KR20160037169A - 레트 증후군 및 그를 위한 치료 - Google Patents

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KR20160037169A
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데이비드 슈이어
모니카 제이. 저스티스
Original Assignee
레트 신드롬 리서치 트러스트
베이롤 칼리지 오브 메드신
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Abstract

본 발명은 유용한 치료 방식의 확인 및/또는 특징 규명을 위한, 및/또는 특정 요법에 대하여 반응할 가능성이 더 많거나, 또는 더 적은 환자를 확인하는 레트 증후군 환자의 계층화를 위한 것을 포함하는, 레트 증후군 및 다른 MECP2-관련 장애 치료를 위한 새로운 전략법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 대사 경로, 및 특히, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로, 가장 특히, 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로의 특정 성분을 잠재적인 레트 증후군 치료제의 확인 및/또는 특징 규명에 유용한 표적으로서 정의한다. 다른 것들 중에서도 특히, 본 발명은 상기 작용제를, 하나 이상의 상기 대사 경로 성분을 포함하는 시스템과 접촉시키고, 그가 하나 이상의 지표 (예컨대, 관련 경로(들)의 성분, 생성물, 및/또는 마커)의 존재, 수준, 활성, 및/또는 형태에 미치는 영향을 평가함으로써 상기 작용제를 확인하고/거나, 특징 규명하기 위한 시스템을 제공한다.

Description

레트 증후군 및 그를 위한 치료 {ＲＥＴＴ SYNDROME AND TREATMENTS THEREFORE}
레트 증후군 (RTT)은 운동 및 신경계 기능장애의 점진적 발생을 특징으로 하는 X 연관 장애이다. RTT에 걸린 소녀는 출생 후 정상적인 시간표대로 언어 및 운동 기술을 습득하지만, 6개월째부터 2세 사이에 증상이 발생하게 된다. 질환의 신경계 징후로는 언어 및 운동 기능 상실, 손의 상동적 움직임, 보행 곤란, 산발적 빠른 호흡 및 발작을 포함한다. RTT의 유병률은 높으며 (10,000명 출생당 1명), 이는 여성에서의 지적 발달 장애 (IDD)의 가장 일반적인 원인 중 하나이다. 수명 및 질환 중증도는 매우 다양하다.
RTT 환자 중 95% 초과의 환자는 MECP2 유전자에 돌연변이를 보유한다. 기전적으로, MECP2는 메틸화된 DNA에 결합하여 억제 또는 활성화를 통해 유전자 전사를 조절한다. MECP2가 유전자 전사를 억제시킬 때, 이는 I형 히스톤 데아세틸라제 (HDAC)를 함유하는 크로마틴-리모델링 복합체와 회합한다 (Bienvenu and Chelly Nat Rev Genet 7: 415-426 2006). 그러므로, MECP2를 제거하면 정상적으로는 억제되는 유전자가 상향조절될 수 있다. 특히, 적어도 부분적으로는 이형접합성인 여성에서 X-염색체 불활성화의 바람직한 패턴에 기인하여 MECP2 돌연변이의 심각도가 항상 질환의 중증도와 상관관계에 있는 것은 아니다.
Mecp2 돌연변이를 보유하고, 대부분의 RTT 증상을 반복하는 마우스 모델이 이용가능하다. Mecp2/Y 수컷 돌연변이체 마우스는 출생 및 이유기때에는 정상이지만, 빠르면 4주령째에 활동 저하, 뒷다리를 움켜잡는 행동, 떨림, 운동 장애 및 이상 호흡을 포함하는 증상이 발생하게 된다. 상기 증상은 점진적으로 악화되어 6 - 16주째에 상기 마우스는 사망하게 된다. Mecp2/Y 널(null) 마우스에서 성숙기로의 이행 지연, 시냅스전 단백질 발현 변경, 및 수상돌기 가시의 밀도 감소를 포함하는, 현저한 뉴런 결핍이 관찰된다.
놀랍게도, 돌연변이체 수컷 및 암컷 마우스에서 증상 발생 후 Mecp2의 재발현은 신경계 결손을 구조하고, 마우스는 정상적인 운동을 회복하여 장수하게 된다 (Guy et al. Science 315: 1143-1147, 2007). 이러한 결과는 RTT가 배발생 동안 뉴런의 영구적인 비정상적 발생에 의해 유발되는 것이 아니며; 대신, 출생 이후 뉴런 유지를 위해서는 MECP2가 필요하다는 것을 보여준다. 그러므로, RTT는 증상 발생 후 유전적 또는 약리학적 수단에 의해 호전될 수 있거나, 또는 심지어는 역전될 수 있으며, 이는 환자 및 가족에게 엄청난 희망을 준다. 불행하게도, 뇌 기능은 MECP2의 수준에 정교하게 민감하기 때문에 MECP2를 사용하는 유전자 요법은 도전과제가 된다: MECP2 증가는 진행성 신경계 장애를 유발하여 이 역시 사망하게 만든다 (Bienvenu and Chelly Nat Rev Genet 7: 415-426 2006). 레트 증후군에 대한 새로운 치료법의 확인 및 개발이 여전히 중요하게 요구되고 있다.
