CN112899273A - 用于改变基因序列的组合物及方法 - Google Patents

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CN112899273A CN201911218232.3A CN201911218232A CN112899273A CN 112899273 A CN112899273 A CN 112899273A CN 201911218232 A CN201911218232 A CN 201911218232A CN 112899273 A CN112899273 A CN 112899273A
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Abstract

本发明提供了一种用于改变基因序列的组合物，及改变基因序列的方法，还提供了利用所述方法制得的基因序列改变了的细胞及所述细胞的用途。

Description

用于改变基因序列的组合物及方法
技术领域
本发明属于生物医药领域。具体地涉及一种用于改变基因序列，特别是同时改变TCR与B2M两种基因序列的组合物，还涉及改变基因序列，特别是同时改变TCR与B2M两种基因序列的方法，还提供了基因改变了的，特别是TCR与B2M两种基因改变了的细胞及其用途。
背景技术
近年来，基因组编辑工具广泛应用于生物医学领域，而成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)技术已成为基因组编辑的热点。CRISPR是自然存在于细菌DNA中的序列，与CRISPR相关核酸内切酶(Cas)结合，具有指导RNAs保护细菌基因组免受侵入性噬菌体中检测到的靶向特异性序列攻击的作用。
CRISPR/Cas9是一种RNA介导的DNA内切酶，通过一个与目标序列互补的向导RNA(guide RNA，gRNA)引导定位到基因组的目标序列上，此目标序列必须与一个以NGG或NAG形式的PAM(Protospacer Adjacent Motif)序列相邻。CRISPR/Cas9在与目标序列结合后，在特定基因组区域产生双链断裂，从而激活机体的NHEJ(非同源末端连接，Non-homologousend joining)DNA突变修复机制。在该修复机制下由于没有模板，DNA只是随机修复以恢复其双链结构，这会使修复结果与原基因组序列不同形成突变，导致目标序列的基因在所述细胞中的表达减少或消除。近几年来，已被改造的CRISPR/Cas9系统已经用于真核细胞中的基因组编辑。
目前，已存在基于CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的实例，但仍存在目标基因敲除率低、需要多次转染或转化、操作繁琐、或脱靶率高等问题，尤其对于双基因或多基因的敲除，上述问题更明显。因此，仍需要优化基于CRISPR/Cas9系统的双基因或多基因的敲除方法和更高效率的gRNA组合。
发明内容
本发明提供一种用于改变细胞中基因序列，特别是改变两种基因或多种基因序列，尤其是改变TCR与B2M两种基因序列的组合物，并提供一种改变基因序列，特别是改变两种基因或多种基因序列，尤其是改变TCR与B2M两种基因序列的方法。
本发明第一方面提供了一种改变细胞中基因序列的组合物，所述组合物包含靶向TCR基因的第一gRNA，靶向B2M基因的第二gRNA，以及具有靶向切割活性的核酸内切酶；所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于60％；
所述第一gRNA和第二gRNA包含crRNA和tracrRNA，所述crRNA包含引导序列，其中所述第一gRNA的引导序列选自
a.SEQ ID NO:1，
b.SEQ ID NO:2，
c.SEQ ID NO:3，
d.SEQ ID NO:4，
e.SEQ ID NO:5，
f.SEQ ID NO:6，
g.SEQ ID NO:7，
h.SEQ ID NO:8，
i.a-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导序列选自
j.SEQ ID NO:9，
k.SEQ ID NO:10，
l.SEQ ID NO:11，
m.j-l中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
优选地，
所述第一gRNA的引导序列选自
a.SEQ ID NO:1，
b.SEQ ID NO:2，
或a-b中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导序列选自
j.SEQ ID NO:9，
k.SEQ ID NO:10，
或j-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
优选地，所述核酸内切酶为Cas9蛋白。
进一步地，所述第一gRNA的引导序列为
SEQ ID NO:1，或
SEQ ID NO:1，其中在SEQ ID NO:1的5’端或3’端任选地添加1～4个碱基，
所述第二gRNA的引导序列为
SEQ ID NO:9，或
SEQ ID NO:9，其中在SEQ ID NO:9的5’端或3’端任选地添加1～4个碱基，
所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于75％。
进一步地，所述组合物中核酸内切酶的总量包含两部分，第一部分核酸内切酶用于与第一gRNA形成第一RNP复合物，其中所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值为0.5；第二部分核酸内切酶用于与第二gRNA形成第二RNP复合物，其中所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值为0.5。
