CN102905697A

CN102905697A - 靶向vegf和/或hif途径、用于治疗中耳炎的化合物如索拉非尼或瓦他拉尼

Info

Publication number: CN102905697A
Application number: CN2011800254426A
Authority: CN
Inventors: M.T.奇斯曼; S.D.M.布朗
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2010-03-22
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2013-01-30
Also published as: CA2793643A1; GB201004761D0; WO2011117568A1; AU2011231405A1; EP2549989A1; US20130078260A1; JP2013522350A

Abstract

本发明提供了靶向VEGF和/或HIF途径、用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的化合物。本发明还提供了包含这样的化合物的药物组合物，以及治疗和/或预防受试者的中耳炎的方法，其包括向所述受试者给药这样的化合物或药物组合物的步骤。

Description

靶向VEGF和/或HIF途径、用于治疗中耳炎的化合物如索拉非尼或瓦他拉尼

发明领域

本发明涉及用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的化合物。

发明背景

中耳炎（OM），一种中耳（ME）的炎症，是儿童中听力损伤的最常见的原因，潜在地引起语言延缓、学习和行为破坏。

婴儿和儿童中的急性OM（AOM）最经常地与涉及肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）和粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）的细菌感染相关。约40%的儿童在AOM后1个月具有ME积液，到AOM后3个月，仅约10%的仍有ME积液。这种没有感染症状的持续渗出性OM被称为渗出性中耳炎（OME）。OME在1-3岁儿童中是非常常见的，发病率为10-30%，到四岁的累积发生率为80%。患有OME的某些儿童接着发生慢性OM，伴有并发症例如鼓膜内陷囊袋、听骨链的侵蚀、胆脂瘤、慢性化脓性OM或耳漏（鼓膜穿孔和排脓）。

这种疾病的高流行性以及其复发性和慢性特征是在受影响儿童中进行大量鼓膜造孔术（在鼓膜中插入通气管道或‘孔眼’）的原因。OM仍然是发展中国家的儿童中手术的最常见原因。鼓膜置管术是英国最常见的手术（每年30,000例）。

在临床试验中，减充血剂、粘液溶解剂、类固醇、抗组胺剂以及抗生素被认为很大程度上是无效的（Lous et al（2005）Cochrane Database Syst.Rev.CD001801）。因而对OM和OME存在着新的医学治疗的临床需求。

附图说明

附图1.Junbo小鼠中耳的缺氧。比例尺：A,B,C=50μm；D=100μm,G=20μm；F=100μm。

（A）Jbo/+小鼠用60mg/kg哌莫硝唑（PIMO）体内标记3h，箭头指示[ep]上皮、[f]结缔组织纤维细胞、

巨噬细胞；[tm]颞下颌骨、[m]增厚的发炎的粘膜中的缺氧、[ex]渗出液含有泡沫状巨噬细胞(mφ)和多形核细胞(PMN)的混合物。利用抗-PIMO抗体的免疫组织化学。注意*裂隙是通过组织处理人工产生的。

(B)PIMO标记的WT小鼠，正常的薄粘膜[m]没有被染色。

(C)未标记的患有OM的Jbo/+小鼠是抗-PIMO抗体的阴性对照。

(D)泡沫状mφ中的缺氧。

(E)Jbo/+小鼠中标记PIMO的时间过程。该指数对以下类别的每一个中的阳性标记细胞进行评分：管腔、粘膜上皮以及粘膜结缔组织内的炎性细胞。柱形图的柱条是平均值±SEM。4周组大小n＝8，7-8周组n＝10，13-15周组n＝5，31-37周组n＝7。

(F)WT小鼠中的咽鼓管上皮[et]中的缺氧清晰地区分于邻近的鼻咽[np]上皮。

(G)Jbo/+小鼠的耳渗出液细胞学：用大鼠抗小鼠F4/80 mAb和PMN染色的泡沫状

附图2.Jbo/+耳液体的FACS分析。对于PIMO(缺氧)，来自哌莫硝唑标记的Jbo/+小鼠的中耳WBC用Ly6G和Ly6C(PMN标志物)染色、以及用膜联蛋白V(Annexin V)(细胞凋亡标志物)染色。PMN群体用Ly6G和Ly6C信号来门选。群体(1)含氧量正常的活的PMN，(2)缺氧的活的PMN，(3)缺氧的凋亡的PMN。以log10荧光轴校准。

附图3.Jbo/+小鼠中Hif-1α的Western印迹。

泳道1 Jbo/+骨髓PMN。

泳道2 Jbo/+中耳WBC显示Hif-1α阳性条带。

实验独立地进行三次，得到相同的结果。

附图4.Jbo/+小鼠的中耳的基因表达。Jbo/+中耳WBC的4周和10周合并样品的实时定量PCR，相对于4周Jbo/+血液WBC的来显示。柱形图的柱条是三次重复测试的平均的倍数增加(或Vegfa和Eviln＝10)。误差线是相对定量(RO)最小和最大值，代表了Δ循环阈值的SEM。