본 발명은 유용한 치료 방식의 확인 및/또는 특징 규명을 위한, 및/또는 특정 요법에 대하여 반응할 가능성이 더 많거나, 또는 더 적은 환자를 확인하는 레트 증후군 환자의 계층화를 위한 것을 포함하는, 레트 증후군 치료를 위한 새로운 전략법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대사 경로, 및 특히, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로, 가장 특히, 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로의 특정 성분을 잠재적인 레트 증후군 치료제의 확인 및/또는 특징 규명(characterization)에 유용한 표적으로서 정의한다. 다른 것들 중에서도 특히, 본 발명은 상기 작용제를, 하나 이상의 상기 대사 경로 성분을 포함하는 시스템과 접촉시키고, 그가 하나 이상의 지표 (예컨대, 관련 경로(들)의 성분, 생성물, 및/또는 마커)의 존재, 수준, 활성, 및/또는 형태에 미치는 영향을 평가함으로써 상기 작용제를 확인하고/거나, 특징 규명하기 위한 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제공하는 시스템은 완전한 및/또는 활성 대사 경로 (예컨대, 지질 또는 콜레스테롤 생합성 경로)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 스쿠알렌 모노옥시게나제를 포함하거나, 또는 생성한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 24S-히드록시콜레스테롤 (24S-OHC)을 포함하거나, 또는 생성한다. 일부 실시양태에서, 24C-OHC는 예를 들어, 대사 경로 활성의 지표로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 24C-OHC는 대상체로부터의 샘플 (예컨대, 조직 샘플, 예컨대, 혈액 샘플) 중에서 (예컨대, 그의 존재, 수준, 활성, 및/또는 형태를 측정함으로써) 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 제공하는 확인 및/또는 특징 규명 시스템은 하나 이상의 세포, 조직, 및/또는 유기체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 마우스 세포, 조직, 및/또는 유기체이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 (예컨대, 유전자 돌연변이 및/또는 화학적 변경의 결과로서) 감소된 MECP2 발현 및/또는 활성을 보이는 하나 이상의 마우스 세포, 조직, 및/또는 유기체이거나, 또는 그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 레트 증후군 치료를 위한 방법 및/또는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제공하는 방법 및/또는 조성물은 MECP2 기능 또는 활성을 조절하는 하나 이상의 작용제 (즉, MECP2 조절제)를 포함하거나, 또는 그를 이용한다. 일부 실시양태에서, 제공하는 방법 및/또는 조성물은 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로, 및 특히, 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 경로를 조절하는 하나 이상의 작용제를 포함하거나, 또는 그를 이용한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증 치료를 필요로 하는 대상체에게 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사를 조절하는 1종 이상의 작용제 또는 방식을 투여하는 단계를 포함하는, MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 작용제 또는 방식은 스타틴, LXR 조절제, 글루코스 대사 조절제, SREBP 조절제, PPARG 조절제, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
일부 특정 실시양태에서, 본 발명은 레트 증후군을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 스타틴을 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 레트 증후군을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 글루코스 대사 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 투여되는 작용제 또는 방식 (예컨대, 스타틴 또는 글루코스 대사 조절제)을 1일 1회 이상으로 투여함으로써 MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증 (예컨대, 레트 증후군)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 작용제 또는 방식 (예컨대, 스타틴 또는 글루코스 대사 조절제)은 주 1회 이상으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 작용제 또는 방식 (예컨대, 스타틴 또는 글루코스 대사 조절제)은 주 2회 이상으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 작용제 또는 방식 (예컨대, 스타틴 또는 글루코스 대사 조절제)은 피하로, 복강내로, 정맥내로, 또는 경구적으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 스타틴은 로바스타틴, 심바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 프라바스타틴, 피타바스타틴, 및 플루바스타틴 중 1 이상의 것이거나, 또는 그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 LXR 조절제는 옥시스테롤, LXR 효능제, RXR 효능제, 및 그의 조합 중 1 이상의 것이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, LXR 조절제는 히포콜라미드, T0901317, GW3965, SR9238, 22(R)-히드록시콜레스테롤, 24(S)-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 콜레스텐산, 벡사로텐, 및 그의 조합 중 1 이상의 것이거나, 또는 그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 글루코스 대사 조절제는 비구아니드 약물, 2,4-디니트로페놀-메틸 에테르 (DNP-ME), 2,4-디니트로페놀-에틸 에테르 (DNP-EE), 2,4-디니트로페놀-비닐 에테르 (DNP-VE), 및 그의 조합 중 1 이상의 것이거나, 또는 그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 비구아니드 약물은 메트포르민, 프로구아닐, 클로르프로구아닐, 및 그의 조합 중 1 이상의 것이거나, 또는 그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 SREBP 조절제는 파토스타틴, N-(4-(2-(2-프로필피리딘-4-일)티아졸-4-일)페닐)메탄술폰아미드 (FGH10019), SREBP1, SREBP2, 및 그의 조합 중 1 이상의 것이거나, 또는 그를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 PPARG 조절제는 티아졸리딘디온이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 티아졸리딘디온은 로시글리타존, 피오글리타존, 트로글리타존, 네토글리타존, 리보글리타존, 시글리타존, 및 그의 조합 중 1 이상의 것이거나, 또는 그를 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명은 레트 증후군 치료에 유용한 치료제를 확인하고/거나, 특징 규명하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 후보 치료제가 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면에 미치는 효과(들)를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 실시와 관련된 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 측면은 콜레스테롤 생합성일 수 있거나, 또는 그를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면은 3-히드록시-3-메틸-글루타릴-CoA 리덕타제 (HMGCR) 억제이다. 일부 실시양태에서, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면은 스쿠알렌 에폭시다제 (SQLE)로도 알려져 있는 스쿠알렌 모노옥시게나제 억제이다. 일부 실시양태에서, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면은 24S-OHC 생성이다.
일부 실시양태에서, 작용제가 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면에 미치는 효과(들)는 행동 검사, 인지 검사, 운동 기능 검사, 하나 이상의 생리학적 파라미터에 대한 검사, 및 그의 조합 중 하나 이상의 것을 통해 평가된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 유용한 행동 검사는 청각 놀람 반응 검사, 놀람 반응의 선행 자극 억제 검사, 오픈 필드 활동 검사, 3 챔버 사회적 상호작용 검사, 홈 케이지 활동(Home Cage Activity) 검사, 및/또는 그의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 유용한 운동 기능 검사는 호흡 유발 검사, 로타로드 검사, 오픈 필드 보행 활동 검사, 디기게이트(DigiGait) 시스템 (마우스 스페서픽스(Mouse Specifics)) 및 그의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 유용한 하나 이상의 생리학적 파라미터에 대한 검사는 이중 X선 흡광 분석법 (DEXA) 검사, 메타콜린 유발을 이용한 전신 체적 변동 기록법 호흡 검사, 글루코스 부하 검사, 인슐린 부하 검사, 혈청 콜레스테롤 검사, 열량 측정 검사, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 특징, 목적, 및 이점은 하기의 상세한 설명에서 자명해진다. 그러나, 상세한 설명은 본 발명의 실시양태를 제시하지만, 제한하는 것이 아니라, 단지 예시하는 것임을 이해하여야 한다. 본 발명의 범주 내의 다양한 변형 및 수정은 상세한 설명으로부터 통상의 기술자에게 자명해질 것이다.
정의
본 개시내용을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해 특정 용어를 하기에 정의한다. 하기 용어 및 다른 용어에 대한 추가의 정의, 또는 그에 대한 설명은 본 명세서 전역에 걸쳐 기술될 수 있다.
본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 바, "포함하다(comprise)"라는 용어 및 예컨대, "포함하는" 및 "포함하다(comprises)"라는 상기 용어의 파생어는 열거된 항목, 요소, 또는 단계가 포함되고, 다른 것들 또한 포함될 수 있는 상황에서 사용된다. 본 출원에서 사용되는 바, "약" 및 "대략"이라는 용어는 동의 어구로서 사용된다. "약" 또는 "대략"이 앞에 오는지 여부와는 상관 없이, 본 출원에서 사용되는 임의의 수치들은 달리 명시되지 않는 한, 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 임의의 정상적인 변동 (예컨대, 표준 오차 또는 편차)을 포함하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "약" 또는 "대략"이라는 용어는 달리 언급되지 않는 한, 또는 문맥을 통해 명백해지지 않는 한 (단, 상기 수치가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 예외로 한다), 언급된 참조 값의 어느 방향으로든 (상기 값보다더 크거나, 또는 더 작게) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만 이내에 포함되는 값의 범위를 의미한다.
