CN110959014A - 抗人ccr1单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供与人CC趋化因子受体1(CCR1)结合而抑制人CCR1的活化的单克隆抗体或该抗体片段。本发明涉及与人CCR1的胞外区结合而抑制由人CC趋化因子配体15(CCL15)引起的人CCR1的活化的单克隆抗体或该抗体片段、产生该抗体的杂交瘤、具有编码该抗体或该抗体片段的碱基序列的核酸、含有包含该核酸的载体的转化细胞、使用该杂交瘤或该转化细胞的该抗体或该抗体片段的制造方法、包含该抗体或该抗体片段的治疗剂和诊断剂、以及使用该抗体或该抗体片段的CCR1相关疾病的治疗方法和诊断方法。

Description

抗人CCR1单克隆抗体
技术领域
本发明涉及与人CC趋化因子受体1(CC chemokine receptor 1、以下记为人CCR1)的胞外区结合而抑制由人CC趋化因子配体(以下记为人CCL)15引起的人CCR1的活化的单克隆抗体或该抗体片段、产生该抗体的杂交瘤、具有编码该抗体或该抗体片段的碱基序列的核酸、含有包含该核酸的载体的转化细胞、使用该杂交瘤或该转化细胞的该抗体或该抗体片段的制造方法、包含该抗体或该抗体片段的治疗剂和诊断剂、以及使用该抗体或该抗体片段的CCR1相关疾病的治疗方法和诊断方法。
背景技术
CCR1有分化群(cluster of differentiation、CD)191、CKR-1、HM145、巨噬细胞炎性蛋白1α受体(Macrophage inflammatory protein 1α receptor、MIP1α R)、CMKBR1或SCYAR1等别名。
编码人CCR1的基因在1993年被鉴定(非专利文献1)。人CCR1的cDNA序列(序列号1)和氨基酸序列(序列号2)已被公开，例如在美国国家生物技术信息中心(NCBI)中，cDNA序列可以参考NM_001295、蛋白质的氨基酸序列可以参考NP_001286。小鼠CCR1的cDNA序列(序列号3)和氨基酸序列(序列号4)也已被公开，在NCBI中，cDNA序列可以参考NM_009912、蛋白质的氨基酸序列可以参考NP_034042。
CCR1是具有七次跨膜型结构的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor；以下简记为GPCR)，是全长由355个氨基酸构成的膜蛋白。作为人CCR1的配体，报道了人CCL3、CCL5、CCL8、CCL14、CCL15、CCL16和CCL23(非专利文献2)。另外，作为小鼠CCR1的配体，报道了小鼠CCL3、CCL5、CCL7和CCL9(非专利文献3)。
人CCL15是C-C趋化因子家族中包含的配体，全长由92个氨基酸构成。已知CCR1和CCR3作为CCL15的受体发挥功能。已知CCL15的N末端在蛋白水解酶的作用下被分解，成为约68个氨基酸的活化型，由此发挥出更强的活性(非专利文献4)。
认为包括CCR1在内的趋化因子受体的活化是经过下述两个步骤而发生的(非专利文献5)。作为步骤1，发生趋化因子(配体)与受体的N末端胞外区的相互作用。作为步骤2，趋化因子的N末端区与受体的细胞外环区域相互作用，产生受体的结构变化，结果信号被转导至细胞内。
在GPCR的细胞内信号转导中，与因配体的结合而产生的GPCR的结构变化相应地，在GPCR的C末端缔合的G蛋白α、β、γ三聚体被活化，α亚基从βγ复合物解离。α亚基进一步作用于下游的因子，活化信号转导通路。当α亚基的活化使磷脂酶C(phospholipase C、以下称为PLC)活化时，磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸[phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate、PIP2]被分解，产生三磷酸肌醇(Inositol triphosphate、IP3)和二酰甘油(diacylglycerol、DAG)。
IP3作用于内质网，向细胞内释放钙离子(Ca2+)，引起由钙调蛋白介导的各种细胞反应。这种细胞内钙浓度的上升可以使用荧光钙指示剂等进行测定，可以作为GPCR的活化的指标。对于CCR1，也可以利用该方法测定细胞内信号的活化。
迄今为止，已报道了中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、NK细胞、T细胞或B细胞等各种血细胞中的人CCR1的表达(非专利文献6～10)。此外，近年来报道了：存在于癌微环境中、促进癌的发展的被称为未成熟髓样细胞(immature myeloid cell、以下称为iMC)、骨髓来源抑制性细胞(myeloid derivedsuppressor cell、以下称为MDSC)的细胞群表达CCR1(非专利文献11和12)。
CCR1被暗示与类风湿关节炎、多发性硬化症、慢性阻塞性肺病等各种自身免疫性疾病、炎性疾病相关(非专利文献13)。另外，由于CCR1在上述iMC和MDSC中表达，因此暗示其助长癌的发展和恶化过程(非专利文献11和12)。
例如，已知在人大肠癌中，以一定的频率观察到癌抑制基因SMAD4的突变或SMAD4蛋白的消失，SMAD4的缺损被认为是预后不良因子。近年来，明确了：SMAD4的缺损通过CCL15的表达上升而成为在肿瘤环境中引入CCR1阳性的iMC或MDSC等的主要原因；以及这些细胞通过基质金属蛋白酶(matrix metalloprotease、MMP)的分泌和免疫抑制作用辅助癌的浸润或转移而使患者的预后变差的机制(非专利文献11和12)。
作为现有的低分子CCR1抑制剂，可以列举CP481,715(Pfizer公司)、MLN3897(Millennium公司)、BX-471(Berlex公司)、CCX-354(Chemocentryx公司)等。针对这些低分子抑制剂，对类风湿关节炎、多发性硬化症、慢性阻塞性肺病等自身免疫性或炎性疾病的患者进行了临床试验，但均未能显示出有效性(非专利文献14)。
在现有的抗CCR1抗体中，作为在文献等中报道了CCR1活化的抑制效果的抗CCR1抗体，可以列举141-2(MBL公司、#D063-3)(非专利文献15)、53504(R&D Systems公司、#MAB145)(非专利文献16)和2D4(Millennium公司)(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第6756035号说明书
非专利文献
非专利文献1：Neote,Kuldeep,et al.“Molecular cloning,functionalexpression,and signaling characteristics of a CC chemokine receptor.”Cell72.3(1993):415-425.
非专利文献2：Mannhold,Raimund,Hugo Kubinyi,and Gerd Folkers.Chemokinereceptors as drug targets.Eds.Martine J.Smit,Sergio A.Lira,and RobLeurs.Vol.46.John Wiley&Sons,2010.
非专利文献3：Ono,Santa Jeremy,et al.“Chemokines:roles in leukocytedevelopment,trafficking,and effector function.”Journal of allergy andclinical immunology 111.6(2003):1185-1199.
非专利文献4：Berahovich,Robert D.,et al.“Proteolytic activation ofalternative CCR1 ligands in inflammation.”The Journal of Immunology174.11(2005):7341-7351.
非专利文献5：Ludeman,Justin P.,and Martin J.Stone.“The structural roleof receptor tyrosine sulfation in chemokine recognition.”British journal ofpharmacology 171.5(2014):1167-1179.
非专利文献6：Su,S.B.,et al.“Preparation of specific polyclonalantibodies to a CC chemokine receptor,CCR1,and determination of CCR1expression on various types of leukocytes.”Journal of leukocyte biology60.5(1996):658-666.
非专利文献7：Weber,Christian,et al.“Specialized roles of the chemokinereceptors CCR1 and CCR5 in the recruitment of monocytes and TH1-like/CD45RO+Tcells.”Blood 97.4(2001):1144-1146.
非专利文献8：Phillips,Rhian M.,et al.“Variations in eosinophilchemokine responses:an investigation of CCR1 and CCR3 function,expression inatopy,and identification of a functional CCR1 promoter.”The Journal ofImmunology 170.12(2003):6190-6201.
非专利文献9：Cheng,Sara S.,et al.“Granulocyte-macrophage colonystimulating factor up-regulates CCR1 in human neutrophils.”The Journal ofImmunology 166.2(2001):1178-1184.
非专利文献10：Corcione,Anna,et al.“Chemotaxis of human tonsil Blymphocytes to CC chemokine receptor(CCR)1,CCR2 and CCR4ligands is restrictedto non-germinal center cells.”International immunology 14.8(2002):883-892.
非专利文献11：Kitamura,Takanori,et al.“SMAD4-deficient intestinaltumors recruit CCR1+ myeloid cells that promote invasion.”Nature genetics39.4(2007):467-475.
非专利文献12：Inamoto,Susumu,et al.“Loss of SMAD4 Promotes ColorectalCancer Progression by Accumulation of Myeloid-Derived Suppressor Cellsthrough CCL15-CCR1 Chemokine Axis.”Clinical Cancer Research(2015):clincanres-0726.
非专利文献13：D’Ambrosio,Daniele,Paola Panina-Bordignon,and FrancescoSinigaglia.“Chemokine receptors in inflammation:an overview.”Journal ofimmunological methods 273.1(2003):3-13.
非专利文献14：Schall,Thomas J.,and Amanda EI Proudfoot."Overcominghurdles in developing successful drugs targeting chemokine receptors."NatureReviews Immunology 11.5(2011):355-363.
非专利文献15：Lebre,Maria C.,et al.“Why CCR2 and CCR5 blockade failedand why CCR1 blockade might still be effective in the treatment of rheumatoidarthritis.”PLoS One 6.7(2011):e21772.
非专利文献16：Oba,Yasuo,et al.“MIP-1α utilizes both CCR1 and CCR5 toinduce osteoclast formation and increase adhesion of myeloma cells to marrowstromal cells.”Experimental hematology 33.3(2005):272-278.
发明内容
发明所要解决的问题
上述非专利文献15、非专利文献16和专利文献1等中记载的现有的抗CCR1抗体中没有作为药品而开发的抗CCR1抗体，作为抗体药品的性能的相关信息不充分。因此，本发明的目的在于提供与人CCR1结合而抑制人CCR1的活化的单克隆抗体或该抗体片段、产生该抗体的杂交瘤、具有编码该抗体或该抗体片段的碱基序列的核酸、含有包含该核酸的载体的转化细胞、使用该杂交瘤或该转化细胞的该抗体或该抗体片段的制造方法、包含该抗体或该抗体片段的治疗剂和诊断剂、以及使用该抗体或该抗体片段的CCR1相关疾病的治疗方法和诊断方法。
用于解决问题的方法
作为用于解决上述技术问题的方法，本发明提供与人CCR1的胞外区结合而抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化的人CCR1单克隆抗体。
即，本发明涉及下述(1)～(27)。
(1)一种单克隆抗体或该抗体片段，所述单克隆抗体或该抗体片段与人CCR1的胞外区结合，抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化。
(2)如(1)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，所述单克隆抗体或该抗体片段抑制由人CCL15诱导的人CCR1表达细胞的迁移。
(3)如(1)或(2)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，所述单克隆抗体或该抗体片段与人CCR1的细胞外环2区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基结合。
(4)如(1)～(3)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(n)中的任意一种抗体：
(a)重链可变区(heavy chain variable region；以下简记为VH)的互补决定区(complementarity determining region；以下简记为CDR)1～3分别包含序列号69、70和71中记载的氨基酸序列、并且轻链可变区(light chain variable region；以下简记为VL)的CDR1～3分别包含序列号72、73和74中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH的CDR1～3分别包含序列号75、76和77中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号78、79和80中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH的CDR1～3分别包含序列号81、82和83中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号84、85和86中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH的CDR1～3分别包含序列号87、88和89中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号90、91和92中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH的CDR1～3分别包含序列号93、94和95中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号96、97和98中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH的CDR1～3分别包含序列号99、100和101中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号102、103和104中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH的CDR1～3分别包含序列号105、106和107中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号108、109和110中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH的CDR1～3分别包含序列号111、112和113中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号114、115和116中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH的CDR1～3分别包含序列号117、118和119中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号120、121和122中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH的CDR1包含序列号75中记载的氨基酸序列、VH的CDR2包含序列号76中记载的氨基酸序列或者导入了选自将序列号76中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Thr、将第9位的Val置换为Ala、将第14位的Phe置换为Ala、以及将第15位的Ile置换为Ala的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、VH的CDR3包含序列号77中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号77中记载的氨基酸序列中的第5位的Tyr置换为Ala、以及将第7位的Thr置换为Ala的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、并且VL的CDR1包含序列号126中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号126中记载的氨基酸序列中的第15位的Phe置换为Ala的改造的氨基酸序列、VL的CDR2包含序列号127中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号127中记载的氨基酸序列中的第2位的Val置换为Ile、以及将第5位的Arg置换为Lys的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、VL的CDR3包含序列号128中记载的氨基酸序列的抗体；
(k)VH的CDR1～3分别包含序列号75、131和77中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号126、134和128中记载的氨基酸序列的抗体；
(l)与所述(a)～(k)中记载的至少一种抗体竞争性地与人CCR1结合的抗体；
(m)与包含所述(a)～(k)中记载的任意一种抗体所结合的表位的表位结合的抗体；
(n)与和所述(a)～(k)中记载的任意一种抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体。
(5)如(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(j)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号51中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号52中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号53中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号54中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号55中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号56中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH包含序列号57中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号58中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH包含序列号59中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号60中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH包含序列号61中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号62中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH包含序列号63中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号64中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH包含序列号65中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号66中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH包含序列号67中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号68中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH包含序列号130中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号133中记载的氨基酸序列的抗体。
(6)如(1)～(4)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(c)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号136中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号136中记载的氨基酸序列中的第6位的Glu置换为Gln、将第20位的Leu置换为Ile、将第27位的Gly置换为Phe、将第29位的Val置换为Leu、将第30位的Ser置换为Asn、将第37位的Ile置换为Val、将第48位的Ile置换为Leu、将第67位的Val置换为Leu、将第71位的Val置换为Lys、将第73位的Thr置换为Asp、将第76位的Asn置换为Ser、将第78位的Phe置换为Val、将第80位的Leu置换为Phe、将第82位的Leu置换为Met、将第85位的Val置换为Leu、将第92位的Val置换为Ile、以及将第97位的Arg置换为Lys的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号135中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号135中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Val、将第15位的Pro置换为Leu、将第50位的Gln置换为Lys、将第92位的Tyr置换为Phe、以及将第109位的Val置换为Leu的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号146中记载的氨基酸序列中的第4位的Leu置换为Val、将第44位的Gly置换为Arg、将第49位的Ser置换为Ala、将第92位的Ala置换为Gly、将第93位的Val置换为Met、将第97位的Ala置换为Thr、以及将第98位的Lys置换为Arg的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号145中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Val、将第15位的Ser置换为Leu、将第19位的Ala置换为Val、将第43位的Gln置换为Lys、将第50位的Gln置换为Lys、以及将第109位的Val置换为Leu的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号163中记载的氨基酸序列中的第42位的Asp置换为Glu、将第87位的Lys置换为Arg、以及将第97位的Ala置换为Thr的氨基酸改造中的任意一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号162中记载的氨基酸序列中的第38位的Gln置换为His、以及将第43位的Ala置换为Gly的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体。
(7)如(1)～(4)和(6)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(h)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号135中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号137中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号138中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号139中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号140中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号141中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号142中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH包含序列号143中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号142中记载的氨基酸序列的抗体。
(8)如(1)～(4)和(6)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(w)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号147中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号148中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号149中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号150中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号152中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号153中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号147中记载的氨基酸序列的抗体；
(k)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号148中记载的氨基酸序列的抗体；
(l)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号149中记载的氨基酸序列的抗体；
(m)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号150中记载的氨基酸序列的抗体；
(n)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(o)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号152中记载的氨基酸序列的抗体；
(p)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号153中记载的氨基酸序列的抗体；
(q)VH包含序列号154中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(r)VH包含序列号155中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(s)VH包含序列号156中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(t)VH包含序列号157中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(u)VH包含序列号158中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(v)VH包含序列号159中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(w)VH包含序列号160中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(9)如(1)～(4)和(6)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(f)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号165中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH包含序列号165中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH包含序列号166中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH包含序列号166中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体。
(10)如(1)～(9)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为基因重组抗体。
(11)如(10)所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，基因重组抗体为选自人型嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的任意一种基因重组抗体。
(12)如(1)～(11)中任一项所述的抗体片段，其中，抗体片段为选自Fab、Fab’、(Fab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双链抗体)、二硫键稳定性V区(dsFv)和包含CDR的肽中的任意一种抗体片段。
(13)一种杂交瘤，其产生(1)～(9)中任一项所述的单克隆抗体。
(14)一种核酸，其具有编码(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的碱基序列。
(15)一种转化细胞，其含有包含(14)所述的核酸的载体。
(16)(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的制造方法，其包括：对(13)所述的杂交瘤或(15)所述的转化细胞进行培养，从培养液中采集(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(17)一种人CCR1的检测或测定用试剂，其包含(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(18)一种人CCR1相关疾病的诊断剂，其包含(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(19)如(18)所述的诊断剂，其中，人CCR1相关疾病为癌症、自身免疫疾病或炎性疾病。
(20)一种人CCR1相关疾病的治疗剂，其含有(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。
(21)如(20)所述的治疗剂，其中，人CCR1相关疾病为癌症、自身免疫疾病或炎性疾病。
(22)一种人CCR1相关疾病的诊断方法，其使用(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(23)一种人CCR1相关疾病的治疗方法，其使用(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
(24)(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段在制造人CCR1相关疾病的诊断剂中的应用。
(25)(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段在制造人CCR1相关疾病的治疗剂中的应用。
(26)如(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其用于作为人CCR1相关疾病的治疗剂来使用。
(27)如(1)～(12)中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其用于作为人CCR1相关疾病的诊断剂来使用。
发明效果
本发明的单克隆抗体或该抗体片段与人CCR1的胞外区结合，抑制伴随人CCR1活化的各种反应。因此，本发明的单克隆抗体或该抗体片段能够用作人CCR1相关疾病的治疗剂和诊断剂。
附图说明
图1(a)和图1(b)是对抗人CCR1抗体测定抑制由活化人CCL15引起的THP-1的迁移的活性的结果。图1(a)和图1(b)的纵轴表示THP-1细胞的迁移(％)，将添加DPBS和活化CCL15时移动至Transwell的下层的细胞数设为100％。图1(a)和图1(b)的横轴表示添加至THP-1细胞中的抗体、配体和它们的浓度。图1(a)和图1(b)中，将添加了DPBS的样品记为DPBS、将未添加活化人CCL15的样品记为无配体、将添加了活化人CCL15的样品记为hCCL15(68aa)。作为抗人CCR1抗体，使用KM5907抗体、KM5908抗体、KM5909抗体、KM5911抗体、KM5915抗体、KM5916抗体、KM5954抗体、KM5955抗体和KM5956抗体。
图2是对抗人CCR1抗体测定抑制由活化人CCL15引起的THP-1的迁移的活性的结果。图2的纵轴表示利用CellTiter-Glo测定移动至Transwell的下层的细胞数时的发光量(相对光单位；relative light unit、RLU)。图2的横轴表示添加至THP-1细胞中的抗体、配体和它们的浓度。图2中，将添加了DPBS的样品记为DPBS、将未添加活化人CCL15的样品记为无配体、将添加了活化人CCL15的样品记为hCCL15(68aa)。作为抗人CCR1抗体，使用2D4抗体(Millennium公司)、53504抗体(R&D Technologies公司)、141-2抗体(MBL公司、#D063-3)、KM5908抗体和KM5916抗体。
图3是对抗人CCR1抗体测定抑制由活化人CCL15引起的THP-1的迁移的活性的结果。图3的纵轴表示利用CellTiter-Glo测定移动至Transwell的下层的细胞数时的发光量(相对光单位；relative light unit、RLU)。图3的横轴表示添加至THP-1细胞中的抗体、配体和它们的浓度。图3中，将未添加抗体的样品记为无mAb、将未添加活化人CCL15的样品记为无配体、将添加了活化人CCL15的样品记为hCCL15。抗作为人CCR1抗体，使用chKM5908抗体和chKM5908’抗体。实验以N＝3来实施，图中示出其平均值和标准偏差。
图4是对抗人CCR1抗体测定抑制由活化人CCL15引起的THP-1的迁移的活性的结果。图4的纵轴表示利用CellTiter-Glo测定移动至Transwell的下层的细胞数时的发光量(相对光单位；relative light unit、RLU)。图4的横轴表示添加至THP-1细胞中的抗体、配体和它们的浓度。图4中，将未添加抗体的样品记为无mAb、将未添加活化人CCL15的样品记为无配体、将添加了活化人CCL15的样品记为hCCL15。作为抗人CCR1抗体，使用chKM5908抗体、chKM5908’抗体、chKM5908’mut02抗体、chKM5908’mut22抗体和chKM5908’mut25抗体。实验以N＝3来实施，图中示出其平均值和标准偏差。
图5示出不含信号序列的mAb5-06抗体的VL和mAb5-06人源化抗体(以下记为hzmAb5-06抗体)的VL(LV0、LV1a、LV1b、LV2a、LV2b、LV4和LV5)的氨基酸序列。各序列中的被框包围的区域表示CDR的氨基酸序列。
图6示出不含信号序列的mAb5-06抗体的VH和hzmAb5-06抗体的VH(HV0、HV14和HV17)的氨基酸序列。各序列中的被框包围的区域表示CDR的氨基酸序列。
图7示出不含信号序列的KM5907抗体的VL和KM5907人源化抗体(以下记为hzKM5907抗体)的VL(LV0、LV1a、LV1b、LV1c、LV2a、LV2b、LV4和LV6)的氨基酸序列。各序列中的被框包围的区域表示CDR的氨基酸序列。
图8示出不含信号序列的KM5907抗体的VH和hzKM5907抗体的VH(HV0、HV1、HV2a、HV2b、HV3a、HV3b、HV3c、HV4和HV7)的氨基酸序列。各序列中的被框包围的区域表示CDR的氨基酸序列。
图9示出不含信号序列的KM5916抗体的VL和KM5916人源化抗体(以下记为hzKM5916抗体)的VL(LV0和LV1a)的氨基酸序列。各序列中的被框包围的区域表示CDR的氨基酸序列。
图10示出不含信号序列的KM5916抗体的VH和hzKM5916抗体的VH(HV0、HV1和HV3)的氨基酸序列。各序列中的被框包围的区域表示CDR的氨基酸序列。
图11是对抗人CCR1抗体测定抑制由活化人CCL15引起的THP-1的迁移的活性的结果。图11的纵轴表示利用CellTiter-Glo测定移动至Transwell的下层的细胞数时的发光量(相对光单位；relative light unit、RLU)。图11的横轴表示添加至THP-1细胞中的抗体、配体和它们的浓度。图11中，将未添加抗体的样品记为无mAb、将未添加活化人CCL15的样品记为无配体、将添加了活化人CCL15的样品记为hCCL15。作为抗人CCR1抗体，使用hzmAb5-06LV5HV14、hzKM5907 LV2bHV3a和hzKM5916 LV2HV0。实验以N＝3来实施，图中示出其平均值和标准偏差。
具体实施方式
本发明涉及与人CCR1的胞外区结合、抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化的单克隆抗体或该抗体片段。
CCR1也称为CD191、CKR-1、HM145、巨噬细胞炎性蛋白1α受体(Macrophageinflammatory protein 1α receptor、MIP1αR)、CMKBR1和SCYAR1等。CCR1是具有七次跨膜型结构的GPCR，是全长由355个氨基酸构成的膜蛋白。
在包括CCR1的GPCR中，细胞表面上的GPCR通过配体结合而被活化，向该细胞内转导该受体依赖性的信号，与此同时，该细胞内的钙离子浓度上升。已知其结果为对该细胞引起细胞迁移、趋化因子的产生、基质金属蛋白酶MMP的产生等。
即，作为CCR1的功能，可以列举下述功能：通过配体与细胞表面上的CCR1结合，向该细胞内转导CCR1依赖性的信号，与此同时，该细胞内的钙离子浓度上升，结果对该细胞引起细胞迁移、趋化因子的产生或MMP的产生等。
作为人CCR1的配体，可以列举例如人CCL3、CCL5、CCL8、CCL14、CCL15、CCL16和CCL23等。作为小鼠CCR1的配体，可以列举例如小鼠CCL3、CCL5、CCL7和CCL9等。
人CCL15是C-C趋化因子家族中包含的配体，全长由92个氨基酸构成。已知人CCL15的N末端在蛋白水解酶的作用下被分解，成为约68个氨基酸的活化型[以下在本发明中记为活化人CCL15或hCCL15(68aa)]，由此发挥出比全长的CCL15(以下在本发明中记为全长CCL15)更强的活性。
人CCL15与细胞表面上的人CCR1结合而活化该受体时，CCR1依赖性的信号被转导至该细胞内，引起磷脂酶C(PLC)的活化、细胞内的钙离子浓度的上升或核因子-κB(nuclearfactor-κB、NF-κB)的活化等。其结果，对该细胞引起细胞迁移等。
作为本发明的单克隆抗体(以下也简称为本发明的抗体)，可以列举抑制由人CCL15引起的人CCR1活化所伴随的各种反应中的至少一种反应的抗体。作为本发明的抗体，具体而言，可以列举例如抑制选自由人CCL15引起的人CCR1表达细胞内的CCR1依赖性的信号转导、PLC的活化、细胞内钙离子浓度的上升、NF-κB的活化和CCR1表达细胞的迁移中的至少一种反应的抗体等。其中，作为本发明的抗体，优选为抑制由人CCL15诱导的人CCR1表达细胞的迁移的抗体。
作为本发明的抗体，可以列举下述抗体：对于由人CCL15引起的人CCR1活化所伴随的上述反应，与仅添加人CCL15而不添加抗体的对照相比，优选抑制5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上的抗体。人CCL15的浓度可以根据测定系统适当调节至添加人CCL15时的上述反应的活性达到最大值的浓度。例如在利用本申请实施例中记载的方法测定CCR1表达细胞的迁移的情况下，CCL15的浓度优选为1ng/mL。另外，对于本发明的抗体的浓度，也可以根据测定系统进行适当调节。例如在利用本实施例中记载的方法测定CCR1表达细胞的迁移的情况下，本发明的抗体浓度可以列举0.3μg/mL以上、优选为1μg/mL以上、更优选为3μg/mL以上、最优选为10μg/mL以上。
本发明中，只要将CCR1活化，人CCL15可以为全长CCL15和活化人CCL15中的任意一种CCL15。
