KR20110114664A - 자폐 스펙트럼 장애의 진단 및 치료 - Google Patents

자폐 스펙트럼 장애의 진단 및 치료 Download PDF

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데이먼 테론 페이지
므리간카 수르
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메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 발명은 자폐 스펙트럼 장애, 특히 증가된 머리 크기 (둘레) 및 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애의 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

자폐 스펙트럼 장애의 진단 및 치료{DIAGNOSIS AND TREATMENT OF AUTISM SPECTRUM DISORDERS}
관련 출원
본원은 그 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 가출원 61/145,294 (2009년 1월 16일 출원)의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 이익을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 자폐 스펙트럼 장애, 특히 증가된 머리 크기 (둘레) 및 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애의 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.
자폐 스펙트럼 장애 (ASD)는 매우 유전적이어서, 형제에서 2-3%의 재발율 및 일란성 쌍둥이에서 60-90%의 일치율을 갖는다. 그러나, 공지의 유전적 원인, 예를 들어, 단일 유전자 질환, 예를 들어 취약 (Fragile)-X 또는 결절 경화증, 또는 염색체 이상이 ASD 사례의 약 10%를 차지한다. 따라서, 대부분의 ASD 사례는 현재 원인이 알려져 있지 않다. 현재의 추정은 ASD 감수성이 서로 및 환경 인자와 상호작용하는 많은 유전자에 의해 부여된다는 것이다.
발명의 개요
PTEN 및/또는 SLC6A4에 대해 이종접합성인 마우스를 사용하여 수행된 실험에 기초하여, 본 발명자들은 이들 유전자 및 그들의 발현 생성물이 자폐 스펙트럼 장애에 대한 생체마커인 것으로 결정하였다. PTEN 및/또는 SLC6A4의 발현 생성물의 생화학적 상호작용에 기초하여, 본 발명자들은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 예기치 않게 인간 ASD 치료제에 대한 실행가능한 후보인 것으로 결정하였다.
자폐 스펙트럼 장애 (ASD), 특히 증가된 머리 크기 (둘레) 및 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 ASD에 대한 생체마커를 제공한다. 생체마커는 PTEN의 감소된 발현 또는 기능 (PTEN 결핍)을 일으키는 유전적 또는 후생유전적 변이 및/또는 SLC6A4의 감소된 발현 또는 기능 (SLC6A4 결핍)을 일으키는 유전적 또는 후생유전적 변이이다. 생체마커로서 사용할 수 있는 후생유전적 변이의 예는 PTEN 전사를 억제하는 작용을 하는 TGF-베타의 상향-조절을 일으키는 염증, 및 PTEN을 억제하는 아라키돈산에 대한 노출을 포함한다 (문헌 [Covey et al., Oncogene. 26(39):578457-92, 2007] 참조). ASD에 대한 추가의 생체마커는 상승된 순환 세로토닌 수준이다.
ASD의 치료 방법을 또한 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 뇌 세로토닌의 이용가능성을 감소시키는 것을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, 뇌 세로토닌의 이용가능성을 감소시키기 위해 SLC6A4의 효능제가 사용된다. 다른 실시양태에서, 치료 방법은 PI3 키나제 경로의 활성화를 감소시키거나 세로토닌 수용체 타입 5-HT2c 경로를 억제하는 것을 포함한다. 구체적인 실시양태에서, ASD는 PTEN 결핍, SLC6A4 결핍, 머리 크기 (둘레) 증가, 증가된 순환 세로토닌 중 하나 이상에 의해 표시된다.
본 발명의 한 측면에 따라, 자폐 스펙트럼 장애의 치료 방법을 제공한다. 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제인 하나 이상의 치료 분자를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 대상체를 치료하기 위해 효과적인 양의 (1) 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt, mTOR, Creb 및/또는 NF-카파 B의 길항제 또는 억제제, 및/또는 (2) GSK-3베타의 활성화제의 효능제이다.
일부 실시양태에서, 5-HT2c 수용체의 길항제 또는 억제제, 바람직하게는 뇌 내로 통과할 수 있는 길항제 또는 억제제가 투여된다. 특정 실시양태에서, 5-HT2c 수용체의 길항제 또는 억제제는 SB242084이다. 일부 실시양태에서, 투여된 SB 242084의 용량은 약 0.1-1 mg/kg/일이다. 다른 실시양태에서, 투여된 SB 242084의 용량은 약 1-10 mg/kg/일이다. 또 다른 실시양태에서, SB 242084는 약 0.1-10 mg/kg의 용량에서 간헐적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 비전형적 항정신병 의약, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (SSRI) 또는 PPAR-감마 효능제로서 시판되지 않는다 (본원의 출원일 현재). 특정 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 리스페리돈, 올란자핀, 지프라시돈, 플루옥세틴, 또는 티아졸리딘디온이 아니다.
일부 실시양태에서, PI3K의 길항제 또는 억제제, 바람직하게는 뇌 내로 통과할 수 있는 길항제 또는 억제제가 투여된다. 특정 실시양태에서, PI3K의 길항제 또는 억제제는 수니티닙 (수텐트 (SUTENT)®)이다.
일부 실시양태에서, Akt의 길항제 또는 억제제, 바람직하게는 뇌 내로 통과할 수 있는 길항제 또는 억제제가 투여된다. 특정 실시양태에서, Akt의 길항제 또는 억제제는 클로자핀 또는 넬피나비르 (비라셉트 (VIRACEPT))이다.
일부 실시양태에서, mTOR의 길항제 또는 억제제, 바람직하게는 뇌 내로 통과할 수 있는 길항제 또는 억제제가 투여된다. 특정 실시양태에서, mTOR의 길항제 또는 억제제는 라파마이신 (시롤리무스)이다.
일부 실시양태에서, 방법은 각각 바람직하게는 뇌 내로 통과할 수 있는, Creb의 길항제 또는 억제제, NF-카파 B의 길항제 또는 억제제, 또는 GSK-3베타의 활성화제의 효능제를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 경구, 정맥내, 근육내, 비내, 복강내, 피하, 또는 경막내 투여된다.
일부 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 자폐 스펙트럼 장애의 진단 후에 투여된다.
일부 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 자폐 스펙트럼 장애의 진단 전에 예방 목적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 달리 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제를 사용한 치료를 필요로 하는 증상이 없다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 PTEN 결핍 및/또는 SLC6A4 결핍 및/또는 증가된 순환 세로토닌에 대해 시험하는 것을 또한 포함한다. 특정 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 PTEN 결핍 및/또는 SLC6A4 결핍 및/또는 증가된 순환 세로토닌이 시험에 의해 검출되는 경우에만 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 대두증 (뇌 과다성장) 및/또는 사회적 행동의 결핍, 예를 들어 사회적 상호작용의 결핍 및/또는 사회적 기억 (social memory)의 결핍에 대해 시험하는 것을 또한 포함한다. 특정 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 대두증 및/또는 사회적 행동의 결핍이 시험에 의해 검출되는 경우에만 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 자폐 스펙트럼 장애에 대한 제2 치료제를 투여하는 것을 또한 포함하고, 여기서 제2 치료제 및 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 대상체를 치료하기 위해 효과적인 조합된 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 리스페리돈, 올란자핀, 지프라시돈, 플루옥세틴 또는 PPAR-감마 효능제이다.
본 발명의 다른 측면에 따라, 자폐 스펙트럼 장애의 치료 방법을 제공한다. 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 대상체에게 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt, mTOR, Creb 및/또는 NF-카파 B의 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자, 및/또는 GSK-3베타의 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자를 대상체를 치료하기 위한 유효량으로 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자는 RNA 간섭을 유도하는 하나 이상의 분자이다. 특정 실시양태에서, RNA 간섭을 유도하는 하나 이상의 분자는 하나 이상의 짧은 간섭 핵산 (siNA)이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 siNA 분자는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 짧은 헤어핀 (hairpin) RNA (shRNA) 분자이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자는 경구, 정맥내, 근육내, 비내, 복강내, 피하, 또는 경막내 투여된다.
일부 실시양태에서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자는 자폐 스펙트럼 장애의 진단 후에 투여된다.
일부 실시양태에서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자는 자폐 스펙트럼 장애의 진단 전에 예방 목적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 대상체는 달리 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자를 사용한 치료를 필요로 하는 증상이 없다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 PTEN 결핍 및/또는 SLC6A4 결핍 및/또는 증가된 순환 세로토닌에 대해 시험하는 것을 또한 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자는 PTEN 결핍 및/또는 SLC6A4 결핍 및/또는 증가된 순환 세로토닌이 시험에 의해 검출되는 경우에만 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체를 대두증 (뇌 과다성장) 및/또는 사회적 행동의 결핍, 예를 들어 사회적 상호작용의 결핍 및/또는 사회적 기억의 결핍에 대해 시험하는 것을 또한 포함한다. 특정 실시양태에서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자는 대두증 및/또는 사회적 행동의 결핍이 시험에 의해 검출되는 경우에만 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 방법은 대상체에게 자폐 스펙트럼 장애에 대한 제2 치료제를 투여하는 것을 또한 포함한다. 제2 치료제 및 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자는 대상체를 치료하기 위해 효과적인 조합된 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제이다. 다른 실시양태에서, 제2 치료제는 리스페리돈, 올란자핀, 지프라시돈, 플루옥세틴 또는 PPAR-감마 효능제이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 증가된 머리 크기 (둘레) 및/또는 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애의 진단 방법을 제공한다. 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플을 자폐 스펙트럼 장애에 대한 하나 이상의 생체마커의 존재에 대해 분석하는 것을 포함한다. 하나 이상의 생체마커는 예를 들어 (1) Pten 유전자 및/또는 Slc6a4 유전자에서 하나 이상의 돌연변이 또는 후생유전적 변이의 존재, 및/또는 (2) 정상 범위의 순환 세로토닌 수준에 비해 증가된 순환 세로토닌 수준이다. 자폐 스펙트럼 장애에 대한 하나 이상의 생체마커의 존재는 대상체가 증가된 머리 크기 (둘레) 및/또는 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애를 가진 것을 나타낸다.
일부 실시양태에서, Pten 유전자 및/또는 Slc6a4 유전자에서 하나 이상의 돌연변이 또는 후생유전적 변이는 PTEN의 감소된 발현 또는 기능 및/또는 SLC6A4의 감소된 발현 또는 기능을 일으킨다.
일부 실시양태에서, 방법은 자폐 스펙트럼 장애에 관하여 대상체의 상태를 나타내는 보고서 (report)를 작성하는 것을 또한 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플의 분석을 대상체에게 의료 관리를 제공하는 임상의에게 제공하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 사회적 행동의 결핍은 사회적 상호작용의 결핍 및/또는 사회적 기억의 결핍이다.
본 발명의 이들 및 다른 측면, 및 다양한 잇점 및 효용성은 본 발명의 상세한 설명을 참조로 하여 보다 명백해질 것이다. 본 발명의 각각의 측면은 다음 설명에 의해 이해될 바와 같은 다양한 실시양태를 포함할 수 있다.
도 1: Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스에서 대두증.
도 1(a). 수컷 Pten+/+; Slc6a4+/+, Pten+/-; Slc6a4+/+, Pten+/+; Slc6a4+/- 및 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스로부터의 뇌의 대표적인 배면도 (dorsal-view image). 뇌를 12주령에서 수집하였다.
도 1(b) 및 (c). 야생형 대조군에 비해, Pten 및 Slc6a4 반수체부족 (haploinsufficient) 마우스는 뇌 질량의 유의한 증가를 보인다. (b) 암컷의 뇌 질량은 Pten+/+; Slc6a4+/+, Pten+/-; Slc6a4+/+ 및 Pten+/+; Slc6a4+/- 마우스에 비해 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스에서 유의하게 증가하였다 [F3,42= 20.6; P < 0.001). n = 10 Pten+/+; Slc6a4+/+, 10 Pten+/-; Slc6a4+/+, 10 Pten+/+; Slc6a4+/- 및 13 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스. (c) 수컷의 뇌 질량은 Pten+/+; Slc6a4+/+, Pten+/-; Slc6a4+/+ 및 Pten+/+; Slc6a4+/- 마우스에 비해 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스에서 유의하게 증가하였다 (F3,33 = 30.0; P < 0.001). n = 6 Pten+/+; Slc6a4+/+, 6 Pten+/-; Slc6a4+/+, 11 Pten+/+; Slc6a4+/- 및 11 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스. * P < 0.05, ** P < 0.01 (Tukey HSD 시험). 나이는 8-12주였다. 동물들 사이의 체질량의 차이를 해명하기 위해, 데이타를 체질량에 대해 표준화한다.
도 2: Pten+/- 마우스의 행동 특징 결정.
도 2(a). 사회적 접근 행동을 분석하기 위해 사용된 기구 (apparatus)의 정지 영상. 사회적 자극 마우스를 챔버 (chamber) 1 내의 아크릴 케이지에 거주시키고, 챔버 3 내의 아크릴 케이지는 대조군으로서 비워둔다. 대상체 마우스는 챔버 2 내에서 분석을 시작하고, 분석을 10분 동안 비디오 (video)-녹화한 후, 각각의 챔버 내에서 소모한 시간%를 정량한다.
도 2(b) 및 (c). 자극 마우스를 보유한 케이지를 넣은 챔버 (챔버 1), 빈 챔버 (챔버 2) 또는 자극 마우스가 없는 케이지를 넣은 챔버 (챔버 3)에서 소모한 시간 %를 보여주는 데이타. 시험한 마우스는 모두 12주령이었다. (b) 암컷에서, Pten+/+ 마우스는 챔버 3에 비해 챔버 1에 대해 유의한 선호를 보여주는 반면, 이러한 선호는 Pten+/- 마우스에서 보이지 않는다. (c) 수컷에서, Pten+/+ 및 Pten+/- 마우스가 모두 챔버 3에 비해 챔버 1에 대한 선호를 보인다. * P < 0.05, 챔버 1 및 챔버 3 사이에서 군 비교 내에서 ANOVA. n = 각각의 유전자형에 대해 17마리 수컷, 12마리 암컷. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 각각의 막대 군에서, 순서는 좌측 막대 = 챔버 1, 중간 막대 = 챔버 2, 우측 막대 = 챔버 3이다.
도 2(d). Pten+/- 마우스에서 청각적 놀람 반응의 전펄스 (prepulse) 억제. 시험한 마우스는 모두 12주령이었다. Pten+/+ 마우스에 비해, Pten+/- 마우스는 배경을 넘어 전펄스 12db 또는 16db에서 놀람 억제의 유의한 결핍을 갖는다. * P < 0.05, 주어진 전펄스 강도에 대한 유전자형들 사이에서 ANOVA 비교, n = 각각의 유전자형에 대해 12마리 마우스 (6마리의 암컷). 각각의 막대 군에서, 순서는 좌측 막대 = Pten+/+, 우측 막대 = Pten+/-이다.
도 3: Pten 및 Slc6a4 반수체부족 마우스에서 사회적 행동 및 전펄스 억제
도 3(a). 8주령 암컷 Pten+/+; Slc6a4+/+ (n = 13), Pten+/-; Slc6a4+/+ (n = 13), Pten+/+; Slc6a4+/- (n = 11) 및 Pten+/-; Slc6a4+/- (n = 13) 마우스에 대한 사회적 접근 데이타. * P < 0.05, 챔버 1 및 챔버 3 사이에서 군 비교 내에서 ANOVA. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 각각의 막대 군에서, 순서는 좌측 막대 = 챔버 1, 중간 막대 = 챔버 2, 우측 막대 = 챔버 3이다.
