 예컨대 2'-데옥시이노신이다. 다른 실시양태에서, 염기 유사체는 2'-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-리보뉴클레오시드, 2'-데옥시리보뉴클레오티드 또는 2'-리보뉴클레오티드이며, 여기서 핵염기는 변형된 염기 (예컨대 예를 들어, 크산틴, 우리딘, 옥사닌 (옥사노신), 7-메틸구아노신, 디히드로우리딘, 5-메틸시티딘, C3 스페이서, 5-메틸 dC, 5-히드록시부틸-2'-데옥시우리딘, 5-니트로인돌, 5-메틸 이소-데옥시시토신, 이소 데옥시구아노신, 데옥시우리딘, 이소 데옥시시티딘, 기타 0-1 퓨린 유사체, N-6-히드록실아미노퓨린, 네불라린, 7-데아자 히포크산틴, 기타 7-데아자퓨린 및 2-메틸 퓨린)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 유사체는 7-데아자-2'-데옥시이노신, 2'-아자-2'-데옥시이노신, PNA-이노신, 모르폴리노-이노신, LNA-이노신, 포스포르아미다이트-이노신, 2'-O-메톡시에틸-이노신 및 2'-OMe-이노신으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 용어 "염기 유사체"는 또한 예를 들어, 2'-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-리보뉴클레오시드, 2'-데옥시리보뉴클레오티드 또는 2'-리보뉴클레오티드를 포함하며, 여기서 핵염기는 치환된 히포크산틴이다. 예를 들어, 치환된 히포크산틴은 할로겐, 예컨대 플루오린 또는 염소로 치환될 수 있다. 일부 실시양태에서, 염기 유사체는 플루오로이노신 또는 클로로이노신, 예컨대 2-클로로이노신, 6-클로로이노신, 8-클로로이노신, 2-플루오로이노신, 6-플루오로이노신, 또는 8-플루오로이노신일 수 있다. 다른 실시양태에서, 염기 유사체는 데옥시우리딘이다. 다른 실시양태에서 염기 유사체는 핵산 모방체 (예컨대 예를 들어, 인공 핵산 및 제노 핵산 (XNA))이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "CRISPR 하이브리드 RNA/DNA 가이드" (chRDNA)는 표적화 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 가이드 분자를 지칭하며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드로 설계된 DNA를 갖는 RNA를 포함한다. 본원의 실시양태에서, Cas12a 가이드의 crRNA 성분은 chRDNA이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체"는 Cas12 단백질과 복합체를 형성하여 핵단백질 복합체를 형성하는 chRDNA 가이드 분자를 지칭하며, 여기서 핵단백질 복합체는 chRDNA 가이드 분자에 존재하는 핵산 표적 결합 서열에 상보적인 핵산 표적 서열과 부위-지정 결합을 할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체"는 Cas12a 단백질과 복합체를 형성하여 핵단백질 복합체를 형성하는 chRDNA 가이드 분자를 지칭하며, 여기서 핵단백질 복합체는 chRDNA 가이드 분자에 존재하는 핵산 표적 결합 서열에 상보적인 핵산 표적 서열과 부위-지정 결합을 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "스템 요소" 또는 "스템 구조"는 이중 가닥 영역 ("스템 요소")을 형성하는 핵산의 두 가닥을 지칭한다. "스템-루프 요소" 또는 "스템-루프 구조"는 한 가닥의 3'-단부 서열이 전형적으로 단일-가닥의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열 ("스템-루프 요소 뉴클레오티드 서열")에 의해 제2 가닥의 5'-단부 서열과 공유 결합되는 스템 구조를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 루프 요소는 약 3개 내지 약 20개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게 약 4개 내지 약 10개의 뉴클레오티드 길이의 루프 요소 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 루프 요소 뉴클레오티드 서열은 이러한 루프 요소 뉴클레오티드 서열 내에 스템 요소를 생성하기 위해 수소 결합 형성을 통해 상호작용하지 않는 쌍을 이루지 않은 핵산 염기의 단일 가닥 뉴클레오티드 서열이다. 용어 "헤어핀 요소"는 또한 스템-루프 구조를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 이러한 구조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 염기쌍 형성은 정확할 수 있지만; 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 스템 요소는 정확한 염기쌍 형성을 필요로 하지 않는다. 따라서, 스템 요소는 하나 이상의 염기 미스매치 또는 쌍을 이루지 않은 염기를 포함할 수 있다. 스템-루프 요소는 유사매듭 구조를 추가로 포함할 수 있다.
"링커 요소 뉴클레오티드 서열", "링커 뉴클레오티드 서열" 및 "링커 폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며 제1 핵산 서열에 공유적으로 부착된 하나 이상의 뉴클레오티드의 서열 (5'-링커 뉴클레오티드 서열-제1 핵산 서열-3')을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커 뉴클레오티드 서열은 2개의 별도의 핵산 서열을 연결하여 단일 폴리뉴클레오티드를 형성한다 (예를 들어, 5'-제1 핵산 서열-링커 뉴클레오티드 서열-제2 핵산 서열-3'). 링커 서열의 다른 예는 5'-제1 핵산 서열-링커 뉴클레오티드 서열-3' 및 5'-링커 뉴클레오티드 서열-제1 핵산 서열-링커 뉴클레오티드 서열-3'을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 링커 요소 뉴클레오티드 서열은 이러한 링커 요소 뉴클레오티드 서열 내에 2차 구조 (예를 들어, 스템-루프 구조)를 생성하기 위해 수소 결합 형성을 통해 서로 상호작용하지 않는 쌍을 이루지 않은 핵산 염기의 단일 가닥 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 단일 가닥 링커 요소 뉴클레오티드 서열은 2개의 링커 요소 뉴클레오티드 서열 간의 수소 결합을 통해 서로 상호작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커 요소 뉴클레오티드 서열은 약 1개 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이, 바람직하게 약 1개 내지 약 15개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동족"은 전형적으로 Cas12 단백질 (예를 들어, Cas12a) 및 하나 이상의 가이드 중 하나에 존재하는 핵산 표적 결합 서열에 상보적인 핵산 표적 서열과 부위-지정 결합할 수 있는 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 하나 이상의 유형 V CRISPR-Cas12-연합 가이드 (예를 들어, Cas12 chRDNA 가이드)를 지칭한다.
용어 "야생형", "자연적으로 발생하는" 및 "비변형된"은 본원에서 자연에 존재하는 전형적인 (또는 가장 통상적인) 형태, 외관, 표현형 또는 계통을 의미하는 것으로 사용되며; 예를 들어, 세포, 유기체, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 거대분자 복합체, 유전자, RNA, DNA 또는 게놈의 전형적인 형태는 자연의 공급원에서 발생하고 그로부터 단리될 수 있다. 야생형 형태, 외관, 표현형 또는 계통은 의도적인 변형 전에 원래의 부모 역할을 한다. 따라서, 돌연변이체, 변이체, 조작된, 재조합 및 변형된 형태는 야생형 형태가 아니다.
폴리펩티드를 언급할 때 "단리된"은 표시된 분자가, 그러한 분자가 자연에서 발견되는 전체 유기체로부터 분리되고 별개의 것이거나 또는 동일한 유형의 다른 생물학적 거대분자의 실질적인 부재 하에 존재하는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오티드와 관련하여 용어 "단리된"은 자연에서 정상적으로 이와 연합된 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 결여된 핵산 분자; 또는 자연에 존재하지만 그와 연합하여 이종 서열을 갖는 서열; 또는 염색체로부터 해리된 분자이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 바람직하게 동일한 분자의 적어도 75중량%, 보다 바람직하게 적어도 85중량%, 보다 더 바람직하게 적어도 95중량%, 가장 바람직하게 적어도 98중량%가 존재하는 것을 의미한다.
용어 "조작된", "유전적으로 조작된", "유전적으로 변형된", "재조합", "변형된", "비-자연적으로 발생하는" 및 "비-천연"은 유기체 또는 세포의 게놈에 대한 의도적인 인간 조작을 나타낸다. 상기 용어는 본원에 정의된 바와 같은 게놈 편집을 포함하는 게놈 변형 방법 뿐만 아니라 유전자 발현 또는 불활성화, 효소 공학, 유도 진화, 지식 기반 설계, 무작위 돌연변이 유발 방법, 유전자 셔플링, 코돈 최적화 등을 변경하는 기술을 포괄한다. 유전적 조작 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
"공유 결합", "공유적으로 부착된", "공유적으로 결합된", "공유적으로 연결된", "공유적으로 연결된" 및 "분자 결합"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며 원자 간에 전자쌍의 공유를 수반하는 화학 결합을 지칭한다. 공유 결합의 예는 포스포디에스테르 결합 및 포스포로티오에이트 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"비-공유 결합", "비-공유적으로 부착된", "비-공유적으로 결합된", "비-공유적으로 연결된", "비-공유 상호작용" 및 "비-공유적으로 연결된"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 한 쌍의 전자를 공유하지 않는 상대적으로 약한 임의의 화학 결합을 지칭한다. 다중 비-공유 결합은 종종 거대분자의 입체 형태를 안정화하고 분자 간의 특이적 상호작용을 매개한다. 비-공유 결합의 예는 수소 결합, 이온 상호작용 (예를 들어, Na+Cl-), 반 데르 발스 상호작용 및 소수성 결합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, "수소 결합", "수소-염기쌍 형성" 및 "수소 결합된"은 상호교환 가능하게 사용되며, "왓슨-크릭-수소 결합 염기쌍" (W-C-수소 결합된 염기쌍 또는 W-C 수소 결합); "후그스틴-수소 결합된 염기쌍" (후그스틴 수소 결합); 및 "워블-수소 결합된 염기쌍" (워블 수소 결합)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 정규 수소 결합 및 비-정규 수소 결합을 지칭한다. 역 W-C 수소 결합을 포함한 W-C 수소 결합은 퓨린-피리미딘 염기쌍 형성, 즉 아데닌:티민, 구아닌:시토신 및 우라실:아데닌을 지칭한다. 역 후그스틴 수소 결합을 포함한 후그스틴 수소 결합은 각각의 가닥에 하나씩 2개의 핵염기가 주요 홈 내의 수소 결합에 의해 함께 유지되는 핵산 내의 염기쌍 형성의 변이를 지칭한다. 이러한 비-W-C 수소 결합은 제3 가닥이 이중체 주위를 감고 삼중 가닥 나선을 형성할 수 있게 한다. 역 워블 수소 결합을 포함한 워블 수소 결합은 왓슨-크릭 염기쌍 규칙을 따르지 않는 RNA 분자 내의 두 뉴클레오티드 간의 염기쌍 형성을 지칭한다. 4가지 주요 워블 염기쌍이 있다: 구아닌:우라실, 이노신 (히포크산틴):우라실, 이노신:아데닌 및 이노신:시토신. 워블 염기 상호작용은 또한 이노신:티민과 이노신:구아닌 간에 발생하는 것으로 공지되어 있다. 이노신 염기 및 데옥시 이노신 염기는 정규 DNA 및 RNA 염기와 수소 결합할 수 있기 때문에 "범용 쌍형성 염기"로서 지칭될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Watkins et al. (Nucleic Acid Research, 2005, 33(19):6258-67)]을 참조한다. 정규 수소 결합 및 비-정규 수소 결합에 대한 규칙은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [R. F. Gesteland (The RNA World, Third Edition (Cold Spring Harbor Monograph Series), 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-0879697396); R. F. Gesteland (The RNA World, Second Edition (Cold Spring Harbor Monograph Series), 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 978-0879695613); R. F. Gesteland (The RNA World, First Edition (Cold Spring Harbor Monograph Series), 1993, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 978-0879694562) (예를 들어, [Appendix 1: Structures of Base Pairs Involving at Least Two Hydrogen Bonds, I. Tinoco] 참조); W. Saenger (Principles of Nucleic Acid Structure, 1988, Springer International Publishing AG, ISBN 978-0-387-90761-1); S. Neidle (Principles of Nucleic Acid Structure, 2007, First Edition, Academic Press, ISBN 978-01236950791)]을 참조한다.
"연결하다", "연결된" 및 "연결하는"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 2개의 거대분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드, 단백질 등) 간의 공유 결합 또는 비-공유 결합을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환 가능하며 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 하나의 5' 단부 및 하나의 3' 단부를 갖고 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있는 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA), 리보뉴클레오티드 (RNA), 그의 유사체 또는 그의 조합일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 기능을 수행할 수 있으며 다양한 2차 및 3차 구조를 가질 수 있다. 상기 용어는 자연 뉴클레오티드 및 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티에서 변형되는 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포괄한다. 특정한 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 형성 특이성을 가지고 있다 (예를 들어, T와 A 염기쌍의 유사체). 폴리뉴클레오티드는 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 플루오린화된 뉴클레오티드, 메틸화된 뉴클레오티드, 화학적으로 변형된 당, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 뉴클레오티드 구조는 중합체가 어셈블리되기 전 또는 후에 변형될 수 있다. 중합 후, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 표지화 성분 또는 표적 결합 성분과의 접합을 통해 부가적으로 변형될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분을 혼입할 수 있다. 상기 용어는 또한 합성, 자연적으로 발생하고/하거나 비-자연적으로 발생하며 참조 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA)와 유사한 결합 특성을 갖는, 변형된 백본 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미다이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA™) [엑시콘 (Exiqon; 미국 매사추세츠주, 우번)] 뉴클레오시드, 글리콜 핵산, 가교된 핵산 및 모르폴리노 구조를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
펩티드-핵산 (PNA)은 폴리뉴클레오티드 포스페이트-당 백본이 가요성 슈도-펩티드 중합체로 대체되는 핵산의 합성 상동체이다. 핵염기는 중합체에 연결되어 있다. PNA는 RNA와 DNA의 상보적인 서열에 대해 높은 친화성과 특이성으로 혼성화할 수 있는 능력을 가지고 있다.
포스포로티오에이트 핵산에서, 포스포로티오에이트 (PS) 결합은 폴리뉴클레오티드 포스페이트 백본 내의 비-가교 산소를 황 원자로 대체한다. 이러한 변형은 뉴클레오티드간 연결이 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 갖게 한다. 일부 실시양태에서, 포스포로티오에이트 결합은 엑소뉴클레아제 분해를 억제하기 위해 폴리뉴클레오티드 서열의 5'-단부 또는 3'-단부 서열에서 마지막 3 내지 5개 뉴클레오티드 사이에 도입된다. 전체 올리고뉴클레오티드 전반에 걸쳐 포스포로티오에이트 결합을 배치하면, 엔도뉴클레아제에 의한 분해를 감소시키는데 또한 도움이 된다.
트레오스 핵산 (TNA)은 인공 유전적 중합체이다. TNA의 백본 구조는 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복되는 트레오스 당을 포함한다. TNA 중합체는 뉴클레아제 분해에 대한 내성이 있다. TNA는 염기쌍 수소 결합을 통해 이중체 구조로 자기 어셈블리할 수 있다.
연결 반전은 "역전된 포스포르아미다이트"의 사용을 통해 폴리뉴클레오티드에 도입될 수 있다 (예를 들어, www.ucalgary.ca/dnalab/synthesis/-modifications/linkages 참조). 폴리뉴클레오티드의 말단에서의 3'-3' 연결은 2개의 5'-OH 말단을 갖지만 3'-OH 말단이 결여된 올리고뉴클레오티드를 생성함으로써 엑소뉴클레아제 분해에 대해 폴리뉴클레오티드를 안정화시킨다. 전형적으로, 이러한 폴리뉴클레오티드는 5'-OH 위치에 포스포르아미다이트 기를 갖고 3'-OH 위치에 디메톡시트리틸 (DMT) 보호기를 갖는다. 정상적으로, DMT 보호기는 5'-OH 상에 있고 포스포르아미다이트는 3'-OH 상에 있다.
폴리뉴클레오티드 서열은 달리 나타내지 않는 한 본원에서 통상적인 5'에서 3' 배향으로 표시된다.
본원에 사용된 바와 같은, "서열 동일성"은 일반적으로 다양한 가중 파라미터를 갖는 알고리즘을 사용하여, 각각 제1 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 제2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 비교하는 뉴클레오티드 염기 또는 아미노산의 동일성 퍼센트를 지칭한다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 간의 서열 동일성은 GENBANK (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 및 EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk.)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 사이트에서 월드와이드 웹을 통해 이용 가능한 다양한 방법 및 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, BLAST, CS-BLAST, FASTA, HMMER, L-ALIGN 등)에 의한 서열 정렬을 사용하여 결정될 수 있다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 서열 간의 서열 동일성은 일반적으로 다양한 방법 또는 컴퓨터 프로그램의 표준 디폴트 파라미터를 사용하여 계산된다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 간의 높은 정도의 서열 동일성은 전형적으로 참조 폴리펩티드의 길이 전체에 걸쳐 약 90% 내지 100% 동일성, 예를 들어 약 90% 이상의 동일성, 바람직하게 약 95% 이상의 동일성, 보다 바람직하게 약 98% 이상의 동일성이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 간의 중간 정도의 서열 동일성은 전형적으로 참조 폴리펩티드의 길이 전체에 걸쳐 약 80% 동일성 내지 약 85% 동일성, 예를 들어 약 80% 이상의 동일성, 바람직하게 약 85% 동일성이다. 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 간의 낮은 정도의 서열 동일성은 전형적으로 참조 폴리펩티드의 길이 전체에 걸쳐 약 50% 동일성 내지 75% 동일성, 예를 들어 약 50% 동일성, 바람직하게 약 60% 동일성, 보다 바람직하게 약 75% 동일성이다. 예를 들어, Cas12 단백질 (예를 들어, 아미노산 치환을 포함하는 Cas12)은 참조 Cas12 단백질 (예를 들어, 야생형 Cas12)에 대해 그의 길이 전체에 걸쳐 낮은 정도의 서열 동일성, 중간 정도의 서열 동일성 또는 높은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다. 또 다른 예로서, 가이드 분자는 참조 Cas12 단백질과 복합체를 형성하는 그의 길이 전체에 걸쳐 참조 야생형 가이드 분자 (예를 들어, Cas12와 복합체를 형성하는 폴리뉴클레오티드)와 비교하여 그의 길이 전체에 걸쳐 낮은 정도의 서열 동일성, 중간 정도의 서열 동일성 또는 높은 정도의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "혼성화", "혼성화하다" 또는 "혼성화하는"은 수소 염기쌍 형성을 통해 단일 이중 가닥 분자 (예를 들어, DNA/DNA, DNA/RNA, RNA/RNA)를 형성하기 위해 2개의 상보적인 단일 가닥 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 분자를 조합하는 프로세스이다. 혼성화 엄격도는 전형적으로 혼성화 온도와 혼성화 완충액의 염 농도에 의해 결정되며; 예를 들어, 고온 및 저염은 높은 엄격도 혼성화 조건을 제공한다. 상이한 혼성화 조건에 대한 염 농도 범위 및 온도 범위의 예는 하기와 같다: 높은 엄격도, 대략 0.01 M 내지 대략 0.05 M 염, 혼성화 온도 Tm 미만 5℃ 내지 10℃; 중간 정도의 엄격도, 대략 0.16 M 내지 대략 0.33 M 염, 혼성화 온도 Tm 미만 20℃ 내지 29℃; 및 낮은 엄격도, 대략 0.33 M 내지 대략 0.82 M 염, 혼성화 온도 Tm 미만 40℃ 내지 48℃. 이중체 핵산 서열의 Tm은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 방법에 의해 계산된다. 예를 들어, 문헌 [Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York); Casey et al. (Nucleic Acids Research, 1977, 4:1539-1552); Bodkin et al. (Journal of Virological Methods, 1985, 10(1):45-52); and Wallace et al. (Nucleic Acids Research, 1981, 9(4):879-894)]을 참조한다. Tm을 추정하는 알고리즘 예측 도구가 또한 널리 이용 가능하다. 혼성화를 위한 높은 엄격도 조건은 전형적으로 표적 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드가 주로 표적 서열과 혼성화하고 비-표적 서열과는 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 전형적으로, 혼성화 조건은 중간 정도의 엄격도, 바람직하게 높은 엄격도의 것이다.
본원에 사용된 바와 같은, "상보성"은 또 다른 핵산 서열과 수소 결합을 형성할 수 있는 핵산 서열의 능력 (예를 들어, 정규 왓슨-크릭 염기쌍 형성을 통함)을 지칭한다. 상보성 퍼센트는 제2 핵산 서열과 수소 결합을 형성할 수 있는 핵산 서열 내의 잔기의 백분율을 나타낸다. 2개의 핵산 서열이 100% 상보성을 갖는 경우, 이러한 2개의 서열은 완벽하게 상보적이며, 즉 제1 폴리뉴클레오티드의 모든 연속 잔기는 제2 폴리뉴클레오티드 내의 동일한 수의 연속 잔기와 수소 결합한다.
리보뉴클레오티드 염기와 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "상응하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기"는 리보뉴클레오티드 염기와 동일한 염기와 상보적 (왓슨-크릭) 염기쌍 형성을 통해 결합하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기 (예를 들어, 정규 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 변형된 또는 변이체 버전 포함)를 지칭한다. 예를 들어, 리보뉴클레오티드 염기 A, C 및 G의 경우, 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기는 각각 A, C 및 G일 수 있다. 리보뉴클레오티드 염기 U의 경우, 상응하는 데옥시리보뉴클레오티드 염기는, 예를 들어, T일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "결합"은 거대분자 간 (예를 들어, 단백질과 폴리뉴클레오티드 간, 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 간, 또는 단백질과 단백질 간 등)의 비-공유 상호작용을 지칭한다. 이러한 비-공유 상호작용은 또한 "연합" 또는 "상호작용"으로서 지칭된다 (예를 들어, 제1 거대분자가 제2 거대분자와 상호작용하는 경우, 제1 거대분자는 비-공유 방식으로 제2 거대분자와 결합함). 결합 상호작용의 일부 부분은 서열-특이적일 수 있다 (용어 "서열-특이적 결합", "서열-특이적으로 결합하다", "부위-특이적 결합" 및 "부위 특이적으로 결합하다"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용됨). 서열-특이적 결합은 전형적으로 단백질 (예를 들어, Cas12)과 복합체를 형성하여 이러한 단백질이, 핵산 표적 결합 서열 (예를 들어, DNA 표적 결합 서열)이 없는 제2 핵산 서열 (예를 들어, 제2 DNA 서열)에 비해 우선적으로 핵산 표적 서열 (예를 들어, 표적 DNA 서열)을 포함하는 핵산 서열 (예를 들어, DNA 서열)과 결합하도록 할 수 있는 하나 이상의 가이드 분자를 지칭한다. 결합 상호작용의 모든 성분은 DNA 백본 내의 포스페이트 잔기와 단백질의 접촉과 같이 서열-특이적일 필요는 없다. 결합 상호작용은 해리 상수 (Kd)를 특징으로 할 수 있다. "결합 친화도"는 결합 상호작용의 강도를 지칭한다. 증가된 결합 친화도는 더 낮은 Kd와 상관관계가 있다.
본원에 사용된 바와 같은, Cas12 단백질은 Cas12 가이드/핵단백질 복합체가 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열에서 폴리뉴클레오티드와 결합하거나 이를 절단하는 경우에, 이러한 폴리뉴클레오티드를 "표적으로 한다"고 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "프로토스페이서 인접 모티프" 또는 "PAM"은 Cas12 단백질-결합 인식 서열을 포함하는 이중 가닥 핵산 서열을 지칭하며, 여기서 Cas12 단백질의 아미노산은 인식 서열과 직접 상호작용한다 (예를 들어, Cas12a 단백질은 PAM 5'-TTTN-3' 또는 PAM 5'-TTTV-3'과 상호작용한다). PAM 서열은 비-표적 가닥에 있으며 표적 보체 서열의 5' 또는 3'일 수 있다 (예를 들어, CRISPR-Cas12a 시스템에서, PAM 5'-TTTN-3' 또는 PAM 5'-TTTV-3' 서열은 비-표적 가닥에 있고 표적-보체 서열의 5'이다). PAM은 표적 서열 풀림 및 표적 서열과 핵산 표적 결합 서열 간의 수소 염기쌍 결합 전에 Cas12 이펙터 단백질 (예를 들어, Cas12a 단백질)에 의해 인식된다.
"표적", "표적 서열", "핵산 표적 서열", "표적 핵산 서열" 및 "온-표적 서열"은 본원에서 Cas12 폴리뉴클레오티드의 핵산 표적 결합 서열에 전체적으로 또는 부분적으로 상보적인 핵산 서열 (예를 들어, 표적화 영역)을 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 전형적으로, 핵산 표적 결합 서열은 Cas12 핵단백질 복합체의 결합이 지시되는 핵산 표적 서열에 100% 상보적이도록 선택되지만; 핵산 표적 서열에 대한 결합을 약화시키기 위해, 더 낮은 퍼센트의 상보성을 사용할 수 있다.
핵산 표적 결합 서열이 이러한 핵산 표적 결합 서열에 함유된 무염기 부위를 제외하고 표적 서열에 100% 상보적일 때, 표적 서열은 "온-표적"으로서 지칭된다. 온-표적 서열 결합은 Cas12 가이드/핵단백질 복합체가 핵산 표적 결합 서열 (스페이서)의 비-무염기 부위 부분에 대해 100% 상보성을 갖는 핵산 서열과 결합하는 것을 지칭한다. 핵산 표적 결합 서열 (스페이서)이 이러한 핵산 표적 결합 서열에 함유된 무염기 부위를 제외하고 표적 서열과 100% 미만의 상보성을 갖는 경우, 표적 서열은 "오프-표적"으로서 지칭될 수 있다. 오프-표적 서열 결합은 Cas12 가이드/핵단백질 복합체가 핵산 표적 결합 서열 (스페이서)의 비-무염기 부위 부분에 대해 100% 미만의 상보성을 갖는 핵산 서열과 결합하는 것을 지칭한다. 핵산 표적 서열은 이중 가닥 또는 단일 가닥 DNA 분자일 수 있다. 표적 서열은 이중 가닥 또는 단일 가닥 RNA 분자일 수 있다. 표적 서열은 RNA:DNA 하이브리드 분자일 수 있다. 표적 서열은 PAM 서열의 반대 가닥에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "이중 가닥 파손부" (DSB)는 절단되는 DNA의 이중 가닥 세그먼트의 양쪽 가닥을 지칭한다. 일부 경우에, 그러한 파손이 발생하면, 하나의 가닥은 뉴클레오티드가 노출되고 다른 가닥 상의 뉴클레오티드와 수소 결합되지 않는 "점착성 단부"를 갖는다고 할 수 있다. 다른 경우에, 양쪽 가닥이 서로 완전히 염기쌍을 이룬 상태로 남아 있는 "평활 단부"가 발생할 수 있다.
"공여자 폴리뉴클레오티드", "공여자 올리고뉴클레오티드", "공여자 템플릿", "비-바이러스 공여자" 및 "비-바이러스 템플릿"은 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며 이중 가닥 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA), 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 또는 그의 조합일 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 삽입 서열 (예를 들어, DNA 내의 DSB)을 플랭킹하는 상동성 아암을 포함할 수 있다. 각각의 측면 상의 상동성 아암은 길이가 다를 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 설계 및 구축을 위한 파라미터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Ran et al. (Nature Protocols, 2013, 8(11):2281-2308); Smithies et al. (Nature, 1985, 317:230-234); Thomas et al. (Cell, 1986, 44:419-428); Wu et al. (Nature Protocols, 2008, 3:1056-1076); Singer et al. (Cell, 1982, 31:25-33); Shen et al. (Genetics, 1986, 112:441-457); Watt et al. (PNAS, 1985, 82:4768-4772); Sugawara et al. (Journal of Molecular Cell Biology, 1992, 12(2):563-575); Rubnitz et al. (Journal of Molecular Cell Biology, 1984, 4(11):2253-2258); Ayares et al. (PNAS, 1986, 83(14):5199-5203); and Liskay et al. (Genetics, 1987, 115(1):161-167)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "상동성-지향 복구" (HDR)는, 예를 들어 DNA에서의 DSB의 복구 동안 세포에서 일어나는 DNA 복구를 지칭한다. HDR은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하며 DSB (예를 들어, 표적 DNA 서열 내)가 발생한 서열을 복구하기 위해 공여자 폴리뉴클레오티드를 사용한다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 DSB를 플랭킹하는 서열과 필수 서열 상동성을 가지므로, 공여자 폴리뉴클레오티드가 복구를 위한 적합한 템플릿으로서 작용할 수 있다. HDR은, 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드로부터 표적 DNA 서열로 유전 정보를 전달하게 한다. HDR은 공여자 폴리뉴클레오티드 서열이 표적 DNA 서열과 상이하고 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 표적 DNA 서열에 혼입되는 경우, 표적 DNA 서열의 변경 (예를 들어, 삽입, 결실 또는 돌연변이)을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 공여자 폴리뉴클레오티드, 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부분, 또는 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피가 표적 DNA 서열의 부위에 통합된다. 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA 서열 내에서의 파손부의 복구를 위해 사용될 수 있으며, 여기서 복구는 DNA 내의 파손 부위 또는 이와 매우 근접한 부위에서 공여자 폴리뉴클레오티드로부터의 유전 정보 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열)의 전달을 초래한다. 따라서, 표적 DNA 서열에 새로운 유전 정보 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열)가 삽입되거나 카피될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "상동성-독립적 표적 통합" (HITI)은 예를 들어 DNA에서의 DSB의 복구 동안 세포에서 일어나는 DNA 복구를 지칭한다. HITI는 HDR과 달리, 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하지 않으며 DSB가 발생한 서열 (예를 들어, 표적 DNA 서열 내)을 복구하기 위해 공여자 폴리뉴클레오티드를 사용한다. HITI는, 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드로부터 표적 DNA 서열로 유전 정보를 전달하게 한다. HITI는 공여자 폴리뉴클레오티드 서열이 표적 DNA 서열과 상이하고 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 표적 DNA 서열에 혼입되는 경우 표적 DNA 서열의 변경 (예를 들어, 삽입, 결실 또는 돌연변이)을 초래할 수 있다. 일부 실시양태에서, 전체 공여자 폴리뉴클레오티드, 공여자 폴리뉴클레오티드의 일부분, 또는 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피가 표적 DNA 서열의 부위에 통합된다. 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드는 표적 DNA 서열 내의 파손부의 복구를 위해 사용될 수 있으며, 여기서 복구는 DNA 내의 파손 부위에서 또는 이와 매우 근접한 부위에서 공여자 폴리뉴클레오티드로부터의 유전 정보 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열)의 전달을 초래한다. 따라서, 표적 DNA 서열에 새로운 유전 정보 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열)가 삽입되거나 카피될 수 있다.
"게놈 영역"은 핵산 표적 서열 부위의 어느 한쪽에 존재하거나, 대안적으로 또한, 핵산 표적 서열 부위의 일부분을 포함하는 숙주 세포의 게놈 내의 염색체의 세그먼트이다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 상동성 아암은 상응하는 게놈 영역과 상동 재조합을 진행하기에 충분한 상동성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드의 상동성 아암은 핵산 표적 서열 부위를 바로 플랭킹하는 게놈 영역과 상당한 서열 상동성을 공유하며; 상동성 아암은 핵산 표적 서열 부위로부터 더 멀리 있는 게놈 영역에 대해 충분한 상동성을 갖도록 설계될 수 있는 것으로 인식된다.
본원에 사용된 바와 같이, "비상동 단부 연결" (NHEJ)은 공여자 폴리뉴클레오티드에 대한 요구사항 없이 파손부의 한 말단을 파손부의 다른 말단에 직접 라이게이션함으로써 DNA에서의 DSB의 복구를 지칭한다. NHEJ는 복구 템플릿을 사용하지 않고 DNA를 복구하기 위해 세포가 이용할 수 있는 DNA 복구 경로이다. 공여자 폴리뉴클레오티드의 부재 하의 NHEJ는 종종 DSB 부위에서 무작위로 삽입되거나 결실되는 뉴클레오티드를 초래한다.
