JP2023545394A - 抗ｐｄ－ｌ１抗体およびその用途 - Google Patents

抗ｐｄ－ｌ１抗体およびその用途 Download PDF

Info

Publication number
JP2023545394A
JP2023545394A JP2023520184A JP2023520184A JP2023545394A JP 2023545394 A JP2023545394 A JP 2023545394A JP 2023520184 A JP2023520184 A JP 2023520184A JP 2023520184 A JP2023520184 A JP 2023520184A JP 2023545394 A JP2023545394 A JP 2023545394A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
active fragment
spd
antibodies
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023520184A
Other languages
English (en)
Inventor
ジョウ，ジュン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immunourchin
Original Assignee
Immunourchin
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunourchin filed Critical Immunourchin
Publication of JP2023545394A publication Critical patent/JP2023545394A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/70532—B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

本発明は、ＰＤ－Ｌ１抗体およびその用途を提供し、当該抗体またはその活性断片は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を遮断せず、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域を特異的に標的する。本発明のノンブロッキングＰＤ－Ｌ１抗体は、ｓＰＤ－Ｌ１を最大限に回避することができ、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能効果を誘導する活性を有し、同時に優れた抗腫瘍活性を有する。

Description

本発明は、腫瘍免疫学の分野に関し、より具体的には、抗ＰＤ－Ｌ１ ＩｇＣ様領域であり、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能効果を誘導する抗体に関する。
過去１０年間で、イピリムマブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）（ＣＴＬＡ４遮断抗体）、ペムブロリズマブ／ニボルマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ／ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）（ＰＤ－１遮断抗体）およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）（ＰＤ－Ｌ１遮断抗体）のような様々な腫瘍免疫チェックポイント抗体遮断剤は、臨床適用において画期的なブレークスルーがある。従って、米国科学者Ｊａｍｅｓ Ａｌｌｉｓｏｎは、一般に受け入れられる免疫チェックポイント遮断（Ｃｈｅｃｋ－ｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ）の概念を最初に提案した。異なる臨床適応症では、患者の治療反応率は、大きく異なる。最も一般的な固形腫瘍患者のグループでは、このような治療反応率は、限られ、おそらく約２０％である。
ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１経路は、重要な免疫チェックポイントの一つである。ＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド１）は、膜タンパク質であり、それは、主に樹状細胞および単球によって発現される。その受容体は、ＰＤ－１（プログラム死タンパク質受容体１）であり、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および単球によって発現される。Ｔ細胞が組織関連抗原を識別して結合する場合、Ｔ細胞は、活性化されてＰＤ－１を発現する。ＰＤ－１に結合したＰＤ－Ｌ１は、Ｔ細胞の活性化を阻害し、免疫機能の低下を引き起こす。研究によると、様々な種類の腫瘍でも、ＰＤ－Ｌ１を発現することが分かる。
研究によると、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の相互作用は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＶ機能領域（アミノ酸１９－１２７）に結合することにより達成することがさらに示される。アテゾリズマブの重鎖は、水素結合を介してＰＤ－Ｌ１エピトープＥ５８、Ｑ６６、Ｖ１１１、Ｒ１１３およびＲ１２５に結合し、エピトープＩ５４、Ｙ５６、Ｎ６３、Ｖ１１１、Ｍ１１５、Ｓ１１７、Ａ１２１、およびＹ１２３は、ファンデルワールス力（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）を介してＰＤ－Ｌ１のＣＣ‘ＦＧプラスミド内の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲｓ）に結合する。アテゾリズマブ、デュルバルマブ（ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ＢＭＳ－９６３５５９およびアベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）のような異なるＰＤ－Ｌ１抗体は、異なるエピトープを識別するが、それらは、すべてＰＤ－Ｌ１のＩｇＶ機能領域に作用する。それらは、ＰＤ－１と同じエピトープで競合し、その目的は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との相互作用を遮断することである。現在、中国内のＰＤ－Ｌ１抗体の研究開発も、免疫チェックポイント遮断の概念に基づいているが、臨床適用は、まだ承認されていない。
免疫チェックポイント遮断によって引き起こす治療反応は、腫瘍特異的免疫応答の生成、腫瘍内免疫阻害性微小環境の形成および免疫応答に対する腫瘍の感受性のような腫瘍特性に部分的に依存する。研究によると、腫瘍患者の血清中に可溶性ＰＤ－Ｌ１（ｓＰＤ－Ｌ１）が存在することが分かる。高レベルのｓＰＤ－Ｌ１は、進行性腎細胞がん、多発性骨髄腫およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫に存在し、低生存率に関連する。最近の研究によると、皮膚黒色腫細胞には四つのＰＤ－Ｌ１スプライス変異体があることが分かり、それらは、ｓＰＤ－Ｌ１を分泌する原因となる。ｓＰＤ－Ｌ１の分泌は、スプライシング活性、サイトカイン刺激、細胞のストレス応答、および細胞損傷および細胞死に関連する。膜性ＰＤ－Ｌ１の発現は、ｓＰＤ－Ｌ１の分泌に正比例する。また、様々な種類の腫瘍細胞は、一般にＰＤ－Ｌ１スプライシング活性およびｓＰＤ－Ｌ１を分泌する機能を有し、ここで、最も一般的または発現量が最も多いのは、ＰＤ－Ｌ１－３／１２およびＰＤ－Ｌ１－９である。ＰＤ－Ｌ１－３／１２およびＰＤ－Ｌ１－９の全長アミノ酸は、それぞれアミノ酸１９－１７８およびアミノ酸１９－２４３である。明らかに、分泌型ｓＰＤ－Ｌ１は、既存の遮断型ＰＤ－Ｌ１抗体識別領域であるＩｇＶを含む。
現在、研究によると、腫瘍によって分泌されるｓＰＤ－Ｌ１スプライス変異体は、ＰＤ－Ｌ１抗体に結合して薬剤耐性を生成する「餌」として使用できることがさらに分かる。わずか１％の腫瘍細胞から分泌されるｓＰＤ－Ｌ１は、ＰＤ－Ｌ１抗体の抗腫瘍効果を完全に無効にすることができる。ＰＤ－Ｌ１抗体治療では、ｓＰＤ－Ｌ１の分泌は、腫瘍患者の再発に関連する。これは、腫瘍によって分泌されるｓＰＤ－Ｌ１が、ＰＤ－Ｌ１遮断抗体による腫瘍障害の治療、または重要な薬剤耐性メカニズムの一つを阻害する可能性があることを示唆する。
要約すると、当技術分野では、ｓＰＤ－Ｌ１を最大限に回避し、Ｆｃセグメントによって誘導されるＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を増強し、抗腫瘍効果を有するＰＤ－Ｌ１特異的モノクローナル抗体である、ｓＰＤ－Ｌ１分泌型薬剤耐性に対するより効果的な治療剤を開発する緊急の必要性がある。
本発明の目的は、抗ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域（ＩｇＣ－ｌｉｋｅ ｒｅｇｉｏｎ）であり、且つＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能効果を誘導する、抗腫瘍および抗ｓＰＤ－Ｌ１分泌型薬剤耐性ＰＤ－Ｌ１抗体を提供することである。
本発明の第１の態様は、ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片を提供し、前記抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を遮断せず、前記抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域に特異的に結合し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能効果を誘導する活性を有する。
別の好ましい例において、前記抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＶ機能領域（即ち、アミノ酸１９－１２７）に結合しない。
別の好ましい例において、前記抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＶ機能領域の結合についてＰＤ－１と競合しない。
別の好ましい例において、前記抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＶ機能領域の同じエピトープに結合についてＰＤ－１と競合しない。
別の好ましい例において、前記抗体は、可溶性ＰＤ－Ｌ１（ｓＰＤ－Ｌ１）タンパク質に結合しないか、または親和性が低下する。
別の好ましい例において、前記抗体は、可溶性ＰＤ－Ｌ１タンパク質ＰＤ－Ｌ１－３に結合しない。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１－９に対する抗体の結合能Ｐ１は、ＰＤ－Ｌ１－９に対する抗体１３００２１（参照抗体）の結合能Ｐ０よりもはるかに低く、好ましくはＰ１／Ｐ０≦１／５、より好ましくは≦１／１０、より好ましくは≦１／１００である。
別の好ましい例において、前記可溶性ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する親和性が低下する抗体は、ＰＤ－Ｌ１－１およびＰＤ－Ｌ１－９を含む。
別の好ましい例において、前記抗体は、可溶性ＰＤ－Ｌ１（ｓＰＤ－Ｌ１）タンパク質に対して結合しないか、または部分的に結合する。
別の好ましい例において、前記抗体に結合しない可溶性ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１－３を含む。
別の好ましい例において、前記抗体部分が結合する可溶性ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１－１およびＰＤ－Ｌ１－９を含む。
前記抗体は、ノンブロッキング抗体であり、
（ｉ）Ｅ５８、Ｑ６６、Ｖ１１１、Ｒ１１３、Ｒ１２５と、および
（ｉｉ）Ｉ５４、Ｙ５６、Ｎ６３、Ｖ１１１、Ｍ１１５、Ｓ１１７、Ａ１２１、およびＹ１２３のＰＤ－Ｌ１に結合しない任意のアミノ酸部位である。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるようなＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるようなＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、および
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるようなＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるようなＨＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるようなＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む
ここで、前記抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域に特異的に結合する。
別の好ましい例において、ＩｇＣ様領域は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＩｇＣ領域およびそれを細胞膜と接続するセグメント領域であり、ここで、前記領域は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基１３２～２３８からなる。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能効果を誘導して腫瘍を殺傷する。
ここで、上記アミノ酸配列中の任意のアミノ酸配列は、少なくとも一つのアミノ酸が任意選択に追加、欠失、修飾および／または置換され、ＰＤ－Ｌ１結合親和性を保持できる誘導体配列をさらに含む。
別の好ましい例において、上記任意のＣＤＲのアミノ酸配列は、１、２または３個のアミノ酸が追加、欠失、修飾および／または置換された誘導ＣＤＲ配列を含み、前記誘導ＣＤＲ配列を含むＶＨおよびＶＬから構成される誘導抗体は、ＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性を保持することができる。
別の好ましい例において、前記追加、欠失、修飾および／または置換されたアミノ酸の数は、１～５個（例えば、１～３個、好ましくは１～２個、より好ましくは１個）である。
別の好ましい例において、前記少なくとも一つのアミノ酸が追加、欠失、修飾および／または置換され、ＰＤ－Ｌ１結合親和性を保持できる誘導体配列は、相同性または配列同一性が少なくとも９６％であるアミノ酸配列である。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のポリペプチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２０、２１、２２、２３、２４または２５と少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖可変領域のポリペプチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２６、２７、２８、２９または３０と少なくとも９５％同一である。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２０、２１、２２、２３、２４または２５に示されるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域と、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２６、２７、２８、２９または３０に示されるポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含む。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるような重鎖可変領域と、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示されるような軽鎖可変領域、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるような重鎖可変領域と、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるような軽鎖可変領域、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるような重鎖可変領域と、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるような軽鎖可変領域、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるような重鎖可変領域と、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるような軽鎖可変領域、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示されるような重鎖可変領域と、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示されるような軽鎖可変領域、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示されるような重鎖可変領域と、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるような軽鎖可変領域と、ならびに
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示されるような重鎖可変領域と、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示されるような軽鎖可変領域からなる群から選択される重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
別の好ましい例において、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２０、２１、２２、２３、２４または２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性または配列同一性を有する。
別の好ましい例において、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２６、２７、２８、２９または３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性または配列同一性を有する。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、キメラである。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、ヒト化されたものである。
本発明の第２の態様は、組換えタンパク質を提供し、前記組換えタンパク質は、
（ｉ）本発明の第１の態様に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、および
（ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意選択のタグ配列を有する。