附图5.用PTK787/ZK 222584治疗Jbo/+小鼠降低了中耳内的炎性改变。用50 mg/kg或75 mg/kg的药物治疗WT和Jbo/+小鼠4周，假治疗的对照Jbo/+组接受单独的载体。在50 mg/kg试验(a)中发炎的粘膜是更薄的。与相应的假治疗对照相比，在两种试验中，药物治疗的组具有更少的血液（b）和淋巴管（c）；与对照相比，在75mg/kg治疗的Jbo/+小鼠中粘膜淋巴管是较少膨胀的。在50mg/kg试验中，WT组大小是n=8；Jbo/+药物组n=15；Jbo/+假治疗组n=13。在75mg/kg试验中，WT组n=8；Jbo/+药物组n=15；Jbo/+假治疗组n=15。柱形图柱条是平均值±s.e.m。双尾Studentt-检验。

附图6.用VEGF受体抑制剂和HSP90抑制剂17-DMAG治疗Junbo小鼠减缓听力损失。（A）在用BAY 43-9006的15天治疗中，按照分贝（dB）的听觉脑干反应（ΔABR）的改变（WT组、假治疗组、药物组分别为n=5、11、11）；（B）用SU-11248治疗28天的ΔABR（WT组、假治疗组、药物组n=10、15、15）；（C）用PTK787治疗21天的ΔABR（WT组、假治疗组、药物组n=9、13、15）；（D）用PTK787治疗28天的ΔABR（WT组n=40，假治疗组n=60，PTK787组n=30）；（E）用17-DMAG治疗28天的ΔABR（WT组n=9，假治疗组n=15，17-DMAG组n=15）。在每个试验中，对药物治疗的反应与假治疗对照相比较。直方图柱条是平均值±SEM。单尾Mann Whitney U检验。

发明内容

利用慢性OM的小鼠模型，本发明人展现了处于OM中的发炎的中耳是低氧的环境，且存在着缺氧诱发因子（HIF）的诱导。他们还显示了血管内皮生长因子（VEGF）受体以及HIF的抑制剂能够降低这样的小鼠模型中的听力损失和中耳粘膜的炎性改变。

靶向HIF-VEGF信号途径提供了预防和/或治疗OM的吸引人的治疗选择。

因而，在第一个方面中，本发明提供了靶向VEGF和/或HIF途径、用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的化合物。

在本发明的这个方面的第一个实施方式中，所述化合物靶向VEGF和VEGFR（血管内皮生长因子受体）之间的相互作用。

在这个实施方式中，所述化合物可以是VEGF受体抑制剂，例如，瓦他拉尼（vatalanib）、舒尼替尼（sunitinib）或索拉非尼（sorafenib）。

或者，所述化合物可以是抗VEGF抗体或抗VEGF肽。

在本发明的这个方面的第二个实施方式中，所述化合物抑制HIF途径。

在这个实施方式中，所述化合物可以通过使HIF不稳定来起作用。例如，所述化合物可以抑制HIF蛋白侣伴HSP90。这样的化合物的一个实例是17-DMAG。

在第二个方面中，本发明提供了用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的药物组合物，其包含根据本发明的第一个方面的化合物。

本发明的进一步的方面涉及：

（i）根据本发明的第一个方面的化合物在制备用于治疗和/或预防中耳炎的药物组合物中的用途；以及

（ii）一种治疗和/或预防受试者的中耳炎（OM）的方法，其包括向所述受试者给药根据本发明的第一个方面的化合物、根据本发明的第二个方面的药物组合物、或根据本发明的第三个方面的试剂盒的步骤。

发明详述

中耳炎（OM）

中耳炎是中耳的炎症，或中耳感染。中耳炎存在于耳鼓和内耳之间的区域中，包括称为咽鼓管的管道。急性中耳炎（AOM）大部分纯粹是病毒引起的或自限性的，它通常伴随着病毒性URI（上呼吸道感染）。存在着耳的充血以及可能的轻微不适和爆音(poping)，但是该症状与潜在的URI一起解决。如果通常为无菌的中耳被细菌污染，可能引起中耳内的脓和压力，这被称为急性细菌性中耳炎。病毒性急性中耳炎有时可能在非常短时间内引起细菌性中耳炎，特别是在儿童中。细菌性病例可能引起耳鼓的穿孔、乳头状间隙的感染（乳突炎），在非常罕见的情况下进一步扩散导致脑膜炎。