투여 : 본원에서 사용되는 바, "투여"라는 용어는 대상체에게 조성물/작용제를 투여하는 것을 의미한다. 투여는 임의의 적절한 경로에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 투여는 기관지 (기관지 점적 주입에 의한 것 포함), 협측, 장관, 진피간, 동맥내, 진피내, 위내, 골수내, 근육내, 비내, 복강내, 경막내, 정맥내, 심실내, 점막, 비강, 경구, 직장, 피하, 설하, 국부, 기관 (기관내 점적 주입에 의한 것 포함), 경피, 질 및 유리체 투여일 수 있다.
동물 : 본원에서 사용되는 바, "동물"이라는 용어는 동물계의 임의의 구성원을 의미한다. 일부 실시양태에서, "동물"이란 임의 발생 단계의 인간을 의미한다. 일부 실시양태에서, "동물"이란 임의 발생 단계의 비인간 동물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 비인간 동물은 포유동물 (예컨대, 설치류, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류, 및/또는 돼지)이다. 일부 실시양태에서, 동물을 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 및/또는 곤충류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 동물은 트랜스제닉 동물, 유전적으로 조작된 동물, 및/또는 클론일 수 있다.
항체 : 본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 특정 표적 항원에의 특이적인 결합을 부여하는 데 충분한 정규 면역글로불린 서열 요소를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 자연상에서 생성된 것과 같은 무손상 항체는 서로 회합하여 통상 "Y자형" 구조로 지칭되는 것을 이루는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 (각각 약 50 kD씩) 및 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드 (각각 약 25 kD씩)로 구성된 대략 150 kD 사량체 작용제이다. 각 중쇄는 4개 이상의 도메인 (각각의 길이는 약 110개의 아미노산 길이) - 아미노 말단 가변 (VH) 도메인 (Y 구조의 선단에 위치), 이어지는 3개의 불변 도메인: CH1, CH2, 및 카르복시 말단 CH3 (Y의 줄기의 맨 아래 부분에 위치)으로 구성된다. "스위치"로 알려져 있는 짧은 영역이 중쇄 가변 및 불변 영역을 연결한다. "힌지"는 CH2 및 CH3 도메인을 항체 나머지 부분에 연결한다. 무손상 항체에서 이 힌지 영역 중의 두 이황화 결합이 두 중쇄 폴리펩티드를 서로에 연결한다. 각 경쇄는 또 다른 "스위치"에 의해 서로 이격되어 있는, 2개의 도메인 - 아미노 말단 가변 (VL) 도메인, 이어지는 카르복시 말단 불변 (CL) 도메인으로 구성된다. 무손상 항체 사량체는 중쇄 및 경쇄가 단일의 이황화 결합에 의해 서로 연결되어 있는 2개의 중쇄-경쇄 이량체로 구성되고; 2개의 다른 이황화 결합은 중쇄 힌지 영역을 서로 연결하고, 이로써, 이량체가 서로 연결되어 사량체가 형성된다. 자연적으로 생성된 항체는 또한 전형적으로는 CH2 도메인 상에서 글리코실화된다. 천연 항체 중의 각 도메인은 압착된 역평행 베타 베럴로 서로에 대하여 패킹된 두 베타 시트 (예컨대, 3-, 4-, 또는 5-가닥 시트)로부터 형성된 "면역글로불린 폴드"를 특징으로 하는 구조를 가진다. 각 가변 도메인은 "상보성 결정 영역"으로 알려져 있는 3개의 초가변 루프 (CDR1, CDR2, 및 CDR3) 및 다수 불변성인 4개의 "프레임워크" 영역 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)을 함유한다. 천연 항체가 폴딩되면, FR 영역은 도메인에 구조적 프레임워크를 제공하는 베타 시트를 형성하고, 중쇄 및 경쇄로부터의 CDR 루프 영역은 함께 3차원 공간으로 결합하여 Y 구조의 선단에 위치하는 단일의 초가변 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 폴리펩티드 쇄 중의 아미노산 서열 비교를 통해 2개의 경쇄 (κ 및 λ) 부류, 수개의 중쇄 (예컨대, μ, γ, α, ε, δ) 부류, 및 특정 중쇄의 서브부류 (α1, α2, γ1, γ2, γ3, 및 γ4)로 정의된다. 항체 부류 (IgA [IgA1, IgA2 포함], IgD, IgE, IgG [IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 포함], IgM)는 사용되는 중쇄 서열의 부류에 기초하여 정의된다. 본 발명의 목적을 위해, 특정 실시양태에서, 천연 항체에서 발견되는 것과 같이 충분한 면역글로불린 도메인 서열을 포함하는 임의의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체는 상기 폴리펩티드가 천연적으로 생성되었건 (예컨대, 항원에 대해 반응하는 유기체에 의해 생성되었건), 또는 재조합 조작, 화학적 합성, 또는 다른 인공 시스템 또는 방법에 의해 제조되었건 간에, "항체"로 지칭되고/거나, 그러한 것으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일클론성이다; 일부 실시양태에서, 항체는 다중클론성이다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스, 토끼, 영장류, 또는 인간 항체의 특징이 되는 불변 영역 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 항체 서열 요소는 관련 기술분야에 공지되어 있는 바와 같이, 인간화, 영장류화, 키메라 등인 것이다. 또한, 본원에서 사용되는 바, "항체"라는 용어는 (달리 언급되지 않는 한, 또는 문맥으로부터 명백해지지 않는 한) 적절한 실시양태에서 대안적 제시로 항체 구조 및 기능적 특징을 포착하기 위한 관련 기술분야에 공지된 또는 개발된 구축물 또는 포맷 중 임의의 것을 의미할 수 있는 것을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 용어는 이중 또는 다른 다중 특이성 (예컨대, 지바디 등) 항체, 스몰 모듈라 이뮤노파마슈티칼즈(Small Modular ImmunoPharmaceuticals: "SMIPs™"), 단일 쇄 항체, 카멜로이드 항체, 및/또는 항체 단편을 의미할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 천연적으로 제조된다면 가질 수도 있는 공유 변형 (예컨대, 글리칸 부착)을 포함하지 않을 수도 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 공유 변형 (예컨대, 글리칸 부착, 페이로드 [예컨대, 검출가능한 모이어티, 치료학적 모이어티, 촉매성 모이어티 등], 또는 다른 펜던트 기 [예컨대, 폴리-에틸렌 글리콜 등])을 함유할 수 있다.
항체 단편 : 본원에서 사용되는 바, "항체 단편"은 무손상 항체의 일부분, 예컨대, 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편; 트리아바디; 테트라바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체 중에 포함된 CDR 함유 모이어티를 포함한다. 통상의 기술자는 "항체 단편"이라는 용어가 임의의 특정 생성 모드를 암시하지 않으며, 그로 한정되는 것이 아니라는 것을 이해할 것이다. 항체 단편은 무손상 항체 절단, 화학적 합성, 재조합 제조 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의의 적절한 방법을 사용함으로써 제조될 수 있다.