"미세 상동성-매개 단부 연결" (MMEJ)은 DNA에서의 DSB를 복구하기 위한 경로이다. MMEJ는 연결하기 전에 DSB를 플랭킹하는 결실 및 파손 부위 내부의 미세 상동 서열의 정렬을 수반한다. MMEJ는 유전적으로 정의되며 예를 들어 CtIP, 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제 1 (PARP1), DNA 폴리머라제 세타 (Pol θ), DNA 리가제 1 (Lig 1) 또는 DNA 리가제 3 (Lig 3)의 활성이 필요하다. 부가의 유전적 성분이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sfeir et al. (Trends in Biochemical Sciences, 2015, 40:701-714)]을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같은, "DNA 복구"는 세포 기구가 세포에 함유된 DNA 분자에 대한 손상을 복구하는 임의의 프로세스를 포괄한다. 복구된 손상은 단일 가닥 파손부 또는 이중 가닥 파손부 (DSB)를 포함할 수 있다. DSB를 복구하기 위해 HDR, NHEJ 및 MMEJ의 3가지 메커니즘이 있다. "DNA 복구"은 또한 인간 조작으로 인한 DNA 복구를 지칭하기 위해 본원에서 사용되며, 여기서 표적 로커스는, 예를 들어, 뉴클레오티드를 삽입, 결실 또는 치환함으로써 변형되며, 이들 모두는 게놈 편집의 형태를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은 "재조합"은 2개의 폴리뉴클레오티드 간의 유전 정보의 교환 프로세스를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조절 서열", "조절 요소" 및 "제어 요소"는 상호교환 가능하고 발현될 폴리뉴클레오티드 표적의 상류 (5' 비-코딩 서열), 내부 또는 하류 (3' 비-번역 서열)에 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은, 예를 들어, 전사 시기, 전사의 양 또는 수준, RNA 프로세싱 또는 안정성, 및/또는 관련된 구조적 뉴클레오티드 서열의 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 활성화제 결합 서열, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, 프로모터, 전사 시작 부위, 억제인자 결합 서열, 스템-루프 구조, 번역 개시 서열, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES), 번역 리더 서열, 전사 종결 서열 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열), 번역 종료 서열, 프라이머 결합 부위 등을 포함할 수 있다.
조절 요소는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적, 유도성 또는 억제성 발현을 지시하는 요소, 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 요소 (예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터, 하나 이상의 pol II 프로모터, 하나 이상의 pol I 프로모터, 또는 그의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. pol II 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스 (RSV) LTR 프로모터 (임의로 RSV 인핸서 수반), 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서 수반; 예를 들어, 문헌 [Boshart et al. (Cell, 1985, 41:521-530)] 참조), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있음을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 인지할 것이다. 벡터는 숙주 세포에 도입됨으로써 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 포함한 전사체, 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "유전자"는 엑손 및 관련 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 유전자는 인트론 및/또는 비번역된 영역 (UTR)을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "작동 가능하게 연결된"은 서로 기능적 관계에 있는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 예를 들어, 조절 서열 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)은 이러한 조절 서열이 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하거나 전사의 조정에 기여하는 경우 유전자 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 "작동 가능하게 연결"된다. 작동 가능하게 연결된 조절 요소는 전형적으로 코딩 서열과 인접해 있다. 그러나, 인핸서는 프로모터로부터 최대 수 킬로염기 이상 떨어져 있는 경우에도 기능할 수 있다. 따라서, 일부 조절 요소는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있지만 폴리뉴클레오티드 서열과 인접하지는 않는다. 유사하게, 번역 조절 요소는 폴리뉴클레오티드로부터의 단백질 발현의 조정에 기여한다.
본원에 사용된 바와 같은, "발현"은, 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 또는 다른 RNA 전사체 (예를 들어, 비-코딩, 예컨대 구조적 또는 스캐폴딩 RNA)를 초래하는, DNA 템플릿으로부터의 폴리뉴클레오티드의 전사를 지칭한다. 이러한 용어는 추가로, 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 프로세스를 지칭한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"로서 지칭될 수 있다. 발현은 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우, 진핵 세포에서 mRNA를 스플라이싱하는 것을 포함할 수 있다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "코딩"하는 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓일 때 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드로 전사되고 (DNA의 경우) 번역되는 (mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' 말단에서의 시작 코돈과 3' 말단에서의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열에 대해 3'에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조정하다"는 기능의 수량, 정도 또는 양에서의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 Cas12-가이드/핵단백질 복합체는 프로모터에서 또는 그 근처에서 핵산 표적 서열과 결합함으로써 프로모터 서열의 활성을 조정할 수 있다. 결합 후 발생하는 작용에 따라, Cas12 가이드/핵단백질 복합체는 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 전사를 유도, 증진, 저해 또는 억제할 수 있다. 따라서, 유전자 발현의 "조정"은 유전자 활성화와 유전자 억제 둘 다를 포함한다.
조정은 표적 유전자의 발현에 의해 직접 또는 간접적으로 영향을 받는 임의의 특징을 결정함으로써 검정될 수 있다. 이러한 특징은, 예를 들어, RNA 또는 단백질 수준, 단백질 활성, 산물 수준, 유전자의 발현 또는 리포터 유전자의 활성 수준에서의 변화를 포함한다. 따라서, 용어 유전자의 "발현 조정", "발현 억제" 및 "발현 활성화"는 유전자의 전사를 변화, 활성화 또는 억제할 수 있는 Cas12 가이드/핵단백질 복합체의 능력을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "벡터" 및 "플라스미드"는 유전 물질을 세포에 도입하기 위한 폴리뉴클레오티드 비히클을 지칭한다. 벡터는 선형 또는 원형일 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포에서 벡터의 복제에 영향을 미칠 수 있는 복제 서열 (예를 들어, 복제 기점)을 함유할 수 있다. 적합한 숙주의 형질전환 시, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제 및 기능하거나 숙주 게놈에 통합될 수 있다. 벡터 설계는 무엇보다도 벡터에 대한 의도된 용도 및 숙주 세포에 의존하며, 특정한 용도 및 숙주 세포를 위한 벡터의 설계는 관련 기술분야의 기술 수준 내에 있다. 벡터의 4가지 주요 유형은 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체이다. 전형적으로, 벡터는 복제 기점, 멀티클로닝 부위 및/또는 선택 가능한 마커를 포함한다. 발현 벡터는 전형적으로 발현 카세트를 포함한다. "재조합 바이러스"는, 예를 들어, 바이러스 게놈 또는 그의 일부분에 이종 핵산 구축물을 부가 또는 삽입함으로써 유전적으로 변경된 바이러스를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은, "발현 카세트"는 재조합 방법을 사용하거나 또는 합성 수단에 의해 생성되고 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현을 용이하게 하기 위해 선택된 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구축물을 지칭한다. 예를 들어, 조절 서열은 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 전사, 또는 숙주 세포에서 선택된 폴리뉴클레오티드의 전사 및 번역을 용이하게 할 수 있다. 발현 카세트는, 예를 들어, 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 벡터에 존재하여 발현 벡터를 형성할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "표적화 벡터"는 표적 유전자 또는 핵산 표적 서열 (예를 들어, DSB)의 요소를 플랭킹하는, 게놈 DNA에 상동인 맞춤형 DNA 아암을 전형적으로 포함하는 재조합 DNA 구축물이다. 표적화 벡터는 공여자 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 유전자의 요소는 결실 및/또는 삽입을 포함한 수많은 방식으로 변형될 수 있다. 결함이 있는 표적 유전자는 기능적 표적 유전자로 대체될 수 있거나, 또는 대안적으로 기능적 유전자가 녹아웃될 수 있다. 임의로, 표적화 벡터의 공여자 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자에 도입되는 선택 가능한 마커를 포함하는 선택 카세트를 포함한다. 표적 유전자에 인접하거나 표적 유전자 내에 있는 표적화 영역을 사용하여 유전자 발현의 조절에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "유전자 편집" 또는 "게놈 편집"은 세포 게놈 내의 특이적 부위에서 유전적 변형, 예컨대 뉴클레오티드 서열 또는 심지어 단일 염기의 삽입, 결실 또는 대체를 초래하는 일종의 유전 공학을 의미한다. 상기 용어는 본원에 정의된 바와 같은 이종 유전자 발현, 유전자 또는 프로모터 삽입 또는 결실, 핵산 돌연변이 및 파괴적 유전적 변형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "내지"는 주어진 범위 내의 말단 값을 포함한다 (예를 들어, 약 1 내지 약 50개의 뉴클레오티드 길이는 1개의 뉴클레오티드 및 50개의 뉴클레오티드를 포함한다).
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "아미노산"은 아미노산 유사체, 변형된 아미노산, 펩티드 모방제, 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체를 포함한 자연 및 합성 (비자연) 아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환 가능하며 아미노산의 중합체를 지칭한다. 폴리펩티드는 임의의 길이일 수 있다. 이는 분지형 또는 선형일 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있으며, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 아세틸화, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, 페길화, 비오티닐화, 가교결합 및/또는 접합을 통해 변형된 아미노산 중합체를 지칭한다 (예를 들어, 표지화 성분 또는 리간드를 수반함). 폴리펩티드 서열은 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 통상적인 N-말단에서 C-말단 배향으로 표시된다. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분자 생물학 분야의 일상적인 기술을 사용하여 만들 수 있다. 더욱이, 본질적으로 임의의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상업적 공급원으로부터 입수 가능하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질" 및 "키메라 단백질"은 단일 단백질에서 자연적으로 함께 발생하지 않는 2개 이상의 단백질, 단백질 도메인 또는 단백질 단편을 연결함으로써 생성된 단일 단백질을 지칭한다.
융합 단백질은 또한 에피토프 태그 (예를 들어, 히스티딘 태그, FLAG® [시그마 알드리치 (Sigma Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스)] 태그, Myc 태그), 리포터 단백질 서열 (예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 베타-갈락토시다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질, 청록색 형광 단백질, 황색 형광 단백질) 및/또는 핵산 서열 결합 도메인 (예를 들어, DNA 결합 도메인 또는 RNA 결합 도메인)을 포함할 수 있다. 융합 단백질은 적어도 하나의 핵 국재화 서열 (NLS), 예컨대 유인원 바이러스 40 (SV40) NLS 또는 뉴클레오플라스민 NLS를 포함할 수 있다. 융합 단백질은 또한 활성화제 도메인 (예를 들어, 열 충격 전사 인자, NFKB 활성화제) 또는 억제인자 도메인 (예를 들어, KRAB 도메인)을 포함할 수 있다. 문헌 [Lupo et al. (Current Genomics, 2013, 14(4):268-278)]에 기재된 바와 같이, KRAB 도메인은 강력한 전사 억제 모듈이며 대부분의 C2H2 징크 핑거 단백질의 아미노-말단 서열에 위치한다. 예를 들어, 문헌 [Margolin et al. (PNAS, 1994, 91:4509-4513); and Witzgall et al. (PNAS, 1994, 91:4514-4518 (1994)]을 참조한다. KRAB 도메인은 전형적으로 단백질-단백질 상호작용을 통해 공동-억제 단백질 및/또는 전사 인자와 결합하여, KRAB 징크 핑거 단백질 (KRAB-ZFP)과 결합하는 유전자의 전사 억제를 유발한다. 예를 들어, 문헌 [Friedman et al. (Genes & Development, 1996, 10:2067-2678)]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 링커 핵산 서열은 2개 이상의 단백질, 단백질 도메인 또는 단백질 단편을 연결하는데 사용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵 국재화 서열" (NLS) 또는 "핵 국재화 신호"는 단백질의 세포 핵으로의 세포하 국재화를 우선적으로 증가시키는 단백질의 폴리펩티드 서열을 지칭한다. NLS 서열은 전형적으로 단백질의 아미노-말단 ("N-말단"), 카르복실-말단 ("C-말단") 또는 단백질 내부에 위치하는 긍정적으로 변화된 아미노산 스트레치이다 (또는 그의 조합, 즉 N-말단에 하나 이상의 NLS가 있고 C-말단에 하나 이상의 NLS가 있다). NLS 서열은 단백질에 직접 공유 결합될 수 있거나 링커 폴리펩티드를 통해 연결될 수 있다. 링커 서열의 길이는 단백질의 구조적 특징 (예를 들어, 말단의 용매 접근성, 말단에 다른 중요한 기능적 펩티드 서열의 존재 등)에 근거하여 최적화되어 동족 임포르틴 단백질 결합 및 트래피킹을 위한 NLS 서열의 접근성을 보장할 수 있다. 부가적으로, 최적의 링커 길이는 경험적으로 스크리닝될 수 있다 (예를 들어, 실시예 11 참조). NLS 서열은 완전히 합성되거나 내인성 또는 외인성 단백질 서열로부터 유래될 수 있다. 계산 도구를 사용하여 단백질 내의 NLS 서열을 예측할 수 있다 (예를 들어, moseslab.csb.utoronto.ca/NLStradamus/, 또는 nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi 참조). NLS 서열의 예가 표 2에 제시되어 있다.
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본원에 사용된 바와 같은 "모이어티"는 분자의 일부분을 지칭한다. 모이어티는 작용기이거나 다수의 작용기 (예를 들어, 공통 구조적 측면을 공유하는 것)이 있는 분자의 일부분을 설명할 수 있다. 용어 "모이어티" 및 "작용기"는 전형적으로 상호교환 가능하게 사용되지만; "작용기"는 보다 구체적으로, 일부 공통의 화학적 행위를 포함하는 분자의 일부분을 지칭할 수 있다. "모이어티"는 종종 구조적 설명으로서 사용된다. 일부 실시양태에서, 5' 말단, 3' 말단, 또는 5' 말단과 3' 말단 (예를 들어, 제1 스템 요소 내의 비-천연 5' 말단 및/또는 비-천연 3' 말단)은 하나 이상의 모이어티를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "변형된 단백질", "돌연변이된 단백질", "단백질 변이체" 및 "조작 단백질"은 전형적으로 비-천연 서열을 포함하도록 변형된 단백질을 지칭한다 (즉, 변형된 단백질은 비변형된 단백질과 비교하여 고유한 서열을 갖는다).
본원에 사용된 바와 같은 "형질전환"은 삽입에 사용된 방법에 관계없이, 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 삽입하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 형질전환은 직접적인 흡수, 형질감염, 감염 등에 의한 것일 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 통합되지 않은 벡터, 예를 들어 에피솜으로서 유지될 수 있거나, 대안적으로 숙주 게놈으로 통합될 수 있다.
"숙주 세포"는 외인성 DNA 서열에 의해 형질전환되었거나 형질전환이 가능한 세포이다. 숙주 세포는 하나 이상의 세포를 갖는 임의의 유기체로부터 기원할 수 있다. 숙주 세포의 예는 원핵 세포, 진핵 세포, 박테리아 세포, 고세균 세포, 단세포 진핵 유기체의 세포, 원생동물 세포, 식물로부터의 세포, 조류 세포, 진균 세포 (예를 들어, 효모 세포, 버섯으로부터의 세포), 동물 세포, 무척추동물로부터의 세포, 척추동물로부터의 세포, 예컨대 포유동물 (예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류, 래트, 마우스, 비-인간 영장류, 인간 등)로부터의 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 더욱이, 숙주 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포, 또는 면역 체계의 세포, 예컨대 본원에 기재된 면역 체계의 세포 중 임의의 것일 수 있다. 숙주 세포는 인간 세포일 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포는 림프구 또는 줄기 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포일 수 있다. 림프구는 세포-매개, 세포독성 적응 면역을 위한 T 세포, 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포; 세포-매개, 세포독성 선천 면역에서 기능하는 자연 살해 (NK) 세포; 및 체액성 항체-구동 적응 면역을 위한 B 세포를 포함한다. 림프계 세포를 생성하는 조혈 줄기 세포가 또한 포함된다. 부가적으로, CAR-T 세포, TCR-조작된 CAR-T 세포를 포함한 T-세포 수용체 (TCR) 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), CAR TIL, CAR-NK 세포 등은 본원의 기술을 사용하여 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 세포는 인체 외부에 있다. 일부 실시양태에서, 살아있는 유기체의 신체 (예를 들어, 인체)의 세포는 생체외에서 (즉, 생체 외부에서) 조작된다. 생체외는 종종 치료 또는 시술을 위해 생체 (예를 들어, 인체)로부터 장기, 세포 또는 조직을 채취한 다음, 이를 생체에 돌려주는 의료 시술을 지칭한다. 생체내는 종종 생체 (예를 들어, 인체) 내의 장기, 세포 또는 조직이 치료 또는 시술을 받는 의료 시술을 지칭한다.
용어 "대상체", "개체" 또는 "환자"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되며, 인간 및 기타 영장류, 예를 들어 비-인간 영장류, 예컨대 레서스 마카크, 침팬지, 및 기타 원숭이 및 유인원 종; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가축 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 토끼, 마우스, 래트 및 기니피그를 포함한 실험실 동물; 가금류, 야생 및 사냥감 조류, 예컨대 닭, 칠면조 및 기타 순계류 조류, 오리 및 거위를 포함한 조류 등을 포함하며 이에 제한되지 않는 척삭동물 문의 임의의 구성원을 지칭한다. 이러한 용어는 특정한 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 상기 용어는 남성과 여성 뿐만 아니라 성인, 청소년 및 신생아 개체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 대상체로부터 유래된다 (예를 들어, 림프구, 줄기 세포, 전구 세포 또는 조직-특이적 세포). 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 대상체이다.
본원에 제공된 바와 같은 유전적으로 조작된 입양 세포와 같은 조성물 또는 작용제의 "유효량" 또는 "치료상 유효량"이라는 용어는 원하는 반응을 제공하기에 충분한 양의 조성물 또는 작용제를 지칭한다. 바람직하게, 유효량은 하나 이상의 유해한 부작용을 방지, 회피 또는 제거할 것이다. 그러한 반응은 문제의 특정한 질환에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 입양 세포 요법을 사용하여 암 치료를 받고 있는 환자에서, 원하는 반응은 하기 중 하나 이상을 포함, 예방, 회피 또는 제거할 수 있다: 이식편 대 숙주 질환 (GvHD), 숙주 대 이식편 거부반응, 시토카인 방출 증후군 (CRS), 시토카인 폭풍 및 투여된 유전적으로 변형된 세포의 발암성 형질전환의 감소의 영향의 치료 또는 예방. 요구되는 정확한 치료량은 대상체의 종, 연령 및 일반적인 상태, 치료 중인 병태의 중증도, 및 사용된 특정한 변형된 림프구, 투여 방식 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 임의의 개별적인 경우에 적절한 "유효"량은 일상적인 실험을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
특정한 질환, 예컨대 암성 병태 또는 GvHD를 "치료" 또는 "치료하는 것"은 하기를 포함한다: 질환을 예방하는 것, 예를 들어 질환의 발생을 예방하거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있지만 질환의 증상을 아직 경험하거나 나타내지 않는 대상체에서 질환의 강도가 약하게 발생하도록 하는 것; 질환을 억제하는 것, 예를 들어 발생 비율을 감소시키는 것, 발생을 저지하는 것, 또는 질환 상태를 역전시키는 것; 및/또는 질환의 증상을 완화시키는 것, 예를 들어 대상체가 경험하는 증상의 수를 감소시키는 것.
Cas12 가이드
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자는 동족 Cas12 단백질, 예컨대 Cas12a 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있으며, 여기서 상기 복합체는 표적화 영역에 상보적인 표적 서열 (스페이서 서열)을 표적화할 수 있다.
도 1A는 하기를 포함하는 아시다미노코쿠스 종 BV3l6 Cas12a 가이드 분자의 예를 예시한다: 스템-루프 이중체 (도 1A, 102)를 포함하는 활성화 영역 (도 1A, 101); 및 표적 결합 서열 (도 1A, 104)을 포함하는 스페이서 서열 (도 1A, 103). 도 1B는 하기를 포함하는 대안적 Cas12a 가이드 분자를 예시한다: 스템-루프 이중체 (도 1B, 106)를 포함하는 활성화 영역 (도 1B, 105); 및 표적 결합 서열 (도 1B, 108) 및 3' 연장부 (도 1B, 109)를 포함하는 스페이서 서열 (도 1B, 107). 3' 연장부 (도 1B, 109)는 링커 서열을 통해 스페이서 서열 (도 1B, 107)에 연결될 수 있다. 도 1C는 하기를 포함하는 대안적 Cas12a 가이드 분자를 예시한다: 스템-루프 이중체 (도 1C, 111)를 포함하는 활성화 영역 (도 1C, 110) 및 링커 뉴클레오티드 (도 1C, 114) 및 5' 연장부 (도 1C, 115); 및 표적 결합 서열 (도 1C, 113)을 포함하는 스페이서 서열 (도 1C, 112).
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자에서, 표적화 영역은 DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역은 DNA 및 RNA 둘 다를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적화 영역은 또한 다른 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위 등 뿐만 아니라 합성, 자연적으로 발생하는 및 비-자연적으로 발생하는 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자에서, 활성화 영역은 DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화 영역은 DNA 및 RNA 둘 다를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성화 영역은 또한 다른 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위 등 뿐만 아니라 합성, 자연적으로 발생하는 및 비-자연적으로 발생하는 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성화 영역은 표적화 영역에 인접해 있다. 특정 실시양태에서, 활성화 영역은 표적화 영역으로부터의 하류에 있다. 특정 실시양태에서, 활성화 영역은 표적화 영역으로부터의 상류에 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자는 리보뉴클레오티드 염기 및 약 2% 이하, 3% 이하, 4% 이하, 5% 이하, 6% 이하, 7% 이하, 8% 이하, 9% 이하, 10% 이하, 11% 이하, 12% 이하, 13% 이하, 14% 이하, 15% 이하, 16% 이하, 17% 이하, 18% 이하, 19% 이하, 20% 이하, 21% 이하, 22% 이하, 23% 이하, 24% 이하, 25% 이하, 26% 이하, 27% 이하, 28% 이하, 29% 이하, 30% 이하, 31% 이하, 32% 이하, 33% 이하, 34% 이하, 35% 이하, 36% 이하, 37% 이하, 38% 이하, 39% 이하, 40% 이하, 41% 이하, 42% 이하, 43% 이하, 44% 이하, 45% 이하, 46% 이하, 47% 이하, 48% 이하, 49% 이하, 50% 이하, 55% 이하, 60% 이하, 65% 이하, 70% 이하, 또는 75% 이하의 데옥시리보뉴클레오티드 염기, 또는 그의 변이체 또는 변형된 유도체를 포함하는 핵산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드는, 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 30 내지 75개 염기일 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드는 무염기 부위를 포함하여 길이가 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 또는 75개 염기이다. 일부 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드는 무염기 부위를 포함하여 길이가 40개 염기이다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 폴리뉴클레오티드 서열, 예컨대 Cas12 chRDNA 가이드, 활성화 영역 또는 표적화 영역의 "전체 길이의 백분율로서"는, 예를 들어, 무염기 부위, 및 변형된 및 변이체 염기를 포함한 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 길이를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 활성화 영역은 무염기 부위를 포함하여 길이가 10 내지 25개 염기이다. 일부 실시양태에서, 활성화 영역은 무염기 부위를 포함하여 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 염기이다. 일부 실시양태에서, 활성화 영역은 무염기 부위를 포함하여 길이가 20개 염기이다.
일부 실시양태에서, 표적화 영역은 무염기 부위를 포함하여 길이가 10-30개 염기이다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역은 무염기 부위를 포함하여 길이가 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 염기이다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역은 무염기 부위를 포함하여 길이가 20개 염기이다.
본원의 실시양태에서, 활성화- 및/또는 표적화 영역은 리보뉴클레오티드 염기 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함한다. 활성화- 및/또는 표적화 영역은 또한 일부 실시양태에서, 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위 또는 그의 조합을 포함한 부가의 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 활성화- 및/또는 표적화 영역은 합성, 자연적으로 발생하는 또는 비-자연적으로 발생하는 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합을 함유할 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기는 표적화 영역 내의 임의의 하나 이상의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 30개 염기인 표적화 영역의 경우, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기가 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 하나 이상에 존재할 수 있다. 더 작은 표적화 영역의 경우, 그에 따라 위치가 감소될 것이다. 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 20개 염기인 표적화 영역의 경우, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기가 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 하나 이상에 존재할 수 있다.
하나 이상의 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)이 표적화 영역 내의 임의의 하나 이상의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 30개 염기인 표적화 영역의 경우, 하나 이상의 부가의 변형이 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 중 하나 이상에 존재할 수 있다. 더 작은 표적화 영역의 경우, 그에 따라 위치가 감소될 것이다. 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 20개 염기인 표적화 영역의 경우, 하나 이상의 부가의 변형이 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 하나 이상에 존재할 수 있다.
하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기는 활성화 영역 내의 임의의 하나 이상의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 25개 염기인 활성화 영역의 경우, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기가 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 중 하나 이상에 존재할 수 있다. 더 작은 활성화 영역의 경우, 그에 따라 위치가 감소될 것이다. 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 20개 염기인 활성화 영역의 경우, 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기가 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 하나 이상에 존재할 수 있다.
하나 이상의 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)이 활성화 영역 내의 임의의 하나 이상의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 25개 염기인 활성화 영역의 경우, 하나 이상의 부가의 변형이 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 중 하나 이상에 존재할 수 있다. 더 작은 활성화 영역의 경우, 그에 따라 위치가 감소될 것이다. 예를 들어, 무염기 부위를 포함하여 길이가 20개 염기인 활성화 영역의 경우, 하나 이상의 부가의 변형이 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 중 하나 이상에 존재할 수 있다.
일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 Cas12 chRDNA 가이드의 전체 크기의 백분율로서 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양은 바람직하게 75% 이하이다. 일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 Cas12 chRDNA 가이드의 전체 크기의 백분율로서 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양은 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 또는 5% 이하이다.
일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 Cas12 chRDNA 가이드의 전체 크기의 백분율로서, 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)의 양은 바람직하게 75% 이하이다. 일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 Cas12 chRDNA 가이드의 전체 크기의 백분율로서, 부가의 변형의 양은 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 또는 5% 이하이다.
일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 표적화 영역의 전체 크기의 백분율로서, 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양은 바람직하게 75% 이하이다. 일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 표적화 영역의 전체 크기의 백분율로서, 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양은 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 또는 5% 이하이다.
일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 표적화 영역의 전체 크기의 백분율로서, 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)의 양은 바람직하게 75% 이하이다. 일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 표적화 영역의 전체 크기의 백분율로서, 부가의 변형의 양은 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 또는 5% 이하이다.
일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 활성화 영역의 전체 크기의 백분율로서, 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양은 바람직하게 75% 이하이다. 일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 활성화 영역의 전체 크기의 백분율로서, 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양은 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 또는 5% 이하이다.
일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 활성화 영역의 전체 크기의 백분율로서, 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)의 양은 바람직하게 75% 이하이다. 일부 실시양태에서, 무염기 부위를 포함하여 활성화 영역의 전체 크기의 백분율로서, 부가의 변형의 양은 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 24% 이하, 23% 이하, 22% 이하, 21% 이하, 20% 이하, 19% 이하, 18% 이하, 17% 이하, 16% 이하, 15% 이하, 14% 이하, 13% 이하, 12% 이하, 11% 이하, 10% 이하, 9% 이하, 8% 이하, 7% 이하, 6% 이하, 또는 5% 이하이다.
일부 실시양태에서, 활성화 영역 및/또는 표적화 영역 내의 데옥시리보뉴클레오티드 염기의 양은, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오티드 염기가 없는 상응하는 활성화 영역 및/또는 표적화 영역과 비교 시 통계적으로 유의미한 차이를 제공하도록 조정된다. 일부 실시양태에서, 통계적으로 유의미한 차이는 온-표적 또는 오프-표적 편집에서의 차이이다.
일부 실시양태에서, 활성화 영역 및 표적화 영역은 각각 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 활성화 영역은 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 함유하고, 표적화 영역은 임의의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 함유하지 않는다 (예를 들어, RNA 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드만을 함유한다). 일부 실시양태에서, 표적화 영역은 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 함유하고, 활성화 영역은 임의의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 함유하지 않는다 (예를 들어, RNA 및/또는 변형된 리보뉴클레오티드만을 함유한다).
일부 실시양태에서, 활성화 영역 및 표적화 영역은 각각 하나 이상의 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)을 함유한다. 일부 실시양태에서, 활성화 영역은 하나 이상의 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)을 함유하고, 표적화 영역은 임의의 부가의 변형을 함유하지 않는다 (즉, RNA 또는 DNA만을 함유한다). 일부 실시양태에서, 표적화 영역은 하나 이상의 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)을 함유하고, 활성화 영역은 임의의 부가의 변형을 함유하지 않는다 (즉, RNA 또는 DNA만을 함유한다).
도 2는 표적 결합 서열 (도 2, 205)을 포함하는 동족 Cas12a chRDNA 가이드 분자 (도 2, 204)와 결합된 Cas12a 단백질 (도 2, 206)을 예시한다. Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 서열을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 풀고, Cas12 chRDNA 가이드 분자의 표적 결합 서열 (도 2, 205)은 수소 결합 (도 2, 폴리뉴클레오티드 사이의 수직선으로써 표시됨)을 통해 표적 서열 (도 2, 207)에 연결된다. 도 2에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 표적 서열 (도 2, 207)을 포함하는 표적 가닥 (도 2, 201) 및 PAM 서열 (도 2, 203)을 포함하는 비-표적 가닥 (도 2, 202)을 포함한다. PAM 서열 (도 2, 203)은 전형적으로 비-표적 가닥 (도 2, 202) 상의 표적 서열 (도 2, 207)의 상류 (즉, 5' 방향)에서 발생한다. Cas12a chRDNA 가이드 분자의 표적 결합 서열 (도 2, 205)과 표적 서열 (도 2, 207) 간의 수소 결합의 형성은 표적 가닥 (도 2, 201)과 비-표적 가닥 (도 2, 202)의 엇갈린 절단 (도 2, 208)을 초래한다.
도 3A-도 3I는 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자에 사용하기 위한 다양한 정규 및 비-정규 뉴클레오티드를 예시한다. 표 3은 도 3A-도 3I에 사용된 일련의 지표를 나타낸다.
Figure pct00004
도 4는 표적 결합 서열 (도 4, 405)을 포함하는 동족 Cas12a chRDNA 가이드 분자 (도 4, 404)와 결합된 Cas12a 단백질 (도 4, 406)을 예시하며, 여기서 표적 결합 서열 (도 4, 405)은 비-RNA 뉴클레오티드 (도 4, 409), 에컨대 도 3B-도 3I에 제시된 정규 및 비-정규 뉴클레오티드를 포함한다. Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 서열을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드를 풀고, Cas12 chRDNA 가이드 분자의 표적 결합 서열 (도 4, 405)은 수소 결합 (도 4, 폴리뉴클레오티드 사이의 수직선으로써 표시됨)을 통해 표적 서열 (도 4, 407)에 연결된다. 도 4에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 표적 서열 (도 4, 407)을 포함하는 표적 가닥 (도 4, 401), 및 PAM 서열 (도 4, 403)을 포함하는 비-표적 가닥 (도 4, 402)을 포함한다. PAM 서열 (도 4, 403)은 전형적으로 비-표적 가닥 (도 4, 402) 상의 표적 서열 (도 4, 407)의 상류 (즉, 5' 방향)에서 발생한다. chRDNA 가이드 분자의 표적 결합 서열 (도 4, 405)과 표적 서열 (도 4, 407) 간의 수소 결합의 형성은 표적 가닥 (도 4, 401)과 비-표적 가닥 (도 4, 402)의 엇갈린 절단 (도 4, 408)을 초래한다.
도 5는 하기를 포함하는 아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a crRNA 가이드 분자의 예를 예시한다: 스템-루프 이중체 (도 5, 502)를 포함하는 활성화 영역 (도 5, 501); 및 표적 결합 서열 (도 5, 504)을 포함하는 스페이서 (도 5, 503). 활성화 영역 (도 5, 501) 및 스페이서 (도 5, 503) 내의 각각의 뉴클레오티드 위치는 가이드 분자의 5' 단부에서 시작하여 표지되며, 여기서 활성화 영역 및 표적 결합 영역은 각각 RNA를 포함한다.