도 3(b). 유전자형 전체의 분석에 대한 접근-회피 스코어로서 제시한 패널 (A)로부터의 사회적 접근 데이타. 챔버 1 내에서 사회적 자극 마우스에서 소모한 시간은 Pten+/+; Slc6a4+/+, Pten+/-; Slc6a4+/+ 및 Pten+/+; Slc6a4+/- 마우스에 비해 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스에서 유의하게 감소한다 (F3,49= 25.3; P < 0.001). * P < 0.05, ** P < 0.01 (Tukey HSD 시험).
도 3(c). 8주령 수컷 마우스에 대한 사회적 접근 및 인지 데이타. 시험 1 동안, 자극 (챔버 1 내에 놓음) 및 대상체 마우스를 10분 동안 상호작용시켰다. 이어서, 이들을 30분 동안 분리시켰다. 이어서, 시험 2를 수행하고, 이 동안 대상체 및 자극 마우스는 5분 동안 상호작용하였다. Pten+/+; Slc6a4+/+ (n = 12), Pten+/-; Slc6a4+/+ (n = 10), Pten+/+; Slc6a4+/- (n = 8) 및 Pten+/-; Slc6a4+/- (n = 8) 마우스. * P < 0.05, 챔버 1 및 챔버 3 사이에서 군 비교 내에서 ANOVA. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 각각의 막대 군에서, 순서는 좌측 막대 = 챔버 1, 중간 막대 = 챔버 2, 우측 막대 = 챔버 3이다.
도 3(d). 8주령 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스에서 청각적 놀람 반응의 전펄스 억제. Pten+/-; Slc6a4+/+ 및 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스는 배경을 넘어 전펄스 16db에서 놀람 억제의 유의한 결핍을 갖는다 (F3,46 = 3.6; P < 0.05). * P < 0.05 (Tukey HSD 시험). n = 11 Pten+/+; Slc6a4+/+ (8마리 암컷), 10 Pten+/-; Slc6a4+/+ (7마리 암컷), 13 Pten+/+; Slc6a4+/- (7마리 암컷) 및 13 Pten+/-; Slc6a4+/- (9마리 암컷) 마우스.
도 4: 유전자형 전체에서 및 내에서 뇌 질량 및 사회성의 상관성
도 4(a). 8주령 암컷 Pten+/+; Slc6a4+/+ (n = 7), Pten+/-; Slc6a4+/+ (n = 8), Pten+/+; Slc6a4+/- (n = 10) 및 Pten+/-; Slc6a4+/- (n = 11) 마우스에 대한 뇌 질량 (체질량에 대해 표준화된) (X-축) 및 사회적 접근-회피 스코어 (Y-축)에 대한 집단 평균의 플롯. r = -0.98.
(b 내지 e). 뇌 질량 (체질량에 대해 표준화된) (X-축) 및 사회적 접근-회피 스코어 (Y-축)에 대해 플롯팅된, 유전자형에 의해 배열된 패널 (A)로부터의 개별 대상체.
도 4(b). Pten+/+; Slc6a4+/+: r = 0.77; P < 0.05 (r에서 P로 전환).
도 4(c). Pten+/-; Slc6a4+/+: r = 0.70; P < 0.05
도 4(d). Pten+/+; Slc6a4+/-: r = 0.60; P = 0.07
도 4(e). Pten+/-; Slc6a4+/-: r = 0.65; P < 0.05
사회적 접근에 대해 분석된 모든 동물을 뇌 질량에 대해 측정하지는 않았으므로, 군 크기는 도 3a-b에 보고된 것과 상이하다.
도 5: Pten 반수체부족 마우스에서 사회적 접근 행동에 대한 5-HT2cR 길항제 SB 242084의 효과.
시험한 마우스는 암컷 한배 새끼들 (8주령)이었다. 분석 개시 20분 전에 마우스에게 0.3 mg/kg의 SB 242084 또는 비히클의 IP 주사를 제공하였다. 사회적 자극 마우스를 챔버 1에 넣고, 동일한 빈 케이지를 챔버 3에 넣었다. 자극 마우스와 상호작용하는 대상체 마우스가 소모한 시간 %를 10분에 걸쳐 정량하였다. SB 242084로 처리한 Pten 반수체부족 마우스는 자극 마우스와의 상호작용에 대해 유의한 선호를 보이고, 그 반면에 상기 유전자형의 비히클 처리 마우스는 상기 선호를 보이지 않는다. 비히클 처리군에 대해, n = 6; SB 242084-처리군에 대해, n = 8. * P < 0.05, 챔버 1 및 챔버 3 사이에서 군 비교 내에서 ANOVA. 각각의 막대 군에서, 순서는 좌측 막대 = 챔버 1, 중간 막대 = 챔버 2, 우측 막대 = 챔버 3이다.
도 6: 냄새 인지 및 식별에 대한 후각 습관화 (habituation)/탈습관화 분석은 새로운 냄새에 대한 습관화 및 탈습관화의 패턴이 Pten 및 Slc6a4 반수체부족 마우스에서 변하지 않음을 보여준다. 각각의 시점에 대한 유전자형 사이의 차이는 ANOVA에 의해 유의하지 않다. 6-9주령에서 동물을 시험하였다. n = 10 Pten+/+; Slc6a4+/+ (8마리 암컷), 10 Pten+/-, Slc6a4+/+ (8마리 암컷), 9 Pten+/+; Slc6a4+/- (4마리 암컷), 9 Pten+/-; Slc6a4+/- (4마리 암컷).
도 7: 세로토닌 및 PI3K 신호전달 경로가 뇌 크기 및 사회성에 영향을 미치도록 Slc6a4 및 Pten을 통해 상호작용할 수 있는 방식에 대한 모델. Slc6a4는 세로토닌 수용체에 이용가능한 세포외 세로토닌 (5-HT)의 양에 영향을 미친다. Pten은 5-HT2C 수용체에 결합하여 그의 기능을 길항한다. 세로토닌 신호전달은 또한 PI3K 경로를 활성화할 수 있다. 제안된 하류 효과기는 mTOR, GSK-3베타, Creb, 및 NF-카파B를 포함하고, 이들은 모두 뇌 형태형성, 성장 및 뉴런 기능에 영향을 미칠 수 있다.
도면은 단지 예시적인 것이고 본 발명의 실시를 위해 요구되지 않음을 이해하여야 한다.
특발성 자폐에 대한 통찰력을 제공하는 2개의 유전자는 PTEN 및 SLC6A4이다. PTEN는 PI3-키나제 (PI3K) 경로의 음성 조절자로서 역할을 한다 (1). 이종접합성 PTEN 돌연변이가 자폐 및 대두증이 있는 개체의 하위세트에서 확인되었고, 따라서 이환된 개체를 PTEN 반수체부족으로 만든다 (2-5). PTEN 반수체부족 개체에서 인지 장애의 임상-표현형 제시는 다양하다. 따라서, PTEN 돌연변이를 갖는 자폐 스펙트럼 장애 (ASD)가 있는 개체는 ASD 임상 표현형의 제2 부위 유전적 변형인자 (modifier)에 대해 스크리닝하기 위한 감작군을 나타낼 수 있음이 제안되었다 (4). SLC6A4는 세로토닌의 막-결합형 수송체 (이 신경전달물질의 세포외 수준에 영향을 미침)를 코딩한다. SLC6A4는 ASD에서 ASD 후보 감수성 유전자 및 제2 부위 유전적 변형인자로서 시사되었다 (6, 7). 뇌 과다성장 (8) 및 몇몇 사회적 행동 장애 (9)가 낮은-발현 Slc6a4 프로모터 다형성 대립유전자를 보유하는 ASD가 있는 개체에서 보고되었다. 추가로, SLC6A4는 세포외 세로토닌 수준을 조절하고, ASD에서 말초 생체마커의 가장 많이 복제된 보고서 중 하나는 ASD가 있는 개체에서 세포외 세로토닌의 증가된 수준이다 (6). 순환 세로토닌 수준을 분석하기 위해 ELISA 분석 및 유사한 면역흡착 분석이 이용될 수 있다. ASD와 연관된 세로토닌의 수준은 대조군 (비-ASD) 집단 평균보다 ≥ 2 표준 편차 초과이다.
ASD에 대한 연관성에 기초하여, PTEN 및 SLC6A4 모두는 두 유전자가 모두 CNS 외부에서 발현 및 기능을 갖는 다면발현형인 점에서 잠재적인 말초 생체마커이다. 그러나, 이들 마커의 변경된 발현 수준의 효과는 생물학적 및 행동적 척도에 대해 입증될 필요가 있다. 세로토닌 경로 (그 내부에서 Slc6a4가 작용하는)가 뇌에서 PI3K 경로 (그에 대해 Pten이 작용하는)와 교차한다는 것을 제안하는 증거가 존재한다. Pten 및 세로토닌 수용체 5-HT2c 사이에서 물리적 상호작용에 대한 증거가 발견되었고, 여기서 Pten의 포스파타제 활성이 상기 수용체의 활성을 조절한다 (10). 더욱이, 신경 및 비-신경 세포에서 몇몇 연구는 Akt가 세로토닌 수용체 효능제에 의해 활성화되고, 상기 활성화는 PI3K-의존 방식으로 일어남을 입증하였다 ((11)에서 검토됨). 그러나, 세로토닌 및 PI3K 경로는 둘 모두 ASD의 발병에서 강하게 시사되지만, ASD-관련 생물학적 및 행동적 표현형에 대한 이들 상호작용의 유의성은 현재 분명하지 않다.
코우덴 (Cowden) 증후군 환자 (그의 하위세트가 ASD를 가짐)에서, PTEN의 미스센스 돌연변이는 엑손 5의 코어 촉매적 포스파타제 도메인에서 집단화하는 경향이 있고, 이들은 단백질의 포스파타제 기능을 불활성화하는 경향이 있다 (12). 이들 유전적 병변에 가까운 마우스 모델로서, 본 발명자들은 엑손 5 및 따라서 코어 촉매적 포스파타제 도메인이 결실된 이전에 생성된 Pten 돌연변이체주를 이용하였다 (13). 상기 돌연변이체 대립유전자에 대해 이종접합성인 마우스는 생존가능하지 않지만; 상기 대립유전자에 대해 이종접합성인 마우스는 성체까지 생존하여, 이들은 뇌 구조 및 기능에 대한 Pten 반수체부족의 발달적 결과를 조사하기 위한 및 또한 상기 표현형의 제2 부위 유전적 및 환경적 변형인자에 대한 스크리닝하기 위한 신빙성있는 도구가 된다. PTEN에 추가로, PI3-키나제 경로의 다른 리프레서 (repressor)의 돌연변이가 또한 ASD, 구체적으로 결절 경화증 복합체 유전자 TSC1 및 TSC2 (14), 및 뉴로피브로민 1 (15, 16)과 연관되었다. 따라서, Pten 반수체부족 마우스는 그 내부에서 ASD 후보 유전자들 사이에서 풍부화된 신호전달 경로, PI3-키나제 경로가 감작되는 일반적으로 유용한 도구를 나타낸다. 또한, 상기 마우스는 자폐에 관련된 뇌 크기 및 행동적 척도에 영향을 미치는데 있어서 유전자-환경 상호작용의 보다 넓은 문제를 탐구하기 위한 기회를 제공한다.
상기 관찰을 기초로 하여, 본 발명자들은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 Pten 반수체부족 마우스에서 예기치 않게 기능을 회복시키고, 따라서 자폐 스펙트럼 장애 치료제로서 유용하다고 결정하였다.
따라서, 본 발명은 일부 측면에서, 5 HT2c 수용체 신호전달 경로의 하나 이상의 길항제 또는 억제제 유효량을 자폐 스펙트럼 장애가 있거나 자폐 스펙트럼 장애가 있는 것으로 생각되는 대상체에게 대상체를 치료하기 위해 투여하는 것을 수반한다. 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 상태의 예방, 개선, 방지 또는 치유를 포함하고자 의도된다. 상태가 확인된 후의 치료는 상태 및/또는 하나 이상의 그의 연관된 증상의 감소, 개선 또는 완전한 제거 및/또는 악화 방지를 위한 것이다. 상태 발생 전의 대상체의 치료 (즉, 예방적 처치)는 상태의 발생 위험의 감소 및/또는 상태가 추후 발생할 경우 그의 심도의 완화를 위한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방하다"는 그에 대한 처치가 대상체가 상태를 발병할 확률을 감소시키거나, 처치가 시행되지 않은 경우보다 상태가 덜 심각할 확률을 증가시키는, 상태가 발생할 위험이 있는 대상체의 예방적 처치를 의미한다. 치료는 본원에 설명되는 바와 같이 본 발명에 따라 치료되지 않은 대상체에 비해 상태가 있는 대상체의 상태 및/또는 하나 이상의 그의 연관된 증상을 감소, 개선 또는 완전히 제거하거나, 악화를 방지할 수 있다.
"대상체"는 인간 또는 동물, 예를 들어 비제한적으로 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 설치류, 예를 들어, 래트 및 마우스, 및 영장류, 예를 들어, 원숭이를 의미한다. 바람직한 대상체는 인간 대상체이다. 인간 대상체는 소아, 성인 또는 노인 대상체일 수 있다.
대상체는 그러한 치료법에 적용가능한 특정 자폐 스펙트럼 장애가 있는 것으로 알려져 있을 수 있거나 그러한 장애가 있는 것으로 생각될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 5 HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제를 사용한 치료를 요구하는 증상이 없다.
자폐 스펙트럼 장애 (ASD)는 단일 및 복합적 다중-유전자 병인을 모두 갖는, 임상적으로 진단되는 장애이다. 의사소통 기술, 사회적 상호작용의 상이한 정도의 손상, 및 제한되고 반복적인 정형화된 행동 패턴을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애는 자폐, PDD-NOS (달리 명시하지 않은 전반 발달 장애), 아스퍼거 (Asperger) 증후군, 레트 (Rett) 증후군 및 소아기 붕괴성 장애를 포함한다 (문헌 [Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, DSM-IV] 참조).
대상체의 사회적 및 의사소통 발달을 평가하기 위한 몇몇 스크리닝 기기가 당업계에 공지되어 있고, 따라서 자폐 스펙트럼 장애의 스크리닝 및 진단을 돕기 위해 사용될 수 있다. 이들은 유아 자폐증 진단 일람표 (CHAT), 변형된 유아 자폐증 진단 일람표 (M-CHAT), 2세 아동 자폐 선별 도구 (STAT), 사회적 의사소통 설문지 (SCQ) (4세 이상의 아동에 대한), 자폐증 선별 질문서 (ASSQ), 호주 아스퍼거 증후군 척도, 및 소아 아스퍼거 증후군 시험 (CAST)을 포함한다.
대개, 진단 평가는 심층적인 인지 및 언어 시험과 함께 신경학적 및 유전적 평가를 포함할 수 있다. 자폐를 특이적으로 진단하기 위해 개발된 추가의 척도는 자폐증 진단 면담지-개정판 (ADI-R), 자폐증 진단 관찰 스케줄 (ADOS-G) 및 소아기 자폐증 평정 척도 (CARS)를 포함한다.
본원에 설명되는 방법은 자폐 스펙트럼 장애에 추가로, 다른 질환에 대한 보다 넓은 적용성을 갖는다. 본 방법은 양극성 장애, 정신분열병, 강박 장애, 및 광범한 관련 인격 및 기분 장애의 치료를 위해 또한 사용될 수 있다.