~와 관련된 : 본원에서 본 용어가 사용되는 바와 같이, 한 이벤트 또는 엔티티의 존재, 수준 및/또는 형태가 나머지 다른 하나의 것과 상관관계가 있다면, 이 두 이벤트 또는 엔티티는 서로 "관련된" 것이다. 예를 들어, 특정 엔티티 (예컨대, 폴리펩티드)는 그의 존재, 수준 및/또는 형태가 (예컨대, 관련 집단 간에) 질환, 장애, 또는 병증의 발병률 및/또는 그에 대한 감수성과 상관관계가 있다면, 특정 질환, 장애, 또는 병증과 관련된 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 엔티티가 직접 또는 간접적으로 상호작용하여 서로 물리적으로 인접하게 있고, 그대로 유지된다면, 서로 물리적으로 "회합되어" 있는 것이다. 일부 실시양태에서, 서로 물리적으로 회합되어 있는 2개 이상의 엔티티는 서로 공유적으로 연결되어 있는 것이고; 일부 실시양태에서, 서로 물리적으로 회합되어 있는 2개 이상의 엔티티는 서로 공유적으로 연결되어 있지는 않지만, 예를 들어, 수소 결합, 반데르 발스 상호작용, 소수성 상호작용, 자성, 및 그의 조합에 의해 비공유적으로 회합되어 있는 것이다.
생체적합성 : 본원에서 사용되는 바, "생체적합성"이라는 용어는 물질이 예컨대, 생체내에서 살아있는 조직과 접촉하도록 놓여졌을 때, 상기 조직에 유의적인 해를 끼치지 않는다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 물질이 세포에 독성이 아닐 경우, 이는 "생체적합성"인 것이다. 특정 실시양태에서, 시험관내에서 물질을 세포에 첨가하였을 때, 20% 이하로 세포를 사멸시키고/거나, 생체내에서 물질을 투여하였을 때, 유의적인 염증 또는 다른 상기와 같은 유해 효과를 유도하지 않는 다면, 이는 "생체적합성"인 것이다.
생체분해성 : 본원에서 사용되는 바, "생체분해성"이라는 용어는 물질이 세포 내로 도입되었을 때, 세포에 대해 유의적인 독성 효과를 일으키지 않으면서, 세포가 재사용하거나, 또는 처리할 수 있는 성분으로 (예컨대, 세포 기구에 의해, 예컨대, 효소적 분해에 의해, 가수분해에 의해 및/또는 그의 조합에 의해) 분해된다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 생체분해성 물질의 분해에 의해 생성된 성분은 생체적합성이고, 따라서, 생체내에서 유의적인 염증 및/또는 다른 유해 효과를 유도하지 않는다. 일부 실시양태에서, 생체분해성 중합체 물질은 그의 단량체로 분해된다. 일부 실시양태에서, 생체분해성 물질 (예를 들어, 생체분해성 중합체 물질 포함)의 분해는 에스테르 결합의 가수분해를 포함한다. 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 생체분해성 물질 (예를 들어, 생체분해성 중합체 물질 포함)의 분해는 우레탄 결합의 절단을 포함한다. 예시적인 생체분해성 중합체로는 예를 들어, 히드록시산, 예컨대, 락트산 및 글리콜산의 중합체 (폴리(히드록실산), 폴리(락트산) (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA), 폴리(락트산-코-글리콜산) (PLGA)을 포함하나, 이에 한정되지 않음), 및 PEG와의 공중합체, 폴리안히드라이드, 폴리(오르토)에스테르, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리(부티르산), 폴리(발레산), 폴리(카프로락톤), 폴리(히드록시알카노에이트, 폴리(락티드-코-카프로락톤), 그의 블렌드 및 공중합체를 포함한다. 예를 들어, 단백질, 예컨대, 알부민, 콜라겐, 젤라틴 및 프롤라민, 예를 들어, 제인, 및 다당류, 예컨대, 알기네이트, 셀룰로스 유도체 및 폴리히드록시알카노에이트, 예를 들어, 폴리히드록시부티레이트 블렌드 및 그의 공중합체를 비롯한, 다수의 천연적으로 발생된 중합체 또한 생체분해성이다. 통상의 기술자는 상기 중합체가 (예컨대, 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 단지 특정 화학 기의 치환 또는 부가에서만 차이가 나는, 실질적으로 동일한 구조에 의해서 모체 중합체와 관련이 있는) 그의 생체적합성이고/거나, 생체분해성인 유도체인 때를 이해하거나, 결정할 수 있다.
생물학적으로 활성 : 본원에서 사용되는 바, "생물학적으로 활성"이라는 어구는 물질이 생물계에서 (예컨대, 세포에서 (예컨대, 단리된, 배양물 중에서, 조직 중에서, 유기체 중에서), 세포 배양물 중에서, 조직 중에서, 유기체 중에서 등) 활성을 가진다는 것을 의미한다. 예를 들어, 유기체에 투여되었을 때, 상기 유기체에 대하여 생물학적 효과를 미치는 물질은 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다. 활성이 존재하기 위해서는 흔히 오직 생물학적으로 활성인 물질의 일부 또는 단편만이 요구되고 (예컨대, 필요하며 충분하고); 상기와 같은 환경에서는 상기 일부 또는 단편이 "생물학적으로 활성인" 일부 또는 단편으로 간주된다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
조합 요법 : 본원에서 사용되는 바, "조합 요법"이라는 용어는 대상체가 동시에 2종 이상의 치료제에 노출되는 상황을 의미한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 동시에 투여되고; 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 순차적으로 투여되고; 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 중복 요법으로 투여된다.
필적하는 :　 본원에서 사용되는 바, "필적하는"이라는 용어는 2개 이상의 작용제, 엔티티, 상황, 조건 세트 등이 서로 동일하지 않을 수도 있지만, 그 사이에 비교를 허용할 정도로 충분히 유사하며, 이로써, 관찰되는 차이점 또는 유사점에 기초하여 합리적인 결론을 도출해낼 수 있다는 것을 의미한다. 통상의 기술자는 맥락상 임의의 주어진 환경하에서 2개 이상의 상기 작용제, 엔티티, 상황, 조건 세트 등이 필적하는 것으로 간주되기 위해서는 어느 정도의 동일성이 요구된다는 것을 이해할 것이다.
~ 에 상응하는 :　 본원에서 사용되는 바, "~에 상응하는"이라는 용어는 대개 중합체 중의 잔기, 예컨대, 폴리펩티드 중의 아미노산 잔기 또는 핵산 중 뉴클레오티드 잔기의 위치/동일성을 나타내는 데 사용된다. 간소화 목적으로, 상기 중합체 중의 잔기는 대개 관련된 참조 중합체에 기초한 정규 번호매김 체계를 사용하여 표시되며, 이로써, 참조 중합체 중 190번 위치의 잔기에 상응하는 제1 중합체 중의 잔기는 예를 들어, 실제로 제1 중합체에서 190번째 잔기일 필요는 없고, 대신 참조 중합체에서 190번째의 위치에서 발견되는 잔기에 상응하는 것임을 통상의 기술자는 이해할 것이며; 구체적으로 중합체 서열 비교를 위해 디자인된 하나 이상의 상업적으로 이용가능한 알고리즘을 사용하는 것을 비롯한, "상응하는" 아미노산을 확인하는 방법을 통상의 기술자는 쉽게 이해할 것이다.