作为人CCR1表达细胞，只要是表达人CCR1的细胞，则可以为任意一种细胞，可以列举例如人细胞、人细胞株和人CCR1强制表达株等。
作为表达人CCR1的人细胞，可以列举例如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、NK细胞、T细胞、B细胞、未成熟髓样细胞(iMC)和骨髓来源免疫抑制性细胞(MDSC)等。
作为人CCR1的胞外区，可以列举包含人CCR1的氨基酸序列的N末端起第1～31位的氨基酸序列的N末端区、包含第97～103位的氨基酸序列的细胞外环1区域、包含第172～195位的氨基酸序列的细胞外环2区域和包含第266～278位的氨基酸序列的细胞外环3区域[Cell 72.3(1993):415-425]。
作为N末端区、细胞外环1区域、细胞外环2区域和细胞外环3区域，具体而言，分别可以列举序列号2的氨基酸序列中的第1～31位、第97～103位、第172～195位和第266～278位的氨基酸序列。
作为本发明的抗体，只要是与上述人CCR1的胞外区结合的抗体，则可以为任何抗体，但优选为与人CCR1的细胞外环2区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基结合的抗体。作为上述抗体，可以列举与序列号2的氨基酸序列的第172～195位的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基结合的抗体等。
另外，更具体而言，作为本发明的抗体，可以列举选自下述(a)～(n)中的任意一种抗体。
(a)VH的CDR1～3分别包含序列号69、70和71中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号72、73和74中记载的氨基酸序列的抗体。
(b)VH的CDR1～3分别包含序列号75、76和77中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号78、79和80中记载的氨基酸序列的抗体。
(c)VH的CDR1～3分别包含序列号81、82和83中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号84、85和86中记载的氨基酸序列的抗体。
(d)VH的CDR1～3分别包含序列号87、88和89中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号90、91和92中记载的氨基酸序列的抗体。
(e)VH的CDR1～3分别包含序列号93、94和95中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号96、97和98中记载的氨基酸序列的抗体。
(f)VH的CDR1～3分别包含序列号99、100和101中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号102、103和104中记载的氨基酸序列的抗体。
(g)VH的CDR1～3分别包含序列号105、106和107中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号108、109和110中记载的氨基酸序列的抗体。
(h)VH的CDR1～3分别包含序列号111、112和113中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号114、115和116中记载的氨基酸序列的抗体。
(i)VH的CDR1～3分别包含序列号117、118和119中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号120、121和122中记载的氨基酸序列的抗体。
(j)VH的CDR1包含序列号75中记载的氨基酸序列、VH的CDR2包含序列号76中记载的氨基酸序列或者导入了选自将序列号76中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Thr、将第9位的Val置换为Ala、将第14位的Phe置换为Ala、以及将第15位的Ile置换为Ala的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、VH的CDR3包含序列号77中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号77中记载的氨基酸序列中的第5位的Tyr置换为Ala、以及将第7位的Thr置换为Ala的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、并且VL的CDR1包含序列号126中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号126中记载的氨基酸序列中的第15位的Phe置换为Ala的改造的氨基酸序列、VL的CDR2包含序列号127中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号127中记载的氨基酸序列中的第2位的Val置换为Ile、以及将第5位的Arg置换为Lys的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、VL的CDR3包含序列号128中记载的氨基酸序列的抗体。
(k)VH的CDR1～3分别包含序列号75、131和77中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号126、134和128中记载的氨基酸序列的抗体。
(l)与上述(a)～(k)中记载的至少一种抗体竞争性地与人CCR1结合的抗体。
(m)与包含上述(a)～(k)中记载的任意一种抗体所结合的表位的表位结合的抗体。
(n)与和上述(a)～(k)中记载的任意一种抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体。
作为本发明的抗体，包含具有与上述(a)～(k)中记载的任意一种抗体的VH的CDR1～3和VL的CDR1～3的氨基酸序列分别显示出90％以上的同源性的抗体的VH的CDR1～3和VL的CDR1～3的氨基酸序列的抗体。90％以上的同源性具体而言可以列举91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％以上的同源性等。
本发明中，作为上述(a)～(i)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举小鼠抗人CCR1单克隆抗体KM5907抗体、KM5908抗体、KM5909抗体、KM5911抗体、KM5915抗体、KM5916抗体、KM5954抗体、KM5955抗体和KM5956抗体。作为上述(a)～(i)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举抗人CCR1嵌合抗体chKM5907抗体、chKM5908抗体、chKM5909抗体、chKM5911抗体、chKM5915抗体、chKM5916抗体、chKM5954抗体、chKM5955抗体和chKM5956抗体。作为上述(a)和(f)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举人源化抗人CCR1抗体hzKM5907抗体和hzKM5916抗体。作为上述(j)中记载的抗体的一个方式，可以列举抗人CCR1嵌合抗体改造体chKM5908’抗体、chKM5908’mut01～32抗体和人源化抗人CCR1抗体hzmAb5-06抗体。作为上述(k)中记载的抗体的一个方式，可以列举抗人CCR1嵌合抗体改造体chKM5908’mut22抗体(也记为mAb5-06)和人源化抗人CCR1抗体hzmAb5-06抗体。作为上述(a)～(k)中记载的抗体的一个方式，此外还可以列举具有上述(a)～(k)中记载的任意一种抗体的VH的CDR1～3和VL的CDR1～3的氨基酸序列的人抗体等。
本发明的上述(l)的抗体是指将上述(a)～(k)中记载的抗体作为第一抗体时抑制该第一抗体与人CCR1的结合的第二抗体。本发明的上述(m)的是指在将上述(a)～(k)中记载的抗体作为第一抗体、并且将第一抗体所结合的表位作为第一表位的情况下，与包含该第一表位的第二表位结合的第二抗体。另外，本发明的上述(n)的抗体是指在将上述(a)～(k)中记载的抗体作为第一抗体、并且将第一抗体所结合的表位作为第一表位的情况下，与该第一表位结合的第二抗体。
另外，作为本发明的抗体，具体而言，还可以列举选自下述(1)-(a)～(j)、(2)-(a)～(c)、(3)-(a)～(h)、(4)-(a)～(w)和(5)-(a)～(f)中的任意一种抗体。
(1)-(a)VH包含序列号51中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号52中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(b)VH包含序列号53中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号54中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(c)VH包含序列号55中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号56中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(d)VH包含序列号57中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号58中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(e)VH包含序列号59中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号60中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(f)VH包含序列号61中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号62中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(g)VH包含序列号63中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号64中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(h)VH包含序列号65中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号66中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(i)VH包含序列号67中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号68中记载的氨基酸序列的抗体。
(1)-(j)VH包含序列号130中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号133中记载的氨基酸序列的抗体。
(2)-(a)VH包含序列号136中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号136中记载的氨基酸序列中的第6位的Glu置换为Gln、将第20位的Leu置换为Ile、将第27位的Gly置换为Phe、将第29位的Val置换为Leu、将第30位的Ser置换为Asn、将第37位的Ile置换为Val、将第48位的Ile置换为Leu、将第67位的Val置换为Leu、将第71位的Val置换为Lys、将第73位的Thr置换为Asp、将第76位的Asn置换为Ser、将第78位的Phe置换为Val、将第80位的Leu置换为Phe、将第82位的Leu置换为Met、将第85位的Val置换为Leu、将第92位的Val置换为Ile、以及将第97位的Arg置换为Lys的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号135中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号135中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Val、将第15位的Pro置换为Leu、将第50位的Gln置换为Lys、将第92位的Tyr置换为Phe、以及将第109位的Val置换为Leu的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体。
(2)-(b)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号146中记载的氨基酸序列中的第4位的Leu置换为Val、将第44位的Gly置换为Arg、将第49位的Ser置换为Ala、将第92位的Ala置换为Gly、将第93位的Val置换为Met、将第97位的Ala置换为Thr、以及将第98位的Lys置换为Arg的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号145中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Val、将第15位的Ser置换为Leu、将第19位的Ala置换为Val、将第43位的Gln置换为Lys、将第50位的Gln置换为Lys、以及将第109位的Val置换为Leu的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体。
(2)-(c)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号163中记载的氨基酸序列中的第42位的Asp置换为Glu、将第87位的Lys置换为Arg、以及将第97位的Ala置换为Thr的氨基酸改造中的任意一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号162中记载的氨基酸序列中的第38位的Gln置换为His、以及将第43位的Ala置换为Gly的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体。
(3)-(a)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号135中记载的氨基酸序列的抗体。
(3)-(b)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号137中记载的氨基酸序列的抗体。
(3)-(c)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号138中记载的氨基酸序列的抗体。
(3)-(d)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号139中记载的氨基酸序列的抗体。
(3)-(e)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号140中记载的氨基酸序列的抗体。
(3)-(f)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号141中记载的氨基酸序列的抗体。
(3)-(g)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号142中记载的氨基酸序列的抗体。
(3)-(h)VH包含序列号143中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号142中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(a)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(b)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号147中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(c)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号148中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(d)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号149中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(e)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号150中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(f)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(g)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号152中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(h)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号153中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(i)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(j)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号147中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(k)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号148中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(l)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号149中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(m)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号150中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(n)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(o)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号152中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(p)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号153中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(q)VH包含序列号154中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(r)VH包含序列号155中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(s)VH包含序列号156中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(t)VH包含序列号157中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(u)VH包含序列号158中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(v)VH包含序列号159中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(4)-(w)VH包含序列号160中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
(5)-(a)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体。
(5)-(b)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体。
(5)-(c)VH包含序列号165中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体。
(5)-(d)VH包含序列号165中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体。
(5)-(e)VH包含序列号166中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体。
(5)-(f)VH包含序列号166中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体。
作为本发明的抗体，包含具有与上述(1)-(a)～(j)、(2)-(a)～(c)、(3)-(a)～(h)、(4)-(a)～(w)和(5)-(a)～(f)中记载的任意一种抗体的VH和VL的氨基酸序列分别显示出90％以上的同源性的抗体的VH和VL的氨基酸序列的抗体。90％以上的同源性具体而言可以列举91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％以上的同源性等。
本发明中，作为上述(1)-(a)～(i)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举小鼠抗人CCR1单克隆抗体KM5907抗体、KM5908抗体、KM5909抗体、KM5911抗体、KM5915抗体、KM5916抗体、KM5954抗体、KM5955抗体和KM5956抗体。
本发明中，作为上述(1)-(a)～(i)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举抗人CCR1嵌合抗体chKM5907抗体、chKM5908抗体、chKM5909抗体、chKM5911抗体、chKM5915抗体、chKM5916抗体、chKM5954抗体、chKM5955抗体和chKM5956抗体。另外，作为上述(1)-(j)中记载的抗体的一个方式，可以列举抗人CCR1嵌合抗体改造体chmAb5-06。
本发明中，作为上述(2)-(a)～(c)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举人源化抗人CCR1抗体hzmAb5-06抗体、hzKM5907抗体和hzKM5916抗体。
本发明中，作为上述(3)-(a)～(h)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举人源化抗人CCR1抗体hzmAb5-06 LV0HV17抗体、hzmAb5-06 LV1aHV17抗体、hzmAb5-06 LV1bHV17抗体、hzmAb5-06 LV2aHV17抗体、hzmAb5-06 LV2bHV17抗体、hzmAb5-06 LV4HV17抗体、hzmAb5-06 LV5HV17抗体和hzmAb5-06 LV5HV14抗体。
本发明中，作为上述(4)-(a)～(w)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举人源化抗人CCR1抗体hzKM5907 LV0HV0抗体、hzKM5907 LV1aHV0抗体、hzKM5907 LV1bHV0抗体、hzKM5907 LV1cHV0抗体、hzKM5907 LV2aHV0抗体、hzKM5907 LV2bHV0抗体、hzKM5907LV4HV0抗体、hzKM5907 LV6HV0抗体、hzKM5907 LV0HV7抗体、hzKM5907 LV1aHV7抗体、hzKM5907 LV1bHV7抗体、hzKM5907 LV1cHV7抗体、hzKM5907 LV2aHV7抗体、hzKM5907LV2bHV7抗体、hzKM5907 LV4HV7抗体、hzKM5907 LV6HV7抗体、hzKM5907 LV2bHV1抗体、hzKM5907 LV2bHV2a抗体、hzKM5907 LV2bHV2b抗体、hzKM5907 LV2bHV3a抗体、hzKM5907LV2bHV3b抗体、hzKM5907 LV2bHV3c抗体和hzKM5907 LV2bHV4抗体。
本发明中，作为上述(5)-(a)～(f)中记载的抗体的一个方式，分别可以列举人源化抗人CCR1抗体hzKM5916 LV0HV0抗体、hzKM5916 LV2HV0抗体、hzKM5916 LV0HV1抗体、hzKM5916 LV2HV1抗体、hzKM5916 LV0HV3抗体和hzKM5916 LV2HV3抗体。
本发明中，作为人CCR1，可以列举包含序列号2中记载的氨基酸序列或NCBI登记号NP_001286的氨基酸序列的多肽；由在序列号2中记载的氨基酸序列或NCBI登记号NP_001286的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加而得到的氨基酸序列构成且具有人CCR1的功能的多肽；或者由与序列号2中记载的氨基酸序列或NCBI登记号NP_001286的氨基酸序列具有60％以上、优选80％以上、进一步优选90％以上、最优选95％以上的同源性的氨基酸序列构成且具有人CCR1的功能的多肽等。
具有在序列号2中记载的氨基酸序列或NCBI登记号NP_001286所表示的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加而得到的氨基酸序列的多肽可以通过使用定点诱变法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology、约翰威利父子出版社(1987-1997)；Nucleic acids Research,10,6487(1982)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79,6409(1982)；Gene,34,315(1985)；Nucleic Acids Research,13,4431(1985)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,488(1985)]等，例如在编码包含序列号2的氨基酸序列的多肽的DNA中导入定点突变而得到。
缺失、置换或添加的氨基酸的数目没有特别限定，优选为1个～几十个、例如为1～20个，更优选为1个～几个、例如为1～5个氨基酸。
作为编码人CCR1的基因，可以列举序列号1中记载的碱基序列和NCBI登记号NM_001295的碱基序列。包含由在序列号1中记载的碱基序列或NM_001295的碱基序列中一种以上的碱基发生缺失、置换或添加而得到的碱基序列构成且编码具有人CCR1的功能的多肽的DNA的基因；包含由与序列号1中记载的碱基序列或NM_001295的碱基序列具有至少60％以上的同源性的碱基序列、优选具有80％以上的同源性的碱基序列、进一步优选具有95％以上的同源性的碱基序列构成且编码具有人CCR1的功能的多肽的DNA的基因；或者由在严格条件下与包含序列号1中记载的碱基序列或NM_001295的碱基序列的DNA杂交的DNA构成且编码具有人CCR1的功能的多肽的基因等也包含在本发明的编码人CCR1的基因中。
作为在严格条件下杂交的DNA，是指通过使用包含序列号1中记载的碱基序列或NM_001295的碱基序列的DNA作为探针的菌落杂交法、噬菌斑杂交法、Southern印记杂交法或DNA微阵列法等得到的能够杂交的DNA。
具体而言，可以列举能够通过如下方法进行鉴定的DNA：使用固定有来源于杂交的菌落或噬菌斑的DNA、或者具有该序列的PCR产物或寡聚DNA的滤膜或载玻片，在0.7～1.0mol/L的氯化钠存在下在65℃下进行杂交[Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology、约翰威利父子出版社(1987-1997)；DNA Cloning 1:Core Techniques,A Practical Approach(DNA克隆1：核心技术实用方法)、第二版、牛津大学出版社(1995)]后，使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mmol/L氯化钠、15mmol/L柠檬酸钠构成)，在65℃条件下对滤膜或载玻片进行清洗。
作为能够杂交的DNA，可以列举与序列号1中记载的碱基序列或NM_001295的碱基序列具有至少60％以上的同源性的DNA、优选具有80％以上的同源性的DNA、进一步优选具有95％以上的同源性的DNA。
编码真核生物的蛋白质的基因的碱基序列常常可以确认到基因的多态性。在本发明中使用的基因内由于这种多态性使碱基序列产生小规模突变而得到的基因也包含在本发明的编码人CCR1的基因中。
除了特别说明的情况以外，本发明中的同源性的数值可以是使用本领域技术人员公知的同源性检索程序算出的数值，对于碱基序列，可以列举使用BLAST[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]中默认的参数算出的数值等，对于氨基酸序列，可以列举使用BLAST2[Nucleic Acids Res.,25,3389(1997)；Genome Res.,7,649(1997)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.htmL]中默认的参数算出的数值等。
作为默认的参数，G(起始空位罚分，Cost to open gap)在碱基序列的情况下为5、在氨基酸序列的情况下为11；-E(空位延伸罚分，Cost to extend gap)在碱基序列的情况下为2、在氨基酸序列的情况下为l；-q(核苷酸错配罚分，Penalty for nucleotidemismatch)为-3；-r(核苷酸匹配得分，reward for nucleotide match)为1；-e(期望值，expect value)为10；-W(字长大小，wordsize)在碱基序列的情况下为11个残基、在氨基酸序列的情况下为3个残基；-y[非空位延伸下降的阈值，Dropoff(X)for blast extensionsin bits]在blastn的情况下为20、在blastn以外的程序中为7；-X(空位比对的下降阈值，Xdropoff value for gapped alignment in bits)为15；-Z(最终空位比对的下降值，finalX dropoff value for gapped alignment in bits)在blastn的情况下为50、在blastn以外的程序中为25(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/htmL/blastcgihelp.htmL)。
包含序列号2中记载的氨基酸序列或NCBI登记号NP_001286的氨基酸序列的部分序列的多肽可以通过本领域技术人员公知的方法来制作。具体而言，可以通过使编码序列号2的氨基酸序列的DNA的一部分缺失并对导入有包含上述DNA的表达载体的转化体进行培养来制作。另外，可以利用与上述同样的方法，得到具有在序列号2中记载的氨基酸序列或NCBI登记号NP_001286的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加而得到的氨基酸序列的多肽。此外，由序列号2中记载的氨基酸序列或NCBI登记号NP_001286的氨基酸序列构成的多肽、或者具有在序列号2中记载的氨基酸序列或NCBI登记号NP_001286的氨基酸序列中一个以上的氨基酸发生缺失、置换或添加而得到的氨基酸序列的多肽也可以通过芴甲氧羰基(Fmoc)法、叔丁氧羰基(tBoc)法等化学合成法来制造。
作为本发明的抗体，多克隆抗体、单克隆抗体和寡克隆抗体中的任意一种抗体都包含在内。多克隆抗体是指不同克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体分子群。单克隆抗体是指单一克隆的抗体产生细胞所分泌的抗体，其识别唯一的表位(也称为抗原决定簇)，构成单克隆抗体的氨基酸序列(一级序列)是相同的。寡克隆抗体是指将两种以上不同的单克隆抗体混合而得到的抗体分子群。
作为本发明中的单克隆抗体，可以列举由杂交瘤产生的抗体、或者由利用包含抗体基因的表达载体进行了转化的转化体产生的基因重组抗体。
表位可以列举单克隆抗体所识别、结合的单一的氨基酸序列、由氨基酸序列构成的立体结构、经翻译后修饰的氨基酸序列、和由经翻译后修饰的氨基酸序列构成的立体结构等。
作为经翻译后修饰的氨基酸序列，可以列举糖链键合于具有OH取代基的Tyr和Ser上的O键合型糖链、糖链键合于具有NH2取代基的Gln和Asn上的N键合型糖链、以及硫酸分子键合于具有OH取代基的Tyr和Ser上的键合有硫酸基等的氨基酸序列。
本发明的抗体与人CCR1的胞外区结合可以通过使用ELISA、流式细胞术和表面等离子共振法等测定本发明的抗体对人CCR1表达细胞的结合性来确认。另外，也可以将公知的免疫学检测法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual、冷泉港实验室(1988)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]等组合来确认。
本发明的抗体所结合的人CCR1的氨基酸残基或表位可以通过使用使人CCR1的一部分结构域缺失而得到的缺陷体、将人CCR1的一部分结构域置换为其他蛋白质来源的结构域而得到的突变体和人CCR1的部分肽片段等进行抗体的结合实验来确定。另外，也可以使用上述缺陷体或突变体的表达细胞来进行抗体的结合实验。
或者，本发明的抗体所结合的人CCR1的氨基酸残基或表位也可以通过在利用蛋白水解酶消化后的人CCR1的肽片段中添加本发明的抗体并使用已知的质谱分析法进行表位定位(epitope mapping)来确定。
本发明的抗体抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化例如可以以人CCR1表达细胞内的CCR1依赖性的信号转导、PLC的活化、细胞内的钙离子浓度上升、NF-κB活化或人CCR1表达细胞的迁移等中的至少一者作为指标来确认。
细胞的迁移可以使用以下所述的趋化性检测来测定。例如，分别在趋化性检测小室的上部添加人CCR1表达细胞，在该小室的下部添加1)培养基或DPBS等阴性对照、2)人CCL15和3)人CCL15和本发明的抗体，培养一定时间后，利用适当的方法测定存在于该小室下部的人CCR1表达细胞数。对于所得到的结果，在添加人CCL15时的细胞数比添加培养基时的细胞数增加的条件下，若添加人CCL15和本发明的抗体时的细胞数比添加人CCL15时的细胞数减少，则可以判定本发明的抗体抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化。
另外，本发明的抗体抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化可以以人CCR1表达细胞内的钙离子浓度的变化作为指标来确认。细胞内的钙离子浓度的变化可以利用公知的方法进行测定，例如可以使用细胞内Ca测定试剂盒(Wako公司制造)等，按照附带的操作规程来测定。
作为确认方法，例如按照上述方法测定在人CCR1表达细胞中分别添加1)培养基或DPBS等阴性对照、2)人CCL15、3)人CCL15和本发明的抗体时的细胞内钙离子浓度的变化。在添加人CCL15时的细胞内钙离子浓度比添加培养基时的细胞内钙离子浓度增加的条件下，若添加人CCL15和本发明的抗体时的细胞内钙离子浓度比添加人CCL15时的细胞内钙离子浓度减少，则可以判定本发明的抗体抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化。
抗体分子也被称为免疫球蛋白(以下记为Ig)，人抗体根据分子结构的差异被分类为IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgM的同种型。也将氨基酸序列的同源性较高的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4统称为IgG。
抗体分子由被称为重链(Heavy chain、以下记为H链)和轻链(Light chain、以下记为L链)的多肽构成。另外，H链从N末端侧起由VH、H链恒定区(也记为CH)各区域构成，L链从N末端侧起由VL、L链恒定区(也记为CL)各区域构成。CH按各亚类分别已知分别有α、δ、ε、γ和μ链。此外，CH从N末端侧起由CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域、CH3结构域各结构域构成。结构域是指构成抗体分子的各多肽的功能性结构单元。另外，将CH2结构域和CH3结构域合并称为Fc段或仅称为Fc。CL已知有Cλ链和Cκ链。
本发明中的CH1结构域、铰链结构域、CH2结构域、CH3结构域和Fc段可以根据EU索引[Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学关注的蛋白质序列)、美国卫生与公众服务部(1991)]利用自N末端起的氨基酸残基的序号来确定。具体而言，CH1确定为EU索引118～215号的氨基酸序列，铰链确定为EU索引216～230号的氨基酸序列，CH2确定为EU索引231～340号的氨基酸序列，CH3确定为EU索引341～447号的氨基酸序列。
作为本发明的抗体，也包括特别是利用基因工程方法制作的重组小鼠抗体、重组大鼠抗体、重组兔抗体、人型嵌合抗体(以下也仅称为嵌合抗体)、人源化抗体(也称为人型互补决定区CDR移植抗体)和人抗体等基因重组抗体。另外，本发明的抗体也包括将来自两种不同的抗体的H链(或VH)和L链(或VL)重组而制作的基因重组抗体(也称为VL置换抗体)。两种不同的抗体可以为来自杂交瘤的单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的任意一种。此外，作为本发明的抗体，也包括在制作上述基因重组抗体时施加了适当的氨基酸残基置换而得到的基因重组抗体。
嵌合抗体是指人以外的动物(非人动物)的抗体的VH和VL与人抗体的CH和CL构成的抗体。作为非人动物，只要能够制作杂交瘤，可以使用小鼠、大鼠、仓鼠、兔等任何动物。
杂交瘤是指使将抗原免疫于非人动物而获得的B细胞与来源于小鼠等的骨髓瘤细胞进行细胞融合而得到的、产生具有所期望的抗原特异性的单克隆抗体的细胞。因此，构成杂交瘤所产生的抗体的可变区由非人动物抗体的氨基酸序列构成。
人型嵌合抗体可以通过下述方法来制造：由生产单克隆抗体的非人动物细胞来源的杂交瘤获得编码该单克隆抗体的VH和VL的cDNA，分别插入至具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人型嵌合抗体表达载体，导入至动物细胞中使其进行表达。
本发明中的嵌合抗体改造体是指，将某一嵌合抗体的VL置换为另一嵌合抗体的VL而得到的抗体(也称为VL置换嵌合抗体)、和/或将该抗体的VL或VH中的一个或多个氨基酸残基置换为其他氨基酸残基而得到的抗体。
嵌合抗体改造体可以通过下述方法来制造：由生产某一单克隆抗体的非人动物细胞来源的杂交瘤获得编码该单克隆抗体的VH的cDNA，由生产另一单克隆抗体的非人动物细胞来源的杂交瘤获得编码该单克隆抗体的VL的cDNA，分别插入至具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建将不同的杂交瘤克隆来源的VH和VL组合而成的人型嵌合抗体表达载体，导入至动物细胞中使其进行表达。另外，对于嵌合抗体或VL置换嵌合抗体的VH或VL的氨基酸，可以制作将一个或多个氨基酸残基置换为与由杂交瘤得到的抗体的氨基酸残基不同的氨基酸残基的DNA，插入至该表达载体中。使用该载体同样地进行表达，所能制造的抗体也称为嵌合抗体改造体。
人源化抗体是指将非人动物抗体的VH和VL的CDR的氨基酸序列移植至人抗体的VH和VL所对应的CDR处而得到的抗体。VH和VL的CDR以外的区域称为框架区(以下记为FR)。
人源化抗体可以通过下述方法来制造：构建编码由非人动物抗体的VH的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VH的FR的氨基酸序列构成的VH的氨基酸序列的cDNA、以及编码由非人动物抗体的VL的CDR的氨基酸序列和任意的人抗体的VL的FR的氨基酸序列构成的VL的氨基酸序列的cDNA，分别插入至具有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体中，构建人源化抗体表达载体，导入至动物细胞中使其进行表达。
人抗体原本是指天然存在于人体内的抗体，但也包含由基于最近的基因工程的、细胞工程的、发育工程的技术进步而制作的人抗体噬菌体文库和人抗体产生转基因动物得到的抗体等。
人抗体可以通过将所期望的抗原免疫于保有人免疫球蛋白基因的小鼠(TomizukaK.et.al.,Proc Natl Acad Sci U S A.97,722-7,2000)而获得。另外，通过使用由人来源的B细胞对抗体基因进行扩增而得到的噬菌体展示文库来选择具有所期望的结合活性的人抗体，可以在不进行免疫的情况下获得人抗体(Winter G.et.al.,Annu Rev Immunol.12:433-55.1994)。此外，可以通过使用EB病毒使人B细胞永生化而制作出生产具有所期望的结合活性的人抗体的细胞，获得人抗体(Rosen A.et.al.,Nature 267,52-54.1977)。
存在于人体内的抗体例如可以如下获得：通过使EB病毒等感染由人外周血分离的淋巴细胞而使其永生化后，进行克隆，由此能够得到产生该抗体的淋巴细胞，对该淋巴细胞进行培养，从所得到的培养物中纯化出该抗体。
人抗体噬菌体文库是通过将由人B细胞制备的抗体基因插入至噬菌体基因中而使Fab、scFv等抗体片段表达在表面的噬菌体的文库。可以以对固定有抗原的底物的结合活性作为指标，从该文库中回收表达具有所期望的抗原结合活性的抗体片段的噬菌体。该抗体片段还可以进一步利用基因工程方法转换成由两条完整的H链和两条完整的L链构成的人抗体分子。
人抗体产生转基因动物是指人抗体基因整合至宿主动物的染色体内的动物。具体而言，可以通过向小鼠ES细胞中导入人抗体基因、将该ES细胞移植至其他小鼠的早期胚胎中后使其发育来制作人抗体产生转基因动物。利用人抗体产生转基因动物的人抗体的制作可以通过下述方法进行：利用通常的在人以外的哺乳动物中进行的杂交瘤制作方法获得人抗体产生杂交瘤并进行培养，由此使人抗体在培养物中产生并蓄积。
作为本发明的抗体的VH和VL的氨基酸序列，可以为人抗体的VH和VL的氨基酸序列、非人动物抗体的VH和VL的氨基酸序列、或者将非人动物抗体的CDR移植至任意的人抗体的框架中而得到的人源化抗体的VH和VL的氨基酸序列中的任意一者。