본원에서 설명되는 바와 같이, 자폐 스펙트럼 장애는 본원에서 개별적으로 길항제 또는 억제제로서 동등하게 언급될 수 있는 5-HT2c (세로토닌) 수용체 경로의 길항제 또는 억제제로 치료된다. "5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제"는 본원에서 사용되는 바와 같이 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 또는 PI3K 신호전달 경로의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자이다. 그러한 길항제 또는 억제제는 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 또는 PI3K 신호전달 경로의 개별적인 폴리펩티드에 대해, 개별적인 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 증가시키는 방식으로 작용할 수 있고, 여기서 효과는 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 또는 PI3K 신호전달 경로를 통한 신호전달의 길항작용 또는 억제이다. 예를 들어, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 또는 PI3K 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 (1) 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt (단백질 키나제 B/PKB), mTOR, Creb 또는 NF-카파 B의 길항제 또는 억제제, 또는 (2) GSK-3베타의 효능제 또는 활성화제일 수 있다. 길항제 또는 억제제는 또한 역효능제, 예를 들어, 5-HT2c 수용체와 같은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 폴리펩티드에서 음성 효능을 갖는 분자일 수 있다. 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 개략도에 대해 도 7을 참조한다.
5-HT2c 활성화 (억제)는 PI3K 신호전달 경로의 중요한 활성화제 (억제제)이지만, 상기 경로는 도 7에 도시된 보다 많은 요소를 포함하는 것으로 당업계에 공지되어 있다. PI3K 신호전달 경로의 추가의 활성화제는 IGF1 수용체의 IGF1 활성화이다. 따라서, IGF1 및 관련 분자는 자폐 스펙트럼 장애, 보다 특히 본원에서 확인된 자폐 스펙트럼 장애의 하위세트의 치료를 위해 본원에 기재된 방식으로 사용될 수도 있다. 적합한 IGF1 및 관련 치료 분자는 WO 2008/153929 (그 개시내용이 본원에 참고로 포함됨), 예를 들어 페이지 12-17에 개시되어 있다.
추가의 실시양태에서, PPAR-감마 효능제 (예를 들어, 로시글리타존 (아반디아 (Avandia)), 피오글리타존 (액토스 (Actos)), 트로글리타존 (레줄린 (Rezulin)), MCC-555, 리보글리타존 및 시글리타존을 포함한 티아졸리딘디온 (TZD))가 상기 분자가 PTEN의 전사 상향조절을 통해 PI3K 경로를 길항한다면 PTEN 또는 SLC6A4 결핍이 있는 개체를 치료하기 위해 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다 (특히 본원에서 확인된 ASD의 하위세트에 대해 1차 치료제로서, 또는 제2 치료제로서) (예를 들어, 문헌 ([Zhang et al., Cancer Biol Ther. 2006. (8): 1008-14]; [Teresi et al., Int J Cancer. 2006. 118(10):2390-8]; [Patel et al., Curr Biol. 2001. 11(10):764-8]) 참조).
적합한 길항제 또는 억제제는 소분자 (특히 유기 소분자), 길항제 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 천연 성분의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 폴리펩티드의 발현을 감소시키기 위해 RNA 간섭을 유도하는 펩티드, 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드 등을 포함한다. 길항제 또는 억제제를 확인하는 방법은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키고, 정상적으로 폴리펩티드와 연관된 하나 이상의 생물학적 활성의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함한다. 길항제 또는 억제제를 확인하기 위한 다른 방법은 세포를 후보 분자와 접촉시키고, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 폴리펩티드, 또는 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현의 검출가능한 변화를 측정하는 것을 포함한다.
5-HT2c 수용체의 예시적인 길항제 또는 억제제는 SB 242084 (6-클로로-5-메틸-1-[[2-(2-메틸]피리드-3-일옥시)피리드-5-일]카르바모일]인돌린) (예를 들어, 문헌 ([Bromidge et al., J. Med. Chem. 40: 3494-3496, 1997]; [Kennett et al., Neuropharmacology 36: 609-620, 1997]) 참조); SB 243213 (5-메틸-1-[[2-[(2-메틸-3-피리딜)옥시]-5-피리딜]카르바모일]-6-트리플루오로메틸인돌린 염산염) (예를 들어, 문헌 [Wood et al., Neuropharmacology. 41(2): 186-199, 2001] 참조); RS 102221 (N-{5-[5-(2,4-디옥소-1,3,8-트리아자피로[4.5]dec-8-일)펜타노일]-2,4-디메톡시페닐}-4-(트리플루오로메틸)벤젠술폰아미드) (예를 들어, 문헌 [Bonhaus et al., Neuropharmacology. 36: 621-629, 1997] 참조); SB 206553; SB 200646A; SB 221284; SB 204741; SB 228357; SB 200646; 발독산 (VALDOXAN)® (아고멜라틴; S 20098) (예를 들어, 문헌 [Loo et al., Int Clin Psychopharmacol 2002 Sep;17(5):239-47)] 참조); 케탄세린 (Bonanno et al., Eur J Pharmacol 126: 317-321); 리탄세린; 아자미안세린; (+)-트랜스-1-(5-클로로-3-(4-플루오로페닐)-1-인다닐)-4-(2-(3-이소프로필-2-이미다졸리디논-1-일)에틸)-피페라진; 2,5-디메틸-3-(4-플루오로페닐)-1-[1-[2-(이미다졸리딘-2-온-1-일)에틸]-피페리딘-4-일]-1H-인돌; 플루옥세틴; 데람시클란; 미르타제핀; 마안세린; 네파조돈; 트라조돈; YM 35992; Ro 60-0759 ((+)-트랜스-8-에틸-7-히드록시-9-메톡시-2-메틸-1,3,4,4a,5,10b-헥사히드로벤조[h]이소퀴놀린-6(2H)-온); Org 38457; Org 12962; EGIS 8465; EGIS-9933; 5-HT2c 수용체에서 효과를 갖는 정신병약, 예를 들어 세르틴돌, 올란자핀 및 리스페리돈; LY 53857; 메테르골린; 메술레르긴; 피레페론; 스피로페론; 클로자핀; 다폭세틴; 메티세르기드; 세라자핀; Ro 60-0491 (N-(2-나프틸)-N'-(3-피리딜)우레아 1:1 HCl, N-(2-나프틸)-N'-(3-피리딜)-우레아 염산염); S16924; 사이아메마진; 나프톡사진 (SDZ NVI-085); S32006 (Dekeyne et al., Psychopharmacologia 199: 549-568, 2008), 및 WO 96/23783, WO 97/48699, WO 97/48700, WO 2002/014273, EP1782813, 문헌 ([Hamprecht et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 17(2):424-7 (2007)], [Hamprecht et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 17(2):428-33 (2007)], 및 [Bromidge et al., Bioorg Med Chem Lett. 10(16): 1867-1870 (2000)])에 기재된 추가의 길항제 또는 억제제 분자를 포함한다.
자폐 스펙트럼 장애를 치료하기 위해 유용한 것으로서 이전에 설명된 몇몇 분자가 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 또는 PI3K 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제로서 기능할 수 있음이 주목된다. 이들 분자, 예를 들어 리스페리돈, 올란자핀, 지프라시돈, 플루옥세틴 및 PPAR-감마 효능제 (예를 들어, 본원에 설명되는 바와 같은)는 본원에서 설명되는 바와 같은 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는 특정 방법에서 사용이 배제된다. 이들 분자, 예를 들어 리스페리돈, 올란자핀, 지프라시돈, 플루옥세틴 및 PPAR-감마 효능제 (예를 들어, 본원에 설명되는 바와 같은)는 본원에서 설명되는 바와 같은 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는 특정 방법에서 사용 (제2 치료제 분자로서 이외의 다른)이 배제된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 그러한 분자는 Pten 또는 Slc6a4에 대해 반수체부족인 ASD 개체의 1차 치료제로서, 및/또는 임의의 ASD 개체의 치료를 위한 제2 치료제 분자로서 사용된다.
특정 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 길항제 또는 억제제는 SB 242084 또는 RS 102221이다.
일부 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 길항제 또는 억제제는 5-HT2a 및/또는 5-HT2b 수용체보다 5배 초과의 선택성, 10배 초과의 선택성, 20배 초과의 선택성, 30배 초과의 선택성, 40배 초과의 선택성, 50배 초과의 선택성, 60배 초과의 선택성, 70배 초과의 선택성, 20배 초과의 선택성, 80배 초과의 선택성, 90배 초과의 선택성, 100배 초과의 선택성, 또는 150배 초과의 선택성을 갖는다. 특정 실시양태에서, 5-HT2C 수용체 길항제 또는 억제제는 다른 5-HT, 도파민 및 아드레날린성 수용체와 비슷한 선택성을 갖는다.
포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K)의 예시적인 길항제 또는 억제제는 LY294002 (2-(4-모르폴리닐)-8-페닐-4H-1-벤조피란-4-온); 워트만닌 (wortmannin); SU6668 (3-[2,4-디메틸-5-(2-옥소-1,2-디히드로-인돌-3-일리덴메틸)-1H-피롤-3-일]-프로피온산); 수니티닙 말레이트 (SU11248, 수텐트®); 게니스테인 (4',5,7-트리히드록시이소플라본); PX-866 (Ihle et al., Mol Cancer Ther, 4(9), 1349-1357, 2005); XL147 (엑셀릭시스 (Exelixis)), 및 US 특허 출원 공개 2008/0306057 A1 (예를 들어, 단락 [0079] 및 [0106]-[0288], 특허청구범위, 및 공개 명세서에 언급된 특허 출원 공개 참조) 및 2008/0293706 A1 (예를 들어, 단락 [0493]-[0494] 및 특허청구범위 참조)에 기재된 추가의 PI3K 길항제를 포함한다.
Akt는 단백질 키나제 B (PKB)로서 또한 알려져 있다. Akt 길항제 또는 억제제는 Akt1, Akt2 및/또는 Akt3의 길항제 또는 억제제일 수 있다. 예시적인 길항제 또는 억제제는 LY294005 (1L-6-히드록시메틸-키로-이노시톨 2(R)-2-O-메틸-3-O-옥타데실카르보네이트); 클로자핀, ALX-349 (알렉시스 바이오케미칼 (Alexis Biochemical; 미국 캘리포니아주 샌 디에고)); VQD-002 (트리시리빈 포스페이트 일수화물, 바이오퀘스트 파마슈티칼스 (VioQuest Pharmaceuticals)); 포스파티딜이노시톨 에테르 지질 유사체; 넬피나비르 (비라셉트); Akt/단백질 키나제 B 신호전달 억제제-2 (Yang et al., Cancer Res, 64(13), 4394-4399, 2004); 및 WO 2006/113837, 문헌 ([Zhu et al., Bioorg. Med Chem Lett. 16: 3150-3155 (2006)], 및 [Lindsley et al., Current Cancer Drug Targets. 8(1): 7-18 (2008)])에 기재된 추가의 Akt 길항제를 포함한다.
mTOR 길항제는 라파마이신 (시롤리무스); 템시롤리무스 (CCI-779, 와이어쓰 (Wyeth); [Nat Genet. 2004;36:585-95]; [J Clin Oncol. 2004;22:2336-47]); 에버롤리무스 (RAD001, 노바티스 (Novartis)); 데포롤리무스 (AP23573, 아리아드 파마슈티칼스 (ARIAD Pharmaceuticals)); 조타롤리무스 (ABT-578); SDZ RAD (40-O(2-히드록시에틸)-라파마이신); 및 WO 2008/027013에 기재된 라파마이신 전구약물 및 유사체를 포함한다.
NV-128 (노보겐 리미티드 (Novogen Limited))는 Akt-mTOR/p70s6k 신호 전달 캐스케이드를 분리시킨다.
Creb 길항제, NF-카파-B 길항제, 및 GSK-3베타 효능제가 본원에 기재된 치료 방법에서 또한 사용될 수 있다.
모든 실시양태에서, 뇌 내로 통과할 (예를 들어, 혈액-뇌 장벽을 가로질러) 수 있는 길항제가 바람직하다.
5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제의 다양한 대체 형태, 예를 들어 본원에 기재된 유기 소분자의 염, 용매화물, 또는 다형체가 본원에서 설명되는 바와 같은 자폐 스펙트럼 장애를 치료하기 위해 또한 유용하다. 그러한 대체 형태는 당업자에게 공지될 것이다.
특정 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 RNA 간섭을 유도하는 분자, 예를 들어 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 내의 폴리펩티드의 유전자 전사체에 대해 특이적인 짧은 간섭 핵산 (siNA)이다. 예를 들어, 치료 방법에서 적절하게 길항 또는 억제되는 것으로서 본원에 설명되는 유전자 (예를 들어, 5-HT2c 수용체, PI3K, Akt, mTOR, Creb 및 NF-카파 B)의 유전자 산물이 상기 방식으로 억제될 수 있다. siNA(들)은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 내의 폴리펩티드의 mRNA 및 단백질의 양을 감소시켜, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로를 억제한다.
짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 분자를 포함하는 짧은 간섭 핵산 (siNA)인 억제제 분자는 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용된다. 본 발명의 siNA, 예를 들어 siRNA는 일반적으로 표적 RNA 전사체 절단/분해 또는 표적 메신저 RNA (mRNA)의 번역 억제를 통해 유전자 발현을 제어한다. 한 실시양태에서, siRNA는 외부에서 세포로 전달된다. 구체적인 실시양태에서, 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt (단백질 키나제 B/PKB), mTOR, Creb 또는 NF-카파 B를 특이적으로 표적화하는 siRNA 분자가 생성된다.
본 발명의 짧은 간섭 핵산 (siNA)은 변형되지 않거나 또는 화학적으로 변형될 수 있다. 본 발명의 siNA는 화학적으로 합성되거나, 벡터로부터 발현되거나 또는 효소에 의해 합성될 수 있다. 본 발명은 또한 RNA 간섭 (RNAi)에 의해 세포에서 유전자 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 다양한 화학적으로 변형된 합성 짧은 간섭 핵산 (siNA) 분자를 특징으로 한다. 화학적으로 변형된 siNA의 사용은 예를 들어 생체 내에서 뉴클레아제 분해에 대한 내성 증가를 통해 및/또는 개선된 세포의 흡수를 통해 천연 siNA 분자의 다양한 특성을 개선한다. 더욱이, 여러 화학적 변형을 갖는 siNA가 그의 RNAi 활성을 보유할 수 있다. 예를 들어, 일부 사례에서, siRNA는 효능, 표적 친화도, 안전성 프로필 및/또는 세포내 분해에 대해 그를 내성 또는 부분적 내성으로 만들기 위한 안정성을 변경하기 위해 변형된다. 예를 들어, 포스포로티오에이트와 같은 변형은 뉴클레아제 분해에 대한 내성, 결합 친화도 및/또는 흡수를 증가시키기 위해 siRNA에 도입될 수 있다. 또한, 소수성화 (hydrophobization) 및 생접합 (bioconjugation)은 siRNA 전달 및 표적화를 향상시키고 (De Paula et al., RNA. 13(4):431-56, 2007), 리보-디플루오로톨루일 뉴클레오티드가 존재하는 siRNA는 유전자 침묵화 (silencing) 활성을 유지시킨다 (Xia et al., ASC Chem. Biol. 1(3):176-83, (2006)). S1 뉴클레아제 분해에 보다 내성이 큰 아미드-연결된 올리고리보뉴클레오시드가 존재하는 siRNA가 생성되었다 (Iwase R et al. 2006 Nucleic Acids Symp Ser 50: 175-176). 또한, 2'-당 위치 및 포스포디에스테르 연결에서 siRNA의 변형은 효능을 상실하지 않으면서 개선된 혈청 안정성을 부여한다 (Choung et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 342(3):919-26, 2006). 한 연구에서, 2'-데옥시-2'-플루오로-베타-D-아라비노핵산 (FANA)-함유 안티센스 올리고뉴클레오티드는 억제 효능 및 분해에 대한 내성의 측면에서 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드, 2'-O-메틸-RNA/DNA 키메라 올리고뉴클레오티드 및 siRNA에 비해 유리한 것으로 비교되었다 (Ferrari N et al., 2006 Ann NY Acad Sci 1082: 91-102).