유도체 : 본원에서 사용되는 바, "유도체"라는 용어는 참조 물질의 구조적 유사체를 의미한다. 즉, "유도체"는 예를 들어, 코어 또는 컨센서스 구조를 공유하면서, 참조 물질과 유의적인 구조적 유사성을 보이지만, 이는 또한 특정의 별개의 방식으로는 차이를 보이는 물질이다. 일부 실시양태에서, 유도체는 화학적 조작에 의해서 참조 물질로부터 생성될 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, 유도체는 참조 물질을 생성하는 것과 실질적으로 유사한 (예컨대, 그의 복수 개의 단계를 공유하는) 합성 공정을 수행함으로써 생성될 수 있는 물질이다.
투여 형태 : 본원에서 사용되는 바, "투여 형태"라는 용어는 대상체에게 투여하기 위한 치료제의 물리적으로 분리된 개별 단위를 의미한다. 각 단위는 미리 결정된 양의 활성제를 함유한다. 일부 실시양태에서, 상기 양은 관련된 집단에게 투여되었을 때 원하는 또는 유익한 결과와 상관관계가 있는 것으로 측정된 투약 요법에 따라 (즉, 치료학적 투약 요법에 따라) 투여하는 데 적절한 단위 투여량 (또는 그의 전체 분획)이다.
투약 요법 : 본원에서 사용되는 바, "투약 요법"이라는 용어는 (전형적으로 1회분 초과의) 단위 용량 세트를 전형적으로는 일정 시간 간격을 두고 대상체에게 개별적으로 투여하는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 주어진 치료제는 1회 이상의 투약을 포함할 수 있는 권고된 투약 요법을 가진다. 일부 실시양태에서, 투약 요법은, 각각이 동일한 시간 간격을 두고 서로 이격되어 있는 복수의 투약을 포함하고; 일부 실시양태에서, 투약 요법은 복수의 투약 및 개별 투약을 이격시키는 2 이상의 상이한 상이한 시간 간격을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투약 요법은 관련 집단 간에 투여되었을 때 원하는 또는 유익한 결과와 상관관계가 있다 (즉, 치료학적 투약 요법이다).
캡슐화된 : 본원에서 사용되는 바, "캡슐화된"이라는 용어는 물질이 또 다른 물질에 의해 완전하게 둘러싸여 있다는 것을 의미한다.
조작된 : 일반적으로, "조작된"이라는 용어는 인공으로 조작된 측면을 의미한다. 예를 들어, 자연상에서는 해당 순서로 함께 연결되어 있지 않은 2개 이상의 서열이 인공으로 조작되어 조작된 폴리뉴클레오티드 중 서로 직접적으로 연결되어 있을 때, "조작된" 것으로 간주된다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태에서, 조작된 폴리뉴클레오티드는 자연상에서는 제1 코딩 서열과 작동적으로 회합되어 있지만, 제2 코딩 서열과는 작동적으로 회합되어 있지 않은 것으로 관찰되고, 인공적으로 연결됨에 따라 제2 코딩 서열과 작동적으로 회합되어 있는 조절 서열을 포함한다. 유사하게, 세포 또는 유기체가 조작되어 그의 유전 정보가 변경되었다면 (예컨대, 앞서 존재하지 않은 새로운 유전 물질이 예를 들어, 형질전환, 교배, 체성 하이브리드화, 형질감염, 형질도입, 또는 다른 기전에 의해 도입되었거나, 앞서 존재한 유전 물질이 예를 들어, 치환 또는 결실 돌연변이에 의해, 또는 교배 프로토콜에 의해 변경 또는 제거되었다면), "조작된" 것으로 간주된다. 일반적인 관행이자, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 비록 선행 엔티티에 대해 실제 조작이 수행되었을지라도, 조작된 폴리뉴클레오티드 또는 세포의 자손 역시 전형적으로 "조작된" 것으로 지칭된다.
발현 : 본원에서 사용되는 바, 핵산 서열의 "발현"이란 하기 이벤트: (1) (예컨대, 전사에 의한) DNA 서열로부터의 RNA 주형 제조; (2) (예컨대, 스플라이싱, 편집, 5' 캡 형성, 및/또는 3' 단부 형성에 의한) RNA 전사체 프로세싱; (3) RNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역 후 변형 중 하나 이상의 것을 의미한다
단편 : 본원에 기술된 물질 또는 엔티티의 "단편"은 전체의 것의 분리된 일부분은 포함하지만, 전체의 것에서 발견되는 하나 이상의 모이어티는 포함하지 않는 구조를 가진다. 일부 실시양태에서, 단편은 상기 분리된 일부분으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 단편은 전체의 것에서 발견되는 특징적인 구조적 요소 또는 모이어티로 이루어진거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 것과 같은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개, 또는 그 초과의 단량체 단위 (예컨대, 잔기)를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 중합체 단편은 전체 중합체에서 발견되는 것과 같은 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과의 단량체 단위 (예컨대, 잔기)를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 전체 물질 또는 엔티티는 전체의 "모체"로서 지칭될 수 있다.
기능성 : 본원에서 사용되는 바, "기능성"이라는 용어는 특정의 특성 및/또는 활성을 보이는 엔티티의 형태 또는 단편을 의미하는 것으로 사용된다.