作为改变的咽鼓管功能产生的负压的结果，渗出性中耳炎（OME）仅是中耳间隙内产生的液体的集合。这可以仅来自病毒性URI，而没有疼痛或细菌感染，或它可能先于或继发于急性细菌性中耳炎。中耳内的液体有时引起传导性听力损伤，但是仅在它影响声波引起的鼓膜正常振动时。在数周到数月间，中耳液体可能变得非常浓稠和胶液样（因而称为胶耳），这提高了引起传导性听力损伤的可能性。

在此使用的术语“中耳炎”涉及所有形式的慢性OM，包括OME，以及由微生物感染引起的复发的急性OM，与作为病毒感染的结果引起的急性OM相对应。

慢性化脓性中耳炎涉及鼓膜中的穿孔（孔洞）和中耳间隙内的活性细菌感染持续几周或更久。可能有足够的脓液，其被导向耳的外侧（耳漏），或者脓液可能小到仅在使用双目显微镜检查时可见。这种疾病在咽鼓管功能不良的人中更为常见得多。听力损伤经常伴随着这种疾病。

当中耳被细菌急性感染时，耳鼓后的压力增大。在严重的或未治疗的病例中，鼓膜可能破裂，容许中耳间隙内的脓液流入耳道。在另一健康人的急性中耳炎的简单病例中，身体的防御很可能解决感染，耳鼓几乎总是痊愈。然而，在某些情况下，来自中耳的排脓可能变为慢性状况。只要有活动的中耳感染，鼓膜将不会痊愈。

肺炎链球菌和不可分型的（nontypable）流感嗜血杆菌是中耳炎的最常见的细菌性病因。导管功能障碍引起失效的中耳细菌清除。

中耳炎通常与适当的病史一同通过鼓膜的目测来诊断。

本发明使用的术语“中耳炎”主要涉及慢性OM，与作为病毒感染的结果的急性OM相对应。该术语可以排除作为呼吸道合胞体病毒（RSV）感染的结果产生的OM。

VEGF/HIF途径

哺乳动物VEGF配体是40kDa的糖蛋白，其作为几种不同的剪接变体和加工形式存在，包括VEGF-A、-B、-C、-D和-E。

VEGF配体以重叠的方式与三种受体酪氨酸激酶（RTKs）VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3结合。

VEGF与它们的受体的结合引起VEGFR同二聚体和异二聚体的形成。二聚作用活化VEGFR，引起细胞内酪氨酸残基的自磷酸化。

术语“VEGF途径”包括靶向VEGF基因或蛋白质表达的上游调节物；或VEGF蛋白表达的下游效应，例如，促进血管生成、白细胞募集的血管渗透性的信号转导途径。

术语“HIF途径”包括靶向HIF-1α表达或活性。HIF信号转导途径是VEGFR的上游。

Duval等人（（2007）Mol.Biol.of the Cell 18：4659-4668）报道了VEGFR2的另一种相关的HSP90联系：通过客户蛋白质（client protein）VEGFR2的HSP90酪氨酸磷酸化是VEGFR2向内皮一氧化氮合成酶信号转导所需的。

VEGF/VEGFR抑制剂

靶向VEGF/VEGFR的抑制剂可以是生物大分子，例如，肽、抗体，或DNA或RNA寡核苷酸，或它可以是小分子抑制剂。

存在着几种VEGF家族成员，它们的表位保守性差，可能优选的是靶向VEGF受体而不是靶向配体本身。

抗VEGF抗体是已知的，例如，VEGF特异性人源化单克隆抗体贝伐单抗^TM（bevacizumab^TM）。贝伐单抗^TM直接通过阻止VEGF与VEGFR-1和-2的相互作用来抑制VEGF的生物学活性。雷珠单抗^TM（Ranibizumab^TM）是另一种抗VEGF人源化单克隆抗体片段，其结合并抑制VEGF-A。HuMV833^TM是另一种抗VEGF-A抗体，当前处于临床试验中。

抗VEGFR-2抗体包括DC-101和小鼠/人嵌合单克隆抗体IMC-IC11，以及完全人抗-VEGFR抗体IMC-2C6和IMC-1121。

适体是为它们以高亲和性和高特异性结合蛋白质的能力而选择的RNA或DNA寡核苷酸。哌加他尼^TM（Pegaptanib^TM）是一种抗VEGF RNA适体。

或者，该抑制剂可以是靶向VEGF/VEGFR途径的核酶。Angiozyme特异性地裂解VEGFR-1RNA，它是作为用于人类疾病的治疗剂被测试的第一个合成的核酶。

靶向VEGF/VEGFR相互作用的另一种方法涉及使用包含VEGF结合位点的可溶性受体来隔离(sequestrate)VEGF和阻断VEGF信号传递，例如VEGF-Trap^TM。