일부 실시양태에서, siNA는 게놈에 통합된 도입유전자 (transgene) 또는 플라스미드-기반 발현 벡터에 의해 코딩되고 이로부터 발현되는 shRNA 분자이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 유전자 발현을 억제할 수 있는 분자는 작은-간섭 핵산을 코딩하는 도입유전자 또는 플라스미드-기반 발현 벡터이다. 상기 도입유전자 및 발현 벡터는 상기 shRNA의 발현을 유도하여 세포에서 기능적 siRNA를 생성시키는 중합효소 II 또는 중합효소 III 프로모터를 사용할 수 있다. 중합효소 II는 유도가능 및 조직 특이적 발현 시스템을 포함하는 전통적인 단백질 발현 전략의 사용을 허용한다. 일부 실시양태에서, 도입유전자 및 발현 벡터는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다. 다른 실시양태에서, 도입유전자 및 발현 벡터는 유도가능 프로모터, 예를 들어 테트라사이클린 유도가능 발현 시스템에 의해 조절된다. 포유동물 세포에서 유전자 침묵화를 위한 상기 헤어핀 RNA의 제조 및 사용의 예는 예를 들어 문헌 ([Paddison et al., Genes Dev, 2002, 16:948-58]; [McCaffrey et al., Nature, 2002, 418:38-9]; [McManus et al., RNA 2002, 8:842-50]; [Yu et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99:6047-52])에 기재되어 있다.
본원에서 하나의 실시양태는 예를 들어 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt (단백질 키나제 B/PKB), mTOR, Creb 또는 NF-카파 B의 발현을 억제할 수 있는 하나 이상의 작은 간섭 핵산을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 전달하기 위한 유전자 치료법, 예를 들어 바이러스-기반 유전자 치료법의 사용을 고려한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 유전자 치료법은 shRNA를 포함하여 치료 활성의 유전자 산물을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터를 병든 세포에 전달함으로써 유전자 질병, 예를 들어 암의 치료에 초점을 맞추는 치료법이다. 발현 벡터의 제작 및 전달 방법은 당업자에게 공지될 것이다.
따라서, 본 발명은 siRNA (shRNA 등)의 시험관내 용도 및 생리학적 조건 하에 그의 안정성 및/또는 세포 흡수를 증가시키기 위해, 예를 들어 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt (단백질 키나제 B/PKB), mTOR, Creb 또는 NF-카파 B를 코딩하는 핵산을 특이적으로 표적화하는 변형된 siRNA (shRNA 등)일 수 있는 siRNA (shRNA 등)를 제약상 허용되는 담체와 함께 포함하는 생체내 제약 제제를 고려한다.
특정 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 안티센스 핵산이다. 안티센스 핵산은 짧은 올리고뉴클레오티드 및 보다 긴 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 안티센스 핵산은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 내의 하나 이상의 폴리펩티드의 코딩 서열 또는 5' 비번역 서열의 일부에 상보성이고 이에 결합하여 기능적 폴리펩티드의 번역을 억제한다. 전사를 감소시키거나 차단하는 다른 안티센스 핵산도 유용하다.
따라서, 본 발명은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 내의 폴리펩티드(들)을 코딩하는 핵산 분자에 선택적으로 결합하여 폴리펩티드(들)의 발현 (전사 또는 번역)을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 생리학적 조건 하에 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt (단백질 키나제 B/PKB), mTOR, Creb 또는 NF-카파 B를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA에 혼성화하여 그 유전자의 전사 및/또는 그 mRNA의 번역을 억제하는 올리고리보뉴클레오티드, 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 변형된 올리고리보뉴클레오티드, 또는 변형된 올리고데옥시리보뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 설명한다.
당업자는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 정확한 길이 및 그의 표적에 대한 그의 상보성 정도가, 표적의 서열 및 이 서열을 포함하는 특정 염기를 비롯하여 선택되는 특이적 표적에 의해 결정됨을 알 것이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생리학적 조건 하에 표적에 선택적으로 결합하도록, 즉 생리학적 조건 하에 표적 세포 내의 임의의 다른 서열보다 표적 서열에 실질적으로 더 많이 혼성화하도록 제작되고 배열되는 것이 바람직하다. 대립유전자 또는 상동성 게놈 및/또는 cDNA 서열을 포함하는, 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt (단백질 키나제 B/PKB), mTOR, Creb 또는 NF-카파 B 핵산의 서열을 기초로 하여, 당업자는 본 발명에 따라 사용하기 위한 임의의 많은 적절한 안티센스 분자를 쉽게 선택하여 합성할 수 있다. 충분한 억제 선택성 및 효능을 갖기 위해, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적에 상보성인 적어도 10개, 보다 바람직하게는 적어도 15개의 연속적인 염기를 포함하여야 하지만, 특정한 경우에는 길이가 7개 염기만큼 짧은 변형된 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 성공적으로 사용되었다 (Wagner et al., Nature Biotechnol. 14:840-844, 1996). 가장 바람직하게는, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 20-30개 염기의 상보성 서열을 포함한다.
유전자 또는 mRNA 전사체의 임의의 영역에 안티센스인 올리고뉴클레오티드가 선택될 수 있지만, 바람직한 실시양태에서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 N-말단 또는 5' 상류 부위, 예를 들어 번역 개시, 전사 개시 또는 프로모터 부위에 대응한다. 또한, 3'-비번역 영역이 표적화될 수 있다. 또한, mRNA 스플라이싱 (splicing) 부위에 대한 표적화도 당업계에서 사용되었지만, 선택적인 mRNA 스플라이싱이 발생할 경우에는 덜 바람직할 수 있다. 또한, 안티센스는 mRNA 2차 구조가 예상되지 않고 (예를 들어, 문헌 [Sainio et al., Cell Mol. Neurobiol. 14(5):439-457, 1994] 참조) 단백질이 결합할 것으로 예상되지 않는 부위에 표적화되는 것이 바람직하다. 마지막으로, 당업자는 데이타베이스 및 간행된 문헌으로부터 5-HT2c 수용체 신호전달 경로 내의 폴리펩티드(들)에 대응하는 cDNA 서열 및 게놈 DNA를 쉽게 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt (단백질 키나제 B/PKB), mTOR, Creb 또는 NF-카파 B를 코딩하는 핵산에 대응하는 게놈 DNA에 상동성인 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 유사하게, 대립유전자 또는 상동성 cDNA 및 게놈 DNA에 대한 안티센스는 과도한 실험을 수행하지 않고 얻을 수 있다.
한 세트의 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 "천연" 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 또는 그의 임의의 조합으로 이루어질 수 있다. 즉, 한 천연 뉴클레오티드의 5' 단부 및 또 다른 천연 뉴클레오티드의 3' 단부는 천연 시스템에서처럼 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 연결을 통해 공유 연결될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 수동으로 또는 자동화 합성기에 의해 수행될 수 있는 당업계에서 인정되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이들은 또한 벡터에 의해 재조합 방식으로 생산될 수 있다.
그러나, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 "변형된" 올리고뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다. 즉, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드의 그의 표적에 대한 혼성화를 억제하지 않지만 그의 안정성 또는 표적화를 향상시키거나 또는 다른 방식으로 그의 치료 유효성을 향상시키는 많은 방식으로 변형될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는 (1) 그의 뉴클레오티드의 적어도 2개가 합성 뉴클레오시드간 연결 (즉, 한 뉴클레오티드의 5' 단부와 또 다른 뉴클레오티드의 3' 단부 사이의 포스포디에스테르 연결 이외의 다른 연결) 및/또는 (2) 올리고뉴클레오티드에 공유 부착된 핵산과 정상적으로는 회합되지 않는 화학기를 통해 공유 연결된 올리고뉴클레오티드를 설명한다. 바람직한 합성 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스페이트 에스테르, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복시메틸 에스테르 및 펩티드이다.
또한, 용어 "변형된 올리고뉴클레오티드"는 공유 변형된 염기 및/또는 당을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 변형된 올리고뉴클레오티드는 3' 위치에서 히드록실기 이외의 다른 및 5' 위치에서 포스페이트 이외의 다른 저분자량 유기기에 공유 부착된 백본 당을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 2'-O-알킬화된 리보스기를 포함할 수 있다. 또한, 변형된 올리고뉴클레오티드는 리보스 대신에 아라비노스와 같은 당을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 안티센스 분자의 시험관내 용도 및 생리학적 조건 하에 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt (단백질 키나제 B/PKB), mTOR, Creb 또는 NF-카파 B를 코딩하는 핵산에 상보성이고 이와 혼성화하는 변형된 안티센스 분자를 제약상 허용되는 담체와 함께 함유하는 생체내 제약 제제를 고려한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 안티센스 핵산은 그 내부에 도입된 발현 벡터에 의해 세포 내에서 발현에 의해 생산할 수 있다. 적절한 벡터의 선택과 설계는 당업자의 능력과 재량 내에 있다.
발현에 필요한 모든 요소를 함유하는 발현 벡터는 상업상 이용가능하고 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 참조). 상기 실시양태에 따르면, 세포는 안티센스 핵산을 코딩하는 이종성 DNA (RNA)의 세포 내로의 도입에 의해 유전자 조작된다. 안티센스 핵산은 숙주 세포 내에서 안티센스 핵산의 발현을 허용하는 전사 요소의 작동가능한 조절 하에 위치한다. 안티센스 핵산의 전달을 위한 추가의 벡터는 당업자에게 공지될 것이다.
핵산이 시험관 내에서 또는 숙주의 생체 내에서 도입되는지에 따라, 안티센스 핵산을 본 발명에 따라 세포 내로 도입하기 위한 다양한 기술이 사용될 수 있다. 그러한 기술은 핵산-CaPO4 침전물의 형질감염, DEAE와 회합된 핵산의 형질감염, 형질감염 또는 관심있는 핵산을 포함하는 바이러스의 감염, 리포좀 매개 형질감염 등을 포함한다. 특정 용도를 위해, 핵산을 특정 세포에 대해 표적화하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 본 발명의 핵산을 세포 (예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 바이러스; 리포좀) 내로 전달하기 위한 비히클에는 표적화 분자가 부착될 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자가 핵산 전달 비히클에 결합되거나 그 내부에 혼입될 수 있다. 리포좀이 본 발명의 핵산의 전달을 위해 사용되는 경우, 세포내 이입과 관련된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 표적화 및/또는 흡수 용이성을 위해 리포좀 제형 내로 혼입될 수 있다. 상기 단백질은 특정 세포 종류에 작용하는 캡시드 (capsid) 단백질 또는 그의 단편, 순환시에 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 세포내 국재화 (localization)를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질 등을 포함한다. 또한, 중합체 전달 시스템도 당업자가 아는 바와 같이 핵산을 세포 내로 전달하기 위해 성공적으로 사용되었다. 그러한 시스템을 사용한 경우에도 핵산을 경구로 전달할 수 있다.
특정 실시양태에서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 상기 경로의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여 폴리펩티드의 촉매 활성을 감소시키는 항체, 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 유도하기 위해 단백질, 단백질의 단편, 단백질 또는 그의 단편을 발현하는 세포 등을 동물에게 투여하는 것을 포함하는 임의의 다양한 방법에 의해 제조된다. 모노클로날 항체의 생산은 당업계에 잘 공지된 기술에 따라 수행한다. 항체 분자의 작은 일부, 즉 파라토프만이 그의 에피토프에 대한 항체의 결합에 관여한다는 사실이 당업계에 잘 공지되어 있다 (일반적으로, 문헌 [Clark, W.R., 1986, The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York]; [Roitt, I., 1991, Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford] 참조). 예를 들어, pFc' 및 Fc 영역은 보체 캐스케이드의 효과기이지만, 항원 결합에 관여하지 않는다. 그로부터 pFc' 영역이 효소에 의해 절단되었거나 또는 pFc' 영역이 없는 상태로 생산된 항체 (F(ab')2 단편으로 명명됨)는 무손상 항체의 두 항원 결합 부위를 모두 보유한다. 유사하게, 그로부터 Fc 영역이 효소에 의해 절단되었거나 또는 Fc 영역이 없는 상태로 생산된 항체 (Fab 단편으로 명명됨)는 무손상 항체 분자의 항원 결합 부위 중의 하나를 보유한다. Fab 단편은 공유 결합된 항체 경쇄 및 Fd로 표시되는 항체 중쇄의 일부로 구성된다. Fd 단편은 항체 특이성의 주요 결정자이고 (단일 Fd 단편은 항체 특이성을 변경하지 않으면서 10개 이하의 상이한 경쇄와 회합될 수 있다), Fd 단편은 그 단독으로 에피토프-결합 능력을 보유한다.
당업계에 잘 공지되어 있는 바와 같이, 항체의 항원-결합부 내에는 항원의 에피토프와 직접 상호작용하는 상보성 결정 영역 (CDR), 및 파라토프의 3차원 구조를 유지하는 프레임워크 영역 (FR)이 존재한다 (일반적으로, 문헌 [Clark, 1986]; [Roitt, 1991] 참조). IgG 면역글로불린의 중쇄 Fd 단편과 경쇄 모두에, 3개의 상보성 결정 영역 (CDR1 내지 CDR3)에 의해 각각 분리된 4개의 프레임워크 영역 (FR1 내지 FR4)이 존재한다. CDR, 특히 CDR3 영역, 보다 특히 중쇄 CDR3이 주로 항체 특이성을 결정한다.
포유동물 항체의 비-CDR 영역이 원래의 항체의 에피토프 특이성을 보유하면서 비특이적 또는 이종특이적 항체의 유사한 영역으로 대체될 수 있음이 현재 당업계에 잘 확립되어 있다. 이것은 비-인간 CDR이 인간 FR 및/또는 Fc/pFc' 영역에 공유 연결되어 기능적 항체를 생성하는 "인간화" 항체의 개발 및 사용시에 가장 분명하게 나타난다. 예를 들어, 미국 특허 4,816,567, 5,225,539, 5,585,089, 5,693,762, 및 5,859,205를 참조한다. 또한, 완전 인간 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 로커스의 큰 부분에 대해 트랜스제닉인 마우스를 면역화함으로써 제조될 수 있다. 이들 마우스 (예를 들어, 제노마우스 (아브게닉스 (Abgenix)), HuMAb 마우스 (메다렉스 (Medarex)/젠팜 (GenPharm))의 면역화 후에, 모노클로날 항체는 표준 하이브리도마 기술에 따라 제조할 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 인간 면역글로불린 아미노산 서열을 가질 것이고, 따라서 인간에게 투여될 때 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 반응을 촉발하지 않을 것이다. 따라서, 당업자에게 명백할 바와 같이, 본 발명은 또한 F(ab')2, Fab, Fv, 및 Fd 단편; Fc 및/또는 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄 CDR3 영역이 상동성 인간 또는 비-인간 서열로 대체된 키메라 항체; FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄 CDR3 영역이 상동성 인간 또는 비-인간 서열로 대체된 키메라 F(ab')2 단편 항체; FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄 CDR3 영역이 상동성 인간 또는 비-인간 서열로 대체된 키메라 Fab 단편 항체; 및 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 영역이 상동성 인간 또는 비-인간 서열로 대체된 키메라 Fd 단편 항체를 제공한다. 또한, 본 발명은 소위 단일쇄 항체, 도메인 항체 및 중쇄 항체를 포함한다.