更进一步地，所述组合物中核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值不大于1.25，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.9～1.1之间；优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1.25之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；更进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值为0.5，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值为1。
进一步地，所述细胞是哺乳动物细胞细胞；优选是灵长类动物细胞，更优选是人细胞。
进一步地，所述细胞是免疫效应细胞，优选地，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞，优选是T细胞，例如，CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、或其组合。
进一步地，本发明提供了一种用于改变细胞中基因序列的试剂盒，其中所述试剂盒包含上述任一项中所述的组合物中的一种或多种。
本发明第二方面提供了一种改变细胞中基因序列的方法，所述方法包括如下步骤：
1)使用靶向所述细胞中TCR基因的第一gRNA、靶向所述细胞中B2M基因的第二gRNA分别或同时与具有靶向切割活性的核酸内切酶接触，形成第一、第二RNP复合物；其中所述第一gRNA和第二gRNA包含crRNA和tracrRNA，所述crRNA包含引导序列，其中第一gRNA的引导序列选自
a.SEQ ID NO:1，
b.SEQ ID NO:2，
c.SEQ ID NO:3，
d.SEQ ID NO:4，
e.SEQ ID NO:5，
f.SEQ ID NO:6，
g.SEQ ID NO:7，
h.SEQ ID NO:8，
i.a-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导序列选自
j.SEQ ID NO:9，
k.SEQ ID NO:10，
l.SEQ ID NO:11，
m.j-l中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基。
2)用步骤1)中所得第一、第二RNP复合物转化所述细胞，其中所述第一gRNA和第二gRNA将具有靶向切割活性的核酸内切酶分别引导至TCR与B2M基因序列，进行TCR和B2M双基因敲除，得到TCR和B2M基因序列改变的细胞，
其中，同时敲除两种基因的效率大于60％；
优选地，
所述第一gRNA的引导序列选自
a.SEQ ID NO:1，
b.SEQ ID NO:2，
或a-b中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导序列选自
i.SEQ ID NO:9，
k.SEQ ID NO:10，
或j-k中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
优选地，所述核酸内切酶为Cas9蛋白。
进一步地，所述核酸内切酶的摩尔总量包含两部分，第一部分核酸内切酶用于与第一gRNA形成第一RNP复合物，其中所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值为0.5；第二部分核酸内切酶用于与第二gRNA形成第二RNP复合物，其中所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值为0.5。
更进一步地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值不大于1.25，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.9～1.1之间；优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1.25，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；更进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值为0.5，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值为1。
进一步地，所述细胞是免疫效应细胞；优选地，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。
本发明第三方面提供了基因改变了的细胞，所述细胞由本发明第二方面所述的方法获得。
本发明第四方面提供了一种治疗患有免疫性疾病的患者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明第三方面所述的细胞。
优选地，所述免疫性疾病为移植物抗宿主反应或宿主对移植物的排斥反应。
术语
T细胞受体(T cell receptor，TCR)，本文中所述的TCR是呈递在主要组织相容性复合体(MHC)上的特异性抗原肽的异源二聚体蛋白受体。本发明的T细胞受体包括完整的T细胞受体分子以及T细胞受体的功能性片段或组成部分，所述功能性片段或组成部分具有与T细胞受体相近的功能。