作为本发明的抗体中的CL的氨基酸序列，可以为人抗体的氨基酸序列或非人动物抗体的氨基酸序列中的任意一者，优选为人抗体的氨基酸序列的Cκ或Cλ。
作为本发明的抗体的CH，只要属于免疫球蛋白，则可以为任何的CH，优选使用属于IgG类的亚类、γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)和γ4(IgG4)中的任意一种。
作为本发明的抗体，Fc与抗体片段结合而成的Fc融合蛋白质、Fc与天然存在的配体或受体结合而成的Fc融合蛋白质(也称为免疫粘附素)、使多个Fc段融合而成的Fc融合蛋白质等也包含在本发明中。另外，为了使抗体稳定化和为了控制血中半衰期而对氨基酸残基进行了改造的Fc段等也可以用于本发明的抗体。
本发明的抗体或该抗体片段也包含含有经翻译后修饰的任何氨基酸的抗体。作为翻译后修饰，可以列举例如H链的C末端的赖氨酸残基的缺失[赖氨酸剪切(lysineclipping)]、或多肽的N末端的谷氨酰胺残基向焦谷氨酰胺(puroGlu)的转换等[Beck etal,Analytical Chemistry,85,715-736(2013)]。
本发明中，抗体片段是指与人CCR1的胞外区结合而抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化的具有抗原结合活性的抗体片段。作为本发明中的抗体片段，可以列举Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、双链抗体、dsFv或包含多个CDR的肽等。Fab是将IgG抗体用蛋白水解酶木瓜蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第224位的氨基酸残基处被切断)H链的N末端侧约一半与L链整体以二硫键(S-S键)结合而成的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
F(ab’)2是将IgG用蛋白水解酶胃蛋白酶进行处理而得到的片段中(在H链的第234位的氨基酸残基处被切断)比Fab借助铰链区的S-S键结合而成的片段稍大的、分子量约10万的具有抗原结合活性的抗体片段。Fab’是将上述F(ab’)2的铰链区的S-S键切断而得到的、分子量约5万的具有抗原结合活性的抗体片段。
scFv是使用由4个Gly和1个Ser残基构成的连接子(G4S)以任意个数连接而成的连接肽等适当的肽连接子(P)将一条VH与一条VL连接而得到的VH-P-VL或VL-P-VH多肽，是具有抗原结合活性的抗体片段。
双链抗体是抗原结合特异性相同或不同的scFv形成二聚体而得到的抗体片段，是具有针对相同抗原的二价的抗原结合活性或者针对不同抗原的特异性抗原结合活性的抗体片段。
dsFv是指将VH和VL中的各一个氨基酸残基置换为半胱氨酸残基、使所得的多肽借助该半胱氨酸残基间的S-S键进行结合而成的片段。
包含CDR的肽含有VH或VL的CDR中的至少一个区域以上而构成。包含多个CDR的肽可以使CDR彼此直接或借助适当的肽连接子进行结合。包含CDR的肽可以通过下述方法来制造：构建编码本发明的改造抗体的VH和VL的CDR的DNA，将该DNA插入至原核生物用表达载体或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入至原核生物或真核生物中使其进行表达。另外，包含CDR的肽也可以利用Fmoc法(芴甲氧羰基法)或tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来制造。
本发明的单克隆抗体包含在本发明的与人CCR1结合的单克隆抗体或其抗体片段上通过化学方法或基因工程方法结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、蛋白质或抗体药物等而得到的抗体的衍生物。
抗体的衍生物可以通过利用化学方法[抗体工程入门、地人书馆(1994)]在本发明的与人CCR1结合的单克隆抗体或其抗体片段的H链或L链的N末端侧、C末端侧、抗体分子中的适当的取代基或侧链或者糖链等上结合放射性同位素、低分子药剂、高分子药剂、免疫激活剂、蛋白质、抗体药物或核酸药物等而制造。
另外，抗体的衍生物可以通过下述基因工程方法来制造：将编码本发明的与人CCR1结合的单克隆抗体或其抗体片段的DNA与编码想要结合的蛋白质或抗体药物的DNA连接并插入至表达载体中，将该表达载体导入至适当的宿主细胞中使其进行表达。
作为放射性同位素，可以列举例如111In、131I、125I、90Y、64Cu、99Tc、77Lu或211At等。可以利用氯胺T法等使放射性同位素直接结合于抗体上。另外，也可以在抗体上结合对放射性同位素进行螯合的物质。作为螯合剂，可以列举例如1-异硫氰酸苄酯基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)等。
作为低分子药剂，可以列举例如烷化剂、亚硝基脲剂、代谢拮抗剂、抗生素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、激素疗法剂、激素拮抗剂、芳香化酶抑制剂、P糖蛋白抑制剂、铂络合物衍生物、M期抑制剂或激酶抑制剂等抗癌剂[临床肿瘤学、癌症与化学疗法出版社(1996)]、氢化可的松或泼尼松龙等甾体剂、阿司匹林或吲哚美辛等非甾体剂、硫代苹果酸金或青霉胺等免疫调节剂、环磷酰胺或硫唑嘌呤等免疫抑制剂、或者马来酸氯苯那敏或氯马斯汀之类的抗组胺剂等抗炎剂[炎症与抗炎疗法、医齿药出版株式会社(1982)]等。
作为抗癌剂，可以列举例如阿米福汀(氨磷汀)、顺铂、达卡巴嗪(DTIC)、更生霉素、二氯甲基二乙胺(氮芥)、链脲霉素、环磷酰胺、异环磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、表柔比星、吉西他滨(健择)、柔红霉素、丙卡巴肼、丝裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、长春碱、长春新碱、博来霉素、道诺霉素、培洛霉素、雌莫司汀、紫杉醇(泰素)、多西紫杉醇(多西他奇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、克拉屈滨、喜树碱、10-羟基-7-乙基喜树碱(SN38)、氟尿苷、氟达拉滨、羟基脲、伊达比星、美司那、依立替康(CPT-11)、拓扑替康、米托蒽醌、托泊替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、羟基脲、普卡霉素、密妥坦、培门冬酶、喷司他丁、哌泊溴烷、他莫昔芬、戈舍瑞林、亮丙瑞林、氟他胺、替尼泊苷、睾内酯、硫鸟嘌呤、塞替派、乌拉莫司汀、长春瑞滨、苯丁酸氮芥、氢化可的松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、长春地辛、尼莫司汀、司莫司汀、卡培他滨、雷替曲塞、氮胞苷、UFT、奥沙利铂、吉非替尼(易瑞沙)、伊马替尼(STI571)、厄洛替尼、FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3；Flt3)抑制剂、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth facotr receptor；VEGFR)抑制剂、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor；FGFR)抑制剂、艾瑞莎或特罗凯等表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor；EGFR)抑制剂、根赤壳菌素、17-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素、雷帕霉素、安吖啶、全反式维甲酸、沙利度胺、来那度胺、阿那曲唑、法曲唑、来曲唑、依西美坦、硫代苹果酸金、D-青霉胺、布西拉明、硫唑嘌呤、咪唑立宾、环孢素、雷帕霉素、氢化可的松、蓓萨罗丁(塔革雷汀)、他莫昔芬、地寒米松、孕激素类、雌激素类、阿那曲唑(瑞宁德)、利普安、阿司匹林、吲哚美辛、塞来昔布、青霉胺、硫代苹果酸金、马来酸氯苯那敏、氯苯那敏、氯马斯汀、维甲酸、蓓萨罗丁、砷、硼替佐米、别嘌呤醇、卡奇霉素、替伊莫单抗、塔革雷汀、奥唑米星、克拉霉素、瘤可维、酮康唑、氨鲁米特、苏拉明或类美登醇或者其衍生物等。
作为使低分子药剂与抗体结合的方法，可以列举例如借助戊二醛使药剂与抗体的氨基间结合的方法、或者借助水溶性碳二亚胺使药剂的氨基与抗体的羧基结合的方法等。
作为高分子药剂，可以列举例如聚乙二醇(以下记为PEG)、白蛋白、葡聚糖、聚环氧乙烷、苯乙烯马来酸共聚物、聚乙烯基吡咯烷酮、吡喃共聚物或羟丙基甲基丙烯酰胺等。通过使这些高分子化合物与抗体或该抗体片段结合，可期待下述等效果：(1)对化学性、物理性或生物性的各种因子的稳定性提高、(2)血中半衰期显著延长、或者(3)免疫原性消失或抑制抗体产生[生物偶联药品、广川书店(1993)]。
例如，作为使PEG与抗体结合的方法，可以列举与PEG化修饰试剂反应的方法等[生物偶联药品、广川书店(1993)]。作为PEG化修饰试剂，可以列举对赖氨酸的ε-氨基的修饰剂(日本特开昭61-178926号公报)、对天冬氨酸和谷氨酸的羧基的修饰剂(日本特开昭56-23587号公报)、或者对精氨酸的胍基的修饰剂(日本特开平2-117920号公报)等。
作为免疫激活剂，可以是作为免疫佐剂而已知的天然物质，作为具体例，促进免疫的药剂可以列举β(1→3)葡聚糖(例如香菇多糖或西佐糖)或α-半乳糖神经酰胺(KRN7000)等。
作为蛋白质，可以列举例如使NK细胞、巨噬细胞或中性粒细胞等免疫活性细胞活化的细胞因子或增殖因子或者毒素蛋白质等。
作为细胞因子或增殖因子，可以列举例如干扰素(以下记为IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(以下记为IL)-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。作为毒素蛋白质，可以列举例如蓖麻毒素、白喉毒素或ONTAK等，也包括为了调节毒性而向蛋白质中导入了突变的蛋白质毒素。
作为抗体药物，可以列举例如通过与抗体的结合而诱导凋亡的抗原、与肿瘤的病态形成相关的抗原、针对调节免疫功能的抗原或与病变部位的血管新生相关的抗原的抗体。
作为通过与抗体的结合而诱导凋亡的抗原，可以列举例如分化群(cluster ofdifferentiation；以下记为CD)19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD53、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80(B7.1)、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86(B7.2)、人白细胞抗原(HLA)II类或表皮生长因子受体(Epidermal Growth FactorReceptor；EGFR)等。
作为与肿瘤的病态形成相关的抗原或调节免疫功能的抗体的抗原，可以列举例如CD4、CD40、CD40配体、B7家族分子(例如CD80、CD86、CD274、B7-DC、B7-H2、B7-H3或B7-H4)、B7家族分子的配体(例如CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1或BTLA)、OX-40、OX-40配体、CD137、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor；TNF)受体家族分子(例如DR4、DR5、TNFR1或TNFR2)、肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor；TRAIL)家族分子、TRAIL家族分子的受体家族(例如TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRAIL-R3或TRAIL-R4)、核因子κ-B配体受体激活剂(receptor activator of nuclear factor kappa Bligand；RANK)、RANK配体、CD25、叶酸受体、细胞因子[例如IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、转化生长因子(transforming growth factor；TGF)β或TNFα等]或这些细胞因子的受体、或者趋化因子(例如SLC、ELC、I-309、TARC、MDC或CTACK等)或这些趋化因子的受体。
作为抑制病变部位的血管新生的抗体的抗原，可以列举例如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor；VEGF)、血管生成素、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor；FGF)、EGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor；HGF)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor；PDGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor；IGF)、促红细胞生成素(EPO)、TGFβ、IL-8、肝配蛋白(ephrin)或SDF-1或者它们的受体等。
与蛋白质或抗体药物的融合抗体可以通过下述方法来制造融合抗体：在编码单克隆抗体或抗体片段的cDNA上连接编码蛋白质或抗体药物中包含的抗体的cDNA，构建编码融合抗体的DNA，将该DNA插入至原核生物或真核生物用表达载体中，将该表达载体导入至原核生物或真核生物中，使其进行表达。
作为核酸药物，可以列举例如包含通过控制基因的功能而作用于生物体的小干扰核糖核酸(small interference ribonucleic acid；siRNA)或小分子核糖核酸(microRNA)等核酸的药品。例如可以考虑与抑制Th17细胞的主要转录因子RORγt的核酸药物的偶联。
在将本发明的抗体的衍生物用于人CCR1的检测和测定以及人CCR1相关疾病的诊断的情况下，作为与该抗体结合的药剂，可以列举通常的免疫学检测或测定法中使用的标记物。作为标记物，可以列举例如碱性磷酸酶、过氧化物酶或荧光素酶等酶、吖啶酯或洛酚碱等发光物质、或者异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明异硫氰酸酯(RITC)等荧光物质等。
另外，本发明包含含有与人CCR1结合的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分的组合物。
另外，本发明涉及一种人CCR1相关疾病的治疗剂，其含有与人CCR1结合的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。另外，本发明涉及一种人CCR1相关疾病的治疗方法，其包括给药与人CCR1结合的单克隆抗体或该抗体片段。
作为人CCR1相关疾病，只要是与人CCR1或人CCR1的配体相关的疾病，则可以为任何疾病，可以列举例如癌症、自身免疫疾病和炎性疾病。作为癌疾病，可以列举例如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、急性髓细胞白血病、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、有毛细胞白血病、套细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肝细胞癌、结直肠癌、非小细胞肺癌、口腔鳞状细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤或骨肉瘤等。作为自身免疫疾病或炎性疾病，可以列举例如类风湿关节炎、多发性硬化症、慢性阻塞性肺病、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、哮喘、特应性皮炎、炎性肠病、克罗恩病或白塞氏病等。
含有本发明的抗体或该抗体片段的治疗剂可以仅包含作为有效成分的该抗体或该抗体片段，但通常优选以与药理学上可接受的一种以上的载体一起混合、利用制剂学技术领域中公知的任意方法制造而成的药物制剂的形式提供。
给药途径优选使用治疗时最有效的途径，可以列举例如经口给药或口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非经口给药，优选列举静脉内给药。作为给药形态，可以列举例如喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴片剂等。
给药量或给药次数根据目标治疗效果、给药方法、治疗期间、年龄和体重等而有所不同，通常成人每一天为10μg/kg～10mg/kg。
本发明涉及含有与人CCR1结合的单克隆抗体或该抗体片段的CCR1的检测或测定用试剂、或者使用与人CCR1结合的单克隆抗体或该抗体片段的CCR1的检测或测定方法。作为本发明中检测或测定人CCR1的方法，可以列举任意的公知的方法。可以列举例如免疫学检测或测定方法等。
免疫学检测或测定方法是指使用实施了标记的抗原或抗体对抗体量或抗原量进行检测或测定的方法。作为免疫学检测或测定方法，可以列举例如放射性物质标记免疫抗体法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法(luminescent immunoassay)、蛋白免疫印迹法或物理化学方法等。
本发明涉及一种CCR1相关疾病的诊断剂，其包含与人CCR1结合的单克隆抗体或该抗体片段；或者一种CCR1相关疾病的诊断方法，其包括使用与人CCR1结合的单克隆抗体或该抗体片段，进行CCR1的检测或测定。通过使用本发明的单克隆抗体或该抗体片段，按照上述方法对表达人CCR1的细胞进行检测或测定，能够诊断人CCR1相关疾病。
本发明中，作为进行人CCR1的检测或测定的对象的生物体试样，只要是例如组织、细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿、粪便、组织液或培养液等可能包含人CCR1或表达人CCR1的细胞的试样，则没有特别限定。
含有本发明的单克隆抗体或该抗体片段的诊断剂可以根据目标诊断法含有用于进行抗原抗体反应的试剂、该反应的检测用试剂。作为用于进行抗原抗体反应的试剂，可以列举缓冲剂、盐等。作为检测用试剂，可以列举识别该单克隆抗体或该抗体片段的进行了标记的二次抗体、或者与标记对应的底物等在通常的免疫学检测或测定法中使用的试剂。
另外，本发明涉及抗人CCR1单克隆抗体或该抗体片段在制造CCR1相关疾病的治疗剂或诊断剂中的应用。
以下，具体地对本发明的抗体的制造方法、疾病的治疗方法和疾病的诊断方法进行说明。
1.抗体的制造方法
(1)抗原的制备
作为抗原的的人CCR1或人CCR1表达细胞可以通过将包含编码全长或部分长度的人CCR1的cDNA的表达载体导入至大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞等中而得到。另外，人CCR1也可以通过从大量表达人CCR1的各种人细胞株、人细胞和人组织等中纯化人CCR1而得到。另外，也可以直接使用这些人细胞株、人细胞和人组织等作为抗原。此外，也可以利用Fmoc法或tBoc法等化学合成法制备具有人CCR1的部分序列的合成肽，将其用作抗原。在人CCR1或具有人CCR1的部分序列的合成肽上，可以在C末端或N末端附加有FLAG或His等公知的标签。
本发明中使用的人CCR1可以通过使用Molecular Cloning,A LaboratoryManual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)或Current Protocols In MolecularBiology、约翰威利父子出版社(1987-1997)等中记载的方法等，利用例如下述方法使编码该人CCR1的DNA在宿主细胞中进行表达来制造。
首先，将包含编码人CCR1的部分的全长cDNA插入至适当的表达载体的启动子的下游，由此制作重组载体。代替上述全长cDNA，也可以使用基于全长cDNA而制备的、包含编码多肽的部分的适当长度的DNA片段。接着，将所得到的该重组载体导入至适合于该表达载体的宿主细胞中，由此能够得到生产多肽的转化体。
作为表达载体，只要是能够在所使用的宿主细胞中自主复制或能够整合到染色体中、并且在能够对编码多肽的DNA进行转录的位置含有适当的启动子的表达载体，均可以使用。作为宿主细胞，只要是大肠杆菌等属于埃希氏菌属等的微生物、酵母、昆虫细胞或动物细胞等能够表达目的基因的宿主细胞，均可以使用。
在使用大肠杆菌等原核生物作为宿主细胞的情况下，表达载体优选为能够在原核生物中自主复制、并且包含启动子、核糖体结合序列、包含编码人CCR1的部分的DNA和转录终止序列的载体。另外，该表达载体中未必需要具有转录终止序列，但优选紧挨在结构基因下配置转录终止序列。此外，该重组载体可以含有控制启动子的基因。
作为该重组载体，优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺序列(也称为SD序列)与起始密码子之间调节为适当的距离(例如6～18个碱基)的质粒。
另外，作为编码该人CCR1的DNA的碱基序列，可以对碱基进行置换以形成最适于在宿主内表达的密码子，由此能够提高作为目标的人CCR1的生产率。
作为表达载体，只要能够在所使用的宿主细胞中发挥功能，均可以使用，可以列举例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上为罗氏诊断公司制造)、pKK233-2(法玛西亚公司制造)、pSE280(Invitrogen公司制造)、pGEMEX-1(普洛麦格公司制造)、pQE-8(Qiagen公司制造)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[Agricultural Biological Chemistry,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制造)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM BP-400)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERM BP-6798)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(美国专利第4686191号说明书、美国专利第4939094号说明书、美国专利第160735号说明书)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(法玛西亚公司制造)、pET系统(Novagen公司制造)或pME18SFL3等。
作为启动子，只要能够在所使用的宿主细胞中发挥功能，可以为任何启动子。可以列举例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子或T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，还可以列举例如将两个Ptrp串联而成的串联启动子、tac启动子、lacT7启动子或let I启动子等进行了人工设计改造的启动子等。
作为宿主细胞，可以列举例如大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49或大肠杆菌DH5α等。
作为将重组载体导入至宿主细胞中的方法，只要是将DNA导入至所使用的宿主细胞中的方法，可以使用任何方法，可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)；Gene,17,107(1982)；Molecular&GeneralGenetics,168,111(1979)]。
在使用动物细胞作为宿主的情况下，作为表达载体，只要是能够在动物细胞中发挥功能的表达载体，均可以使用，可以列举例如pcDNAI、pCDM8(Funakoshi公司制造)、pAGE107[日本特开平3-22979号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]、pAS3-3(日本特开平2-227075号公报)、pCDM8[Nature,329,840(1987)]、pcDNAI/Amp(Invitrogen公司制造)、pcDNA3.1(Invitrogen公司制造)、pREP4(Invitrogen公司制造)、pAGE103[J.Biochemistry,101,1307(1987)]、pAGE210、pME18SFL3、pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、N5KG1val(美国专利第6001358号说明书)、INPEP4(Biogen-IDEC公司制造)和转座子载体(国际公开第2010/143698号)等。
作为启动子，只要是能够在动物细胞中发挥功能的启动子均可以使用，可以列举例如巨细胞病毒(CMV)的即刻早期(IE)基因的启动子、SV40的早期启动子、逆转录病毒的启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、SRα启动子或莫洛尼小鼠白血病病毒的启动子或增强子。另外，也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子一起使用。
作为宿主细胞，可以列举例如人白血病细胞那马瓦(Namalwa)细胞、猴细胞COS细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞[Journal of Experimental Medicine,108,945(1958)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,1275(1968)；
Genetics,55,513(1968)；Chromosoma,41,129(1973)；Methods in CellScience,18,115(1996)；Radiation Research,148,260(1997)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)；Proc.Natl.Acad.Sci.,60,1275(1968)；
Cell,6,121(1975)；Molecular Cell Genetics,Appendix I,II(pp.883-900)]、二氢叶酸还原酶基因(以下记为dhfr)缺陷的CHO细胞(CHO/DG44细胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]、CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUkXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、Pro-3、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NSO、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14、叙利亚仓鼠细胞BHK或HBT5637(日本特开昭63-000299号公报)等。
作为将重组载体导入至宿主细胞中的方法，只要是将DNA导入至动物细胞中的方法均可以使用，可以列举例如电穿孔法[Cytotechnology,3,133(1990)]、磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]、等。
将如上得到的来源于包含整合有编码人CCR1的DNA的重组载体的微生物或动物细胞等的转化体在培养基中进行培养，使该人CCR1在培养液中生成并蓄积，从该培养液中采集，由此能够制造人CCR1。将该转化体在培养基中进行培养的方法可以按照宿主培养中使用的通常的方法来进行。
在来源于真核生物的细胞中进行表达的情况下，能够得到附加有糖或糖链的人CCR1。
在对利用使用了诱导性启动子的重组载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要向培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用了lac启动子的重组载体进行了转化的微生物进行培养的情况下，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等，在对利用使用了trp启动子的重组载体进行了转化的微生物进行培养的情况下，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为对以动物细胞为宿主而得到的转化体进行培养的培养基，可以列举例如通常使用的RPMI1640培养基[The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)]、伊格尔(Eagle)的MEM培养基[Science,122,501(1952)]、杜氏改良MEM培养基[Virology,8,396(1959)]、199培养基[Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,73,1(1950)]或伊思考夫(Iscove)改良的杜氏培养基(IMDM)或者在这些培养基中添加胎牛血清(FBS)等而得到的培养基等。培养通常在pH6～8、30～40℃、5％CO2存在下等条件下进行1～7天。另外，培养中可以根据需要向培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
作为编码人CCR1的基因的表达方法，例如除了直接表达以外，还可以列举分泌生产或融合蛋白质表达等方法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)]。
作为人CCR1的生产方法，可以列举例如在宿主细胞内进行生产的方法、分泌至宿主细胞外的方法、或者在宿主细胞外膜上进行生产的方法，可以通过改变所使用的宿主细胞或所生产的人CCR1的结构来选择适当的方法。
在人CCR1在宿主细胞内或宿主细胞外膜上进行生产的情况下，通过使用鲍尔森等人的方法[J.Biol.Chem.,264,17619(1989)]、罗等人的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86,8227(1989)；Genes Develop.,4,1288(1990)]、日本特开平05-336963号公报或国际公开第94/23021号等中记载的方法，能够使人CCR1主动地分泌至宿主细胞外。另外，也可以利用使用了二氢叶酸还原酶基因等的基因扩增系统(日本特开平2-227075号公报)来提高人CCR1的生产量。
所得到的人CCR1例如可以如下进行分离、纯化。在人CCR1在细胞内以溶解状态表达的情况下，在培养结束后通过离心分离回收细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、MANTON-GAULIN匀浆器或戴诺磨机(Dyno mill)等将细胞破碎，得到无细胞提取液。从将该无细胞提取液离心分离而得到的上清中，利用通常的蛋白质分离纯化法，即，单独使用或组合使用溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化学公司制造)等树脂的阴离子交换色谱法、使用S-琼脂糖FF(法玛西亚公司制造)等树脂的阳离子交换色谱法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性色谱法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和色谱法、色谱聚焦法或等电点电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。
在人CCR1在细胞内形成不溶体而进行表达的情况下，与上述同样地回收细胞后将其破碎，进行离心分离，由此作为沉淀级分回收该人CCR1的不溶体。将回收的该人CCR1的不溶体用蛋白变性剂进行可溶化。对该可溶化液进行稀释或透析，由此使该人CCR1恢复至正常的立体结构后，利用与上述同样的分离纯化法能够得到多肽的纯化制备品。
在人CCR1或其糖修饰体等衍生物被分泌至细胞外的情况下，可以在培养上清中回收该人CCR1或其糖修饰体等衍生物。与上述同样地使用离心分离等方法对该培养物进行处理，由此获取可溶性级分，使用与上述同样的分离纯化法，能够从该可溶性级分中得到纯化制备品。
另外，本发明中使用的人CCR1也可以利用Fmoc法或tBoc法等化学合成法来制造。另外，也可以利用Advanced ChemTech公司制造、泊金埃尔默公司制造、法玛西亚公司制造、Protein Technology Instrument公司制造、Synthecell-Vega公司制造、Perceptive公司制造或岛津制作所公司制造等的肽合成仪进行化学合成。
(2)动物的免疫和融合用抗体产生细胞的制备
对3～20周龄的小鼠、大鼠或仓鼠等动物进行(1)中得到的抗原的免疫，采集该动物的脾脏、淋巴结、外周血中的抗体产生细胞。另外，也可以使用小鼠CCR1敲除小鼠作为被免疫动物。
免疫通过将抗原与例如弗氏完全佐剂、或者氢氧化铝凝胶与百日咳菌疫苗等适当的佐剂一起给药于动物的皮下、静脉内或腹腔内来进行。在抗原为部分肽的情况下，制作与BSA(牛血清白蛋白)或钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet hemocyanin，KLH)等载体蛋白的结合体，将其用作免疫原。
抗原的给药在第一次给药后每隔1～2周进行5～10次。在各给药后第3～7天从眼底静脉丛采血，使用酶联免疫测定法[Antibodies-A Laboratory Manual、冷泉港实验室(1988)]等测定其血清的抗体效价。将其血清对免疫所用的抗原显示出充分的抗体效价的动物作为融合用抗体产生细胞的供给源。
在抗原的最终给药后第3～7天，从免疫后的动物体内摘除脾脏等包含抗体产生细胞的组织，采集抗体产生细胞。在使用脾脏细胞的情况下，将脾脏细切、打散后离心分离，进而除去红细胞，从而获得融合用抗体产生细胞。
(3)骨髓瘤细胞的制备
作为骨髓瘤细胞，使用由小鼠得到的细胞株，例如8-氮杂鸟嘌呤抗性小鼠(来源于BALB/c)骨髓瘤细胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology andImmunology,18,1(1978)]、P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J.Immunology,6,511(1976)]、SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature,276,269(1978)]、P3-X63-Ag8653(653)[J.Immunology,123,1548(1979)]或P3-X63-Ag8(X63)[Nature,256,495(1975)]等。
该骨髓瘤细胞在正常培养基[添加有谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素、FBS和8-氮杂鸟嘌呤的RPMI1640培养基]中传代，在细胞融合的3～4天前传代于正常培养基中，在融合当天确保2×107个以上的细胞数。
(4)细胞融合进和单克隆抗体产生杂交瘤的制备
将(2)中得到的融合用抗体产生细胞和(3)中得到的骨髓瘤细胞用最低必需培养基(MEM)或PBS(磷酸氢二钠1.83g、磷酸二氢钾0.21g、氯化钠7.65g、蒸馏水1升、pH7.2)充分清洗，按照细胞数为融合用抗体产生细胞:骨髓瘤细胞＝5～10:1的方式混合，离心分离后，除去上清。将沉淀的细胞团块充分打散后，在37℃下一边搅拌一边加入聚乙二醇-1000(PEG-1000)、MEM培养基和二甲亚砜的混合液。进一步，每1～2分钟添加MEM培养基1～2mL，添加数次后，加入MEM培养基使总量为50mL。离心分离后，除去上清。将沉淀的细胞团块轻轻打散后，将细胞轻柔地悬浮于HAT培养基[添加有次黄嘌呤、胸腺嘧啶和氨基蝶呤的正常培养基]中。将该悬浮液在37℃、5％CO2培养箱中培养7～14天。
培养后，抽取一部分培养上清，利用后述的结合检测等杂交瘤的选择方法，筛选出与包含人CCR1的抗原反应而不与不包含人CCR1的抗原反应的细胞群。接着，利用有限稀释法进行克隆化，筛选出稳定确认到强抗体效价的细胞作为单克隆抗体产生杂交瘤。
(5)纯化单克隆抗体的制备
对姥鲛烷处理[腹腔内给药2,6,10,14-四甲基十五碳烷(姥鲛烷)0.5mL，饲养2周]后的8～10周龄的小鼠或裸鼠腹腔内注射(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤。在10～21天，杂交瘤形成癌性腹水。从该小鼠采集腹水，离心分离除去固体成分后，用40～50％硫酸铵进行盐析，利用辛酸沉淀法、DEAE-琼脂糖柱、蛋白A柱或凝胶过滤柱进行纯化，收集IgG或IgM级分，制成纯化单克隆抗体。
另外，将(4)中得到的单克隆抗体产生杂交瘤在添加有10％FBS的RPMI1640培养基等中进行培养后，通过离心分离除去上清，悬浮于Hybridoma SFM培养基中，培养3～7天。对所得到的细胞悬浮液进行离心分离，利用蛋白A柱或蛋白G柱从所得到的上清中进行纯化，收集IgG级分，也能够得到纯化单克隆抗体。需要说明的是，也可以在Hybridoma SFM培养基中添加5％的Daigo GF21。
抗体亚类的确定使用亚类分型试剂盒通过酶联免疫测定法来进行。蛋白量的定量可以利用劳里法或由280nm处的吸光度算出。
(6)单克隆抗体的筛选
抗体的筛选如下所示，通过利用流式细胞术测定抗体对人CCR1表达细胞的结合性等来进行。人CCR1表达细胞只要在细胞表面上表达人CCR1，可以为任何细胞，可以列举例如人细胞、人细胞株和(1)中得到的人CCR1强制表达细胞株等。
将人CCR1表达细胞分注至96孔板等板中后，分注血清、杂交瘤的培养上清或纯化单克隆抗体等受试物质作为第一抗体，使其进行反应。将反应后的细胞用含有1～10％牛血清白蛋白(BSA)的PBS(以下记为BSA-PBS)等充分清洗后，分注用荧光试剂等进行了标记的抗免疫球蛋白抗体作为第二抗体，使其进行反应。用BSA-PBS等充分清洗后，使用流式细胞仪对标记化抗体的荧光量进行测定，由此筛选出与人CCR1表达细胞特异性地反应的单克隆抗体。
另外，与本发明的抗体竞争性地与人CCR1结合的抗体可以通过将受试抗体添加至上述的使用流式细胞术的测定系统中使其进行反应而获得。即，通过筛选在添加了受试抗体时抑制本发明的抗体与人CCR1的结合的抗体，能够获得在与人CCR1的氨基酸序列或其立体结构的结合中与本发明的抗体竞争的单克隆抗体。
另外，与包含本发明的与人CCR1结合的单克隆抗体所结合的表位的表位结合的抗体可以通过下述方法获得：利用公知的方法对通过上述筛选方法获得的抗体的表位进行鉴定，制作包含所鉴定出的表位的合成肽或模拟表位的立体结构的合成肽等，进行免疫。
此外，与和本发明的与人CCR1结合的单克隆抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体可以通过下述方法获得：对利用上述的筛选方法获得的抗体的表位进行鉴定，制作包含所鉴定出的表位的部分的合成肽或模拟表位的立体结构的合成肽等，进行免疫。
2.基因重组抗体的制作
作为基因重组抗体的制作例，以下示出人型嵌合抗体、人型嵌合抗体改造体和人源化抗体的制作方法。基因重组的小鼠抗体、大鼠抗体和兔抗体等也可以利用同样的方法制作。
(1)基因重组抗体表达用载体的构建
基因重组抗体表达用载体是整合有编码人抗体的CH和CL的DNA的动物细胞用表达载体，可以通过将编码人抗体的CH和CL的DNA分别克隆至动物细胞用表达载体中来构建。
人抗体的C区可以使用任何人抗体的CH和CL。例如使用人抗体的γ1亚类的CH和κ类的CL等。编码人抗体的CH和CL的DNA使用cDNA，但也可以使用由外显子和内含子构成的染色体DNA。动物细胞用表达载体只要能够整合编码人抗体的C区的基因并进行表达，可以使用任何表达载体。例如使用pAGE107[Cytotechnol.,3,133(1990)]、pAGE103[J.Biochem.,101,1307(1987)]、pHSG274[Gene,27,223(1984)]、pKCR[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78,1527(1981)]、pSG1bd2-4[Cytotechnol.,4,173(1990)]或pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol.,13,79(1993)]等。动物细胞用表达载体中启动子和增强子可以列举SV40的早期启动子[J.Biochem.,101,1307(1987)]、莫洛尼小鼠白血病病毒LTR[Biochem.Biophys.Res.Commun.,149,960(1987)]或免疫球蛋白H链的启动子[Cell,41,479(1985)]和增强子[Cell,33,717(1983)]等。
从基因重组抗体表达载体的构建的容易度、向动物细胞中导入的容易度、抗体H链和L链在动物细胞内的表达量的平衡达到均衡等观点出发，基因重组抗体表达用载体使用抗体H链和L链存在于同一载体上的类型(串联型)的基因重组抗体表达用载体[J.Immunol.Methods,167,271(1994)]，但也可以使用抗体H链和L链存在于分开的载体上的类型的载体。串联型的基因重组抗体表达用载体使用pKANTEX93(国际公开第97/10354号)、pEE18[Hybridoma,17,559(1998)]等。
(2)编码来源于人以外的动物的抗体的V区的cDNA的获得和氨基酸序列的分析
编码非人抗体的VH和VL的cDNA的获得和氨基酸序列的分析可以如下进行。
由产生非人抗体的杂交瘤细胞提取mRNA，合成cDNA。将所合成的cDNA克隆至噬菌体或质粒等载体中，制作cDNA文库。使用编码小鼠抗体的C区部分或V区部分的DNA作为探针，从上述文库中分别分离出具有编码VH或VL的cDNA的重组噬菌体或重组质粒。分别确定重组噬菌体或重组质粒上的作为目标的小鼠抗体的VH或VL的全部碱基序列，由碱基序列分别推定VH或VL的全部氨基酸序列。
制作产生非人抗体的杂交瘤细胞的人以外的动物使用小鼠、大鼠、仓鼠或兔等，但只要能够制作杂交瘤细胞，任何动物均可以使用。
由杂交瘤细胞制备总RNA时，使用异硫氰酸胍-三氟乙酸铯法[Methods inEnzymol.,154,3(1987)]或RNA easy kit(Qiagen公司制造)等试剂盒等。
由总RNA制备mRNA时，使用固定有寡聚(dT)的纤维素柱法[Molecular Cloning,ALaboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)]或Oligo-dT30<Super>(注册商标)mRNA纯化试剂盒(宝生物公司制造)等试剂盒等。另外，也可以使用Fast Track(注册商标)mRNA分离试剂盒(Invitrogen公司制造)或QuickPrep(注册商标)mRNA纯化试剂盒(法玛西亚公司制造)等试剂盒由杂交瘤细胞制备mRNA。