따라서, 본 발명은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하여 기능적 활성을 억제하는 많은 크기 및 종류의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 폴리펩티드는 항체 기술 이외의 다른 공급원으로부터도 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드 결합제는 용액, 고정된 형태로 또는 파지 디스플레이 라이브러리로서 쉽게 제조될 수 있는 축퇴성 (degenerate) 펩티드 라이브러리에 의해 제공될 수 있다. 또한, 하나 이상의 아미노산을 함유하는 펩티드의 조합 라이브러리가 합성될 수 있다. 또한, 펩티드 및 비-펩티드 합성 모이어티의 라이브러리가 합성될 수 있다.
5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 대상체에서 자폐 스펙트럼 장애를 치료하기에 효과적인 양으로 투여된다. 유효량은 의학적으로 바람직한 반응을 제공하기에 충분한 치료 분자(들)의 투여량이다. 예를 들어, 바람직한 반응은 자폐 스펙트럼 장애의 진행의 억제일 수 있다. 이것은 단지 자폐 스펙트럼 장애의 진행을 일시적으로 늦추는 것을 수반할 수 있지만, 보다 바람직하게는, 자폐 스펙트럼 장애의 진행을 영구적으로 중지시키는 것을 수반한다. 이것은 당업자에게 공지된 일상적인 진단 방법에 의해 모니터링할 수 있다.
본 발명의 치료 분자는 자폐 스펙트럼 장애의 치료 또는 예방을 위해 사용되고, 즉 자폐 스펙트럼 장애가 발생할 위험이 있는 대상체에서 예방 목적으로 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 유효량은 자폐 스펙트럼 장애의 위험을 감소시키거나 그 심도를 완화하거나 아마도 그 발병을 완전히 억제할 수 있는 양이다.
유효량 결정에 관련되는 인자는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 단지 일상적인 실험을 통해 결정될 수 있다. 본 발명의 치료 분자의 최대 용량 (단독으로 또는 다른 치료 분자 또는 치료 요법과 조합되어), 즉 충분한 의학적 판단에 따른 최고 안전 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 환자는 의학적 이유, 심리적인 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 보다 낮은 용량 또는 참을 수 있는 용량을 고집할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 단독으로, 제약 조성물로 또는 다른 치료 분자(들) 또는 치료 요법과 조합되어 투여될 수 있다. 임의로, 다른 치료 분자(들)은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 다른 치료 분자(들)이 동시에 투여될 때, 이들은 동일한 제형으로 또는 별개의 제형으로 투여될 수 있지만, 동시에 투여된다. 다른 치료 분자(들)은 다른 치료 분자(들) 및 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제의 투여가 일시적으로 분리된 경우에 서로 및 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제와 순차적으로 투여될 수 있다. 상기 분자들의 투여 사이의 시간 간격은 분 단위의 시간일 수 있거나 또는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12시간, 또는 그 초과의 시간, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 또는 그 초과의 시간으로 더 길 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 제약 조성물은 바람직하게는 멸균되고, 목적하는 반응의 생성을 위한 유효량의 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제를 대상체에게 투여하기 적합한 중량 또는 부피 단위로 함유한다. 대상체에게 투여되는 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제의 용량은 상이한 파라미터에 따라, 특히 사용된 투여 방식 및 대상체의 상태에 따라 선택될 수 있다. 다른 인자는 목적하는 치료 기간을 포함한다. 대상체의 반응이 적용되는 초기 용량에서 불충분한 경우에, 보다 높은 용량 (또는 상이한, 보다 국소화된 전달 경로에 의한 효과적으로 보다 높은 용량)이 환자가 참을 수 있는 수준까지 사용될 수 있다. 하나 이상의 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제의 투여량은 특히 임의의 합병증의 경우에 개별적인 의사 또는 수의사에 의해 조정될 수 있다. 치료 유효량은 일반적으로 1일 이상 동안 1회 이상의 용량 투여로 0.01 mg/kg 내지 약 1000 mg/kg, 바람직하게는 약 0.1-10 mg/kg, 예를 들어 약 0.1-1 mg/kg/일 또는 약 1-10 mg/kg/일이다.
약물학적 물질을 목적하는 조직, 세포 또는 체액에 효과적으로 전달하는 다양한 투여 방식이 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 분자의 투여는 경구, 정맥내, 피하, 근육내, 국소, 데포 (depot) 주사, 삽입, 지연방출 방식, 강내, 비내, 흡입, 경막내, 안내, 및 제어 방출을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 비경구로, 경점막 (예를 들어, 경구), 코, 경막내, 직장내, 질내, 설하, 점막하, 또는 경피로 도입된다. 비경구 투여는 소화관을 통하지 않고, 예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내, 경막내, 복강내, 안와내, 낭내, 척수내, 흉골내, 정맥내, 또는 피내 투여에 의한 몇몇 다른 경로를 통한 투여이다. 본원에 기재된 유기 소분자는 경구 투여가 바람직하다. 당업자는 투여 방식의 선택시에 고려되는 특정 잇점 및 단점을 알 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 특정 투여 방식으로 제한되지 않는다. 당업계의 표준 문헌 (예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, Lippincott, Williams and Wilkins, Baltimore MD, 2001])은 투여 방식 및 제약 담체 내의 다양한 제약 제제 및 제형의 전달을 위한 제형을 제시한다. 용량, 투여 스케쥴, 투여 부위, 투여 방식 등이 본원에서 제시되는 것과 상이한, 본 발명의 약물학적 물질의 투여에 유용한 다른 프로토콜이 당업자에게 공지될 것이다.
예를 들어 시험 또는 동물 치료 목적을 위해 인간 이외의 다른 포유동물에 대한 본 발명의 약물학적 물질의 투여는 상기 설명한 바와 실질적으로 동일한 조건 하에 수행된다. 본 발명이 인간과 동물 질병 모두에 적용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
투여될 때, 본 발명의 제약 제제는 제약상 허용되는 양 및 제약상 허용되는 조성물로 적용된다. 용어 "제약상 허용되는"은 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 저해하지 않는 비-독성 물질을 의미한다. 그러한 제제는 통상적으로 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 및 임의로 다른 치료 분자를 함유할 수 있다. 의약에서 사용될 때, 염은 제약상 허용되어야 하지만, 비-제약상 허용되는 염은 그의 제약상 허용되는 염의 제조를 위해 편리하게 사용될 수 있고, 본 발명의 범위로부터 배제되지 않는다. 상기 약물학상 및 제약상 허용되는 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등으로부터 제조되는 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 또한, 제약상 허용되는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조될 수 있다.
약물학적 물질 또는 조성물은 요구되는 경우에 제약상 허용되는 담체와 조합될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "제약상 허용되는 담체"는 인간에게 투여하기 적합한 하나 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 용어 "담체"는 적용을 용이하게 하기 위해 활성 성분이 그와 조합되는 천연 또는 합성 유기 또는 무기 성분을 나타낸다. 또한, 제약 조성물의 성분은 목적하는 제약 효능을 실질적으로 손상하는 상호작용이 존재하지 않는 방식으로 본 발명의 약물학적 물질과, 및 서로 혼합될 수 있다.
제약 조성물은 아세테이트, 포스페이트, 시트레이트, 글라이신, 보레이트, 카르보네이트, 비카르보네이트, 히드록시드 (및 다른 염기) 및 상기 화합물의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 상기한 바와 같은 적합한 완충제를 함유할 수 있다. 또한,제약 조성물은 임의로, 적합한 보존제, 예를 들어 벤즈알코늄 클로라이드; 클로로부탄올; 파라벤 및 티메로살을 함유할 수 있다.
제약 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있고, 제약업계에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 활성 물질을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 조성물은 활성 화합물을 액체 담체, 미분 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 긴밀하게 회합시킨 후, 필요한 경우 제품을 성형함으로써 제조된다.
5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 전신 전달이 바람직할 때, 주사, 예를 들어 볼러스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 첨가된 보존제와 함께 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 (ampoule) 또는 다중-용량 용기 내에 제시될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태일 수 있고, 제형화제, 예를 들어 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제약 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 오일성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방유, 예를 들어 예를 들어 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의로, 현탁액은 또한 적합한 안정화제 또는 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하기 위해 화합물의 용해도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다.
별법으로, 화합물은 사용 전에 적합한 비히클 (예를 들어, 염수, 버퍼, 또는 멸균 발열원 미함유 물)을 사용한 재구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
경구 투여에 적합한 조성물은 각각 소정량의 활성 화합물(들)을 함유하는 분리된 단위, 예를 들어 캡슐, 정제, 알약, 로젠지제로서 제시될 수 있다. 다른 조성물은 수성 액체 또는 비-수성 액체 내의 현탁액, 예를 들어 시럽, 엘릭시르, 에멀젼, 또는 겔을 포함한다.
경구 사용을 위한 제약 제제는 임의로 생성되는 혼합물을 연마하고, 요구되는 경우에 적합한 보조제를 첨가한 후, 정제 또는 당의정 코어를 얻기 위해 과립의 혼합물을 가공하여 고체 부형제로서 수득될 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충전제, 예를 들어 당, 예를 들어 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨 또는 셀룰로스 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 요구되는 경우에, 붕해제, 예를 들어 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가, 또는 알긴산 또는 그의 염, 예를 들어 알긴산나트륨이 첨가될 수 있다. 임의로, 경구 제형은 또한 염수 또는 버퍼, 즉, 내부 산 조건을 중화하기 위한 EDTA 내에서 제형화될 수 있거나 또는 임의의 담체를 첨가하지 않은 상태로 투여될 수 있다.
또한, 상기 성분 또는 성분들의 경구 투여 형태가 구체적으로 고려된다. 성분 또는 성분들은 유도체의 경구 전달이 효능을 보이도록 화학적으로 변형될 수 있다. 일반적으로, 고려되는 화학적 변형은 성분 분자 자체에 대한 적어도 하나의 모이어티의 부착이고, 여기서 상기 모이어티는 (a) 단백질 분해의 억제; 및 (b) 위 또는 창자로부터 혈류 내로의 흡수를 허용한다. 또한, 성분 또는 성분들의 전체 안정성의 증가 및 체내 순환 시간의 증가가 요구된다.
성분 (또는 유도체)에 대해, 방출 위치는 위, 소장 (십이지장, 공장, 또는 회장), 또는 대장일 수 있다. 당업자는 위에서 용해되지 않지만 물질을 십이지장 또는 장의 다른 부위에서 방출하는 제형을 입수할 수 있다. 바람직하게는, 방출은 분자(들)의 보호에 의해 또는 위 환경 이후의, 예를 들어 창자에서의 생물학적 활성 분자(들)의 방출에 의해 위 환경의 유해한 효과를 방지할 것이다.
완전한 위 내성을 보장하기 위해서는, 적어도 pH 5.0에 불투과성인 코팅이 필수적이다. 장용 코팅으로서 사용되는 보다 통상적인 불활성 성분의 예는 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트 (CAT), 히드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트 (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP), 유드라기트 (Eudragit) L30D, 아쿠아테릭 (Aquateric), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 (CAP), 유드라기트 L, 유드라기트 S, 및 쉘락 (Shellac)이다. 상기 코팅은 혼합 필름으로서 사용될 수 있다.
또한, 코팅 또는 코팅의 혼합물은 위에 대한 보호가 의도되지 않은 정제에도 사용될 수 있다. 이는 당 코팅, 또는 정제를 삼키기 더 쉽도록 만드는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건식 치료제, 즉 분말의 전달을 위한 경질 외피 (예를 들어 젤라틴)로 구성될 수 있고; 액체 형태의 경우에는 연질 젤라틴 외피가 사용될 수 있다. 카세제 (cachet)의 외피 물질은 두꺼운 전분 또는 다른 먹을 수 있는 종이일 수 있다. 알약, 로젠지제, 성형 정제 또는 습제 정제 (tablet triturate)의 경우에는, 습식 매싱 (moist massing) 기술이 사용될 수 있다.
치료 분자의 부피는 불활성 물질로 희석하거나 증가시킬 수 있다. 상기 희석제는 탄수화물, 특히 만니톨, a-락토스, 무수 락토스, 셀룰로스, 수크로스, 변형된 덱스트란 및 전분을 포함할 수 있다. 또한, 삼인산칼슘, 탄산마그네슘 및 염화나트륨을 포함하는 특정 무기 염이 충전제로서 사용될 수 있다. 일부 상업상 이용가능한 희석제는 Fast-Flo, 엠덱스 (Emdex), STA-Rx 1500, 엠콤프레스 (Emcompress) 및 아비셀 (Avicell)이다.
붕해제는 고체 투여 형태로 치료제의 제형에 포함될 수 있다. 붕해제로서 사용되는 물질은 전분, 예를 들어 전분을 기재로 하는 시판 붕해제인 엑스플로탭 (Explotab)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 나트륨 전분 글리글리콜레이트, 앰벌라이트 (Amberlite), 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 울트라아밀로펙틴, 알긴산나트륨, 젤라틴, 오렌지 껍질, 산 카르복시메틸 셀룰로스, 천연 스폰지 및 벤토나이트가 모두 사용될 수 있다. 또 다른 형태의 붕해제는 불용성 양이온 교환 수지이다. 분말 검은 붕해제로서 및 결합제로서 사용될 수 있고, 분말 검, 예를 들어 아가, 카라야 (Karaya) 또는 트라가칸트를 포함할 수 있다. 알긴산 및 그의 나트륨염도 붕해제로서 유용하다.
결합제는 경질 정제를 형성하기 위해 치료 분자를 함께 유지하기 위해 사용될 수 있고, 천연 산물로부터의 물질, 예를 들어 아카시아, 트라가칸트, 전분 및 젤라틴을 포함한다. 다른 결합제는 메틸 셀룰로스 (MC), 에틸 셀룰로스 (EC) 및 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC)를 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈 (PVP) 및 히드록시프로필메틸 셀룰로스 (HPMC) 모두가 치료제를 과립화하기 위해 알콜 용액에 사용될 수 있다.
제형화 과정 동안 들러붙는 것을 방지하기 위해 마찰방지제가 치료제의 제형 내에 포함될 수 있다. 윤활제가 치료제와 다이 벽 사이의 층으로서 사용될 수 있고, 이것은 그의 마그네슘 및 칼슘염을 포함하는 스테아르산, 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE), 액체 파라핀, 식물유 및 왁스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트, 마그네슘 라우릴 술페이트, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 카르보왁스 (Carbowax) 4000 및 6000과 같은 가용성 윤활제도 사용될 수 있다.
제형화 동안 약물의 유동 특성을 개선하고 압축 동안 재배열을 돕기 위한 활제가 첨가될 수 있다. 활제는 전분, 탈크, 발열성 실리카 및 수화된 실리코알루미네이트를 포함할 수 있다.