別の好ましい例において、前記タグ配列は、６Ｈｉｓタグを含む。
別の好ましい例において、前記組換えタンパク質は、特異的な抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質である。
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、または本発明の第２の態様に記載の組換えタンパク質をコードする、ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の第４の態様は、ベクターを提供し、それは、本発明の第３の態様に記載のポリヌクレオチドを含む。
別の好ましい例において、前記ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、例えばアデノウイルス、レトロウイルス等の哺乳動物細胞ウイルス、または他のベクターを含む。
本発明の第５の態様は、遺伝子操作された宿主細胞を提供し、それは、本発明の第４の態様に記載のベクターを含むか、またはゲノムには本発明の第３の態様に記載のポリヌクレオチドが組み込まれている。
本発明の第６の態様は、免疫コンジュゲートを提供し、当該免疫コンジュゲートは、
（ａ）本発明の第１の態様に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片と、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分を含む。
本発明の第７の態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、
（ａ）本発明の第１の態様に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、または本発明の第２の態様に記載の組換えタンパク質、または本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲート、および
（ｂ）薬学的に許容される担体を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、追加の有効成分をさらに含み、好ましくは、前記有効成分は、小分子化合物、サイトカイン、抗体（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ４７抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ－免疫細胞）を含む。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、注射剤の形態である。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍を治療するための薬物の調製に使用され、前記腫瘍は、膀胱がん、例えば低悪性度神経膠腫、神経膠芽腫等の神経膠腫等の脳がん、子宮頸がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、腎細胞がん、腎盂がん、白血病、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、線維肉腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫、骨髄由来腫瘍、甲状腺がんからなる群から選択される。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、感染性疾患を治療するための薬物の調製に使用され、前記感染性疾患は、感染性ウイルス疾患、感染性細菌性疾患または感染性真菌性疾患を含む。
別の好ましい例において、前記感染性疾患において、感染病巣または感染された宿主細胞は、ＰＤ－Ｌ１（ＨＩＶ、肝炎ウイルス、結核菌）を発現する。
別の好ましい例において、前記感染性ウイルス疾患は、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ）、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、アルボウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ムンプスアデノウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟体動物ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス、アルボウイルス、および脳炎ウイルスから選択される病原体によって引き起こされる。
別の好ましい例において、前記感染性細菌性疾患は、結核菌、クラミジア、リケッチア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、淋菌、クレブシエラ、プロテウス、レイテレラ、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、バチルス、コレラ、破傷風、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ、およびライム病細菌から選択される病原体によって引き起こされる。
別の好ましい例において、前記感染性真菌性疾患は、カンジダ、クリプトコッカスネオフォルマンス、アスペルギルス、ムコール、スポロトリックスシェンキー、ブラストミセスデルマチチディス、パラコクシジオイデスブラジリエンシス、コクシジオイデスイミティス、およびヒストプラズマカプスラリスから選択される病原体によって引き起こされる。別の好ましい例において、前記感染性疾患は、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ジアルジア、マラリア原虫、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌から選択される病原体によって引き起こされる。
別の好ましい例において、前記感染性疾患は、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ）および結核菌から選択される病原体によって引き起こされる。
別の好ましい例において、前記組成物は、化学療法、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ、抗ＬＡＧ－３ｍＡｂ、抗ＣＤ７３ｍＡｂ、抗ＣＤ４７ｍＡｂ、抗ＤＬＬ３ｍＡｂ、抗ＦＲｍＡｂｍＡｂ、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＰＤ－１抗体、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療、他の免疫腫瘍薬、抗血管新生薬、放射線療法、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、標的療法または他の抗がん薬を含むがこれらに限定されない、別の腫瘍免疫療法と併用することができる。
別の好ましい例において、前記医薬組成物、必要とする被験者の癌細胞の表面ＰＤ－Ｌ１を標的するか、またはＡＤＣＣ／ＣＤＣ効果を増強する方法は、前記対象に本発明の第７の態様に記載の医薬組成物を投与する段階を含む。
本発明の第８の態様は、サンプル中のＰＤ－Ｌ１タンパク質を検出するための方法を提供し、前記方法は、
（１）被験者からサンプルを取得する段階と、
（２）サンプルを本発明の第１の態様に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片と接触させる段階と、
（３）被験者のＰＤ－Ｌ１レベルを決定する段階とを含む。
別の好ましい例において、前記方法は、非治療的かつ非診断的である。
別の好ましい例において、前記方法は、インビトロ検出である。
本発明の第９の態様は、ＰＤ－Ｌ１を検出するためのキットを提供し、前記キットは、本発明の第１の態様に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、または本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲート、本発明の第７の態様に記載の医薬組成物、および説明書からなる群から選択される一つまたは複数の種を含む。
別の好ましい例において、前記説明書には、前記キットは、被験対象のＰＤ－Ｌ１発現を検出するために使用されることが記載される。
別の好ましい例において、前記キットは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質（即ち、ＰＤ－Ｌ１陽性）を発現する腫瘍の検出に使用される。
本発明の第１０の態様は、免疫細胞を提供し、前記免疫細胞は、本発明の第１の態様に記載の抗体を発現するか、または細胞膜外に露出する。
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞を含む。
別の好ましい例において、前記免疫細胞は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）に由来する。
本発明の第１１の態様は、ＰＤ－Ｌ１発現または機能異常に関連する疾患を治療するための方法を提供し、前記方法は、必要とする対象に医薬有効量の本発明の第１の態様に記載のＰＤ－Ｌ１抗体、本発明の第６の態様に記載の免疫コンジュゲート、または本発明の第７の態様に記載の医薬組成物、本発明の第１０の態様に記載の免疫細胞、またはその組み合わせを投与する段階を含む。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１発現または機能異常に関連する疾患は、腫瘍または感染性疾患である。
別の好ましい例において、前記ＰＤ－Ｌ１抗体は、単独で使用するか、または他の治療剤と併用して投与することができる。
別の好ましい例において、前記他の治療剤は、免疫チェックポイント遮断剤、アジュバントまたはワクチンを含む。
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
図Ａは、ＰＤ－Ｌ１の全長およびそのスプライス変異体ｓＰＤ－Ｌ１－３または１２、ｓＰＤ－Ｌ１－９のアミノ酸領域、既知のＰＤ－Ｌ１抗体の識別領域およびＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃１９およびそのヒト化抗体のエピトープを示す。図Ｂは、ヒトＰＤ－Ｌ１ ＩｇＣおよびそれと細胞膜との接続セグメントのアミノ酸配列を示す。ここで、下線付きの点は、シグナルペプチドセグメントを表し、下線付きの二重線は、ＩｇＶ（アミノ酸１９－１２７）を表し、下線付きの一本線は、ＩｇＣおよびそれと細胞膜との接続セグメント（アミノ酸１３２－２３８）を表し、下線付きのダッシュ＋下線付きの短線は、膜貫通ドメイン（アミノ酸２３９－２５９）を表し、下線付きの波線は、細胞内ドメイン（アミノ酸２６０－２９０）を表す。
ヒトＰＤ－Ｌ１スプライス変異体の模式図を示す。ここで、図Ａは、ＰＤ－Ｌ１の全長に六つのエクソンを含まれることを表し、ＰＤ－Ｌ１－１、ＰＤ－Ｌ１－３、ＰＤ－Ｌ１－９およびＰＤ－Ｌ１－１２は、それぞれスプライス変異体であり、膜貫通領域は、第４のエクソンに位置し、且つピンク色で標識され、切除セグメントは、括弧で標識され、Ｓｔｏｐは、停止コドンを表す。図Ｂは、それぞれ全長膜型ＰＤ－Ｌ１、スプライス変異体ＰＤ－Ｌ１－１、ＰＤ－Ｌ１－３、ＰＤ－Ｌ１－９およびＰＤ－Ｌ１－１２の核酸およびアミノ酸配列を表し、ここで、膜貫通領域は、エクソン４セグメントでピンク色で標識され、切除セグメントは、赤色括弧で標識され、各スプライス変異体のアミノ酸配列は、青色で標識され、下線付きの線は、追加の異なるアミノ酸を表す。
ヒトＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様に対するＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体の結合能を示す。ここで、図Ａは、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様に対するＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体１３００２１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）および２９Ｅ．２Ａ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国）の結合能がフローサイトメトリーによって検出されることを示す。ここで、抗体１３００２１は、ＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様に結合し、抗体２９Ｅ．２Ａ３は、ＰＤ－Ｌ１のみに結合し、ＩｇＣ様セグメントを識別せず、その識別領域がＩｇＶのみにあることを示し、クローン２４Ｆ．１０Ｃ１２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）は、ヒトＰＤ－Ｌ２マウスモノクローナル抗体であり、図Ｂは、ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体の細胞フローサイトメトリーによるスクリーニング図を示し、ここで、スクリーニングされた五つのＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１５、ｍＡｂ＃１９およびｍＡｂ＃２３は、ＰＤ－Ｌ１に結合することができ、ＩｇＣ様を識別することもできる。ここで、ＰＤ－Ｌ１ ＰＥは、ＰＥ蛍光標識ＰＤ－Ｌ１抗体を表す。
組換えタンパク質ｒＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体の親和性を示す。ここで、図Ａは、五つのＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１５、ｍＡｂ＃１９およびｍＡｂ＃２３と組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１との親和性がＥＬＩＳＡによって検出されることを示し、図Ｂは、五つのＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１５、ｍＡｂ＃１９およびｍＡｂ＃２３に対する組換えタンパク質ｒＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳおよびｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの遮断効果がフローサイトメトリーによって検出されることを示し、図Ｃは、マウスモノクローナル抗体＃１９結合ＰＤ－Ｌ１に対する様々な濃度の組換えタンパク質ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの影響がフローサイトメトリーによって検出されることを示す。
天然形態ｓＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体＃１９の親和性がＥＬＩＳＡによって検出されることを示す。ここで、図Ａは、細胞培養上清中のｓＰＤ－Ｌ１－３およびｓＰＤ－Ｌ１－９に対するマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃１９の親和性を示し、図Ｂは、細胞培養上清中のｓＰＤ－Ｌ１－３に対するマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃１９の親和性を示し、図Ｃは、細胞培養上清中のｓＰＤ－Ｌ１－９に対するマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃１９の親和性を示す。ここで、Ｂｌａｎｋは、培地の陰性対照を表す。
ヒトＰＤ－Ｌ１およびｓＰＤ－Ｌ１－９を発現するＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおけるＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体＃１９の抗腫瘍効果を示し、ここで、図Ａは、異なる日数のマウスの腫瘍の大きさを表し、腫瘍体積平均値±標準誤差として表され、図Ｂは、異なる日数のマウスの生存率を示す。
マウスモノクローナル抗体＃１９のヒト化を示す。異なる重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）Ｆａｂのアミノ酸配列は、図面に示されたとおりである。ｍＶＨおよびｍＶＬ：マウスモノクローナル抗体重および軽鎖可変領域。ＶＨおよびＶＬ：ヒト化抗体重および軽鎖可変領域。重鎖および軽鎖のＣＤＲ領域は、赤い太字および下線で表す。 膜型と分泌型ＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様に対するマウスモノクローナル抗体＃１９のヒト化、異なる重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の組み合わせの親和性を示す。
膜型ＰＤ－Ｌ２（ヒト）に対するマウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化、異なる重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の組み合わせの親和性を示す。膜型ＰＤ－Ｌ２（Ａは、ＭＦＩで示され、Ｂは、点で示される）に対するクローン＃１９ヒト化抗体の親和性がフローサイトメトリーによって検出されることを示す。Ｃ：陰性対照としてのＣＨＯ－Ｋ１親細胞。クローン２４Ｆ．１０Ｃ１２：ヒトＰＤ－Ｌ２マウスモノクローナル抗体。二次抗体：ＰＥ標識ヤギ抗マウス抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）。
膜型ＣＤ８０（ヒト）に対するマウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化、異なる重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の組み合わせの親和性を示す。膜型ＣＤ８０（Ａは、ＭＦＩで示され、Ｂは、点で示される）に対するクローン＃１９ヒト化抗体の親和性がフローサイトメトリーによって検出されることを示す。Ｃ：陰性対照としてのＣＨＯ－Ｋ１親細胞。クローン２Ｄ１０：ヒトＣＤ８０マウスモノクローナル抗体クローン（Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ、武漢）。二次抗体：ＰＥ標識ヤギ抗マウス抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの非存在下または存在下で、膜型ＰＤ－Ｌ１に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の親和性を示す。膜型ＰＤ－Ｌ１親和性（Ａ）に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の影響、およびＨ６Ｌ２親和性に対する様々な濃度のｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの影響（Ｂは、ＭＦＩで示され、Ｃは、点で示される）がフローサイトメトリーによって検出され、同時に、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）と比較する。
ｒＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳの非存在下または存在下で、膜型ＰＤ－Ｌ１に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の親和性を示す。Ｈ６Ｌ２親和性に対する様々な濃度のｒＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳの影響（Ａは、ＭＦＩで示され、およびＢは、点で示される）がフローサイトメトリーによって検出され、同時に、アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）と比較する。
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の遮断効果を示す。 そのＡＤＣＣ効果に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２のＡＤＣＣ活性および分泌型ｓＰＤ－Ｌ１の影響を示す。Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅプラットフォームでは、分泌型ｓＰＤ－Ｌ１（組換えタンパク質ｒＰＤＬ１－３－ＨＩＳまたはｒＰＤＬ１－９－ＨＩＳ）の有（Ｂ）無（Ａ）条件下で、＃１９ヒト化抗体がＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ルシフェラーゼ）の活性を誘導する能力が検出され、同時に、アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）と比較する。
ヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の抗腫瘍効果を示す。Ａ．各群の腫瘍体積の平均値±標準誤差で表される腫瘍大きさ。Ｂ．生存率。ＰＢＳおよびアベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）は、それぞれ陰性対照群および陽性対照群である。 天然形態のｓＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブの結合能を示す。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブと天然形態のｓＰＤ－Ｌ１との結合能がＥＬＩＳＡによって検出される。ここで、ＢＬは、バックグラウンド対照としてのｓＰＤ－Ｌ１上清のないことを示し、ａｔｅ ｔｒｅａｔｅｄは、アテゾリズマブによって処理されたことを表し、ｈＩｇＧ１ ｔｒｅａｔｅｄは、ヒトｈＩｇＧ１によって処理されたことを示し、ｓＰＤ－Ｌ１－３またはｓＰＤ－Ｌ１－９は、それぞれｓＰＤ－Ｌ１－３またはｓＰＤ－Ｌ１－９を含む上清液を表す。
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合に対するヒトＰＤ－Ｌ１抗体アベルマブおよびアテゾリズマブの遮断効果、その遮断効果に対する分泌型ｓＰＤ－Ｌ１の影響を示す。細胞間ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用に対するＡおよびＢ．アベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）の影響、アベルマブおよびアテゾリズマブの遮断に多雨するＣおよびＤ．ｓＰＤ－Ｌ１の影響。抗体用量は、１００ｎｇ／データポイントであり、ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの用量は、図面に示されたとおりである。
本発明者らは、広範囲かつ綿密な研究の後、ノンブロッキングＰＤ－Ｌ１抗体を初めて発見し、前記抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を遮断しないが、このようなノンブロッキングＰＤ－Ｌ１抗体は、実際に優れた抗腫瘍活性を有する。研究によると、本発明のノンブロッキングＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域を特異的に標的し、ｓＰＤ－Ｌ１を最大限に回避し、同時にＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を誘導できることを示す。これに基づいて、反発明を完成させた。
具体的には、本発明者らは、いずれもｓＰＤ－Ｌ１－３に結合しない五つの特異的な抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体を構築し、そのうちの一つのモノクローナル抗体は、ＰＤ－Ｌ１の細胞外全長ｓＰＤ－Ｌ１－９を部分的に回避でき、そのヒト化抗体は、この態様において対照抗ヒトＰＤ－Ｌ１アテゾリズマブおよびアベルマブよりも大幅に優れる。
用語
本開示をより容易に理解できるようにするために、まず特定の用語を定義する。本出願で使用されるように、本明細書で特に明記しない限り、以下の各用語は、以下に示される意味を有する者とする。本出願全体に他の定義を記載する。
本発明において、「本発明のノンブロッキングＰＤ－Ｌ１抗体」、「本発明のＰＤ－Ｌ１抗体」、「本発明の特異的抗体」、「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」という用語は、交換可能に使用され、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的に結合するする抗体を指す。本発明のノンブロッキングＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を遮断せず、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域を特異的に標的することができ、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能効果を誘導する活性を有する。例えば、重鎖（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２０、２１、２２、２３、２４および２５に示されるアミノ酸配列）および／または軽鎖（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２６、２７、２８、２９および３０に示されるアミノ酸配列）を有するタンパク質またはポリペプチド。それらは、出発物質であるメチオニンを含んでも含まなくてもよい。
ＩｇＣ様領域
本明細書で使用されるように、ＩｇＣ領域と細胞膜との間の接続セグメントは、「ＩｇＣ様領域」と示され、ＰＤ－Ｌ１タンパク質ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１９中のアミノ酸１３２－２３８セグメント（図１におけるＡおよびＢ）である。
ＰＤ－Ｌ１抗体
本発明は、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して高親和性を有するＰＤ－Ｌ１抗体を提供する。被験抗体は、効果的な結合および腫瘍殺傷活性を示し、治療および診断の用途として使用される。ＰＤ－Ｌ１タンパク質は、４０ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質である。その細胞外部分は、Ｎ－末端の免疫グロブリンＶ（ＩｇＶ）ドメイン（アミノ酸１９～１２７）およびＣ末端免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）ドメイン（アミノ酸１３２～２２５）を含む。抗体のＩｇＶドメインとＴ細胞受容体との間の相互作用と同様に、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は、それらのＩｇＶドメインに保存された前面および側面を介して相互作用する。現在の抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、すべてＩｇＶドメインに結合することにより、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間の結合を遮断する（図１ＡおよびＢ）。従って、本発明は、一つの発見を開示する。即ち、本発明のノンブロッキングＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＩｇＣ様ドメインに結合した後にＰＤ－Ｌ１標的を効果的に利用することができ、治療効果をさらに改善することができる。従って、本発明によって開示された一実施形態は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片を提供し、当該抗体またはその活性断片は、ヒトプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）タンパク質の免疫グロブリンＣ（ＩｇＣ）様ドメインに特異的に結合することができる。本発明の抗体は、ＰＤ－Ｌ１との高親和性結合、ＰＤ－Ｌ１に対する高特異性、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を刺激する能力、抗体依存性食作用（ＡＤＰＣ）および／またはＰＤ－Ｌ１発現細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、ならびに被験者および動物モデルにおいて単独でまたは他の抗がん療法と併用して使用する場合に有する腫瘍増殖を阻害する能力を含むがこれらに限定されない、一つまたは複数の種の所望の機能特性を有する。
いくつかの実施形態において、ＩｇＣ様ドメインは、アミノ酸残基１３２～２３８からなる。いくつかの実施形態において、前記抗体またはその活性断片は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸残基に結合することができる。
本発明の好ましい実施形態において、前記ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸配列は、
である。
ここで、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：１９中の１３２～２３８位は、ＩｇＣ様領域である。
ＰＤ－Ｌ１のアミノ酸セグメントおよび位置は、次の表に示されたとおりである。
分泌型ｓＰＤ－Ｌ１スプライス変異体
本発明者らは、分泌型ＰＤ－Ｌ１スプライス変異体、およびそれらとｓＰＤ－Ｌ１分泌との関係をはじめて発見した。ｓＰＤ－Ｌ１の分泌は、膜型ＰＤ－Ｌ１の発現に正比例し、そのスプライシング活性、サイトカインの刺激、細胞のストレス応答、および細胞の損傷と細胞死にも関連する。ヒトＰＤ－Ｌ１スプライス変異体ＰＤ－Ｌ１－１、ＰＤ－Ｌ１－３、ＰＤ－Ｌ１－９とＰＤ－Ｌ１－１２およびその配列は、図２に示されたとおりである（注：ＰＤ－Ｌ１－１２は、ＰＤ－Ｌ１－３アミノ酸配列と同じである）。ここで、「分泌型ＰＤ－Ｌ１」、「可溶性ＰＤ－Ｌ１」、「分泌型ｓＰＤ－Ｌ１」、「ｓＰＤ－Ｌ１」とは、交換可能に使用され、すべて分泌型ＰＤ－Ｌ１スプライス変異体を指す。
具体的な実施例において、天然形態の分泌型ｓＰＤ－Ｌ１は、ＭＣ３８細胞によって発現および分泌され、ｒＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳは、ｒＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳ、ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳを含む、ＨＥＫ２９３細胞によって組換え発現されたＨｉｓタグを有する分泌型ｓＰＤ－Ｌ１である。
別の好ましい例において、五つの特異的な抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体の選択に成功し、それらは、細胞上に発現するＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣを識別する。この五つのモノクローナル抗体のいずれもｓＰＤ－Ｌ１－３に結合せず、そのうちの一つのモノクローナル抗体は、ｓＰＤ－Ｌ１－９を部分的に回避することができ、ｓＰＤ－Ｌ１－９は、ＩｇＶおよびＩｇＣ機能セグメントを含む、ＰＤ－Ｌ１全体の細胞外全長である。ｓＰＤ－Ｌ１－９を分泌するマウス腫瘍モデルにおけるインビボ実験は、それが抗薬剤耐性および抗腫瘍効果を有することを示す。
別の好ましい例において、ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体＃１９を選択する。
抗体１３００２１（参照抗体）、即ちマウスモノクローナル抗体１３００２１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域に結合し、可溶性ＰＤ－Ｌ１タンパク質中のｓＰＤ－Ｌ１－３に結合せず、ｓＰＤ－Ｌ１－９に結合する。
本明細書で使用されるように、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、二つの同一の軽鎖（Ｌ）および二つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、同じ構造的特徴を有する約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、一つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に結合し、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間でのジスルフィド結合の数は、異なる。各重鎖および軽鎖には、規則的な間隔で配置された鎖内ジスルフィド結合もある。各重鎖は、一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域が続く。各軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）を有し、別の端に定常領域を有し、軽鎖の定常領域は、重鎖の第１の定常領域に対向し、軽鎖の可変領域は、重鎖の可変領域に対向する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖との可変領域間で界面を形成する。
本明細書で使用されるように、「可変」という用語は、抗体中の可変領域の特定の部分の配列が異なることを表し、それは、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成する。しかしながら、可変性は、抗体可変領域全体に均等に分散されていない。これは、軽鎖および重鎖の可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる三つの断片に集中する。可変領域のより保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、四つのＦＲ領域を含み、それらは、接続環を形成する三つのＣＤＲによって接続された大抵β－フォールディング構成にあり、場合によっては部分的なβフォールディング構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によって緊密に近接され、かつ別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２、巻Ｉ、６４７～６６９ページ（１９９１）を参照する）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関与するが、それらは、抗体の抗体依存性細胞毒性に関与する等、様々なエフェクター機能を示す。
脊椎動物の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に従って、二つの異なるクラス（κおよびλと呼ばれる）のいずれかに割り当てることができる。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に従って、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの五つの主なクラスがあり、そのうちのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２のようなサブクラス（アイソタイプ）にさらに分類できる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構成は、当業者に周知である。
本明細書で使用されるように、「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、実質的に均一な集団から得られる抗体を指し、即ち、当該集団に含まれる個々の抗体は、いくつかの可能性のある自然に発生する突然変異を除いて同じである。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して非常に特異的である。また、従来のポリクローナル抗体製剤（通常、異なる決定基に対する異なる抗体を有する）とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体の利点は、それらがハイブリドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンによって汚染されないことである。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の特性を表し、これは、抗体精製に特定の方法が必要であると解釈されるべきではない。
本発明は、前記抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質モノクローナル抗体の対応するアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体、前記抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質モノクローナル抗体可変領域鎖を有するモノクローナル抗体、ならびにこれらの鎖を有する他のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現生成物をさらに含む。具体的には、本発明は、当該超可変領域が本発明の軽鎖および重鎖の超可変領域と同一であるか、または少なくとも９０％相同性、好ましくは少なくとも９５％相同性である限り、超可変領域（相補性決定領域、ＣＤＲ）を含む軽鎖および重鎖を有する任意のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現生成物（即ち、免疫コンジュゲートおよび融合発現生成物）を含む。
当業者に知られているように、免疫コンジュゲート及融合発現生成物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素ならびに他の診断用分子または治療用分子を前記抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質モノクローナル抗体またはその断片に結合して形成されるコンジュゲートを含む。本発明は、前記抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質モノクローナル抗体またはその断片に結合する細胞表面マーカーまたは抗原をさらに含む。
本発明は、完全なモノクローナル抗体だけでなく、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２断片のような免疫活性を有する抗体断片、抗体重鎖、抗体軽鎖も含む。
本明細書で使用されるように、「重鎖可変領域」および「ＶＨ」という用語は、交換可能に使用される。
本明細書で使用されるように、「可変領域」および「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）」という用語は、交換可能に使用される。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖可変領域は、三つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