本文中所述的B2M，也称为β-2微球蛋白，是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白。B2M是MHC I类分子的轻链，并因此是主要组织相容性复合体的不可缺少的部分。在敲除T细胞基因B2M时，HLA1(人类的MHC编码的分子表达于白细胞上，称为人类白细胞抗原HLA)类分子基因的功能受损，因此，HLA1基因功能的改变可以通过编辑B2M来实现。本发明的B2M包括完整的B2M分子以及B2M的功能性片段或组成部分，所述功能性片段或组成部分具有与B2M相近的功能。
本文所述“改变细胞中基因序列”或“基因序列发生改变”等表述中的“改变”包含细胞中目标序列基因或其附近产生插入、缺失或置换等突变，所述改变导致基因的表达减少或消除。
本文中所述的CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR-associated endonumclease 9)，是一种人工核酸内切酶基因编辑系统，是现有技术常用的一种基因敲除手段。CRISPR/Cas9基因编辑系统由两部分构成：1)向导RNA，以下也称为gRNA，和2)核酸内切酶-Cas9；本文所述gRNA，包括crRNA(CRISPR-derived RNA)和tracrRNA(trans-activating RNA)。所述crRNA和tracrRNA以以下所述方式中的一种起作用：1)tracrRNA/crRNA二聚体，crRNA的部分序列与tracrRNA的部分序列互补、并形成二聚体，本领域技术人员可以理解的是，crRNA的一部分碱基序列是与目标DNA序列互补的引导序列，另一部分碱基序列与tracrRNA的一部分序列通过碱基配对结合在一起，形成嵌合RNA(即tracrRNA/crRNA二聚体)；2)crRNA与tracrRNA融合成为一条嵌合型单链向导RNA(single guide RNA，sgRNA)，crRNA位于tracrRNA的5’端，其中所述crRNA包括引导序列。gRNA的tracrRNA序列可以是本领域技术人员知晓的常规tracrRNA序列，即本领域技术人员知晓何种tracrRNA序列能够用于实现本发明，如本领域技术人员知晓SEQ ID NO:12可以作为tracrRNA；进一步地，本领域技术人员知晓与常规使用的tracrRNA序列，如SEQ ID NO:12，具有50％～99％，优选60％～99％，更优选70％～99％，还优选80％～99％，甚至优选90％～99％的同一性的突变体也可以用于实现本发明。本领域技术人员可以理解的是，gRNA包含引导序列和骨架序列，gRNA的形式可以是由crRNA和tracrRNA组成的二聚体，也可以是人工改造的由crRNA和tracrRNA融合而成的嵌合型单链gRNA，所以骨架序列可以是由crRNA和tracrRNA组成的二聚体，也可以人工改造的由crRNA和tracrRNA融合而成的嵌合型单链gRNA，且骨架序列为本领域技术人员所知晓的；Cas9核酸内切酶用于切割DNA的活性结构域，使得DNA断裂。
本文中所述的核糖核酸蛋白(ribonucleoprotein，RNP复合物)，是指包含有RNA的核蛋白，即将核酸和蛋白质结合在一起的形式。在优选的CRISPR/Cas9系统中，gRNA与Cas9结合形成Cas9-gRNA复合物，所述复合物与PAM毗邻的目标DNA结合后，Cas9发生构象改变，激发内切酶活性，引起DNA单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，细胞将通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)等方式修复而改变目标序列。
本文所述的“具有靶向切割活性的核酸内切酶”是指能够实现特异性识别特定片段并在该特定片段的一定位置进行切割或裂解的核酸内切酶。所述具有靶向切割活性的核酸内切酶可以选自Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4或Cpf1；其同系物，其天然存在的分子、其密码子优化形式或其修饰形式的重组以及其组合。
本文所述“基因的敲除”和“敲除基因”等表述中的“敲除”包括目的基因通过NHEJ或HDR方式插入、缺失或置换突变，从而消除目的基因的表达。基于本文所述的细节，本领域技术人员将容易地理解如何使用本发明的CRISPR/Cas9系统来敲除目的基因。
本发明相比于现有技术：
(1)本发明提供的组合物，靶向TCR和B2M两种基因的特异性强，敲除所述基因表达的效率高。根据本发明的方法，同时敲除TCR和B2M两种基因的效率超过60％。再经磁珠分选，获得的效率达99.00％。
(2)本发明采用将靶向TCR的第一gRNA、靶向B2M的第二gRNA分别或同时与Cas9接触，形成RNP复合物，所述第一gRNA和第二gRNA将Cas9蛋白分别引导至TCR与B2M基因序列，实现基因敲除，敲除效率显著提高。
(3)当核酸内切酶的摩尔总量与第一、第二gRNA摩尔量之和的比值不大于1.25，且第一gRNA和第二gRNA的摩尔比值为0.9～1.1时能够保证高敲除效率。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1：外周血分离T细胞
(1)招募健康志愿者，无感冒发烧症状，签署知情同意书，由专业医务人员用采血针(BD)于静脉取血15ml，将所得外周血加入到EDTA抗凝管(BD)中，加入等体积的PBS(胎牛血清PBS，Gibco)稀释。
(2)在EDTA抗凝管(BD)中加入7.5ml淋巴分离液(MPbio)，将步骤1)中稀释的外周血置于淋巴分离液之上，400x g，离心30min。吸出上层血清，弃去，用移液枪吸取剩余在抗凝管内的单核细胞，移入50ml离心管，加入等体积的PBS(胎牛血清PBS，Gibco)稀释，吹打混匀，200xg离心5min，倒掉上清。