치료제가 수성 환경에 용해되는 것을 돕기 위해, 계면활성제가 습윤제로서 첨가될 수 있다. 계면활성제는 음이온성 세제, 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트, 디옥틸 나트륨 술포숙시네이트 및 디옥틸 나트륨 술포네이트를 포함할 수 있다. 양이온성 세제가 사용될 수 있고, 벤즈알코늄 클로라이드 또는 벤제토뮴 클로라이드를 포함할 수 있다. 제형에 계면활성제로서 포함될 수 있는 잠재적인 비-이온성 세제의 목록은 라우로마크로골 400, 폴리옥실 40 스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 수소화 캐스터유 10, 50 및 60, 글리세롤 모노스테아레이트, 폴리소르베이트 40, 60, 65 및 80, 수크로스 지방산 에스테르, 메틸 셀룰로스 및 카르복시메틸 셀룰로스이다. 이들 계면활성제는 제형에 단독으로 또는 상이한 비율의 혼합물로서 존재할 수 있다.
경구로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸시-핏 (push-fit) 캡슐, 및 젤라틴 및 가소화제, 예를 들어 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 활성 성분을 충전제, 예를 들어 락토스, 결합제, 예를 들어 전분, 및/또는 윤활제, 예를 들어 탈크 또는 스테아르산마그네슘 및 임의로 안정화제와의 혼합물로 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적합한 액체, 예를 들어 지방유, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜 내에 용해되거나 현탁될 수 있다. 추가로, 안정화제가 첨가될 수 있다.
비내 또는 흡입에 의한 투여를 위해, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 편리하게는 적합한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체의 사용과 함께 가압 팩 (pack) 또는 연무기 (nebulizer)로부터 에어로졸 분무 제시 형태로 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우에, 투여량 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 화합물 및 적합한 분말 베이스, 예를 들어 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하는, 흡입기 또는 취입기 (insufflator)에서 사용하기 위한 예를 들어, 젤라틴의 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다.
5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제의 폐 전달이 또한 본원에서 고려된다. 분자(들)은 흡입하는 동안 포유동물의 폐에 전달되고, 폐 상피층을 가로질러 혈류로 횡단한다.
연무기, 계량 용량 흡입기, 및 분말 흡입기 (이들은 모두 당업자에게 익숙하다)를 포함하고 이로 제한되지 않는 치료 생성물의 폐 전달을 위해 고안된 매우 다양한 기계 장치가 본 발명의 실시에 사용하기 위해 고려된다.
본 발명의 제약 조성물의 코 (또는 비내) 전달이 또한 고려된다. 코 전달은 폐 내에 생성물의 침적을 필요로 하지 않으면서, 치료 생성물을 코에 투여한 후 직접적으로 혈류로 본 발명의 제약 조성물의 통과를 허용한다.
코 투여를 위해, 유용한 장치는 계량 용량 분무기가 부착된 작은 단단한 병이다. 하나의 실시양태에서, 계량 용량은 본 발명의 제약 조성물 용액을 규정된 부피의 챔버 내로 끌어당겨 전달되고, 상기 챔버는 챔버 내의 액체가 압축될 때 분무를 형성하여 에어로졸 제형을 에어로졸화하기 위한 치수의 구멍을 갖는다. 본 발명의 제약 조성물을 투여하기 위해 챔버는 압축된다. 구체적인 실시양태에서, 챔버는 피스톤 배열이다. 그러한 장치는 상업상 이용가능하다.
별법으로, 짤 때 분무를 형성하여 에어로졸 제형을 에어로졸화하기 위한 치수의 구멍 또는 개구부를 갖는 플라스틱 스퀴즈 (squeeze) 병이 사용된다. 개구부는 대체로 병의 상단부에서 발견되고, 상단부는 에어로졸 제형의 효율적인 투여를 위해 비도 내에 부분적으로 맞도록 전체적으로 끝이 가늘어진다. 바람직하게는, 코 흡입기는 측정된 용량의 약물의 투여를 위해 계량된 양의 에어로졸 제형을 제공할 것이다.
이전에 설명된 제형에 추가로, 화합물은 데포 제제로서 또한 제형화될 수 있다. 그러한 지속 작용 제형은 적합한 중합체성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 허용되는 오일 내에 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 사용하여, 또는 난용성 유도체, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형화될 수 있다.
제약 조성물은 적합한 고체 또는 겔상 담체 또는 부형제를 또한 포함할 수 있다. 그러한 담체 또는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적합하다. 약물 전달 방법에 대한 간략한 검토를 위해 본원에 참고로 포함된 문헌 [Langer, Science 249:1527-1533, 1990]을 참조한다.
5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제는 제어 방출 시스템 내에 포함될 수 있다. 용어 "제어 방출"은 제형으로부터 약물 방출의 방식 및 프로필이 제어되는 임의의 약물-함유 제형을 나타내도록 의도된다. 이는 즉각적 및 비-즉각적 방출 제형을 나타내고, 여기서 비-즉각적 방출 제형은 지속 방출 및 지연 방출 제형을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 용어 "지속 방출" ("연장 방출"로도 언급됨)은 그의 통상적인 의미로 사용되어, 연장된 기간에 걸쳐 약물의 점진적인 방출을 제공하고, 반드시는 아니지만 바람직하게는 연장된 기간에 걸쳐 약물의 실질적으로 불변하는 혈액 수준을 생성시키는 약물 제형을 나타낸다. 용어 "지연 방출"은 그의 통상적인 의미로 사용되어, 제형의 투여와 그로부터 약물의 방출 사이에 시간 지연이 존재하는 약물 제형을 나타낸다. "지연 방출"은 연장된 기간에 걸쳐 약물의 점진적인 방출을 수반할 수 있거나 그렇지 않을 수 있고, 따라서 "지속 방출"일 수 있거나 그렇지 않을 수 있다.
장기 지속 방출 임플란트의 사용은 만성 상태의 치료에 특히 적합할 수 있다. "장기" 방출은 본원에서 사용될 때 치료 수준의 활성 성분을 적어도 7일, 바람직하게는 30-60일 동안 전달하도록 임플란트가 제작되고 배열되는 것을 의미한다. 장기 지속 방출 임플란트는 당업자에게 잘 공지되어 있고, 상기 설명된 방출 시스템의 일부를 포함한다.
본 발명은 키트의 사용을 또한 고려한다. 본 발명의 일부 측면에서, 키트는 제약 제제 바이알 (vial), 제약 제제 희석제 바이알, 및 본원에서 설명되는 바와 같은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제를 포함할 수 있다. 제약 제제용 희석제를 담은 바이알은 선택적이다. 희석제 바이알은 분자(들)의 농축 용액 또는 동결건조 분말일 수 있는 것을 희석하기 위한 희석제, 예를 들어 생리 염수를 담는다. 지시서는 특정량의 희석제를 특정량의 농축된 제약 제제와 혼합하기 위한 지시서 (그에 의해 주사 또는 주입을 위한 최종 제형이 제조된다)를 포함할 수 있다. 지시서는 대상체를 유효량의 분자(들)로 치료하기 위한 지시서를 포함할 수 있다. 제제를 담은 용기 (용기가 병, 격막이 있는 바이알, 격막이 있는 앰플, 및 주입 백 등이든지)는 제제가 고압멸균되거나 달리 멸균될 때 색상이 변하는 통상적인 마킹 (marking)과 같은 표식을 포함할 수 있음이 또한 이해될 것이다.
자폐 스펙트럼 장애의 생체마커의 본원에 따른 확인에 기초한 진단 방법, 및 치료법과 조합한 그러한 진단 방법의 사용이 또한 고려된다. 진단 방법은 적절한 치료법 및/또는 환자 집단 (예를 들어, 임상 시험을 위한)의 선택을 돕기 위해 사용될 수 있다.
진단 방법은 대상체를 자폐 스펙트럼 장애, 특히 증가된 머리 크기 (둘레) 및/또는 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애에 대한 생체마커의 존재에 대해 평가하는 것을 포함한다. 사회적 행동의 결핍은 일부 실시양태에서, 본원에서 나타낸 바와 같이 사회적 상호작용의 결핍 및/또는 사회적 기억의 결핍이다.
예를 들어, 증가된 머리 크기 (둘레) 및 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애는 Pten 유전자 및/또는 Slc6a4 유전자에서 본원에 제시된 바와 같이 상기 유전자(들)의 반수체부족을 일으키는 돌연변이 또는 변이와 연관되고/되거나 그에 의해 유발되는 것으로 본원에서 나타난다. 따라서, 대상체를 그러한 돌연변이, 변이 또는 반수체부족에 대해 스크리닝할 수 있다. 진단 방법은 대상체를 대두증 (뇌 과다성장) 및/또는 감소된 사회성 (사회적 접근 행동의 결핍)에 대해 시험하는 것을 또한 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 진단 방법은 생물학적 샘플을 PTEN의 감소된 발현 또는 기능 (PTEN 결핍)을 일으키는 유전적 또는 후생유전적 변이 및/또는 SLC6A4의 감소된 발현 또는 기능 (SLC6A4 결핍)을 일으키는 유전적 또는 후생유전적 변이의 존재에 대해 분석하는 것을 포함한다.
진단 방법은 추가로 또는 별법으로 대상체의 생물학적 샘플을 증가된 순환 세로토닌에 대해 분석하는 것을 포함한다. ELISA 분석 및 유사한 면역흡착 분석이 순환 세로토닌 수준을 분석하기 위해 사용될 수 있다. ASD와 연관된 세로토닌의 수준은 대조군 (비-ASD) 집단 평균의 ≥ 2 표준 편차 초과이다. 추가로, 순환 세로토닌 수준을 분석하기 위해 HPLC, 질량 분광법 및 단백질체학 어레이가 또한 사용될 수 있다.
진단 방법은 또한 본원에 기재된 치료 방법과 조합될 수 있다. 진단 및 치료 방법의 조합이 치료를 지도하기 위해, 예를 들어 어떠한 대상체가 치료되는지 결정하기 위해 치료에 앞서 진단 방법이 사용될 때 사용될 수 있다. 진단 및 치료 방법의 조합이 치료의 과정 및/또는 질환의 과정 후에, 예를 들어 대상체의 치료의 유효성을 결정하기 위해 치료 동안 또는 치료 후에 진단 방법이 사용될 때 사용될 수 있다. 치료 방법과 조합한 진단 방법의 그러한 적용은 의학 분야에서 통상적으로 실시된다.
진단 방법은 본원에 기재된 바와 같은 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제를 사용한 치료에 대한 대상체의 적합성을 결정하기 위해 치료 전에 수행할 수 있다. 상기 유전적 기초를 갖고 본원에 기재된 치료법에 적용가능한 다른 질병, 상태 및 질환이 있는 대상체가 또한 동일한 방식으로 진단 및 치료될 수 있다. 특히, Pten 유전자 및/또는 Slc6a4 유전자의 표적이거나 5-HT2c 수용체의 하류에 있는 유전자에서 돌연변이 또는 변이가 있는 대상체가 본원에 기재된 치료법에 적용가능하고, 동일한 방식으로 진단 및 치료될 수 있다.
표준 임상 진단 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 대개, 이들 방법은 대상체로부터 샘플 (이는 비제한적으로 조직 샘플, 생검, 유체 샘플 (예를 들어, 혈액, 뇨, 타액, 뇌척수액) 등일 수 있음)을 얻은 후, 샘플을 진단 절차로 처리하는 것을 포함한다. 당업자가 샘플을 분석하기 위해 많은 잘 알려진 방법, 예를 들어 다양한 핵산 검출 및 증폭 방법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응-기반 방법, 및 다양한 단백질 검출 방법, 예를 들어 항체-기반 검출 방법이 이용가능하다. 다른 경우에, 비-침습적 진단을 위해 영상화 기술을 이용하는 것이 가능할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이들 실시예는 본 발명을 추가로 제한하는 것으로 생각되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: Pten 및 세로토닌 수송체에 대한 반수체부족은 협동하여 뇌 크기 및 사회적 행동에 영향을 미친다
물질 및 방법
동물: 사용된 마우스주는 B6.129-Ptentm1Rps (13) (미국 국립암연구소 (National Cancer Institute, 미국 프레데릭)) 및 B6.129-Slc6a4tm1Kpl (23) (타코닉 (Taconic))이었다. 각각의 시설에서, 각각의 동물주를 합치에 도달하도록 10 세대 동안 C57BL/6 배경에 교배시켰다. 본 발명자들은 다음 2가지 교배로부터 상기 연구를 위한 마우스를 생성하였다: Pten+/+; Slc6a4+/+ ("야생형") 및 Pten+/-; Slc6a4+/+ ("Pten 반수체부족") 마우스를 얻기 위해 Pten+/-; Slc6a4+/+ x Pten+/+; Slc6a4+/+ 마우스, 및 Pten+/+; Slc6a4+/- ("Slc6a4 반수체부족") 및 Pten+/-; Slc6a4+/- ("Pten 및 Slc6a4 반수체부족") 마우스를 얻기 위해 Pten+/-; Slc6a4+/+ x Pten+/+; Slc6a4+/- 마우스. 본 발명자들은 상기 방법이 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스에서 배아 및 조기 출생후 치사성의 상승된 비율 때문에 Pten+/- x Slc6a4+/- 교배 전략에 비해 유리함을 발견하였다.
행동 시험은 8주 또는 12주령에 일어났다. 모든 동물을 케이지 당 2-5마리 마우스의 군으로 수용하였고, 유전자형들 사이에서 하우징 내에 차이는 없다. 음식 및 물을 자유롭게 이용가능하게 하고, 동물을 12시간 명/암 사이클로 유지하였다. 모든 행동 시험은 명 사이클의 끝 가까이에 수행하였다. 실험은 동물 실험에 대한 기술 위원회의 매사추세츠주 연구소 (Massachusetts Institute of Technology Committee on Animal Care)에서 승인된 프로토콜에 따르고 NIH 지침에 따라 수행하였다.
사회적 접근: 마우스를 벽이 불투명한 위가 열린 아크릴 상자 (24"L x 12"W x 12"H) 내에 넣었다. 상자를 챔버들 사이에 통로를 제공하는 홀 (hole)이 있는 불투명 아크릴 패널로 3개 (8"L x 12"W)의 챔버로 나누었다. 참조를 위해, 챔버를 좌측에서 우측으로 1, 2, 및 3으로 숫자를 매겼다. 챔버 1에서, 야생형의 익숙하지 않은 성별 및 동물주 매칭된 마우스를 적합한 환기뿐만 아니라 2마리의 마우스 사이에 시각, 촉각 및 후각 접촉을 허용하기 위해 많은 홀이 설치된 투명한 원통형 아크릴 케이지 (4" 직경 x 8"H) 내에 유지하였다. 동일한 케이지를 챔버 3에 넣지만 비워 두었다. 시험실 내의 기구의 배향은 시험에서 추적까지 일관되도록 유지하였다. 본 발명자들은 시험실에 비해 기구의 배향을 무작위화할 경우 결과가 변경되지 않음을 이전에 발견하였다. 시험 전에, 자극 마우스 및 대상체 마우스를 사회적 접근 기구에 개별적으로 3일 동안 매일 5분간 적응시켰다. 시험일에, 마우스를 다시 기구에 5분간 적응시켰다. 이 시간 동안, 대상체 마우스를 챔버 1 또는 3을 향한 편향에 대해 관찰하였고 - 임의의 유전자형에 대해 그러한 편향은 관찰되지 않았다. 이어서, 자극 마우스를 기구에 넣고, 10분 시험의 비디오 기록을 녹화하였다. 생성되는 비디오를 ImageJ 소프트웨어 (http://rsb.info.nih.gov/ij/)로 임포팅함으로써 컴퓨터를 사용하여 스코어링하였고, 여기서 각각의 챔버를 사내에서 쓰여진 스크립트 (script)를 사용하여 관심있는 영역으로서 규정하고, 마우스가 관심있는 각각의 영역 내에 있는 프레임의 수를 정량하였다. 모든 데이타 세트는 정확성을 보장하기 위해 유전자형에 대해 모르는 훈련된 관찰자가 수동 점검하였다.