cDNA的合成和cDNA文库的制作使用公知的方法[Molecular Cloning,ALaboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols inMolecular Biology、附录1、约翰威利父子出版社(1987-1997)]；或者用于cDNA合成和质粒克隆的SuperScript质粒系统(Invitrogen公司制造)或ZAP-cDNA(注册商标)合成试剂盒(Stratagene公司制造)等试剂盒等。
制作cDNA文库时，作为整合以由杂交瘤细胞提取的mRNA为模板而合成的cDNA的载体，只要是可整合该cDNA的载体，任何载体均可以使用。例如使用ZAP Express[Strategies,5,58(1992)]、pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research,17,9494(1989)]、λZAPII(Stratagene公司制造)、λgt10、λgt11[DNA Cloning:A PracticalApproach(DNA克隆实用方法),I,49(1985)]、Lambda BlueMid(Clontech公司制造)、λExCell、pT7T3-18U(法玛西亚公司制造)、pCD2[Mol.Cell.Biol.,3,280(1983)]或pUC18[Gene,33,103(1985)]等。
作为导入利用噬菌体或质粒载体构建的cDNA文库的大肠杆菌，只要能够导入、表达和维持该cDNA文库，可以使用任何大肠杆菌。例如使用XL1-Blue MRF’[Strategies,5,81(1992)]、C600[Genetics,39,440(1954)]、Y1088、Y1090[Science,222,778(1983)]、NM522[J.Mol.Biol.,166,1(1983)]、K802[J.Mol.Biol.,16,118(1966)]或JM105[Gene,38,275(1985)]等。
从cDNA文库中选择编码非人抗体的VH或VL的cDNA克隆时，使用利用了同位素或荧光标记的探针的集落杂交法或菌斑杂交法[Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)]等。
另外，也可以通过制备引物，以由mRNA合成的cDNA或cDNA文库作为模板，进行聚合酶链式反应法[以下记为PCR法；Molecular Cloning,A Laboratory Manual、第二版、冷泉港实验室出版社(1989)；Current Protocols in Molecular Biology、附录1、约翰威利父子出版社(1987-1997)]来制备编码VH或VL的cDNA。
将所选择的cDNA用适当的限制酶等切割后，克隆至pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，利用通常使用的碱基序列分析方法等确定该cDNA的碱基序列。作为碱基序列分析方法，例如在进行双脱氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,5463(1977)]等反应后，使用ABI PRISM3700(PE生物系统公司制造)或A.L.F.DNA测序仪(法玛西亚公司制造)等碱基序列自动分析装置等。
由所确定的碱基序列分别推定VH和VL的全部氨基酸序列，与已知抗体的VH和VL的全部氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学关注的蛋白质序列)、美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，由此分别确认所获得的cDNA是否编码包含分泌包含信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列。关于包含分泌信号序列的抗体的VH和VL的完整氨基酸序列，通过与已知抗体的VH和VL的全部氨基酸序列[Sequencesof Proteins of Immunological Interest(免疫学关注的蛋白质序列)、美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较，能够推定分泌信号序列的长度和N末端氨基酸序列，进而能够知晓它们所属的亚类。另外，对于VH和VL的各CDR的氨基酸序列，也可以通过与已知抗体的VH和VL的氨基酸序列[Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学关注的蛋白质序列)、美国卫生与公众服务部(1991)]进行比较来找出。
另外，使用所得到的VH和VL的完整氨基酸序列，对例如SWISS-PROT或PIR-Protein等任意的数据库进行BLAST法[J.Mol.Biol.,215,403(1990)]等的同源性检索，能够确认VH和VL的完整氨基酸序列是否为新序列。
(3)人型嵌合抗体表达载体或人型嵌合抗体改造体表达载体的构建
将分别编码非人抗体的VH或VL的cDNA分别克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，由此能够构建人型嵌合抗体表达载体。
通过使用编码来源于某一单克隆抗体的VH的cDNA和编码来源于另一单克隆抗体的VL的cDNA，能够构建人型嵌合抗体改造体表达载体。
另外，以该cDNA或已经制作好的人型嵌合抗体表达载体作为PCR的模板，使用在期望的氨基酸改造位点导入点突变的PCR引物对基因片段进行扩增，进行克隆连接至(1)中得到的载体中，由此能够构建人型嵌合抗体改造体表达载体。在改造位点涉及多个部位的情况下，也可以使用通过人工DNA合成制作的基因片段。
为了将编码非人抗体的VH或VL的cDNA的3’末端侧与人抗体的CH或CL的5’末端侧连接，制作以如下方式设计的VH和VL的cDNA：连接部分的碱基序列编码适当的氨基酸且成为适当的限制酶识别序列。将所制作的VH和VL的cDNA分别克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达，从而构建人型嵌合抗体表达载体或人型嵌合抗体改造体表达载体。
另外，也可以使用在两端具有适当的限制酶的识别序列的合成DNA，利用PCR法对编码非人抗体VH或VL的cDNA分别进行扩增，将它们克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
(4)编码人源化抗体的V区的cDNA的构建
编码人源化抗体的VH或VL的cDNA可以如下构建。
分别选择出用于移植非人抗体的VH或VL的CDR的氨基酸序列的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列。所选择的FR的氨基酸序列只要来源于人抗体，可以使用任何的FR的氨基酸序列。例如使用蛋白数据库(Protein Data Bank)等数据库中登记的人抗体的FR的氨基酸序列、或人抗体的FR的各亚类的共有氨基酸序列[Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学关注的蛋白质序列)、美国卫生与公众服务部(1991)]等。为了抑制抗体的结合活性的降低，选择与原抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列具有尽量高的同源性(至少60％以上)的FR的氨基酸序列。
接着，向所选择的人抗体的VH或VL的FR的氨基酸序列中分别移植原抗体的CDR的氨基酸序列，分别设计出人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列。考虑在抗体基因的碱基序列中出现的密码子的使用频率[Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学关注的蛋白质序列)、美国卫生与公众服务部(1991)]而将所设计的氨基酸序列转换成DNA序列，分别设计出编码人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列。
基于所设计的DNA序列，合成多条由约100个碱基的长度构成的合成DNA，使用这些合成DNA进行PCR反应。这种情况下，从PCR反应中的反应效率和能够合成的DNA的长度的观点出发，优选对于VH、VL分别设计各6条合成DNA。此外，通过在位于两端的合成DNA的5’末端或3’末端导入适当的限制酶的识别序列，能够容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
PCR反应后，将扩增产物分别克隆至pBluescript SK(-)(Stratagene公司制造)等质粒中，通过与(2)中记载的方法同样的方法确定碱基序列，从而获得具有编码所期望的人源化抗体的VH或VL的氨基酸序列的DNA序列的质粒。
或者，也可以使用基于所设计的DNA序列以各一条长链DNA的形式合成VH全长和VL全长而得到的DNA来代替上述PCR扩增产物。进一步，通过在合成长链DNA的两端导入适当的限制酶的识别序列，能够容易地将编码人源化抗体的VH或VL的cDNA克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体中。
(5)人源化抗体的V区的氨基酸序列的改造
对于人源化抗体而言，仅将非人抗体的VH和VL的CDR移植至人抗体的VH和VL的FR中时，其抗原结合活性与原来的非人抗体相比降低[BIO/TECHNOLOGY,9,266(1991)]。在人源化抗体中，通过鉴定出人抗体的VH和VL的FR的氨基酸序列中直接与抗原的结合相关的氨基酸残基、与CDR的氨基酸残基相互作用的氨基酸残基、以及维持抗体的立体结构而间接与抗原的结合相关的氨基酸残基，并将这些氨基酸残基置换为原来的非人抗体的氨基酸残基，能够使降低的抗原结合活性升高。
为了鉴定出与抗原结合活性相关的FR的氨基酸残基，可以通过使用X射线晶体分析[J.Mol.Biol.,112,535(1977)]或计算机建模[Protein Engineering,7,1501(1994)]等进行抗体的立体结构的构建和分析。另外，通过针对各个抗体制作多种改造体并反复研究与各自的抗原结合活性的相关性来进行各种尝试，能够获得具有所需要的抗原结合活性的人源化抗体。
人抗体的VH和VL的FR的氨基酸残基可以通过使用改造用合成DNA进行(4)中记载的PCR反应来进行改造。对于PCR反应后的扩增产物，通过(2)中记载的方法来确定碱基序列，从而确认已实施了目标改造。
(6)人源化抗体表达载体的构建
将所构建的编码基因重组抗体的VH或VL的cDNA分别克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，能够构建人源化抗体表达载体。
例如，通过向(4)和(5)中得到的构建人源化抗体的VH或VL时使用的合成DNA中位于两端的合成DNA的5’末端或3’末端导入适当的限制酶的识别序列，分别克隆至(1)中得到的基因重组抗体表达用载体的编码人抗体的CH或CL的各基因的上游，以使它们以适当的形式进行表达。
另外，在制作上述嵌合抗体、人源化抗体等基因重组抗体的情况下，通过制作将来源于两种不同的抗体的H链(或VH)和L链(或VL)重组而成的抗体表达用载体，能够构建VL置换嵌合抗体表达用载体。
(7)基因重组抗体的瞬时性表达
使用(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体或者对它们进行改造而得到的表达载体，进行基因重组抗体的瞬时性表达，能够高效地对所制作的多种人型嵌合抗体、人源化抗体的抗原结合活性进行评价。
导入表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，可以使用任何细胞，例如使用COS-7细胞[美国典型培养物保藏中心(ATCC)编号：CRL1651][Methods inNucleic Acids Res.,CRC press,283(1991)]。
向COS-7细胞中导入表达载体时，使用DEAE-右旋糖酐法[Methods in NucleicAcids Res.,CRC press(1991)]或脂质体转染法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987)]等。
导入表达载体后，使用酶免疫抗体法[Monoclonal Antibodies-Principles andpractice、第三版、学术出版社(1996)；Antibodies-A Laboratory Manual、冷泉港实验室(1988)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]等测定培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性。
(8)稳定表达基因重组抗体的转化株的获得和基因重组抗体的制备
通过将(3)和(6)中得到的基因重组抗体表达载体导入至适当的宿主细胞中，能够得到稳定表达基因重组抗体的转化株。
表达载体向宿主细胞中的导入使用电穿孔法[日本特开平2-257891号公报；Cytotechnology,3,133(1990)]等。
导入基因重组抗体表达载体的宿主细胞只要是能够表达基因重组抗体的宿主细胞，可以使用任何细胞。例如使用CHO-K1(ATCC CCL-61)、DUKXB11(ATCC CCL-9096)、Pro-5(ATCC CCL-1781)、CHO-S(Life Technologies、Cat#11619)、大鼠骨髓瘤细胞YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20(ATCC编号：CRL1662、或者也称为YB2/0)、小鼠骨髓瘤细胞NS0、小鼠骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(ATCC编号：CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC编号：CRL1580)、二氢叶酸还原酶基因(Dihydroforate Reductase、以下记为dhfr)缺陷的CHO细胞(CHO/DG44细胞)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4216(1980)]等。
另外，也可以使用与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖的合成相关的酶等蛋白质、与在N-糖苷键复合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺的6位上使岩藻糖的1位进行α连接的糖链修饰相关的酶等蛋白质、或者与细胞内糖核苷酸GDP-岩藻糖向高尔基体的转运相关的蛋白质等的活性降低或缺失的宿主细胞，例如α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞(国际公开第2005/035586号、国际公开第02/31140号)、获得了凝集素抗性的Lec13[Somatic Celland Molecular genetics,12,55(1986)]等。
导入表达载体后，将稳定表达基因重组抗体的转化株在含有G418硫酸盐(以下记为G418)等药剂的动物细胞培养用培养基进行培养，由此进行筛选(日本特开平2-257891号公报)。
动物细胞培养用培养基使用RPMI1640培养基(Invitrogen公司制造)、GIT培养基(日本制药公司制造)、EX-CELL301培养基(JRH公司制造)、IMDM培养基(Invitrogen公司制造)或Hybridoma-SFM培养基(Invitrogen公司制造)、或者在这些培养基中添加有FBS等各种添加物的培养基等。通过将所得到的转化株在培养基中进行培养，使基因重组抗体在培养上清中表达并蓄积。培养上清中的基因重组抗体的表达量和抗原结合活性可以利用ELISA法等进行测定。另外，可以利用dhfr基因扩增系统(日本特开平2-257891号公报)等使转化株所产生的基因重组抗体的表达量升高。
基因重组抗体可以使用蛋白A柱从转化株的培养上清中进行纯化[MonoclonalAntibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；Antibodies-ALaboratory Manual、冷泉港实验室(1988)]。另外，也可以将凝胶过滤、离子交换色谱和超滤等蛋白质的纯化中使用的方法组合来进行纯化。
纯化后的基因重组抗体的H链、L链或整个抗体分子的分子量可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法[Nature,227,680(1970)]或蛋白免疫印迹法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；Antibodies-A LaboratoryManual、冷泉港实验室(1988)]等进行测定。
3.纯化单克隆抗体或该抗体片段的活性评价
纯化后的本发明的单克隆抗体或该抗体片段的活性评价可以如下进行。
本发明的抗体或该抗体片段对人CCR1的结合活性使用上述1-(6)中记载的流式细胞术进行测定。另外，也可以使用荧光抗体法[Cancer Immunol.Immunother.,36,373(1993)]等进行测定。
本发明的抗体或该抗体片段抑制由人CCL15引起的人CCR1表达细胞的迁移的活性可以使用上述的趋化性检测进行测定。
对人CCR1表达细胞的CDC活性或ADCC活性可以利用公知的测定方法[CancerImmunol.Immunother.,36,373(1993)；Current protocols in Immunology,Chapter7.Immunologic studies in humans,Editor,John E,Coligan et al.,JohnWiley&Sons,Inc.,(1993)]进行测定。
4.控制抗体的效应子活性的方法
作为控制本发明的单克隆抗体的效应子活性的方法，已知有对结合于抗体的Fc段的第297位的天冬酰胺(Asn)的N键合复合型糖链的还原末端上存在的N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)上α1,6键合的岩藻糖(也称为核心岩藻糖)的量进行控制的方法(国际公开第2005/035586号、国际公开第2002/31140号、国际公开第00/61739号)；或者通过对抗体的Fc段的氨基酸残基进行改造而进行控制的方法等。对本发明的单克隆抗体使用任意一种方法，均能够控制效应子活性。
效应子活性是指由抗体的Fc段所引起的抗体依赖性活性，已知有ADCC活性、CDC活性、或者由巨噬细胞或树突细胞等吞噬细胞产生的抗体依赖性吞噬活性(Antibody-dependent phagocytosis、ADP活性)等。
作为效应子活性的测定法，例如，可以将作为标靶的炎性细胞、作为效应子的人外周血单核细胞(PBMC)、以及炎性细胞特异性的抗体混合，温育约4小时后，测定作为细胞损伤指标的游离出来的乳酸脱氢酶(LDH)。或者，可以在人全血中添加识别例如CD20之类的血液细胞特异性的抗原的抗体，温育后，测定作为标靶的血液细胞数的减少作为效应子活性。或者，例如，可以在人全血中混合另外的标靶细胞，进一步添加标靶细胞的特异性抗体并温育后，测定标靶细胞数的减少作为效应子活性。任何一种情况下，效应子活性均可以通过游离LDH法、游离51Cr法或流式细胞术法等来进行测定。
通过控制抗体的Fc的N键合复合型糖链的核心岩藻糖的含量，能够增加或降低抗体的效应子活性。作为降低与抗体的Fc结合的N键合复合型糖链上结合的岩藻糖的含量的方法，可以通过使用α1,6-岩藻糖转移酶基因缺陷的CHO细胞对抗体进行表达而获得未结合岩藻糖的抗体。未结合岩藻糖的抗体具有高的ADCC活性。
另一方面，作为增加与抗体的Fc结合的N键合复合型糖链上结合的岩藻糖的含量的方法，可以通过使用导入有α1,6-岩藻糖转移酶基因的宿主细胞对抗体进行表达而获得结合有岩藻糖的抗体。结合有岩藻糖的抗体具有比未结合岩藻糖的抗体低的ADCC活性。
另外，可以通过对抗体的Fc段的氨基酸残基进行改造来增加或降低ADCC活性或CDC活性。例如，通过使用美国专利申请公开第2007/0148165号说明书中记载的Fc段的氨基酸序列，能够增加抗体的CDC活性。
另外，通过进行美国专利第6737056号说明书、美国专利第7297775号说明书或美国专利第7317091号说明书中记载的氨基酸改造，既可以增加也可以降低ADCC活性或CDC活性。另外，本发明的抗体也包含通过配合上述的抗体恒定区中的氨基酸改造或糖链改造来进行例如日本特开第2013-165716号公报或日本特开第2012-021004号公报等中记载的氨基酸改造而控制对Fc受体的反应性、由此控制了血中半衰期的抗体。
此外，通过将上述方法组合而用于一种抗体，能够获得控制了抗体的效应子活性、血中半衰期的抗体。
5.使用本发明的抗人CCR1单克隆抗体或该抗体片段的疾病的治疗方法
只要是人CCR1依赖性的细胞迁移、病变等CCR1相关的疾病，本发明的单克隆抗体或该抗体片段能够用于任何人CCR1相关疾病的治疗。
含有本发明的单克隆抗体或该抗体片段的治疗剂可以仅含有作为有效成分的该抗体或该抗体片段，但通常优选以与药理学上可接受的一种以上的载体一起混合、利用制剂学技术领域中公知的方法制造而成的药物制剂的形式提供。
作为给药途径，可以列举例如经口给药或口腔内、呼吸道内、直肠内、皮下、肌肉内或静脉内等非经口给药。作为给药形态，可以列举例如喷雾剂、胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、栓剂、注射剂、软膏或贴片剂等。
作为适合于经口给药的制剂，可以列举乳剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等。
乳剂或糖浆剂这样的液体制备物使用水、蔗糖、山梨醇或果糖等糖类、聚乙二醇或聚丙二醇等二醇类、芝麻油、橄榄油或大豆油等油类，对羟基苯甲酸酯类等防腐剂、或者草莓香料或薄荷等香料类等作为添加剂来制造。
胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等使用乳糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇等赋形剂、淀粉或海藻酸钠等崩解剂、硬脂酸镁或滑石等润滑剂、聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶等粘结剂、脂肪酸酯等表面活性剂或甘油等增塑剂等作为添加剂来制造。
作为适合于非经口给药的制剂，为注射剂、栓剂或喷雾剂等。注射剂使用由盐溶液或葡萄糖溶液或者这两者的混合物构成的载体等来制造。栓剂使用可可脂、氢化脂肪或羧酸等载体来制造。
喷雾剂使用不刺激接受者的口腔和呼吸道粘膜并且使本发明的单克隆抗体或该抗体片段以微细粒子的形式分散从而容易吸收的载体等来制造。作为载体，使用例如乳糖或甘油等。另外，也可以以气溶胶或干粉的形式制造。此外，上述非经口剂中也可以添加在适合于经口给药的制剂中作为添加剂所例示的成分。
6.使用本发明的抗人CCR1单克隆抗体或该抗体片段的疾病的诊断方法
通过使用本发明的单克隆抗体或该抗体片段对人CCR1或表达人CCR1的细胞进行检测或测定，能够对人CCR1相关疾病进行诊断。
作为人CCR1相关疾病的癌疾病、自身免疫性疾病和炎性疾病的诊断例如可以利用免疫学方法对患者体内存在的人CCR1进行检测或测定。另外，可以通过使用流式细胞术等免疫学方法检测在患者体内的细胞上表达的人CCR1来进行诊断。
免疫学方法是指使用实施了标记的抗原或抗体等对抗体量或抗原量进行检测或测定的方法。例如使用放射性物质标记免疫抗体法、酶联免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、蛋白免疫印迹法或物理化学方法等。
放射性物质标记免疫抗体法例如是使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进一步使实施了放射线标记的抗免疫球蛋白抗体或该抗体片段进行反应，然后利用闪烁计数仪等进行测定。
酶联免疫测定法例如是使本发明的抗体或该抗体片段与抗原或表达抗原的细胞等反应，进一步使利用酶等实施了标记的抗免疫球蛋白抗体或该抗体片段进行反应，然后添加底物并利用吸光光度计测定反应液的吸光度。例如使用夹心ELISA法等。作为酶联免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知[酶联免疫测定法、医学书院(1987)]的酶标记。
例如使用碱性磷酸酶标记、过氧化物酶标记、荧光素酶标记或生物素标记等。夹心ELISA法是使抗体结合于固相上后、使其捕获作为检测或测定对象的抗原并使第二抗体与被捕获的抗原反应的方法。在该ELISA法中，准备作为对想要检测或测定的抗原进行识别的抗体或抗体片段的、抗原识别位点不同的两种抗体，预先使其中的第一抗体或抗体片段吸附至板(例如96孔板)上，接着将第二抗体或抗体片段预先用FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶或生物素等进行标记。在吸附有上述抗体的板上使从生物体内分离的细胞或其破碎液、组织或其破碎液、细胞培养上清、血清、胸水、腹水或眼液等进行反应，然后使标记的单克隆抗体或抗体片段进行反应，并进行与标记物质对应的检测反应。利用将浓度已知的抗原进行连续稀释而制作的标准曲线，算出受试样品中的抗原浓度。作为夹心ELISA法中使用的抗体，可以使用多克隆抗体或单克隆抗体中的任何一种，也可以使用Fab、Fab’或F(ab)2等抗体片段。作为夹心ELISA法中使用的两种抗体的组合，可以是识别不同表位的单克隆抗体或抗体片段的组合，也可以是多克隆抗体与单克隆抗体或抗体片段的组合。
荧光免疫测定法利用文献[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]等中记载的方法进行测定。作为荧光免疫测定法中使用的标记物，可以使用公知[荧光抗体法、SoftScience公司(1983)]的荧光标记。例如使用FITC或RITC等。
发光免疫测定法利用文献[生物发光与化学发光临床检查42、广川书店(1998)]等中记载的方法进行测定。作为发光免疫测定法中使用的标记物，可以列举公知的发光物标记，使用吖啶酯或洛酚碱等。
蛋白免疫印记法通过将抗原或表达抗原的细胞等利用SDS(十二烷基硫酸钠)-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)[Antibodies-A Laboratory Manual、冷泉港实验室(1988)]分级分离后，将该凝胶印迹至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜或硝酸纤维素膜上，使识别抗原的抗体或抗体片段与该膜进行反应，进而使实施了FITC等荧光物质、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等的抗小鼠IgG抗体或结合片段进行反应，然后使该标记可见化来进行测定。
以下示出一例。将表达具有序列号2的氨基酸序列的多肽的细胞或组织溶解，在还原条件下使每个泳道的蛋白量为0.1～30μg，利用SDS-PAGE法进行电泳。将电泳后的蛋白转录至PVDF膜上，在含有1～10％BSA的PBS(以下记为BSA-PBS)中在室温下反应30分钟，进行封闭操作。在此，使本发明的单克隆抗体进行反应，用含有0.05～0.1％的Tween-20的PBS(以下记为Tween-PBS)进行清洗，并使过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG在室温下反应2小时。用Tween-PBS进行清洗，使用ECL蛋白免疫印迹检测试剂(安玛西亚公司制造)等对结合有单克隆抗体的条带进行检测，由此对具有序列号2的氨基酸序列的多肽进行检测。作为利用蛋白免疫印迹法的检测中使用的抗体或该抗体片段，使用能够与未保持天然型立体结构的多肽结合的抗体。
物理化学方法例如通过使作为抗原的人CCR1与本发明的单克隆抗体或该抗体片段结合而形成聚集物并检测该聚集体来进行。作为其他物理化学方法，还可以列举毛细管法、单向免疫扩散法、免疫比浊法或乳胶免疫比浊法[临床检查法提要、金原出版(1998)]等。乳胶免疫比浊法中，使用以抗体或抗原致敏的粒径约0.1μm～约1μm的聚苯乙烯乳胶等载体，利用对应的抗原或抗体引起抗原抗体反应时，反应液中的散射光增加，透射光减少。以吸光度或积分球浊度的形式检测该变化，由此测定受试样品中的抗原浓度等。
表达人CCR1的细胞的检测或测定可以使用公知的免疫学检测法，其中优选使用免疫沉淀法、免疫细胞染色法、免疫组织染色法或荧光抗体染色法等。
免疫沉淀法中，使表达人CCR1的细胞等与本发明的单克隆抗体或该抗体片段反应后，加入对蛋白G-琼脂糖等免疫球蛋白具有特异性结合能力的载体，使抗原抗体复合物沉淀。或者也可以利用下述方法进行。使上述本发明的单克隆抗体或该抗体片段固相化于ELISA用96孔板上，然后利用BSA-PBS进行封闭。在抗体为例如杂交瘤培养上清等未进行纯化的状态的情况下，使抗小鼠免疫球蛋白、抗大鼠免疫球蛋白、蛋白A或蛋白G等预先固相化于ELISA用96孔板上，利用BSA-PBS进行封闭后，分注杂交瘤培养上清使其进行结合。接着，弃去BSA-PBS并用PBS充分清洗后，使表达人CCR1的细胞或组织的溶解液进行反应。利用SDS-PAGE用样品缓冲液从充分清洗后的板上提取免疫沉淀物，通过上述蛋白免疫印迹法进行检测。
免疫细胞染色法或免疫组织染色法为下述方法：将表达抗原的细胞或组织等根据情况用表面活性剂或甲醇等进行处理以使抗体的透过性良好，然后与本发明的抗体进行反应，进而与实施了FITC等荧光标记、过氧化物酶等酶标记或生物素标记等的抗免疫球蛋白抗体或其结合片段进行反应，然后使该标记可见化并利用显微镜进行显微观察。另外，可以通过使细胞与荧光标记的抗体反应并利用流式细胞仪进行分析的荧光抗体染色法[Monoclonal Antibodies-Principles and practice、第三版、学术出版社(1996)；单克隆抗体实验手册、讲谈社Scientific(1987)]来进行检测。特别地，与人CCR1结合的本发明的单克隆抗体或该抗体片段可以利用荧光抗体染色法对保持天然型立体结构而表达的细胞进行检测。
另外，荧光抗体染色法中，在使用FMAT8100HTS系统(应用生物系统公司制造)等的情况下，可以在不对形成的抗体-抗原复合物与未参与抗体-抗原复合物形成的游离抗体或抗原进行分离的情况下测定抗原量或抗体量。
以下，利用实施例具体地对本发明进行说明，但本发明不受下述实施例的限定。
实施例
[实施例1]人、小鼠CCR1的表达载体的制作
(1)各CCR1基因的制作
合成下述1～7的编码人或小鼠的CCR1或CCR1-CCR3嵌合受体的DNA(GenScriptJapan公司)。合成时附加用于整合到各载体中的限制酶位点(BamHI和NotI)和Kozak序列。
1.编码人CCR1(以下记为hCCR1)的cDNA序列(序列号1)
2.编码小鼠CCR1(以下记为mCCR1)的cDNA序列(序列号3)
3.编码人CCR3(以下记为hCCR3)的cDNA序列(序列号5)
4.编码将人CCR1的第1位至第31位的氨基酸序列置换为人CCR3的相应的N末端的氨基酸序列而得到的嵌合受体(以下记为NC3-hCCR1)的cDNA序列(序列号6)
5.编码将小鼠CCR1的第1位至第31位的氨基酸序列置换为人CCR3的相应的N末端的氨基酸序列而得到的嵌合受体(以下记为NC3-mCCR1)的cDNA序列(序列号7)
6.编码将人CCR3的第171位至第194位的氨基酸序列置换为人CCR1的第171位至第194位的氨基酸序列而得到的的嵌合受体(以下记为hCCR3_EL2hCCR1)的cDNA序列(序列号8)
7.编码将人CCR3的第171位至第194位的氨基酸序列置换为小鼠CCR1的第171位至第194位的氨基酸序列而得到的嵌合受体(以下记为hCCR3_EL2mCCR1)的cDNA序列(序列号9)
(2)人CCR1表达载体的制作
用限制酶BamHI和NotI(New England Biolab公司)对上述(1)-1中合成的编码hCCR1的DNA进行处理，对DNA片段进行纯化。用相同的限制酶对Tol2转座子载体(国际公开第2010/143698号)(以下记为Tn-pMug-Hygro)进行处理，与编码CCR1的DNA片段混合后，通过DNA连接酶(宝生物公司)处理进行连接。将连接后的DNA导入至大肠杆菌感受态细胞(宝生物公司)中，从获得了抗药性的菌落中筛选出具有目标质粒DNA的大肠杆菌株。将该大肠杆菌株再次进行培养，从培养液中纯化出转染用的DNA(以下，将这样制作的质粒表示为hCCR1/Tn-pMug-Hygro)。
(3)各种CCR表达载体的制作
利用与上述(2)同样的方法，将上述(1)中合成的mCCR1、hCCR3、NC3-hCCR1、NC3-mCCR1、hCCR3_EL2hCCR1、hCCR3_EL2mCCR1与Tn-pMug-Hygro连接，构建表达载体(以下，分别表示为mCCR1/Tn-pMug-Hygro、hCCR3/Tn-pMug-Hygro、NC3-hCCR1/Tn-pMug-Hygro、NC3-mCCR1/Tn-pMug-Hygro、hCCR3_EL2hCCR1/Tn-pMug-Hygro、hCCR3_EL2mCCR1/Tn-pMug-Hygro)。
(4)mCCR1表达载体的制作
利用与上述(2)同样的方法，将上述(1)中合成的编码mCCR1的DNA与在pCAGGS[Gene.1991 Dec 15；108(2):193-9.]上附加有内部核糖体进入位点(internal ribosomalentry site；IRES)和新霉素抗性基因的载体pCAG-IRES-neo连接，构建表达载体(以下表示为mCCR1/pCAG-IRES-neo)。
[实施例2]CCR1表达细胞株的制作
(1)hCCR1表达细胞的制作
将作为实施例1中制作的质粒DNA的hCCR1/Tn-pMug-Hygro和Tol2转座酶表达载体TPEX_pMug(国际公开第2013/005649号)共导入至CHO-S(Thermo Fisher Scientific公司)中，制作表达细胞株。基因导入使用Fugene HD(普洛麦格公司)如下进行。在6孔板中接种制备成1×105细胞/mL的细胞各2.5mL，24小时后在培养液中添加hCCR1/Tn-pMug-Hygro、TPEX_pMug、Fugene HD的混合物。添加后72小时后，添加1mg/mL的潮霉素(Invitrogen公司)，进行约2周的药剂筛选。回收获得了抗药性的细胞，利用流式细胞术(FACS Calibur、BDBiosciences公司)进行表达分析，结果确认到所导入的hCCR1的表达。将该细胞株表示为CHO-S-hCCR1。
(2)各种CCR表达细胞的制作
对于实施例1中制作的mCCR1/Tn-pMug-Hygro、hCCR3/Tn-pMug-Hygro、NC3-hCCR1/Tn-pMug-Hygro、NC3-mCCR1/Tn-pMug-Hygro、hCCR3_EL2hCCR1/Tn-pMug-Hygro和hCCR3_EL2mCCR1/Tn-pMug-Hygro，利用与上述(1)同样的方法导入至CHO-S细胞中，制作表达细胞株。以下，将这些细胞株分别表示为CHO-S-mCCR1、CHO-S-hCCR3、CHO-S-NC3-hCCR1、CHO-S-NC3-mCCR1、CHO-S-hCCR3_EL2hCCR1和CHO-S-hCCR3_EL2mCCR1。
(3)RL33-hCCR1细胞的制作
将实施例1中制作的hCCR1/Tn-pMug-Hygro和Tol2转座酶表达载体TPEX_pMug(国际公开第2013/005649号)共导入至兔细胞株RL-33[Yoshii et al.,Jpn J Med SciBiol.1977Jun；30(3):149-57]中，制作hCCR1表达细胞株。基因导入使用LipofectamineLTX(Thermo Fisher Scientific公司)如下进行。在6孔板中接种制备成1×105细胞/mL的细胞各2mL，在培养基中添加2.5μg的质粒DNA、5μL的Lipofectamine LTX的混合物。添加后72小时后，添加1mg/mL的新霉素，进行约2周的药剂筛选。回收获得了抗药性的细胞，利用流式细胞术进行表达分析，结果确认到所导入的hCCR1的表达。以下，将该细胞株表示为RL33-hCCR1。
(4)RL33-mCCR1细胞的制作
利用与上述(3)同样的方法将实施例1(4)中制作的mCCR1/pCAG-IRES-neo导入至RL-33中，制作表达细胞株。药剂筛选利用0.5mg/mL的G418来进行。以下，将该细胞株表示为RL33-mCCR1。
[实施例3]抗CCR1兔多克隆抗体的制作
利用以下的方法制作抗CCR1兔多克隆抗体。合成人CCR1的N末端肽(序列号10)，对2只兔(新西兰白兔)以2周的间隔进行5次免疫。免疫仅在首次使用完全弗氏佐剂(CFA)，第二次以后使用不完全弗氏佐剂(IFA)，在背部的多个部位以皮下注入进行免疫。免疫后从抗体效价上升的个体中采集血清，通过利用蛋白A柱(GE Healthcare公司)的亲和纯化对IgG进行纯化。将这样制作的抗CCR1兔多克隆抗体表示为E5971。
[实施例4]利用流式细胞术进行的表达分析
(1)CCR1表达的确认
对于实施例2中制作的CCR1表达细胞株，使用实施例3中制作的抗CCR1兔多克隆抗体E5971进行染色，利用流式细胞术(FCM)确认CCR1的表达。FCM分析如下进行。将细胞以2×105细胞/孔接种至96孔板中，利用染色缓冲液[3％FBS(Thermo Fisher Scientific公司)/DPBS(Nacalai Tesque公司)/0.1％叠氮化钠(Nacalai Tesque公司)]进行清洗。利用10μg/mL的E5971对该细胞在冰上进行1小时处理，利用染色缓冲液进行清洗后，以终浓度1μg/mL添加二次抗体Alexa Fluor647山羊抗兔IgG(Thermo Fisher Scientific公司制造)，在室温下处理30分钟。对于该细胞，再次利用染色缓冲液进行清洗后，在染色缓冲液中悬浮，使用BD FACSCalibur(BD Biosciences公司)进行分析。由此，能够确认所制作的CCR1表达细胞株表达了导入的CCR1。
(2)CCR3表达的确认
对于实施例2中制作的CHO-S-hCCR3，利用与上述(1)同样的方法确认CCR3的表达。一次抗体使用市售的作为抗CCR3抗体的444-11抗体(MBL公司)，二次抗体使用Alexa Fluor647山羊抗小鼠IgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific公司)。由此，能够确认利用CHO-S-hCCR3导入的CCR3进行了表达。
[实施例5]使用CCR1敲除小鼠的单克隆抗体的制作
为了得到小鼠交叉性抗体，使用市售的CCR1敲除(KO)小鼠(B6.129S4-Ccr1tm1GaoN10+N5)(Taconic公司)制作单克隆抗体。抗体制作按照下述过程进行。
(1)免疫致敏
作为免疫原，使用实施例2中制作的CHO-S-hCCR1、CHO-S-mCCR1、RL33-hCCR1和RL33-mCCR1。每一次免疫使用1×107细胞/只。对5～9周龄的CCR1 KO小鼠仅初次免疫时施加作为佐剂的Alum凝胶(LSL公司)(80μL/只)和百日咳疫苗(Nacalai Tesque公司)(1×107细胞/只)，通过腹腔内给药进行免疫致敏。任何一次免疫均按照给药量为500μL/只的方式用PBS进行制备。在初次免疫两周后进行第二次免疫，进而在一周后进行第三次免疫，三天后进行部分采血。
(2)抗血清评价(FCM)
使用实施例2中制作的各种CCR1表达细胞，通过FCM对血清中的特异性抗体效价进行测定。测定按照下述过程进行。将细胞分别以1×105细胞/孔的方式用1％BSA(NacalaiTesque公司)-PBS(Nacalai Tesque公司)[包含0.02％EDTA(Nacalai Tesque公司)、0.05％NaN3(Nacalai Tesque公司)]进行制备，以50μL/孔分注于96孔细胞培养用U型底的板中。将作为受试样品的从被免疫动物采集的血清按照终浓度200倍稀释、1000倍稀释和5000倍稀释的方式用1％BSA-PBS(0.02％EDTA、0.05％NaN3)进行制备，以50μL/孔分注于上述板中，在4℃下放置30分钟。离心分离(2000rpm、2分钟)后抽吸上清，利用微孔板振荡器使细胞的团块解体。以200μL/孔分注1％BSA-PBS(0.02％EDTA、0.05％NaN3)，再次离心分离(2000rpm、2分钟)后抽吸上清，利用微孔板振荡器使细胞的团块解体。将Alexa Fluor647山羊抗小鼠IgG(H+L)或Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG(H+L)以最终为300倍稀释的方式用1％BSA-PBS(0.02％EDTA、0.05％NaN3)进行制备，以50μL/孔分注于上述板中，在遮光下在4℃放置30分钟。离心分离(2000rpm、2分钟)后抽吸上清，利用微孔板振荡器使细胞的团块解体。以200μL/孔分注1％BSA-PBS(0.02％EDTA、0.05％NaN3)，再次离心分离(2000rpm、2分钟)后抽吸上清，利用微孔板振荡器使细胞的团块解体。以50μL/孔向其中分注1％BSA-PBS(0.02％EDTA、0.05％NaN3)，利用流式细胞仪[FACSCanto(商标)II/BD]测定荧光强度。由此，筛选出确认到抗体效价上升的个体，摘除其脾脏。
(3)通过细胞融合进行的杂交瘤制作
将小鼠骨髓瘤细胞株P3-U1(P3X63Ag8U.1、ATCC CRL-1597)在S-Clone克隆培养基(EIDIA公司)中培养而进行无血清驯化后，作为细胞融合的亲本株来使用。以无菌方式采集被免疫动物的脾脏，利用红细胞裂解缓冲液(Sigma-Aldrich公司)进行溶血后，用PBS清洗两次，按照脾细胞与P3-U1的细胞数为脾脏细胞:P3-U1＝8:1的方式混合，进行离心分离(1200rpm、5分钟)。将所得到的沉淀级分的细胞群充分打散后，一边搅拌一边在37℃下添加1g的聚乙二醇-1000(PEG-1000、纯正化学公司)、1mL的MEM培养基(Nacalai Tesque公司)和0.35mL的二甲亚砜(Sigma-Aldrich公司)的混合液0.5mL，每一分钟向其中添加1mL的MEM培养基，添加5次后，加入MEM培养基使全量为50mL。对细胞悬浮液进行离心分离(900rpm、5分钟)，将所得到的沉淀级分的细胞轻轻打散后，利用添加有HAT补充剂(Thermo FisherScientific公司)的S-Clone克隆培养基使脾脏细胞以1.5×107细胞/9mL的细胞浓度悬浮。预先在96孔培养用板中以100μL/孔分注添加有HAT的克隆培养基，向其中以100μL/孔分别分注细胞悬浮液，在CO2培养箱(5％CO2、37℃)中培养8～10天。
(4)杂交瘤的筛选
通过FCM对杂交瘤培养上清中包含的抗体与CCR1的结合活性进行评价。受试样品使用杂交瘤培养上清，染色和测定按照与上述(2)同样的过程来实施。
(5)杂交瘤的亚克隆
对于通过筛选呈阳性的孔的细胞进行亚克隆，在克隆培养基中培养约7～10天。
(6)抗体亚类的決定
使用亚类特异性的二次抗体通过FCM确定各抗体的亚类。染色、测定的过程与上述(2)同样地进行。受试样品使用杂交瘤培养上清。检测抗体使用Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG(H+L)(Thermo Fisher Scientific公司)和各亚类特异性的抗体(Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG1(Thermo Fisher Scientific公司)、Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG2a(ThermoFisher Scientific公司)、Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG2b(Thermo Fisher Scientificedium公司)、Alexa Fluor488山羊抗小鼠IgG3)(Thermo Fisher Scientific公司)。