(3)用磁珠分选试剂EasySepTM Human T Cell Isolation Kit(STEMCELL)去除非T细胞，分选出总CD3+T细胞。按照说明书操作，具体操作如下：首先取步骤(2)制备所得的细胞悬液(5x107cells/ml，0.25-2ml)，将细胞悬液加入到试管中；向其中加入分选试剂(50ul/ml样品)，混合并孵育5分钟；将磁珠加入到细胞悬液中(40ul/ml样品)，混合；加入培养基，将样品加到2.5ml，轻轻上下吸2-3次，将试管放到磁极中孵育3分钟；最后倒出T细胞。
(4)将T细胞按照浓度1x106/ml培养在12-孔板(Costar)上，培养基为RPMI-1640(Thermo)+10％FBS(Gibco)或者无血清培养基TexMACX medium(美天旎)，在培养T细胞时，加入刺激剂anti-CD3/CD28(Thermo)，同时加入IL-2(四环生物)，培养2-3天，备用。
实施例2：gRNA的设计与合成
(1)第一和第二gRNA的设计
基于TCR和B2M的核苷酸序列，设计适当的靶向TCR基因的第一gRNA和靶向B2M基因的第二gRNA，本发明实施例中使用的gRNA是由crRNA与tracrRNA两部分融合形成的单链gRNA，其中第一gRNA的引导序列任意选自SEQ ID NO:1-8，第二gRNA的引导序列任意选自SEQ ID NO:9-11，第一和第二gRNA的骨架序列为SEQ ID NO:13。所设计的第一、第二gRNA同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于60％，显著高于目前文献报道的同时敲除两种基因的效率。
第一gRNA的引导序列如表1所示：
表1.第一gRNA的引导序列
SEQ ID NO 第一gRNA的引导序列
1 UCUCUCAGCUGGUACACGGC
2 CUCUCAGCUGGUACACGGCA
3 GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU
4 UGGAUUUAGAGUCUCUCAGC
5 UGUGCUAGACAUGAGGUCUA
6 ACAAAACUGUGCUAGACAUG
7 AGAGUCUCUCAGCUGGUACA
8 UAGGCAGACAGACUUGUCAC
第二gRNA的引导序列如表2所示:
表2.第二gRNA的引导序列
SEQ ID NO 第二gRNA的引导序列
9 GAGUAGCGCGAGCACAGCUA
10 AAGUCAACUUCAAUGUCGGA
11 CGCGAGCACAGCUAAGGCCA
第一和第二gRNA的骨架序列(SEQ ID NO:13):
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
(2)相关的引物设计与合成委托Thermo公司完成，在gRNA的序列已经设计完成的情况下，本领域技术人员知晓如何根据gRNA序列设计合成用于获得gRNA的引物的方法。
(3)体外转录
将设计好的gRNA引物在体外经GeneArtTM Precision gRNA Synthesis Kit(Thermo)试剂盒转录成相应的gRNA，具体操作步骤如下：先通过PCR方法组装gRNA的DNA转录模板，再通过体外转录获得gRNA，最后纯化通过体外转录获得的gRNA。所得gRNA经琼脂糖凝胶电泳检测，均达到要求，用无核酸酶的水溶解，零下80℃保存。
实施例3：T细胞的基因编辑
(1)取实施例1获得的T细胞1-2x105个，用PBS(Thermo)洗涤两次，用30ul电转buffer(Lonza)重悬。
(2)吸取20ug(120pmol)Cas9蛋白(Thermo)加入无RNA酶的200ul EP管，分别取120pmol的第一gRNA和120pmol的第二gRNA混合，再与Cas9蛋白混匀，室温放置15min，形成相应的Cas9-gRNA核糖核酸蛋白质复合物(RNP)。
(3)用30ul电转buffer(Lonza)混匀RNP复合物。
(4)用Lonza 4D电转仪(Lonza)，按照程序EO-115电转T细胞。
(5)将步骤(4)获得的T细胞在24-48h之后，同时用anti-CD3(Thermo)，anti-HLA1(BD)，anti-B2M(BD)抗体孵育电转后的T细胞，通过流式细胞仪检测敲除的效率，如表3所示：
表3敲除效率
Figure BDA0002300079860000111
用试剂盒EasySepTM Human PE Positive Selection Kit(STEMCELL)磁珠分选TCR-B2M-双阴型的T细胞(双敲除)，具体操作如下：在规定的细胞浓度范围(1x108 cells/ml，0.1-2.5ml)内制备样品；将样品添加到所需的试管中；加入FcR阻断剂(100ul/ml样品)到样品中混合；将PE-偶联抗体(0.3-3ug/ml样品)加入样品中混合孵育；将分选试剂(100ul/ml样品)加入样品中，混合并孵育；向样品中加入磁珠(50ul/ml样品)，搅拌并孵育；将培养基添加到样品中至指定体积(2.5ml)；轻轻上下吸2-3次，混合均匀，放入磁铁中孵育；拿出磁铁，倒出上清液；从磁铁上取下试管，试管中含有被分离的细胞；重复上述步骤。经过磁珠分选后双敲除的效率见表4。
表4磁珠分选后双敲除效率
Figure BDA0002300079860000121
实施例4：核酸内切酶Cas9的摩尔总量与第一、第二gRNA摩尔量之和的不同比值对双敲除效率的影响
第一gRNA的引导序列为SEQ ID NO:1，第二gRNA的引导序列为SEQ ID NO:9，第一gRNA与第二gRNA的摩尔量相同，与实施例3的区别在于，改变核酸内切酶Cas9的摩尔总量与第一、第二gRNA摩尔量之和的比例，实验证明，核酸内切酶Cas9的摩尔总量与第一、第二gRNA摩尔量之和的比值不大于1.25时能保证基因编辑效率高，详见表5：