후각: 프로토콜은 (30, 59)로부터 채택하였다. 각각의 마우스를 홈 케이지와 동일한 깨끗한 플라스틱 케이지에 넣고 5분간 적응시켰다. 10 ㎕의 증류수를 적신 면봉 (swab)을 케이지의 두껑을 통해 10 cm의 높이에서 1분 동안 삽입하였다. 면봉을 총 3회 제시를 위해 새로운 면봉으로 2회 교체한 후, 10 ㎕ 바닐라 추출액 (프런티어 (Frontier, 미국 아이오와주 노르웨이))을 적신 면봉으로 3회 1분 제시하였다. 바닐라의 제시 후에, 5 ㎕의 레몬 추출액 (심플리 오개닉 (Simply Organic, 미국 콜로라도주 보울더))을 적신 면봉을 각각 1분 동안 3회 제시하였다. 각각의 면봉 제시에 대해, 면봉에서 3 cm 이내에서 킁킁거리는 빈도 및 지속기간 (초 단위)을 기록하였다.
전펄스 억제: 본 발명자들은 ASR-PRO1 청각적 놀람 반사 시험 기구 (메드 어소시에이츠 (Med Associates, 미국 버몬트주 세인트 올번스))를 사용하였다. 시험 전에, 마우스를 시험실에 1시간 동안 적응시켰다. 마우스를 기구에 2분 동안 적응시킨 후, 시험을 시작하였다. 시험은 3-8초의 간격으로 제공되었다 (무작위화). 시험은 40 ms 놀람 자극 단독 (110 db 화이트 노이즈 (noise)), 또는 더 이른 100 ms의 놀람 자극에 이어 20 ms 화이트 노이즈 전펄스 (이는 배경 (60 bd 화이트 노이즈)보다 8 db, 12 db 또는 16 db 넘음)로 이루어졌다. 각각의 자극 설정에 대해 5회 시험을 놀람 반사 (Startle Reflex) 소프트웨어 (메드 어소시에이츠, 미국 버몬트주 세인트 올번스)을 이용하여 기록하였다.
결과
Pten 및 Slc6a4 사이의 잠재적인 상호작용에 대해 시험하기 위해, 본 발명자들은 먼저 ASD에 관련된 표현형 판독을 확인할 필요가 있었다. ASD에서 보고된 가장 널리 보고된 신경해부학적 이상 중 하나는 대두증이고, 그의 발병률은 성인에서 10-30%이고 발육 동안 60%까지이다 (17). ASD 환자에서 연구는 뇌 크기가 ASD-관련 척도에서 행동 표현형의 심도와 양성 상관관계가 있음을 보여주었다 (18, 19). 마우스 뇌에서 Pten의 조건 낙아웃 (knockout)으로부터의 보고서는 대두증 표현형을 설명하고, 여기서 세포체 (soma) 크기의 증가 및 신경돌기 비대가 아마도 이들 표현형에 기여하는 것 같다 (20-22). 본 발명자들은 Pten 반수체부족 마우스를 이전에 설명된 Slc6a4 기능 상실 대립유전자를 보유하는 동물주에 교배함으로써 Pten 및 Slc6a4 화합 이종접합성 돌연변이체 마우스를 생성하였다 (23). 본 발명자들은 임상 관련성을 최대화하기 위해 생식계열 이종접합성 마우스에 집중하였다. Pten 또는 Slc6a4 반수체부족 마우스가 뇌 과다성장을 보이는지 여부를 검사하기 위해, 체격의 변동을 해명하기 위해 체질량에 대해 표준화된 전체 뇌 질량의 척도를 얻었다. 이들 데이타는 Pten 또는 Slc6a4에 대한 반수체부족이 수컷 및 암컷 모두에서 대두증 표현형을 생성시킴을 보여주었다 (도 1a-c). 더욱이, Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스는 Pten 또는 Slc6a4 반수체부족 마우스에서 보인 것보다 더 중증인 추가의 뇌 과다성장 표현형을 가졌다 (도 1a-c). 성장에 대한 효과의 근본이 되는 세포성 메카니즘은 확인되어야 하지만, 이들 데이타는 Pten 및 Slc6a4가 협동하여 작용하여 ASD에 관련된 표현형, 뇌 과다성장에 영향을 미침을 나타낸다.
상기 결과는 Pten 반수체부족 마우스가 다유전자성 ASD에 관련된 방식으로 Pten과 상호작용하는 제2 부위 유전적 변형인자를 검사하기 위해, 및 환경적 변형의 효과 및 치료 화합물의 효과를 시험하기 위해 유용한 도구일 수 있음을 주장한다. Pten 반수체부족 마우스가 ASD에 관련된 행동 표현형에 대한 표면 타당성을 갖는지 여부를 조사하기 위해, 몇몇 행동 분석을 이용하여 12주령 마우스를 시험하였다. 본 발명자들이 사용한 분석에서는 사회성 (이는 ASD가 있는 개체에서 보이는 코어 진단 결핍을 반영함 (24)) 및 전펄스 억제 (ASD가 있는 개체에서 비정상인 것으로 보고된 감각운동 관문 (sensorimotor gating)의 척도 (25-27))를 시험하였다. 사회적 행동에서 후각 기능의 가능한 교란 인자에 대해 시험하기 위해, Pten 반수체부족 마우스 및 대조군을 후각 습관화-탈습관화 시험에 노출시켰고 이들 마우스가 정상적으로 반응함을 발견하였고 (도 6), 이것은 후각 기능의 총체적 손상이 없음을 나타낸다. 사회적 접근 행동을 측정하기 위해, 마우스가 익숙하지 않은 성별- 및 연령-매칭된 자극 마우스 또는 무생물 사물과 상호작용하는 소모 시간 사이에서 선택해야 하는 기구의 변형을 사용하였다 (28, 29) (도 2a). 두 성별의 야생형 마우스는 사회적 챔버 내의 소모 시간에 대한 유의한 선호를 보인 반면, Pten 반수체부족 암컷 마우스는 이러한 선호를 보이지 않았고, 사회적 및 비-사회적 챔버 내에서 대략 동일한 시간을 소모하였다 (도 2b). 수컷 Pten 반수체부족 마우스는 사회적 접근 행동의 상기 동일한 결핍을 보이지 않았다 (도 2c). Pten 반수체부족 마우스 및 대조군에서 감각운동 관문의 시험에서, 두 성별 모두가 청각적 놀람 반응의 전펄스 억제가 결핍되었음을 발견하였다 (도 2d). Pten 반수체부족 마우스를 사용한 본 발명의 결과는 CNS-특이적 조건 Pten 낙아웃 마우스로부터의 행동 결과와 일반적으로 일치하고 (21), 여기서 동물은 다양한 ASD-관련 표현형에 대해 시험되었다. 수컷에서 사회적 접근에 대한 초기 경향에서 차이가 보였고, 여기서 조건 낙아웃은 결핍을 보여주고 Pten 반수체부족 마우스는 그렇지 않다. 이들 차이는 대부분 아마도 이들 2개의 상보성 모델에서 유전적 조작의 상이한 성질에 기인할 것 같다. 이들 모델에서 상이한 행동 표현형에 대한 신경생물학적 기초를 확인하는 것은 Pten이 ASD에 관련된 신경 회로의 발달에 영향을 미치는 방식에 대한 통찰력을 제공할 것이다.
뇌 크기에서와 같이, Pten+/- 암컷 마우스에서 관찰한 사회적 접근 표현형이 Slc6a4에 대한 반수체부족에 의해 변형될 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 8주령 암컷 야생형, Pten 반수체부족, Slc6a4 반수체부족 및 Pten+/-; Slc6a4+/- 화합 돌연변이체 마우스를 검사하였다. Slc6a4 반수체부족 및 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스는 후각 습관화-탈습관화의 시험에서 정상적으로 반응하였고 (도 6), 이는 이들 마우스에서 후각의 총체적 손상이 없음을 나타낸다. 본 발명자들은 Slc6a4 반수체부족 마우스가 야생형 마우스에 비해 사회적 접근 분석에서 자극 마우스와의 상호작용에 대해 감소된 선호를 보임을 발견하였지만, 이것은 유의성에 대한 역치 아래에 있지 않았다. 그러나, Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스는 자극 마우스와의 상호작용에 대해 유의한 선호를 보이지 않았다 (도 3a). 사회적 접근-회피 스코어를 이용하여 이들 데이타를 분석하면 (28) (사회적 챔버 1 내의 시간 - 비-사회적 챔버 3 내의 시간), 자극 마우스와 상호작용하며 소모한 시간이 야생형, Pten 반수체부족, 또는 Slc6a4 반수체부족 마우스에서보다 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스에서 유의하게 더 적음을 발견하였다 (도 3b). 상기 결과는 Pten 및 Slc6a4에 대한 반수체부족이 상가적으로 작용하여 ASD-관련 행동 표현형, 사회적 접근에 영향을 미친다는 것과 일치한다.
Pten+/- 수컷 마우스에서 추가의 사회적 접근을 검사하기 위해, 8주령 수컷 야생형, Pten 반수체부족, Slc6a4 반수체부족 및 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스를 사회적 접근 및 인지 행동에 대해 시험하였다. 이를 위해, 정상적인 초기 사회적 조사 행동을 보이지만 30분 후 재-노출 시에 동일한 사회적 표적을 인지하지 못하는 옥시토신 낙아웃 마우스에서 사회적 인지를 시험하기 위해 사용된 프로토콜에 본 발명의 3개 챔버 기구를 채택하였다 (30-32). 12주령 수컷 야생형 및 Pten 반수체부족 마우스에 대한 본 발명의 발견과 일치하게 (도 2c), 제1 10-분 시험 (시험 1)에 대해 수컷군에서 임의의 이들 유전자형에서 사회적 상호작용에 대한 선호의 유의한 변화를 관찰할 수 없었다 (도 3c). 시험 2 (5분)에서 동일한 사회적 표적에 재-노출시키면, 야생형 마우스는 대조군 및 자극 마우스-포함 챔버를 조사하는데 동일한 관심을 보였고, 상기 효과는 아마도 습관화 때문인 것 같다 (도 3c). 이와 반대로, Pten 반수체부족, Slc6a4 반수체부족 및 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스는 제1 및 제2 시험 사이에서 사회적 조사에 대한 선호의 약화를 보이지 않았다 (도 3d). 상기 발견은 Pten 및 Slc6a4에 대한 반수체부족이 수컷 마우스에서 사회적 인지를 손상시킬 수 있음을 나타내지만; 사회적 인지 경로 (즉, 옥시토신-바소프레신-도파민)에서 특이적인 결핍 대 사회적 상호작용의 지속된 관심을 분리하기 위해 추가의 시험이 필요할 것이다.
전펄스 억제의 시험에서, Pten 및 Slc6a4 반수체부족 사이의 관계는 상가적이라기보다는 상위 (epistatically) 우성인 것으로 나타났고, 여기서 Pten 반수체부족 및 Pten+/-; Slc6a4+/- 마우스는 각각 야생형에 비해 유의하게 손상되지만, 서로에 비해서는 그렇지 않다 (도 3d). 이것은 Pten 및 Slc6a4 사이의 상호작용이 행동의 근본이 되는 뇌 회로의 발달에 관련하여 일정 정도의 특이성을 가질 수 있음을 제안한다. 본 발명자들은 Pten 및 Slc6a4의 협동 기능이 뇌 크기 대조군에 대해 그러한 것처럼 사회적 행동에 관여된 회로의 조립 및 기능을 위해 특히 중요하지만, 다른 ASD-관련 행동, 예를 들어 감각운동 관문에 관여된 회로에 대해 반드시 그렇지는 않은 것으로 예상한다.
이어서, 사회적 접근 표현형이 유전자형 전체에서 및 각각의 유전자형 내에서 뇌 크기에 관련되는지 여부를 검토하였다. 집단 평균을 분석하여 유전자형 전체에서 뇌 크기 (체질량에 비해) 및 사회적 접근-회피 스코어 사이의 음성 상관성을 밝혔다 (도 4a). 놀랍게도, 각각의 유전자형 내의 개별적인 대상체의 분석은 각각의 군 내의 상기 척도들 사이에서 유의한 양성 상관성을 보여주었고, 여기서 가능하게는 보다 가변성을 보여준 Slc6a4 반수체부족 마우스는 제외된다 (도 4b 내지 e). 이것은 Pten 및 Slc6a4에 대한 반수체부족이 뇌 크기의 증가와 함께 사회성의 감소를 일으킴을 나타낸다. 그러나, 각각의 유전자형 내에서, 군내 인자가 뇌 크기의 증가와 함께 사회성의 증가를 매개하는 것으로 보인다.
그에 의해 세로토닌 신호전달 (Slc6a4 포함) 및 PI3K 경로 (Pten 포함)이 상호작용하여 뇌 발달에 영향을 미칠 수 있는 메카니즘을 도 7에 예시한다. 하나의 가능성은 Pten 및 세로토닌 수용체가 조절 방식으로 물리적으로 상호작용하여 뇌 발달에 영향을 미칠 수 있는 것이다. 뉴런에서, Pten은 5-HT2c 수용체에 결합하고, 그의 포스파타제 활성을 통해, 상기 수용체의 효능제-유도된 활성화를 제한하고, 복측 피개 (ventral tegmental) 영역에서 도파민성 뉴런의 흥분율 (firing rate)을 조정한다 (10). 본 발명자들은 암컷 Pten 반수체부족 마우스에서 사회적 접근 행동에 대한 5-HT2c 수용체의 특이적 길항제, SB 242084 (33)의 효과의 예비 시험을 수행하였고, 상기 약물이 사회적 접근 행동의 결핍을 상쇄할 수 있음을 발견하였다 (도 5). 자폐 증상을 경감시키는 것으로서 보고된 3가지 약물 (비전형적 항정신병약 리스페리돈 (34) 및 올란자핀 (35), 및 항우울제 플루옥세틴 (36))은 모두 세로토닌 및 도파민 경로의 다른 구성원을 표적화하는 잘 알려진 효과에 추가로 5-HT2c 수용체에 대해 길항 효과를 가짐을 아는 것은 흥미롭다. 본원에 보고된 발견에 기초하여, 본 발명자들은 5-HT2c 수용체의 길항작용이 자폐에서 이들 약물의 작용에 관련될 수 있음을 제안한다.