상동성 : 본원에서 사용되는 바, "상동성"이라는 용어는 중합체 분자 사이의, 예컨대, 핵산 분자 (예컨대, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 사이의, 및/또는 폴리펩티드 분자 사이의 전반적 관련성을 의미한다. 일부 실시양태에서, 중합체 분자는 그의 서열이 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상 동일할 때, 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 중합체 분자는 그의 서열이 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 이상 유사할 때 (예컨대, 상응하는 위치에 관련된 화학적 특성을 가지는 잔기를 함유할 때) 서로 "상동성"인 것으로 간주된다. 예를 들어, 통상의 기술자에게 주지되어 있는 바와 같이, 특정 아미노산은 전형적으로 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산으로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄를 가지는 것으로서 서로 유사한 것으로 분류된다. 같은 유형의 또 다른 것을 대신하여 한 아미노산으로 치환되는 것 또한 대개는 "상동성" 치환인 것으로 간주될 수 있다. 전형적인 아미노산 분류는 하기에 요약되어 있다:
Figure pct00001
Figure pct00002
통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 상이한 서열에서 어느 서열이 서로 "상응한다"고 간주될 때, 또 다른 서열과 비교하여 한 서열에 지정된 길의 갭을 허용하는 것을 포함하는, 서열의 상동성 정도를 측정하기 위해 서열 비교를 허용하는 다양한 알고리즘이 이용가능하다. 예를 들어, 두 핵산 서열 사이의 상동성(%)을 계산하는 것은 최적의 비교 목적으로 두 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다 (예컨대, 최적으로 정렬되도록 하기 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 그 둘 모두에 갭을 도입할 수 있고, 비상응하는 서열은 비교 목적을 위해 무시할 수 있다). 특정 실시양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열 길이의 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 실질적으로 100%이다. 이어서, 상응하는 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열 중의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오티드에 의해 점유되었을 때, 이때 분자는 상기 위치에서 동일한 것이다; 제1 서열 중의 위치가 제2 서열 중의 상응하는 위치와 유사한 뉴클레오티드에 의해 점유되었을 때, 이때 분자는 상기 위치에서 유사한 것이다. 두 서열 사이의 상동성(%)은 두 서열이 최적으로 정렬될 수 있도록 하기 위해 도입될 필요가 있는, 갭의 개수, 및 각 갭의 길이를 고려한, 서열이 공유하는 동일 및 유사한 위치의 개수에 관한 함수이다. 두 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성(%)을 측정하는 데 유용한 대표적인 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램으로는 예를 들어, PAM120 가중치 잔기 표, 갭 길이 패널티 = 12, 및 갭 패널티 = 4를 사용하는 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)으로 도입된, 메이어스(Meyers) 및 밀러(Miller)의 알고리즘 (CABIOS, 1989, 4: 11-17)을 포함한다. 별법으로, 두 뉴클레오티드 서열 사이의 상동성(%)은 예를 들어, NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 중의 GAP 프로그램을 사용함으로써 측정될 수 있다.
단리된 : 본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 용어는 물질 및/또는 엔티티가 (1) (자연상에서든 및/또는 실험 환경에서든) 초기에 제조되었을 때 그와 회합되어 있던 성분들 중 적어도 일부로부터 분리되고/거나, (2) 인공으로 디자인, 생산, 제조, 및/또는 제작되었다는 것을 의미한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 초기에 그와 회합되어 있던 다른 성분 중 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로부터 분리된 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 작용제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 순수한 것이다. 본원에서 사용되는 바, 물질이 실질적으로 다른 성분을 함유하지 않는다면, 이는 "순수한" 것이다. 일부 실시양태에서, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 물질은 특정의 다른 성분, 예를 들어, 하나 이상의 담체 또는 부형제 (예컨대, 완충제, 용매, 물 등)와 조합된 이후에도 여전히 "단리된" 것 또는 심지어는 "순수한" 것으로 간주될 수 있고; 상기 실시양태에서, 물질의 단리 정도(%) 또는 순도(%)는 상기 담체 또는 부형제를 포함하지 않고 계산된다. 일부 실시양태에서, 단리는 (더욱 긴 폴리펩티드로부터 폴리펩티드 도메인을 단리시키기 위해 및/또는 더욱 긴 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로부터 뉴클레오티드 서열 요소를 단리시키기 위해) 공유 결합의 파괴를 포함하거나, 필요로 한다.
MECP2 조절제 : 본원에서 사용되는 바, "MECP2 조절제"라는 용어는 그의 존재, 수준, 상태 및/또는 형태가 MECP2 수준 및/또는 활성 변경과 상관관계에 있는 작용제를 의미한다. 즉, 관찰된 MECP2 수준 및/또는 활성은 작용제 부재와 비교하였을 때 및/또는 필적하는 참조와 비교하였을 때 작용제의 존재하에서 (또는 작용제가 특정 수준으로 존재할 때, 또는 특정 상태 또는 형태로 존재할 때) 검출가능하게 상이하다.
조절제: 일반적으로, "조절제"라는 용어는 관심 활성이 관찰되는 시스템에서의 그의 존재, 수준, 상태, 및/또는 형태가, 조절제 (또는 그의 관련 수준, 수준, 상태 및/또는 형태)가 존재하지 않을 때 그 외에는 필적하는 조건하에서 관찰되는 것과 비교하였을 때 상기 활성의 수준 및/또는 성질 변화와 상관관계가 있는 것인 엔티티를 의미한다. 일부 실시양태에서, 조절제는 조절제가 존재하지 않을 때 그 외에는 필적하는 조건하의 그의 부재와 비교하여 그의 존재하에서 활성이 증가된다는 점에서 활성제이다. 일부 실시양태에서, 조절제는 그 외에는 필적하는 조건하의 그의 부재와 비교하여 그의 존재하에서 활성이 감소된다는 점에서 억제제이다. 일부 실시양태에서, 조절제는 그의 활성이 관심의 대상이 되는 표적 엔티티와 직접적으로 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 조절제는 그의 활성이 관심의 대상이 되는 표적 엔티티와 간접적으로 (즉, 표적 엔티티와 상호작용하는 중간체와 직접) 상호작용한다. 일부 실시양태에서, 조절제는 관심 표적 엔티티의 수준에 영향을 미치고; 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 조절제는 표적 엔티티의 수준에는 영향을 미치지 않으면서, 관심 표적 엔티티의 활성에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 조절제는 관심 표적 엔티티의 수준 및 활성, 둘 모두에 영향을 미침에 따라, 이에 관찰되는 활성 차이는 관찰되는 수준 차이에 의해 완전하게 설명되지 못하거나, 또는 그에 상응하지 않게 된다. 일부 실시양태에서, 조절제의 활성은 참조와의 비교로 평가되고; 일부 실시양태에서, 상기 참조는 이력 참조일 수 있고/거나, 유형 또는 전자 매체로 구현될 수 있다.
핵산 : 본원에서 사용되는 바, "핵산"이라는 용어는 그의 가장 광범위한 의미로 올리고뉴클레오티드 쇄로 도입되거나, 도입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 의미한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합을 통해 올리고뉴클레오티드 쇄로 도입되거나, 도입될 수 있는 화합물 및/또는 물질을 의미한다. 문맥으로부터 명백해지는 바와 같이, 일부 실시양태에서, "핵산"이란 개별 핵산 잔기 (예컨대, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 의미하고; 일부 실시양태에서, "핵산"이란 개별 핵산 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 쇄를 의미한다. 일부 실시양태에서, "핵산"은 RNA이거나, 또는 그를 포함하고; "핵산"은 DNA이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 천연 핵산 잔기이거나, 그를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 핵산 유사체이거나, 그를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 골격을 이용하지 않는다는 점에서 핵산과 다르다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 핵산은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 골격에 포스포디에스테르 결합 대신 펩티드 결합을 가지며, 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 간주되는 하나 이상의 "펩티드 핵산"이거나, 그를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 별법으로 또는 추가로, 일부 실시양태에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합 대신 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 5'-N-포스포라미다이트 결합을 가진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 천연 뉴클레오시드 (예컨대, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘)이거나, 그를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체 (예컨대, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 메틸화된 염기, 삽입된 염기, 및 그의 조합)이거나, 그를 포함하거나, 또는 그로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 핵산 중의 것과 비교하여 하나 이상의 개질된 당 (예컨대, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 기능성 유전자 생성물, 예컨대, RNA 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 인트론을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산은 천연 공급원으로부터의 단리, (생체내 또는 시험관내에서의) 상보적인 주형에 기초한 중합화에 의한 효소적 합성, 재조합 세포 또는 시스템에서의 재생한, 및 화학적 합성 중 하나 이상의 것에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 핵산의 길이는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000개 또는 그 초과의 잔기 길이다.