(7)从杂交瘤培养上清中的抗体纯化
从如上所述克隆的杂交瘤的培养上清中对抗体进行纯化。纯化使用蛋白G琼脂糖4Fast Flow(GE Healthcare公司)。对培养上清进行离心分离，除去沉淀物，用过滤器进行过滤。在柱中填充400μL的载体，用DPBS置换缓冲液。添加培养上清，使抗体吸附于单体上后，用10mL的DPBS清洗两次。添加0.4mL的IgG洗脱缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司)进行洗脱，之后立即用0.1mL的1M Tris-HCl(NIPPON GENE公司)pH8.6进行中和。使用NAP柱(GE Healthcare公司)进行脱盐和向DPBS的缓冲液置换，用于之后的分析。将所制作的抗体的克隆名、来源和亚类示于表1。
[表1]
Figure BDA0002373893050000801
[实施例6]THP-1迁移(趋化性)检测
作为表达CCR1的人细胞株，已知人单核细胞性白血病细胞株THP-1。已知该细胞对CCL3、CCL5、CCL15或CCL23等CCR1配体的浓度梯度显示出趋化性，使用THP-1的迁移检测是作为CCR1抑制剂的评价系统而被通用的系统。因此，对实施例5中得到的抗人CCR1抗体，也使用该实验系统来评价是否抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化。
迁移检测的方法如下所述。THP-1细胞从ATCC获得。将THP-1细胞在5μM全反式维甲酸(ATRA)(和光纯药工业公司)存在下培养3天，分化诱导后进行回收，在37℃下用加温的检测培养基[1％FBS(Thermo Fisher Scientific公司)/RPMI1640(Nacalai Tesque公司)]清洗后，重悬于该培养基中。制备成1×106细胞/mL，以100μL/孔将细胞分注于孔径5μm的Transwell(Corning公司、#3421)的上层。在下层中加入添加有作为趋化因子的1ng/mL的重组人CCL15(68aa)(R&D technologies公司、#628-LK)的检测培养基，在37℃下在5％CO2培养箱内培养4-6小时后，利用Celltiter-Glo(普洛麦格公司)对移动至下层的细胞数进行定量。
使用本测定系统评价纯化抗体的细胞迁移时，预先在1.5mL管内将90μL的细胞悬浮液与10μL的纯化抗体溶液混合，在37℃下温育1小时后，将细胞分注于Trasnwell的上层。抗体的终浓度调节至0.3μg/mL、1μg/mL、3μg/mL和10μg/mL，用于测定。
将所得到的结果示于图1(a)和图1(b)。如图1(a)和图1(b)所示，实施例5中得到的小鼠抗人CCR1单克隆抗体KM5907抗体、KM5908抗体、KM5909抗体、KM5911抗体、KM5915抗体、KM5916抗体、KM5954抗体、KM5955抗体和KM5956抗体均以浓度依赖的方式抑制了由活化CCL15诱导的THP-1的迁移。
由以上表明，本发明的小鼠抗人CCR1单克隆抗体均为抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化的抗体。
[实施例7]抗人CCR1抗体的人CCR1结合区域的确定
使用CCR1-CCR3嵌合受体表达细胞，通过FCM考察实施例5中得到的小鼠抗人CCR1单克隆抗体的人CCR1的结合区域。测定通过与实施例4同样的方法进行。
作为CCR1-CCR3嵌合受体表达细胞，使用实施例2中制作的CHO-S-hCCR3、CHO-S-NC3-hCCR1、CHO-S-NC3-mCCR1和CHO-S-hCCR3_EL2hCCR1。另外，作为阴性对照，使用CHO-S。
作为受试抗体，使用10倍稀释的各杂交瘤培养上清、现有的小鼠抗人CCR1单克隆抗体53504抗体(R&D Technologies公司)和小鼠抗人CCR3单克隆抗体444-11抗体(MBL公司)。
关于测定结果，将用某种受试抗体(各杂交瘤培养上清、53504抗体或444-11抗体)和二次抗体对某种细胞进行染色时的荧光强度除以仅用二次抗体对该细胞进行染色时的荧光强度。所得到的数值为10以上时，判定为该受试抗体与该细胞结合，小于10时，判定为该受试抗体不与该细胞结合，在表2中分别用○、×来表示。
[表2]
Figure BDA0002373893050000821
根据表2，小鼠抗人CCR1单克隆抗体KM5907抗体、KM5908抗体、KM5909抗体、KM5911抗体、KM5915抗体、KM5916抗体、KM5954抗体、KM5955抗体和KM5956抗体均不与CHO-S-hCCR3结合，与CHO-NC3-hCCR1和CHO-S-hCCR3_EL2hCCR1这两者结合。因此可知，本发明的小鼠抗人CCR1单克隆抗体均与人CCR1的细胞外环2结合。
[实施例8]使用现有的抗人CCR1抗体和抗人CCR1抗体的趋化性检测
(1)现有的小鼠抗人CCR1单克隆抗体2D4抗体的制备
从ATCC获得产生作为现有的抗人CCR1抗体的2D4抗体(美国专利第6756035号说明书)的杂交瘤(LS-125-2D4-11-10-1)。使用Hybridoma-SFM(Thermo Fisher Scientific公司)对该杂交瘤进行培养，从培养上清中对抗体进行纯化。纯化使用蛋白G琼脂糖4FastFlow(GE Healthcare公司)。对培养上清进行离心分离，将所得到的培养上清用过滤器进行过滤。在柱中填充400μL的载体，用DPBS置换缓冲液。在该柱中添加该培养上清，使抗体吸附于载体上后，用10mL的DPBS清洗两次。在该柱中添加0.4mL的IgG洗脱缓冲液(ThermoScientific公司)，使抗体洗脱，立即用0.1mL的1M Tris-Cl(Nacalai Tesque公司)pH8.6对抗体溶液进行中和。使用NAP柱(GE Healthcare公司)进行该抗体溶液的脱盐和向DPBS的缓冲液置换，用于之后的分析。
对于纯化的2D4抗体，利用通常的方法进行还原条件下的SDS-PAGE，确认了抗体已被纯化。
另外，按照实施例4中记载的方法通过FCM确认2D4抗体对人CCR1的结合活性。使2D4抗体以0.1、1μg/mL进行反应，细胞使用CHO-S-hCCR1作为人CCR1表达细胞，使用CHO-S作为阴性对照。其结果，2D4抗体不与CHO-S结合，以浓度依赖的方式与CHO-S-hCCR1结合。因此能够确认，纯化的2D4抗体与市售的141-2抗体(MBL公司)和53504抗体(R&D Systems公司)同样地具有对人CCR1的结合性。
(2)趋化性检测
对于现有的抗人CCR1抗体以及实施例5中得到的小鼠抗人CCR1抗体单克隆抗体KM5908抗体和KM5916抗体，按照实施例6中记载的方法测定对人CCR1的活化进行抑制的活性，将各抗体所得到的结果进行比较。
作为现有的抗人CCR1抗体，使用(1)中制作的2D4抗体以及市售的141-2抗体和53504抗体。
将所得到的结果示于图2。如图2所示出，作为现有的抗人CCR1抗体的2D4抗体、141-2抗体和53504抗体均不抑制由活化CCL15诱导的THP-1细胞的迁移，另一方面，本发明的小鼠抗人CCR1单克隆抗体KM5908抗体和KM5916抗体均以浓度依赖的方式抑制上述细胞的迁移。
如实施例6中所记载，实施例5中获得的抗人CCR1抗体均在与本实施例相同的实验条件下以抗体浓度依赖的方式抑制由活化CCL15诱导的THP-1细胞的迁移[图1(a)和图1(b)]。
因此可知，现有的抗人CCR1抗体不抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化，另一方面，实施例5中得到的小鼠抗人CCR1单克隆抗体KM5907抗体、KM5908抗体、KM5909抗体、KM5911抗体、KM5915抗体、KM5916抗体、KM5954抗体、KM5955抗体和KM5956抗体均为抑制由人CCL15引起的人CCR1的活化的抗体。
[实施例9]基因重组抗体的制作
(1)抗体可变区基因的克隆和序列确定
使用Trizol(Life Technologies公司)从实施例5中克隆的杂交瘤中提取总RNA，利用5’-RACE法对抗体基因进行扩增。RACE用cDNA的合成中使用SMARTer RACE试剂盒(Clontech公司)。通过使用对于在RACE用cDNA合成过程中附加的序列具有特异性的引物和小鼠Igγ链或κ链扩增用引物(序列号11-14)的PCR扩增抗体可变区片段，进行克隆并对该DNA片段的碱基序列进行确认。
对于实施例5中得到的各抗人CCR1抗体，将表示编码重链和轻链的可变区的氨基酸序列的碱基序列、由该碱基序列推定的氨基酸序列和由该氨基酸序列除去了信号序列的氨基酸序列的序列号分别示于表3。此外，将表示本发明的各抗体的CDR的氨基酸序列的序列号分别示于表4。
[表3]
Figure BDA0002373893050000851
[表4]
Figure BDA0002373893050000852
(2)嵌合抗体的表达载体的制作
对于实施例5中制作的各抗人CCR1抗体，通过以下记载的方法制作将恒定区置换为包含S228P、L235E和R409K的氨基酸改造的人IgG4恒定区(人IgG4PE_R409K)的嵌合抗体。以(1)中制作的克隆了编码各抗体的可变区的氨基酸序列的碱基序列的质粒DNA作为模板，通过使用附加有同源重组用的碱基序列的引物的PCR对编码各抗体的可变区的氨基酸序列的碱基序列进行扩增。使用In-Fusion HD克隆试剂盒(Clontech公司)，将该碱基序列与N5KG4PE R409K载体[将N5KG1载体(美国专利第6001358号说明书)中的编码人IgG1的恒定区的碱基序列置换为编码包含上述氨基酸改造的突变人IgG4的恒定区的碱基序列的载体(以下记为N5KG4PE R409K载体)]连接，制作嵌合抗体的表达载体。实验的过程按照试剂盒附带的操作说明来进行。
(3)嵌合抗体的产生和纯化
使用(2)中制作的表达载体和Expi293表达系统(Life Technologies公司)，产生嵌合抗体。过程按照附带的操作说明如下进行。将Expi293F细胞(Thermo FisherScientific公司)以2×106细胞/mL的密度在37℃下培养24小时，然后对每一反应在42.5mL的Expi293表达培养基(Thermo Fisher Scientific公司)中添加1.25×108细胞。在Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific公司)中添加50μg的质粒DNA和ExpiFectamin 293试剂(Thermo Fisher Scientific公司)，静置30分钟后，将该质粒溶液添加至上述的细胞液中。进一步培养一晩后，在该细胞液中添加ExpiFectamin 293转染增强剂(培养体积总计为50mL)。将该细胞液培养7～10天后，回收培养上清。
抗体的纯化使用蛋白G琼脂糖4Fast Flow(GE Healthcare公司)。将回收的培养上清离心分离，用过滤器对所得到的培养上清进行过滤。在柱中填充400μL的载体，用DPBS置换缓冲液。在该柱中添加培养上清，使抗体吸附于单体上后，用10mL的DPBS将该柱清洗两次。在该柱中添加0.4mL的IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific公司)，使抗体洗脱，立即在该抗体溶液中加入0.1mL的1M Tris-Cl pH8.6进行中和。使用NAP柱(GE Healthcare公司)对该抗体溶液进行脱盐，用于之后的分析。
将这样得到的小鼠抗人CCR1单克隆抗体KM5907抗体、KM5908抗体、KM5909抗体、KM5911抗体、KM5915抗体、KM5916抗体、KM5954抗体、KM5955抗体和KM5956抗体的嵌合抗体分别记为chKM5907抗体、chKM5908抗体、chKM5909抗体、chKM5911抗体、chKM5915抗体、chKM5916抗体、chKM5954抗体、chKM5955抗体和chKM5956抗体。
[实施例10]嵌合抗体的结合性的评价
对于实施例9中制作的嵌合抗体chKM5907抗体、chKM5908抗体、chKM5909抗体、chKM5911抗体、chKM5915抗体、chKM5916抗体、chKM5954抗体、chKM5955抗体和chKM5956抗体，按照实施例4中记载的方法通过FCM测定抗体对人和小鼠CCR1的结合性。作为人CCR1表达细胞和小鼠CCR1表达细胞，分别使用实施例2中制作的CHO-S-hCCR1、CHO-S-mCCR1。其结果，chKM5955抗体显示出与人CCR1的结合。其他嵌合抗体显示出与人和小鼠CCR1两者的结合。
[实施例11]使用嵌合抗体的趋化性检测
对于实施例9中制作的嵌合抗体chKM5907抗体、chKM5908抗体、chKM5909抗体、chKM5911抗体、chKM5915抗体、chKM5916抗体、chKM5954抗体、chKM5955抗体和chKM5956抗体，按照实施例6中记载的方法进行抑制人CCR1活化的活性测定。其结果表明，任何一种嵌合抗体均抑制由活化人CCL15引起的THP-1的迁移。
[实施例12]置换了VL的chKM5908抗体改造体的制作
为了进一步对chKM5908抗体进行改良，研究了将chKM5908抗体的VL置换为其他抗CCR1嵌合抗体的VL的抗体的制作。作为进行置换的VL，基于利用实施例5中记载的方法获得的小鼠抗人CCR1抗体，对多种利用实施例10中记载的方法制作的嵌合抗体的VL进行了研究。其中，以下记载了将按照THP-1迁移活性等基准筛选出的、VL被置换为chKM5914抗体的VL而得到的chKM5908抗体改造体的制作。
(1)VL置换嵌合抗体的设计
进行置换的chKM5914的VL由于与chKM5908的VL的氨基酸序列的同源性高而被选择。将编码chKM5914抗体的VL的氨基酸序列的碱基序列、由该碱基序列推定的包含信号序列的氨基酸序列和从该氨基酸序列中除外信号序列的氨基酸序列分别示于序列号123、124和125。另外，将chKM5914抗体的VL的CDR1～3的氨基酸序列分别示于序列号126～128。
(2)表达载体的制作
以克隆了编码chKM5914抗体的VL可变区的氨基酸序列的碱基序列的质粒DNA作为模板，通过使用附加有同源重组用的碱基序列的引物的PCR对编码各抗体的VL可变区的氨基酸序列的碱基序列进行扩增。对chKM5908 VH可变区也同样地进行扩增。使用In-FusionHD克隆试剂盒(Clontech公司)，将该碱基序列与N5hK载体(L链用表达载体)或N5hG4PE_R409K载体(H链用表达载体)连接，制作嵌合抗体的表达载体。实验的过程按照试剂盒附带的操作说明来进行。对大肠杆菌DH5α感受态细胞(宝生物公司)进行转化，确认所得到的质粒的序列。筛选出产生插入了正确的碱基序列的质粒的大肠杆菌的菌落，使用NucleoBondXtra Midi EF试剂盒(宝生物公司)制备质粒。
(3)VL置换嵌合抗体的产生和纯化
使用Expi293表达系统(Life Technologies公司)使目标VL置换嵌合抗体进行瞬时性表达。质粒导入的方法按照附带的资料进行。轻链的表达载体与重链的表达载体以1:2的比率混合而导入。将质粒导入后的细胞在120mL的培养液中在37℃、5％CO2、125rpm的条件下培养3天。然后，进行细胞培养悬浮液的离心分离，在0.2μm过滤器(Thermo Scientific公司)中通过并回收培养上清。通过使用MabSelect SuRe(GE Healthcare公司)的亲和纯化从培养上清中获得纯化抗体。
具体而言，用PBS将填充于柱中的树脂平衡化后，在该柱中添加培养上清，用PBS清洗两次，用洗涤缓冲液1(PBS中的1M NaCl)、洗涤缓冲液2(20mM柠檬酸、50mM NaCl、pH5.0)各清洗一次后，使用洗脱缓冲液(20mM柠檬酸、50mM NaCl、pH3.4)将抗体洗脱。
在所得到的抗体溶液中加入1/10量的中和缓冲液(1M磷酸-NaOH、pH7.0)进行中和，使用NAP25(GE Healthcare公司)将抗体溶液的溶剂置换为PBS。对于缓冲液置换后的抗体溶液，使用Amicon Ultra-4离心过滤单元(Millipore公司)进行基于超滤的浓缩，使用Nanodrop(Thermo Scientific公司)测定吸光度A280，进行抗体溶液的浓度的测定和调节。在下文的记述中将这样得到的包含chKM5908抗体的VH和chKM5914抗体的VL的嵌合抗体改造体记为chKM5908’抗体。
[实施例13]chKM5908’抗体的抗原结合活性和THP-1迁移抑制活性的评价
通过使用实施例2中制作的CHO-S-hCCR1细胞的流式细胞术，对作为VL置换嵌合抗体的chKM5908’抗体的抗原结合活性进行测定。离心分离并收集细胞，除去上清，在包含2％胎牛血清(FBS)、0.05％NaN3和1mM EDTA的PBS(染色介质、以下简记为SM)中悬浮。接着，按照细胞数为每一孔1×105个的方式接种至96孔板中，添加10000、2000、400、80、16和3.2ng/mL的各最终浓度的chKM5908’抗体，在4℃下进行60分钟的反应。用SM清洗细胞后，添加用SM稀释至500倍的山羊F(ab’)2抗人IgG PE(γ链特异性)(Southern Biotech公司)，在4℃下进行60分钟的反应。用SM清洗细胞后，将细胞重悬在50μL的SM中，利用流式细胞术(FACSCantoII、BD Bioscience公司)测定荧光强度。
数据利用FlowJo 7.65(Tomy Digital Biology公司)进行分析，根据各浓度下的几何平均值对结合强度进行比较。其结果可知，chKM5908’抗体对CHO-S-hCCR1细胞具有与chKM5908同等的结合活性。
另外，对于chKM5908’抗体，利用实施例6中所示的方法进行THP-1迁移抑制活性的测定。抗体浓度以1μg/mL的浓度进行添加。其结果，如图3所示，可知chKM5908’抗体具有与chKM5908抗体同等以上的THP-1迁移抑制活性。
[实施例14]CDR改造chKM5908’抗体改造体的制作和评价
(1)对CDR的氨基酸进行了改造的嵌合抗体改造体的制作和评价
基于chKM5908’抗体，尝试进一步进行CDR改造。将所设计的chKM5908 VH的改造VH示于表5。另外，将所设计的chKM5914 VL的改造VL示于表6。此外，将它们组合而成的CDR改造嵌合抗体改造体示于表7。
[表5]
Figure BDA0002373893050000901
[表6]
Figure BDA0002373893050000902
[表7]
抗体 VH VL
chKM5908’ 5908VH 5914VL
chKM5908’mut01 5908VH 5914VL-m1
chKM5908’mut02 5908VH 5914VL-m2
chKM5908’mut03 5908VH 5914VL-m3
chKM5908’mut04 5908VH 5914VL-m4
chKM5908’mut05 5908VH-m1 5914VL
chKM5908’mut06 5908VH-m2 5914VL
chKM5908’mut07 5908VH-m3 5914VL
chKM5908’mut08 5908VH-m4 5914VL
chKM5908’mut09 5908VH-m5 5914VL
chKM5908’mut10 5908VH-m6 5914VL
chKM5908’mut11 5908VH-m7 5914VL
chKM5908’mut12 5908VH-m8 5914VL
chKM5908’mut13 5908VH-m9 5914VL
chKM5908’mut14 5908VH-m10 5914VL
chKM5908’mut15 5908VH-m11 5914VL
chKM5908’mut16 5908VH-m12 5914VL
chKM5908’mut17 5908VH-m1 5914VL-m1
chKM5908’mut18 5908VH-m3 5914VL-m1
chKM5908’mut19 5908VH-m7 5914VL-m1
chKM5908’mut20 5908VH-m8 5914VL-m1
chKM5908’mut21 5908VH-m1 5914VL-m2
chKM5908’mut22 5908VH-m3 5914VL-m2
chKM5908’mut23 5908VH-m7 5914VL-m2
chKM5908’mut24 5908VH-m8 5914VL-m2
chKM5908’mut25 5908VH-m1 5914VL-m3
chKM5908’mut26 5908VH-m3 5914VL-m3
chKM5908’mut27 5908VH-m7 5914VL-m3
chKM5908’mut28 5908VH-m8 5914VL-m3
chKM5908’mut29 5908VH-m1 5914VL-m4
chKM5908’mut30 5908VH-m3 5914VL-m4
chKM5908′mut31 5908VH-m7 5914VL-m4
chKM5908’mut32 5908VH-m8 5914VL-m4
通过全合成或者通过使用导入了相应突变的引物的装配PCR来制作用于表达这些嵌合抗体改造体所需要的碱基序列，使用实施例12-(2)中所示的方法导入至表达载体中，制作所需要的质粒。接着，使用实施例12-(3)中所示的方法获得嵌合抗体改造体。
使用实施例13中所示的方法对所得到的CDR改造嵌合抗体改造体分别测定抗原结合活性，将与同种型对照嵌合抗体[使用Mol Immunol.1996Jun；33(9):759-68.中记载的编码DNP-1抗体的VL和VH(GenBank登记号：VL U16688、VH U116687)的载体，按照实施例12-(3)中记载的方法制作的抗体；以下记为chDNP1)]相比显示出10倍以上的荧光强度的抗体判定为与人CCR1结合。其结果可知，任何一种CDR改造嵌合抗体改造体从抗体浓度为至少80ng/mL开始均显示出对人CCR1的结合性。
另外，使用实施例13中所示的方法对各个CDR改造抗体进行THP-1迁移抑制活性的评价。其结果可知，任何一种CDR改造嵌合抗体改造体均抑制由活化人CCL15引起的THP-1的迁移。
对于chKM5908’mut02、chKM5908’mut22和chKM5908’mut25，进一步在抗体浓度为10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.75μg/mL、0.5μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL和0.05μg/mL的条件下进行THP-1迁移抑制活性的测定。将结果示于图4。
如图4所示，任何一种抗体均以抗体浓度依赖的方式抑制THP-1细胞迁移。另外可知，chKM5908’mut22与chKM5908’、chKM5908’mut02和chKM5908’mut25相比具有同等或更高的抑制活性。
在下文的记述中，将chKM5908’mut22记为mAb5-06。将mAb5-06的VH和VL的碱基序列和氨基酸序列以及VH和VL各自的CDR1～3的氨基酸序列的序列号示于表8。
[表8]
碱基序列 氨基酸序列 CDR1氨基酸序列 CDR2氨基酸序列 CDR3氨基酸序列
VH 序列号129 序列号130 序列号75 序列号131 序列号77
VL 序列号132 序列号133 序列号126 序列号134 序列号128
[实施例15]mAb5-06、chKM5907和chKM5916的人源化抗体的轻链和重链可变区的设计
(1)mAb5-06人源化抗体的VL和VH的氨基酸序列的设计
利用以下记载的方法设计mAb5-06人源化抗体的各种VL和VH的氨基酸序列。在下文的记述中，将具有各种VL、VH的氨基酸序列的mAb5-06人源化抗体的总称记为hzmAb5-06抗体。对于VL和VH，分别比较mAb5-06抗体的FR的氨基酸序列与由Kabat等人[Sequences ofProteins of Immunological Interest(免疫学关注的蛋白质序列)、美国卫生与公众服务部(1991)]报道的人FR共有序列的同源性。其结果，人亚群L链II(hSGLII)和人亚群H链II(hSGHII)分别与mAb5-06抗体的VL和VH的FR的氨基酸序列的同源性最高。
因此，在hSGLII的FR的氨基酸序列的适当位置分别移植序列号126、134和128所表示的mAb5-06 VL的CDR1～3的氨基酸序列，设计出hzmAb5-06 LV0(序列号135)。另外，在hSGHII的FR的氨基酸序列的适当位置分别移植序列号75、131和77所表示的mAb5-06 VH的CDR1～3的氨基酸序列，设计出hzmAb5-06 HV0(序列号136)。
如上所述设计的hzmAb5-06 LV0和hzmAb5-06 HV0是仅将作为小鼠来源抗体的CDR改造体的mAb5-06来源的CDR的氨基酸序列移植至所选择的人抗体的FR的氨基酸序列中而得到的氨基酸序列。但是，通常，在制作人源化抗体的情况下，仅将啮齿类来源抗体的CDR的氨基酸序列移植至人抗体的FR的氨基酸序列中时，人源化抗体的生物活性大多会降低。为了避免这样的结合活性的降低，在CDR的氨基酸序列的移植的同时，对在人抗体与啮齿类抗体之间存在差异的FR的氨基酸残基中被认为对抗体的结合活性产生影响的氨基酸残基进行改造。因此，本实施例中，也如下对被认为对抗体的结合活性产生影响的FR的氨基酸残基进行了鉴定、改造。
在下文的记述中，将上述中设计的VL、VH分别具有hzmAb5-06 LV0和hzmAb5-06HV0的抗体记为hzmAb5-06 LV0HV0抗体或简记为hzmAb5-06 LV0HV0。对其他hzmAb5-06抗体也用同样的方法进行记载。使用计算机建模的方法构建hzmAb5-06 LV0HV0抗体的可变区的三维结构。
三维结构坐标制作和三维结构的表示使用Discovery Studio(BIOVIA公司)。另外，mAb5-06抗体的可变区的三维结构的计算机模型也同样地进行构建。进一步，制作将hzmAb5-06 LV0HV0抗体的VL和VH的FR的氨基酸序列中与mAb5-06抗体不同的氨基酸残基置换为存在于mAb5-06抗体的相同部位的氨基酸残基而得到的氨基酸序列，同样地构建三维结构模型。对这些制作出的mAb5-06抗体、hzmAb5-06 LV0HV0抗体和改造体的可变区的三维结构进行比较，鉴定出预测对抗体的结合活性产生影响的氨基酸残基。
其结果，作为在hzmAb5-06 LV0HV0抗体的可变区的FR的氨基酸残基中被认为改变抗原结合部位的三维结构会对抗体的结合活性产生影响的氨基酸残基，在VL中选择出序列号135所表示的氨基酸序列的第2位的Ile、第15位的Pro、第50位的Gln、第92位的Tyr、第109位的Val，在VH中选择出序列号136所表示的氨基酸序列的第6位的Glu、第20位的Leu、第27位的Gly、第29位的Val、第30位的Ser、第37位的Ile、第48位的Ile、第67位的Val、第71位的Val、第73位的Thr、第76位的Asn、第78位的Phe、第80位的Leu、第82位的Leu、第85位的Val、第92位的Val、第97位的Arg。将这些选择出的氨基酸残基中的至少一个以上的氨基酸残基置换为存在于mAb5-06抗体的相同部位的氨基酸残基，设计出具有各种改造的人源化抗体的VL和VH。
具体而言，对于VL，导入将序列号135所表示的氨基酸序列的第2位的Ile置换为Val、将第15位的Pro置换为Leu、将第50位的Gln置换为Lys、将第92位的Tyr置换为Phe、以及将第109位的Val置换为Leu的氨基酸改造中的至少一种改造。由此，作为hzmAb5-06抗体的VL，设计出hzmAb5-06 LV0(序列号135)、LV1a(序列号137)、LV1b(序列号138)、LV2a(序列号139)、LV2b(序列号140)、LV4(序列号141)和LV5(序列号142)，将各自的氨基酸序列示于图5。
另外，对于VH，导入将序列号136所表示的氨基酸序列的第6位的Glu置换为Gln、将第20位的Leu置换为Ile、将第27位的Gly置换为Phe、将第29位的Val置换为Leu、将第30位的Ser置换为Asn、将第37位的Ile置换为Val、将第48位的Ile置换为Leu、将第67位的Val置换为Leu、将第71位的Val置换为Lys、将第73位的Thr置换为Asp、将第76位的Asn置换为Ser、将第78位的Phe置换为Val、将第80位的Leu置换为Phe、将第82位的Leu置换为Met、将第85位的Val置换为Leu、将第92位的Val置换为Ile、以及将第97位的Arg置换为Lys的氨基酸改造中的至少一种改造。由此，作为hzmAb5-06抗体的VH，设计出hzmAb5-06 HV0(序列号136)、HV14(序列号143)和HV17(序列号144)，将各自的氨基酸序列示于图6。
(2)chKM5907人源化抗体的VL和VH的氨基酸序列的设计
对于chKM5907人源化抗体的各种VL和VH的氨基酸序列，也利用与实施例15(1)同样的方法进行设计。在下文的记述中，将具有各种VL、VH的氨基酸序列的chKM5907人源化抗体的总称记为hzKM5907抗体。在GenBank登记号ABG38363.1(免疫球蛋白轻链可变区、部分[智人])所表示的人抗体的VL的FR的氨基酸序列的适当位置移植KM5907抗体的VL的CDR1～3的氨基酸序列(分别为序列号72、73和74)，由此设计出hzKM5907 LV0(序列号145)。
另外，在结合有人重链V区胚系VH3-23(FR1～3)和hSGHI(FR4)的人抗体的FR的氨基酸序列的适当位置移植KM5907抗体VH的CDR1～3的氨基酸序列(分别为序列号69、70和71)，由此设计出hzKM5907 HV0(序列号146)。
对于被认为对hzKM5907抗体的结合活性产生影响的FR的氨基酸残基，也利用与hzmAb5-06抗体的情况下同样的方法分别对VL、VH进行选择。将选择出的氨基酸残基中的至少一个以上的氨基酸序列置换为存在于KM5907抗体的相同部位的氨基酸残基，设计出具有各种改造的人源化抗体的VL和VH。
具体而言，对于VL，导入将序列号145所表示的氨基酸序列的第2位的Ile置换为Val、将第15位的Ser置换为Leu、将第19位的Ala置换为Val、将第43位的Gln置换为Lys、将第50位的Gln置换为Lys、以及将第109位的Val置换为Leu的氨基酸改造中的至少一种改造。由此，作为hzKM5907抗体的VL，设计出hzKM5907 LV0(序列号145)、LV1a(序列号147)、LV1b(序列号148)、LV1c(序列号149)、LV2a(序列号150)、LV2b(序列号151)、LV4(序列号152)和LV6(序列号153)，将各自的氨基酸序列示于图7。
另外，对于VH，导入将序列号146所表示的氨基酸序列的第4位的Leu置换为Val、将第44位的Gly置换为Arg、将第49位的Ser置换为Ala、将第92位的Ala置换为Gly、将第93位的Val置换为Met、将第97位的Ala置换为Thr、以及将第98位的Lys置换为Arg的氨基酸改造中的至少一种改造。由此，作为hzKM5907抗体的VH，设计出hzKM5907 HV0(序列号146)、HV1(序列号154)、HV2a(序列号155)、HV2b(序列号156)、HV3a(序列号157)、HV3b(序列号158)、HV3c(序列号159)、HV4(序列号160)和HV7(序列号161)，将各自的氨基酸序列示于图8。
在下文的记述中，将VL、VH分别具有hzKM5907 LV0和hzKM5907 HV0的抗体记为hzKM5907 LV0HV0抗体或hzKM5907 LV0HV0。对其他hzKM5907抗体也用同样的方法进行记载。
(3)chKM5916人源化抗体的VL和VH的氨基酸序列的设计
对于chKM5916人源化抗体的各种VL和VH的氨基酸序列，也利用与实施例15(1)同样的方法进行设计。在下文的记述中，将具有各种VL、VH的氨基酸序列的chKM5916人源化抗体的总称记为hzKM5916抗体。在PIR登记号S52789(Igκ链V区-人(片段))所表示的人抗体的VL的FR的氨基酸序列的适当位置移植KM5916抗体的VL的CDR1～3的氨基酸序列(分别为序列号102、103和104)，由此设计出hzKM5916 LV0(序列号162)。
另外，在GenBank登记号AAX82494.1(抗恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3免疫球蛋白重链可变区、部分[智人])所表示的人抗体的VH的FR的氨基酸序列的适当位置移植KM5916抗体VH的CDR1～3的氨基酸序列(分别为序列号99、100和101)，由此设计出hzKM5916 HV0(序列号163)。
对于被认为对hzKM5916抗体的结合活性产生影响的FR的氨基酸残基，也利用与hzmAb5-06抗体的情况下同样的方法分别对VL、VH进行选择。将选择出的氨基酸残基中的至少一个以上的氨基酸序列置换为存在于KM5916抗体的相同部位的氨基酸残基，设计出具有各种改造的人源化抗体的VL和VH。
具体而言，对于VL，导入将序列号162所表示的氨基酸序列的第38位的Gln置换为His、以及将第43位的Ala置换为Gly的氨基酸改造中的至少一种改造。由此，作为hzKM5916抗体的VL，设计出hzKM5916 LV0(序列号162)和LV2(序列号164)，将各自的氨基酸序列示于图9。
另外，对于VH，导入将序列号163所表示的氨基酸序列的第42位的Asp置换为Glu、将第87位的Lys置换为Arg、以及将第97位的Ala置换为Thr的氨基酸改造中的至少一种改造。由此，作为hzKM5916抗体的VH，设计出hzKM5907 HV0(序列号163)、HV1(序列号165)和HV3(序列号166)，将各自的氨基酸序列示于图10。
在下文的记述中，将VL、VH分别具有hzKM5916 LV0和hzKM5916 HV0的抗体记为KM5916 LV0HV0抗体或hzKM5916LV0HV0。对其他hzKM5916抗体也用同样的方法进行记载。
(4)人源化抗体的可变区基因的设计
使用在动物细胞中高频率使用的密码子，设计出编码表9中所示的人源化抗体(hzmAb5-06抗体、hzKM5907抗体、hzKM5916抗体)的可变区的氨基酸序列的碱基序列。
[表9]
Figure BDA0002373893050000991
[实施例16]人源化抗体的制作和评价
使用实施例12-(2)中所示的方法将实施例15-(4)中设计的碱基序列导入至表达载体中，制作所需要的质粒。其中，作为VL表达载体，使用具有信号序列和人κ链恒定区序列的pCI-OtCMV_hK载体，作为VH表达载体，使用具有信号序列和人γ链恒定区序列的pCI-OtCAG_hG4PE(R409K)载体。
接着，使用实施例12-(3)中所示的方法进行改造抗体的获得。通过SDS-PAGE进行品质确认后，使用实施例13中所示的方法进行抗原结合活性的测定，将与同种型对照人源化抗体[是基于chDNP1、按照实施例15中记载的方法进行设计(使用共有序列作为人FR序列)、按照实施例12-(3)中记载的方法制作得到的抗体，具有分别由序列号167和168所表示的氨基酸序列构成的VL和VH；以下记为hzDNP1)]相比显示出10倍以上的荧光强度的抗体判定为与人CCR1结合。其结果可知，任何一种人源化抗体从抗体浓度为至少80ng/mL开始均显示出对人CCR1的结合性。
接着，对所制作的全部人源化抗体进行THP-1迁移抑制活性的评价。其结果可知，任何一种人源化抗体均具有THP-1迁移抑制活性。对于hzmAb5-06 LV5HV14、hzKM5907LV2bHV3a和hzKM5916 LV2HV0，进一步在抗体浓度为10μg/mL、3μg/mL、1μg/mL、0.75μg/mL、0.5μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL和0.05μg/mL的条件下评价THP-1迁移抑制活性。其结果，如图11所示，任何一种人源化抗体在抗体浓度为0.3μg/mL以上时均显示出THP-1迁移抑制活性。
参考特定的方式详细地对本发明进行了说明，但对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下进行各种变更和修正。需要说明的是，本申请基于2017年7月18日提交的日本专利申请(日本特愿2017-139157)，通过引用对其全部内容进行援引。另外，在此引用的所有参考作为整体并入本说明书中。
序列表自由文本
序列号6-人工序列的说明：NC3-hCCR1的碱基序列
序列号7-人工序列的说明：NC3-mCCR1的碱基序列
序列号8-人工序列的说明：hCCR3_EL2hCCR1的碱基序列
序列号9-人工序列的说明：hCCR3_EL2mCCR1的碱基序列
序列号10-人工序列的说明：N末端hCCR1肽的氨基酸序列
序列号11-人工序列的说明：引物_小鼠_γ_r1的碱基序列
序列号12-人工序列的说明：引物_小鼠_γ_r2的碱基序列
序列号13-人工序列的说明：引物_小鼠_κ_r1的碱基序列
序列号14-人工序列的说明：引物_小鼠_κ_r2的碱基序列
序列号51-人工序列的说明：除信号序列外的KM5907 VH的氨基酸序列
序列号52-人工序列的说明：除信号序列外的KM5907 VL的氨基酸序列
序列号53-人工序列的说明：除信号序列外的KM5908 VH的氨基酸序列
序列号54-人工序列的说明：除信号序列外的KM5908 VL的氨基酸序列
序列号55-人工序列的说明：除信号序列外的KM5909 VH的氨基酸序列
序列号56-人工序列的说明：除信号序列外的KM5909 VL的氨基酸序列
序列号57-人工序列的说明：除信号序列外的KM5911 VH的氨基酸序列
序列号58-人工序列的说明：除信号序列外的KM5911 VL的氨基酸序列
序列号59-人工序列的说明：除信号序列外的KM5915 VH的氨基酸序列
序列号60-人工序列的说明：除信号序列外的KM5915 VL的氨基酸序列
序列号61-人工序列的说明：除信号序列外的KM5916 VH的氨基酸序列
序列号62-人工序列的说明：除信号序列外的KM5916 VL的氨基酸序列
序列号63-人工序列的说明：除信号序列外的KM5954 VH的氨基酸序列
序列号64-人工序列的说明：除信号序列外的KM5954 VL的氨基酸序列
序列号65-人工序列的说明：除信号序列外的KM5955 VH的氨基酸序列
序列号66-人工序列的说明：除信号序列外的KM5955 VL的氨基酸序列
序列号67-人工序列的说明：除信号序列外的KM5956 VH的氨基酸序列
序列号68-人工序列的说明：除信号序列外的KM5956 VL的氨基酸序列
序列号69-人工序列的说明：KM5907 VH CDR1的氨基酸序列
序列号70-人工序列的说明：KM5907 VH CDR2的氨基酸序列
序列号71-人工序列的说明：KM5907 VH CDR3的氨基酸序列
序列号72-人工序列的说明：KM5907 VL CDR1的氨基酸序列
序列号73-人工序列的说明：KM5907 VL CDR2的氨基酸序列
序列号74-人工序列的说明：KM5907 VL CDR3的氨基酸序列
序列号75-人工序列的说明：KM5908 VH CDR1的氨基酸序列
序列号76-人工序列的说明：KM5908 VH CDR2的氨基酸序列
序列号77-人工序列的说明：KM5908 VH CDR3的氨基酸序列
序列号78-人工序列的说明：KM5908 VL CDR1的氨基酸序列
序列号79-人工序列的说明：KM5908 VL CDR2的氨基酸序列
序列号80-人工序列的说明：KM5908 VL CDR3的氨基酸序列
序列号81-人工序列的说明：KM5909 VH CDR1的氨基酸序列
序列号82-人工序列的说明：KM5909 VH CDR2的氨基酸序列
序列号83-人工序列的说明：KM5909 VH CDR3的氨基酸序列
序列号84-人工序列的说明：KM5909 VL CDR1的氨基酸序列
序列号85-人工序列的说明：KM5909 VL CDR2的氨基酸序列
序列号86-人工序列的说明：KM5909 VL CDR3的氨基酸序列
序列号87-人工序列的说明：KM5911 VH CDR1的氨基酸序列
序列号88-人工序列的说明：KM5911 VH CDR2的氨基酸序列
序列号89-人工序列的说明：KM5911 VH CDR3的氨基酸序列
序列号90-人工序列的说明：KM5911 VL CDR1的氨基酸序列
序列号91-人工序列的说明：KM5911 VL CDR2的氨基酸序列
序列号92-人工序列的说明：KM5911 VL CDR3的氨基酸序列
序列号93-人工序列的说明：KM5915 VH CDR1的氨基酸序列
序列号94-人工序列的说明：KM5915 VH CDR2的氨基酸序列
序列号95-人工序列的说明：KM5915 VH CDR3的氨基酸序列
序列号96-人工序列的说明：KM5915 VL CDR1的氨基酸序列
序列号97-人工序列的说明：KM5915 VL CDR2的氨基酸序列
序列号98-人工序列的说明：KM5915 VL CDR3的氨基酸序列
序列号99-人工序列的说明：KM5916 VH CDR1的氨基酸序列
序列号100-人工序列的说明：KM5916 VH CDR2的氨基酸序列
序列号101-人工序列的说明：KM5916 VH CDR3的氨基酸序列
序列号102-人工序列的说明：KM5916 VL CDR1的氨基酸序列
序列号103-人工序列的说明：KM5916 VL CDR2的氨基酸序列
序列号104-人工序列的说明：KM5916 VL CDR3的氨基酸序列
序列号105-人工序列的说明：KM5954 VH CDR1的氨基酸序列
序列号106-人工序列的说明：KM5954 VH CDR2的氨基酸序列
序列号107-人工序列的说明：KM5954 VH CDR3的氨基酸序列
序列号108-人工序列的说明：KM5954 VL CDR1的氨基酸序列
序列号109-人工序列的说明：KM5954 VL CDR2的氨基酸序列
序列号110-人工序列的说明：KM5954 VL CDR3的氨基酸序列
序列号111-人工序列的说明：KM5955 VH CDR1的氨基酸序列
序列号112-人工序列的说明：KM5955 VH CDR2的氨基酸序列
序列号113-人工序列的说明：KM5955 VH CDR3的氨基酸序列
序列号114-人工序列的说明：KM5955 VL CDR1的氨基酸序列
序列号115-人工序列的说明：KM5955 VL CDR2的氨基酸序列
序列号116-人工序列的说明：KM5955 VL CDR3的氨基酸序列
序列号117-人工序列的说明：KM5956 VH CDR1的氨基酸序列
序列号118-人工序列的说明：KM5956 VH CDR2的氨基酸序列
序列号119-人工序列的说明：KM5956 VH CDR3的氨基酸序列
序列号120-人工序列的说明：KM5956 VL CDR1的氨基酸序列
序列号121-人工序列的说明：KM5956 VL CDR2的氨基酸序列
序列号122-人工序列的说明：KM5956 VL CDR3的氨基酸序列
序列号125-人工序列的说明：除信号序列外的chKM5914 VL的氨基酸序列
序列号126-人工序列的说明：chKM5914 VL CDR1的氨基酸序列
序列号127-人工序列的说明：chKM5914 VL CDR2的氨基酸序列
序列号128-人工序列的说明：chKM5914 VL CDR3的氨基酸序列
序列号129-人工序列的说明：mAb5-06 VH的碱基序列
序列号130-人工序列的说明：mAb5-06 VH的氨基酸序列
序列号131-人工序列的说明：mAb5-06 VH CDR2的氨基酸序列