도 6은 하기를 포함하는 아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a chRDNA 가이드 분자의 예를 예시한다: 스템-루프 이중체 (도 6, 602)를 포함하는 활성화 영역 (도 6, 601); 및 표적 결합 서열 (도 6, 604)을 포함하는 스페이서 (도 6, 603). 활성화 영역 (도 6, 601) 및 스페이서 (도 6, 603) 내의 각각의 뉴클레오티드 위치는 가이드 분자의 5' 단부에서 시작하여 표지되며, 여기서 활성화 영역은 RNA (흰색 채우기) 및 DNA (회색 채우기)의 혼합물을 포함하고 표적 결합 서열은 RNA (흰색 채우기) 및 DNA (회색 채우기)의 혼합물을 포함한다.
도 7은 하기를 포함하는 아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a chRDNA 가이드 분자의 예를 예시한다: 스템-루프 이중체 (도 7, 702)를 포함하는 활성화 영역 (도 7, 701) 및 표적 결합 서열 (도 7, 704)을 포함하는 스페이서 (도 7, 703). 활성화 영역 (도 7, 701) 및 스페이서 (도 7, 703) 내의 각각의 뉴클레오티드 위치는 가이드 분자의 5' 단부에서 시작하여 표지되며, 여기서 활성화 영역은 RNA (흰색 채우기) 및 DNA (회색 채우기)의 혼합물을 포함한다. Cas12a chRDNA 가이드 분자는 다른 비-정규 뉴클레오티드, 예컨대 화학적으로 변형된 당 뉴클레오티드 (도 7, 705), 무염기 리보뉴클레오티드 (도 7, 706), 화학적으로 변형된 백본을 갖는 데옥시리보뉴클레오티드 (도 7, 707), 화학적으로 변형된 백본을 갖는 리보뉴클레오티드 (도 7, 708) 및 무염기 데옥시-리보뉴클레오티드 (도 7, 709)를 추가로 포함한다.
도 8은 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 형성을 예시하며, 여기서 Cas12 단백질 (도 8, 801)은 Cas12 chRDNA 가이드 분자 (도 8, 802)와 결합하여 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 (도 8, 803)를 형성한다. Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 (도 8, 803)는 표적 폴리뉴클레오티드 (도 8, 804)와 결합하며, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드는 Cas12 chRDNA 가이드 분자의 표적 결합 서열에 상보적인 표적 서열을 함유하고, Cas12 chRDNA 가이드 분자의 표적 결합 서열과 표적 서열 (도 8, 805) 간에 수소 결합이 형성된다.
도 9는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의한 표적 폴리뉴클레오티드에서의 삽입 또는 결실 (indel)의 생성을 예시하며, 여기서 Cas12 chRDNA 가이드 분자 (도 9, 902)와 복합체 형성된 Cas12 단백질 (도 9, 901)은 PAM (도 9, 904)을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 (도 9, 903)와 결합하고, 표적 폴리뉴클레오티드는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의해 절단된다 (도 9, 905). 표적화가 발생한 후, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 (도 9, 906)로부터 해리되며, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드는 PAM (도 9, 904)에 비해 상류 (즉, 5' 방향으로) 가닥 (도 9, 907) 및 하류 (즉, 3' 방향으로) 가닥 (도 9, 908)을 포함한다. 세포 DNA 복구 기구는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 절단 부위 주위의 서열의 삽입 또는 결실 (도 9, 910)을 통해 표적 폴리뉴클레오티드를 복구한다. 상류 가닥 (도 9, 911) 및 하류 가닥 (도 9, 912)은 재연결되고 편집된 표적 폴리뉴클레오티드 (도 9, 914)는 절단 부위에서 indel (도 9, 913)을 포함하며, 여기서 편집된 표적 폴리뉴클레오티드는 편집되지 않은 표적 폴리뉴클레오티드에 비해 상이한 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의한 표적 폴리뉴클레오티드에서의 삽입 또는 결실 (indel)의 생성은 세포 내부에서 발생한다.
도 10은 표적 폴리뉴클레오티드 내로의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 혼입을 예시하며, 여기서 Cas12 chRDNA 가이드 분자 (도 10, 1002)와 복합체 형성된 Cas12 단백질 (도 10, 1001)은 PAM (도 10, 1004)을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 (도 10, 1003)와 결합하고, 표적 폴리뉴클레오티드는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의해 절단된다 (도 10, 1005). 표적화가 발생한 후, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 (도 10, 1006)로부터 해리되며, 여기서 표적 폴리뉴클레오티드는 PAM (도 10, 1004)에 비해 상류 (즉, 5' 방향으로) 가닥 (도 10, 1007) 및 하류 (즉, 3' 방향으로) 가닥 (도 10, 1008)을 포함하고, 공여자 폴리뉴클레오티드가 제공된다 (도 10, 1009). 세포 DNA 복구 기구는 공여자 폴리뉴클레오티드 (도 10, 1011)를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 (도 10, 1010)를 복구한다. 그 결과로 생성된 편집된 표적 폴리뉴클레오티드 (도 10, 1010)는 표적 부위에 공여자 서열 (도 10, 1011)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 내로의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 혼입은 세포 내부에서 발생한다.
도 11은 표적 폴리뉴클레오티드의 닉킹을 예시하며, 여기서 표적 결합 서열 (도 11, 1106) 내의 DNA 염기를 포함하는, Cas12 chRDNA 가이드 분자 (도 11, 1102)와 복합체 형성된 Cas12 단백질 (도 11, 1101)은 PAM (도 11, 1104)을 포함하는 표적 폴리뉴클레오티드 (도 11, 1103)와 결합하고, 표적 폴리뉴클레오티드는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의해 표적 폴리뉴클레오티드의 한 가닥에서만 닉킹된다 (도 11, 1105).
도 12는 표적 폴리뉴클레오티드에서 엇갈린 이중 가닥 파손부를 생성하기 위한 2개의 닉킹 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 사용을 예시하며, 여기서 제1 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 (도 12, 1201)의 상류 (즉, 5' 방향으로) 표적 서열과 결합하여 표적 폴리뉴클레오티드 내에 제1 닉을 생성하고 (도 12, 1202), 제2 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 (도 12, 1203)의 하류 (즉, 3' 방향으로) 표적 서열과 결합하여 표적 폴리뉴클레오티드 내에 제2 닉을 생성한다 (도 12, 1204). 탠덤 닉킹이 발생한 후, 절단 후 표적 폴리뉴클레오티드는 5' 오버행을 갖는 상류 (즉, 5' 방향으로) 가닥 (도 12, 1205) 및 하류 (즉, 3' 방향으로) 가닥 (도 12, 1206)을 포함한다. 공여자 폴리뉴클레오티드가 제공되고, 세포 DNA 복구 기구는 공여자 폴리뉴클레오티드 (도 12, 1208)를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드 (도 12, 1207)를 복구한다. 그 결과로 생성된 편집된 표적 폴리뉴클레오티드 (도 12, 1209)는 탠덤 닉킹된 부위에 공여자 서열 (도 12, 1210)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 폴리뉴클레오티드에서 엇갈린 DSB를 생성하기 위한 2개의 닉킹 Cas12chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 사용은 세포 내부에서 발생한다.
도 13은 DNA 염기에 순응하는 아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a chRDNA 가이드 분자의 표적 결합 서열에서의 위치를 예시한다. y축은 표적 결합 서열 내의 단일 위치에서 DNA가 있는 다중 표적의 정규화된 퍼센트 편집 (실시예 5 참조)을 나타낸다 (오차 막대는 표준 편차를 나타낸다). x축은 표적 결합 서열 내의 각각의 위치의 위치 (5'에서 3')를 나타낸다. 표적 결합 서열은 그래프 위에 예시되며 (도 13, 1301), DNA 염기 활용의 바람직한 위치 (즉, 70% 초과의 평균 정규화된 편집)는 회색으로 채워져 표시된다. Cas12a chRDNA 활성화 영역의 위치가 또한 표시된다 (도 13, 1302).
도 14는 DNA 염기에 순응하는 아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a chRDNA 가이드 분자의 활성화 영역에서의 위치를 예시한다 (실시예 8 참조). y축은 활성화 영역 내의 단일 위치에서 DNA가 있는 가이드 분자의 정규화된 퍼센트 편집을 나타낸다. x축은 활성화 영역 내의 각각의 위치의 위치 (5'에서 3')를 나타낸다. 활성화 영역은 그래프의 왼쪽에 예시되어 있으며 (도 14, 1401), DNA 염기 활용의 바람직한 위치 (즉, 70% 초과의 평균 정규화된 편집)는 회색으로 채워져 표시된다. Cas12a chRDNA 가이드 표적 결합 서열의 위치가 또한 표시된다 (도 14, 1402).
도 15A 및 도 15B는 Cas12a/chRDNA 핵단백질 복합체를 사용하여 조작된 CAR-T 세포의 유동 세포계수법 분석을 예시한다. 도 15A는 항-BCMA CAR (도 15A, 1501), TRAC 단백질 (도 15A, 1502) 및 B2M 단백질 (도 15A, 1503)을 발현하는 세포의 퍼센트를 보여준다. x축은 미처리된 세포 (도 15A, 1504), TRAC 및 B2M 유전자 둘 다를 표적으로 하는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체로 형질감염된 세포 (도 15A, 1505), 및 TRAC 및 B2M 유전자 둘 다를 표적으로 하는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 둘 다로 형질감염되고 각각 항-BCMA CAR 및 B2M-HLA-E 융합 유전자를 코딩하는 DNA 공여자를 함유하는 2개의 바이러스로 형질도입된 세포 (도 15A, 1506)를 나타낸다. y축은 다양한 세포 표면 마커에 대해 유동 세포계수법을 통해 측정된 바와 같은 양성 세포 퍼센트를 나타낸다. 도 15B는 BCMA-양성 표적 세포주에 대항한 항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T 세포 (회색 원) 및 대조군 TRAC KO T 세포 (흑색 원)에 대한 시험관내 세포독성 검정으로부터의 결과를 예시한다. y축은 표적 세포 사멸의 퍼센트를 나타내고, x축은 사용된 E:T 비율을 나타낸다. 각각의 데이터 포인트는 각각의 E:T 비율에서 3개의 공동-배양 웰의 평균을 나타낸다.
도 16A 및 도 16B는 다중 링커 및 핵 국재화 서열 (NLS) 구성을 포함하는 Cas12a/chRDNA 핵단백질 복합체의 세포 편집 활성을 예시한다. 도 16A 및 도 16B 내의 그래프의 y축은 차세대 시퀀싱에 의해 측정된 바와 같은 편집 퍼센트를 나타낸다. 도 16A에서, x축은 각각의 링커-NLS 구성을 나타내며, 여기서 각각의 데이터 포인트는 반복 측정을 나타낸다. 도 16B에서, x축은 '비최적화된' 링커-NLS 구성 (도 16B, 1613) 뿐만 아니라 도 16A에 나타낸 상위 4개의 링커-NLS 설계의 Cas12a 및 chRDNA 가이드의 pmol 농도 (20:60 또는 80:240 pmol)를 나타낸다. 각각의 데이터 포인트는 고유한 가이드 표적 서열을 나타내며 데이터 포인트당 3회 반복실험 측정의 평균이다.
도 17은 단일 형질감염 반응에서 다중 Cas12a 가이드를 공동-전달할 때 GS-SV40 (도 7, 1708; 서열식별번호: 479) 및 (G4S)2-NPL (도 7, 1712; 서열식별번호: 489)과의 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 세포 편집 활성을 예시한다. 도 17의 y축은 차세대 시퀀싱에 의해 측정된 바와 같은 편집 퍼센트를 나타낸다. 도 17에서, x축은 표적 유전자를 TRAC 유전자 (도 17, 1701; 서열식별번호: 36), B2M 유전자 (도 17, 1702; 서열식별번호: 62), CISH 유전자 (도 17, 1703; 서열식별번호: 158) 또는 CBLB 유전자 (도 17, 1704; 서열식별번호: 171)로서 나타낸다. Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 형질감염당 단일 표적화 복합체 (도 17, 1705 및 도 17, 1709), 형질감염당 2개의 표적화 복합체 (도 17, 1706 및 도 17, 1710) 또는 형질감염당 4개의 표적 복합체 (도 17, 1707 및 도 17, 1711)로서 사용되었다. 각각의 막대는 2 내지 3회 반복실험의 평균을 나타낸다.
데옥시리보뉴클레오티드 염기 및 임의로 부가의 변형 (예컨대 염기 유사체, 변형된 뉴클레오티드, 무염기 부위, 변형된 백본 잔기 또는 연결, 또는 그의 조합)이 설계될 수 있는 특정한 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 설계하는 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Briner et al. (Molecular Cell, 2014, 56:333-339)]을 참조한다. 이를 위해, 표적화될 유전자에 대한 게놈 서열을 먼저 확인한다. 표적으로 하기 위해 선택한 유전자의 정확한 영역은 구체적 적용에 따라 다를 것이다. 예를 들어, CRISPR 활성화 또는 CRISPR 억제를 사용하여 표적 유전자를 활성화 또는 억제하기 위해, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 관심 유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 표적화될 수 있다. 유전적 녹아웃의 경우, Cas12 chRDNA 가이드 분자는 대안적 스플라이싱으로 인해 mRNA로부터 표적화된 영역이 제거될 가능성을 감소시키기 위해, 5' 구성적으로 발현된 엑손을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. N-말단 근처의 엑손은, 여기서 프레임시프트 돌연변이가 비기능적 단백질 산물의 생산 가능성을 증가시킬 것이기 때문에 표적이 될 수 있다. 대안적으로, 동족 Cas12 chRDNA 가이드 분자는 공지된 필수 단백질 도메인을 코딩하는 엑손을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 이와 관련하여, 비-프레임시프트 돌연변이, 예컨대 삽입 또는 결실은, 단백질 기능에 필수적인 단백질 도메인에서 발생할 때 단백질 기능을 변경시킬 가능성이 더 크다. HDR을 사용한 유전자 편집의 경우, 표적 서열이 원하는 편집 위치에 가까워야 한다. 이러한 경우, 편집이 필요한 위치를 확인하고 근처의 표적 서열을 선택한다.
일부 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드 분자는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체가 Cas12 단백질의 절단 부위 외부와 결합할 수 있도록 설계될 수 있다. 이러한 경우, 표적 핵산은 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체와 상호작용하지 않을 수 있으며 표적 핵산을 절제할 수 있다 (예를 들어, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체가 없음). 일부 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드 분자는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체가 Cas12 단백질의 절단 부위 내부와 결합할 수 있도록 설계될 수 있다. 이러한 경우, 표적 핵산은 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체와 상호작용할 수 있고 표적 핵산은 결합될 수 있다 (예를 들어, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체와 결합된다).
Cas12 chRDNA 가이드 분자는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체가 핵산 샘플 내의 복수 개의 위치와 혼성화할 수 있는 방식으로 설계될 수 있다. 복수 개의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체가 핵산 샘플에 접촉될 수 있다. 복수 개의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 동일한 서열과 혼성화하도록 설계된 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 포함할 수 있다. 복수 개의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 상이한 표적 서열과 혼성화하도록 설계된 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 포함할 수 있다.
표적 서열은 표적 핵산 내의 상이한 위치에 있을 수 있다. 위치는 동일하거나 유사한 표적 핵산 서열을 포함할 수 있다. 위치는 상이한 표적 핵산 서열을 포함할 수 있다. 위치는 서로의 거리에 따라 정의될 수 있다. 위치는 10 킬로염기 (Kb) 미만의 간격, 8 Kb 미만의 간격, 6 Kb 미만의 간격, 4 Kb 미만의 간격, 2 Kb 미만의 간격, 1 Kb 미만의 간격, 900개 뉴클레오티드 미만의 간격, 800개 뉴클레오티드 미만의 간격, 700개 뉴클레오티드 미만의 간격, 600개 뉴클레오티드 미만의 간격, 500개 뉴클레오티드 미만의 간격, 400개 뉴클레오티드 미만의 간격, 300개 뉴클레오티드 미만의 간격, 200개 뉴클레오티드 미만의 간격 또는 100개 뉴클레오티드 미만의 간격일 수 있다.
Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 핵산을 절단할 수 있으며, 이로 인해 10 킬로염기 (Kb) 미만 길이, 8 Kb 미만 길이, 6 Kb 미만 길이, 4 Kb 미만 길이, 2 Kb 미만 길이, 1 Kb 미만 길이, 900개 뉴클레오티드 미만 길이, 800개 뉴클레오티드 미만 길이, 700개 뉴클레오티드 미만 길이, 600개 뉴클레오티드 미만 길이, 500개 뉴클레오티드 미만 길이, 400개 뉴클레오티드 미만 길이, 300개 뉴클레오티드 미만 길이, 200개 뉴클레오티드 미만 길이, 또는 100개 뉴클레오티드 미만 길이일 수 있는 절제된 표적 핵산이 초래될 수 있다.
Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 10 킬로염기 (Kb) 미만 길이, 8 Kb 미만 길이, 6 Kb 미만 길이, 4 Kb 미만 길이, 2 Kb 미만 길이, 1 Kb 미만 길이, 900개 뉴클레오티드 미만 길이, 800개 뉴클레오티드 미만 길이, 700개 뉴클레오티드 미만 길이, 600개 뉴클레오티드 미만 길이, 500개 뉴클레오티드 미만 길이, 400개 뉴클레오티드 미만 길이, 300개 뉴클레오티드 미만 길이, 200개 뉴클레오티드 미만 길이, 또는 100개 뉴클레오티드 미만 길이일 수 있는 단편화된 표적 핵산과 결합될 수 있다.
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자는 공지된 방법에 의해, 예컨대 용액 중에서 또는 고체 지지체 상에서 화학적으로 시험관내에서 합성될 수 있거나, 또는 일부 경우에, 재조합적으로 생산될 수 있다. 데옥시리보뉴클레오티드 염기 및/또는 변형이 서열 길이 전체에 걸쳐 하나 이상의 위치에 도입될 수 있는 단일 생산 또는 합성 기술, 또는 생산 및 합성 기술의 조합이 이용될 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드 분자, 그의 표적화 영역, 또는 그의 활성화 영역은 각각 리보뉴클레오티드 염기로 구성된, 참조 Cas12 chRDNA 가이드 분자, 참조 표적화 영역 또는 참조 활성화 영역과 비교 시 특정 위치에서 데옥시리보뉴클레오티드 염기(들) (및/또는 변형된 데옥시리보뉴클레오티드 염기(들))를 함유하도록 설계된다.
일부 실시양태에서, 참조 Cas12a chRDNA 가이드 분자는 하기 RNA 서열: UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGUCUCUCAGCUGGUACAC를 함유한다. 이러한 참조 RNA 서열에 기초하여 설계된, 본 개시내용의 Cas12a chRDNA 가이드 분자는 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40 중 하나 이상에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 갖는 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 열거된 위치 중 23개 이하, 22개 이하, 21개 이하, 20개 이하, 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개는 데옥시리보뉴클레오티드 염기이다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역 내의 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 모두는 표적 서열과 정규 염기쌍을 형성한다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역 내의 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 중 적어도 하나는 표적 서열과 정규 염기쌍을 형성하지 않는다.
일부 실시양태에서, 참조 Cas12a chRDNA 가이드 분자는 하기 RNA 서열: UAAUUUCUACUCUUGUAGAUAGUGGGGGUGAAUUCAGUGU를 함유한다. 이러한 참조 RNA 서열에 기초하여 설계된, 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자는 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40 중 하나 이상에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 갖는 Cas12a chRDNA 가이드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 열거된 위치 중 23개 이하, 22개 이하, 21개 이하, 20개 이하, 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개는 데옥시리보뉴클레오티드 염기이다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역 내의 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 모두는 표적 서열과 정규 염기쌍을 형성한다. 일부 실시양태에서, 표적화 영역 내의 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기 중 적어도 하나는 표적 서열과 정규 염기쌍을 형성하지 않는다.
일부 실시양태에서, 참조 활성화 영역은 하기 RNA 서열: UAAUUUCUACUCUUGUAGAU를 함유한다. 이러한 참조 RNA 서열에 기초하여 설계된, 본 개시내용의 데옥시리보뉴클레오티드 염기-함유 활성화 영역은 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 및 19 중 하나 이상에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 갖는 활성화 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 열거된 위치 중 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개는 데옥시리보뉴클레오티드 염기이다.
일부 실시양태에서, 참조 표적화 영역은 하기 RNA 서열: GAGUCUCUCAGCUGGUACAC를 함유한다. 이러한 참조 RNA 서열에 기초하여 설계된, 본 개시내용의 데옥시리보뉴클레오티드 염기-함유 표적화 영역은 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 하나 이상에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 갖는 표적화 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 열거된 위치 중 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개는 데옥시리보뉴클레오티드 염기이다.
일부 실시양태에서, 참조 표적화 영역은 하기 RNA 서열: AGUGGGGGUGAAUUCAGUGU를 함유한다. 이러한 참조 RNA 서열에 기초하여 설계된, 본 개시내용의 데옥시리보뉴클레오티드 염기-함유 표적화 영역은 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 하나 이상에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 갖는 표적화 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이들 열거된 위치 중 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개는 데옥시리보뉴클레오티드 염기이다.
일부 실시양태에서, 활성화 영역은 서열 TrAArUrUrUCrUrACrUCrUTGrUrArGArU (여기서 "r"은 리보뉴클레오티드 염기에 선행하고, 염기 앞에 "r"이 없으면 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 나타냄)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 표적화 영역은 서열 GrArGrUrCrUrCrUrCrAGrCrUrGrGrUrArCrAC (여기서 "r"은 리보뉴클레오티드 염기에 선행하고, 염기 앞에 "r"이 없으면 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 나타냄)를 갖는다.
일부 실시양태에서, 표적화 영역은 서열 ArGrUrGrGrGrGrGrUrGArArUrUrCrArGrUrGT (여기서 "r"은 리보뉴클레오티드 염기에 선행하고, 염기 앞에 "r"이 없으면 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 나타냄)를 갖는다.
일부 실시양태에서, Cas12a chRDNA 가이드는 서열 TrAArUrUrUCrUrACrUCrUTGrUrArGArUGrArGrUrCrUrCrUrCrAGrCrUrGrGrUrArCrAC (여기서 "r"은 리보뉴클레오티드 염기에 선행하고, 염기 앞에 "r"이 없으면 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 나타냄)를 갖는다.
일부 실시양태에서, Cas12a chRDNA 가이드는 서열 TrAArUrUrUCrUrACrUCrUTGrUrArGArUArGrUrGrGrGrGrGrUrGArArUrUrCrArGrUrGT (여기서 "r"은 리보뉴클레오티드 염기에 선행하고, 염기 앞에 "r"이 없으면 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 나타냄)를 갖는다.
Cas12 단백질
본 개시내용의 Cas12 단백질은 유형 V CRISPR-Cas 시스템으로부터 유래된 Cas12 야생형 단백질, 변형된 Cas12 단백질, Cas12 단백질의 변이체, Cas12 오르토로그, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, Cas12 단백질은 야생형 Cas12a 단백질, 변형된 Cas12a 단백질, Cas12a 단백질의 변이체, Cas12a 오르토로그 또는 그의 조합이다.
Cas12 단백질은 변형될 수 있다. 변형은 아미노산에 대한 변형을 포함할 수 있다. 변형은 또한 1차 아미노산 서열 및/또는 2차, 3차 및/또는 4차 아미노산 구조를 변경할 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas12 단백질의 하나 이상의 아미노산 서열은 Cas12 단백질의 구조 또는 기능에 상당한 영향을 미치지 않으면서 변할 수 있다. 단백질의 일부 영역 (예를 들어, 중요하지 않은 영역)에서 변경이 발생하는 경우 돌연변이의 유형은 관련이 없을 수 있다. 대체 위치에 따라, 돌연변이는 그 결과로 생성되는 변이체의 생물학적 특성에 큰 영향을 미치지 않을 수 있다. 예를 들어, 특정 Cas12 변이체의 특성 및 기능은 야생형 Cas12의 특성 및 기능과 동일한 유형일 수 있다.
일부 경우에, 돌연변이가 Cas12 단백질의 구조 및/또는 기능에 결정적으로 영향을 미칠 수 있는지 여부는 서열 및/또는 구조적 정렬을 사용하여 결정될 수 있다. 서열 정렬은 유사하고/하거나 상이한 (예를 들어, 보존된, 보존되지 않은, 소수성, 친수성 등) 폴리펩티드의 영역을 확인할 수 있다. 일부 경우에, 다른 서열과 유사한 관심 서열 내의 영역이 변형에 적합하다. 다른 경우에, 다른 서열과 상이한 관심 서열 내의 영역이 변형에 적합하다. 예를 들어, 서열 정렬은 데이터베이스 검색, 쌍별 정렬, 다중 서열 정렬, 게놈 분석, 모티프 찾기, 벤치마킹, 및/또는 BLAST, CS-BLAST, HHPRED, psi-BLAST, LALIGN, PyMOL, 및 SEQALN과 같은 프로그램에 의해 수행될 수 있다. 구조적 정렬은 Dali, PHYRE, 키메라, COOT, O 및 PyMOL과 같은 프로그램에 의해 수행될 수 있다. 정렬은 데이터베이스 검색, 쌍별 정렬, 다중 서열 정렬, 게놈 분석, 모티프 찾기 또는 벤치 마킹, 또는 그의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다.
Cas12 단백질은 전형적으로 REC1, REC2, PAM 상호작용 (PI), 뉴클레아제 (Nuc), 웨지 (WED) 및 RuvC 도메인에 상응하는 6개의 도메인으로 이루어진다. 예를 들어, 문헌 [Yamano et al. (Cell, 2016, 165(4):949-962)]을 참조한다. WED 도메인 및 RuvC 도메인은 다른 도메인으로부터의 서열에 의해 중단되는 3자 서열 아키텍처를 가질 수 있다. 예를 들어, 아시다미노코쿠스 종 Cas12a WED 도메인 서열은 REC1, REC2 및 PI 도메인 서열에 의해 중단된다. 부가적으로, Cas12 단백질의 특정 하위유형은 RuvC 도메인 서열에 인접하거나 그 사이에 발생하는 브릿지 나선 도메인을 함유한다.
Cas12 단백질의 영역은 이러한 Cas12 단백질의 활성을 조정하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, PI 도메인 (598-718) 및 WED 도메인 (526-597 및 719-883)의 잔기에 상응하는 아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a 단백질의 영역을 변형시켜 PAM 특이성을 변경할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Toth et al. (Nucleic Acid Research, 2020, 48(7):3722-3733)]을 참조한다. REC1 (24-319) 및 REC2 (320-526) 도메인의 잔기에 상응하는 아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a 단백질의 영역을 변형시켜 표적 개입 및 절단 동역학을 변경할 수 있다. REC1 (226-304) 및 REC2 (368-435) 도메인의 영역은 표적 결합 서열 및 표적 서열의 PAM 원위 단부와 직접 상호작용하고, 표적 서열 절단의 효율을 변형하도록 조작될 수 있다. Nuc 도메인 (1066-1261) 및 RuvC 도메인 (940-956, 957-1065 및 1261-1307)의 영역을 변형시켜 표적 서열의 표적 가닥, 비-표적 가닥, 또는 표적 가닥과 비-표적 가닥의 절단 효율을 변경할 수 있다. 이러한 영역을 조작하는 것은 돌연변이를 도입하는 것, 다른 Cas12 오르토로그로부터의 상응하는 영역으로 대체하는 것, 결실, 삽입 등을 포함할 수 있다.
변형된 Cas12 단백질은 Cas12 단백질의 활성 또는 특이성을 변경하기 위해 Cas12 chRDNA 가이드 분자와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 경우에, Cas12 단백질은 Cas12 chRDNA 가이드 분자와 복합체 형성될 때 증진된 활성 또는 특이성을 제공하도록 변형될 수 있으며, 여기서 Cas12 변형은 REC1, REC2, RuvC, WED 및/또는 Nuc 도메인(들)에서 발생한다. 일부 경우에, Cas12 단백질은 Cas12 chRDNA 가이드 분자와 복합체 형성될 때 증진된 활성 또는 특이성을 제공하도록 변형될 수 있으며, 여기서 Cas12a 변형은 영역 226-304, 368-435, 940-956, 978-1158, 1159-1180, 및 1181-1298 (아시다미노코쿠스 종 Cas12a 서열을 기반으로 한 넘버링)에서 발생한다.
그러한 돌연변이는 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 생산될 수 있다. 돌연변이는 치환, 부가, 결실 또는 그의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 알라닌으로 전환시킨다. 다른 경우에, 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 또 다른 아미노산 (예를 들어, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 리신 또는 아르기닌)으로 전환시킨다. 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 비-자연 아미노산 (예를 들어, 셀레노메티오닌)으로 전환시킬 수 있다. 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을 아미노산 모방체 (예를 들어, 포스포모방체)로 전환시킬 수 있다. 돌연변이는 보존적 돌연변이일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 돌연변이된 아미노산을, 이러한 돌연변이된 아미노산의 크기, 모양, 전하, 극성, 입체형태 및/또는 로타머가 유사한 아미노산으로 전환시킬 수 있다 (예를 들어, 시스테인/세린 돌연변이, 리신/아스파라긴 돌연변이, 히스티딘/페닐알라닌 돌연변이).
일부 실시양태에서, Cas12 단백질은 nCas12 단백질이다. nCas12 단백질은 "닉킹 Cas12" 또는 "Cas12-니카제"라고도 하는 뉴클레아제 결핍인 Cas12 단백질의 변이체이다. 이러한 분자는 엔도뉴클레아제 활성의 일부분이 결여되므로, 표적 핵산의 한 가닥만 닉킹할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek et al. (Science, 2012, 337:816-821)]을 참조한다. 이는, 예를 들어, RuvC 뉴클레아제 도메인에 돌연변이(들)를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적 예는 에프. 노비시다(F. novicida) Cas12a 단백질의 RuvC 뉴클레아제 도메인에 대한 D917A, E1006A 및 D1225A를 포함할 수 있다. RuvC 뉴클레아제 도메인의 활성을 감소시키기 위한 다른 촉매 잔기의 돌연변이가 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있는 것으로 이해된다. 그 결과로 생성된 nCas12 단백질은 이중 가닥 DNA를 절단할 수 없지만 가이드 분자와 복합체를 형성하고, 표적 DNA 서열과 결합하며 표적 DNA의 한 가닥만 닉킹할 수 있는 능력은 유지한다. 표적화 특이성은 PAM 서열에 대한 Cas12 단백질 결합 및 게놈 로커스에 대한 가이드 분자의 상보적 염기쌍 형성에 의해 결정된다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, nCas12 단백질은 nCas12a 단백질이다.
일부 실시양태에서, Cas12 단백질은 dCas12 단백질이다. dCas12 단백질은 "촉매적으로 불활성인 Cas12 단백질", "효소적으로 불활성인 Cas12", "촉매적으로 죽은 Cas12" 또는 "죽은 Cas12"라고도 하는, 뉴클레아제-불활성화된 Cas12 단백질의 변이체이다. 이러한 분자는 엔도뉴클레아제 활성이 결여되므로, RNA-가이드된 방식으로 유전자를 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek et al. (Science, 2012, 337:816-821)]을 참조한다. RuvC 도메인의 활성을 제거하기 위한 촉매 잔기의 돌연변이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다. 그 결과로 생성된 dCas12 단백질은 이중 가닥 DNA를 절단할 수 없지만 가이드 분자와 복합체를 형성하고 표적 DNA 서열과 결합할 수 있는 능력은 유지한다. 표적화 특이성은 PAM 서열에 대한 Cas12 단백질 결합 및 게놈 로커스에 대한 가이드 분자의 상보적 염기쌍 형성에 의해 결정된다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, dCas12 단백질은 dCas12a 단백질이다.