还可能的是使用VEGF剪接变体来调节VEGFR的活性。

用于本发明的VEGFR抑制剂可以选自：索拉非尼、舒尼替尼、瓦他拉尼、凡德他尼（vandetanib）、AZD-2171、SU-6668、CP-547632、帕唑帕尼（pazopanib）、BIBF-1120、阿西替尼、AMG-706、AEE-788、EXEL-0999、EXEL-7647、XL-880、EXEL-2880、SU-14813、ZK-304709、E-7080、CHIR-265、CHIR-258、OSI-930、BAY-579352、ABT-869、BMS-582664、KRN-951和CEP-7055。

这样的小分子抑制剂的进一步的细节可以在Kiselyov et al（（2007）Expert Opin.Invest.Drugs（2007）16（1）：83-107）中找到。

VEGF抑制剂可以是苯胺酞嗪（anilinophthalazine）型的，例如，瓦他拉尼；或是脲型的，例如索拉非尼。

VEGF抑制剂可以是索拉非尼、舒尼替尼或瓦他拉尼。

HIF途径抑制剂

许多小分子HIF-1抑制剂是已知的，包括以下四种化合物，其共有相同的噻吩

二唑核心（在方框中标出）：

作为HIF-1抑制剂还在开发的有2,2-二甲基苯并吡喃化合物。

该化合物可以作用于HIF的蛋白侣伴HSP90。该化合物可以，例如，是17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基-格尔德霉素（17-DMAG）。17-DMAG诱导HIF-1α去稳定化和降解（van der Bilt etal（2007）A m.J.Pathol.170：1379-1388；Milkiewicz etal（2007）J.Physiol.583：753-766）。

HSP90抑制剂已经被开发为抗癌药物，例如，坦螺旋霉素(tanespimycin)（17-AAG）、盐酸瑞他霉素（IPI-505）、BIIB012、CNF2024、AUY922、STA-9090、IPI-493、SNX-5422甲磺酸盐、BIIB028、KW-2478、AT13387、XL888、HSP990、MPC-3100、ABI-010、PU3、根赤壳菌素(Radicicol)和新生霉素。参见Trepel etal（2010）Nat.Rev.Cancer 10：537-549,表1；和Fukuyo etal（2010）Cancer Letts.290：24-35附图1）。

格尔德霉素是苯醌安莎霉素（ansamycin）抗生素，其通过抑制HSP90蛋白侣伴功能显现抗癌活性。相关的抑制剂包括KOS-953、IPI-504和IPI-493（参见上文的Fukoyo et al.）。格尔德霉素通过抑制HSP90ATP酶活性来离解成熟的多蛋白侣伴复合物，且释放的客户蛋白质随后被泛素蛋白酶体途径降解。格尔德霉素诱导HSP90客户蛋白HIF-1α的降解。

药物组合物

所述药物组合物可以基本上由瓦他拉尼组成。换句话说，瓦他拉尼可以是抑制VEGFR的组合物的唯一成分。瓦他拉尼可以是在中耳炎的治疗/预防中组合物的有活性的唯一成分。所述药物组合物可以基本上缺乏用于治疗RSV感染的成分。所述药物组合物可以基本上缺少任何二吲哚基甲烷相关的吲哚。

所述药物组合物还可以包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

受试者

本发明的化合物和组合物可以用于治疗患有中耳炎的受试者，例如，患有慢性中耳炎的受试者。

或者，本发明的化合物和组合物可以用于治疗被认为具有感染中耳炎的风险的受试者。例如，受试者可能过去患有OM，或可能有与OM相关的病毒或细菌感染或有感染与OM相关的病毒或细菌感染的风险。所述受试者可能具有倾向于发生OM的异常的耳结构或生理机能，例如，不良的咽鼓管功能。

所述受试者可以是人类受试者，例如，成年人或儿童。特别地，所述受试者可以是1到4岁之间的儿童。

所述受试者可以是动物受试者，特别是驯养的或家畜动物，例如，猫、狗、兔子、豚鼠、啮齿动物、马、山羊、绵羊、奶牛或猪。

给药

本发明的化合物或药物组合物可以通过适合于治疗中耳的任何途径给。

在适当时，所述药物组合物可以通过吸入，以栓剂或阴道栓剂的形式，以洗液、溶液、乳剂、软膏剂或扑粉的形式的局部地给药，通过使用皮肤贴片，以片剂、胶囊剂或卵珠的形式口服地给药。或者，所述药物组合物可以胃肠外地注射，例如，静脉内地、肌肉内地或皮下地注射。

现在将通过实施例的方式进一步描述本发明，实施例是用来帮助本领域普通技术人员实施本发明，而无论如何不意味着限制本发明的范围。

实施例

实施例1-Jbo/+OM小鼠模型中缺氧的研究

为了进一步表征OM和建立ME白细胞（WBC）中基因表达研究的适当的对照，检查了耳液体和外周血中的WBC分类。Jbo/+小鼠不具有全身性的白细胞增多（表I）。Jbo/+耳液体中的WBC计数为每μl 1.7-2.1×10⁶，是血液中的约1000倍，细胞学显示了高的多形核细胞（PMN）计数，和更少数量的F4/80阳性泡沫状巨噬细胞（mφ）（图1G）。