序列号132-人工序列的说明：mAb5-06 VL的碱基序列
序列号133-人工序列的说明：mAb5-06 VL的氨基酸序列
序列号134-人工序列的说明：mAb5-06 VL CDR2的氨基酸序列
序列号135-人工序列的说明：hzmAb5-06 LV0的氨基酸序列
序列号136-人工序列的说明：hzmAb5-06 HV0的氨基酸序列
序列号137-人工序列的说明：hzmAb5-06 LV1a的氨基酸序列
序列号138-人工序列的说明：hzmAb5-06 LV1b的氨基酸序列
序列号139-人工序列的说明：hzmAb5-06 LV2a的氨基酸序列
序列号140-人工序列的说明：hzmAb5-06 LV2b的氨基酸序列
序列号141-人工序列的说明：hzmAb5-06 LV4的氨基酸序列
序列号142-人工序列的说明：hzmAb5-06 LV5的氨基酸序列
序列号143-人工序列的说明：hzmAb5-06 HV14的氨基酸序列
序列号144-人工序列的说明：hzmAb5-06 HV17的氨基酸序列
序列号145-人工序列的说明：hzKM5907 LV0的氨基酸序列
序列号146-人工序列的说明：hzKM5907 HV0的氨基酸序列
序列号147-人工序列的说明：hzKM5907 LV1a的氨基酸序列
序列号148-人工序列的说明：hzKM5907 LV1b的氨基酸序列
序列号149-人工序列的说明：hzKM5907 LV1c的氨基酸序列
序列号150-人工序列的说明：hzKM5907 LV2a的氨基酸序列
序列号151-人工序列的说明：hzKM5907 LV2b的氨基酸序列
序列号152-人工序列的说明：hzKM5907 LV4的氨基酸序列
序列号153-人工序列的说明：hzKM5907 LV6的氨基酸序列
序列号154-人工序列的说明：hzKM5907 HV1的氨基酸序列
序列号155-人工序列的说明：hzKM5907 HV2a的氨基酸序列
序列号156-人工序列的说明：hzKM5907 HV2b的氨基酸序列
序列号157-人工序列的说明：hzKM5907 HV3a的氨基酸序列
序列号158-人工序列的说明：hzKM5907 HV3b的氨基酸序列
序列号159-人工序列的说明：hzKM5907 HV3c的氨基酸序列
序列号160-人工序列的说明：hzKM5907 HV4的氨基酸序列
序列号161-人工序列的说明：hzKM5907 HV7的氨基酸序列
序列号162-人工序列的说明：hzKM5916 LV0的氨基酸序列
序列号163-人工序列的说明：hzKM5916 HV0的氨基酸序列
序列号164-人工序列的说明：hzKM5916 LV2的氨基酸序列
序列号165-人工序列的说明：hzKM5916 HV1的氨基酸序列
序列号166-人工序列的说明：hzKM5916 HV3的氨基酸序列
序列号167-人工序列的说明：hzDNP1 VL的氨基酸序列
序列号168-人工序列的说明：hzDNP1 VH的氨基酸序列
序列表
<110> 协和麒麟株式会社（Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.）
国立大学法人京都大学（National University Corporation, Kyoto University）
<120> 抗人CCR1单克隆抗体（Anti-human CCR1 monoclonal antibody）
<130> W525071
<140> JP2017-139157
<141> 2017-07-18
<160> 168
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1068
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1068)
<400> 1
atg gaa act cca aac acc aca gag gac tat gac acg acc aca gag ttt 48
Met Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Glu Phe
1 5 10 15
gac tat ggg gat gca act ccg tgc cag aag gtg aac gag agg gcc ttt 96
Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys Val Asn Glu Arg Ala Phe
20 25 30
ggg gcc caa ctg ctg ccc cct ctg tac tcc ttg gta ttt gtc att ggc 144
Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Val Ile Gly
35 40 45
ctg gtt gga aac atc ctg gtg gtc ctg gtc ctt gtg caa tac aag agg 192
Leu Val Gly Asn Ile Leu Val Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Lys Arg
50 55 60
cta aaa aac atg acc agc atc tac ctc ctg aac ctg gcc att tct gac 240
Leu Lys Asn Met Thr Ser Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp
65 70 75 80
ctg ctc ttc ctg ttc acg ctt ccc ttc tgg atc gac tac aag ttg aag 288
Leu Leu Phe Leu Phe Thr Leu Pro Phe Trp Ile Asp Tyr Lys Leu Lys
85 90 95
gat gac tgg gtt ttt ggt gat gcc atg tgt aag atc ctc tct ggg ttt 336
Asp Asp Trp Val Phe Gly Asp Ala Met Cys Lys Ile Leu Ser Gly Phe
100 105 110
tat tac aca ggc ttg tac agc gag atc ttt ttc atc atc ctg ctg acg 384
Tyr Tyr Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr
115 120 125
att gac agg tac ctg gcc atc gtc cac gcc gtg ttt gcc ttg cgg gca 432
Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala
130 135 140
cgg acc gtc act ttt ggt gtc atc acc agc atc atc att tgg gcc ctg 480
Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Ile Ile Trp Ala Leu
145 150 155 160
gcc atc ttg gct tcc atg cca ggc tta tac ttt tcc aag acc caa tgg 528
Ala Ile Leu Ala Ser Met Pro Gly Leu Tyr Phe Ser Lys Thr Gln Trp
165 170 175
gaa ttc act cac cac acc tgc agc ctt cac ttt cct cac gaa agc cta 576
Glu Phe Thr His His Thr Cys Ser Leu His Phe Pro His Glu Ser Leu
180 185 190
cga gag tgg aag ctg ttt cag gct ctg aaa ctg aac ctc ttt ggg ctg 624
Arg Glu Trp Lys Leu Phe Gln Ala Leu Lys Leu Asn Leu Phe Gly Leu
195 200 205
gta ttg cct ttg ttg gtc atg atc atc tgc tac aca ggg att ata aag 672
Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ile Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys
210 215 220
att ctg cta aga cga cca aat gag aag aaa tcc aaa gct gtc cgt ttg 720
Ile Leu Leu Arg Arg Pro Asn Glu Lys Lys Ser Lys Ala Val Arg Leu
225 230 235 240
att ttt gtc atc atg atc atc ttt ttt ctc ttt tgg acc ccc tac aat 768
Ile Phe Val Ile Met Ile Ile Phe Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn
245 250 255
ttg act ata ctt att tct gtt ttc caa gac ttc ctg ttc acc cat gag 816
Leu Thr Ile Leu Ile Ser Val Phe Gln Asp Phe Leu Phe Thr His Glu
260 265 270
tgt gag cag agc aga cat ttg gac ctg gct gtg caa gtg acg gag gtg 864
Cys Glu Gln Ser Arg His Leu Asp Leu Ala Val Gln Val Thr Glu Val
275 280 285
atc gcc tac acg cac tgc tgt gtc aac cca gtg atc tac gcc ttc gtt 912
Ile Ala Tyr Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val
290 295 300
ggt gag agg ttc cgg aag tac ctg cgg cag ttg ttc cac agg cgt gtg 960
Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe His Arg Arg Val
305 310 315 320
gct gtg cac ctg gtt aaa tgg ctc ccc ttc ctc tcc gtg gac agg ctg 1008
Ala Val His Leu Val Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp Arg Leu
325 330 335
gag agg gtc agc tcc aca tct ccc tcc aca ggg gag cat gaa ctc tct 1056
Glu Arg Val Ser Ser Thr Ser Pro Ser Thr Gly Glu His Glu Leu Ser
340 345 350
gct ggg ttc tga 1068
Ala Gly Phe
355
<210> 2
<211> 355
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Glu Phe
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Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys Val Asn Glu Arg Ala Phe
20 25 30
Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Val Ile Gly
35 40 45
Leu Val Gly Asn Ile Leu Val Val Leu Val Leu Val Gln Tyr Lys Arg
50 55 60
Leu Lys Asn Met Thr Ser Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp
65 70 75 80
Leu Leu Phe Leu Phe Thr Leu Pro Phe Trp Ile Asp Tyr Lys Leu Lys
85 90 95
Asp Asp Trp Val Phe Gly Asp Ala Met Cys Lys Ile Leu Ser Gly Phe
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Tyr Tyr Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr
115 120 125
Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala
130 135 140
Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Ile Ile Trp Ala Leu
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Arg Glu Trp Lys Leu Phe Gln Ala Leu Lys Leu Asn Leu Phe Gly Leu
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Ile Leu Leu Arg Arg Pro Asn Glu Lys Lys Ser Lys Ala Val Arg Leu
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Ile Phe Val Ile Met Ile Ile Phe Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn
245 250 255
Leu Thr Ile Leu Ile Ser Val Phe Gln Asp Phe Leu Phe Thr His Glu
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Cys Glu Gln Ser Arg His Leu Asp Leu Ala Val Gln Val Thr Glu Val
275 280 285
Ile Ala Tyr Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val
290 295 300
Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe His Arg Arg Val
305 310 315 320
Ala Val His Leu Val Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp Arg Leu
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340 345 350
Ala Gly Phe
355
<210> 3
<211> 1068
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1068)
<400> 3
atg gag att tca gat ttc aca gaa gcc tac ccc aca act aca gaa ttt 48
Met Glu Ile Ser Asp Phe Thr Glu Ala Tyr Pro Thr Thr Thr Glu Phe
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gac tat ggg gac tcc act cca tgc caa aag act gct gta aga gcc ttt 96
Asp Tyr Gly Asp Ser Thr Pro Cys Gln Lys Thr Ala Val Arg Ala Phe
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Gly Ala Gly Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Ile Gly
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Val Val Gly Asn Val Leu Val Ile Leu Val Leu Met Gln His Arg Arg
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ctt caa agc atg acc agc atc tac ctg ttc aac ctg gct gtc tct gat 240
Leu Gln Ser Met Thr Ser Ile Tyr Leu Phe Asn Leu Ala Val Ser Asp
65 70 75 80
ctg gtc ttc ctt ttc act tta cct ttc tgg att gac tac aag ttg aaa 288
Leu Val Phe Leu Phe Thr Leu Pro Phe Trp Ile Asp Tyr Lys Leu Lys
85 90 95
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Asp Asp Trp Ile Phe Gly Asp Ala Met Cys Lys Leu Leu Ser Gly Phe
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tat tac ctg ggt tta tac agt gag atc ttc ttt atc atc ctg ttg acg 384
Tyr Tyr Leu Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr
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att gac aga tac ctg gcc att gtc cat gct gtg ttt gcc ctg agg gcc 432
Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala
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Glu Phe Thr His Arg Thr Cys Ser Pro His Phe Pro Tyr Lys Ser Leu
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att ttg cct ctg tta gtc atg ata atc tgc tat gca ggg atc atc aga 672
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att ctg ctc aga aga ccc agt gag aag aag gtc aaa gcc gtg cgt ctg 720
Ile Leu Leu Arg Arg Pro Ser Glu Lys Lys Val Lys Ala Val Arg Leu
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Leu Ser Val Phe Val Ser Ala Phe Gln Asp Val Leu Phe Thr Asn Gln
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tgt gag cag agt aag caa ctg gac ctg gcc atg cag gtg act gag gtg 864
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<210> 4
<211> 355
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275 280 285
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Ala Gly Phe
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<210> 5
<211> 1068
<212> DNA
<213> Homo sapiens
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ggcctgctct gtgaaaaagc tgataccaga gcactgatgg cccagtttgt gcccccgctg 120
tactccctgg tgttcactgt gggcctcttg ggcaatgtgg tggtggtgat gatcctcata 180
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ctgctcttcc tcgtcaccct tccattctgg atacactatg tcagggggca taactgggtt 300
tttggccatg gcatgtgtaa gctcctctca gggttttatc acacaggctt gtacagcgag 360
atctttttca taatcctgct gacaatcgac aggtacctgg ccattgtcca tgctgtgttt 420
gcccttcgag cccggactgt cacttttggt gtcatcacca gcatcgtcac ctggggcctg 480
gcagtgctag cagctcttcc tgaatttatc ttctatgaga ctgaagagtt gtttgaagag 540
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ctgagaatga ccatcttctg tctcgttctc cctctgctcg ttatggccat ctgctacaca 660
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atttttgtca tcatggcggt gtttttcatt ttctggacac cctacaatgt ggctatcctt 780
ctctcttcct atcaatccat cttatttgga aatgactgtg agcggagcaa gcatctggac 840
ctggtcatgc tggtgacaga ggtgatcgcc tactcccact gctgcatgaa cccggtgatc 900
tacgcctttg ttggagagag gttccggaag tacctgcgcc acttcttcca caggcacttg 960
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<210> 6
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : nucleotide sequence of
NC3-hCCR1
<400> 6
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ctgctcttcc tgttcacgct tcccttctgg atcgactaca agttgaagga tgactgggtt 300
tttggtgatg ccatgtgtaa gatcctctct gggttttatt acacaggctt gtacagcgag 360
atctttttca tcatcctgct gacgattgac aggtacctgg ccatcgtcca cgccgtgttt 420
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gccatcttgg cttccatgcc aggcttatac ttttccaaga cccaatggga attcactcac 540
cacacctgca gccttcactt tcctcacgaa agcctacgag agtggaagct gtttcaggct 600
ctgaaactga acctctttgg gctggtattg cctttgttgg tcatgatcat ctgctacaca 660
gggattataa agattctgct aagacgacca aatgagaaga aatccaaagc tgtccgtttg 720
atttttgtca tcatgatcat cttttttctc ttttggaccc cctacaattt gactatactt 780
atttctgttt tccaagactt cctgttcacc catgagtgtg agcagagcag acatttggac 840
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<210> 7
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : nucleotide sequence of
NC3-mCCR1
<400> 7
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<210> 8
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : nucleotide sequence of
hCCR3_EL2hCCR1
<400> 8
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tctgtctctc catccacagc agagccggaa ctctctattg tgttttag 1068
<210> 9
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : nucleotide sequence of
hCCR3_EL2mCCR1
<400> 9
atgacaacct cactagatac agttgagacc tttggtacca catcctacta tgatgacgtg 60
ggcctgctct gtgaaaaagc tgataccaga gcactgatgg cccagtttgt gcccccgctg 120
tactccctgg tgttcactgt gggcctcttg ggcaatgtgg tggtggtgat gatcctcata 180
aaatacagga ggctccgaat tatgaccaac atctacctgc tcaacctggc catttcggac 240
ctgctcttcc tcgtcaccct tccattctgg atacactatg tcagggggca taactgggtt 300
tttggccatg gcatgtgtaa gctcctctca gggttttatc acacaggctt gtacagcgag 360
atctttttca taatcctgct gacaatcgac aggtacctgg ccattgtcca tgctgtgttt 420
gcccttcgag cccggactgt cacttttggt gtcatcacca gcatcgtcac ctggggcctg 480
gcagtgctag cagctcttcc tgaatttatc ttttttaagg cccagtggga gttcactcac 540
cgtacctgta gccctcattt cccctacaag agcctgaagc agtggaggca tttccacact 600
ctgagaatga ccatcttctg tctcgttctc cctctgctcg ttatggccat ctgctacaca 660
ggaatcatca aaacgctgct gaggtgcccc agtaaaaaaa agtacaaggc catccggctc 720
atttttgtca tcatggcggt gtttttcatt ttctggacac cctacaatgt ggctatcctt 780
ctctcttcct atcaatccat cttatttgga aatgactgtg agcggagcaa gcatctggac 840
ctggtcatgc tggtgacaga ggtgatcgcc tactcccact gctgcatgaa cccggtgatc 900
tacgcctttg ttggagagag gttccggaag tacctgcgcc acttcttcca caggcacttg 960
ctcatgcacc tgggcagata catcccattc cttcctagtg agaagctgga aagaaccagc 1020
tctgtctctc catccacagc agagccggaa ctctctattg tgttttag 1068
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
N-terminal hCCR1 peptide
<400> 10
Cys Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Thr Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Gly Asp
1 5 10 15
Ala Thr Pro Ala Gln Lys
20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : primer mouse_gamma_r1
<400> 11
gcacacyrct ggacagggat ccagagttcc 30
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : primer mouse_gamma_r2
<400> 12
cckyggtsyt gctggcyggg tg 22
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : primer mouse_kappa_r1
<400> 13
gaagcacacg actgaggcac ctccagatgt 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : primer_mouse_kappa_r2
<400> 14
gtaggtgctg tctttgctgt cctgatcagt 30
<210> 15
<211> 411
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(411)
<400> 15
atg aac ttc ggg ctc agc ttg att ttc ctt gcc ctt att tta aaa ggt 48
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
gtc cag tgt gag gtg cag gtg gtg gag tct ggg gga aac tta gtg aaa 96
Val Gln Cys Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Lys
20 25 30
cct gga ggg tcc ctg aaa ctt tcc tgt tca gcc tct gga ttc act ttc 144
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
agt cgc tat ggc atg tcc tgg gtt cgc cag act cca gac aag agg ctg 192
Ser Arg Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
gag tgg gtc gca tcc att agt gct act ttt act tac acc tac tat aca 240
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ala Thr Phe Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
gac aat gtg aag ggg cgt ttc acc atc tcc aga gac aat gcc aag aac 288
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
acc ctg tac cta caa atg agc agt ctg agg tct gag gac aca ggc atg 336
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Met
100 105 110
tat tac tgt aca aga caa gat aat tac gcc tgg ttt gat tcc tgg ggc 384
Tyr Tyr Cys Thr Arg Gln Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Asp Ser Trp Gly
115 120 125
caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca 411
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 16
<211> 137
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Arg Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ala Thr Phe Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr
65 70 75 80
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Gln Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Asp Ser Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
130 135
<210> 17
<211> 393
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(393)
<400> 17
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gtt 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Val
1 5 10 15
tcc aac agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Asn Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gtc tcc atc tcc tgc aga tct agt cag agt att 144
Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
35 40 45
gtg cat agt aat gga aac acc ttt tta gaa tgg tac ctg aag aaa cca 192
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Lys Lys Pro
50 55 60
ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tat aaa gtt tcc agc cga ttt tct 240
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc aag atc agg aga gtg gag gct gac gat ctg gga gtt tat tac tgc 336
Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
ttt caa ggt tca cat att ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aac ctg 384
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu
115 120 125
gaa atc aaa 393
Glu Ile Lys
130
<210> 18
<211> 131
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 18
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Val
1 5 10 15
Ser Asn Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile
35 40 45
Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Lys Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 19
<211> 414
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 19
atg gct gtc ctg gtg ctg ctc ttc tgc ctg gtg aca ttc cca agc tgt 48
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
gtc cta tcc cag gtg cag ctg aag cag tca gga cct ggc cta gtg cag 96
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
20 25 30
ccc tca cag agt ctg tcc atc acc tgc aca gtc tct ggt ttc tca tta 144
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
aat aac tat ggt gta cac tgg gtt cgc cag cct cca gga aag ggt ctg 192
Asn Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
gag tgg ctg gga gtg ata tgg agt gct gga acc aca gtc tat aat gct 240
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala
65 70 75 80
gct ttc ata tcc aga ctg agc atc agc aag gac gac tcc aag agc caa 288
Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln
85 90 95
gtt ttc ttt aaa atg aac agt ctg caa gct ggt gac act gcc ata tac 336
Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Ile Tyr
100 105 110
tac tgt gcc aaa gac ggt agt aga tat tat act gct atg gac tac tgg 384
Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Thr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 414
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 20
<211> 138
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Met Ala Val Leu Val Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Asn Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala
65 70 75 80
Ala Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Ile Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Lys Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Thr Ala Met Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 21
<211> 393
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(393)
<400> 21
atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
acc agc agt gat gtt gtg atg acc caa act cct cgc tcc ctg cct gtc 96
Thr Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Arg Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct cgt cag agc ctt 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu
35 40 45
att cac agt aat gga atc acc ttt tta cat tgg tac ctg cag aag gca 192
Ile His Ser Asn Gly Ile Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ala
50 55 60
ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc agg atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat ttc tgc 336
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