특정 Cas12 단백질 하위유형은 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인의 불활성화 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인의 일부 또는 전부의 부재로 인해 뉴클레아제 활성이 결여된다. 이러한 하위유형 중 하나인 유형 V-K 및 연관 단백질 Cas12k는 대신, Tn7-유사 전이 요소인 tnsB, tnsC, tniQ와 연합된다. 예를 들어, 문헌 [Strecker et al. (Science, 2019, 364(6448):48-53)]을 참조한다. Cas12k는 가이드 분자와 복합체를 형성하고 표적 DNA 서열과 결합할 수 있는 능력을 보유하고 있으며, 연관된 Tn7-유사 단백질은 DNA 서열의 RNA-가이드된 전위를 용이하게 한다. 본 개시내용의 일부 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 Cas12k chRDNA 가이드/핵단백질 복합체이다.
다른 아미노산 변경은 글리코실화된 형태를 갖는 아미노산, 다른 분자와의 집합적 접합체, 및 관련되지 않은 화학적 모이어티 (예를 들어, 페길화된 분자)를 갖는 공유 접합체를 포함할 수 있다. 공유 변이체는 아미노산 쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기에서 발견되는 기에 기능을 연결함으로써 제조될 수 있다. 일부 경우에, 돌연변이된 부위-지정 폴리펩티드는 또한 대립유전자 변이체 및 종 변이체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, Cas12 단백질은 Cas12 단백질로부터의 제1 도메인, 및 상이한 단백질, 예컨대 Csy4 단백질로부터의 제2 도메인을 함유하는 융합 또는 키메라 단백질일 수 있다. Cas12 단백질에 대한 융합 변형은 변형된 Cas12 단백질에 부가의 활성을 부여할 수 있다. 이러한 활성은 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 복구 활성, DNA 손상 활성, 탈아미노화 활성, 디스뮤타제 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 리컴비나제 활성, 폴리머라제 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 포토리아제 활성, 글리코실라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 역전사효소 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, SUMO화 활성, 탈SUMO화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 및/또는 핵산 표적 서열과 연합된 폴리펩티드 (예를 들어, 히스톤)를 변형시키는 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, Cas12 단백질은 하나 이상의 NLS 서열 (예를 들어, Cas12 단백질 서열에 부속되고/되거나 이러한 서열 내에 삽입됨)을 함유할 수 있다. NLS 서열은, 예를 들어, Cas12 단백질 (예컨대 Cas12a 단백질)의 N-말단, C-말단, 또는 그 안에 내부적으로 위치할 수 있으며, 그의 조합 (예를 들어, N-말단에 하나 이상의 NLS가 위치하고 C-말단에 하나 이상의 NLS가 위치함)을 포함한다.
특정 실시양태에서, Cas12a 단백질을 포함한 Cas12 단백질은 복수 개의 NLS 서열, 예컨대 예를 들어, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개 또는 적어도 5개의 NLS 서열을 함유할 수 있다. 복수 개의 NLS 서열은 Cas12a 단백질의 단일 말단에 존재할 수 있거나 (예를 들어, NLS 서열은 N-말단에만 존재하거나 C-말단에만 존재함), 양쪽 말단에 존재할 수 있다 (예를 들어, N-말단에 하나 이상의 NLS 서열이 존재하고 C-말단에 하나 이상의 NLS 서열이 존재함). NLS 서열은 완전히 합성되거나, 변형되거나, 또는 내인성 또는 외인성 단백질 서열로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas12a 단백질을 포함한 Cas12 단백질은 SV40 대형 T-항원, 뉴클레오플라스민, 53BP1, VACM-1/CUL5, CXCR4, VP1, ING4, IER5, ERK5, UL79, EWS, Hrp1, cMyc (1), cMyc (2), 마우스 c-able IV, Matα2 및 MINIYO로부터 선택된 NLS 서열, 또는 이러한 NLS 서열로부터 변형되거나 유래된 NLS 서열을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas12a 단백질을 포함한 Cas12 단백질은 서열식별번호: 04, 05, 및 493-507 중 임의의 것으로부터 선택된 NLS 서열, 또는 이러한 NLS 서열로부터 변형되거나 유래된 NLS 서열을 함유할 수 있다. 변형되거나 유래된 NLS 서열은 참조 NLS 서열 (예를 들어, 서열식별번호: 04, 05 및 493-507 중 임의의 것으로부터 선택된 NLS 서열)과 관련하여, 예를 들어: 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 치환; 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 결실; 및/또는 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개의 아미노산 부가를 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, NLS 서열은, 예를 들어, 서열식별번호: 04, 05 및 493-507 중 임의의 것으로부터 선택된 NLS 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
NLS 서열은 직접적으로 또는 링커 폴리펩티드를 통해 (예를 들어, Cas12 단백질에, 또 다른 NLS 서열(들)에, 또는 Cas12 단백질에 부착된 융합 펩티드 서열에) 공유 부착될 수 있다. 링커 서열의 길이는 특정한 Cas12 단백질의 구조적 특징 (예를 들어, 말단의 용매 접근성, 말단에 다른 중요한 기능적 펩티드 서열의 존재 등)에 따라 최적화되어 동족 임포르틴 단백질 결합 및 트래피킹을 위한 NLS 서열의 접근성을 보장할 수 있다. 부가적으로, 본원의 실시예 11에 기재된 바와 같이, 바람직한 링커 길이에 대해 경험적으로 스크리닝하는 것이 가능하다.
일부 실시양태에서, NLS 서열은 하나 이상의 아미노산을 포함하는 링커 서열을 통해 (예를 들어, Cas12 단백질에, 또 다른 NLS 서열(들)에, 또는 Cas12 단백질에 부착된 융합 펩티드 서열에) 공유 부착된다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 적어도 하나의 글리신, 세린 및/또는 트레오닌 잔기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 적어도 하나의 글리신 잔기 및 적어도 하나의 세린 잔기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 복수 개의 글리신 잔기 및 적어도 하나의 세린 잔기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 GS 서열로 이루어지거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 GGGGS 서열로 이루어지거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커 서열은 GGGGSGGGGS 서열로 이루어지거나 또는 이를 포함한다.
일부 실시양태에서, Cas12a 단백질은 C-말단에 적어도 하나의 링커 서열 및 적어도 하나의 NLS 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 NLS 서열은 SV40 대형 T-항원 및 뉴클레오플라스민, 또는 그로부터 변형되거나 유래된 서열로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, Cas12a 단백질은 C-말단에 GGGGSGGGGS 링커 서열 및 뉴클레오플라스민 NLS 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오플라스민 NLS 서열은 GGGGSGGGGS 링커 서열의 C-말단 측에 위치한다.
특정 실시양태에서, Cas12a 단백질은 C-말단에 적어도 하나의 GS 링커 서열, SV40 대형 T-항원 NLS 서열, 및 뉴클레오플라스민 NLS 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오플라스민 NLS 서열은 SV40 대형 T-항원 NLS 서열의 C-말단 측에 위치한다. 그의 일부 실시양태에서, 제1 GS 링커 서열은 SV40 대형 T-항원 NLS 서열의 N-말단 측에 존재하고, 제2 GS 링커 서열은 SV40 대형 T-항원 NLS 서열과 뉴클레오플라스민 NLS 서열 사이에 존재한다.
특정 실시양태에서, Cas12a 단백질은 C-말단에 GS 링커 서열, GGGGSGGGGS 링커 서열, SV40 대형 T-항원 NLS 서열, 및 뉴클레오플라스민 NLS 서열을 포함하며, 여기서 뉴클레오플라스민 NLS 서열은 SV40 대형 T-항원 NLS 서열의 C-말단 측에 위치한다. 그의 일부 실시양태에서, GGGGSGGGGS 링커 서열은 SV40 대형 T-항원 NLS 서열의 N-말단 측에 존재하고, GS 링커 서열은 SV40 대형 T-항원 NLS 서열과 뉴클레오플라스민 NLS 서열 사이에 존재한다.
특정 실시양태에서, Cas12a 단백질은 C-말단에 GGGGSGGGGS 링커 서열 및 SV40 대형 T-항원 NLS 서열을 포함하며, 여기서 SV40 대형 T-항원 NLS 서열은 GGGGSGGGGS 링커 서열의 C-말단 측에 위치한다.
일부 실시양태에서, Cas12a 단백질은 C-말단에 링커- 및 NLS-함유 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 링커- 및 NLS-함유 서열은 서열식별번호: 479-490으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 링커- 및 NLS-함유 서열은 서열식별번호: 479-490으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
동족 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 또한 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있다. Cas12 단백질 성분은 재조합적으로 생산될 수 있으며, 이후 Cas12 chRDNA 가이드 분자 및 Cas12 단백질은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 함께 복합체 형성될 수 있다. 예를 들어, 가이드 분자/Cas12 단백질을 포함하는 핵단백질 복합체를 어셈블리하는 방법의 비-제한적인 예를 제공하는 실시예 2를 참조한다.
부가적으로, Cas12 단백질을 구성적으로 발현하는 세포주가 개발될 수 있고 Cas12 chRDNA 가이드 성분으로 형질감염될 수 있으며, 복합체는 표준 정제 기술, 에컨대 친화도, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피 (단, 이에 제한되지는 않음)를 사용하여 세포로부터 정제될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jinek et al. (Science, 2012, 337:816-821)]을 참조한다.
공지된 방법에 따르면, Cas12 단백질을 코딩하는 발현 카세트를 사용하여 Cas12 단백질을 생산할 수 있다. 발현 카세트는 전형적으로 이들이 도입되는 숙주 세포에서 기능적인 조절 서열을 포함한다. 조절 서열은 하기: 전사의 조절, 전사 후 조절 및 번역의 조절 중 하나 이상에 관여한다. 발현 카세트는 발현 벡터에 존재할 수 있으며, 박테리아 세포, 효모 세포, 식물 세포 및 포유동물 세포를 포함한 매우 다양한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
Cas12 단백질은 Cas12 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (발현 벡터 포함)에서 생산될 수 있다. Cas12 단백질 생산에 유용한 벡터는 플라스미드, 바이러스 (파지 포함) 및 통합 가능한 핵산 단편 (즉, 상동 재조합에 의해 숙주 게놈에 통합될 수 있는 단편)을 포함한다. 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제 및 기능하거나, 일부 경우에 게놈 자체에 통합될 수 있다. 적합한 복제 벡터는 의도된 발현 숙주 세포와 양립되는 종으로부터 유래된 레플리콘 및 제어 서열을 함유할 것이다. 일부 실시양태에서, Cas12 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 유도성 프로모터, 억제성 프로모터 또는 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 발현 벡터는 또한 단백질 태그 (예를 들어, 폴리-His 태그, 헤마글루티닌 태그, 형광 단백질 태그, 생물발광 태그, 핵 국재화 태그)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 단백질 태그에 대한 코딩 서열은 코딩 서열에 융합될 수 있거나, 또는 발현 카세트, 예를 들어 표적화 벡터에 포함될 수 있다.
발현 벡터의 구축을 위한 일반적인 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 대부분의 숙주 세포에 대한 발현 벡터는 상업적으로 입수 가능한다. 적절한 벡터의 선택 및 그의 구축, 예컨대 곤충 세포에서 곤충 세포 형질전환 및 유전자 발현을 위한 곤충 세포 벡터, 박테리아 세포에서 박테리아 형질전환 및 유전자 발현을 위한 박테리아 플라스미드, 효모 및 기타 진균에서 세포 형질전환 및 유전자 발현을 위한 효모 플라스미드, 포유동물 세포 또는 포유동물에서 포유동물 세포 형질전환 및 유전자 발현을 위한 포유동물 벡터, 세포 형질전환 및 유전자 발현을 위한 바이러스 벡터 (레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노바이러스 벡터 포함), 및 그러한 폴리뉴클레오티드의 클로닝을 쉽게 가능하게 하는 방법을 용이하게 하도록 설계된 몇 가지 상업적 소프트웨어 제품이 있다. 예를 들어 스냅진(SnapGene)™ [GSL 바이오텍(Biotech) LLC; 미국 일리노이주 시카고; snapgene.com/resources/plasmid_files/your_time_is_valuable/]은 벡터, 개별 벡터 서열 및 벡터 맵의 광범위한 목록 뿐만 아니라 많은 벡터에 대한 상업적 공급원을 제공한다. 사용하기에 적합한 다수의 포유동물 벡터가 상업적으로 입수 가능하다 [예를 들어, 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies; 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드); 네오바이오랩 (NeoBiolab; 미국 매사추세츠주 케임브리지); 프로메가 (Promega; 미국 위스콘신주 매디슨); ATUM (미국 캘리포니아주 멘로 파크); 애드젠 (Addgene; 미국 매사추세츠주 케임브리지)로부터 입수 가능함].
포유동물 바이러스로부터 유래된 벡터는 또한 포유동물 세포에서 본 방법의 Cas12 단백질 성분을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 이는 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 파보바이러스, 헤르페스바이러스, 폴리오마바이러스, 시토메갈로바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 백시니아 및 유인원 바이러스 40 (SV40)으로부터 유래된 벡터를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Kaufman et al. (Mol . Biotech., 2000, 16:151-160); and Cooray et al. (Methods Enzymol., 2012, 507:29-57)]을 참조한다. Cas12 단백질-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 서열은 활성화제 결합 서열, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, 프로모터, 억제인자 결합 서열, 스템-루프 구조, 번역 개시 서열, 번역 리더 서열, 전사 종결 서열, 번역 종결 서열, 프라이머 결합 부위 등을 포함할 수 있다. 통상적으로 사용되는 프로모터는 구성적 포유동물 프로모터 CMV, MND, EF1a, SV40, PGK1 (마우스 또는 인간), Ubc, CAG, CaMKIIa 및 베타-Act이며, 또한 기타 프로모터가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Khan et al. (Advanced Pharmaceutical Bulletin, 2013, 3:257-263)]을 참조한다. 더욱이, H1 및 U6을 포함한 포유동물 RNA 폴리머라제 III 프로모터가 사용될 수 있다.
HEK 293 (인간 배아 신장) 및 CHO (차이니즈 햄스터 난소)를 포함한 수많은 포유동물 세포주가 유전자 산물의 발현에 활용되었다. 이들 세포주는 표준 방법 (예를 들어, 인산칼슘 또는 폴리에틸렌이민 (PEI) 또는 전기천공 사용)에 의해 형질감염될 수 있다. 다른 전형적인 포유동물 세포주는 HeLa, U2OS, 549, HT1080, CAD, P19, NIH 3T3, L929, N2a, 인간 배아 신장 293 세포, MCF-7, Y79, SO-Rb50, Hep G2, DUKX-X11, J558L, 및 새끼 햄스터 신장 (BHK) 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 세포는 Cas12 단백질을 생산하는데 사용될 수 있는 세포의 예이다.
벡터는 원핵생물에 도입되어 전파될 수 있다. 원핵 벡터는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 원핵 벡터는 표적 숙주 세포에 적합한 복제 기점 [예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)로부터 유래된 oriC, pBR322로부터 유래된 pUC, 살모넬라(Salmonella)로부터 유래된 pSC101], 15A 기원 (p15A로부터 유래됨) 및 박테리아 인공 염색체를 포함한다. 벡터는 선택 가능한 마커 (예를 들어, 암피실린, 클로람페니콜, 겐타마이신 및 카나마이신에 대한 내성을 코딩하는 유전자)를 포함할 수 있다. 제오신(Zeocin)™ (라이프 테크놀로지스; 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드)이 박테리아, 진균 (효모 포함), 식물 및 포유동물 세포주에서의 선별에 사용될 수 있다. 따라서, 다수의 유기체에서 선택 작업을 위해 제오신™에 대한 단 하나의 약물 내성 유전자를 보유하는 벡터를 설계할 수 있다. 원핵생물에서 단백질 발현에 유용한 프로모터, 예를 들어 T5, T7, 람노스 (유도성), 아라비노스 (유도성) 및 PhoA (유도성)가 공지되어 있다. 더욱이, T7 프로모터는 T7 RNA 폴리머라제를 코딩하는 벡터에도 널리 사용된다. 원핵 벡터는 또한 다양한 강도의 리보솜 결합 부위 및 분비 신호 (예를 들어, mal, sec, tat, ompC 및 pelB)를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 NATNA의 발현을 위한 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함할 수 있다. 원핵 RNA 폴리머라제 전사 종결 서열이 또한 널리 공지되어 있다 [예를 들어, 에스. 피오게네스(S. pyogenes)로부터의 전사 종결 서열].
원핵생물에서의 단백질의 발현은 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 이. 콜라이에서 자주 수행된다. 그러나, 다른 원핵 시스템을 사용한 단백질 발현이 본 개시내용의 범주 내에 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 사카로미세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현하기 위한 벡터의 예는 하기를 포함하나, 그에 제한되지는 않는다: pYepSec1, pMFa, pJRY88, pYES2, 및 picZ. 효모 세포에서의 유전자 발현을 위한 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Christine Guthrie and Gerald R. Fink ("Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part A" in Methods in Enzymology, 2004, Volume 194, Elsevier Academic Press, San Diego, CA)]을 참조한다. 전형적으로, 효모에서의 단백질-코딩 유전자의 발현은 관심 코딩 영역 및 전사 종결인자에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 필요로 한다. 다양한 효모 프로모터를 사용하여 효모에서의 유전자 발현을 위한 발현 카세트를 구축할 수 있다.
Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 세포의 게놈 편집
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자, Cas12 단백질 및 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 세포로의 시험관내, 생체외 또는 생체내 전달은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다수의 방법에 의해 달성될 수 있다. 이들 성분을 세포에 도입하는 비-제한적 방법은 바이러스 벡터 전달, 초음파천공, 세포 압착, 전기천공, 뉴클레오펙션, 리포펙션, 입자 총 기술, 미세발사체 충격 또는 화학물질 (예를 들어, 세포 투과 펩티드)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 세포에 전달하기 위해 전기천공이 사용될 수 있다. 전기천공은 또한 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, chRDNA 가이드 분자 또는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 세포와 함께 전기천공 완충액에서 혼합되어 현탁액을 형성한다. 그런 다음 이러한 현탁액에 최적화된 전압의 전기 펄스를 가하여, 세포막의 인지질 이중 층에 일시적인 기공을 생성하여 하전된 분자 (예컨대 핵산 및 단백질)가 기공을 통해 구동되어 세포 내로 유입되도록 한다. 전기천공을 수행하기 위한 시약 및 장비는 상업적으로 판매된다.
실시예 3은 Cas12 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 활성화된 T 세포의 뉴클레오펙션을 예시한다. 실시예 5는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 활성화된 T 세포의 뉴클레오펙션을 예시한다.
Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 핵산을 절단하거나 그와 결합하는데 사용될 수 있다. Cas12 chRDNA 가이드 분자는 Cas12 단백질과 함께 세포에 도입됨으로써, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 형성할 수 있다. Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 표적 핵산과 혼성화할 수 있으며, 여기서 표적 핵산은 PAM을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 세포 내로의 도입을 위한 하나 이상의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 제공하는 단계, 및 Cas12 핵단백질 복합체(들)를 세포 내로 전달함으로써, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체(들)와 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 접촉을 용이하게 하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이중 가닥 DNA (dsDNA)) 내의 핵산 표적 서열을 결합시키는 방법을 포괄한다. 한 실시양태에서, 제1 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열에 상보적인 제1 표적화 영역 요소를 갖는 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 포함하며; 제2 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 상보적인 제2 표적화 영역을 갖는 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 포함한다. Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체와 폴리뉴클레오티드의 접촉은 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열과 결합시킨다. 한 실시양태에서, 제1 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 제1 핵산 표적 서열과 결합하며; 제2 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열과 결합한다.
핵산 표적 서열을 결합시키는 이러한 방법은 시험관내 (예를 들어, 생화학적 반응에서 또는 배양된 세포에서; 일부 실시양태에서, 배양된 세포는 배양액에 남아 있고 인간에게 도입되지 않은 인간 배양된 세포임); 생체내 (예를 들어, 살아있는 유기체의 세포 내에서, 단 일부 실시양태에서, 유기체는 비-인간 유기체임); 또는 생체외 (예를 들어, 대상체로부터 제거된 세포, 단 일부 실시양태에서 대상체는 비-인간 대상체임)에서 수행될 수 있다.
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자, Cas12 단백질 및 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 세포로의 전달은 이들 성분을 생물학적 구획으로 패키징함으로써 달성될 수 있다. 성분을 포함하는 생물학적 구획은 생체내 (예를 들어, 살아있는 유기체의 세포에서, 단 일부 실시양태에서, 유기체는 비-인간 유기체임) 투여될 수 있다. 생물학적 구획은 바이러스 (렌티바이러스, 아데노바이러스), 나노구, 리포솜, 양자점, 나노입자, 마이크로입자, 나노캡슐, 소포, 폴리에틸렌 글리콜 입자, 히드로겔 및 미셀을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
예를 들어, 생물학적 구획은 리포솜을 포함할 수 있다. 리포솜은 하나 이상의 지질 이중 층을 포함하는 자기-어셈블리 구조일 수 있으며, 이들 각각은 반대 방향으로 배향된 양친매성 지질 분자를 함유하는 2개의 단일층을 포함할 수 있다. 양친매성 지질은 하나 또는 둘 이상의 비-극성 (소수성) 아실 또는 알킬 쇄에 공유 연결된 극성 (친수성) 헤드기를 포함할 수 있다. 소수성 아실 쇄와 주변 수성 매질 간의 에너지적으로 불안정한 접촉은 극성 헤드기가 이중 층의 표면을 향하고 아실 쇄가 이중 층의 내부를 향하도록 배열하기 위해 양친매성 지질 분자를 유도하여, 수성 환경과의 접촉으로부터 아실 쇄를 효과적으로 보호한다.
리포솜에 사용되는 바람직한 양친매성 화합물의 예는 포스포글리세리드 및 스핑고지질을 포함할 수 있으며, 그의 대표적인 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디리놀레오일포스파티딜콜린, 에그 스핑고미엘린, 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.
생물학적 구획은 나노입자를 포함할 수 있다. 나노입자는 약 40나노미터 내지 약 1.5마이크로미터, 약 50나노미터 내지 약 1.2마이크로미터, 약 60나노미터 내지 약 1마이크로미터, 약 70나노미터 내지 약 800나노미터, 약 80나노미터 내지 약 600나노미터, 약 90나노미터 내지 약 400나노미터, 또는 약 100나노미터 내지 약 200나노미터의 직경을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 나노입자의 크기가 증가함에 따라 방출 속도가 느려지거나 연장될 수 있고, 나노입자의 크기가 감소함에 따라 방출 속도가 증가될 수 있다.
특정 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 생물학적 구획으로 패키징된다. 일부 경우에, Cas12를 코딩하는 핵산과 화학적으로 합성된 chRDNA 가이드가 생물학적 구획으로 패키징된다. 일부 경우에, Cas12를 코딩하는 mRNA와 화학적으로 합성된 chRDNA 가이드가 생물학적 구획으로 패키징된다.
핵산 서열과 폴리펩티드 간의 상호작용을 평가 및/또는 정량화하기 위한 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이는 하기를 포함하나 그에 제한되지는 않는다: 면역침전 (ChIP) 검정, DNA 전기영동 이동성 변화 검정 (EMSA), DNA 풀다운 검정, 및 마이크로플레이트 캡처 및 검출 검정. 상업용 키트, 재료 및 시약은 이러한 많은 방법을 실행하는데 이용 가능하며, 예를 들어 하기 공급업체로부터 수득될 수 있다: 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific; 미국 델라웨어주 윌밍톤), 시그노시스 (Signosis; 미국 캘리포니아주 산타 클라라), 바이오-래드 (Bio-Rad; 미국 캘리포니아주 헤라클레스), 및 프로메가 (미국 위스콘신주 매디슨). 폴리펩티드와 핵산 서열 간의 상호작용을 검출하기 위한 통상적인 접근 방식은 EMSA이다 (예를 들어, 문헌 [Hellman L. M., et al., Nature Protocols 2(8):1849-1861 (2007)] 참조).
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 세포로의 도입을 위한 하나 이상의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 제공하는 단계, 및 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체(들)를 세포로 전달함으로써, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체(들)와 폴리뉴클레오티드의 접촉을 촉진시키는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열을 커팅하는 (예를 들어, dsDNA에서의 단일 가닥 커팅, 또는 dsDNA에서의 이중 가닥 커팅) 방법을 포괄한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 내의 제1 핵산 표적 서열에 상보적인 제1 표적화 영역을 갖는 제1 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 포함하는 제1 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체; 및 폴리뉴클레오티드 내의 제2 핵산 표적 서열에 상보적인 제2 표적화 영역을 갖는 제2 Cas12 chRDNA 가이드 분자를 포함하는 제2 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체가 세포 내로 도입된다. 접촉은 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체(들)에 의해 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, dsDNA) 내의 핵산 표적 서열의 커팅을 초래한다. 한 실시양태에서, 제1 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 dsDNA 내의 제1 핵산 표적 서열과 결합하고 dsDNA의 제1 가닥을 절단하며; 제2 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 dsDNA 내의 제2 핵산 표적 서열과 결합하고 dsDNA의 제2 가닥을 절단한다. 일부 실시양태에서, 핵산 표적 서열은 DNA 또는 게놈 DNA이다. 핵산 표적 서열을 결합시키는 이러한 방법은 시험관내, 세포내 (예를 들어, 배양된 세포내), 및 생체외 (예를 들어, 대상체로부터 제거된 줄기 세포) 및 생체내에서 수행된다.
표적 핵산 서열(들)은, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열 또는 게놈 내의 원하는 위치; 및/또는 결실되거나 파괴될 폴리뉴클레오티드 서열 또는 게놈 내의 원하는 유전자 서열에 기초하여 적절하게 선택될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 내의 핵산 표적 서열을 커팅하는 부가의 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드가 또한 세포 내로 도입되어, 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분이 세포의 게놈 DNA로 혼입되는 것을 용이하게 할 수 있다. 전형적으로, 공여자 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 파손 부위로의 공여자 폴리뉴클레오티드의 삽입 (예를 들어, 상동 재조합)을 증진시키기 위해 부위-지정 표적 핵산 파손부에 근접하게 된다. 일부 경우에, 공여자 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥 파손부를 생성하는 Cas12 단백질 (예를 들어, Cas12a)과 결합함으로써, 표적 핵산 내의 이중 가닥 파손 부위에 근접하게 된다.
공여자 폴리뉴클레오티드 서열(들)은, 예를 들어, 추구되는 원하는 변형에 기초하여 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 공여자 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질의 전부 또는 일부를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 CAR을 코딩할 수 있다.
본 개시내용은 바이러스를 통한 세포로의 공여자 폴리뉴클레오티드의 전달을 추가로 포괄하며, 여기서 공여자 폴리뉴클레오티드는 CAR을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 이중 가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 DNA는 미니서클일 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 플라스미드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 플라스미드는 슈퍼코일될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 메틸화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 메틸화되지 않을 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 변형을 포함할 수 있다. 변형은 비오티닐화, 화학적 접합 및 합성 뉴클레오티드를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 본원에 기재된 것을 포함할 수 있다.
치료 조성물, 적용 및 방법
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드 분자 및 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 변형된 세포 (예컨대 CAR-발현 세포)의 생산에 사용될 수 있다. 이러한 변형된 세포는, 예를 들어, 세포 요법 (예를 들어, 세포의 투여를 통한 질환의 치료 또는 예방) 분야, 특히 입양 세포 요법에 사용될 수 있다. 이러한 투여된 세포는, 예를 들어, 유전적으로 변형된 입양 세포일 수 있다. 유전적 변형은 하나 이상의 전달 기술을 사용하여 본원에 개시된 Cas12 chRDNA 가이드 분자 및 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 통해 입양 세포 내로 도입될 수 있다. 본 개시내용은, 예를 들어, 투여될 수용자에 대해 자가 또는 동종이계인 세포의 변형 및 투여를 포괄한다. 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "동종이계"는 동일한 종의 상이한, 유전적으로 동일하지 않은 개체를 지칭한다. 예를 들어, 동종이계 세포는 (세포가 투여되는 수용자와 관련하여) 동일한 종의 상이한, 유전적으로 동일하지 않은 개체로부터 유래된 세포를 지칭한다. 대조적으로, 용어 "자가"는 동일한 개체를 지칭한다. 예를 들어, 개체에게 투여된 자가 세포는 동일한 개체로부터 유래되는 세포 (변형 또는 비변형, 또는 그의 변형 또는 비변형 자손)를 지칭한다.
"입양 세포"는 세포 요법 치료에 사용하기 위해 유전적으로 변형될 수 있는 세포를 지칭한다. 입양 세포는 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 제대혈 줄기 세포, 림프구, 자연 살해 세포, 섬유모세포, 내피 세포, 상피 세포, 췌장 전구 세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"줄기 세포"는 자기 재생 능력, 즉 미분화 상태를 유지하면서 수많은 세포 분열 주기를 거칠 수 있는 능력을 가진 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 전능성, 다능성, 다분화능, 과분화능 또는 단분화능일 수 있다. 줄기 세포는 배아, 태아, 양막, 성체 또는 유도 다능성 줄기 세포이다.
"유도 다능성 줄기 세포" (iPSC)는 비-다능성 세포, 전형적으로 체세포로부터 인위적으로 유래되는 다능성 줄기 세포의 유형을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 체세포는 인간 체세포이다. 체세포의 예는 진피 섬유모세포, 골수 유래 중간엽 세포, 심근 세포, 각질세포, 간 세포, 위 세포, 신경 줄기 세포, 폐 세포, 신장 세포, 비장 세포 및 췌장 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 체세포의 부가의 예는 B 세포, 수지상 세포, 과립구, 선천 림프계 세포, 거핵구, 단핵구/대식세포, 골수 유래 억제 세포, NK 세포, T 세포, 흉선 세포 및 조혈 줄기 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는 면역 체계의 세포를 포함한다. 다능성 줄기 세포는 체세포, NK 세포, NK-유사 세포, T 세포, T 세포-유사 세포, NK-T 세포, NK-T 세포-유사 세포, 수지상 세포, 수지상-유사 세포, 대식세포 및 대식세포-유사 세포를 포함한 복수 개의 세포 유형으로 분화될 수 있다. 다능성 줄기 세포는 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 분화 전 또는 후에 편집될 수 있다. iPSC는 외인성 유전자 또는 서열, 예컨대 CAR을 코딩하는 서열을 게놈 내로 도입함으로써, 분화 전 또는 후에 추가로 변형될 수 있다.
"조혈 줄기 세포"는 조혈 세포, 예컨대 림프구로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포를 지칭한다.
"림프구"는 척추동물 면역 체계의 일부인 백혈구 (백혈구)를 지칭한다. 또한 용어 "림프구"는 림프계 세포를 발생시키는 조혈 줄기 세포를 포괄한다. 림프구는 세포-매개, 세포독성 적응 면역을 위한 T 세포, 예컨대 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포; 알파/베타 T 세포 및 감마/델타 T 세포; 조절 T 세포, 예컨대 Treg 세포; 세포-매개, 세포독성 선천 면역에서 기능하는 자연 살해 (NK) 세포; 및 체액성, 항체-구동 적응 면역을 위한 B 세포; NK/T 세포; 시토카인 유도 살해 세포 (CIK 세포); 및 항원 제시 세포 (APC), 예컨대 수지상 세포를 포함한다. 림프구는 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포일 수 있다.
또한 본원에 사용된 바와 같은 용어 "림프구"는 표적 세포의 단백질 또는 (당)지질 항원을 인식할 수 있는 하나 이상의 특이적, 자연적으로 발생하거나 또는 조작된 T-세포 수용체(들)를 발현하도록 유전적으로 조작된 T 세포 수용체 조작된 T 세포 (TCR)를 포괄한다. 이러한 항원의 작은 조각, 예컨대 펩티드 또는 지방산은 표적 세포 표면으로 이동하여 주요 조직적합성 복합체 (MHC)의 일부로서 T 세포 수용체에 제시된다. 항원-로딩된 MHC와 결합하는 T 세포 수용체는 림프구를 활성화시킨다.