表I.Junbo小鼠的血液和耳中的白细胞

平均值±SEM.^aWBC x10³/μl。与来自相同龄的小鼠的Jbo/+血液相比，在8周（^bP<0.001）和15周（^dP<0.001）时Jbo/+耳液体中的平均WBC计数显著更高。^cND未进行。

在发炎的组织中，缺氧的生理学的驱动力可能是嗜中性粒细胞和mφ的氧摄取以及它们从基底血管床的物理分离。这些模型可应用于成年小鼠的5-6μl ME内的炎性细胞的积累。为了评估发炎的ME中的缺氧，我们用哌莫硝唑（PIMO）体内注射小鼠，哌莫硝唑是标记pO₂<10托（~1.5%O₂）的组织和细胞的一种标志物。免疫组织化学显示了ME管腔、增厚发炎的粘膜的上皮以及结缔组织内的炎性细胞中的缺氧（附图1A、1C、1D）。缺氧在4周时是明显的，在7-8周升高，之后保持长期升高达>30周（附图1E）。在未受影响的、带有正常的空气填充的小泡的WT同窝出生小鼠中，薄的未发炎的粘膜不是缺氧的（附图1B）。在正常的生理学（非发炎的）状况下呈现缺氧的ME结构的仅有的部分是咽鼓管（附图1F）。FACS分析提供了Jbo/+小鼠的耳液中PMN群体中缺氧的另外的证据（附图2）。在两个时间点，5-8周和12-17周，存在着相似百分比的活的和细胞凋亡的细胞。更老的Jbo/+小鼠具有显著更大数量的缺氧凋亡的细胞，以及相应的更小数量的含氧量正常的凋亡的细胞（表I）。未标记的Jbo/+ME PMN和来自PIMO标记的Jbo/+小鼠的未染色的外周（含氧量正常的）PMN充当阴性对照。碘化丙锭染色显示了，7±2%的Jbo/+PMN群体是坏死的。虽然来自Jf/+小鼠的ME液一般是稻草色的浆液性渗出物，但它们含有缺氧的活的和凋亡的PMN群体（表II）；8±2%的Jf/+PMN群体是坏死的。

表II.哌莫硝唑标记的Junbo和Jeff小鼠的耳液中多形核细胞群体中的缺氧

平均多形核细胞（PMN）百分比±SEM。群体数(population)表示为它们的母体的活的或凋亡的群体数的百分比。与5-8周的Jbo/+小鼠中的相比，在12-17周Jbo/+中缺氧的凋亡PMN的群体数更大（^aP=0.0024）。与12-17周的Jbo/+小鼠中的相比，在5-8周Jbo/+中含氧量正常的凋亡PMN的群体数更大（^bP<0.001）。

实施例2-Hif-1α蛋白质稳定化的分析

缺氧通过抑制脯氨酰羟化酶2（PHD2）来稳定Hif1-α蛋白。在含氧量正常的条件下，PHD2羟基化Hif1-α中的脯氨酰残基，使得Hif1-α被E3泛素连接酶VHL结合和多聚泛素化（polyubiquitinated），并被蛋白酶体降解。HIF还在转录、翻译和翻译后水平上被一系列炎症介质调节，该炎症介质通过HIF与NF-κB之间的相互作用关联，NF-κB是作为炎症的主要调节物的转录因子。在患有OM的患者和在OM的动物模型的中耳中，一系列的炎症性细胞因子已经被记录（Juhn,S.K.etal.（2008）Clin.Exp.Otorhinolaryngol.1,117-138）。在这些之中，IL-1β和TNFα提高了HIF-1αmRNA的翻译（Frede,S.etal.（2007）Meth.Enzymol.435,405-419）。

为了确认缺氧与Hif-1α蛋白稳定化相关，进行了Western印迹，其显示了Jbo/+耳液中M_r~90-110kD以及M_r~70kD的Hif-1α阳性条带的存在，而在骨髓PMN对照中没有（附图3）。然后研究了Jbo/+小鼠的ME中的基因和蛋白质表达模式。为了建立适合的对照，首先比较了WT和Jbo/+血液中4周和10周时的基因表达水平。这些是相当的（<2倍差异），然后4周的Jbo/+血液用作参考点。在耳液中PMN标志物Gr-1为2-4倍高，可能反应了与血液相比的更高的PMN差异（表I；附图1F），因而超过这个限度的任何倍数变化被解释为基因上调。与血液WBC相比，在Jbo/+ME液WBC中存在更高的Hif1-α（9-14倍）、IL-1β（11-21倍）和Tnfa（24-34倍）表达（附图4）。在耳渗出液中检出IL-1β蛋白（50,371±21,124，pg/ml n=7），但是在来自Jbo/+和WT小鼠的血清样品的全部（除了14%的Jbo/+和WT小鼠的血清样品）中低于分析检测极限（n=22）。在血清中IL-1β是可检测的，范围是4-67pg/ml。在耳渗出液中Tnfα也提高（12,321±1881pg/ml（n=8），相对于血清在Jbo/+和WT中分别为1.65±0.16pg/ml（n=12）和1.48±0.04pg/ml（n=12））。