tct caa ggt aca cat gtt cct ccc acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384
Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gaa atc aaa 393
Glu Ile Lys
130
<210> 22
<211> 131
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 22
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Thr Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Arg Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu
35 40 45
Ile His Ser Asn Gly Ile Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ala
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 23
<211> 414
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
<400> 23
atg aac ttc ggg ctc agc ttg att ttc ctt gcc ctt att tta aaa ggt 48
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag 96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc tta 144
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu
35 40 45
agt aat tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gac aag agg ctg 192
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
gaa tgg gtc gca tcc att agt att ggc aat tac atc tat tat cta gac 240
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ile Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp
65 70 75 80
agt gtg aag ggg cga ttc acc atc tac aga gac aat gcc aag aac acc 288
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
ctg ttc ctg caa atg agg agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat 336
Leu Phe Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
cac tgt gca aga cag ggg aat gat tac gac tgg ttt act tac tgg ggc 384
His Cys Ala Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Thr Tyr Trp Gly
115 120 125
caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca gcc 414
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
130 135
<210> 24
<211> 138
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ile Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
Leu Phe Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
His Cys Ala Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Thr Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
130 135
<210> 25
<211> 393
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(393)
<400> 25
atg aag ttg cct gtt aga ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gtt 48
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Val
1 5 10 15
tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc gtt 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val
35 40 45
gta cat act aat gga aac acc tat tta gag tgg tac ctg cag aaa cca 192
Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
ctc aag atc aac aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc 336
Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
ttt caa ggt tca cat ctt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aaa ctg 384
Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
gag atc aaa 393
Glu Ile Lys
130
<210> 26
<211> 131
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 26
Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Val
1 5 10 15
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val
35 40 45
Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 27
<211> 420
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(420)
<400> 27
atg aac ttc ggg ctc aga ttg att ttc ctt gtc ctt act tta aaa ggt 48
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
1 5 10 15
gtc cag tgt gac gtg aag ttg gtg gag tct ggg gaa ggc tta gtg aag 96
Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys
20 25 30
cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gct gcc tct gga ttc acg ttc 144
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
agc aga aat gcc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gag aag agg atg 192
Ser Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Met
50 55 60
gag tgg gtc gca tac att agt agt ggt ggt gat tac atc tac tat gca 240
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
gac act gtg aag ggc cga ttc acc gtc tcc aga gac aat gcc agg aac 288
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
85 90 95
acc ctg tac ctg cga atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg 336
Thr Leu Tyr Leu Arg Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
tat tac tgt aca aga ttc tcc tat ggt tac gca aaa aat gct ctg gac 384
Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Ala Lys Asn Ala Leu Asp
115 120 125
tac tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 420
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 28
<211> 140
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 28
Met Asn Phe Gly Leu Arg Leu Ile Phe Leu Val Leu Thr Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Arg Asn Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Met
50 55 60
Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Arg Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Ala Lys Asn Ala Leu Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 29
<211> 378
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(378)
<400> 29
atg aga ccg tct att cag ttc ctg ggg ctc ttg ttg ttc tgg ctt cat 48
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
ggt gct cag tgt gac atc cag atg aca cag tct cca tcc tca ctg tct 96
Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
gca tct ttg gga ggc aaa gtc acc atc act tgc aag gca agc caa gac 144
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
att aag aag tat ata gct tgg tac caa cac aag cct gga aaa ggt cct 192
Ile Lys Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
agg ctg ctc ata cat tac aca tct tca tta cag cca ggc atc cca tca 240
Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
agg ttc agt gga agt ggg tct ggg aga gat tat tcc ttc agc atc agc 288
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
85 90 95
aac ctg gag cct gag gat att gca act tat tat tgt cta cag tat gat 336
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
100 105 110
tat ctt atg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aaa 378
Tyr Leu Met Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
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<211> 126
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 30
Met Arg Pro Ser Ile Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Phe Trp Leu His
1 5 10 15
Gly Ala Gln Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Ile Lys Lys Tyr Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Arg Leu Leu Ile His Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp
100 105 110
Tyr Leu Met Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
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<221> CDS
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Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga gac tta gtg aag 96
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
cct gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
agt aac tat ggc atg tct tgg gtt cgc cag act cca gac aag agg ctg 192
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
gag tgg gtc gca tcc att agt att ggc agt tac atc tat tat cta gac 240
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp
65 70 75 80
agt gtg aag ggg cga ttc acc atc tac aga gac aat gcc aag aac acc 288
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
85 90 95
ctg ttc ctg caa atg agg agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat 336
Leu Phe Leu Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
cac tgt gca aga cag ggg aat gat tac gac tgg ttt gct tac tgg ggc 384
His Cys Ala Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
115 120 125
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<213> Mus musculus
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Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
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Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp
65 70 75 80
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tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96
Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag aac att 144
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile
35 40 45
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ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288
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Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
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Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
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Val Gln Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys
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Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
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<213> Mus musculus
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agt agt cat cca tgc acg ttc gga ggg gga acc aag ctg gaa ata aaa 384
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65 70 75 80
gct ctc aaa tcc aga ctg agc atc agc aaa gac aac tcc aag agt caa 288
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
gtt ttc tta aaa atg aac agt ctg caa agt ggt gac aca gcc agg tac 336
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Thr Ala Arg Tyr
100 105 110
tac tgt gcc aga aat gga gcc tac tat agt aac tcc ggt tct tac tgg 384
Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Gly Ser Tyr Trp
115 120 125
tac ttc gat gtc tgg ggc aca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 429
Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 48
<211> 143
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 48
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Leu Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ala Arg Tyr Thr Ile Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Leu Ile Arg Thr Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Ser
65 70 75 80
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Thr Ala Arg Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Gly Ser Tyr Trp
115 120 125
Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 49
<211> 384
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(384)
<400> 49
atg gat ttt cag gtg cag att ttc agc ttc ctg cta atc agt gcc tca 48
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
gtc atg atg tcc aga gga caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc 96
Val Met Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
atg tct gca tct cta ggg gag gag atc acc cta acc tgc agt gcc agc 144
Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
tcg agt gta act tac atg cac tgg tac cag cag aag tca ggc act tct 192
Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
50 55 60
ccc aaa ctc ttg att tat agc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct 240
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
tct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc ttt tat tct ctc aca atc 288
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
agc agt gtg gag gct gaa gat gct gcc gat tat tac tgt cat cag tgg 336
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp
100 105 110
agt agt cat cca tgc acg ttc gga ggg ggg gcc aag ctg gaa ata aaa 384
Ser Ser His Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Ala Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 50
<211> 128
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 50
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Met Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20 25 30
Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser
35 40 45
Ser Ser Val Thr Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp
100 105 110
Ser Ser His Pro Cys Thr Phe Gly Gly Gly Ala Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 51
<211> 118
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5907 VH excluding signal sequence
<400> 51
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Asn Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ala Thr Phe Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 52
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5907 VL excluding signal sequence
<400> 52
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Lys Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Arg Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5908 VH excluding signal sequence
<400> 53
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5908 VL excluding signal sequence
<400> 54
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Arg Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Arg Gln Ser Leu Ile His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ala Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 55
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5909 VH excluding signal sequence
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ile Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
115
<210> 56
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5909 VL excluding signal sequence
<400> 56
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Val His Thr
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 57
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5911 VH excluding signal sequence
<400> 57
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Met Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Ala Lys Asn Ala Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5911 VL excluding signal sequence
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Lys Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Met Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5915 VH excluding signal sequence
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Tyr Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Arg Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr His Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala
115
<210> 60
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5915 VL excluding signal sequence
<400> 60
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Thr
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 61
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5916 VH excluding signal sequence
<400> 61
Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Glu Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Ala Pro Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5916 VL excluding signal sequence
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr
20 25 30
Ile Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Gly Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
His Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Tyr Thr Met Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
100 105
<210> 63
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5954 VH excluding signal sequence
<400> 63
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Pro Arg Tyr
20 25 30
Thr Ile Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Leu Ile Arg Thr Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Gly Ala Tyr Tyr Ser Lys Ser Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5954 VL excluding signal sequence
<400> 64
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser His Pro Cys Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5955 VH excluding signal sequence
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Asp Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Thr Ala Ile Ser Tyr Val Asp Lys Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Tyr Ser Lys Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5955 VL excluding signal sequence
<400> 66
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ile Lys Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ser
85 90 95
Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 67
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5956 VH excluding signal sequence
<400> 67
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ala Arg Tyr
20 25 30
Thr Ile Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Leu Ile Arg Thr Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Gly Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Gly Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
100 105 110
Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5956 VL excluding signal sequence
<400> 68
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser His Pro Cys Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Ala Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 69
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5907 VH CDR1
<400> 69
Arg Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5907 VH CDR2
<400> 70
Ser Ile Ser Ala Thr Phe Thr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Asn Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5907 VH CDR3
<400> 71
Gln Asp Asn Tyr Ala Trp Phe Asp Ser
1 5
<210> 72
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5907 VL CDR1
<400> 72
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu
1 5 10 15
<210> 73
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5907 VL CDR2
<400> 73
Lys Val Ser Ser Arg Phe Ser
1 5
<210> 74
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5907 VL CDR3
<400> 74
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Trp Thr
1 5
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5908 VH CDR1
<400> 75
Asn Tyr Gly Val His
1 5
<210> 76
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5908 VH CDR2
<400> 76
Val Ile Trp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
1 5 10 15
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5908 VH CDR3
<400> 77
Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Thr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5908 VL CDR1
<400> 78
Arg Ser Arg Gln Ser Leu Ile His Ser Asn Gly Ile Thr Phe Leu His
1 5 10 15
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5908 VL CDR2
<400> 79
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5908 VL CDR3
<400> 80
Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 81
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5909 VH CDR1
<400> 81
Asn Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5909 VH CDR2
<400> 82
Ser Ile Ser Ile Gly Asn Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 83
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5909 VH CDR3
<400> 83
Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Thr Tyr
1 5 10
<210> 84
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5909 VL CDR1
<400> 84
Arg Ser Ser Gln Ser Val Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 85
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5909 VL CDR2
<400> 85
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 86
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5909 VL CDR3
<400> 86
Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5911 VH CDR1
<400> 87
Arg Asn Ala Met Ser
1 5
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5911 VH CDR2
<400> 88
Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 89
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5911 VH CDR3
<400> 89
Phe Ser Tyr Gly Tyr Ala Lys Asn Ala Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5911 VL CDR1
<400> 90
Lys Ala Ser Gln Asp
1 5
<210> 91
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5911 VL CDR2
<400> 91
Tyr Thr Ser Ser Leu Gln
1 5
<210> 92