종양 침윤 림프구 (TIL)는 또한 본원에 사용된 바와 같은 용어 "림프구"에 포괄된다. TIL은 종양 내부 및 주변 환경 ("종양 미세환경")에 침투한 면역 세포이다. TIL은 전형적으로 종양 세포 및 종양 미세 환경으로부터 단리되며, 종양 항원에 대항한 높은 반응성을 위해 시험관 내에서 선택된다. TIL은 생체내 존재하는 관용화 영향을 극복하는 조건하에 시험관 내에서 성장한 다음, 치료를 위해 대상체 내로 도입된다.
용어 "림프구"는 또한 유전적으로 변형된 T 세포 및 NK 세포, 예컨대 T 또는 NK 세포 표면 상에 키메라 항원 수용체 (CAR)를 생산하도록 변형된 것 (CAR-T 세포 및 CAR-NK 세포)을 포괄한다.
림프구는 대상체, 예컨대 인간 대상체, 예를 들어 혈액 또는 고형 종양 (TIL의 경우와 같음), 또는 림프 기관, 예컨대 흉선, 골수, 림프절 및 점막-연관 림프 조직으로부터 단리될 수 있다. 림프구를 단리하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 혈액 층을 분리하는 친수성 폴리사카라이드인 피콜, 및 밀도 구배 원심분리를 사용하여 전혈로부터 분리되는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 림프구를 단리할 수 있다. 일반적으로, 항응고제 또는 섬유소 제거 혈액 표본은 피콜 용액 위에 층을 이루고 원심분리하여 상이한 세포 층을 형성한다. 바닥 층은 적혈 세포 (적혈구)를 포함하며, 이는 피콜 배지에 의해 수집 또는 응집되어 바닥으로 완전히 가라앉는다. 그 다음 층은 주로, 피콜-파크 용액을 통해 아래로 이동하는 과립구를 함유한다. 그 다음 층은 전형적으로 단핵구 및 혈소판과 함께 혈장과 피콜 용액 사이의 경계면에 있는 림프구를 포함한다. 림프구를 단리하기 위해, 이러한 층을 회수하고, 염 용액으로 세척하여 혈소판, 피콜 및 혈장을 제거한 다음 다시 원심분리한다.
림프구를 단리하기 위한 다른 기술은 관심 세포를 항체-코팅된 플라스틱 표면과 결합함으로써 용액으로부터 세포 집단을 단리하는 바이오패닝을 포함한다. 이어서, 원하지 않는 세포는 특이적 항체 및 보체로 처리함으로써 제거한다. 부가적으로, 형광 활성화 세포 분류기 (FACS) 분석을 사용하여 림프구를 검출하고 계수할 수 있다. FACS 분석은 광 산란과 형광에서의 차이에 근거하여 표지된 세포를 분리하는 유동 세포계수기를 사용한다.
TIL의 경우, 림프구는 종양으로부터 단리되고, 예를 들어 고용량 IL-2에서 성장하고 자가 종양 또는 HLA-매칭 종양 세포주에 대항한 시토카인 방출 공동-배양 검정을 사용하여 선택된다. 동종이계 비-MHC 매칭 대조군과 비교하여 증가된 특이적 반응성의 증거가 있는 배양물은 신속한 확장을 위해 선택될 수 있고, 이어서 암을 치료하기 위해 대상체 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Rosenberg et al. (Clin . Cancer Res., 2011, 17:4550-4557); Dudly et al. (Science, 2002, 298:850-854); Dudly et al. (J. Clin. Oncol ., 2008, 26:5233-5239); and Dudley et al. (J. Immunother ., 2003, 26:332-342)]을 참조한다.
단리 시, 림프구는 특이성, 빈도 및 기능의 관점에서 명확히 규명될 수 있다. 자주 사용되는 검정은 T 세포 반응의 빈도를 측정하는 ELISPOT 검정을 포함한다.
단리 후, 림프구는 전문화된 이펙터 림프구로의 증식 및 분화를 촉진하기 위해 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 활성화될 수 있다. 활성화된 T 세포에 대한 표면 마커는, 예를 들어, CD3, CD4, CD8, PD1, IL2R 등을 포함한다. 활성화된 세포독성 림프구는 표적 세포의 표면 상의 동족 수용체과 결합한 후 표적 세포를 사멸시킬 수 있다. NK 세포에 대한 표면 마커는, 예를 들어, CD16, CD56 등을 포함한다.
단리 및 임의로 활성화 후, 림프구는 입양 T 세포 면역요법에 사용하기 위해 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 변형될 수 있다. 입양 면역요법은 전형적으로 환자의 면역 세포 (자가 세포)를 활용하여 암을 치료한다. 그러나, 입양 면역요법의 생성을 위한 본 방법은 또한 제3자 공여자 세포 (동종이계 세포)의 사용을 허용하여, "쉽게 사용할 수 있는" 요법을 초래한다.
따라서, 일부 실시양태에서, 입양 면역요법에 사용하기 위한 림프구는 대상체로부터 단리되고, 생체외에서 변형된 다음, 동일한 대상체 내로 재도입된다. 이러한 기술은 "자가 림프구 요법"으로서 공지되어 있다.
대안적으로, 림프구는 단리되고, 생체외에서 변형되며, 상이한 대상체 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 "동종이계 림프구 요법"으로서 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 동종이계 세포를 포함하는 치료 조성물의 생산에 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 동종이계 세포는 T-세포이다. 보다 바람직한 실시양태에서, T-세포는 CAR을 발현한다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, CAR은 암과 연관된 항원을 표적으로 한다.
일부 실시양태에서, T 세포는 더 안전하고 더 효율적인 동종이계 요법을 허용하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, T 세포 수용체 α 상수 (TRAC)는 αβ TCR의 일부를 형성하는 단백질-코딩 유전자이다. 따라서 TRAC에서의 선택된 돌연변이 뿐만 아니라 TRAC의 녹아웃 발현은 동종이계 세포 요법 동안 GvHD를 제거하는데 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Poirot et al. (Cancer Res., 2015, 75:3853-3864)]을 참조한다. CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 CD19-특이적 CAR을 TRAC 로커스로 유도하면 종양 거부가 발생할 수 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, 문헌 [Eyquem et al. (Nature, 2017, 543:113)]을 참조한다. 유사하게, αβ TCR의 발현을 방지하기 위해 T 세포 수용체 β 상수 (TRBC)가 또한 표적화될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Ren et al. (Clin . Cancer Res., 2017, 23:2255-2266)]을 참조한다.
PD1, PDCD1 및 CD279로서 공지되기도 한 프로그램된 세포 사멸 단백질 1은 면역 체계를 하향 조절하고 T 세포 염증 활동을 억제함으로써 자기-관용을 촉진시키는데 중요한 역할을 하는 세포 표면 수용체이다. PDCD1은 PD-L1, CD274 및 B7 동족체 1 (B7-H1)로서 공지되기도 한 동족 리간드인 "프로그램된 사멸-리간드 1"과 결합한다. PD1은 림프절의 항원-특이적 T 세포에서 프로그램된 세포 사멸 (아폽토시스)을 촉진하는 동시에 항염증 억제 T 세포 (조절 T 세포)에서 아폽토시스를 감소시키는 이중 메커니즘을 통해 자가면역을 방지한다. 이러한 메커니즘을 통해, PD-L1의 PD1 결합은 면역 체계를 억제하므로, 자가면역 장애를 예방할 뿐만 아니라 면역 체계가 암 세포를 사멸시키는 것도 방지한다. 따라서, PD1의 생산을 돌연변이시키거나 녹아웃시키는 것은 T 세포 요법에서 유익할 수 있다.
PD1은 "면역 체크포인트" 분자의 한 예이다. 면역 체크포인트 분자는 면역 반응을 하향 조정하거나 억제하는 역할을 한다. 면역 체크포인트 분자는 PD1, 세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA-4; CD152로서 공지되기도 함), LAG3 (CD223으로서 공지되기도 함), Tim3 (HAVCR2로서 공지되기도 함), BTLA (CD272로서 공지되기도 함), BY55 (CD160으로서 공지되기도 함), TIGIT (IVSTM3으로서 공지되기도 함), LAIR1 (CD305로서 공지되기도 함), SIGLEC10, 2B4 (CD244로서 공지되기도 함), PPP2CA, PPP2CB, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7, SIGLEC9, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, 및 GUCY1B3을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자는 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 불활성화된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자의 불활성화는 상기 기재된 바와 같이 하나 이상의 TCR 성분의 불활성화와 조합된다.
베타-2 마이크로글로불린 (B2M)은 유핵 세포에 존재하는 MHC 클래스 I 분자의 성분이다. 베타-2 마이크로글로불린은 종양 세포를 포함한 세포에 의해 혈액으로 배출되며, HLA I 복합체의 어셈블리 및 발현에 필수적이다. 그러나, 동종이계 T 세포의 표면 상에서의 HLA 발현은 숙주 면역 체계의 T 세포에 의한 신속한 거부를 유발한다. 따라서, 베타-2 마이크로글로불린의 발현을 방해하는 것은 또한 동종이계 T 세포 요법 효율을 증가시키는데 바람직하다. 부가적으로, 동종이계 T 세포 상에서의 MHC 클래스 I 분자의 발현 결여는 숙주 면역 체계에 의한 제거를 유발한다. 따라서, HLA 분자의 서브세트, 바람직하게 HLA-E만이 세포 표면에 제시되는 것이 바람직하다.
부가의 유전자는 입양 면역 세포 요법의 효능을 증진시키기 위해 본원에 개시된 Cas12 chRDNA 가이드로 유사하게 표적화될 수 있다. 바람직한 유전자 및 염색체 위치 (hg38 게놈 어셈블리)의 비-제한적 예가 표 4에 제공된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
일부 실시양태에서, TRAC를 코딩하는 유전자는 본원에 개시된 바와 같은 Cas12 chRDNA 가이드를 사용하여 세포 내에서 표적화된다. 일부 실시양태에서, PD1을 코딩하는 유전자는 본원에 개시된 바와 같은 Cas12 chRDNA 가이드를 사용하여 세포 내에서 표적화된다. 일부 실시양태에서, B2M을 코딩하는 유전자는 본원에 개시된 바와 같은 Cas12 chRDNA 가이드를 사용하여 세포 내에서 표적화된다. 일부 실시양태에서, TRAC를 코딩하는 유전자 및 B2M을 코딩하는 유전자는 본원에 개시된 바와 같은 Cas12 chRDNA 가이드를 사용하여 세포 내에서 표적화된다.
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 변형된 세포는, 예를 들어, 암 치료를 위한 입양 세포 요법에 사용될 수 있다. 그의 일부 실시양태에서, 변형된 세포는 유전적으로 변형된 림프구이다. 이러한 유전적으로 변형된 림프구, 예컨대 CAR-T 세포는 전립선암; 난소암; 자궁경부암; 결장직장암; 장암; 고환암; 피부암; 폐암; 갑상선암; 골암; 유방암; 방광암; 자궁암; 질암; 췌장암; 간암; 신장암; 뇌암; 척수암; 구강암; 이하선 종양; 혈액암; 림프종, 예컨대 B 세포 림프종; 및 백혈병 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 대상체에서 다양한 유형의 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직하게, 변형된 세포의 유효량이 이러한 치료에 사용된다.
표 5는 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 생산된 입양 세포 (예컨대 CAR-T 세포)를 사용하여 치료할 수 있는 대표적인 B 세포 백혈병 및 림프종을 열거한다. 본원에 개시된 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체에 의해 변형된 림프구는 표 5에 열거된 질환의 치료에 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
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Figure pct00008
다른 실시양태에서, 전암성 병태; 혈액 장애; 및 면역 장애, 예컨대 에디슨병, 셀리악병, 유형 1 진성 당뇨병, 그레이브스병, 하시모토병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스성 관절염, 경피증 및 전신성 홍반성 루푸스를 포함하나 이에 제한되지는 않는 자가면역 장애를 포함한, 다른 세포 증식성 장애는 본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용하여 생산된 입양 세포 (예컨대 CAR-T 세포)를 사용하여 치료될 수 있다.
본원에 기재된 입양 세포 요법 치료는 항체 요법, 화학요법, 시토카인 요법, 수지상 세포 요법, 유전자 요법, 호르몬 요법, 레이저 광 요법 및 방사선 요법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 부가의 요법과 동시에 또는 상이한 시간에 조합될 수 있다.
대상체에 대한 본 개시내용의 변형된 세포의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 수혈, 체내이식 또는 이식을 포함한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 결절내, 골수내, 근육내, 정맥내 또는 림프내 주사에 의해, 또는 복강내로 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 변형된 세포 조성물은 바람직하게 정맥내 주사에 의해 투여된다. 투여는 체중 kg당 104-109개 세포, 바람직하게 체중 kg당 105 내지 106개 세포의 투여를 포함할 수 있다. 세포는 1회 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 세포의 유효량이 단일 용량으로서 투여된다. 다른 실시양태에서, 세포의 유효량이 일정 기간에 걸쳐 1회 초과의 용량으로서 투여된다. 특정한 질환 또는 병태에 대해 주어진 세포 유형의 유효량의 최적 범위를 결정하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자의 기술 내에 있다.
키메라 항원 수용체 (CAR) 세포
일부 실시양태에서, 입양 세포는 CAR-발현 세포이다. CAR은 특이적 항원 또는 에피토프를 인식하고 그와 결합하도록 조작된 수용체이다. 수용체는 항원-결합 및 T-세포 활성화 기능 둘 다를 단일 수용체로 조합하기 때문에 키메라이다. CAR은 전형적으로 항원과 결합할 수 있는 세포외 리간드-결합 도메인, 막횡단 도메인 및 적어도 하나의 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 세포외 리간드-결합 도메인은 하나 이상의 링커에 의해 연결된 2개 이상의 가변 영역의 융합을 포함하는 단일-쇄 가변 단편 (scFv)을 포함할 수 있다. CAR은 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다. CAR은 종종 "키메라 수용체", "T-바디" 또는 "키메라 면역 수용체 (CIR)"로 불린다.
일부 실시양태에서, CAR은 TRUCK, 범용 CAR, 자기-구동 CAR, TanCAR, 무장 CAR, 자기-파괴 CAR, 조건부 CAR, 표시된 CAR, TenCAR, 이중 CAR, 또는 sCAR일 수 있다.
TRUCK (범용 시토카인 살해를 위해 재지정된 T 세포)는 키메라 항원 수용체 (CAR)와 항종양 시토카인을 공동-발현한다. 시토카인 발현은 구성적이거나 또는 T 세포 활성화에 의해 유도될 수 있다. CAR 특이성에 의해 표적화된, 염증 유발성 시토카인의 국재된 생산은 내인성 면역 세포를 종양 부위로 동원하고 항종양 반응을 강화할 수 있다.
범용 동종이계 CAR-T 세포는 내인성 T 세포 수용체 (TCR) 및/또는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자를 더 이상 발현하지 않도록 조작됨으로써, 각각 이식편 대 숙주 질환 (GVHD) 또는 거부반응을 방지한다.
자기-구동 CAR은 종양 리간드와 결합하는 케모카인 수용체와 CAR을 공동-발현함으로써, 종양 귀소를 증진시킨다.
면역억제에 내성이 있도록 조작된 CAR-T 세포 (무장 CAR)는 면역 체크포인트 스위치 수용체를 사용하여 다양한 면역 체크포인트 분자 (예를 들어, 세포독성 T 림프구-연관 항원 4 (CTLA4) 또는 프로그램된된 세포 사멸 단백질 1 (PD1))를 더 이상 발현하지 않도록 유전적으로 변형될 수 있거나, 또는 면역 체크포인트 신호전달을 차단하는 모노클로날 항체와 함께 투여될 수 있다.
자기-파괴 CAR은 CAR을 코딩하기 위해 전기천공에 의해 전달된 RNA를 사용하여 설계될 수 있다. 대안적으로, T 세포의 유도성 아폽토시스는 유전자-변형된 림프구에서 티미딘 키나제와 결합하는 간시클로비르 또는 보다 최근에 기재된 소분자 이량체에 의한 인간 카스파제 9의 활성화 시스템에 기초하여 달성될 수 있다.
조건부 CAR-T 세포는 작은 분자가 부가되어 회로를 완성하여, 신호 1과 신호 2 둘 다의 완전한 변환을 가능하게 함으로써, CAR-T 세포를 활성화할 때까지 기본적으로 반응하지 않거나 '꺼짐'으로 전환된다. 대안적으로, T 세포는 표적 항원을 대상으로 한 후속 투여된 이차 항체에 대한 친화성을 갖는 어댑터-특이적 수용체를 발현하도록 조작될 수 있다.
표시된 CAR-T 세포는 기존 모노클로날 항체 작용제가 결합하는 종양 에피토프 및 CAR을 발현한다. 견딜 수 없는 부작용이 있는 상황에서, 모노클로날 항체를 투여하면 CAR-T 세포가 제거되고 부가의 오프-종양 효과 없이 증상이 완화된다.
탠덤 CAR (TanCAR) T 세포는 상이한 친화도를 갖고 하나 이상의 세포내 공동-자극 도메인(들) 및 CD3ζ 신호전달 도메인과 융합되는 2개의 연결된 scFv를 포함하는 단일 CAR을 발현한다. TanCAR-T 세포 활성화를 위해서는, 표적 세포 상에 하나의 항원만 존재해야 하지만; 항원 둘 다의 존재가 상승작용적 활성화를 용이하게 한다. 특정 실시양태에서, TanCAR의 scFv는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 가변 영역 (VL), 한 쌍의 2개의 중쇄 가변 영역 (VH), 또는 한 쌍의 2개의 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, TanCAR의 2개의 scFv는 적층된 구성으로 발생할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, TanCAR의 2개의 scFv는 일련으로, 또는 루프 구성으로 발생할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 탠덤 CAR의 scFv 중 적어도 하나는 항-CD20 scFv이며, 제2 scFv는 암 세포 상의 특이적 항원을 표적으로 하도록 선택되며, 예컨대 항-BCMA scFv, 항-CD19 scFv, 항-CD30 scFv, 항-CD22 scFv, 항-CD70 scFv, 항-ROR1 scFv, 또는 항-카파 경쇄 scFv이다.
이중 CAR-T 세포는 상이한 리간드 결합 표적을 갖는 2개의 별도의 CAR을 발현하며; 하나의 CAR은 CD3ζ 도메인만을 포함하고 다른 CAR은 공동-자극 도메인(들)만을 포함한다. 이중 CAR-T 세포 활성화는 종양 상에서의 표적 둘 다의 공동-발현을 필요로 한다.
안전성 CAR (sCAR)은 세포내 억제 도메인과 융합된 세포외 scFv로 이루어지며, 표준 CAR을 공동-발현하는 sCAR-T 세포는, 표준 CAR 표적을 보유하지만 sCAR 표적이 결여된 표적 세포를 만날 때만 활성화된다.
CAR의 세포외 (항원 인식) 도메인은 바람직하게 단일 쇄 항체, 보다 바람직하게 scFv이다. 한 실시양태에서, 항원-결합 도메인은 scFv를 포함한다. 그러나, 높은 친화도로 주어진 표적과 결합하는 임의의 적합한 모이어티가 항원 인식 영역으로서 사용될 수 있다. 항원과 결합할 수 있는 CAR의 세포외 도메인은, 예를 들어, 특정 항원과 결합할 수 있는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다.
표적화되길 원하는 항원에 따라, 본 개시내용의 CAR은 원하는 항원 표적에 특이적인 적절한 항원-결합 모이어티를 포함하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, BCMA가 표적화되길 원하는 항원인 경우, BCMA를 표적으로 하는 항체 또는 항체 단편 (예를 들어 scFv)은 본 개시내용의 CAR 내로 혼입하기 위한 항원-결합 모이어티로서 사용될 수 있다.
바람직한 세포 표적 및 이를 표적으로 하는 CAR scFv/결합 단백질이 표 6에 제시되어 있다.
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Figure pct00010
Figure pct00011
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특정 실시양태에서, CAR이 결합하는 세포 표적은 보다 바람직하게 BCMA, CD19, CD20, CD22, CD47, CD79b, CD371, ROR-1, EphA2, MUC16, 글리피칸 3, PSCA, 및 클라우딘 18.2로부터 선택된다.
보다 더 바람직한 실시양태에서, CAR이 결합하는 세포 표적은 BCMA이다.
보다 더 바람직한 실시양태에서, CAR이 결합하는 세포 표적은 CD371이다.
CAR의 세포내 도메인은 세포에서 생물학적 프로세스의 활성화 또는 억제를 유발하는 신호를 전달하는 도메인으로서 기능하는 것으로 공지된 올리고펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 세포내 도메인은 이펙터 기능 신호를 전달하는 한, T-세포 수용체 (TCR) 및/또는 공동-수용체의 세포내 신호전달 도메인의 전부 또는 일부분을 포함하는 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 자극 방식으로 작용하는 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 세포질 신호전달 서열은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)로서 공지되는 신호전달 모티프를 함유할 수 있다. ITAM 함유 세포질 신호전달 서열의 예는 CD8, CD3ζ, CD3δ, CD3γ, CD3ε, CD32 (FcγRIIa), DAP10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FcγRIIIγ, FcεRIβ (FCERIB), 및 FcεRIγ (FCERIG)로부터 유래된 것을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 세포내 신호전달 도메인의 활성화 도메인은 CD3ζ로부터 유래된다.
본 개시내용의 CAR의 세포내 신호전달 도메인은 활성화 도메인, 예컨대 CD3ζ 신호전달 도메인을 그 자체로 또는 본 개시내용의 CAR의 맥락에서 유용한 임의의 다른 원하는 세포질 도메인(들)과 조합하여 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공동-자극 도메인에 더하여, 활성화 도메인, 예컨대 CD3ζ 쇄 부분을 포함할 수 있다. 공동-자극 도메인은 공동자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 일부분을 지칭한다.
공동-자극 분자는 항원에 대한 림프구의 효율적인 반응에 필요한 항원 수용체 또는 그의 리간드 이외의 분자이다. 그의 전부 또는 일부가 본 개시내용의 CAR의 공동-자극 도메인에 사용될 수 있는 이러한 공동-자극 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, CD30, CD40, ICOS-1, GITR, 림프구 기능-연관 항원-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C 및 B7-H3을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, CAR은 적어도 4-1BB로부터 유래된 공동-자극 도메인을 함유한다.
막횡단 도메인은 자연 또는 합성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 공급원이 자연인 경우, 도메인은 임의의 막-결합 또는 막횡단 단백질로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 막횡단 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄의 막횡단 영역(들), CD28, CD3ζ, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8 (예를 들어, CD8α, CD8β), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, 또는 CD154, KIRDS2, OX40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1BB (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Rα, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, 및 PAG/Cbp로부터 유래될 수 있다 (즉, 그의 적어도 일부를 포함한다).
대안적으로 막횡단 도메인은 합성일 수 있으며, 이러한 경우 그것은 주로 소수성 잔기, 예컨대 류신 및 발린을 포함할 것이다. 일부 경우에, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중자가 합성 막횡단 도메인의 각각의 단부에서 발견될 것이다. 짧은 올리고- 또는 폴리펩티드 링커, 예컨대 2 내지 10개 아미노산 길이는 CAR의 막횡단 도메인과 소포질 도메인 간의 연결을 형성할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, CAR은 동일한 막횡단 도메인의 반복부일 수 있거나 상이한 막횡단 도메인일 수 있는 1개 초과의 막횡단 도메인을 갖는다.
힌지 영역은 가변 길이의 폴리펩티드 힌지, 예컨대 하나 이상의 아미노산, CD8 부분, 또는 IgG4 영역, 및 그의 조합을 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 CD8로부터 유래된다.
CAR은 또한 TIL, NK 세포, 대식세포, 수지상 세포, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC) 또는 TCR에 혼입되어 각각 CAR-TIL, CAR-NK 세포, CAR-M, CAR-DC 및 TCR 조작된 CAR-T 세포를 생성할 수 있다. CAR-T 세포, CAR-T 세포를 만드는 방법, 및 그의 용도에 대한 설명은, 예를 들어, 문헌 [Brudno et al. (Nature Rev. Clin . Oncol ., 2018, 15:31-46); Maude et al. (N. Engl . J. Med., 2014, 371:1507-1517); and Sadelain et al. (Cancer Disc., 2013, 3:388-398)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, CAR 발현 카세트는 입양 세포 내로 형질도입되고, 카세트는 Cas12 단백질-매개 파손 부위 내로 통합된다. 본원의 실시예 9는 CAR 카세트를 포함하는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터로 1차 세포를 형질도입하는 것을 예시한다.
일부 실시양태에서, CAR 발현 카세트는 CAR 발현을 구동하기 위한 프로모터를 포함한다. 통상적으로 사용되는 프로모터는 구성적 포유동물 프로모터 CMV, MND, EF1a, SV40, PGK1 (마우스 또는 인간), Ubc, CAG, CaMKIIa 및 베타-Act를 포함하고, 기타는 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Khan et al. (Advanced Pharmaceutical Bulletin, 2013, 3:257-263)]을 참조한다. 대안적으로, CAR 발현 카세트는 리보솜 스키핑 서열 (자기-절단 펩티드라고도 함)을 포함할 수 있고 내인성으로 발현된 유전자의 프레임 내로 도입될 수 있다. 통상적으로 사용되는 리보솜 스키핑 서열은 T2A, P2A, E2A 및 F2A를 포함한다. 리보솜 스키핑 서열 및 그의 용도에 대한 설명은, 예를 들어, 문헌 [Chng et al. (MAbs, 2015, 7(2):403-412)]을 참조한다. 유사하게, 비-CAR 발현 카세트는 유사한 프로모터 또는 리보솜 스키핑 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 환자의 단일 대립유전자에 존재하는 병원성의 상염색체 "우성 음성" 돌연변이에 의해 유발되는 유전적 장애를 치료하는데 사용된다. 일부 경우에, 근본적인 유전적 돌연변이가 대립유전자 중 하나에 대한 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)일 수 있다. chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 SNP 대립유전자를 표적으로 하도록 조작될 수 있지만, 야생형 대립유전자를 표적으로 하지 않으므로 SNP 대립유전자만 방해할 수 있다. 예를 들어, SNP를 포함하는 오프-표적 서열에서 감소된 편집이 가능한 야생형 서열을 표적으로 하기 위해 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 설계하는 방법의 비-제한적 예를 제공하는 실시예 7을 참조한다.
일부 실시양태에서, Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 야생형 대립유전자를 변형시키지 않으면서 SNP-함유 대립유전자를 선택적으로 편집 (예를 들어, 녹아웃, 또는 상동성 지향 복구를 통해 야생형으로 되돌리기)하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 편집은 유전자 파괴를 초래할 수 있다. 다른 실시양태에서, 이러한 편집은 대립유전자를 예컨대 상동성 지향 복구를 통해 "야생형" 상태로 복원할 수 있다. 예를 들어, 진행성 시력 상실을 초래하는 많은 유전 질환은 병원성의 상염색체 "우성-음성" 돌연변이로 인한 것이다. 우성 음성 질환의 SNP 교정 전략의 예는 색소성 망막염을 유발하는 로돕신 유전자에서의 SNP 돌연변이의 표적화 (예를 들어, 문헌 [Li et al. (CRISPR J., 2018, 1(1):55-64)] 참조); 각막 이영양증을 유발하는 전환 성장 인자, 베타-유도 (TGFBI) 유전자에서의 SNP 돌연변이의 표적화 (예를 들어, 문헌 [Christie et al. (Scientific Reports, 2017, 7(1):16174)] 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는, 예를 들어, 상염색체의 병원성 "우성-음성" 유전적 돌연변이에 의해 영향을 받는 안구 조직으로 전달될 수 있다. 그의 일부 실시양태에서, chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 근본적인 병리학을 치료하기 위해 야생형 대립유전자를 표적으로 하지 않으면서 질환 대립유전자를 선택적으로 파괴하도록 설계된다. 그러한 질환은 황반 이영양증, 간상체-추상체 이영양증, 추상체-간상체 이영양증 또는 맥락망막병증을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 Cas12 chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 진행성 시력 상실을 유발하는 유전 질환의 치료에 제한되지는 않는 것으로 이해된다.
실험
본 개시내용의 비-제한적 실시양태는 하기 실시예에 예시된다. 사용된 숫자 (예를 들어, 양, 농도, 변화 퍼센트 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오류 및 편차를 고려해야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 온도는 ℃이고 압력은 대기압이거나 대기압에 가깝다. 이들 실시예는 단지 예시로서 제공되며 본 발명자가 본 개시내용의 다양한 실시양태로서 간주하는 것의 범주를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 각각의 실시예에 제시된 하기 단계가 모두 필요한 것은 아니며 각각의 실시예에서의 단계 순서가 반드시 제시된 바와 같은 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같은, 뉴클레오티드 앞의 "r"은 RNA를 나타내며; 다른 모든 뉴클레오티드는 달리 언급되지 않는 한 DNA이다 (예를 들어, 표 15 및 17 참조). 포스포로티오에이트 결합은 인접한 염기 사이에 "*"로 표시된다.
실시예 1
PBMC로부터의 세포독성 T 세포 (CD4+ 및 CD8+)의 제조 및 1차 세포의 배양
본 실시예는 공여자 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 제조를 예시한다.
CD4+ 및 CD8+ T 세포는 본질적으로 하기와 같이 공여자 PBMC로부터 제조되었다. RoboSep-S [스템셀 테크놀로지 (STEMCELL Technologies; 미국 매사추세츠주 케임브리지)] 및 EasySep™ 인간 T 세포 단리 키트 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 T 세포를 단리하고, 재조합 인간 (rh) IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 ImmunoCult-XF 완전 배지 [ImmunoCult-XF T 세포 확장 배지 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지), CTS 면역 세포 SR (깁코(Gibco) A2596102), 항생제-항진균제 (100X, 코닝(Corning) 30-004-Cl)]에서 항-CD3/CD28 비드 (Dynabeads™; 깁코 11132D)의 존재 하에 3일 동안 활성화하였다. 3일 후, 자기 분리를 통해 비드를 제거하고 IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 ImmunoCult-XF 완전 배지에서 1일 동안 세포를 확장하였다.
실시예 2
Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 클로닝 , 발현, 생산 및 어셈블리
본 실시예는 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 클로닝, 발현 및 정제하는 방법 뿐만 아니라 Cas12a 가이드 성분을 생산하는 방법을 설명한다.
A. Cas12 단백질의 클로닝
아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) 촉매적으로 활성인 Cas12a 단백질 서열 (서열식별번호: 1)은 이. 콜라이 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었다. C-말단에, 글리신-세린 링커와 하나의 핵 국재화 서열 (NLS) (서열식별번호: 4)을 부가하였다. Cas12a-NLS 단백질 (하기 실시예에서 AsCas12a 및 Cas12a 단백질로서 지칭됨)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다. 그런 다음 DNA 서열을 표준 클로닝 방법을 사용하여 적합한 박테리아 발현 벡터로 클로닝하였다.
B. Cas12a 단백질의 발현 및 정제
AsCas12a 단백질은 발현 벡터를 사용하여 이. 콜라이에서 발현되었고 본질적으로 예를 들어, 문헌 [Swarts et al. (Molecular Cell, 2017, 66:221-233)]에 기재된 바와 같이 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다.
C. Cas12a 가이드 성분의 생산
특정한 Cas12a 가이드 활성화 영역에 표적화 영역을 연결함으로써 Cas12a 가이드를 생산하였다. 표적화 영역 또는 스페이서는 바람직하게 20개 뉴클레오티드 표적 결합 서열을 포함하였다. 표적 결합 서열은 5'-TTTV 또는 5'-TTTN PAM의 하류 (3' 방향)에서 발생하는 표적 서열에 대해 상보적이었다. 예시적인 Cas12a 가이드 활성화 영역 서열은 아시다미노코쿠스 종, 엘. 박테리움(L. bacterium) 및 에프. 노비시다 Cas12a 종에 대해 각각 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 8 및 서열식별번호: 10이다.