別の好ましい例において、前記抗体の重鎖は、上記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含み、前記重鎖定常領域は、マウスまたはヒト由来であり得る。
別の好ましい例において、前記抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質のマウスまたはヒト－マウスキメラモノクローナル抗体であり、その重鎖定常領域および／または軽鎖定常領域は、ヒト化重鎖定常領域または軽鎖定常領域であり得る。より好ましくは、前記ヒト化重鎖定常領域または軽鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２等の重鎖定常領域または軽鎖定常領域である。
本発明は、本発明の抗体を有する他のタンパク質または融合発現生成物をさらに提供する。具体的には、本発明は、当該可変領域が本発明の抗体の重鎖および軽鎖の可変領域と同一であるか、または少なくとも９０％相同性、好ましくは少なくとも９５％相同性である限り、可変領域を含む重鎖および軽鎖の任意のタンパク質またはタンパク質コンジュゲートおよび融合発現生成物（即ち、免疫コンジュゲートおよび融合発現生成物）を含む。
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎖および軽鎖の可変領域に位置する三つの特定の領域によって説明でき、当該セクションを四つのフレームワーク領域（ＦＲ）に分割され、四つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的に保存され、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲは、環状構造を形成し、その間のＦＲによって形成されたβフォールディングは、空間構造的に近接し、重鎖のＣＤＲおよびそれに対応する軽鎖のＣＤＲは、抗体の抗原結合部位を構成する。同種の抗体のアミノ酸配列を比較することにより、ＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するアミノ酸を決定することができる。
本発明の抗体の重鎖および／または軽鎖の可変領域は、それらの少なくともいくつかが抗原との結合に関与するため、特に興味深い。従って、本発明は、そのＣＤＲがここで同定されたＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の相同性を有する限り、ＣＤＲを有するそれらのモノクローナル抗体の軽鎖和重鎖可変領域をゆする分子を含む。
本発明は、完全なモノクローナル抗体だけでなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体と他の配列とで形成される融合タンパク質も含む。従って、本発明は、前記抗体の断片、誘導体および類似体をさらに含む。
本明細書に使用されるように、「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、本発明の抗体と基本的に同じ生物学機能または活性を保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチド断片、誘導体または類似体は、（ｉ）一つのまたは複数の保存的または非保存性的アミノ酸残基（好ましくは、保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド（このように置換されたアミノ酸残基は、遺伝暗号によってエンコードされる場合とされない場合であり得る）、または（ｉｉ）一つのまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと別の化合物（例えば、ポリエチレングリコール等のポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチドまたは（ｉｖ）追加のアミノ酸配列がポリペプチド配列に融合されることによって形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列または分泌配列またはこのポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質配列または６Ｈｉｓタグで形成された融合タンパク質）であり得る。本明細書で使用されるように、これらの断片、誘導体および類似体は、当業者の周知の範囲内である。
本発明の抗体とは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質結合活性を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドを指す。当該用語は、本発明の抗体と同じ機能を有する、上記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異形態をさらに含む。これらの変異形態は、一つまたは複数（通常は、１～５０個、好ましくは１～３０個、より好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個である）のアミノ酸の欠失、挿入および／または置換、およびＣ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数（通常は、２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内である）のアミノ酸の追加を含む（これらに限定されない）。例えば、当技術分野において、類似または近似の性能を有するアミノ酸によって置換される場合、通常、タンパク質の機能を変化させない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端での一つまたは複数のアミノ酸の追加も、通常、タンパク質の機能を変化させない。当該用語は、本発明の抗体の活性断片および活性誘導体をさらに含む。
当該ポリペプチドの変異形態は、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然突然変異体、誘導突然変異体、高いまたは低いストリンジェンシー条件下で本発明の抗体のコーティングＤＮＡとハイブリダイズすることができるタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を使用することによって得られるポリペプチドまたはタンパク質を含む。
本発明は、ヒト抗体またはその断片を含む融合タンパク質等の、他のポリペプチドをさらに提供する。ほぼ全長のポリペプチドに加えて、本発明は、本発明の抗体の断片をさらに含む。通常、当該断片は、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続アミノ酸を有する。
本発明は、上記抗体またはその断片またはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であり得る。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であり得る。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意選択の追加のコード配列）ならびに非コード配列を含む。
「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、このポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み得るか、追加のコードおよび／または非コード配列をさらに含むポリヌクレオチドであり得る。
本発明は、前記配列とハイブリダイズし、二つの配列間で少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドにさらに関する。本発明は、特に、ストリンジェント条件下で本発明の前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェント条件」とは、（１）例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０oＣ等のより低いイオン強度およびより高い温度でのハイブリダイズおよび溶出、または（２）ハイブリダイズ中に、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、４２oＣ等の変性剤の添加、または（３）二つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは、９５％以上である場合にのみおこるハイブリダイズを指す。さらに、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
本発明の抗体の全長ヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法によって得ることができる。特にフラグメントの長さが短い場合、実行可能な方法は、人工合成法を使用して関連する配列を合成することである。一般に、最初に複数の小さなフラグメントを合成した後、接続して非常に長い配列のフラグメントを獲得する。さらに、重鎖のコード配列および発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合させて、融合タンパク質を形成することができる。
関連する配列を得られたら、組換え法を使用して、関連する配列を大量に得ることができる。通常、これは、それをベクターにクローニングし、次に細胞に形質転換し、次に従来の方法によって増殖した宿主細胞から関連する配列を単離することによって得られる。本発明に関与する生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。
現在、完全に化学的合成によって本発明のタンパク質（またはそのフラグメントまたはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列を当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入することができる。さらに、化学的合成によって突然変異を本発明のタンパク質配列に導入することができる。
本発明は、前記適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含むベクターにさらに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現できるように適切な宿主細胞に形質転換するために使用されることができる。
宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞、または酵母細胞のような下等真核細胞、または哺乳動物細胞のような上等真核細胞であり得る。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス、チャイニーズハムスター菌の細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ドロソフィラＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７および２９３細胞の動物細胞等を含む。
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術によって実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡ吸収することができるコンピテント細胞は、指数増殖期の後にＣａＣｌ２法で処理されることによって獲得され、使用される段階は、当技術分野でよく知られている。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションの方法によって、形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法，マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション等の従来の機械的方法、リポソームパッケージ等のようなＤＮＡトランスフェクション方法を選択することができる。
得られた形質転換体を従来の方法で培養して、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで増殖した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）を使用して選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間さらに培養する。
前記方法における組換えポリペプチドは、細胞内、または細胞膜で発現されるか、または細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、物理的、化学的およびその他の特性を使用して、様々な単離方法で組換えされたタンパク質を単離および精製することができる。これらの方法は、当業者によく知られている。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧滅菌、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および他の様々な液体クロマトグラフィー技術ならびにこれらの方法の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、単独で使用することができ、検出可能なマーカー（診断目的のために）、治療剤、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分または任意のこれらの物質の組み合わせと結合またはカップリングすることができる。
診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（コンピューター断層撮影）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素を含むが、これらに限定されない。
本発明の抗体と結合するか、またはカップリングすることができる治療剤は、１．放射性核種、２．生物学的毒性、３．ＩＬ－２等のサイトカイン、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．ナノ磁性粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、１０．化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
免疫コンジュゲート
本発明は、本発明の抗体に基づく免疫コンジュゲートを提供し、好ましくは、前記免疫コンジュゲートは、抗体薬物コンジュゲート（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）である。
典型的には、前記抗体薬物コンジュゲートは、前記抗体、およびエフェクター分子を含み、前記抗体は、前記エフェクター分子にカップリングし、好ましくは、化学カップリングである。ここで、前記エフェクター分子は、好ましくは治療活性を有する薬物である。さらに、前記エフェクター分子は、毒性タンパク質、化学療法薬、小分子薬または放射性核種のうちの一つまたは複数の種であり得る。
本発明の抗体は、カップリング剤を介して前記エフェクター分子にカップリングされることができる。前記カップリング剤の例としては、非選択的カップリング剤、カルボキシル基を用いたカップリング剤、ペプチド鎖、ジスルフィド結合を用いたカップリング剤のうちの任意の一つまたは複数の種であり得る。前記非選択的カップリング剤は、エフェクター分子と抗体とを共有結合させる化合物、例えば、グルタルアルデヒドなどを指す。前記カルボキシル基を用いたカップリング剤は、シスアコニット酸無水物カップリング剤（例えば、シスアコニット酸無水物）、アシルヒドラゾンカップリング剤（カップリング部位は、アシルヒドラゾンである）のうちの任意の一つまたは複数の種であり得る。
抗体上の特定の残基（例えば、ＣｙｓまたはＬｙｓ等）は、様々な官能基と結合するために使用され、ここで、イメージング試薬（例えば、発色団および蛍光団）、診断試薬（例えば、ＭＲＩ造影剤および放射性同位体）、安定剤（例えば、グリコールポリマー）ならびに治療剤を含む。抗体は、機能剤にカップリングされて、抗体－機能剤のコンジュゲートを形成することができる。機能剤（例えば、薬物、検出試薬、安定剤）は、抗体にカップリング（共有結合）される。機能剤は、抗体に直接、またはリンカーを介して間接的に結合することができる。
抗体は、薬物にカップリングされることにより、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣｓ）を形成することができる。典型的に、ＡＤＣは、薬物と抗体との間に位置するリンカーを含む。リンカーは、分解性または非分解性リンカーであり得る。分解性リンカーは、通常、細胞内環境、例えば、リンカーを分解する目的の部位で分解を受けやすく、それによって抗体から薬物を放出する。適切な分解性リンカーは、例えば、細胞内プロテアーゼ（例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼ）によって分解可能なペプチジル含有リンカーを含む酵素的に分解可能なリンカー、またはグルクロニダーゼによって分解可能なグルクロニド含有リンカー等の糖リンカーを含む。ペプチジルリンカーは、例えば、バリン－シトルリン、フェニルアラニン－リジンまたはバリン－アラニンなどの二ペプチドを含むことができる。他の適切な分解性リンカーは、例えば、ｐＨ感受性リンカー（例えば、５．５未満のｐＨで加水分解するリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカー）および還元条件下で分解できるリンカー（例えば、ジスルフィド結合リンカー）を含む。非分解性リンカーは、通常、抗体がプロテアーゼによって加水分解される条件下で薬物を放出する。
薬物は、任意の細胞毒性、細胞成長阻害性または免疫阻害性の薬物であり得る。実施形態において、リンカーは、抗体および薬物と結合し、薬物は、リンカーと結合を形成できる官能基を有する。例えば、薬物は、リンカーと結合を形成できるアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、またはケト基を有することができる。薬物がリンカーに直接結合される場合、薬物は、抗体に結合される前に、反応性活性基を有する。
有用な薬物のクラスは、例えば、抗チューブリン薬、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化試薬、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイド等を含む。特に有用な細胞毒性薬の種類の例としては、例えば、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、例えば、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、デュオカルマイシン／デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）およびメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）またはベンゾジアゼピンを含む薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｒｕｇｓ）（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、インドリンベンゾジアゼピン（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）およびオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））およびビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ ａｌｋａｌｏｉｄｓ）。