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5911 VL CDR3
<400> 92
Leu Gln Tyr Asp Tyr Leu Met Thr
1 5
<210> 93
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5915 VH CDR1
<400> 93
Asn Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5915 VH CDR2
<400> 94
Ser Ile Ser Ile Gly Ser Tyr Ile Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 95
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5915 VH CDR3
<400> 95
Gln Gly Asn Asp Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 96
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5915 VL CDR1
<400> 96
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Thr Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 97
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5915 VL CDR2
<400> 97
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 98
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5915 VL CDR3
<400> 98
Phe Gln Gly Ser His Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5916 VH CDR1
<400> 99
Arg Asn Ala Met Ser
1 5
<210> 100
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5916 VH CDR2
<400> 100
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asp Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 101
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5916 VH CDR3
<400> 101
Phe Ser Tyr Gly Tyr Gly Lys Asn Ala Pro Asp Tyr
1 5 10
<210> 102
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5916 VL CDR1
<400> 102
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Lys Tyr Ile Ala
1 5 10
<210> 103
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5916 VL CDR2
<400> 103
Tyr Thr Ser Ser Leu Gln Pro
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5916 VL CDR3
<400> 104
Leu Gln Tyr Asp Tyr Thr Met Thr
1 5
<210> 105
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5954 VH CDR1
<400> 105
Arg Tyr Thr Ile Thr
1 5
<210> 106
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5954 VH CDR2
<400> 106
Leu Ile Arg Thr Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 107
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5954 VH CDR3
<400> 107
Asn Gly Ala Tyr Tyr Ser Lys Ser Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 108
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5954 VL CDR1
<400> 108
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His
1 5 10
<210> 109
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5954 VL CDR2
<400> 109
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 110
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5954 VL CDR3
<400> 110
His Gln Trp Ser Ser His Pro Cys Thr
1 5
<210> 111
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5955 VH CDR1
<400> 111
Asp Phe Gly Met His
1 5
<210> 112
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5955 VH CDR2
<400> 112
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Thr Ala Ile Ser Tyr Val Asp Lys Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 113
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5955 VH CDR3
<400> 113
Arg Pro Tyr Ser Lys Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5955 VL CDR1
<400> 114
Lys Ser Ile Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 115
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5955 VL CDR2
<400> 115
Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5955 VL CDR3
<400> 116
Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 117
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5956 VH CDR1
<400> 117
Arg Tyr Thr Ile Thr
1 5
<210> 118
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5956 VH CDR2
<400> 118
Leu Ile Arg Thr Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 119
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5956 VH CDR3
<400> 119
Asn Gly Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 120
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5956 VL CDR1
<400> 120
Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met His
1 5 10
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5956 VL CDR2
<400> 121
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Description of the artificial sequence : amino acid sequence of
KM5956 VL CDR3
<400> 122
His Gln Trp Ser Ser His Pro Cys Thr
1 5
<210> 123
<211> 393
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 123
atgaagttgc gtgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc caccggtgat 60
gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120
ttttgcagat ctagtcagag ccttgtacac aggaatggaa tcaccttttt tcattggtac 180
ctgcagaagc caggccagtc tccaaaactc ctgatctaca aagtctccaa ccgattttct 240
ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300
agggtggcgc ctgacgatct gggagtttat ttctgctctc aaggaacaca tgttcctccc 360
actttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 393
<210> 124
<211> 131
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 124
Met Lys Leu Arg Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala
1 5 10 15
Ser Thr Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Phe Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Val His Arg Asn Gly Ile Thr Phe Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Ala Pro Asp Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys
100 105 110
Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 125
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofKM5914 VL excluding signal sequence
<400> 125
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Phe Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Phe Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Ala Pro Asp Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 126
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofKM5914 VL CDR1
<400> 126
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg Asn Gly Ile Thr Phe Phe His
1 5 10 15
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofKM5914 VL CDR2
<400> 127
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 128
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofKM5914 VL CDR3
<400> 128
Ser Gln Gly Thr His Val Pro Pro Thr
1 5
<210> 129
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: nucleotide sequence ofmAb5-06 VH
<400> 129
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagag tctgtccatc 60
acctgcacag tctctggttt ctcattaaat aactatggtg tacactgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg ctggaaccac agtctataat 180
gctgctgcca tatccagact gagcatcagc aaggacgact ccaagagcca agttttcttt 240
aaaatgaaca gtctgcaagc tggtgacact gccatatact actgtgccaa agacggtagt 300
agatattata ctgctatgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357
<210> 130
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofmAb5-06 VH
<400> 130
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asn Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala Ala Ala Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Gly Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 131
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofmAb5-06 VH CDR2
<400> 131
Val Ile Trp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala Ala Ala Ile Ser
1 5 10 15
<210> 132
<211> 336
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: nucleotide sequence ofmAb5-06 VL
<400> 132
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atcttttgca gatctagtca gagccttgta cacaggaatg gaatcacctt ttttcattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct acaaaatctc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagggtgg cgcctgacga tctgggagtt tatttctgct ctcaaggaac acatgttcct 300
cccactttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336
<210> 133
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofmAb5-06 VL
<400> 133
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Phe Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Phe Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Ala Pro Asp Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 134
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofmAb5-06 VL CDR2
<400> 134
Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 135
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofhzmAb5-06 LV0
<400> 135
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Phe Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 136
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofhzmAb5-06 HV0
<400> 136
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Ala Gly Thr Thr Val Tyr Asn Ala Ala Ala Ile
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gly Ser Arg Tyr Tyr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 137
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofhzmAb5-06 LV1a
<400> 137
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Phe Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 138
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofhzmAb5-06 LV1b
<400> 138
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Phe Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 139
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofhzmAb5-06 LV2a
<400> 139
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Phe Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Gly
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 140
<211> 112
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofhzmAb5-06 LV2b
<400> 140
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Arg
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Phe Phe His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
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Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 168
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> description of the artificial sequence: amino acid sequence ofhzDNP1 VH
<400> 168
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Gly Val Arg His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (27)

1.一种单克隆抗体或该抗体片段，所述单克隆抗体或该抗体片段与人CC趋化因子受体1(CC chemokine receptor 1；以下简记为CCR1)的胞外区结合，抑制由人CC趋化因子配体(以下简记为CCL)15引起的人CCR1的活化。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，所述单克隆抗体或该抗体片段抑制由人CCL15诱导的人CCR1表达细胞的迁移。
3.如权利要求1或2所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，所述单克隆抗体或该抗体片段与人CCR1的细胞外环2区域的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基结合。
4.如权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(n)中的任意一种抗体：
(a)重链可变区(heavy chain variable region；以下简记为VH)的互补决定区(complementarity determining region；以下简记为CDR)1～3分别包含序列号69、70和71中记载的氨基酸序列、并且轻链可变区(light chain variable region；以下简记为VL)的CDR1～3分别包含序列号72、73和74中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH的CDR1～3分别包含序列号75、76和77中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号78、79和80中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH的CDR1～3分别包含序列号81、82和83中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号84、85和86中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH的CDR1～3分别包含序列号87、88和89中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号90、91和92中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH的CDR1～3分别包含序列号93、94和95中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号96、97和98中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH的CDR1～3分别包含序列号99、100和101中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号102、103和104中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH的CDR1～3分别包含序列号105、106和107中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号108、109和110中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH的CDR1～3分别包含序列号111、112和113中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号114、115和116中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH的CDR1～3分别包含序列号117、118和119中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号120、121和122中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH的CDR1包含序列号75中记载的氨基酸序列、VH的CDR2包含序列号76中记载的氨基酸序列或者导入了选自将序列号76中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Thr、将第9位的Val置换为Ala、将第14位的Phe置换为Ala、以及将第15位的Ile置换为Ala的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、VH的CDR3包含序列号77中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号77中记载的氨基酸序列中的第5位的Tyr置换为Ala、以及将第7位的Thr置换为Ala的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、并且VL的CDR1包含序列号126中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号126中记载的氨基酸序列中的第15位的Phe置换为Ala的改造的氨基酸序列、VL的CDR2包含序列号127中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号127中记载的氨基酸序列中的第2位的Val置换为Ile、以及将第5位的Arg置换为Lys的改造中的至少任意一种改造的氨基酸序列、VL的CDR3包含序列号128中记载的氨基酸序列的抗体；
(k)VH的CDR1～3分别包含序列号75、131和77中记载的氨基酸序列、并且VL的CDR1～3分别包含序列号126、134和128中记载的氨基酸序列的抗体；
(l)与所述(a)～(k)中记载的至少一种抗体竞争性地与人CCR1结合的抗体；
(m)与包含所述(a)～(k)中记载的任意一种抗体所结合的表位的表位结合的抗体；
(n)与和所述(a)～(k)中记载的任意一种抗体所结合的表位相同的表位结合的抗体。
5.如权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(j)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号51中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号52中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号53中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号54中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号55中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号56中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH包含序列号57中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号58中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH包含序列号59中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号60中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH包含序列号61中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号62中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH包含序列号63中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号64中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH包含序列号65中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号66中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH包含序列号67中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号68中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH包含序列号130中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号133中记载的氨基酸序列的抗体。
6.如权利要求1～4中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(c)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号136中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号136中记载的氨基酸序列中的第6位的Glu置换为Gln、将第20位的Leu置换为Ile、将第27位的Gly置换为Phe、将第29位的Val置换为Leu、将第30位的Ser置换为Asn、将第37位的Ile置换为Val、将第48位的Ile置换为Leu、将第67位的Val置换为Leu、将第71位的Val置换为Lys、将第73位的Thr置换为Asp、将第76位的Asn置换为Ser、将第78位的Phe置换为Val、将第80位的Leu置换为Phe、将第82位的Leu置换为Met、将第85位的Val置换为Leu、将第92位的Val置换为Ile、以及将第97位的Arg置换为Lys的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号135中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号135中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Val、将第15位的Pro置换为Leu、将第50位的Gln置换为Lys、将第92位的Tyr置换为Phe、以及将第109位的Val置换为Leu的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号146中记载的氨基酸序列中的第4位的Leu置换为Val、将第44位的Gly置换为Arg、将第49位的Ser置换为Ala、将第92位的Ala置换为Gly、将第93位的Val置换为Met、将第97位的Ala置换为Thr、以及将第98位的Lys置换为Arg的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号145中记载的氨基酸序列中的第2位的Ile置换为Val、将第15位的Ser置换为Leu、将第19位的Ala置换为Val、将第43位的Gln置换为Lys、将第50位的Gln置换为Lys、以及将第109位的Val置换为Leu的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号163中记载的氨基酸序列中的第42位的Asp置换为Glu、将第87位的Lys置换为Arg、以及将第97位的Ala置换为Thr的氨基酸改造中的任意一种改造的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列或者导入了将序列号162中记载的氨基酸序列中的第38位的Gln置换为His、以及将第43位的Ala置换为Gly的氨基酸改造中的至少一种改造的氨基酸序列的抗体。
7.如权利要求1～4和6中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(h)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号135中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号137中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号138中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号139中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号140中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号141中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH包含序列号144中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号142中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH包含序列号143中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号142中记载的氨基酸序列的抗体。
8.如权利要求1～4和6中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(w)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号147中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号148中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号149中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号150中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(g)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号152中记载的氨基酸序列的抗体；
(h)VH包含序列号146中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号153中记载的氨基酸序列的抗体；
(i)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号145中记载的氨基酸序列的抗体；
(j)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号147中记载的氨基酸序列的抗体；
(k)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号148中记载的氨基酸序列的抗体；
(l)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号149中记载的氨基酸序列的抗体；
(m)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号150中记载的氨基酸序列的抗体；
(n)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(o)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号152中记载的氨基酸序列的抗体；
(p)VH包含序列号161中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号153中记载的氨基酸序列的抗体；
(q)VH包含序列号154中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(r)VH包含序列号155中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(s)VH包含序列号156中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(t)VH包含序列号157中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(u)VH包含序列号158中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(v)VH包含序列号159中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体；
(w)VH包含序列号160中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号151中记载的氨基酸序列的抗体。
9.如权利要求1～4和6中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为选自下述(a)～(f)中的任意一种抗体：
(a)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体；
(b)VH包含序列号163中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体；
(c)VH包含序列号165中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体；
(d)VH包含序列号165中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体；
(e)VH包含序列号166中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号162中记载的氨基酸序列的抗体；
(f)VH包含序列号166中记载的氨基酸序列、并且VL包含序列号164中记载的氨基酸序列的抗体。
10.如权利要求1～9中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，单克隆抗体为基因重组抗体。
11.如权利要求10所述的单克隆抗体或该抗体片段，其中，基因重组抗体为选自人型嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的一种基因重组抗体。
12.如权利要求1～11中任一项所述的抗体片段，其中，抗体片段为选自Fab、Fab’、(Fab’)2、单链抗体(scFv)、二聚体化V区(双链抗体)、二硫键稳定性V区(dsFv)和包含CDR的肽中的一种抗体片段。
13.一种杂交瘤，其产生权利要求1～9中任一项所述的单克隆抗体。
14.一种核酸，其具有编码权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的碱基序列。
15.一种转化细胞，其含有包含权利要求14所述的核酸的载体。
16.权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段的制造方法，其包括：对权利要求13所述的杂交瘤或权利要求15所述的转化细胞进行培养，从培养液中采集权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
17.一种人CCR1的检测或测定用试剂，其包含权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
18.一种人CCR1相关疾病的诊断剂，其包含权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
19.如权利要求18所述的诊断剂，其中，人CCR1相关疾病为癌症、自身免疫疾病或炎性疾病。
20.一种人CCR1相关疾病的治疗剂，其含有权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段作为有效成分。
21.如权利要求20所述的治疗剂，其中，人CCR1相关疾病为癌症、自身免疫疾病或炎性疾病。
22.一种人CCR1相关疾病的诊断方法，其使用权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
23.一种人CCR1相关疾病的治疗方法，其使用权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段。
24.权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段在制造人CCR1相关疾病的诊断剂中的应用。
25.权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段在制造人CCR1相关疾病的治疗剂中的应用。
26.如权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其用于作为人CCR1相关疾病的治疗剂来使用。
27.如权利要求1～12中任一项所述的单克隆抗体或该抗体片段，其用于作为人CCR1相关疾病的诊断剂来使用。
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