Cas 12a 가이드 서열 (예컨대 crRNA 및 chRDNA)은 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
가이드 RNA 성분 (예컨대 crRNA)은 dsDNA 템플릿 서열의 5' 단부에 T7 프로모터를 혼입함으로써 이중 가닥 (ds) DNA 템플릿으로부터 시험관내 전사 [예를 들어, T7 신속 고수율 RNA 합성 키트; 뉴잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs; 미국 매사추세츠주 입스위치)]에 의해 생산될 수 있다.
D. Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 어셈블리
C-말단 핵 국재화 서열 (NLS)로 태그부착된 아시다미노코쿠스 종 Cas12a (AsCas12a)를 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현하고 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제하였다. 달리 명시되지 않는 한, 핵단백질 복합체는 80 pmol Cas12a 단백질:240 pmol 가이드의 농도에서 형성되었다. Cas12a 단백질로 어셈블리하기 전에, 각각의 가이드 성분 (예를 들어, crRNA 또는 chRDNA)은 최종 용적 1 μl에서 원하는 총 농도 (240 pmol)로 조정하고, 95℃에서 2분 동안 인큐베이션한 다음, 써모사이클러로부터 제거하고, 실온으로 평형화되도록 하였다. Cas12a 단백질을 결합 완충액 (60 mM TRIS-아세테이트, 150 mM 아세트산칼륨, 30 mM 아세트산마그네슘, pH 7.9) 중 적절한 농도로 최종 용적 1.5 μl로 희석하고 가이드 성분 1 μl와 혼합한 후, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
실시예 3
Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 PBMC로부터의 T 세포 (CD4+ 및 CD8+)의 뉴클레오펙션
본 실시예는 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 활성화된 T 세포의 뉴클레오펙션을 설명한다.
실시예 2의 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 뉴클레오펙터(Nucleofector)™ 96-웰 셔틀 시스템 [론자 (Lonza; 미국 뉴저지주 앨런데일)]을 사용하여 1차 활성화된 T 세포 (CD4+ 및 CD8+) (실시예 1에 기재된 바와 같이 제조됨)로 형질감염시켰다. Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 96-웰 플레이트의 개별 웰에 최종 용적 2.5 μl로 분배하였다. 현탁된 T 세포를 200 x g에서 10분 동안 원심분리하여 펠릿화하고, 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 세포 펠릿을 10 ml의 칼슘 및 마그네슘이 없는 PBS에 재현탁시켰다. 세포를 카운티스(Countess)® II 자동화 세포 계수기 (라이프 테크놀로지스; 미국 뉴욕주 그랜드아일랜드)를 사용하여 계수하였다.
2.2e7개의 세포를 15 ml 원추형 튜브에 옮기고 펠릿화하였다. PBS를 흡인하고, 세포를 뉴클레오펙터™ P4 또는 P3 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 용액에 샘플당 2e5-1e6개 세포/ml의 밀도로 재현탁하였다. 그런 다음 세포 현탁액 20 μl를 2.5 μl의 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 함유하는 각각의 웰에 부가하고, 각각의 웰로부터의 전체 용적을 96-웰 뉴클레오큐벳(Nucleocuvette)™ 플레이트 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일)의 웰로 옮겼다. 플레이트를 뉴클레오펙터™ 96-웰 셔틀 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일)에 로딩하고 CA137 뉴클레오펙터™ 프로그램 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일)을 사용하여 세포를 뉴클레오펙션하였다. 뉴클레오펙션 후, IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 ImmunoCult-XF 완전 배지 77.5 μl를 각각의 웰에 부가하였으며, 형질감염된 세포 현탁액의 전체 용적을 IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 100 μl의 미리-가온된 ImmunoCult-XF 완전 배지를 함유하는 96-웰 세포 배양 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 조직 배양 인큐베이터로 옮기고 하류 분석 전에 48시간 동안 5% CO2에서 37℃로 유지하였다.
실시예 4
Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 인간 유전자의 타일링
본 실시예는 인간 T 세포에서, 인간 T 세포 알파 불변 영역 (TRAC), 베타-2-마이크로글로불린 (B2M), 프로그램된 세포 사멸 1 (PDCD1), 시토카인-유도성 SH2-함유 단백질 (CISH) 및 Cbl-원종양형성 유전자 B (CBL-B)를 코딩하는 유전자를 표적으로 하기 위한 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 설계 및 용도를 설명한다.
A. AsCas12a crRNA 가이드의 설계
인간 TRAC, B2M, PDCD1, CISH 및 CBL-B를 코딩하는 유전자의 코딩 영역에서 5'-TTTV PAM 모티프의 하류 (3' 방향)의 모든 20개 뉴클레오티드 서열은 표적화를 위해 선택되었다 (서열식별번호: 12-189). 표적 선택 기준은 게놈 내의 다른 영역에 대한 상동성; GC 함량 퍼센트; 용융 온도; 및 스페이서 내의 동종중합체의 존재를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
확인된 20개-뉴클레오티드 서열은 AsCas12a 활성화 영역 서열 (서열식별번호: 6)에 하류 (3' 방향으로) 첨부되었다.
서열은 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다. 그런 다음, 개별 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 1차 T 세포로 형질감염시켰다.
B. 게놈 편집 효율 결정
(1) 심층 시퀀싱을 위한 표적 dsDNA 서열 생성
웰당 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체 및 50 μL 퀵익스트랙트(QuickExtract)™ DNA 추출 용액 [에피센터 (Epicentre; 미국 위스콘신주 매디슨)]을 사용하여 형질감염시킨 후 48시간에 뉴클레오펙션된 1차 T 세포로부터 gDNA를 단리한 후, 37℃에서 10분, 65℃에서 30분, 및 95℃에서 3분 동안 인큐베이션하여 반응을 정지시켰다. 단리된 gDNA는 50 μL 멸균수로 희석하였고 샘플은 -80℃에서 저장하였다.
단리된 gDNA를 사용하여, 1x 농도의 Q5 핫 스타트 고-충실도 2X 마스터 믹스 (뉴잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 제1 PCR을 수행하였고, Cas12a 표적 주변 영역을 증폭하도록 설계된 프라이머를 각각 0.5 μM로 사용하였으며, 3.75 μL의 gDNA를 최종 용적 10μL로 사용하였다. 증폭은 98℃에서 1분 동안의 초기 사이클, 98℃에서 10초, 및 60℃에서 20초, 72℃에서 30초의 35 사이클; 및 72℃에서 2분 동안 최종 연장을 시행하였다. PCR 반응물을 물에 1:100으로 희석하였다.
바코딩 PCR을 위한 고유한 인덱스 프라이머 세트를 사용하여 각각의 샘플에 대한 멀티플렉스 시퀀싱을 용이하게 하였다. 바코딩 PCR은 1x 농도의 Q5 핫 스타트 고-충실도 2X 마스터 믹스 (뉴잉글랜드 바이오랩스; 미국 매사추세츠주 입스위치), 각각 0.5 μM의 프라이머, 및 10 μL의 최종 용적에서 1:100으로 희석된 제1 PCR 1 μL를 포함하는 반응 혼합물을 사용하여 수행되었다. 반응 혼합물을 하기와 같이 증폭시켰다: 98℃에서 1분 동안; 이어서 98℃에서 10초, 60℃에서 20초, 및 72℃에서 30초의 12 사이클; 최종 연장 반응은 72℃에서 2분 동안 수행되었다.
(2) SPRIselect 클린-업
PCR 반응물을 풀링하고 SPRIselect [베크만 쿨터 (Beckman Coulter; 미국 캘리포니아주 파사데나)] 비드-기반 앰플리콘 클린업을 위한 단일 마이크로퓨즈 튜브로 옮겨 시퀀싱하였다.
앰플리콘에 0.9x 용적의 SPRIselect 비드를 부가하고, 혼합하며, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 마이크로퓨즈 튜브는 용액이 청정해질 때까지 자석 튜브 스탠드에 놓아두었다. 상청액을 제거하고 버리며, 잔여 비드를 1 용적의 85% 에탄올로 세척하고, 비드를 실온에서 30초 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 에탄올을 흡인하고, 비드를 실온에서 10분 동안 공기 건조시켰다. 자석 스탠드로부터 마이크로퓨즈 튜브를 제거하고 0.25x 용적의 퀴아젠(Qiagen) EB 완충액 (퀴아젠; 네덜란드 벤로)을 비드에 부가하고 격렬하게 혼합하며, 실온에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 마이크로퓨지 튜브를 자석으로 되돌리고, 용액이 청정해질 때까지 인큐베이션하고, 정제된 앰플리콘을 함유하는 상청액을 깨끗한 마이크로퓨즈 튜브에 분배하였다. 정제된 앰플리콘은 나노드롭(Nanodrop)™ 2000 시스템 (써모 사이언티픽; 미국 델라웨어주 윌밍턴)을 사용하여 정량화하고, 단편 분석기™ 시스템 [어드밴스드 아날리티칼 테크놀로지 (Advanced Analytical Technologies; 미국 아이오와주 에임즈)] 및 DNF-910 dsDNA 시약 키트 (어드밴스드 아날리티칼 테크놀로지; 미국 아이오와주 에임즈)을 사용하여 라이브러리 품질을 분석하였다.
(3) 심층 시퀀싱 설정
풀링된 앰플리콘은 나노드롭™ 2000 시스템 값 및 앰플리콘의 평균 크기로부터 계산된 바와 같은 4 nM 농도로 정규화되었다. 라이브러리는 MiSeq 시약 키트 v2 [일루미나 (Illumina; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)]가 포함된 MiSeq 시퀀서 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에서 300 사이클 동안 2회의 151-사이클 페어드 엔드 실행 및 2회의 8-사이클 인덱스 판독값으로 분석되었다.
(4) 심층 시퀀싱 데이터 분석
시퀀싱 데이터에서 제품의 신원은 바코딩 PCR에서 앰플리콘에 적응된 인덱스 바코드 서열을 기반으로 결정되었다. 예를 들어, 하기 작업을 실행하는 MiSeq 데이터를 처리하기 위해 계산 스크립트가 사용되었다:
a. 보타이(Bowtie) (bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) 소프트웨어를 사용하여 판독값을 인간 게놈 (빌드 GRCh38/38)에 정렬하였고;
b. 정렬된 판독값을 예상된 야생형 게놈 로커스 서열과 비교하였고, 야생형 로커스의 임의의 부분과 정렬되지 않은 판독값은 폐기하였으며;
c. 야생형 서열과 매칭하는 판독값이 집계되었고;
d. indel (염기의 삽입 또는 결실)이 있는 판독값은 indel 유형별로 분류하고 집계하였으며;
e. 총 indel 판독값을 야생형 판독값과 indel 판독값의 합으로 나누어 돌연변이된 판독값 퍼센트를 제공하였다.
Cas12a 가이드/핵단백질 복합체에 의해 표적화된 영역에서 indel 서열의 확인을 통해, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 결정하였다. 세포내 편집 실험의 결과가 표 7에 제시되어 있다.
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
StDev=표준 편차; n=3
표 7에 제시된 데이터는 Cas12a crRNA/핵단백질 복합체가 인간 1차 T 세포에서 다중 유전자를 편집 중일 수 있음을 명확하게 보여준다. 본원의 다른 곳에 기재된 것과 같은 다른 유전자는 AsCas12a 또는 다른 Cas12a 단백질 (예컨대 엘. 박테리움 또는 에프. 노비시다)을 사용하여 유사한 방식으로 표적화될 수 있다.
실시예 5
표적 결합 서열 내의 DNA를 갖는 Cas12a chRDNA 가이드 분자의 조작
하기 실시예는 표적 결합 서열 내의 DNA 염기를 포함하도록 AsCas12a chRDNA 가이드 분자를 조작하는 것을 설명한다.
A. 인 실리코 Cas12a chRDNA 가이드 설계
AsCas12a 가이드의 20개 뉴클레오티드 표적 결합 서열이 조작을 위해 선택되었고, 개별 DNA 염기는 표적 결합 서열 내의 각각의 위치에서 활용되었다. AsCas12a chRDNA 가이드 분자의 표적 결합 서열 내의 DNA 염기의 위치가 표 8에 제시되어 있다 (DNA 염기는 "d"로 표시되고 RNA 염기는 "R"로 표시되며; 대조군 crRNA가 또한 표시됨).
Figure pct00019
인간 B2M을 코딩하는 유전자 내의 3개의 표적 서열 (B2M-tgt12, B2M-tgt1, B2M-인트론-tgt12), 인간 TRAC를 코딩하는 유전자 내의 표적 서열 (TRAC-tgt12), 및 인간 DNA 메틸트랜스퍼라제 1 (DNMT1)을 코딩하는 유전자 내의 표적 서열 (DNMT1-tgt1)이 편집을 위해 선택되었다. Cas12a crRNA 대조군 서열 뿐만 아니라 각각의 위치에 단일 DNA 염기를 함유하는 표적 결합 서열을 포함하는 각각의 표적에 대한 Cas12a chRDNA 가이드 (표 8 참조)가 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
B. 세포 형질감염 및 분석
스크리닝을 위한 개별 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체는 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 핵단백질 복합체를 1차 T 세포로 형질감염시키고, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. 세포내 편집 실험의 결과가 표 9에 제시되어 있다.
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
StDev=표준 편차; n=3
표 9에서의 편집 결과는 스페이서 내의 DNA를 포함하는 Cas12a chRDNA 가이드 분자가 다중 표적 전체에 걸쳐 crRNA에 필적하는 비율로 편집할 수 있음을 입증한다 (서열식별번호: 211과 서열식별번호: 224를 비교하거나; 서열식별번호: 232와 서열식별번호: 234를 비교하거나, 또는 서열식별번호: 274와 서열식별번호: 293을 비교함). 표 9에서의 chRDNA 가이드 설계의 편집 비율은 각각의 표적에 대한 crRNA의 편집 비율로 정규화되었다. 평균 정규화된 편집 비율이 도 13에 제시되며, 여기서 표적 결합 서열 내의 위치는 평균 정규화된 편집의 함수로서 플롯된다. DNA 염기 활용의 바람직한 위치 (즉, 70% 초과의 평균 정규화된 편집)는 회색 채우기로 표시되며, 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20을 포함한다. 표 9 및 도 13에서의 데이터 뿐만 아니라 본 실시예에 제시된 데이터는 Cas12a 가이드의 표적 결합 서열 내의 어느 위치가 DNA로서 조작될 수 있는지를 결정하는데 사용될 수 있다.
실시예 6
표적 결합 서열 내의 다중 DNA 염기를 갖는 Cas12a chRDNA 가이드 분자
본 실시예는 표적 결합 서열 내의 다중 DNA 염기를 갖는 Cas12a chRDNA 가이드 분자의 설계 및 시험을 설명한다.
A. Cas12a chRDNA 가이드의 인 실리코 설계
인간 B2M을 코딩하는 유전자 내의 3개의 표적 (B2M-tgt12, B2M-tgt1, B2M-인트론-tgt12), 인간 TRAC를 코딩하는 유전자 내의 표적 (TRAC-tgt12), 및 인간 DNA 메틸트랜스퍼라제 1을 코딩하는 유전자 내의 표적 (DNMT1-tgt1)의 20개 뉴클레오티드 서열이 편집을 위해 선택되었다. 각각의 표적에 대해, DNA의 1 내지 7개의 뉴클레오티드를 각각의 AsCas12a 가이드의 표적 결합 서열로 설계하였다. DNA 염기의 위치에 대한 설계 기준은 이전의 단일 위치 스크린 데이터 (실시예 5 참조), DNA에 내성이 있는 위치의 사전 컨센서스 (도 13 참조), 표적 결합 서열 내의 개별 DNA 염기 간의 거리, 및 오프-표적 서열에서 미스매치의 공지된 위치를 포함하나 이에 제한되지는 않았다. Cas12a chRDNA 가이드 설계 뿐만 아니라 crRNA 대조군 서열이 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
B. 세포 형질감염 및 분석
스크리닝을 위한 개별 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체는 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 1차 T 세포로 형질감염시키고, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. 세포내 편집 실험의 결과, 및 각각의 Cas12a chRDNA 가이드의 표적 결합 서열 내의 DNA 염기의 위치가 표 10에 제시되어 있다.
Figure pct00025
Figure pct00026
StDev=표준 편차; n=3
표 10에서의 편집 결과는 표적 결합 서열 내의 다중 DNA 염기를 포함하는 Cas12a chRDNA 가이드 분자가 다중 표적 전체에 걸쳐 crRNA에 필적하는 비율로 편집할 수 있음을 입증한다 (서열식별번호: 316과 서열식별번호: 321를 비교하거나; 서열식별번호: 330과 서열식별번호: 335를 비교하거나, 또는 서열식별번호: 345와 서열식별번호: 347을 비교함).
실시예 7
Cas12a chRDNA 가이드로 감소된 오프 - 표적 편집
본 실시예는 SITE-Seq® 검정을 사용한 Cas12a 오프-표적의 확인 (문헌 [Cameron, P., et al., (2017). Mapping the genomic landscape of CRISPR - Cas9 cleavage. Nature Methods, 14(6), 600-606. https :// doi . org /10.1038/ nmeth .4284]) 및 Cas12a crRNA 가이드와 비교하여 Cas12a chRDNA 가이드의 오프-표적 편집 비율 감소를 설명한다.
A. SITE-Seq® 검정
인간 1차 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 성장시켰다. 50 ml 원추형 튜브에서 세포를 확장한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 혈액 및 세포 배양 DNA 맥시 키트 (퀴아젠; 독일 힐덴)를 사용하여, 인간 1차 T 세포로부터 고분자량 게놈 DNA (gDNA)를 추출하였다.
인간 리보솜 단백질 L32 (RPL32)를 코딩하는 유전자 (RPL32-tgt1) 및 DNMT1을 코딩하는 유전자 (DNMT1-tgt1) 내의 20개 뉴클레오티드 표적을 SITE-Seq® 검정을 사용하여 평가를 위해 선택하였다 (Cameron, P., et al., (2017). Nature Methods, 14(6), 600-606). 각각의 Cas12a 가이드 성분을 상응하는 핵단백질 농도로 연속 희석하고, 95℃에서 2분 동안 인큐베이션한 다음, 5분에 걸쳐 천천히 실온이 되도록 두었다. 절단 반응 완충액 (60 mM TRIS-아세테이트, 150 mM 아세트산칼륨, 30 mM 아세트산마그네슘, pH 7.9) 중에 인큐베이션된 Cas12a 가이드와 Cas12a 단백질을 3:1 비율로 조합함으로써 RPL32 (서열식별번호: 375) 및 DNMT1 (서열식별번호: 404) 표적에 대한 Cas12a 핵단백질 복합체를 형성하고 37℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 10 μg의 게놈 DNA (gDNA)의 개별 절단은 총 용적 50 μL에서 6개의 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체 농도 (8 nM, 16 nM, 32 nM, 48 nM, 64 nM, 96 nM, 및 128 nM)에서 발생하였다. 음성 대조군 반응물 (0 nM)을 병렬로 어셈블리하였고, 어떠한 핵단백질 복합체도 포함하지 않았다. 음성 대조군을 포함한 모든 절단 반응물은 96-웰 형식 플레이트에서 모두 3중으로 어셈블리되었다. 절단 반응물을 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
라이브러리 준비 및 시퀀싱은 핵단백질 복합체 절단 후 dA-테일링 단계를 제외하고, 본질적으로 문헌 [Cameron et al. (Nature Meth., 2017, 14:600-606)]에 기재된 바와 같이 수행되었다. 엇갈린 (5' 오버행) 단부를 초래하는 Cas12a 핵단백질 복합체 절단으로 인해 부가의 효소적 단부-복구 단계가 필요하였다. 부가된 용적은 동일하게 유지되었지만, 원래 dA-테일링 키트 성분은 뉴잉글랜드 바이오랩스로부터의 NEBNext® Ultra™ 단부 복구/dA-테일링 모듈 (NEB # E7442L)의 단부 프렙 효소 믹스 (3 μL) 및 10x 단부 복구 반응 완충액 (5 μL) 성분으로 교체되었다. 샘플을 20℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 65℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 표준 절차를 재개하였다. NGS 시퀀싱은 일루미나 NextSeq 플랫폼 (일루미나; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)을 사용하여 수행되었으며, 각각의 샘플에 대해 ~3백만 판독값을 수득하였다. 커트-부위의 1개 뉴클레오티드 내에 위치한 오프-표적 모티프 없이 SITE-Seq® 검정 (문헌 [Cameron, P., et al., (2017). Nature Methods, 14(6), 600-606)]에 의해 회수된 임의의 부위는 위양성물로 간주되어 폐기되었다. SITE-Seq® 오프-표적 검정 실험으로부터 회수된 표적화 부위의 수가 표 11에 제시되어 있다.
Figure pct00027
표 11에 제시된 데이터는 SITE-Seq® 검정 (문헌 [Cameron, P., et al., (2017). Mapping the genomic landscape of CRISPR - Cas9 cleavage. Nature Methods, 14(6), 600-606])이 추가의 세포내 평가를 위해 Cas12 가이드의 생화학적 오프-표적을 회수한다는 것을 명확하게 보여준다.
B. SITE-Seq® 오프-표적 검정 회수된 부위의 세포내 검증
표 11에 제시된 SITE-Seq® 오프-표적 부위에서 indel 빈도를 측정하기 위해, 표적화된 심층 시퀀싱 분석이 가장 낮은 (예를 들어, 8 nM 및 16 nM) Cas12a 핵단백질 복합체 농도에 대해 RPL32 및 DNMT1 샘플에서 회수된 부위의 서브세트에서 수행되었다. RPL32 샘플로부터의 2개의 오프-표적 부위 (서열식별번호: 371 및 서열식별번호: 372) 및 DNMT1 내의 단일 오프-표적 부위 (서열식별번호: 374)를 선택하여 crRNA에 의한 세포내 오프-표적 편집 비율을 평가하였다. 정방향 및 역방향 앰플리콘 프라이머는 각각의 오프-표적 부위에 대해 설계되었고 상업적 제조업체로부터 주문되었다.
인간 1차 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 배양하였다. RPL32 (서열식별번호: 375) 및 DNMT1 (서열식별번호: 404) Cas12a 핵단백질 복합체를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 핵단백질 복합체를 1차 T 세포로 형질감염시키고, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. 형질감염되지 않은 세포 풀을 야생형 참조로서 사용하였다. 돌연변이체 판독값 (% indel)은 커트 부위의 20개 염기쌍 (bp) 내의 임의의 비-참조 변이체 호출로서 정의되었다. 시퀀싱 적용 범위가 낮은 부위 (조합된 Cas12a 핵단백질 복합체-처리된 샘플에서 <1,000개 판독값 또는 참조 샘플에서 <200개 판독값) 또는 참조 샘플에서 >2% 변이체 호출이 있는 부위는 폐기되었다. 조합된 Cas12a 핵단백질 복합체-처리된 샘플에서 >0.1% 돌연변이체 판독값이 축적된 경우, 부위는 세포 오프-표적으로서 집계되었다. 회수된 SITE-Seq® (문헌 [Cameron, P., et al., (2017). Nature Methods, 14(6), 600-606]) 오프-표적 부위의 표적화된 심층 시퀀싱 결과가 표 12에 제시되어 있으며, 여기서 미스매치된 뉴클레오티드에 밑줄이 그어져 있다.
Figure pct00028
StDev=표준 편차; n=3
표 12에 제시된 데이터는 SITE-Seq® 검정이 Cas12a crRNA 가이드에 의해 T-세포에서 편집되는 오프-표적을 회복한다는 것을 명확하게 보여준다.
C. chRDNA 가이드의 인 실리코 설계
인간 RPL32를 코딩하는 유전자 (RPL32-tgt1) 및 DNMT1을 코딩하는 유전자 (DNMT1-tgt1) 내의 20개-뉴클레오티드 표적이 편집을 위해 선택되었다. 각각의 표적에 대해, DNA의 1 내지 4개 뉴클레오티드를 각각의 AsCas12a chRDNA 가이드의 표적 결합 서열로 설계하였다. DNA 염기의 위치에 대한 설계 기준은 이전의 단일 위치 스크린 데이터 (실시예 5 참조), DNA에 내성이 있는 위치의 사전 컨센서스 (도 13 참조), 표적 결합 서열 내의 개별 DNA 염기 간의 거리, 및 오프-표적 서열에서 미스매치의 공지된 위치를 포함하였으나 이에 제한되지는 않았다. Cas12a chRDNA 가이드 뿐만 아니라 Cas12a crRNA 대조군 서열이 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
D. 세포 형질감염 및 분석
개별 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체는 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 핵단백질 복합체를 1차 T 세포로 형질감염시키고, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. RPL32 (표 13) 및 DNMT1 (표 14) 표적에 대한 온- 및 오프-표적 (표 12 참조) 세포 편집 실험의 결과 및 각각의 Cas12a chRDNA 가이드의 표적 결합 서열 내의 DNA 염기의 위치가 제시된다. 부가적으로, 무염기 데옥시리보스 부위가 있는 Cas12a chRDNA 가이드 분자를 또한 시험하였으며, 무염기 부위의 위치는 dN으로 표시된다.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
StDev=표준 편차; n=3
Figure pct00032
StDev=표준 편차; n=3
표 13 및 표 14에서의 편집 결과는 Cas12a chRDNA 가이드 분자가 오프-표적 부위에서 감소된 편집이 가능하다는 것을 명확하게 보여주고 (서열식별번호: 375와 서열식별번호: 391; 서열식별번호: 375와 서열식별번호: 394의 오프-표적 편집의 표 13에서의 결과를 비교하고; 서열식별번호: 404와 서열식별번호: 408, 또는 서열식별번호: 404와 서열식별번호: 412의 오프-표적 편집의 표 14에서의 결과를 비교함), 심지어 단일 뉴클레오티드 미스매치가 있는 부위에서도 감소된 편집이 가능하다 (예를 들어, 표 12, 서열식별번호: 371 및 서열식별번호: 372 참조).
실시예 8
활성화 영역 내의 DNA 염기를 갖는 Cas12a chRDNA 가이드 분자
본 실시예는 활성화 영역 내의 DNA 염기를 갖는 AsCas12a chRDNA 가이드 분자의 설계 및 시험을 설명한다.
A. chRDNA 가이드의 인 실리코 설계
AsCas12a 가이드의 20개-뉴클레오티드 활성화 영역이 조작을 위해 선택되었으며, 여기서 개별 DNA 염기는 활성화 영역 내의 각각의 위치에서 활용되었다. AsCas12a 가이드의 활성화 영역 내의 DNA 염기의 위치가 표 15에 제시되어 있다.
Figure pct00033
인간 DNMT1 (서열식별번호: 361)을 코딩하는 유전자 내의 표적이 편집을 위해 선택하였다. DNMT 표적 결합 서열은 각각의 위치에서 단일 DNA 염기를 함유하는 활성화 영역 서열에 대해 하류 (즉, 3' 방향)에 첨부되었다 (표 15 참조). 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
B. 세포 형질감염 및 분석
스크리닝을 위한 개별 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체는 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 핵단백질 복합체를 1차 T 세포로 형질감염시키고, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. 세포내 편집 실험의 결과가 표 16에 제시되어 있다.
Figure pct00034
StDev=표준 편차; n=3
표 16에서의 편집 결과는 활성화 영역 내의 DNA를 갖는 Cas12a chRDNA가 다중 표적 전체에 걸쳐 crRNA에 필적하는 비율로 편집할 수 있다는 것을 명확하게 보여준다 (서열식별번호: 438과 서열식별번호: 445를 비교하거나; 서열식별번호: 438과 서열식별번호: 450을 비교하거나, 또는 서열식별번호: 438과 서열식별번호: 457을 비교함). 표 16에서의 chRDNA 설계의 편집 비율은 crRNA의 편집 비율로 정규화되었다. 평균 정규화된 편집 비율은 도 14에 제시되어 있으며, 여기서 활성화 영역 내의 위치는 평균 정규화된 편집의 함수로서 플롯된다. DNA 염기 활용의 바람직한 위치 (즉, 70% 초과의 평균 정규화된 편집)는 회색 채우기로 표시되며 위치 1, 3, 5, 7, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 및 19를 포함한다.
D. 활성화 영역 내의 다중 DNA 염기를 갖는 chRDNA
표 10에 제시된 결과에 기초하여, 개별 DNA 위치는 다중 DNA 염기를 함유하는 활성화 영역 설계물로 조합되었다. AsCas12a 가이드의 활성화 영역 내의 DNA 염기의 설계 및 위치가 표 17에 제시되어 있다.
Figure pct00035
표 17에 제시된 활성화 영역 설계는 표적 결합 서열 내의 DNA 뉴클레오티드로 설계된 인간 TRAC를 코딩하는 유전자 (서열식별번호: 321) 내의 20개 뉴클레오티드 표적 서열과 조합되었다. TRAC 표적 결합 서열은 표 17에 제시된 활성화 영역 서열에 대해 하류 (즉, 3' 방향)에 첨부되었고, chRDNA 설계물 뿐만 아니라 crRNA 대조군 서열이 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
E. 세포 형질감염 및 분석
스크리닝을 위한 개별 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체는 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 1차 T 세포로 형질감염시키고, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. 세포내 편집 실험의 결과 및 각각의 chRDNA의 활성화 영역 및 표적 결합 서열 내의 DNA 염기의 위치가 표 18에 제시되어 있다.
Figure pct00036
StDev=표준 편차; n=3
표 18에서의 편집 결과는 활성화 영역과 표적 결합 서열 둘 다 내의 DNA를 갖는 Cas12a chRDNA 가이드 분자가 crRNA에 필적하는 비율로 편집할 수 있다는 것을 명확하게 보여준다 (서열식별번호: 466과 서열식별번호: 467을 비교하거나; 서열식별번호: 466과 서열식별번호: 468을 비교하거나, 또는 서열식별번호: 466과 서열식별번호: 469를 비교함).
실시예 9
AAV 공여자 카세트의 클로닝 , AAV 생산, 및 1차 세포의 AAV 형질도입
본 실시예는 AAV 벡터로의 DNA 공여자 카세트의 설계 및 클로닝, AAV의 생산, Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 1차 세포로의 전달, 및 CAR 발현 카세트의 1차 세포로의 부위-특이적 통합을 위한 AAV로 1차 세포의 형질도입을 설명한다.
AAV는 포유동물 세포에 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드를 전달하도록 조작될 수 있다. AAV 전달이 게놈 절단 이벤트와 조합되고 AAV 내의 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드가 상동성 아암에 의해 플랭킹되는 경우, DNA 공여자 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 문헌 [Eyquem et al. (Nature, 2017, 543:113-117)]에 기재된 바와 같이, HDR에 의해 게놈 커트 부위에 매끄럽게 삽입될 수 있다.
A. AAV 공여자 카세트의 인 실리코 설계 및 rAAV 생산
CAR 수용체의 설계가 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Kochenderfer et al. (J. Immunotherapy, 2009, 32:689-702)]을 참조한다. CAR 구축물은 N-말단 분비 신호 (CD8a 신호 펩티드), BCMA에 특이적인 scFv 부분, 이어서 CD8 힌지 영역 및 막횡단, 4-1BB 이펙터 영역, CD3ζ 이펙터 영역 및 C-말단 BGH 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하도록 설계되었다. 포유동물 프로모터 서열을 CAR 폴리뉴클레오티드의 상류에 삽입하였다. 부위-특이적 절단 후 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈에 부위-특이적으로 삽입하기 위해, 내인성 TRAC 로커스 (서열식별번호: 23) 내의 표적 부위를 선택하였다. 그런 다음, 커트 부위의 500 bp 길이 상동성 아암 5' 및 3'을 확인하였다. 5' 및 3' 상동성 아암은 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드의 단부에 첨부되었며, 여기서 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드는 상동성 아암에 대해 역방향으로 (즉, 3'에서 5'로) 배향되었다. 그 결과로 생성된 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 413에 제시되어 있다.