Jbo/+ME中Hif信号转导的下游效应在Glut1（14-20倍）和Vegfa（164-249倍）的上调方面是明显的（附图4）。与血清相比，在耳液中Vegf蛋白提高>390倍，从4周到8周这些水平加倍（表III）。重要地，在Jf1+耳液中Vegf也提高，确认了Hif信号不局限于单个OM模型（表III）。

表III.Junbo和Jeff小鼠的血清和耳液中的Vegf滴度（titer）（pg/ml）

平均值±SEM（n）。与来自它们相应年龄的Jbo/+小鼠的血清中的相比，在4周（^aP=0.0035）和8周（^b P<0.001）时在Jbo/+耳液中平均Vegf滴度更高。与4周的Jbo/+耳液中相比，8周时平均Vegf滴度显著更高（^cP=0.031）。与血清中相比，在Jf/+耳液中平均Vegf滴度更高（^dP<0.001）。

在Jbo/+小鼠的ME中Evi1表达的38-74倍提高（附图4）部分是以下反映，即它在血液中刚刚是可检测的（与另一个基因的循环28-32相比，在循环35时）。尽管如此，这种结果提高了Evi1通过它作为转录因子的作用来扰动缺氧途经的可能性。在Jbo/+小鼠中，Evi1表达可能受到反馈环路驱动，所述反馈环路由Evi1蛋白异常调节（dysregulating）下游的缺氧和炎症途径的突变所产生。Evi1可能通过Hif-1α和Smad3潜在地影响HIF信号，该Hif-1α和Smad3共激活小鼠巨噬细胞中的Vegf表达。或者，相互作用可能通过产生(raise)AP-1的Evi1的远端锌指区域来发生。Evi1中的突变可能影响Vegf表达，因为AP-1具有人类VEGF启动子内部的结合位点。在Jeff突变体的情况下，在Fbxo11与HIF信号转导之间没有明显的联系，这说明，异常调节的HIF信号转导在慢性OM中也可能是下游的事件。

实施例3-OM小鼠模型中VEGFR信号转导和Hsp90的抑制作用的效果

Vegf起作用来诱导血管生成，提高血管渗透性以及WBC的募集，因而可能通过引起传导性听力损失、以及通过炎症介质和由蜗窗扩散的毒素引起的继发性耳蜗功能障碍，来促成OM病理过程。

为了测试Vegf具有促炎症性作用的假说，用小分子VEGFR抑制剂来治疗Junbo小鼠。Junbo小鼠是治疗试验的较好的小鼠模型，因为OM表型是更加高渗透性的。例如在解剖时，在7-11周Jf/+小鼠（n=14）中在一侧（57%）或两侧（21%）鼓膜后方血清或黄色液体是明显可见的，而在8周的Jbo/+小鼠（n=54）中在一侧（14%）或两侧（79%）鼓膜后可见液体（数据采集自假治疗对照组）。值得注意的是，即使没有非常明显的液体时，Jbo/+小鼠具有一定程度的显微镜下的OM。

在Jbo/+小鼠中，从4周开始存在着渐进性的听力损失。在独立试验中，用BAY 43-9006治疗Jbo/+小鼠2周，用50mg/kg PTK787/ZK 222584（以下称为PTK787）治疗3周，或用75mg/kg PTK787治疗4周，降低了听力损失（表IV和附图6）。用BAY 43-9006的试验在2周后终止，此时小鼠突然变得竖毛（piloerect）。虽然BAY 43-9006不象PTK787一样耐受良好，对治疗的阳性治疗反应是VEGFR作为OM治疗的HIF途径靶点的重要性的强力证据。

表IV.用血管内皮生长因子受体（VEGFR）治疗的Junbo小鼠中按照分贝（dB）的听觉脑干（ΔABR）应答改变

听力损失减缓伴随着ME粘膜中降低的炎性改变。虽然PTK787/ZK222584治疗的Jbo/+小鼠在泡腔（bulla lumen）中具有液体和炎性细胞，但在50mg/kg试验中治疗减缓了粘膜增厚（附图5a），且在两个试验中血管生成和淋巴管数量都降低了（附图5b和c）。淋巴管扩张仅在75mg/kg剂量组中缓解（附图5d）。在使用BAY 43-9006的2周试验中，存在着淋巴管数量（10.8±1.1，n=11只小鼠，对比16.4±1.0，n=11，P=0.0012）和淋巴管扩张（9.9±1.0μm，n=11，对比14.2±0.9μm，n=11，P=0.0072）的降低，但是在粘膜增厚或血管生成方面没有，可能因为这两者在2周后都没有足够地发展。发明人继续测试HSP90抑制剂17-DMAG，其起作用使得HIF-1α不稳定化，它的使用也减缓听力损失（附图6）。