表5：Cas9的摩尔总量与第一、第二gRNA摩尔量之和的不同比对双敲除效率的影响
Figure BDA0002300079860000122
本发明已经通过上述实施例进行了说明，但应当理解的是，上述实施例只是用于举例和说明的目的，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明并不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。
序列表
<110> 甘李药业股份有限公司
<120> 用于改变基因序列的组合物及方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ucucucagcu gguacacggc 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cucucagcug guacacggca 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagaaucaaa aucggugaau 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uggauuuaga gucucucagc 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ugugcuagac augaggucua 20
<210> 6
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaaaacugu gcuagacaug 20
<210> 7
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agagucucuc agcugguaca 20
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
uaggcagaca gacuugucac 20
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaguagcgcg agcacagcua 20
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aagucaacuu caaugucgga 20
<210> 11
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcgagcaca gcuaaggcca 20
<210> 12
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agcauagcaa guuaaaauaa ggcuaguccg uuaucaacuu gaaaaagugg caccgagucg 60
gugcuuu 67
<210> 13
<211> 80
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80

Claims (14)

1.一种用于改变细胞中基因序列的组合物，包含靶向TCR基因的第一gRNA，靶向B2M基因的第二gRNA，以及具有靶向切割活性的核酸内切酶；所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于60％；所述第一gRNA和第二gRNA包含crRNA和tracrRNA，crRNA包含引导序列，其中所述第一gRNA的引导序列选自
a.SEQ ID NO:1，
b.SEQ ID NO:2，
c.SEQ ID NO:3，
d.SEQ ID NO:4，
e.SEQ ID NO:5，
f.SEQ ID NO:6，
g.SEQ ID NO:7，
h.SEQ ID NO:8，
i.a-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导序列选自
j.SEQ ID NO:9，
k.SEQ ID NO:10，
l.SEQ ID NO:11，
m.j-l中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
优选地，
所述第一gRNA的引导序列选自
a.SEQ ID NO:1，
b.SEQ ID NO:2，
或a-b中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导选自序列
j.SEQ ID NO:9，
k.SEQ ID NO:10，
或j-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
优选地，所述核酸内切酶为Cas9蛋白。
2.如权利要求1所述的组合物，其中
所述第一gRNA的引导序列为
SEQ ID NO:1，或
SEQ ID NO:1，其中在SEQ ID NO:1的5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导序列为
SEQ ID NO:9，或
SEQ ID NO:9，其中在SEQ ID NO:9的5’端或3’端任选地添加1～4个碱基，
所述组合物同时敲除TCR和B2M两种基因的效率大于75％。
3.如权利要求1所述的组合物，所述组合物中核酸内切酶的总量包含两部分，第一部分核酸内切酶用于与第一gRNA形成第一RNP复合物，其中所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值为0.5；第二部分核酸内切酶用于与第二gRNA形成第二RNP复合物，其中所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值为0.5。