本発明において、薬物－リンカーは、一つの簡単安段階でＡＤＣを形成することができる。他の実施形態において、二官能性リンカー化合物は、２段階または多段階方法でＡＤＣを形成するために使用されることができる。例えば、システイン残基は、最初の段階でリンカーの反応活性部分と反応され、また、その後の段階で、リンカー上の官能基が薬物と反応されることにより、ＡＤＣを形成する。
本発明は、抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するのに十分な条件下で、抗体を薬物－リンカー化合物と結合させる段階をさらに含むことができる、ＡＤＣを調製するための方法を提供する。
特定の実施形態において、本発明の方法は、抗体－リンカーコンジュゲートを形成するのに十分な条件下で、抗体を二官能性リンカー化合物と結合させる段階を含む。これらの実施形態において、本発明の方法は、リンカーを介して薬物部分を抗体に結合させるのに十分な条件下で、抗体リンカーコンジュゲートを薬物部分に結合させる段階をさらに含む。
いくつかの実施形態において、抗体薬物コンジュゲートＡＤＣは、次のような分子式を有し、
ここで、
Ａｂは、抗体であり、
ＬＵは、リンカーであり、
Ｄは、薬物であり、
下付きｐは、１～８の値から選択される。
医薬組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましい例において、前記組成物は、医薬組成物であり、それは、上記の抗体またはその活性断片またはその融合タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む。通常、これらの物質を、毒性がなく、不活性で、薬学的に許容される水性担体媒体で処方することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８、好ましくは、約６～８であり、ｐＨ値は、処方される物質の性質および治療される病症によって異なる。製剤化された医薬組成物は、従来の経路で投与されることができ、ここで、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（これらに限定されない）。
本発明の医薬組成物は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質分子に結合するために直接使用されることができ、従って、腫瘍を予防および治療するために使用されることができる。さらに、他の治療剤と同時に使用されることもできる。
本発明の医薬組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは、０．０１～９０ｗｔ％、より好ましくは、０．１～８０ｗｔ％）の本発明の上記のモノクローナル抗体（またはそのコンジュゲート）および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。このような担体は、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。薬物製剤は、投与方法と一致する必要がある。本発明の医薬組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースと他のアジュバントとを含む水溶液を使用して、従来の方法によって注射の形態で調製することができる。注射剤および溶液等の医薬組成物は、無菌条件下で調製する必要がある。有効成分の投与量は、治療有效量であり、例えば、毎日の約１μｇ／ｋｇ体重～約５ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、本発明の二重特異性抗体は、他のポリペプチドとともに使用することもできる。
別の具体的な実施形態において、医薬組成物は、追加の有効成分をさらに含み、好ましくは、前記有効成分は、小分子化合物、サイトカイン、抗体（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＣＤ４７抗体、ＡＤＣ、ＣＡＲ－免疫細胞）を含む。
別の具体的な実施形態において、癌、炎症性疾患、病症または病況、免疫疾患、病症または病況、自己免疫疾患、病症または病況または感染性疾患、病症または病況の治療に使用される組成物は、化学療法、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、抗ＴＩＭ－３ｍＡｂ、抗ＬＡＧ－３ｍＡｂ、抗ＣＤ７３ｍＡｂ、抗ＣＤ４７ｍＡｂ、抗ＤＬＬ３ｍＡｂ、抗ＦＲｍＡｂｍＡｂ、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＰＤ－１抗体、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１治療、他の免疫腫瘍薬、抗血管新生薬、放射線療法、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、標的療法または他の抗がん薬を含むがこれらに限定されない、別の両方と併用して使用されることができる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＰＤ－１、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＣＴＬＡ－４、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ－２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ７３、ＣＤ４７、ＤＬＬ－３、ＣＬＤＮ１８．２、葉酸受容体α（ＦＯＬＲ１）、および／または他の腫瘍表面抗原等の標的に対するパートナーｍＡｂと一緒に、ＰＤ－Ｌ１および特定の腫瘍関連抗原を発現する癌／腫瘍を治療するための二重特異性抗体構築することができる。
医薬組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫コンジュゲートを哺乳動物に投与し、ここで、当該安全かつ有効な量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該投与量は、約１０μｇ／ｋｇ体重～約１ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん，具体的な投与量は、投与経路および患者の健康状態等の要因を考慮する必要があり、これらは、すべて熟練した医師のスキル範囲内にある。
適用
本発明の他の方法は、特定の毒素または病原体に露出される患者を治療するために使用される。従って、本発明の別の態様は、対象に本発明のＰＤ－Ｌ１結合分子を投与して、前記対象の腫瘍または感染性疾患を予防および／または治療する段階を含む、前記対象における腫瘍または感染性疾患を予防および／または治療するための方法を提供する。
別の好ましい例において、前記医薬組成物は、腫瘍を治療するための薬物の調製に使用され、前記腫瘍は、膀胱がん、例えば低悪性度神経膠腫、神経膠芽腫等の神経膠腫の脳がん、子宮頸がん、乳がん、結腸がん、直腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん、腎細胞がん、腎盂がん、白血病、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん、線維肉腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫、骨髄由来腫瘍、甲状腺がんからなる群から選択される。
上記のような腫瘍に対する適用と同様に、本発明のＰＤ－Ｌ１抗体は、単独で使用するか、またはワクチンと組み合わせてアジュバントとしてとして使用して、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。当該治療法が特に適用可能な病原体の例としては、現在有効なワクチンがない病原体、または従来のワクチンが十分に有効でない病原体を含む。ここで、Ｈ１Ｖ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ）、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌を含むが、これらに限定されない。ＰＤ－Ｌ１遮断剤は、感染時に変化した抗原を提示する、ＨＩＶ等の病原体による確立された感染に対して特に有用である。抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体を投与する場合、これらの新規エピトープは、外来性として識別されることにより、ＰＤ－Ｌ１の負のシグナル影響とは関係なく強力なＴ細胞応答を引き起こす。
好ましくは，本発明の抗体は、感染性疾患の治療に使用されることができる。本発明の抗体によって治療される感染性疾患は、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ）、結核菌からなる群から選択されることができる。
上記のすべての方法において、本発明のＰＤ－Ｌ１抗体は、サイトカイン療法（例えば、インターフェロン、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＩＬ－２）または二重特異性抗体療法等の他の形態の免疫療法と併用することができ、二重特異性抗体療法は、増強された腫瘍抗原の提示を提供する。
ハイブリドーマ細胞株
本発明は、本発明のＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を生成できるハイブリドーマ細胞株をさらに提供し、好ましくは、本発明は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する高力価のモノクローナル抗体を有するハイブリドーマ細胞株を提供する。
本発明のＰＤ－Ｌ１タンパク質に対するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを得た後、当業者は、当該ハイブリドーマを使用して抗体を簡単に調製することができる。さらに、当業者は、本発明の抗体の構造（例えば、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域）を容易に知ることができ、次いで組換え法により本発明のモノクローナル抗体を調製することができる。
方法およびサンプル
本発明は、細胞および／または組織で溶解されたサンプルで腫瘍を検出するための方法に関する。当該方法の段階は、大まかに次のとおりである。細胞および／または組織サンプルを得、サンプルを媒体に溶解し、前記溶解されたサンプルでＰＤ－Ｌ１タンパク質のレベルを検出する。本発明の検出方法において、使用されるサンプルは、特に限定されず、代表的な例としては、細胞保存液に存在する細胞含有サンプルである。
キット
本発明は、本発明の抗体（またはその断片）または本発明の検出プレートを含むキットをさらに提供し、本発明の好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、緩衝剤等をさらに含む。
本発明は、ＰＤ－Ｌ１レベルを検出するための検出キットをさらに設計し、当該キットは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質を識別するための抗体、サンプルを溶解するための溶解媒体、様々な緩衝液、検出標識、検出基質等の検出に必要な一般的な試薬および緩衝液を含む。当該検出キットは、インビトロ診断装置であり得る。
本発明の主な利点は、次のとおりである。
（ａ）本発明の抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質の抗体は、独特のエピトープを有し、ＩｇＣ様機能セグメントを標的とする。アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ＢＭＳ－９６３５５９およびアベルマブ等の、ＩｇＶ機能セグメントを標的とする既知のＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体とは異なる。
（ｂ）本発明の抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質の抗体は、膜型ＰＤ－Ｌ１を特異的に識別し、分泌型ｓＰＤ－Ｌ１を最大限に回避することができる。
（ｃ）本発明の抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質の抗体は、ｓＰＤ－Ｌ１を分泌する腫瘍に対して抗薬剤耐性を有する。
（ｄ）本発明の抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質の抗体は、ＡＤＣＣ機能を増強させることができる。
（ｅ）本発明の抗ＰＤ－Ｌ１タンパク質の抗体は、腫瘍殺傷効果を有する。
（ｆ）本発明のＰＤ－Ｌ１抗体、または他の抗腫瘍薬との併用投与は、遮断型ＰＤ－Ｌ１抗体薬剤耐性のある腫瘍のために選択可能な方法を提供することにより、免疫療法の治療効果を改善する。
以下、本発明は、具体的実施例と併せてされに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例において、具体的条件を示さない実験方法は、通常、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）に記載される条件等の従来の条件、またはメーカーによって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージおよび部数は、重量パーセンテージおよび重量部数で計算される。
プライマー配列および発現宿主細胞
表１．ヒトまたはマウスＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１特異的プライマー
遺伝子発現宿主細胞および試験的用途
表２．遺伝子発現宿主細胞および試験的用途
表３．本発明に関与する抗体
細胞株および細胞培養条件
ＭＣ３８は、マウス結腸がん細胞であり、ＨＥＫ２９３は、ヒト胎児腎細胞であり、どちらも、上海ＧＡＩＮＩＮＧ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ株式会社から入手し、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清培地で増殖させる。ＣＨＯ－Ｋ１は、チャイニーズハムスター卵巣細胞であり、杭州ＨＵＡＢＩＯ株式会社から提供され、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ウシ胎児血清培地で増殖させる。
細胞蛍光抗体標識および細胞フローサイトメトリー検出
ＭＣ３８／ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、陽性検出細胞としてそれぞれＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様を発現する。ＭＣ３８／ＣＨＯ－Ｋ１細胞野生型および発現ＰＤ－Ｌ２は、陰性対照として使用する。マウス免疫後の血清（１：１００、１：１０００、１：１００００）または抗体クローンハイブリッド腫瘍細胞培養上清液（５０μｌ）、またはマウスモノクローナル抗体（濃度は、図面に示されている）、およびそのヒト化抗体（濃度は、図面に示されている）を加えて、約１×１０５の陰性および陽性検出細胞を標識し、４℃下で１５分間インキュベートする。ＰＢＳを加えて洗浄した後、ＰＥ結合ヤギ抗マウス抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えて標識し、４℃の暗所で１５分間インキュベートする。再びＰＢＳを加えて洗浄した後、細胞フローサイトメトリーによって検出する（ＮｏｖｏＣｙｔｅ、Ａｃｅａｂｉｏ、杭州）。
ＰＤ－Ｌ１細胞ＥＬＩＳＡ、直接ＰＤ－Ｌ１タンパク質ＥＬＩＳＡ、および分泌型ｓＰＤ－Ｌ１間接ＥＬＩＳＡ
確立された細胞ＥＬＩＳＡによってＰＤ－Ｌ１抗体サブクローンをスクリーニングする。９６ウェル細胞培養プレートにおいて、各ウェルに５０００個の陽性細胞をプレーティングし、３７℃、ＣＯ２細胞インキュベーターで２日間培養する。ＰＢＳを加えて細胞を洗浄し、培養プレートを１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、合計２回洗浄する。マウス免疫後の血清または抗体のクローンハイブリッド腫瘍細胞培養上清液を加え、４℃下で１時間インキュベートする。再びＰＢＳで２回洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、武漢、１：１０００希釈）を加え、且つ４℃下で３０分間インキュベートする。ＰＢＳで２回洗浄した後、ＴＭＢを加えて発色させ、１Ｍ ＨＣｌで発色反応を停止させる。マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＬＸ、Ｂｉｏｔｅｋ、米国）で、４５０波長の吸収値を介して上清液中のＰＤ－Ｌ１抗体の有無を検出する。
確立された直接タンパク質ＥＬＩＳＡによってＰＤ－Ｌ１抗体がｓＰＤ－Ｌ１に結合するかどうかを分析する。過去に行われたように、ウェルあたり５０ｎｇのＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳまたはＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳを高いタンパク質親和性を有する９６ウェルプレートにコーティングし、４℃下で一晩静置する。上清を捨て、各ウェルに１００ｕｌのＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を加えて９６ウェルプレートを３回洗浄する。各ウェルに１００μｌのＰＢＳ＋１％ＢＳＡを加え、室温下で４時間静置する。上清液を捨てた後、各ウェルに５０μｌの抗体のクローンハイブリドーマ細胞培養上清液を加え、４℃下で一晩インキュベートする。上清液を捨てた後、各ウェルに１００μｌのＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を加えて９６ウェルプレートを５回洗浄する。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１：１０００希釈）を加え、且つ室温下で２時間インキュベートする。ＴＭＢを加えて発色させた後、４５０波長の吸収値によって抗体がｓＰＤ－Ｌ１に結合するかどうかを検出する。
分泌型ｓＰＤ－Ｌ１（天然形態）ＥＬＩＳＡを使用してｓＰＤ－Ｌ１に対する抗体の親和性をさらに明らかにする。過去に行われたように、天然形態ｓＰＤ－Ｌ１は、ＭＣ３８細胞によって発現および分泌される。ｓＰＤ－Ｌ１を含む細胞培養上清は、ＰＤ－Ｌ１抗体の親和性を検出するために使用される。精製されたＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（０．２μｇ／ウェル）を４℃下で一晩コーティングする。ｓＰＤ－Ｌ１－３および／またはｓＰＤ－Ｌ１－９を発現するＭＣ３８細胞培養上清に、１００μｌ／ウェルを加える。４℃下で一晩洗浄した後、１００μｌ／０．１μｇ／ウェルのビオチン化ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、米国）を加え、室温下で２時間インキュベートする。洗浄した後にストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：２００００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国）を加え、室温下で２時間インキュベートする。７０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を加えて発色させ、その後３５μｌ／ウェルの１Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させる。抗体とｓＰＤ－Ｌ１との結合能は、４５０波長の吸収値によって検出される。