B2M 및 HLA 클래스 I 조직적합성 항원인 알파 쇄 E (HLA-E)에 대한 설계가 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Gornalusse et al. (Nature Biotechnology, 2017, 35(8):765-772)]을 참조한다. 융합 구축물은 N-말단 B2M 분비 신호, 이어서 HLA-G 유래 펩티드 서열, 제1 링커 서열, B2M 서열, 제2 링커 서열, HLA-E 서열 및 C-말단 BGH 폴리아데닐화 신호 서열로 설계되었다. EF1α 포유동물 프로모터 서열을 B2M-HLA-E 폴리뉴클레오티드의 상류에 삽입하였다. 부위 특이적 절단 후 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 게놈에 부위 특이적으로 삽입하기 위해, 내인성 B2M 로커스 내의 표적 부위가 선택되었다 (서열식별번호: 62). 그런 다음, 커트 부위의 500 bp 길이 상동성 아암 5' 및 3'을 확인하였다. 5' 및 3' 상동성 아암은 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드의 단부에 첨부되었으며, 여기서 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드는 상동성 아암에 대해 역방향으로 (즉, 3'에서 5'로) 배향되었다. 그 결과로 생성된 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 414에 제시되어 있다.
DNA 공여자 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열은 적합한 재조합 AAV (rAAV) 플라스미드로의 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다. 서열식별번호: 413을 함유하는 rAAV 플라스미드 및 서열식별번호: 414를 함유하는 별도의 rAAV 플라스미드는 2개의 별도의 AAV6 바이러스로 패키징하기 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
B. rAAV를 사용한 1차 T 세포 형질도입
1차 활성화된 T 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 PBMC로부터 수득되었다. TRAC (서열식별번호: 415) 및 B2M (서열식별번호: 416)을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. T 세포를 TRAC (서열식별번호: 415)-표적화 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체로 형질감염시켰으며, 뉴클레오펙션 후 1분 내지 4시간에, 세포를 1 x 106의 MOI에서 CAR 공여자 서열 (서열식별번호: 413)로 패키징된 AAV6 바이러스로 감염시켰다. 부가적으로, T 세포를 B2M (서열식별번호: 416)-표적화 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체로 형질감염시켰으며, 뉴클레오펙션 후 1분 내지 4시간에, 세포를 1 x 106의 MOI에서 B2M-HLA-E 공여자 서열 (서열식별번호: 414)로 패키징된 AAV6 바이러스로 감염시켰다. 형질도입 후 24시간 동안 IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 ImmunoCult-XF 완전 배지 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)에서 T 세포를 배양하였다. 그 다음 날, 형질도입된 T 세포를 50 mL 원추형 튜브로 옮기고 대략 7-10분 동안 300 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 부드럽게 재현탁하며, IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 적절한 용적의 ImmunoCult-XF 완전 배지 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)에 T 세포를 풀링하였다.
열거된 T 세포를 IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 ImmunoCult-XF 완전 배지 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)에 1 x 106개 세포/mL로 재현탁하고, 필요한 만큼 많은 T-175 현탁액 플라스크에 플레이팅하였다 (플라스크당 최대 용적은 250 mL임).
C. 항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T 세포의 발현
항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T 세포 뿐만 아니라 대조군 (TRAC 녹아웃 (KO) 및 B2M KO) 및 야생형 T 세포의 시험관내 특징 규명을 형질도입 후 7일에 수행하였다.
CAR-T 세포는 피코에리트린 (PE)과 접합된 재조합 BCMA 단백질을 사용한 항-BCMA CAR 발현; 알렉사 플루오르(Alexa Fluor)® 647 [써모피셔 사이언티픽 (ThermoFisher Scientific; 미국 매사추세츠주 월섬)]에 대한 항-TCR a/b 특이적 항체 접합체를 사용한 TRAC 발현; 또는 PE와 접합된 항-B2M 특이적 항체를 사용한 B2M 발현에 대해 유동 세포계수법을 통한 발현에 관하여 평가되었다. 유동 세포계수법 분석으로부터의 결과가 도 15A에 제시되어 있으며, 여기서 CAR 양성 (도 15A, 1501), TRAC 양성 (도 15A, 1502), 및 B2M 양성 (도 15A, 1503) 비율이, 미처리된 세포 (야생형 T 세포; 도 15A, 1504), Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 둘 다만으로 형질감염된 세포 (TRAC KO/B2M KO; 도 15A, 1505), 및 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 둘 다로 형질감염되었고 바이러스 둘 다로 형질도입된 세포 (항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T; 도 15A, 1506)에 대해 제시된다. y축은 다양한 세포 표면 마커에 대해 FACS를 통해 측정된 바와 같이, 양성 세포 퍼센트를 나타낸다. 그 결과가 또한 표 19에 제공된다.
Figure pct00037
도 15A 및 표 19에 제시된 결과는 내인성 TRAC 및 B2M 발현의 Cas12a chRDNA 가이드-매개 KO, 및 항-BCMA CAR 및 외인성 B2M-HLA-E 단백질의 AAV6 매개 도입 및 발현을 입증한다.
D. 항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T 세포의 시험관내 세포독성
항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T 세포의 세포독성은 BCMA 항원을 제시하는 다발성 골수종 NCI-H929 세포주에 대항하여 시험관 내에서 평가되었다. TRAC KO T 세포는 CAR-매개 사멸을 위한 대조군으로서 사용되었다. 간단히 언급하면, 표적 세포 (NCI-H929(T))를 이펙터 항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T (E)와 구별하기 위해 셀트레이스(CellTrace)™ 바이올렛 (CTV; 써모 피셔 C34557)로 표지하고, 세포를 0:1, 1:20, 1:10, 1:5, 1:3, 1:1, 3:1, 및 10:1의 E:T 비율로 공동-배양하였다 (3개의 공동-배양 웰/E:T 비율). 공동 배양에서 48시간 후 프로피듐 아이오다이드 (PI)에 의해 측정된 바와 같이 CTV 세포 집단 (표적 세포) 및 살아있는 세포에 대한 게이팅에 의해 세포독성을 측정하였다. 데이터는 유동 세포계수법 [인텔리시트 iQue 스크리너 플러스(Intellicyt iQue Screener Plus)]에 의해 분석되었다. 각각의 웰에 대해 하기 방정식을 사용하여 특이적 용해를 계산하였다: 특이적 용해 = 1 - (시험 샘플 중의 살아있는 표적 세포의 수/대조군 샘플 중의 살아있는 표적 세포의 수).
항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T 세포 (회색 원) 및 대조군 TRAC KO T 세포 (흑색 원)에 대한 시험관내 세포독성 검정으로부터의 결과가 도 15B에 제시된다. y축은 표적 세포 사멸의 퍼센트를 나타내고 x축은 사용된 E:T 비율을 나타낸다. 도 15B에 제시된 데이터는 또한 표 20에 제시되어 있다.
Figure pct00038
StDev=표준 편차; n=3
도 15B 및 표 20에 제시된 결과는 Cas12a chRDNA 가이드 분자를 사용하여 제조된 CAR-T 세포가 표적 세포를 항원-특이적 사멸시킬 수 있다는 것을 입증한다.
본원에 제시된 방법은 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 공여자 폴리뉴클레오티드의 부위-특이적 도입을 위해 Cas12a chRDNA 가이드 분자를 사용하여 다른 세포를 제조하는데 사용될 수 있다. 비-CAR 폴리펩티드 (즉, B2M-HLA-E 융합 구축물)를 발현하는 부가의 공여자 폴리뉴클레오티드는 본원의 지침을 사용하여 유사하게 도입될 수 있다.
실시예 10
B2M - HLA -E 융합물의 내인성 B2M 프로모터 구동 발현을 사용한 항- BCMA CAR-T의 생성
본 실시예는 1차 세포의 게놈으로의 Cas12a chRDNA 매개 파손 부위에서 CAR 폴리뉴클레오티드 및 B2M-HLA-E 폴리뉴클레오티드 발현 카세트의 부위-특이적 통합을 위한 AAV로 1차 세포의 형질도입을 위한 설계를 설명한다.
A. AAV 공여자 카세트의 인 실리코 설계 및 rAAV 생산
항-BCMA CAR은 실시예 9에 기재된 바와 같이 설계되었다.
P2A-B2M-HLA-E 융합 구축물에 대한 공여자 카세트 폴리뉴클레오티드는 N-말단 B2M 분비 신호를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 이어, HLA-G 유래 펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제1 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, B2M 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 제2 링커 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HLA-E 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 C-말단 BGH 폴리아데닐화 신호 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 설계되었다. P2A 리보솜 스키핑 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 B2M-HLA-E의 상류에 삽입하여, 융합 구축물의 발현이 내인성 B2M 프로모터의 제어하에 있게 하였다. 부위-특이적 절단 후 숙주 세포 게놈에 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드를 부위-특이적으로 삽입하기 위해, 내인성 B2M 로커스 내의 표적 부위를 선택하였다 (서열식별번호: 62). 그런 다음, 커트 부위의 500개 염기쌍 길이 상동성 아암 5' 및 3'을 확인하였다. 5' 및 3' 상동성 아암은 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 단부에 첨부되었으며, 여기서 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드는 상동성 아암에 대해 정방향으로 (즉, 5'에서 3'로) 배향되었다. 그 결과로 생성된 DNA 공여자 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 479에 제시되어 있다.
DNA 공여자 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 올리고뉴클레오티드 서열은 적합한 재조합 AAV (rAAV) 플라스미드로의 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다. 서열식별번호: 413을 함유하는 rAAV 플라스미드 및 서열식별번호: 479를 함유하는 별도의 rAAV 플라스미드는 2개의 별도의 AAV6 바이러스로 패키징하기 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
B. rAAV를 사용한 1차 T 세포 형질도입
1차 활성화된 T 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 PBMC로부터 수득되었다. TRAC (서열식별번호: 415) 및 B2M (서열식별번호: 416)을 코딩하는 유전자를 표적으로 하는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. T 세포를 TRAC (서열식별번호: 415)-표적화 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체로 형질감염시켰으며, 뉴클레오펙션 후 1분 내지 4시간에, 세포를 1 x 106의 MOI에서 CAR 공여자 서열 (서열식별번호: 413)로 패키징된 AAV6 바이러스로 감염시켰다. 부가적으로, T 세포를 B2M (서열식별번호: 416)-표적화 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체로 형질감염시켰으며, 뉴클레오펙션 후 1분 내지 4시간에, 세포를 P2A-B2M-HLA-E 공여자 서열 (서열식별번호: 479)로 패키징된 AAV6 바이러스로 1 x 106의 MOI로 감염시켰다. T 세포를 형질도입 후 24시간 동안 IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 ImmunoCult-XF 완전 배지 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)에서 배양하였다. 그 다음 날, 형질도입된 T 세포를 50 mL 원추형 튜브로 옮기고 대략 7-10분 동안 300 x g에서 원심분리하여 세포를 펠릿화하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 부드럽게 재현탁하고, T 세포를 IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 적절한 용적의 ImmunoCult-XF 완전 배지 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)에 풀링하였다.
열거된 T 세포를 IL-2 (100 단위/mL)가 보충된 ImmunoCult-XF 완전 배지 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)에 1 x 106개 세포/mL로 재현탁하였고, 필요한 만큼 많은 T-175 현탁액 플라스크에 플레이팅하였다 (플라스크당 최대 용적은 250 mL임).
C. CAR-T 세포 상에서의 항-BCMA CAR 및 B2M-HLA-E의 발현
항-BCMA, P2A-B2M-HLA-E CAR-T 세포 뿐만 아니라 대조군 (TRAC 녹아웃 (KO) 및 B2M KO) 및 야생형 T 세포의 시험관내 특징 규명을 형질도입 7일 후에 수행하였다.
CAR-T 세포는 피코에리트린 (PE)과 접합된 재조합 BCMA 단백질을 사용한 항-BCMA CAR의 발현; 알렉사 플루오르® 647 (써모피셔 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬)에 대한 항-TCR a/b 특이적 항체 접합체를 사용한 TRAC의 발현, 또는 PE와 접합된 항-B2M 특이적 항체를 사용한 B2M의 발현에 관하여 유동 세포계수법을 통해 평가되었다. 유동 세포계수법 분석으로부터 결과가 표 21에 제시되어 있으며, 여기서 CAR 양성, TRAC 양성 및 B2M 양성 비율은 미처리된 세포 (야생형 T 세포), Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 둘 다만으로 형질감염된 세포 (TRAC KO/B2M KO), 및 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체 둘 다로 형질감염되고 바이러스 둘 다로 형질도입된 세포 (항-BCMA, B2M-HLA-E CAR-T)에 대해 표시된다.
Figure pct00039
표 21에 제시된 결과는 내인성 TRAC 및 B2M 발현의 Cas12a chRDNA 가이드-매개 KO, 및 항-BCMA CAR 공여자 카세트의 AAV6-매개 도입 및 외인성 발현 및 외인성 B2M-HLA-E 공여자 카세트의 내인성 B2M 프로모터 구동된 발현을 입증한다.
본원에 제시된 방법은 다른 표적에 대한 Cas12 chRDNA 가이드 설계를 확인하는데 사용할 수 있다. 다른 Cas12 chRDNA 가이드의 활성화 영역 및 표적 결합 서열은 본원에 기재된 방법과 유사한 방식으로 스크리닝될 수 있다.
실시예 11
대안적 링커- NLS 구성을 갖는 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체
본 실시예는 글리신-세린 링커 및 본 출원의 이전 실시예에서 사용된 유인원 공포화 바이러스 40 대형 T 항원 NLS (SV40; 서열식별번호: 04)를 사용한 '비최적화된' 설계와 비교한 상이한 링커 및 핵 국재화 신호 (NLS) 구성을 가진 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 설계 및 비교를 설명한다.
A. Cas12a 링커-NLS 서열의 인 실리코 설계
아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a 단백질 (서열식별번호: 01)이 조작을 위해 선택되었으며, 2개의 NLS 서열, SV40 (서열식별번호: 04) 및 뉴클레오플라스민 서열 (NPL; 서열식별번호: 05)이, 글리신-세린 (GS) 또는 한 쌍의 글리신-글리신-글리신-글리신-세린 (G4S) 아미노산 링커를 사용하여 Cas12a 단백질에 공유 부가하기 위해 선택되었다. 가변 링커가 있는 2개의 NLS를 포함하는 설계물이 또한 시험을 위해 생성되었다. 링커-NLS 서열 설계물이 표 22에 제시되어 있다:
Figure pct00040
* = 이전 실시예에서 사용된 NLS 설계
표 22에 제시된 NLS 서열을 아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a 단백질 (서열식별번호: 01)의 C-말단 단부에서 클로닝하고, 재조합 단백질을 실시예 2에 기재된 바와 같이 발현하였다.
B. Cas12a 링커-NLS 설계물의 세포 활성
표 22에 제시된 링커-NLS 서열을 포함하는 정제된 재조합 Cas12a 단백질을 실시예 2에 기재된 바와 같이 TRAC 유전자 (서열식별번호: 467)를 표적으로 하는 chRDNA 가이드와 복합체 형성하고, 실시예 3에 기재된 바와 같이 1차 T 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에, 그 결과로 생성된 각각의 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. 세포 편집 실험의 결과가 도 16A에 나타나 있고 표 23에 제시되어 있다.
Figure pct00041
StDev=표준 편차; n=3; * = 이전 실시예에서 사용된 NLS 설계
본 실시예의 표 23 뿐만 아니라 도 16A에 제시된 데이터는 대안적 링커 및 NLS 서열이 단일 GS-SV40 NLS 구성을 갖는 설계물과 비교하여 증가된 편집을 초래할 수 있다는 것을 보여준다.
C. 표적 전체에 걸쳐 대안적 Cas12a 링커-NLS 서열의 세포 활성
표 23에 제시된 상위 4개의 Cas12a 링커-NLS 구성 (서열식별번호: 489, 서열식별번호: 485, 서열식별번호: 487, 및 서열식별번호: 483) 및 '비최적화된' 설계물 (서열식별번호: 479)이, crRNA 및 chRDNA의 혼합 패널을 사용하여 비교를 위해 선택되었다. chRDNA 설계물 내의 DNA 염기의 위치를 포함한 표적화 영역이 표 24에 제시되어 있다.
Figure pct00042
표 24에 제시된 표적화 영역은 활성화 영역 (서열식별번호: 459)의 3' 단부에 첨부되었고, 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
각각의 가이드와 복합체 형성된 개별 Cas12a 링커-NLS 구성은 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조되었으며, 복합체는 각각의 Cas12a 링커-NLS 및 가이드 조합을 가이드하기 위해 Cas12a의 20:60 및 80:240 pmol의 두 농도에서 어셈블리되었다는 편차가 있다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 1차 T 세포로 형질감염시키고, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다.
표 24에 제시된 가이드와 복합체 형성된 Cas12a 링커-NLS 구성의 편집 결과가 도 16B 및 표 25 및 26에 제시되어 있다.
Figure pct00043
Figure pct00044
StDev=표준 편차; n=2; * = 이전 실시예에서 사용된 NLS 설계
도 16B 및 표 25 및 26에 제시된 데이터는 인간 1차 T 세포에서 다중 표적 전체에 걸쳐 다양한 NLS 구성의 개선된 활성을 입증한다 (즉, 도 16B (1616) 또는 도 16B (1617)의 평균 편집과 비교한 도 16B (1613)의 평균 편집; 도 16B 참조). 대안적 NLS 서열, 링커 및 Cas 뉴클레아제는 본원에 기재된 방법과 유사한 방식으로 스크리닝될 수 있다.
실시예 12
Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 멀티플렉스화
본 실시예는 GS-SV40 (서열식별번호: 479; "비최적화된 NLS") 및 (G4S)2-NPL (서열식별번호: 489; "최적화된 NLS")과의 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체의 멀티플렉스화된 편집 비율을 비교하는 것과, 단일 형질감염 반응 (멀티플렉스화)에서 다중 Cas12a chRDNA를 세포에 공동 전달하는 것을 설명한다.
A. Cas12a chRDNA 링커-NLS 서열의 인 실리코 설계
아시다미노코쿠스 종 (균주 BV3L6) Cas12a 단백질 (서열식별번호: 01)은 제1 C-말단 링커-NLS 서열 (서열식별번호: 479) 또는 제2 C-말단 링커-NLS 서열 (서열식별번호: 489)로 조작되었고, Cas12a 재조합 단백질은 실시예 2에 기재된 바와 같이 발현되었다.
B. Cas12a 링커-NLS의 세포 멀티플렉스화 활성
링커-NLS 서열 (서열식별번호: 479) 또는 링커-NLS 서열 (서열식별번호: 489)을 포함하는 정제된 재조합 Cas12a 단백질을 실시예 2에 기재된 바와 같이, TRAC 표적화 chRDNA (서열식별번호: 508), B2M 표적화 chRDNA 유전자 (서열식별번호: 416), CISH 표적화 chRDNA (서열식별번호: 509), 또는 CBLB 표적화 chRDNA (서열식별번호: 510)와 복합체 형성하였으며, 복합체가 가이드에 대한 Cas12a의 40:80 pmol의 비율로 어셈블리되었다는 편차를 갖는다. 각각의 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체는 단일 표적화 복합체로서; 하나의 혼합물로 조합된, TRAC 및 B2M 둘 다를 표적으로 하는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체로서; 하나의 혼합물로 조합된, CISH 및 CBLB 둘 다를 표적으로 하는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체로서; 또는 하나의 혼합물로 조합된, TRAC, B2M, CISH, 및 CBLB 모두를 표적으로 하는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체로서 사용되었다. 각각의 Cas12a chRDNA/핵단백질 조성물을 실시예 3에 기재된 바와 같이 1차 T 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 후 48시간에, 그 결과로 생성된 각각의 Cas12a chRDNA/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. 세포 편집 실험의 결과가 도 17에 나타나 있고 표 27에 제시되어 있다.
Figure pct00045
도 17 및 표 27에 제시된 데이터는 인간 1차 T 세포에서 멀티플렉스화를 위해 사용될 때 링커-NLS 구축물의 개선된 활성을 입증한다. 예를 들어, 비최적화된 GS-SV40 링커-NLS (서열식별번호: 479, 도 17 1708)를 사용한 시리즈 도 17, 1707의 평균 편집 및 최적화된 (G4S)2-NPL 링커 NLS (서열식별번호: 489, 도 17, 1712)를 사용한 시리즈 도 17, 1711의 평균 편집을 참조한다. 대안적 NLS 서열, 링커, Cas12 뉴클레아제 및 멀티플렉스화를 위한 표적은 본원에 기재된 방법과 유사한 방식으로 스크리닝될 수 있다.
실시예 13
화학적 변형을 포함하는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체를 사용한 편집
본 실시예는 Cas12a 가이드 RNA의 활성화 및 표적화 영역에서 포스포로티오에이트 화학적 변형을 함유하는 Cas12a chRDNA의 세포 편집 활성을 설명한다.
A. 화학적 변형을 갖는 Cas12a chRDNA의 인 실리코 설계
TRAC 표적-12 서열 (서열식별번호: 316)이 조작을 위해 선택되었다. Cas12a 가이드의 5' 단부에 (즉, 활성화 영역의 5'-말단 뉴클레오티드) 2개의 포스포로티오에이트 결합을 설계하였고, Cas12a 가이드의 3' 단부에 (즉, 표적화 영역의 3'-말단 뉴클레오티드) 2개의 포스포로티오에이트 결합을 설계하였다. 이어서, 일련의 Cas12a 가이드는 단부-보호 포스포로티오에이트 변형 이외에 활성화 영역 내의 DNA 염기로 설계되었다. 화학적 변형을 갖는 Cas12a chRDNA의 서열이 표 28에 제시되어 있다. 이러한 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다 (열거된 포스포로티오에이트 결합 및 DNA 염기 위치는 도 5에 제시된 번호에 상응함).
Figure pct00046
포스포로티오에이트 결합은 "*"로 나타낸다.
B. 세포 형질감염 및 분석
개별 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체를 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이 핵단백질 복합체를 1차 T 세포로 형질감염시키고, 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율을 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정하였다. 세포내 편집 실험의 결과가 표 29에 제시되어 있다.
Figure pct00047
StDev=표준 편차; n=2
표 29에 제시된 데이터는 포스포로티오에이트 결합 단독을 포함하거나 또는 포스포로티오에이트 결합과 DNA 염기를 포함하는 Cas12a 가이드의 편집 활성을 입증한다. 이들 가이드는 모든 RNA 가이드와 비교하여 인간 1차 T 세포에서 강력한 편집이 가능한다 (즉, 서열식별번호: 512 또는 서열식별번호: 515의 평균 편집과 비교한 서열식별번호: 511의 평균 편집; 표 29 참조). 화학적 변형의 대안적 조합 및 위치는 본원에 기재된 방법과 유사한 방식으로 스크리닝할 수 있다.
실시예 14
Cas12a chRDNA /핵단백질 복합체를 사용한 인간 유도 다능성 줄기 세포의 형질감염
본 실시예는 Cas12a chRDNA/핵단백질 복합체를 사용한 인간 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC)의 세포 편집을 설명한다.
A. chRDNA 가이드의 인 실리코 설계
가이드의 활성화 영역 내의 DNA 염기를 포함하는 CISH 유전자 (서열식별번호: 509)를 표적으로 하는 AsCas12a 가이드 서열이 추가 조작 및 표적화 영역 (서열식별번호: 518 - 서열식별번호: 529) 내로의 부가의 DNA 염기의 도입을 위해 선택되었다. 서열은 합성을 위해 상업적 제조업체에게 제공되었다.
B. 세포 형질감염 및 분석
개별 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체는 본질적으로 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 핵단백질 복합체를 실시예 3에 기재된 바와 같이 1차 T 세포로 형질감염시켰다.
iPSC는 하기 변형을 수반하여, 실시예 3에 기재된 1차 T 세포를 취급하고 형질감염시키는 방법과 유사한 방식으로 취급되고 형질감염되었다. iPSC는 형질감염 전에 37℃에서 3시간 동안 최종 농도 10 uM의 Rho-연관, 나선형-코일-함유 단백질 키나제 억제제 ["ROCKi"; 밀리포어시그마 (MilliporeSigma; 미국 매사추세츠주 벌링턴)]가 보충된 mTeSR-플러스 배지 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)에서 배양되었다. mTeSR-플러스/ROCKi 배지를 제거하고 iPSC를 10 mL의 PBS로 세척한 다음, 3 mL의 아쿠타제 (스템셀 테크놀로지; 미국 매사추세츠주 케임브리지)를 부가하고 세포를 37℃에서 5-10분 동안 인큐베이션하였다. 7 mL의 mTeSR-플러스와 ROCKi를 세포에 부가하고 세포를 혼합하여 계수하였다. 그런 다음, 세포를 원심분리하고 배지를 제거한 후, 세포를 10 mL의 PBS로 세척하고 다시 원심분리하여 PBS를 제거하였다. 세포를 뉴클레오펙터™ P3 (론자; 미국 뉴저지주 앨런데일) 용액에 2e5개 세포/mL의 밀도로 재현탁하고, Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체와 혼합하고, 펄스 코드 CA158을 사용하여 형질감염시켰다. 그 결과로 생성된 Cas12a 가이드/핵단백질 복합체의 게놈 편집 효율은 실시예 4에 기재된 바와 같이 결정되었고 표 29에 제시되어 있다.