4.如权利要求3所述的组合物，所述组合物中核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值不大于1.25，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.9～1.1之间；优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1.25之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；更进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值为0.5，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值为1。
5.如权利要求1所述的组合物，所述细胞是哺乳动物细胞，优选是灵长类动物细胞，更优选是人细胞。
6.如权利要求1所述的组合物，所述细胞是免疫效应细胞，优选地，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。
7.一种用于改变细胞中基因序列的试剂盒，其中所述试剂盒包含选自权利要求1～6任一项中所述的组合物中的一种或多种。
8.一种用于改变细胞中基因序列的方法，所述方法包括如下步骤：
1)使用靶向细胞中TCR基因的第一gRNA、靶向所述细胞中B2M基因的第二gRNA分别或同时与具有靶向切割活性的核酸内切酶接触，形成第一、第二RNP复合物；所述第一gRNA和第二gRNA包含crRNA和tracrRNA，所述crRNA包含引导序列，其中所述第一gRNA的引导序列选自
a.SEQ ID NO:1，
b.SEQ ID NO:2，
c.SEQ ID NO:3，
d.SEQ ID NO:4，
e.SEQ ID NO:5，
f.SEQ ID NO:6，
g.SEQ ID NO:7，
h.SEQ ID NO:8，
i.a-h中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导序列选自
j.SEQ ID NO:9，
k.SEQ ID NO:10，
l.SEQ ID NO:11，
m.j-l中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
2)用1)中所得第一、第二RNP复合物转化所述细胞，其中所述第一gRNA和第二gRNA将具有靶向切割活性的核酸内切酶分别引导至TCR与B2M基因序列，进行TCR和B2M双基因敲除，得到TCR和B2M基因序列改变的细胞，
其中，同时敲除两种基因的效率大于60％；
优选地，
所述第一gRNA的引导序列选自
a.SEQ ID NO:1，
b.SEQ ID NO:2，
或a-b中的任一项，在其5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
所述第二gRNA的引导序列选自
j.SEQ ID NO:9
k.SEQ ID NO:10，
或j-k中的任一项，在其中5’端或3’端任选地添加1～4个碱基；
优选地，所述核酸内切酶为Cas9蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，所述核酸内切酶的摩尔总量包含两部分，第一部分核酸内切酶用于与第一gRNA形成第一RNP复合物，其中所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第一部分核酸内切酶与所述第一gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第一部分核酸内切酶与第一gRNA的摩尔比值为0.5；第二部分核酸内切酶用于与第二gRNA形成第二RNP复合物，其中所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值不大于1.25，优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值在0.25～1之间，进一步优选地，所述第二部分核酸内切酶与所述第二gRNA的摩尔比值为0.5。
10.如权利要求9所述的方法，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值不大于1.25，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.9～1.1之间；优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1.25之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值在0.25～1之间，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值在0.95～1.05之间；更进一步优选地，所述核酸内切酶的摩尔总量与所述第一、第二gRNA摩尔量之和的比值为0.5，且所述第一gRNA与所述第二gRNA的摩尔比值为1。
11.如权利要求8所述的方法，所述细胞是免疫效应细胞；优选地，所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。
12.权利要求8-11任一项所述的方法制得的基因序列发生改变的细胞。
13.一种治疗患有免疫性疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如权利要求12所述的细胞。
14.如权利要求13所述的方法，所述免疫性疾病为移植物抗宿主反应或宿主对移植物的排斥反应。
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