細胞結合試験
ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用に対するＰＤ－Ｌ１抗体の影響を分析するために、ＭＣ３８およびＣＨＯ－Ｋ１細胞は、それぞれトランスフェクトされ、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１を発現する。米国ＥＭＤ会社の細胞蛍光染色標識法に従って、ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８およびＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ６７によって標識され、ＰＤ－１を発現するＭＣ３８およびＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ２６によって標識される。二つの異なる標識細胞をＰＤ－Ｌ１または同型抗体の存在または非存在条件下で１時間共培養する。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用に対するＰＤ－Ｌ１抗体の影響は、細胞フローサイトメトリーによって検出される。二重陽性で標識された細胞クラスターは、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合したことを示す。さらに、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８およびＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ２６によって標識され、ヒトＰＤ－１を発現するＭＣ３８およびＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ６７によって標識される。ＰＤ－Ｌ１を発現するが異なるマーカーを発現するＭＣ３８細胞を共培養し、ＰＤ－１を発現するが異なるマーカーを発現ＭＣ３８細胞を共培養し、二重陽性で標識された細胞クラスターは、非特異的結合を表す（バックグラウンド対照）。
ＡＤＣＣ検出
ｉＣａｒＴａｂ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（蘇州）によって提供されるＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ＣＤ１６を介して、抗体Ｆｃによって誘導されるＣＤ１６活性化および細胞内ＮＦ－ＡＴシグナル伝達経路の活性化およびレポーター遺伝子ルシフェラーゼの生成を測定し、抗体のＦｃエフェクター機能を定量的に検出する。異なる濃度のヒト化ＰＤ－Ｌ１抗体条件下で、約１．２５×１０４／ウェルのＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１標的細胞を、ヒトＦｃγＲＩＩＩａを発現するエフェクター細胞と１：１０の比率で混合する。細胞インキュベーターで１０時間培養する。７５μｌ／ウェルのＢｒｉｇｈｔ Ｌｉｔｅ（商標）ルシフェラーゼ基質（ＶＡＺＹＭＥ ＢＩＯＴＥＣＨ、南京）を加え、且つ室温下で５乃至３０分間インキュベートする。光度計（Ｓｙｎｅｒｇｙ ＬＸ）によって発光強度を検出することにより、抗体Ｆｃによって誘導されるＡＤＣＣ機能を定量的に分析する。
抗ＰＤ－Ｌ１抗体の調製
ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域に結合する高親和性を有する抗体は、一次抗体の生成、精製および検証によって得られる。
表４．本発明の抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖可変領域、ＨＣＤＲ、軽鎖可変領域およびＬＣＤＲのアミノ酸配列
実施例１．抗ＰＤ－Ｌ１抗体の調製
段階１：ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１－ＩｇＣ様断片発現細胞株の確立
ヒトまたはマウス由来ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ２遺伝子テンプレートは、長沙ＹｏｕＢｉｏから入手される。各遺伝子および遺伝子断片は、遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲによってそれぞれ増幅される（例えば、表１に示される）。
増幅されたＰＣＲ生成物を消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて消化した同じｐｃＤＮＡ４プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、米国）を挿入する。遺伝子および遺伝子断片を発現するｐｃＤＮＡ４プラスミドベクターをそれぞれ異なる発現宿主細胞にトランスフェクトし、耐性スクリーニングを行う。ここで、ＰＤ－Ｌ１、ＩｇＣ様、ＰＤ－Ｌ２、またはＰＤ－１遺伝子断片を含むプラスミドベクターをそれぞれＣＨＯ－Ｋ１およびＭＣ３８細胞にトランスフェクトし、ｓＰＤ－Ｌ１－３およびｓＰＤ－Ｌ１－９遺伝子断片を含むプラスミドベクターをそれぞれＭＣ３８細胞にトランスフェクトし、ｓＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳおよびｓＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳ遺伝子断片を含むプラスミドベクターをそれぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトする。ＰＤ－Ｌ１、ＩｇＣ様、ＰＤ－Ｌ２、またはＰＤ－１遺伝子発現の宿主細胞および用途は、表２に示されたとおりである。
段階２：モノクローナルハイブリドーマ細胞の調製
ｈＰＤ－Ｌ１（アミノ酸１９－２９０）を発現するプラスミドベクターおよびＩｇＣ様（アミノ酸１３２－２９０）を高発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株で二つの方法でマウスをそれぞれ免疫化する。血清を１：１００、１：１０００、１：１００００に希釈し、ＭＣ３８発現ＰＤ－Ｌ１細胞（陽性細胞）、ＭＣ３８野生型およびＰＤ－Ｌ２発現細胞（陰性細胞）を使用して、細胞フローサイトメトリーによってマウス血清中の特異的抗体の力価を検出する。陽性血清を有するマウスを選択して細胞融合する。直接ＰＤ－Ｌ１タンパク質ＥＬＩＳＡおよび陽性と陰性細胞フローサイトメトリーによって培養上清の抗体の特異性および力価を検出する。適格な母クローンおよびサブクローンを選択し、モノクローナルハイブリドーマ細胞をさらに取得する。ｓＰＤ－Ｌ１タンパク質を用いてこれらの抗体の結合能力をさらに検出し、ｓＰＤ－Ｌ１親和性の欠失または低下のヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体をスクリーニングし、特に、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ機能を有するマウスＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂサブタイプをスクリーニングする。
段階３：抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体は、モノクローナルハイブリドーマ細胞の腹腔内注射、腹水の調製、タンパク質Ａのアフィニティークロマトグラフィー精製によって得られる。
段階４：抗ヒトＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体重鎖および軽鎖可変領域ＤＮＡシーケンシング、ならびにそのヒト化および発現と精製
簡単に言えば、全ＲＮＡは、マウスモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞から得られる。遺伝子特異的プライマーを使用し、且つ逆転写およびＰＣＲ反応によって重鎖および対応する軽鎖可変領域ＤＮＡを取得し、ＴＯＰＯ ＴＡクローン方法によって標的遺伝子をｐＣＲ（商標）ベクタープラスミドに挿入し、シーケンシングする。マウスモノクローナル抗体の可変領域のヒト化は、ＣＤＲ移植および復帰変異（Ｂａｃｋ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を含み、ヒトＩｇＧ１、кに移植される。ヒト化抗体配列を合成した後、それぞれ、ヒト化重鎖および軽鎖抗体発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を構築し、同時に対照としてヒト－マウスキメラ抗体発現ベクターを構築する。重鎖および軽鎖発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトする。抗体を分泌する細胞株をさらに増幅させる。抗体を含む培養上清をタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。
実施例２：ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体のスクリーニング
フローサイトメトリーによってヒトＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様の結合能が強いＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体をスクリーニングされる。ＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様をそれぞれ発現するＭＣ３８細胞を陽性検出細胞として使用する。ＭＣ３８細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ２を発現し、ＭＣ３８親細胞は、陰性対照として使用される。
抗体クローンハイブリドーマ細胞培養上清液（５０μｌ）またはマウスモノクローナル抗体（１００ｎｇ）で約１×１０５の陰性および陽性検出細胞を標識し、４℃下で１５分間インキュベートする。ＰＢＳを加えて洗浄した後、ＰＥ結合ヤギ抗マウス抗体（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加えて標識し、４℃の暗所で１５分間インキュベートする。ＰＢＳを加えて洗浄した後、細胞フローサイトメトリーによって検出される。
図３Ａに示されたように、ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体クローン１３００２１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様に結合する。ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体クローン２９Ｅ．２Ａ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）は、ＰＤ－Ｌ１にのみ結合するが、ＩｇＣ様セグメントを識別せず、その識別領域がＩｇＶにのみあること示す。図３Ｂに示されるように、細胞フローサイトメトリーによって、３３個のＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体からＰＤ－Ｌ１に結合し、ＩｇＣ様を識別する五つのモノクローナル抗体をスクリーニングし、それぞれｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１５、ｍＡｂ＃１９およびｍＡｂ＃２３からスクリーニングする。
実施例３：ＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体の親和性、親和性に対するｓＰＤ－Ｌ１の影響
直接ＰＤ－Ｌ１タンパク質ＥＬＩＳＡによって、組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１抗体の親和性を検出する。組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳおよびＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳをＨＥＫ２９３細胞で発現し、その培養上清をＮｉカラムに通してｒＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳを精製する。５０ｎｇのＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳまたはＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの各ウェルをタンパク質高親和性を有する９６ウェルプレートにコーティングされ、４℃下で一晩静置する。上清を捨て、各ウェルに１００ｕｌのＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を加えて９６ウェルプレートを３回洗浄する。各ウェルに１００μｌのＰＢＳ＋１％ＢＳＡを加え、室温下で４時間静置する。上清液を捨てた後、各ウェルに１００μｌ（１００ｎｇ）のモノクローナル抗体を加え、４℃下で一晩インキュベートする。上清液を捨てた後、各ウェルに１００μｌのＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）を加えて９６ウェルプレートを５回洗浄する。ＨＲＰ結合ヤギ抗マウス二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１：１０００希釈）を加え、且つ室温下で２時間インキュベートする。ＴＭＢを加えて発色させた後、４５０波長の吸収値によって抗体がｓＰＤ－Ｌ１に結合するかどうかを検出する。直接ＥＬＩＳＡによって、組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１（ｒＰＤ－Ｌ１）に対する五つのＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１５、ｍＡｂ＃１９およびｍＡｂ＃２３の結合能を検出する。
実験結果は、図４Ａに示されたとおりであり、五つのＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体のいずれも、ＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳに結合せず、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃１９とＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳとの結合能力が最も小さい。
細胞フローサイトメトリーによって、五つのＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体に対する組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳ（ｒＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳ）およびＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの遮断効果を検出する。２００ｎｇの組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳ（抗体のモル数の１４倍）または組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳ（抗体のモル数の１０倍）を、それぞれ１００ｎｇのＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１５、ｍＡｂ＃１９およびｍＡｂ＃２３と、４℃下で２時間プレインキュベートした後、ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞と３０分間プレインキュベートする。
実験結果は、図４Ｂに示されたとおりであり、結果によると、ｒＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳは、五つのＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体とＰＤ－Ｌ１との結合を遮断できず、ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳは、ｍＡｂ＃４、ｍＡｂ＃１５、およびｍＡｂ＃２３を遮断できるが、ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃１１、ｍＡｂ＃１９と細胞上のＰＤ－Ｌ１との結合を部分的に阻害することを示す。マウスモノクローナル抗体は、分泌型ＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳを回避でき、ＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳを部分的に回避できることを示す。
スクリーニングされた五つのマウスモノクローナル抗体からＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体＃１９を選択し、ＰＤ－Ｌ１へのマウスモノクローナル抗体＃１９の結合に対する組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－９の影響を検出する。１００ｎｇの抗体＃１９を、異なる濃度（図面に示されるように）の組換えタンパク質ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳと共に、４℃下で２時間プレインキュベートした後、ＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞と共に３０分間インキュベートする。細胞フローサイトメトリーによって、ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体＃１９結合機能に対するｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの影響を分析する。
実験結果は、図４Ｃに示されたとおりであり、結果によると、組換えタンパク質ＰＤ－Ｌ１－９のモル濃度がマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃１９の４０倍の場合、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ＃１９は、依然としてＰＤ－Ｌ１に結合できることを示す。さらに、マウスモノクローナル抗体は、ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳを部分的に回避できることを示す。