与对小分子VEGFR抑制剂的阳性治疗反应相比，PPARγ激动剂罗格列酮(Rosiglitazone)在Jbo/+小鼠中不减缓听力损失（表V）。我们在试验中包括罗格列酮，因为它已经显示了在小鼠的过敏性气道病中调节反应性氧物质产生，以及调节HIF信号转导的上游调节物NFκB和Hif-1α（Lee et al.,2006）。

表V.用PPARγ激动剂罗格列酮治疗的Junbo小鼠中按照分贝（dB）的听觉脑干（ΔABR）应答改变

平均值ΔABR（dB）±SEM（n）。与WT小鼠相比，在药物（^aP=0.041）和假治疗的Jbo/+小鼠（^bP=0.002）中平均ΔABR显著更高，而Jbo/+药物和假治疗组没有显著不同（^cP>0.05）。

总之，ME细胞缺氧可能是慢性OM的常见特征，其未被ME气体或液体中氧的物理测量所揭示。

已经显示的是，OM的Junbo模型中的ME的特征在于慢性的炎症性的缺氧，提高了炎症性细胞因子例如TNFα和IL-1β在调节Hif1-α中起到作用的可能性。Hif1-α信号与Vegf的上调相关。在慢性OM的第二种小鼠模型Jeff中独立地确认了ME缺氧和Vegf上调的关键发现。

VEGFR抑制剂PTK787和BAY 43-9006降低听力损失发展的发现支持了Vegf在慢性OM中起到重要的促炎症作用的假说。

总之，这项工作表明，OM类似于慢性缺氧炎症的其他疾病，例如类风湿性关节炎（Grosios,K.etal.（2004）Inflamm.Res.53,133-142），打开了在慢性OM的治疗中靶向HIF和VEGF途径的新的研究路径。

材料和方法

小鼠：同类系的C3H/HeH Junbo（Parkinson,N.,et al.（2006）PloS Genet.2,e149）和在混合的C3H/HeH和C57BL/6J遗传背景下的Jeff小鼠（Hardisty-Hughes,R.E.,etal.（2006）Hum.Mol.Genet.15,3273-3279.）的人道的照料和使用根据合适的英国内政部许可。

样品采集：血液在腹膜内过量的戊巴比妥钠诱导的终端麻醉下从小鼠的眼窝窦后采集。来自每只小鼠的耳液的经测量的体积（0.5-2μl）采集到冰冷的PBS中。

哌莫硝唑标记：小鼠用溶于100μl无菌PBS中的60mg/g哌莫硝唑（PIMO）（缺氧探针(Hypoxyprobe),HPI Inc）通过腹膜内注射体内标记3小时。头部在10%中性缓冲的福尔马林中固定48小时，然后用Formical（DecalCorp）脱钙72小时。ME的蜡包埋的3μm背部平切片对PIMO进行免疫染色。对于FACS，耳液样品用抗-PIMO FITC、抗小鼠Ly6G和Ly6C PerCP-Cy5.5（BD Pharminogen）以及抗-膜联蛋白V生物素（BD Pharminogen）/链霉抗生物素太平洋蓝（Streptavidin Pacific Blue）（Invitrogen）来染色。碘化丙锭（BD Pharminogen）用于评估坏死的细胞。50μl EDTA血液样品在100μlFACS缓冲液中稀释，然后用RBC裂解缓冲液（BD Pharminogen）处理。

HIF Western印迹：Jbo/+骨髓PMN在52/64/72%不连续的等渗Percoll梯度（Sigma-Aldrich）上分离，来自5只小鼠的ME液采集到带有蛋白酶抑制剂（Sigma-Aldrich）的150μl等分量的冰冷裂解缓冲液（Ambion）中。合并的细胞质和核蛋白质提取物的35μg蛋白质样品以及分子量标志物在7.5%Tris-HCl凝胶上进行SDS-PAGE。硝化纤维素印迹用一抗：1：500兔抗HIF-1α（Novus Biologicals）；1：1000山羊IgG抗人/小鼠髓过氧化物酶（R&D systems）；1：500兔抗βActin（Abcam）封闭并在4℃孵育过夜。HRP-缀合的山羊抗兔IgG（Abcam）或HRP兔抗山羊IgG（Abcam）二抗以1：2000使用1小时，且使用化学发光检测系统（Pierce Supersignal West Pico）。