Figure pct00048
StDev=표준 편차; n=1-2
표 29에 제시된 데이터는 Cas12a chRDNA 가이드/핵단백질 복합체가 인간 iPSC의 조작에 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 다른 세포 유형은 본원에 기재된 방법과 유사한 방식으로 편집될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본 개시내용의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 상기 실시양태의 변형 및 변동이 이루어질 수 있다. 이러한 변형 및 변동은 본 개시내용의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CARIBOU BIOSCIENCES, INC. <120> DNA-CONTAINING POLYNUCLEOTIDES AND GUIDES FOR CRISPR TYPE V SYSTEMS, AND METHODS OF MAKING AND USING THE SAME <130> CBI039.30 <140> PCT/US2021/055394 <141> 2021-10-18 <150> 63/229,870 <151> 2021-08-05 <150> 63/127,648 <151> 2020-12-18 <150> 63/093,459 <151> 2020-10-19 <160> 529 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1307 <212> PRT <213> Acidaminococcus sp. <220> <223> Acidaminococcus sp. (strain BV3L6) <220> <223> Cas12a <400> 1 Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr 1 5 10 15 Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly Lys Thr Leu Lys His Ile Gln 20 25 30 Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln 50 55 60 Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile 65 70 75 80 Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile 85 90 95 Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly 100 105 110 Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile Asn Lys Arg His Ala Glu Ile 115 120 125 Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys 130 135 140 Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu His Glu Asn Ala Leu Leu Arg 145 150 155 160 Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe Ser Gly Phe Tyr Glu Asn Arg 165 170 175 Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile Ser Thr Ala Ile Pro His Arg 180 185 190 Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe Lys Glu Asn Cys His 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localization sequence (NLS) <400> 4 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> Nuclear localization sequence (NLS) <400> 5 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Acidaminococcus sp. <220> <223> Acidaminococcus sp. (strain BV3L6) <220> <223> AsCas12 CRISPR repeat <400> 6 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 7 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> AsCas12 crRNA <220> <221> modified_base <222> (21)..(40) <223> a, c, g, or u <400> 7 uaauuucuac ucuuguagau nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 40 <210> 8 <211> 21 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Lachnospiraceae bacterium ND2006 <220> <223> LbaCas12 CRISPR repeat <400> 8 uaauuucuac uaaguguaga u 21 <210> 9 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> LbaCas12 crRNA <220> <221> modified_base <222> (22)..(41) <223> a, c, g, or u <400> 9 uaauuucuac uaaguguaga unnnnnnnnn nnnnnnnnnn n 41 <210> 10 <211> 20 <212> RNA <213> Francisella tularensis <220> <223> Francisella tularensis subsp. novicida (strain U112) <220> <223> FnoCas12 CRISPR repeat <400> 10 uaauuucuac uguuguagau 20 <210> 11 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> FnoCas12 crRNA <220> <221> modified_base <222> (21)..(40) <223> a, c, g, or u <400> 11 uaauuucuac uguuguagau nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 40 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt1 <400> 12 tttctctcct ctttcccaca gaat 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt2 <400> 13 tttcccacag aatttagcat ggct 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt3 <400> 14 tttagcatgg ctcagacagt cact 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt4 <400> 15 tttattctgg tacaagcagc ctcc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt5 <400> 16 tttctggaag ttcacagaga aacg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt6 <400> 17 tttctctgtg aacttccaga aagc 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt7 <400> 18 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gaat 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt17 <400> 28 tttgtctgtg atatacacat caga 24 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt18 <400> 29 tttgttgctc caggccacag cact 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt19 <400> 30 tttgcacatg caaagtcaga tttg 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt20 <400> 31 tttgcatgtg caaacgcctt caac 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt21 <400> 32 tttcctttta gaaagttcct gtga 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt22 <400> 33 tttagaaagt tcctgtgatg tcaa 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt23 <400> 34 tttctcgacc agcttgacat caca 24 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt24 <400> 35 tttcaaagct tttctcgacc agct 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt25 <400> 36 tttacagata cgaacctaaa cttt 24 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt26 <400> 37 tttgaaagtt taggttcgta tctg 24 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt27 <400> 38 tttcaaaacc tgtcagtgat tggg 24 <210> 39 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt28 <400> 39 tttcaggagg aggattcgga accc 24 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt29 <400> 40 tttaatctgc tcatgacgct gcgg 24 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt30 <400> 41 tttggagagg gagaagaggg gcaa 24 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt31 <400> 42 tttcacctcc ttgggggtag gaga 24 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt32 <400> 43 tttatgatta agattgctga agag 24 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt33 <400> 44 tttggcagct cttcagcaat ctta 24 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> TRAC-tgt34 <400> 45 tttatttttt tttaatagtg ttca 24 <210> 46 <211> 24 <212> DNA 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> d12 <220> <221> modified_base <222> (1)..(11) <223> a, c, g, or u <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> a, c, g, or t <220> <221> modified_base <222> (13)..(20) <223> a, c, g, or u <400> 202 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> d13 <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> a, c, g, or u <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> a, c, g, or t <220> <221> modified_base <222> (14)..(20) <223> a, c, g, or u <400> 203 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> d14 <220> <221> 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20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> d19 <220> <221> modified_base <222> (1)..(18) <223> a, c, g, or u <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> a, c, g, or t <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> a, c, g, or u <400> 209 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> d20 <220> <221> modified_base <222> (1)..(19) <223> a, c, g, or u <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> a, c, g, or t <400> 210 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20 <210> 211 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_cr <400> 211 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Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_d19 <400> 272 cugauggucc augucuguta 20 <210> 273 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_d20 <400> 273 cugauggucc augucuguua 20 <210> 274 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_crRNA <400> 274 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 275 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.1 <400> 275 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 276 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.2 <400> 276 atauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 277 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.3 <400> 277 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.4 <400> 278 auataagugg aggcgucgcg 20 <210> 279 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.5 <400> 279 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Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.9 <400> 283 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 284 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.10 <400> 284 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 285 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.11 <400> 285 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 286 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_d.12 <400> 286 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 287 <211> 20 <212> DNA <213> 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Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR.t12_d19.15.11.10.3 <400> 327 gagucucuca gcugguacac 20 <210> 328 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR.t12_d20.17.15.10.1 <400> 328 gagucucuca gcugguacac 20 <210> 329 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR.t12_d_7 <400> 329 gagucucuca gcugguacac 20 <210> 330 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_act.3'_crRNA <400> 330 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 331 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d20.17 <400> 331 agugggggug aauucagugt 20 <210> 332 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d15.11 <400> 332 agugggggug aauucagugu 20 <210> 333 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d15.14 <400> 333 agugggggug aautcagugu 20 <210> 334 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d11.10 <400> 334 agugggggug aauucagugu 20 <210> 335 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d20.11.1 <400> 335 agugggggug aauucagugt 20 <210> 336 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d17.11 <400> 336 agugggggug aauucagugu 20 <210> 337 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d2.1 <400> 337 agugggggug aauucagugu 20 <210> 338 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d20.17.15.2 <400> 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Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d_6b <400> 342 agugggggug aatucagugu 20 <210> 343 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d16.9.1-3 <400> 343 agtgggggtg aauucagugu 20 <210> 344 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.t12_d_10 <400> 344 agugggggug aattcagtgt 20 <210> 345 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_cr-3' <400> 345 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 346 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_cr-3'_d.20.11.1 <400> 346 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 347 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_cr-3'_d.19.14.8 <400> 347 auauaagtgg aggcgucgcg 20 <210> 348 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_cr-3'_d.19.17.14.8 <400> 348 auauaagtgg aggcgucgcg 20 <210> 349 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_cr-3'_d.12.11.8 <400> 349 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 350 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_cr-3'_d.18.16.10 <400> 350 auauaagugg aggcgtcgcg 20 <210> 351 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_cr-3'_d.19.17.15.1 <400> 351 auauaagugg aggcgucgcg 20 <210> 352 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM_tgt1_cr-3'_d.19-16 <400> 352 auauaagugg aggcgtcgcg 20 <210> 353 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.in_t12_cr-3' <400> 353 ucuggaggcu 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<223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.in_t12_cr-3'_d.01.08.10.17 <400> 357 tcuggaggct cucaaggacu 20 <210> 358 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.in_t12_cr-3'_d.17.19.20 <400> 358 ucuggaggcu cucaaggact 20 <210> 359 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.in_t12_cr-3'_d.08.09.19.20 <400> 359 ucuggaggcu cucaaggact 20 <210> 360 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> BM.in_t12_cr-3'_d01.10.11.17.19.20 <400> 360 tcuggaggct 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augucuguta 20 <210> 365 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_d8.14 <400> 365 cugauggtcc augtcuguua 20 <210> 366 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_d1.8.20 <400> 366 cugauggtcc augucuguua 20 <210> 367 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_d8-10 <400> 367 cugauggtcc augucuguua 20 <210> 368 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_d8.9.15 <400> 368 cugauggtcc augucuguua 20 <210> 369 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_d1.8.19 <400> 369 cugauggtcc augucuguta 20 <210> 370 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> RPL32_on <400> 370 tttggggtga tcagacccaa cagc 24 <210> 371 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> RPL_32-off.1 <400> 371 tttggggtga tcagacccaa cacc 24 <210> 372 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> RPL_32-off.2 <400> 372 tttggggtga tcagacccaa cacc 24 <210> 373 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> DNMT1_on <400> 373 tttcctgatg gtccatgtct gtta 24 <210> 374 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> DNMT1_off-1 <400> 374 tttcctgatg gtccatgtct gaat 24 <210> 375 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr <400> 375 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 376 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.1 <400> 376 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 377 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.8 <400> 377 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 378 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.9 <400> 378 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 379 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.10 <400> 379 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 380 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.11 <400> 380 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 381 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.12 <400> 381 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 382 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.14 <400> 382 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 383 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.15 <400> 383 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 384 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.16 <400> 384 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 385 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.17 <400> 385 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 386 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.18 <400> 386 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 387 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.19 <400> 387 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 388 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_2_d.20 <400> 388 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 389 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d.13 <400> 389 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 390 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d11.12 <400> 390 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 391 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d12.14 <400> 391 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 392 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d14.15 <400> 392 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 393 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d11.15 <400> 393 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 394 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d11.12.14 <400> 394 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 395 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d12.14.15 <400> 395 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 396 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d11.14.15 <400> 396 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 397 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d11.12.14.15 <400> 397 gggugaucag acccaacagc 20 <210> 398 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_sp.20 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> an abasic site that lacks 2' - hydroxyl <400> 398 gggugaucag acccaacagn t 21 <210> 399 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d14_sp20 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> an abasic site that lacks 2' - hydroxyl <400> 399 gggugaucag acccaacagn t 21 <210> 400 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d15_sp20 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> an abasic site that lacks 2' - hydroxyl <400> 400 gggugaucag acccaacagn t 21 <210> 401 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d12_sp20 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> an abasic site that lacks 2' - hydroxyl <400> 401 gggugaucag acccaacagn t 21 <210> 402 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d11_sp20 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> an abasic site that lacks 2' - hydroxyl <400> 402 gggugaucag acccaacagn t 21 <210> 403 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> RP_cr_3'_d14.15_sp20 <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> an abasic site that lacks 2' - hydroxyl <400> 403 gggugaucag acccaacagn t 21 <210> 404 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-crRNA <400> 404 cugauggucc augucuguua 20 <210> 405 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-d1.20 <400> 405 cugauggucc augucuguua 20 <210> 406 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-d8.19 <400> 406 cugauggtcc augucuguta 20 <210> 407 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-d9 <400> 407 cugauggucc augucuguua 20 <210> 408 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-d8.14 <400> 408 cugauggtcc augtcuguua 20 <210> 409 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-d10.17 <400> 409 cugauggucc augucuguua 20 <210> 410 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-d1.8.20 <400> 410 cugauggtcc augucuguua 20 <210> 411 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-d1.8.19 <400> 411 cugauggtcc augucuguta 20 <210> 412 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DNMT1-d8.9.15 <400> 412 cugauggtcc augucuguua 20 <210> 413 <211> 3147 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> anti-BCMA CAR construct <400> 413 cataaacctc ccattctgct aatgcccagc ctaagttggg gagaccactc cagattccaa 60 gatgtacagt ttgctttgct gggccttttt cccatgcctg cctttactct gccagagtta 120 tattgctggg gttttgaaga agatcctatt aaataaaaga ataagcagta ttattaagta 180 gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca ggccaggcct ggccgtgaac gttcactgaa 240 atcatggcct cttggccaag attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc agtccatcac 300 gagcagctgg tttctaagat gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg acttgccagc 360 cccacagagc cccgcccttg tccatcactg gcatctggac tccagcctgg gttggggcaa 420 agagggaaat gagatcatgt cctaaccctg atcctcttgt cccacagata tccagaaccc 480 tgaccctgcc gtgtaccagc ttaattaatt agtccataga gcccaccgca tccccagcat 540 gcctgctatt gtcttcccaa tcctccccct tgctgtcctg ccccacccca ccccccagaa 600 tagaatgaca cctactcaga caatgcgatg caatttcctc attttattag gaaaggacag 660 tgggagtggc accttccagg gtcaaggaag gcacggggga ggggcaaaca acagatggct 720 ggcaactaga aggcacagtt attacctcgg tggcagggcc tgcatatgga gggcatcgta 780 tgtatctttc gtggccgtac tcaggccttg gtagagaccg tcgtggcctt tccctctgcg 840 tctctctccc ttcatcccga tctcgctgta agcctccgcc atcttatctt tctgcagttc 900 attataaagc ccctcttgcg ggttttttct cctcggtttt cctcccatct ctgggtccct 960 ccctcggcgc ttatccaata catcatattc ctctcgcctc cccaggttaa gctcattgta 1020 aagttggttt tgcccttgct gataggccgg agcgtcagca gaccggctaa atttcactct 1080 cagttcgcaa ccaccctcct cttcttcggg gaatcggcag ctacatccat cctcctcttg 1140 cgtagtttgg accgggcgca taaatggttg cttaaaaata tacagcaact tttttcttcc 1200 tcttttgcag taaagagtaa taacgaggga cagcagcaag accccgcacg ttccggcaag 1260 cggtgcccag atgtagatgt cgcaagcaaa gtccagcccg cgagtatgaa ccgcgcctcc 1320 cgctgcgggg cgacaagcct ccggccgaag agagagtggc tgggaagcga tagtgggtgc 1380 aggcgtgggt ggccgagggg caggcgtggt tgtggcagcg gctttaattt ccactttggt 1440 gccgccgcca aaggtcggcg gaaagctatg gccgttctgg caataataca ccgcaaaatc 1500 ttccggttcc aggctgctaa tggtcagggt aaaatcggtg ccgctgccgc tgccgctaaa 1560 gcgcgccgga atgccggtaa tgctctggct cgcataataa atcagcaggc gcggcgcctg 1620 gcccggtttc tgctgatacc aatgcagata atcgctaatg ctctggctcg cgcggcagct 1680 cagggtcgcg cgttcgcccg ggctcaggct cagggtcgcc gggctctggg tcagcacaat 1740 ttcgctgccg ccgccgccgc tgccgccgcc gccgctgccg ccgccgccgc tgctcacggt 1800 caccagggtg ccctggcccc acacatcaaa atagccatca tagttatagc gcgcgcaata 1860 atacaccgcg gtatcttcgc tgcgcaggct gctcagttcc atatacgcgg tgctggtgct 1920 tttatccgcg gtaatggtca cgcggccttt aaatttttcg ttatatttgg tcgcatcgtt 1980 atacggaata atatagccca tccattccag gccctggccc ggcgcctggc gcacccaatg 2040 catcacatag ctggtaaagg tatagccgct cgctttgcag ctcactttca cgctgctgcc 2100 cggttttttc acttccgcgc cgctctgcac cagctgcacc tgcggtcttg ccgcgtggag 2160 caggagtgcc aatggaagca gaagtgcggt cacgggcaac gccatggtgg ctatgacgcg 2220 tcgcgccgag tgaggggttg tgggctcttt tattgagctc ggggagcaga agcgcgcgaa 2280 cagaagcgag aagcgaactg attggttagt tcaaataagg cacagggtca tttcaggtcc 2340 ttggggcacc ctggaaacat ctgatggttc tctagaaact gctgagggcg ggaccgcatc 2400 tggggaccat ctgttcttgg ccctgagccg gggcaggaac tgcttaccac agatatcctg 2460 tttggcccat attctgctgt tccaactgtt cttggccctg agccggggca ggaactgctt 2520 accacagata tcctgtttgg cccatattct gctgtctctc tgttcctaac cttgatccta 2580 gcttgccaaa cctacaggtg gggtctttca ttcccccctt tttctggaga ctaaataaag 2640 tttaaactga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 2700 tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 2760 ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 2820 gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 2880 agcccaggta agggcagctt tggtgccttc gcaggctgtt tccttgcttc aggaatggcc 2940 aggttctgcc cagagctctg gtcaatgatg tctaaaactc ctctgattgg tggtctcggc 3000 cttatccatt gccaccaaaa ccctcttttt actaagaaac agtgagcctt gttctggcag 3060 tccagagaat gacacgggaa aaaagcagat gaagagaagg tggcaggaga gggcacgtgg 3120 cccagcctca gtctctccaa ctgagtt 3147 <210> 414 <211> 3409 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> B2M-HLA-e construct <400> 414 tgagtgctga gagggcatca gaagtccttg agagcctcca gagaaaggct cttaaaaatg 60 cagcgcaatc tccagtgaca gaagatactg ctagaaatct gctagaaaaa aaacaaaaaa 120 ggcatgtata gaggaattat gagggaaaga taccaagtca cggtttattc ttcaaaatgg 180 aggtggcttg ttgggaaggt ggaagctcat ttggccagag tggaaatgga attgggagaa 240 atcgatgacc aaatgtaaac acttggtgcc tgatatagct tgacaccaag ttagccccaa 300 gtgaaatacc ctggcaatat taatgtgtct tttcccgata ttcctcaggt actccaaaga 360 ttcaggttta ctcacgtcat ccagcagaga atggaaagtc aaatttcctg aattgctatg 420 tgtctgggtt tcatccatcc gacattgaag ttgacttact gaagaatgga gagagaattg 480 aaaaagtgga gcattcagac ttgtctttca gcaaggactg gtctttctat ctcttgtact 540 acactgaatt tttaattaat tagtccatag agcccaccgc atccccagca tgcctgctat 600 tgtcttccca atcctccccc ttgctgtcct gccccacccc accccccaga atagaatgac 660 acctactcag acaatgcgat gcaatttcct cattttatta ggaaaggaca gtgggagtgg 720 caccttccag ggtcaaggaa ggcacggggg aggggcaaac aacagatggc tggcaactag 780 aaggcacagt tattacaagc tgtgagactc agacccctgg gcactgtcgc tccactcagc 840 cttagagtag ctccctcctt ttccacctga gctcttcttc ctccatatca cagcagcaac 900 cacagctcca gagaccacag atccaaggag aaccaggcca gcaatgatgc ccacgatggg 960 gatggtgggc tgggaagccg gcttccatct cagggtgacg ggctcgggta gcccctcatg 1020 ctgcacatgg cacgtgtatc tctgctcctc tccagaaggc accaccacag ctgcccactt 1080 ctggaaggtt ccatcccctg caggcctggt ctccacgagc tccgtgtcct gggtatggcc 1140 ctccccatcc tgctgccagg tcagtgtgat ctccgcaggg tagaagccca gggcccagca 1200 cctcagggtg gcctcatggt cagagatggg gtggtgagtc acgtgtgtct ttgggggctc 1260 caggtgaagc agcgtctcct tccccttctc caggtatttg tggagccact ccacgcatgt 1320 gtcttccagg taggctctct ggtgctccgc ctcagaagca tcatttgact tttgctcgga 1380 gatctgagcc gccgtgtcca ccgcggtcca ggagcgcagg tcctcattca gggtgagata 1440 atccttgccg tcgtaggcga actgttcata cccgcggagg aagcgcccgt cgggccccag 1500 ctcgcagcca tgcatccact gcagggtgtg agacccggcc tcgctctgat tgtagtagcc 1560 gcgcagcgtc cgcagattca ctcggaaaat ctgtgcggtg tccctggcgc tccgtgtctc 1620 ccggtcccaa tactctgacc cctcctgctc catccacggc gcccgcggca ccatcctcgg 1680 actcgcggcg tcgttgtcga agcgcacgaa ctgggtgtcg tccacgtagc ccacagagat 1740 gaagcggggc tccccgcggc cgggccggga cacggaagtg tggaaatact tcaaggagtg 1800 ggatccagac cctccgccac cagatccccc tcctccagaa ccgcctccgc cagaccctcc 1860 gccacccatg tctcgatccc atttcacgat cttgggctgt gacaaagtca catggttcac 1920 acggcaggca tactcatctt tctccgtagg tgtaaactct gtatagtaca agagatagaa 1980 agaccagtcc ttgctgaaag acaagtctga atgctccact ttttcaattc tctctccatt 2040 cttcagtaag tcaacttcaa tgtcggatgg atgaaaccca gacacatagc aattcaggaa 2100 atttgacttt ccattctctg ctggatgacg tgagtaaacc tgaatctttg gagtacgctg 2160 gatggagccg ccgcctccgc taccgcctcc tccgctccca cctccaccca gaaagagggt 2220 ccgtggtgcc attacagcct ccaggccaga aagagagagt agcgcgagca cagctaaggc 2280 cacggagcga gacatggtgg ctctagagta ggcgccggtc acagcttgga tctgtaacgg 2340 cgcagaacag aaaacgaaac aaagacgtag agttgagcaa gcagggtcag gcaaagcgtg 2400 gagagccggc tgagtctagg taggctccaa gggagcgccg gacaaaggcc cggtctcgac 2460 ctgagcttta aacttaccta gacggcggac gcagttcagg aggcaccaca ggcgggaggc 2520 ggcagaacgc gactcaaccg gcgtggatgg cggcctcagg tagggcggcg ggcgcgtgaa 2580 ggagagatgc gagcccctcg aagcttcagc tgtgttctgg cggcaaaccc gttgcgaaaa 2640 agaacgttca cggcgactac tgcacttata tacggttctc ccccaccctc gggaaaaagg 2700 cggagccagt acacgacatc actttcccag tttaccccgc gccaccttct ctaggcaccc 2760 gttcaattgc cgacccctcc 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415 taauuucuac ucutguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 416 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> B2M_cr3'_tgt.12-d20.11.1 <400> 416 taauuucuac ucutguagau agugggggug aauucagugt 40 <210> 417 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> crRNA <400> 417 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 418 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d1 <400> 418 taauuucuac ucuuguagau 20 <210> 419 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d2 <400> 419 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 420 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d3 <400> 420 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 421 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d4 <400> 421 uaatuucuac ucuuguagau 20 <210> 422 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d5 <400> 422 uaautucuac ucuuguagau 20 <210> 423 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d6 <400> 423 uaauutcuac ucuuguagau 20 <210> 424 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d7 <400> 424 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 425 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d8 <400> 425 uaauuuctac ucuuguagau 20 <210> 426 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d9 <400> 426 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 427 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d10 <400> 427 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 428 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d11 <400> 428 uaauuucuac tcuuguagau 20 <210> 429 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d12 <400> 429 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 430 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d13 <400> 430 uaauuucuac 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Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d17 <400> 434 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 435 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d18 <400> 435 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 436 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d19 <400> 436 uaauuucuac ucuuguagau 20 <210> 437 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISPR-d20 <400> 437 uaauuucuac ucuuguagat 20 <210> 438 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_cr-d7 <400> 445 uaauuucuac ucuuguagau cugauggucc augucuguua 40 <210> 446 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_cr-d8 <400> 446 uaauuuctac ucuuguagau cugauggucc augucuguua 40 <210> 447 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_cr-d9 <400> 447 uaauuucuac ucuuguagau cugauggucc augucuguua 40 <210> 448 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> DMT.t3_cr-d10 <400> 448 uaauuucuac ucuuguagau cugauggucc 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uaauuucuac ucutguagau 20 <210> 463 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISRP-402 <400> 463 taauuucuac ucutgtagau 20 <210> 464 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISRP-403 <400> 464 uaauuucuac ucutguagau 20 <210> 465 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CRISRP-404 <400> 465 taauuucuac ucutguagau 20 <210> 466 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR_cr_tgt.12-d20.11.1 <400> 466 uaauuucuac ucuuguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 467 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR_cr3'_tgt.12-d20.11.1 <400> 467 taauuucuac ucutguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 468 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR_cr-2_tgt.12-d20.11.1 <400> 468 taauuucuac ucuugtagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 469 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR_cr-6_tgt.12-d20.11.1 <400> 469 taauuucuac uctugtagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 470 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR_cr-401_tgt.12-d20.11.1 <400> 470 uaauuucuac ucutguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 471 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR_cr-403_tgt.12-d20.11.1 <400> 471 taauuucuac ucutgtagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 472 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR_cr-404_tgt.12-d20.11.1 <400> 472 uaauuucuac ucutguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 473 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TR_cr-405_tgt.12-d20.11.1 <400> 473 taauuucuac ucutguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 474 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> BCMA scFv chain 1 <400> 474 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Ala Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asn Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 475 <211> 107 <212> PRT 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BCMA scFv <400> 477 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Ala Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asn Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 130 135 140 Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 165 170 175 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Thr Gly Ile Pro 180 185 190 Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 195 200 205 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> (GGGGS)2_SV40-NLS_GS_NPL-NLS <400> 485 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Val Gly Ser Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys 20 25 30 Lys Lys Lys 35 <210> 486 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> (GGGGS)2_NPL-NLS_GS_SV40-NLS <400> 486 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Pro Ala Ala Thr 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Pro Lys Lys Lys 20 25 30 Arg Lys Val 35 <210> 487 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> (GGGGS)2_SV40-NLS <400> 487 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Val <210> 488 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> (GGGGS)2_SV40-NLS_GS_SV40-NLS <400> 488 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys 1 5 10 15 Val Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 <210> 489 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> (GGGGS)2_NPL-NLS <400> 489 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Pro Ala Ala Thr 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 20 25 <210> 490 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> (GGGGS)2_NPL-NLS_GS_NPL-NLS <400> 490 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Arg Pro Ala Ala Thr 1 5 10 15 Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Gly Ser Lys Arg Pro Ala 20 25 30 Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 35 40 <210> 491 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TRAC-tgt25 <400> 491 cagauacgaa ccuaaacuuu 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Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CISH-tgt3 chRDNA <400> 509 taauuucuac ucutguagau gguguacagc aguggcuggu 40 <210> 510 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CBLB-tgt3 chRDNA <400> 510 taauuucuac ucutguagau ccugauacau aucagcauuu 40 <210> 511 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TRAC-tgt12 crRNA <400> 511 uaauuucuac ucuuguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 512 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TRAC-tgt12 ps-r1.2_s19.20 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(40) <223> Phosphorothioate linkage <400> 512 uaauuucuac ucuuguagau 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ucuuguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 517 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> TRAC-tgt12 ps-r1.2_r-d14 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> Phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (38)..(40) <223> Phosphorothioate linkage <400> 517 uaauuucuac ucutguagau gagucucuca gcugguacac 40 <210> 518 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CSH-tgt3_3'_d1 <400> 518 taauuucuac ucutguagau gguguacagc aguggcuggu 40 <210> 519 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CSH-tgt3_3'_d8 <400> 519 taauuucuac ucutguagau gguguacagc aguggcuggu 40 <210> 520 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CSH-tgt3_3'_d9 <400> 520 taauuucuac ucutguagau gguguacagc aguggcuggu 40 <210> 521 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CSH-tgt3_3'_d10 <400> 521 taauuucuac ucutguagau gguguacagc aguggcuggu 40 <210> 522 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide <220> <223> CSH-tgt3_3'_d11 <400> 522 taauuucuac 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Claims (43)

  1. 하기를 포함하는, CRISPR 가이드 분자:
    표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역 및
    리보뉴클레오티드 대신 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한 RNA 서열 UAAUUUCUACUCUUGUAGAU를 포함하는 활성화 영역으로서, Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 활성화 영역.
  2. 제1항에 있어서, 활성화 영역 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 및 19 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  3. 제1항에 있어서, 활성화 영역 내의 위치 1, 3, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 18 및 19 중 10개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  4. 제1항에 있어서, 이노신, 데옥시-이노신, 데옥시-우라실, 크산토신, C3 스페이서, 5-메틸 dC, 5-히드록시부틸-2'-데옥시우리딘, 5-니트로인돌, 5-메틸 이소데옥시시토신, 이소 데옥시구아노신, 데옥시우리딘, 이소-데옥시시티딘, 및 무염기 부위를 포함한 염기 변형, 및 포스포로티오에이트 변형을 포함한 백본 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화학적 변형을 포함하는 CRISPR 가이드 분자.
  5. 제1항에 있어서, 표적화 영역이 B2M 유전자를 표적으로 하고 RNA 서열 AGUGGGGGUGAAUUCAGUGU를 포함하며, 여기서 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체되는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  6. 제5항에 있어서, 표적화 영역 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  7. 제5항에 있어서, 표적화 영역 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 5개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  8. 제5항에 있어서, 표적화 영역이 서열식별번호: 51-133으로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  9. 제5항에 있어서, 서열식별번호: 212-231, 275-315, 및 331-350으로부터 선택된 서열을 포함하는 CRISPR 가이드 분자.
  10. 제5항에 있어서, 서열식별번호: 416의 서열을 포함하는 CRISPR 가이드 분자.
  11. 제1항에 있어서, 표적화 영역이 TRAC 유전자를 표적으로 하고 RNA 서열 GAGUCUCUCAGCUGGUACAC를 포함하며, 여기서 임의로, 서열 내의 염기 중 적어도 하나는 염기 유사체 또는 무염기 부위로 대체되는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  12. 제11항에 있어서, 표적화 영역 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 하나 이상이 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  13. 제11항에 있어서, 표적화 영역 내의 위치 1, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중 5개 이하가 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  14. 제11항에 있어서, 표적화 영역이 서열식별번호: 15-20으로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  15. 제11항에 있어서, 서열식별번호: 233-252, 317-329, 491-492, 및 508로부터 선택된 서열을 포함하는 CRISPR 가이드 분자.
  16. 제11항에 있어서, 화학적 변형을 추가로 포함하며, 여기서 CRISPR 가이드 분자는 서열식별번호: 512-517로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  17. 제11항에 있어서, 서열식별번호: 415의 서열을 포함하는 CRISPR 가이드 분자.
  18. 제1항에 있어서, 표적화 영역이 CISH 유전자를 표적으로 하고 서열식별번호: 157-165로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  19. 제18항에 있어서, 서열식별번호: 509, 및 519-529로부터 선택된 서열을 포함하는 CRISPR 가이드 분자.
  20. 제1항에 있어서, 표적화 영역이 PDCD1 유전자를 표적으로 하고 서열식별번호: 135-155로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  21. 제1항에 있어서, 표적화 영역이 CBLB 유전자를 표적으로 하고 서열식별번호: 167-189로부터 선택된 서열과 혼성화할 수 있는 것인 CRISPR 가이드 분자.
  22. 제21항에 있어서, 서열식별번호: 510의 서열을 포함하는 CRISPR 가이드 분자.
  23. 제1항의 CRISPR 가이드 분자 및 Cas12 단백질을 포함하는, CRISPR 핵산/단백질 조성물.
  24. 제23항에 있어서, Cas12 단백질이 C-말단에, 서열식별번호: 479-490으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 링커- 및 핵 국재화 신호 (NLS)-함유 서열을 포함하는 Cas12a 단백질인 CRISPR 핵산/단백질 조성물.
  25. 제1항의 CRISPR 핵산/단백질 조성물을 포함하는 세포로서, 여기서 세포는 림프구, 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포, T 세포 수용체 (TCR) 세포, TCR-조작된 CAR-T 세포, 종양 침윤 림프구 (TIL), CAR TIL, 수지상 세포 (DC), CAR-DC, 대식세포, CAR-대식세포 (CAR-M), 자연 살해 (NK) 세포, 유도 다능성 줄기 세포 (iPSC), iPSC 세포로부터 분화된 세포, 또는 CAR-NK 세포인 세포.
  26. 하기 단계를 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR)-발현 세포를 생산하는 방법:
    a) 세포 내의 TRAC 서열을 포함하는 제1 표적 핵산을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제1 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역; 및 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 활성화 영역을 갖는 제1 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키며, 여기서 상기 CRISPR 가이드 분자는 활성화 영역, 표적화 영역 또는 이들 둘 다에 리보뉴클레오티드 염기 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하고, 핵단백질 복합체는 제1 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인 단계;
    b) 동일한 세포 내의 B2M 서열을 포함하는 제2 표적 핵산 서열을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제2 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역; 및 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 활성화 영역을 갖는 제2 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키며, 여기서 상기 CRISPR 가이드 분자는 활성화 영역, 표적화 영역 또는 이들 둘 다에 리보뉴클레오티드 염기 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하고, 핵단백질 복합체는 제2 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인 단계;
    c) scFv, 막횡단 도메인, 공동-자극 도메인, 및 활성화 도메인을 포함하는 CAR을 코딩하는 제1 공여자 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 CAR은 제1 표적 핵산 서열 내의 절단 부위에 삽입될 수 있는 것인 단계;
    d) B2M 분비 신호, HLA-G 펩티드 신호 서열, 제1 링커 서열, B2M 서열, 제2 링커 서열, 및 HLA-E 서열을 포함하는 B2M-HLA-E 융합 구축물을 코딩하는 제2 공여자 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 B2M-HLA-E 융합 구축물은 제2 표적 핵산 서열 내의 절단 부위에 삽입될 수 있는 것인 단계;
    e) 제1 표적 핵산 서열을 절단하고 제1 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 절단 부위에 삽입하는 단계; 및
    f) 제2 표적 핵산 서열을 절단하고 제2 공여자 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분을 절단 부위에 삽입하는 단계.
  27. 제26항에 있어서, 제2 공여자 폴리뉴클레오티드가 B2M-HLA-E 융합 구축물의 5'-단부에 P2A 서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항에 있어서, 제1 공여자 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 413을 포함하는 것인 방법.
  29. 제26항에 있어서, 제2 공여자 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 414를 포함하는 것인 방법.
  30. 제26항에 있어서, CAR 내의 scFv가 CD37, CD38, CD47, CD73, CD4, CS1, PD-L1, NGFR, ENPP3, PSCA, CD79B, TACI, VEGFR2, B7-H3, B7-H6, B-세포 성숙 항원 (BCMA), CD123, CD138, CD171/L1CAM, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD70, CD371, CEA, 클라우딘 18.1, 클라우딘 18.2, CSPG4, EFGRvIII, EpCAM, EphA2, 표피 성장 인자 수용체, ErbB, ErbB2 (HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, 글리피칸 3, IL-11Rα, IL-13Rα2, IL13 수용체 알파, 루이스Y/LeY, 메소텔린, MUC1, MUC16, NKG2D 리간드, PD1, PSMA, ROR-1, SLAMF7, TAG72, ULBP 및 MICA/B 단백질, VEGF2 및 WT1로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 표적과 결합할 수 있는 것인 방법.
  31. 제26항에 있어서, scFv가 BCMA와 결합할 수 있고, 서열식별번호: 474의 아미노산 서열을 포함하는 제1 가변 영역, 서열식별번호: 475의 아미노산 서열을 포함하는 제2 가변 영역, 및 서열식별번호: 476의 아미노산 서열을 포함하는 제1 가변 영역과 제2 가변 영역 사이의 링커를 포함하는 것인 방법.
  32. 제26항에 있어서, scFv가 서열식별번호: 477의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  33. 제26항에 있어서, CAR의 막횡단 도메인이 T 세포 수용체 α 쇄, T 세포 수용체 β 쇄, CD3ζ 쇄, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, ICOS, CD154, 또는 GITR로부터 유래되는 것인 방법.
  34. 제26항에 있어서, CAR의 공동-자극 도메인이 CD28, 4-1BB, GITR, ICOS-1, CD27, OX-40 또는 DAP10으로부터 유래되는 것인 방법.
  35. 제26항에 있어서, CAR이 CD8로부터 유래된 막횡단 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, 및 CD3ζ 활성화 도메인을 포함하는 것인 방법.
  36. 제26항에 있어서, CAR 서열을 함유하는 벡터가 서열식별번호: 478의 핵산 서열을 갖는 리더 서열을 포함하는 것인 방법.
  37. 제26항에 있어서, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질이 C-말단에, 서열식별번호: 479-490으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 링커 및 핵 국재화 신호 (NLS)-함유 서열을 포함하는 것인 방법.
  38. 제26항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하며:
    a. 동일한 세포 내의 제3 표적 핵산 서열을, 촉매적으로 활성인 Cas12 단백질 및 제3 표적 핵산 서열과 결합할 수 있는 표적화 영역; 및 Cas12 단백질과 핵단백질 복합체를 형성할 수 있는 활성화 영역을 갖는 제3 CRISPR 가이드 분자를 포함하는 핵단백질 복합체와 접촉시키며, 여기서 상기 CRISPR 가이드 분자는 활성화 영역, 표적화 영역 또는 이들 둘 다에 리보뉴클레오티드 염기 및 적어도 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 염기를 포함하고, 핵단백질 복합체는 제3 표적 핵산 서열을 절단할 수 있는 것인 단계;
    b. 제3 표적 핵산 서열을 절단하고 절단 부위에서 제3 표적 핵산 서열로부터 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시키는 단계,
    여기서 제3 표적 핵산 서열은 PDCD 유전자, CISH 유전자 및 CBLB 유전자로부터 선택되는 것인
    방법.
  39. 제26항에 있어서, CAR-발현 세포가 T-림프구로부터 생산된 동종이계 또는 자가 CAR-T 세포인 방법.
  40. 제26항의 방법에 의해 생산된 CAR-발현 세포로서, 여기서 세포는 림프구, CAR-T 세포, TCR 세포, TCR-조작된 CAR-T 세포, TIL, CAR TIL, 수지상 세포, CAR-DC, 대식세포, CAR-M, iPSC 세포, iPSC 세포로부터 분화된 세포, NK 세포 또는 CAR-NK 세포로부터 선택되는 것인 CAR-발현 세포.
  41. 입양 세포 요법의 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 제40항의 CAR-발현 세포를 투여하는 것을 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 입양 세포 요법이 BCMA-양성 암 세포를 사멸시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, BCMA-양성 암 세포가 다발성 골수종 암 세포를 포함하는 것인 방법.
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