分泌型ｓＰＤ－Ｌ１間接ＥＬＩＳＡによって、天然形態ｓＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体＃１９の親和性を検出する。ＭＣ３８細胞は、トランスフェクトされ、天然形態ｓＰＤ－Ｌ１を発現する。その細胞培養上清は、天然形態ｓＰＤ－Ｌ１を含む。精製されたＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体（０．２μｇ／ウェル）を４℃下で一晩コーティングする。ｓＰＤ－Ｌ１－３またはｓＰＤ－Ｌ１－９を発現するＭＣ３８細胞培養上清から１００μｌ／ウェルを加える。４℃下で一晩洗浄した後、１００μｌ／０．１μｇ／ウェルのビオチン化ＰＤ－Ｌ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、室温下で２時間インキュベートする。洗浄した後にストレプトアビジン－ＨＲＰ（１：２００００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温下で２時間インキュベートする。７０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を加えて発色させ、その後３５μｌ／ウェルの１Ｍ ＨＣｌを加えて反応を停止させる。抗体とｓＰＤ－Ｌ１との結合能は、４５０波長の吸収値によって検出される。
ＥＬＩＳＡによって、ｓＰＤ－Ｌ１－３およびｓＰＤ－Ｌ１－９（Ａ）、ｓＰＤ－Ｌ１－３（Ｂ）、またはｓＰＤ－Ｌ１－９（Ｃ）を含む細胞培養上清に対する＃１９モノクローナル抗体の親和性を検出する。Ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１ｔｏｔａｌは、ｓＰＤ－Ｌ１－３およびｓＰＤ－Ｌ１－９を識別するが、クローン１３００２１は、ｓＰＤ－Ｌ１－９のみに結合する。
実験結果は、図５に示されたとおりであり、結果によると、ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体＃１９は、細胞上のヒト膜型ＰＤ－Ｌ１を特異的に識別するが、天然形態ｓＰＤ－Ｌ１－３に結合せず、天然形態ｓＰＤ－Ｌ１－９に対する親和性は、クローン１３００２１よりもはるかに低く（注意すべきことは、図３Ａおよび３Ｂのフローサイトメトリー検出は、この抗体が膜型ｈＰＤ－Ｌ１に対して非常に低い親和性を有し、ＰＤ－Ｌ１マウスモノクローナル抗体＃１９よりもはるかに弱いことである）、即ち、分泌型ｓＰＤ－Ｌ１（ｓＰＤ－Ｌ１－３およびｓＰＤ－Ｌ１－９）を最大限に回避する。
実施例４：マウスＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗体活性の検出
ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞とヒトｓＰＤ－Ｌ１－９を分泌するＭＣ３８細胞とを２０：１の比率で混合し、約５×１０５細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１群６匹ずつ皮下注射する。７日後に腫瘍形成が見え、１００μｇ／マウスのアイソタイプ抗体またはモノクローナル抗体＃１９（ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を腹腔内注射し、抗体治療は、それぞれ腫瘍細胞注射後７日目、１０日目、１５日目にそれぞれ３回行われる。腫瘍大きさおよびマウスの生存率を定期的に検出する。腫瘍体積＝（長さ×幅２）／２。Ｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ ｔｅｓｔ）およびログランク検定（Ｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）は、それぞれ腫瘍大きさおよび生存率の実験で実験群間に有意差があるかどうかを検定するために使用される。
実験結果は、図６に示されたとおりである。結果によると、ヒトＰＤ－Ｌ１およびｓＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８マウス腫瘍モデルにおいて、ＰＤ－Ｌ１特異的抗体は、抗薬剤耐性および抗腫瘍効果を有することを示す。
実施例５：マウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体活性
マウスモノクローナル抗体＃１９をヒト化して、そのヒト化抗体を取得する。マウスモノクローナル抗体＃１９およびそのヒト化アミノ酸配列、異なる重鎖（Ａ）および軽鎖（Ｂ）Ｆａｂアミノ酸配列は、図７および表４に示されたとおりである。ここで、ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＨ４、ＶＨ５、ＶＨ６は、マウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体の重鎖可変領域であり、ＶＬ１、ＶＬ２、ＶＬ３、ＶＬ４、ＶＬ５は、マウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体の軽鎖可変領域である。
５．１．膜型および分泌型ＰＤ－Ｌ１、ならびにＩｇＣ様に対するマウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体の親和性
異なる重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の組み合わせ対膜型および分泌型ＰＤ－Ｌ１、ならびにＩｇＣ様に対する親和性を検出することにより、高親和性を有する重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の組み合わせをスクリーニングする。ここで、Ｈ６Ｌ２、Ｈ６Ｌ５、Ｈ４Ｌ４、Ｈ５Ｌ４、Ｈ６Ｌ４、Ｈ５Ｌ５，およびＨ４Ｌ５の親和性が最も高い。
ここで、膜型および分泌型ＰＤ－Ｌ１、ならびにＩｇＣ様に対するマウスモノクローナル抗体＃１９によってヒト化された異なる重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の組み合わせ（Ｈ６Ｌ２、Ｈ６Ｌ５、Ｈ４Ｌ４、Ｈ５Ｌ４）の親和性検出は、図８に示されたとおりである。
細胞フローサイトメトリーによって、膜型ＰＤ－Ｌ１（Ａ）およびＰＤ－Ｌ１ＩｇＣ様（Ｂ）に対するマウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体の親和性を検出する。
ＭＣ３８細胞をそれぞれトランスフェクトし、天然形態ｓＰＤＬ１－３およびｓＰＤＬ１－９の細胞培養上清を分泌させ、マウスモノクローナル抗体＃１９およびそのキメラ抗体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）、１３００２１、ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１ｔｏｔａｌと比較し、ＥＬＩＳＡによって分泌型ｓＰＤ－Ｌ１（ＣおよびＤ）に対するマウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体の結合能を検出する。
実験結果によると、マウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化重鎖および軽鎖の組み合わせ（Ｈ６Ｌ２、Ｈ６Ｌ５、Ｈ４Ｌ４、Ｈ５Ｌ４）は、ＰＤ－Ｌ１およびＩｇＣ様に結合し、また、それらは、ｓＰＤ－Ｌ１－３に結合せず、ｓＰＤ－Ｌ１－９に対する親和性は低いことを示す。
５．２．膜型ＰＤ－Ｌ２（ヒト）に対するマウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体の親和性
細胞フローサイトメトリーによって、膜型ＰＤ－Ｌ２に対するマウスモノクローナル抗体＃１９によってヒト化された異なる重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の組み合わせの親和性を検出する。
実験結果は、図９に示されたとおりであり、Ｈ６Ｌ２およびＨ６Ｌ５は、ＰＤ－Ｌ２に結合せず、Ｈ５Ｌ４は、ＰＤ－Ｌ２およびＣＨＯ－Ｋ１親細胞に対して微弱な結合を有する。
５．３．膜型ＣＤ８０（ヒト）に対するマウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体の親和性
細胞フローサイトメトリーによって、膜型ＣＤ８０（ヒト）に対する重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の組み合わせの親和性を検出する。
実験結果は、図１０に示されたとおりであり、Ｈ６Ｌ２およびＨ６Ｌ５は、ＣＤ８０に結合しない。
５．４．膜型ＰＤ－Ｌ１に対するマウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の親和性
５．４．１．ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの存在または非存在の条件下で、膜型ＰＤ－Ｌ１に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の親和性
アベルマブおよびアテゾリズマブと比較して、膜型ＰＤ－Ｌ１に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の親和性、ならびにアベルマブおよびアテゾリズマブと比較して、Ｈ６Ｌ２に対する様々な濃度のｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳの親和性の影響を細胞フローサイトメトリーによって検出される。
実験結果は、図１１Ａに示されたとおりであり、測定されたＨ６Ｌ２のＥＣ５０は、０．６２μｇ／ｍｌであり、アベルマブのＥＣ５０は、０．１７μｇ／ｍｌであり、アテゾリズマブのＥＣ５０は、０．２１μｇ／ｍｌである。
実験結果は、図１１ＢおよびＣに示されたとおりであり、ヒト化抗体Ｈ６Ｌ２は、抗ｓＰＤ－Ｌ１－９に対してアベルマブおよびアテゾリズマブよりも強い親和性を有する。
５．４．２．ｒＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳの存在または非存在の条件下で、膜型ＰＤ－Ｌ１に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の親和性
アベルマブ（Ａｖｅｌｕｍａｂ）およびアテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）と比較して、Ｈ６Ｌ２に対する様々な濃度のｒＰＤ－Ｌ１－３－ＨＩＳの親和性の影響を細胞フローサイトメトリーによって検出する。
図１２に示されたとおりであり、実験結果によると、ヒト化抗体Ｈ６Ｌ２は、抗ｓＰＤ－Ｌ１－３に対してアベルマブおよびアテゾリズマブよりも強い親和性を有することを示す。
５．５．ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の遮断効果
ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用を分析するために、ＣＨＯ－Ｋ１細胞をそれぞれトランスフェクトし、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１を発現する。ＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ６７で標識され、ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ２６で標識される。二つの異なる標識された細胞は、Ｈ６Ｌ２の存在または非存在の条件下で１時間共培養する。様々な抗体濃度は、図に示されたとおりである。細胞フローサイトメトリーによって、細胞間のＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用に対するこの抗体の影響を検出し、二重陽性標識細胞クラスターは、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合したことを示す。同時に、ＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ２６で標識されるが、ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞も、ＰＫＨ６７で標識される。ＰＤ－Ｌ１を発現するが異なる標識を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を共培養し、ＰＤ－１を発現するが異なる標識を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を共培養し、二重陽性標識細胞クラスターは、非特異的結合（バックグラウンド対照）を示す。結果は、図１３に示されたとおりである。
実験結果によると、Ｈ６Ｌ２は、細胞間のＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を遮断できないことを示す。
５．６．そのＡＤＣＣ作用に対するヒト化抗体Ｈ６Ｌ２のＡＤＣＣ活性および分泌型ｓＰＤ－Ｌ１の影響
図１４に示されたように、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ１６－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅプラットフォームにおいて、分泌型ｓＰＤ－Ｌ１（組換えタンパク質ｒＰＤＬ１－３－ＨＩＳまたはｒＰＤＬ１－９－ＨＩＳ）の無（Ａ）有（Ｂ）条件下で、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ルシフェラーゼ）活性を誘導する＃１９ヒト化抗体の能力を検出し、同時に、アベルマブと比較する。
実験結果によると、ヒト化抗体Ｈ６Ｌ２は、ＡＤＣＣ活性の誘導およびその抗ｓＰＤ－Ｌ１に対する能力において、アベルマブより優れることを示す。
実施例６：マウスモノクローナル抗体＃１９ヒト化抗体Ｈ６Ｌ２の抗腫瘍効果
３乃至５×１０５／マウスのヒトＰＤ－Ｌ１を発現するＭＣ３８細胞をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに１群５匹ずつ皮下注射する。７日後に腫瘍形成が見え、それぞれ腫瘍細胞注射後の７日目、１０日目、および１３日目に、１００μｇ／マウスのヒト化抗体Ｈ６Ｌ２またはアベルマブ、またはＰＢＳを対照群に合成３回腹腔内注射する。
結果は、図１５に示されたとおりであり、ここで、Ａ．各群における腫瘍大きさの平均値±標準誤差として表される腫瘍大きさを表す。Ｂ．生存率。Ｔ検定およびログランク検定は、それぞれ腫瘍大きさおよび生存率実験で実験群間に有意差があるかどうかを検定するために使用される。
実験結果によると、ヒト化抗体Ｈ６Ｌ２は、統計的に有意な抗腫瘍効果を有し、アベルマブよりも有意に優れることを示す。
比較例１：天然形態ｓＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブの結合能の間接ＥＬＩＳＡ検出
分泌型ｓＰＤ－Ｌ１の間接ＥＬＩＳＡによって、天然形態ｓＰＤ－Ｌ１に対する抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体アテゾリズマブの結合能を検出し、ＭＣ３８細胞は、それぞれｓＰＤ－Ｌ１－３またはｓＰＤ－Ｌ１－９を発現する。アテゾリズマブによってインキュベートされた細胞培養上清液中のｓＰＤ－Ｌ１濃度をＥＬＩＳＡによって検出することにより、その結合能を分析する。ｓＰＤ－Ｌ１－３またはｓＰＤ－Ｌ１－９を含む無血清細胞培養上清液を、それぞれ１．５μｇ／ｍｌのアテゾリズマブまたはヒトＩｇＧ１と共に一晩インキュベートし（示されるようにａｔｅ ｔｒｅａｔｅｄまたはｈＩｇＧ１ ｔｒｅａｔｅｄ）、タンパク質Ｇアガロース（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）を加え、遠心分離によってアテゾリズマブを除去する。ｓＰＤ－Ｌ１－３またはｓＰＤ－Ｌ１－９を含む上清液（示されるようにｓＰＤ－Ｌ１－３またはｓＰＤ－Ｌ１－９）をプレインキュベーションなしで陽性対照として使用する。ＢＬは、バックグラウンド対照として、ｓＰＤ－Ｌ１上清がないことを表す。
実験結果は、図１６に示されたとおりであり、結果によると、アテゾリズマブは、ｓＰＤ－Ｌ１－３およびｓＰＤ－Ｌ１－９に結合できることを示す。
比較例２．ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合に対するヒトＰＤ－Ｌ１抗体アベルマブおよびアテゾリズマブの遮断効果、ならびにその遮断効果に対する分泌型ｓＰＤ－Ｌ１の的影響
ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合に対するヒトＰＤ－Ｌ１抗体アベルマブおよびアテゾリズマブの遮断効果、ならびにその遮断効果に対する分泌型ｓＰＤ－Ｌ１の影響を検出するために、ＣＨＯ－Ｋ１細胞をトランスフェクトし、ヒトＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１を発現する。ＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ６７で標識されるが、ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞は、ＰＫＨ２６で標識される。二つの異なる標識細胞は、それぞれ、アベルマブまたはアテゾリズマブの存在条件下で、１時間共培養する。様々な抗体濃度は、図１７に示されたとおりである。細胞間のＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用に対する二つの抗体の影響を細胞フローサイトメトリーによって検出し、二重陽性標識細胞クラスターは、ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１に結合したことを表す。
ここで、ＡおよびＢは、細胞間のＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用に対するアベルマブおよびアテゾリズマブの影響を示す。ＣおよびＤは、アベルマブおよびアテゾリズマブに対するｓＰＤ－Ｌ１の遮断影響を示す。抗体用量は、１００ｎｇ／データポイントであり、ｒＰＤ－Ｌ１－９－ＨＩＳ用量は、図面に示されたとおりである。同時に、ＰＤ－Ｌ１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞も、ＰＫＨ２６で標識されるが、ＰＤ－１を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞も、ＰＫＨ６７で標識される。ＰＤ－Ｌ１を発現するが異なる標識を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を共培養し、ＰＤ－１を発現するが異なる標識を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を共培養し、二重陽性標識細胞クラスターは、非特異的結合を示す（バックグラウンド対照）。
実験結果によると、１μｇ／ｍｌの濃度を超えるアベルマブおよびアテゾリズマブは、細胞間のＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との結合を完全に遮断することができ、ｓＰＤ－Ｌ１は、アベルマブおよびアテゾリズマブの遮断効果を弱めたり失ったりすることができるが、完全な遮断を達成することができないことを示す。
比較例の結果によると、高濃度（１μｇ／ｍｌを超える）のアベルマブおよびアテゾリズマブは、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用を完全に遮断することができるが、天然形態ｓＰＤ－Ｌ１に結合することができるため、この二つのモノクローナル抗体の遮断能力を低下させ、薬剤耐性が乗じることを示す。