实时定量PCR（RG-qPCR）和分析：利用Mouse RiboPure试剂盒（Ambion）从WT或Jbo/+（5只雄性、5只雌性小鼠）分离来自全血或ME液（采集到干冰上）的总RNA。在Nanodrop 8000（Thermo FisherScientific）上测量RNA量，通过凝胶电泳评估完整性，之后集中等量的RNA。使用High Capacity cDNA archive试剂盒（Ambion）从1μg总RNA合成双链cDNA。使用

Gene Expression Assays（表VI）、使用FastUniversal PCR Master Mix在7500Fast Real-Time PCR System（AppliedBiosystems）上进行PT-qPCR。

表VI RT-qPCR测试

Vegf、IL-1β、TNFα蛋白质测试：血液采集到血清-凝胶凝固激活物试管（Sarstedt）中。PBS中的ME液体样品在5000g在8℃下离心20秒。上清液和血清样品保存在-80℃待用。使用Quantikine小鼠VegfELISA试剂盒（R&D systems）测量Vegf，用Fluorokine多分析物概况（MAP）试剂盒（R&D systems）测量IL-1β和TNFα。

药物治疗、ABR和炎症的分析：27-29天龄的WT和Jbo/+小鼠通过口服每天一次饲喂BAY 43-90062周，50mg/kg PTK7874周，75mg/kg PTK787四周、罗格列酮或10mg/kg 17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基-格尔德霉素（17-DMAG）4周。水性PTK787（LC Laboratories）的贮备溶液、或BAY43-9006（LC Laboratories）以及罗格列酮（Molekula）的DMSO贮备溶液在-20℃冷冻，然后在2%甲基纤维素中稀释10倍用于给药。假治疗的Jbo/+组是年龄、性别和试验前ABR（30-60dB）匹配的，接受单独的载体。在试验的开始和结束时（或在50mg/kg PTK787试验的3周后）测量咔哒声激起的ABR（Zheng,Q.Y.,etal.（1999）Hearing Res.130,94-107）。对于具有恢复的ABR，通过用10mg/kg甲苯噻嗪和100mg/kg氯胺酮的混合物腹膜内注射来诱导麻醉，通过5mg/kg盐酸阿替美唑来逆转。在两个PTK787试验中都在4周评估组织学。

图像捕获和分析：数字图象使用带有中性密度滤光片的×20、×40或×60Plan Achromat物镜在Olympus BX51显微镜上、使用自动曝光在ColorViewSoft Imaging System软件上捕获。在药物试验中，用于图像分析的H&E染色的切片在Nanozoomer数字病理系统（Hamamatsu Photonics）上以×400放大率扫描。沿着其内侧面的鼓膜厚度和粘膜厚度（避开耳蜗和邻近咽鼓管开口的区域）5次测量取平均值。毛细血管和淋巴管的数量以及它们相应的直径在标准化的1000μm长度的内侧(medial)粘膜中测量。进行形态学测量时，对于鉴定员而言治疗和基因型是未知的。

统计学：进行Student t-检验或Mann Whitney U检验（对于ABR测量，其中间隔数据以5dB的增量），检验值p<0.05被认为是显著的。在使用t-检验之前百分比进行反正弦转化。在药物试验中，使用单尾检验比较药物和假治疗组，也使用双尾检验。

上文说明书中提及的所有公开文件通过引用合并在此。本发明的描述的方法和系统的各种修改和变体对于本领域的技术人员是显而易见的，而不背离本发明的范围和精神。虽然已经结合具体的优选实施方式描述了本发明，应当理解的是要求权利的发明不应过度局限于这种特定的实施方式。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员明显的、用于进行本发明的描述的模式的各种修改，预计在权利要求的范围之内。

Claims

1.靶向VEGF途径和/或HIF途径、用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的化合物。

2.根据权利要求1的化合物，其靶向VEGF和VEGFR之间的相互作用。

3.根据权利要求1或2的化合物，其是VEGF受体抑制剂。

4.根据权利要求3的化合物，其是瓦他拉尼或索拉非尼。

5.根据权利要求1或2的化合物，其是抗VEGF抗体。

6.根据权利要求1或2的化合物，其是抗VEGF肽。

7.根据权利要求1的化合物，其使HIF不稳定。

8.根据权利要求7的化合物，其抑制HSP90。

9.根据权利要求8的化合物，其是17-二甲基氨基乙基氨基-17-去甲氧基-格尔德霉素（17-DMAG）。

10.用于治疗和/或预防受试者的中耳炎的药物组合物，其包含根据前述权利要求任一项的化合物。

11.根据权利要求10的药物组合物，其基本上由瓦他拉尼组成。

12.根据权利要求1到9的任一项的化合物在制备用于治疗和/或预防中耳炎的药物组合物中的用途。

13.治疗和/或预防受试者的中耳炎（OM）的方法，其包括向所述受试者给药根据权利要求1到9的任一项的化合物、或根据根据权利要求10或11的药物组合物的步骤。