환자 : 본원에서 사용되는 바, "환자" 또는 "대상체"라는 용어는 요법이 투여되는 인간 또는 임의의 비인간 동물 (예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 의미한다. 다수의 실시양태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 질환, 장애 또는 병증의 진단 또는 치료를 위한 의료 제공자에게 제시되는 인간이다. 일부 실시양태에서, 환자는 질환, 장애 또는 병증의 하나 이상의 증상 또는 특징을 보인다. 일부 실시양태에서, 환자는 질환, 장애, 또는 병증의 어떤 증상 또는 특징도 보이지 않는다. 일부 실시양태에서, 환자는 질환, 장애, 또는 병증에 걸리기 쉽거나, 또는 그의 위험이 있다는 것을 나타내는 것에 특징적인 하나 이상의 특성을 보이는 인간이다.
제약상 허용되는 : 본원에서 사용되는 바, "제약상 허용되는"이라는 용어는 타당한 의학적 판단의 범주 안에서 과도한 독성, 자극, 알레르기성 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 적당한 이익/위험 비에 맞게, 인간 및/또는 동물 조직과 접촉하여 사용하는 데 적합한 작용제를 의미한다.
폴리펩티드 : 본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"라는 용어는 일반적으로 펩티드 결합에 의해 서로 연결된, 3개 이상의 아미노산으로 이루어진 중합체라는, 관련 기술분야에 알려져 있는 그의 의미를 가진다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 구체적인 기능 부류의 폴리펩티드, 예컨대, 자가항원 폴리펩티드, 니코틴성 아세틸콜린 수용체 폴리펩티드, 동종항원 폴리펩티드 등을 의미하는 것으로 사용된다. 상기의 각 부류에 대하여, 본 명세서는 상기 부류 내의 공지된 예시적인 폴리펩티드의 아미노산 서열의 수개의 일례를 제공하며; 일부 실시양태에서, 상기의 고지된 폴리펩티드는 상기 부류에 대해 참조 폴리펩티드이다. 상기 실시양태에서, "폴리펩티드"라는 용어는 관련된 참조 폴리펩티드와 유의적인 서열 상동성 또는 동일성을 보이는 부류의 임의의 구성원을 의미한다. 다수의 실시양태에서, 상기 구성원은 또한 참조 폴리펩티드와 유의적인 활성을 공유한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 구성원 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 약 30-40% 이상, 및 대개는 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과, 또는 그 초과의 전반적인 서열 상동성 또는 동일성 정도를 보이고/거나, 매우 높은 서열 동일성, 대개는 90% 초과, 또는 심지어는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 서열 동일성을 보이는 1개 이상의 영역 (즉, 보존 영역, 대개는 특징적인 서열 요소를 포함하는 것)을 포함한다. 상기 보존 영역은 일반적으로 3-4개 이상 및 대개는 최대 20개 이상의 아미노산을 포함하며; 일부 실시양태에서, 보존 영역은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15개 또는 그 초과의 연속된 아미노산으로 이루어진 1개 이상의 스트레치를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 유용한 폴리펩티드는 모체 폴리펩티드의 단편을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 유용한 폴리펩티드는, 각각이 같은 모체 폴리펩티드 중 서로에 대하여 관심 폴리펩티드에서 발견되는 것과 다른 공간적 배열로 발견되는 복수 개의 단편 (예컨대, 모체에서 직접적으로 연결되어 있는 단편은 관심 폴리펩티드에서 공간적으로 이격되어 있을 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있고/거나, 단편은 관심 폴리펩티드 중에서 모체와는 다른 순서로 존재할 수 있다)을 포함하거나, 또는 그로 이루어질 수 있으며, 이로써, 관심 폴리펩티드는 그의 모체 폴리펩티드의 유도체이다.
참조 : "참조"라는 용어는 흔히 본원에서 관심 작용제 또는 값의 비교 기준이 되는 표준 또는 대조군 작용제 또는 값을 기술하는 것으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 관심 작용제 또는 값을 시험 또는 측정할 때, 실질적으로 그와 동시에 참조 작용제를 시험하고/거나, 참조 값을 측정한다. 일부 실시양태에서, 참조 작용제 또는 값은 임의적으로 유형 매체로 구현된, 이력 참조이다. 전형적으로, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 참조 작용제 또는 값은 관심 작용제 또는 값을 측정하거나, 특징 규명하는 데 사용되는 것에 필적하는 조건하에서 측정하거나, 특징 규명한다.
샘플 : "샘플"이라는 용어는 수득, 제공, 및/또는 분석되는 부피 또는 질량의 것이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플, 세포 샘플, 체액 샘플 등이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 대상체 (예컨대, 인간 또는 동물 대상체)로부터 채취된다. 일부 실시양태에서, 조직 샘플은 뇌, 모발 (모근 포함), 협측 면봉, 혈액, 타액, 정액, 근육, 또는 임의의 내장 기관으로부터의 것, 또는 상기 중 어느 하나와 관련된 암, 전암성 또는 종양 세포로부터의 것이거나, 또는 그를 포함한다. 체액으로는 뇨, 혈액, 복수, 흉수, 척수액 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 체조직으로는 뇌, 피부, 근육, 자궁 내막, 자궁, 및 자궁경부 조직, 또는 상기 중 어느 하나와 관련된 암, 전암성 또는 종양 세포를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 체조직은 뇌 조직 또는 뇌 종양 또는 암이다. 일부 실시양태에서, "샘플"은 공급원 (예컨대, 대상체)로부터 수득된다는 점에서 이는 "1차 샘플"이고; 일부 실시양태에서, "샘플"은 예를 들어, 잠재적으로 오염성인 특정 성분을 제거하기 위해, 및/또는 특정의 관심 성분을 단리 또는 정제시키기 위해 1차 샘플을 프로세싱한 그의 결과물이라는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
소분자 : 본원에서 사용되는 바, "소분자"라는 용어는 생물학적 프로세스에서 효소 기질 또는 조절인자로서 작용할 수 있는 저분자량 유기 화합물을 의미한다. 일반적으로, "소분자"는 크기가 약 5 킬로달톤 (kD) 미만인 분자이다. 일부 실시양태에서, 제공하는 나노입자는 하나 이상의 소분자를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 소분자는 약 4 kD, 3 kD, 약 2 kD, 또는 약 1 kD 미만이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 약 800 달톤 (D), 약 600 D, 약 500 D, 약 400 D, 약 300 D, 약 200 D, 또는 약 100 D 미만이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 약 2,000 g/mol 미만, 약 1,500 g/mol 미만, 약 1,000 g/mol 미만, 약 800 g/mol 미만, 또는 약 500 g/mol 미만이다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 소분자는 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 실시양태에서, 소분자는 비중합성이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라, 소분자는 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 다당류, 당단백질, 프로테오글리칸 등이 아니다. 일부 실시양태에서, 소분자는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 애주번트이다. 일부 실시양태에서, 소분자는 약물이다.