議論
抗体のＦｃセグメントは、その受容体ＦｃγＲに結合する。ＦｃγＲは、ナチュラルキラー細胞、単球、好中球および巨核球等の一連の免疫細胞に発現する。ＦｃとＦｃγＲとの間の相互作用は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、抗体代謝および力価の調節に対してかけがえのない役割を果たす。分子生物工学によるＦｃ ＣＨ２セグメントのＤＥＬアミノ酸置換は、ナチュラルキラー細胞の機能を大幅に高めることができる。
抗腫瘍における遮断型ＰＤ－Ｌ１抗体Ｆｃによって引き起こされる役割に関しては、ＰＤ－Ｌ１遮断型抗体（クローン１４Ｄ８）が異なる機能を有するマウスＦｃセグメントに置換され、それらの識別特異性、親和性、および代謝動態特性は変化しないが、抗腫瘍効果には統計的に有意差があることが研究で示される。例えば、ＩｇＧ２ａを有する１４Ｄ８抗体のＦｃ（即ち、１４Ｄ８／ＩｇＧ２ａ）は、腫瘍増殖を阻害する機能を有するＦｃ受容体を特異的に結合して活性化することができ、阻害性ＦｃγＲ受容体に結合する１４Ｄ８／ＩｇＧ１抗体、およびＦｃ受容体への結合能を失った１４Ｄ８／ＩｇＧ１－Ｄ２６５Ａ抗体の二つの抗体は、統計的に腫瘍阻害効果を失う。さらに、野生型マウスと比較して、活性化型ＦｃγＲｓを失うが阻害性ＦｃγＲＩＩｂを保持するマウス腫瘍モデルにおいて、別の遮断型ＰＤ－Ｌ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２）の抗腫瘍効果は、有意に弱められる。マウス腫瘍モデルにおいて、当該抗体は、抗腫瘍メカニズムの研究に広く使用される。これらの研究によると、抗腫瘍態様において、遮断型ＰＤ－Ｌ１抗体の重要な役割は、Ｆｃによって誘導されるＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性にあることを示し、別の態様において、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１との間の相互作用を遮断することによる遮断型ＰＤ－Ｌ１抗体の抗腫瘍効果は、非常に限られていることも示す。私たちの研究によると、遮断型ＰＤ－Ｌ１抗体のより高い濃度のみが完全に遮断できることを示す。
ＮＫ細胞は、自然免疫エフェクター細胞であり、それは、組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ）陰性の腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を溶解し、自然免疫応答を調整する。ＮＫ細胞は、溶解系を持続的に発現する。従って、ＮＫ細胞は、標的細胞を殺傷するために事前の活性化を必要とせず、変異細胞または腫瘍細胞の免疫監視において重要な役割を果たす。
ＡＤＣＣは、主にＮＫ細胞の殺傷活性に依存する。ＰＤ－１を発現するＴ細胞とは異なり、様々なアゴニスト性または阻害性生物標識を有する状態下のＮＫ細胞は、細胞フローディスプレイ、ｑＲＴ－ＰＣＲ、およびＲＮＡ－ｓｅｑ等の様々な検出方法によって、ＰＤ－１の発現が持続的に欠く。この特徴は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路をバイパスし、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞を殺傷するのに有益出る。また、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ、およびＣｅｔｕｘｉｍａｂのようなＡＤＣＣを誘導し、且つ癌患者を臨床的に効果的に治療できる腫瘍標的抗体の開発にせいこうした。アベルマブと比較して、私たちの抗体は、ＮＫ細胞活性を強力に誘導し、顕著な抗腫瘍効果を示す。要約すると、ＰＤ－Ｌ１の機能遮断、Ｔ細胞の機能回復、間接的な殺傷効果だけでなく、ＡＤＣＣおよびＮＫ細胞を用いてＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞を標的とし、直接殺傷することで、反応率を増加させる可能性がある。
モノクローナル抗体１３００２１、＃４、＃１５および＃２３は、細胞上の膜型ＰＤ－Ｌ１への結合能が＃１９より弱いが、ｓＰＤ－Ｌ１－９（細胞外全長）への結合能が＃１９より強い。これは、細胞上の膜型ＰＤ－Ｌ１への親和性がｓＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域への結合能を决定せず、その逆でも同じであることを示す。さらに、細胞上の膜型および分泌型タンパク質の三次構造は、まったく同じではない可能性がある。実験結果によると、抗体がこの２種類の標的タンパク質に対して異なる親和性を有し、ｓＰＤ－Ｌ１分泌型薬剤耐性腫瘍を治療するために好機をもたらす可能性があることを示す。
分泌型ｓＰＤ－Ｌ１の薬剤耐性メカニズムおよびそれらのアミノ酸配列の特徴、ならびに抗腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１抗体のＦｃおよびＮＫ細胞によって引き起こされる重要な役割に基づいて、本発明者らは、まったく新しいエピトープを設計し、且つ免疫原として使用し、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ機能セグメントに対するＰＤ－Ｌ１特異的モノクローナル抗体をスクリーニングする。また、それは、ｓＰＤ－Ｌ１を最大限に回避し、ＦｃのＡＤＣＣ／ＣＤＣ活性を増強させ、抗腫瘍効果を有する。これは、ｓＰＤ－Ｌ１を分泌し、遮断型ＰＤ－Ｌ１抗体薬剤耐性を生じる腫瘍の治療および併用投与に選択可能な経路またはスキームを提供し、腫瘍免疫療法の治療効果を向上させる潜在的な意味を有する。
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって定義される範囲に含まれる。

Claims (17)

  1. ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片であって、
    前記抗体は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との結合を遮断せず、前記抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域（ＩｇＣ－ｌｉｋｅ ｒｅｇｉｏｎ）に特異的に結合し、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能効果を誘導する活性を有することを特徴とする、前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片。
  2. （ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるようなＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるようなＬＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるようなＬＣＤＲ３のアミノ酸配列、および
    （ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるようなＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるようなＨＣＤＲ２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示されるようなＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
    ここで、前記抗体は、ＰＤ－Ｌ１のＩｇＣ様領域に特異的に結合することを特徴とする
    請求項１に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片。
  3. 前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のポリペプチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２０、２１、２２、２３、２４または２５に示されるポリペプチド配列と少なくとも９５％同一であり、前記軽鎖可変領域のポリペプチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２６、２７、２８、２９または３０に示されるポリペプチド配列と少なくとも９５％同一であることを特徴とする
    請求項１または２に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片。
  4. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、２０、２１、２２、２３、２４または２５に示されるポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、２６、２７、２８、２９または３０に示されるポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域を含むことを特徴とする
    請求項１～３のいずれか１項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片。
  5. 前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、キメラであることを特徴とする
    請求項１～４のいずれか１項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片。
  6. 前記ＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片は、ヒト化されたものであることを特徴とする
    請求項１～５のいずれか１項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片。
  7. 組換えタンパク質であって、
    前記組換えタンパク質は、
    （ｉ）請求項１～６のいずれか１項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、および
    （ｉｉ）発現および／または精製を補助する任意選択のタグ配列を有することを特徴とする、前記組換えタンパク質。
  8. ポリヌクレオチドであって、
    請求項１～６のいずれか１項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、または請求項７に記載の組換えタンパク質をコードすることを特徴とする、前記ポリヌクレオチド。
  9. ベクターであって、
    請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、前記ベクター。
  10. 遺伝子操作された宿主細胞であって、
    請求項９に記載のベクターを含むか、またはゲノムには請求項８に記載のポリヌクレオチドが組み込まれていることを特徴とする、前記遺伝子操作された宿主細胞。
  11. 免疫コンジュゲートであって、
    当該免疫コンジュゲートは、
    （ａ）請求項１に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、および
    （ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、または酵素からなる群から選択されるカップリング部分を含むことを特徴とする、前記免疫コンジュゲート。
  12. 医薬組成物であって、
    前記医薬組成物は、
    （ａ）請求項１に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、または請求項２に記載の組換えタンパク質、または請求項１１に記載の免疫コンジュゲート、および
    （ｂ）薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
  13. サンプル中のＰＤ－Ｌ１タンパク質を検出するための方法であって、
    前記方法は、
    （１）被験者からサンプルを取得する段階と、
    （２）サンプルを請求項１に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片と接触させる段階と、
    （３）被験者のＰＤ－Ｌ１レベルを決定する段階とを含むことを特徴とする、前記方法。
  14. 免疫細胞であって、
    前記免疫細胞は、請求項１～４のいずれか１項に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片を発現するか、または細胞膜外に露出することを特徴とする、前記免疫細胞。
  15. ＰＤ－Ｌ１発現または機能異常に関連する疾患を治療するための方法であって、
    前記方法は、必要とする対象に医薬有効量の請求項１に記載のＰＤ－Ｌ１抗体またはその活性断片、請求項１１に記載の免疫コンジュゲート、請求項１２に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載の免疫細胞、またはその組み合わせを投与する段階を含むことを特徴とする、前記方法。
  16. 前記ＰＤ－Ｌ１発現または機能異常に関連する疾患は、腫瘍または感染性疾患であることを特徴とする
    請求項１５に記載の方法。
  17. 前記感染性疾患は、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ）および結核菌から選択される病原体によって引き起こされることを特徴とする
    請求項１６に記載の方法。
JP2023520184A 2020-09-29 2021-09-27 抗ｐｄ－ｌ１抗体およびその用途 Pending JP2023545394A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011049435.7 2020-09-29
CN202011049435.7A CN114316045A (zh) 2020-09-29 2020-09-29 抗pd-l1抗体及其用途
PCT/CN2021/121022 WO2022068775A1 (zh) 2020-09-29 2021-09-27 抗pd-l1抗体及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023545394A true JP2023545394A (ja) 2023-10-30

Family

ID=80949697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023520184A Pending JP2023545394A (ja) 2020-09-29 2021-09-27 抗ｐｄ－ｌ１抗体およびその用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230406936A1 (ja)
EP (1) EP4223776A1 (ja)
JP (1) JP2023545394A (ja)
CN (1) CN114316045A (ja)
WO (1) WO2022068775A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116854820B (zh) * 2023-06-26 2024-02-06 华中科技大学同济医学院附属协和医院 Pd-1非阻断性清除抗体及其用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101607288B1 (ko) * 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
CN105461808B (zh) * 2015-12-24 2019-03-19 长春金赛药业股份有限公司 单克隆抗体及其应用
CA3027209C (en) * 2016-06-13 2022-08-16 I-Mab Anti-pd-l1 antibodies and uses thereof
CN107488229B (zh) * 2016-06-13 2020-11-17 天境生物科技(上海)有限公司 Pd-l1抗体及其用途
CN109385400A (zh) * 2017-08-09 2019-02-26 科济生物医药（上海）有限公司 共表达pd-l1阻断剂的嵌合抗原受体修饰的免疫效应细胞
CN109897111B (zh) * 2017-12-08 2021-02-23 杭州翰思生物医药有限公司 抗pd-1/cd47的双特异性抗体及其应用
KR102475106B1 (ko) * 2018-03-29 2022-12-08 아이-맵 항-pd-l1 항체 및 그것의 사용

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022068775A1 (zh) 2022-04-07
CN114316045A (zh) 2022-04-12
US20230406936A1 (en) 2023-12-21
EP4223776A1 (en) 2023-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107735105B (zh) 抗ntb-a抗体和相关组合物以及方法
JP2019047807A (ja) Ｐｄｇｆ受容体ベータ結合ポリペプチド
JP2018138034A (ja) 抗ｈｅｒ２抗体及びその結合体
KR20140008308A (ko) 신규한 egfr-결합 분자 및 이의 면역컨쥬게이트
JP2013532978A (ja) Ｃｄ２７に対するアゴニスト抗体
US11965037B2 (en) Anti-HER3 humanized monoclonal antibody
JP2020527332A (ja) 抗−ｉｌ１ｒａｐ抗体および抗体薬物コンジュゲート
JP7048567B2 (ja) 二重特異性抗原結合ポリペプチド
JP7020656B2 (ja) 組織因子を標的とする抗体、その調製方法及びその使用
CN114269783A (zh) 结合egfrviii的单克隆抗体及其应用
CN116251196A (zh) 抗-edb抗体和抗体-药物缀合物
CN112794911B (zh) 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用
CN113045659B (zh) 抗cd73人源化抗体
WO2022068775A1 (zh) 抗pd-l1抗体及其用途
WO2023169583A1 (zh) 基于Pep42构建的双特异性细胞接合器分子的制备及其应用
WO2020108636A1 (zh) 全人抗gitr抗体及其制备方法
US20230032465A1 (en) Antibody-drug conjugates specific for cd276 and uses thereof
WO2023025303A1 (zh) 抗cldn-18.2抗体药物偶联物及其用途
CN117402255A (zh) 抗人pd-l1和人ox40的双特异抗体及其应用
CN116462765A (zh) 抗cd3和抗cd20双特异性抗体及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230529

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20240419

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240510