논의
뇌 구조 및 기능에 관하여, 본 발명자들은 두 성별의 Pten 반수체부족 마우스가 뇌 과다성장을 갖고, 암컷은 사회적 접근 행동이 결핍됨을 발견하였다. 본 발명자들은 이들 표현형이 Slc6a4 반수체부족과 상가적 방식으로 변형될 수 있음을 발견하였다. 이들 발견은 자폐가 남성 대 여성에서 약 4:1의 비율로 이환된다는 사실에 기초하여 놀라운 것이다. 현재, 본 발명자들은 Pten 반수체부족 마우스에서 사회적 행동에서 성별의 차별적인 효과가 보이는 이유를 모른다. 본 발명자들이 사용한 사회적 접근 분석은 ASD에 관련될 수 있는 설치류에서 사회적 행동의 한 측면만을 포착한다는 점을 강조하는 것이 중요하다. 이들 마우스에서 사회적 손상의 정도 및 성질을 충분히 특성 결정하기 위해 행동의 추가의 시험, 예를 들어 초음파 발성 또는 사회적 보상이 필요할 것이고; 그러한 시험은 수컷 Pten 반수체부족 마우스에서 결핍을 또한 밝힐 수 있음이 가능하다. 그러나, 본 발명의 분석에서 이들 성별 차이에 대한 하나의 흥미로운 가능한 단서는 면역계 기능이상, 특히 자가면역 및 ASD 사이의 연계에 대한 증거의 보고에 기인한다 (19, 37, 38). 사후 연구에서는 또한 ASD에서 신경염증에 대한 몇몇 마커의 발현 증가를 보여주었다 (39). 중요하게는, Pten+/- 마우스는 자가면역을 포함한 면역계 이상을 갖고, 이들 효과는 수컷 마우스에 비해 암컷 마우스에서 보다 현저하다 (40). 이것은 Pten 반수체부족 마우스가 신경 발달에 대한 성별 및 면역계 기능이상의 영향을 연구하기 위해 유용한 모델일 것임을 주장한다.
본 발명자들은 세로토닌 수용체 5-HT2cR의 조정이 ASD에 대한 잠재적인 치료 표적임을 제안한다. SB 24208에 추가로, 리스페리돈 (34), 올란자핀 (35) 및 플루옥세틴 (36)보다 더 큰 특이성으로 5-HT2cR을 길항하는 작용을 하는 몇몇 다른 약물이 개발되었고; 본 발명자들은 이들이 또한 ASD에 대한 치료제로서 유용할 수 있음을 예측한다. 상기 약물의 예는 FR 260010 (41) 및 RS 102221 (42)을 포함한다. 세로토닌 수용체 5-HT2cR에 대한 작용에 추가로, PI3K/Akt 경로가 세로토닌 신호전달에 의해 직접 조정되는 것이 또한 가능하다. 배양된 설치류 해마 뉴런에서, 5-HT1A 수용체 효능제의 첨가는 Akt를 활성화시킬 수 있고, 상기 활성화는 PI3K의 약물학적 억제를 통해 차단될 수 있다 (43). 5-HT1A 수용체는 배발생 중기에서 이르게 뇌에서 발현되고 (44), 이는 상기 수용체의 변경된 활성이 심지어 형태형성의 조기 기간으로부터 뇌 발달의 과정을 변형할 수 있음을 제안한다. 5-HT1B 수용체의 자극은 또한 Akt를 활성화할 수 있다 (45). 상기 수용체가 발생하는 신생피질에서 유도 신호에 대해 축삭 반응을 조정하고 (46), 상기 수용체에 대해 작용하는 과잉의 세로토닌이 Slc6a4 낙아웃 마우스에서 특이적인 세포구조 이상의 원인이라 (47)는 증거가 존재한다. 두 메카니즘는 형태형성, 성장 및 뉴런 기능에 영향을 미칠 수 있는 분자, 예를 들어 mTOR, GSK-3베타, Creb 및 NF-카파-B에서 수렴할 수 있다. 흥미롭게도, 세로토닌성 자극은 마우스 뇌에서 Ser 9에서 인산화된 GSK-3베타의 수준을 증가시키고 (48), 세로토닌 결핍은 그를 감소시킨다 (49). Akt를 통한 Pten에 의한 Ser 9에서 GSK-3베타의 조절은 뉴런 극성을 확립하고 유지하는데 관여되고 (50), 포스포-GSK-3베타의 수준은 Pten이 CNS에서 조건적으로 낙아웃된 마우스의 뇌에서 상승된 것으로 보고되었다 (21). 상기 모델을 입증하기 위해 추가의 실험이 필요할 것이지만, 세로토닌 및 Pten-PI3K 경로가 수렴하는 분자는 ASD가 있는 개체의 하위세트에 대한 유용한 생체마커 및 치료 표적인 것으로 입증될 수 있다.
본 발명의 데이타는 또한 본 연구에서 검사된 유전자형 전체에서 뇌 크기 및 사회성 사이에 음성 상관성이 존재함을 제안한다. 그러나, 주어진 유전자형 군 내의 개별 동물 수준에서, 본 발명자들은 뇌 크기 및 사회성 사이에 유의한 양성 상관성을 발견하였다. 본 발명자들은 상기 발견을 사회성에 관하여, 뇌 크기를 변화시키는 유익하고 유해한 방식이 존재함을 나타내는 것으로서 해석한다. 본 발명자들은 Pten 및 Slc6a4에 대한 반수체부족이 상가적으로 뇌 크기의 상호관련된 증가 및 감소된 사회성을 일으킴을 확인하였다. 아마도 그에 2차적으로 작용하고, 가능하게는 신경 가소성 (plasticity)에 대한 환경적 효과를 반영하여, 본 발명자들은 특이적 경로가 사회성에 관하여 유익한 방식으로 뇌 크기에 영향을 미치는 것으로 예상한다. 자폐에서, 임상 데이타는 머리 둘레 및 사회성 사이에 음성 상관성을 나타내지만 (18, 19), 수많은 연구로부터, 영장류 및 다른 동물에서 뇌 크기 및 사회적 복잡성 사이에 양성 상관성이 존재한다는 증거가 존재한다 ((51)에서 검토됨). 구분되는 생물학적 경로가 뇌 크기에 영향을 미치고 사회성에 관하여 차별적인 성과에 이르는 가능성은 상기 역설의 설명을 도울 수 있다. 본 발명자들은 이들 경로가 종 내에서 및 종 전체에서 사회적 행동의 변화에 대한 진화 기질로서 작용을 할 수 있는 것으로 가설을 세웠다.
본 발명의 결과는 또한 전체 뇌 크기가 세로토닌 및 PI3K 경로와의 상호작용에 대해 스크리닝하기 위한 편리한 표현형 판독으로서 역할을 할 수 있음을 주장한다. 장래의 작업은 본원에 보고된 해부학적 및 행동 표현형의 근본이 되는 메카니즘, 및 유전적, 환경적 및 약물학적 조작이 상기 표현형에 영향을 미치는 방식을 특성 결정하는 것을 목표로 할 것이다. ASD 병태생리학의 제안된 메카니즘, 예를 들어 전두엽 피질에서 증가된 흥분/억제 비 (52) 및 변경된 국소 대 장거리 연결도 (53)가 상기 모델에서 명백한지 여부를 검사하는 것은 흥미로울 것이다. 드 노보 (de novo) 게놈 카피수 변이의 상승된 비율이 ASD에서 관찰되었다 (54). Pten은 게놈 안정성의 유지에 일정 역할을 하고 Pten 상실은 이중 가닥 DNA 파괴의 축적을 일으킨다 (55, 56)는 사실에 기초하여, PTEN 반수체부족의 배경이, 일어날 2차 변형 사건, 예를 들어 ASD에 관련된 유전자에서 카피수 변이의 확률을 증가시킬 수 있는 것이 가능하다. 환경적 변형인자에 관련하여, 폴리염화 비페닐 (PCB)는 신생피질 발달을 파괴할 수 있는 유기 화합물의 클래스이고, ASD 병인에서 유전적 감수성과 상호작용하기 위한 후보이다 (57). PCB, PCB77이 PI3K 경로를 통해 NF-카파-B 활성 및 산화질소 신호전달을 변경시킨다는 실험적인 증거가 존재하고, 상기 효과는 PI3K를 억제함으로써 상쇄될 수 있다 (58). PI3K 신호전달의 음성 조절자로서 PTEN의 역할에 기초하여, 본 발명자들은 PTEN에 대한 반수체부족이 PI3K 경로에 대해 영향을 미치는 환경 독소, 예를 들어 PCB에의 노출에 반응하여 ASD 감수성에 대한 유전적 위험 인자일 수 있다는 가설을 세웠다.
참고문헌
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사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 면에서 사용되고, 그러한 용어 및 표현이 도시되거나 설명된 특징 및 그의 일부의 임의의 동등물을 배제하는 의도는 없고, 여기서 다양한 변형은 본 발명의 범위 내에서 가능한 것으로 인정된다.
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Claims (54)

  1. 자폐 스펙트럼 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제인 하나 이상의 치료 분자를 투여하는 것을 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애의 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 대상체를 치료하기 위해 효과적인 양의 (1) 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt, mTOR, Creb 및/또는 NF-카파 B의 길항제 또는 억제제, 및/또는 (2) GSK-3베타의 활성화제의 효능제인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 5-HT2c 수용체의 길항제 또는 억제제가 투여되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 5-HT2c 수용체의 길항제 또는 억제제가 뇌 내로 통과할 수 있는 길항제 또는 억제제인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 5-HT2c 수용체의 길항제 또는 억제제가 SB242084인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 투여된 SB 242084의 용량이 약 0.1-1 mg/kg/일인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 투여된 SB 242084의 용량이 약 1-10 mg/kg/일인 방법.
  8. 제5항에 있어서, SB 242084가 약 0.1-10 mg/kg의 용량에서 간헐적으로 투여되는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 비전형적 항정신병 의약, 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (SSRI) 또는 PPAR-감마 효능제로서 시판되지 않는 (본원의 출원일 현재) 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 리스페리돈, 올란자핀, 지프라시돈, 플루옥세틴 또는 티아졸리딘디온이 아닌 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, PI3K의 길항제 또는 억제제가 투여되는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, PI3K의 길항제 또는 억제제가 뇌 내로 통과할 수 있는 길항제 또는 억제제인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, PI3K의 길항제 또는 억제제가 수니티닙 (수텐트 (SUTENT)®)인 방법.
  14. 제1항에 있어서, Akt의 길항제 또는 억제제가 투여되는 것인 방법.
  15. 제14항에 있어서, Akt의 길항제 또는 억제제가 뇌 내로 통과할 수 있는 길항제 또는 억제제인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, Akt의 길항제 또는 억제제가 클로자핀 또는 넬피나비르 (비라셉트 (VIRACEPT))인 방법.
  17. 제1항에 있어서, mTOR의 길항제 또는 억제제가 투여되는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, mTOR의 길항제 또는 억제제가 뇌 내로 통과할 수 있는 길항제 또는 억제제인 방법.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, mTOR의 길항제 또는 억제제가 라파마이신 (시롤리무스)인 방법.
  20. 제1항에 있어서, Creb의 길항제 또는 억제제가 투여되는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, NF-카파 B의 길항제 또는 억제제가 투여되는 것인 방법.
  22. 제1항에 있어서, GSK-3베타의 활성화제의 효능제가 투여되는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 경구, 정맥내, 근육내, 비내, 복강내, 피하, 또는 경막내 투여되는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 자폐 스펙트럼 장애의 진단 후에 투여되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 자폐 스펙트럼 장애의 진단 전에 예방 목적으로 투여되는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제를 사용한 치료를 필요로 하는 증상이 없는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체를 PTEN 결핍 및/또는 SLC6A4 결핍 및/또는 증가된 순환 세로토닌에 대해 시험하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가, PTEN 결핍 및/또는 SLC6A4 결핍 및/또는 증가된 순환 세로토닌이 시험에 의해 검출되는 경우에만 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체를 대두증 (뇌 과다성장) 및/또는 사회적 행동의 결핍, 예를 들어 사회적 상호작용의 결핍 및/또는 사회적 기억의 결핍에 대해 시험하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가, 대두증 및/또는 사회적 행동의 결핍이 시험에 의해 검출되는 경우에만 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 자폐 스펙트럼 장애에 대한 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 제2 치료제 및 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제가 대상체를 치료하기 위해 효과적인 조합된 양으로 투여되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 제2 치료제가 리스페리돈, 올란자핀, 지프라시돈, 플루옥세틴 또는 PPAR-감마 효능제인 방법.
  34. 자폐 스펙트럼 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 5-HT2c 수용체, 포스포이노시톨-3 키나제 (PI3K), Akt, mTOR, Creb 및/또는 NF-카파 B의 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자, 및/또는 GSK-3베타의 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자를 대상체를 치료하기 위한 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 자폐 스펙트럼 장애의 치료 방법.
  35. 제34항에 있어서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자가 RNA 간섭을 유도하는 하나 이상의 분자인 방법.
  36. 제35항에 있어서, RNA 간섭을 유도하는 하나 이상의 분자가 하나 이상의 짧은 간섭 핵산 (siNA)인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 하나 이상의 siNA 분자가 짧은 간섭 RNA (siRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), 마이크로-RNA (miRNA), 및 짧은 헤어핀 (hairpin) RNA (shRNA) 분자인 방법.
  38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자가 경구, 정맥내, 근육내, 비내, 복강내, 피하, 또는 경막내 투여되는 것인 방법.
  40. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자가 자폐 스펙트럼 장애의 진단 후에 투여되는 것인 방법.
  41. 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자가 자폐 스펙트럼 장애의 진단 전에 예방 목적으로 투여되는 것인 방법.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자를 사용한 치료를 필요로 하는 증상이 없는 것인 방법.
  43. 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체를 PTEN 결핍 및/또는 SLC6A4 결핍 및/또는 증가된 순환 세로토닌에 대해 시험하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자가, PTEN 결핍 및/또는 SLC6A4 결핍 및/또는 증가된 순환 세로토닌이 시험에 의해 검출되는 경우에만 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  45. 제34항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체를 대두증 (뇌 과다성장) 및/또는 감소된 사회성 (사회적 접근 행동의 결핍)에 대해 시험하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자가, 대두증 및/또는 감소된 사회성이 시험에 의해 검출되는 경우에만 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  47. 제34항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 자폐 스펙트럼 장애에 대한 제2 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하고, 여기서 제2 치료제 및 발현을 감소시키는 하나 이상의 분자 및/또는 발현을 증가시키는 하나 이상의 분자가 대상체를 치료하기 위해 효과적인 조합된 양으로 투여되는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 제2 치료제가 5-HT2c 수용체 신호전달 경로의 길항제 또는 억제제인 방법.
  49. 제47항에 있어서, 제2 치료제가 리스페리돈, 올란자핀, 지프라시돈, 플루옥세틴 또는 PPAR-감마 효능제인 방법.
  50. 대상체로부터의 생물학적 샘플을 자폐 스펙트럼 장애에 대한 하나 이상의 생체마커의 존재에 대해 분석하는 것을 포함하고, 여기서 하나 이상의 생체마커는 (1) Pten 유전자 및/또는 Slc6a4 유전자에서 하나 이상의 돌연변이 또는 후생유전적 변이의 존재, 및/또는 (2) 정상 범위의 순환 세로토닌 수준에 비해 증가된 순환 세로토닌 수준이고, 여기서 자폐 스펙트럼 장애에 대한 하나 이상의 생체마커의 존재는 대상체가 증가된 머리 크기 (둘레) 및/또는 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애를 가진 것을 나타내는 것인, 증가된 머리 크기 (둘레) 및/또는 사회적 행동의 결핍을 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애의 진단 방법.
  51. 제50항에 있어서, Pten 유전자 및/또는 Slc6a4 유전자에서 하나 이상의 돌연변이 또는 후생유전적 변이가 PTEN의 감소된 발현 또는 기능 및/또는 SLC6A4의 감소된 발현 또는 기능을 일으키는 것인 방법.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 자폐 스펙트럼 장애에 관하여 대상체의 상태를 나타내는 보고서 (report)를 작성하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 샘플의 분석을 대상체에게 의료 관리를 제공하는 임상의에게 제공하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  54. 제50항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 사회적 행동의 결핍이 사회적 상호작용의 결핍 및/또는 사회적 기억의 결핍인 방법.
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