실질적으로 : 본원에서 사용되는 바, "실질적으로"라는 용어는 관심 특징 또는 특성을 완전한 또는 거의 완전한 규모 또는 정도로 보이는 정질적 상태를 의미한다. 생물학적 및 화학적 현상은 설사 있다해도 드물게 완료되고/거나, 진행되어 완료되거나, 또는 절대적인 결과를 달성하거나, 모면한다는 것을 생물 분야의 통상의 기술자는 이해할 것이다. 그러므로, 본원에서 "실질적으로"라는 용어는 많은 생물학적 및 화학적 현상에 고유한 잠재적인 완전성 결핍을 포착하는 데 사용된다.
~을 앓는 : 질환, 장애, 또는 병증"을 앓는" 개체는 질환, 장애, 또는 병증의 진단을 받았고/거나, 그의 하나 이상의 증상 또는 특징을 보이거나, 또는 보인 개체이다.
~에 걸리기 쉬운 : 질환, 장애, 또는 병증에 "걸리기 쉬운" 개체는 질환, 장애, 또는 병증이 발생할 위험에 있는 개체이다. 일부 실시양태에서, 질환, 장애, 또는 병증에 걸리기 쉬운 개체는 질환, 장애, 또는 병증의 어느 증상도 보이지 않는 개체이다. 일부 실시양태에서, 질환, 장애, 또는 병증에 걸리기 쉬운 개체는 질환, 장애, 및/또는 병증의 진단을 받지 않은 개체이다. 일부 실시양태에서, 질환, 장애, 또는 병증에 걸리기 쉬운 개체는 질환, 장애, 또는 병증 발생과 관련된 병증에 노출된 개체이다. 일부 실시양태에서, 질환, 장애, 및/또는 병증이 발생할 위험은 집단에 기반한 위험이다 (예컨대, 알레르기를 앓는 개체로 이루어진 가족 구성원 등).
증상이 감소된 : 본 발명에 따라, 특정 질환, 장애 또는 병증의 하나 이상의 증상의 크기 (예컨대, 강도, 중증도 등) 및/또는 빈도가 감소되었을 때, "증상이 감소된" 것이다. 명확하게 하기 위해, 특정 증상의 발병 지연은 상기 증상의 빈도를 감소시키는 것의 한 형태로 간주된다.
치료제 : 본원에서 사용되는 바, "치료제"라는 어구는 대상체에게 투여되었을 때, 치료학적 효과를 미치고/거나, 원하는 생물학적 및/또는 약리학적 효과를 유도하는 임의의 작용제를 의미한다. 일부 실시양태에서, 작용제를 투여받는 특정 대상체가 원하는 또는 유익한 치료학적 결과를 경험하였는지 여부와는 상관없이 관련 집단으로의 작용제 투여가 집단 내에서 원하는 또는 유익한 치료학적 결과와 통계학상 상관관계가 있다면, 상기 작용제는 치료제인 것으로 간주된다.
치료학상 유효량 : 본원에서 사용되는 바, "치료학상 유효량"이라는 용어는 치료학적 투약 요법에 따라 질환, 장애, 및/또는 병증을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 집단에게 투여되었을 때, 질환, 장애, 및/또는 병증을 치료하는 데 충분한 양을 의미한다. 일부 실시양태에서, 치료학상 유효량은 질환, 장애, 및/또는 병증의 하나 이상의의 발병 및/또는 중증도를 감소시키고/거나, 그의 발병을 지연시키는 양이다. "치료학상 유효량"이라는 용어는 실제로 특정 개체에서 성공적인 치료가 달성되어야 하는 것을 요하지는 않는다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 그보다는 오히려, 치료학상 유효량은 치료를 필요로 하는 환자에게 투여되었을 때, 상당수의 대상체에서 특정의 원하는 약리학적 반응을 일으키는 양일 수 있다. 특정 대상체는 실제로 "치료학상 유효량"에 대하여 "불응성"일 수 있다는 것도 구체적으로 이해할 수 있을 것이다. 단지 일례를 제공하자면, 불응성 대상체는 임상적 효능을 수득할 수 없을 정도로 낮은 생체이용성을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료학상 유효량이라고 언급하는 것은 하나 이상의 특정 조직 (예컨대, 질환, 장애 또는 병증에 이환된 조직) 또는 체액 (예컨대, 혈액, 타액, 혈청, 땀, 눈물, 뇨 등)에서 측정되는 바와 같은 양을 언급하는 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료학상 유효량은 단일 용량으로 제제화되고/거나, 투여될 수 있다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 치료학상 유효량은 예를 들어, 투약 요법의 일부로서, 복수 개의 용량으로 제제화되고/거나, 투여될 수 있다
치료학적 요법 : 본원에서 사용되는 바, "치료학적 요법"이라는 용어는 관련 집단 간의 투여가 원하는 또는 유익한 치료학적 결과와 상관관계가 있는 것인 투약 요법을 의미한다.
치료 : 본원에서 사용되는 바, "치료" (또는 "치료하다" 또는 "치료하는")라는 용어는 특정 질환, 장애, 및/또는 병증을 부분적으로 또는 완전하게 완화시키고/거나, 호전시키고/거나, 경감시키고/거나, 억제시키고/거나, 그의 발병을 지연시키고/거나, 그의 중증도를 감소시키고/거나, 그의 하나 이상의 증상, 특징 및/또는 원인의 빈도, 발생 또는 중증도를 감소시키는 물질의 임의 투여를 의미한다. 상기 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병증의 징후를 보이지 않는 대상체에 대한 것일 수 있고/거나 (예컨대, 예방적 치료일 수 있고/거나), 오직 질환, 장애, 및/또는 병증의 조기 징후만을 보인 대상체에 대한 것일 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 상기 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병증의 하나 이상의 확립된 징후를 보이는 대상체에 대한 것일 수 있다 (예컨대, 치료학적 치료일 수 있다). 일부 실시양태에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병증을 앓는 것으로 진단을 받은 대상체에 대한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 관련 질환, 장애, 및/또는 병증의 발생 위험의 증가와 통계학적으로 상관관계가 있는 하나 이상의 감수성 인자를 가지는 것으로 공지된 대상체에 대한 것일 수 있다.
적어도 하기 도면으로 구성된 도면은 제한하고자 하는 것이 아니라, 단지 예시 목적의 것이다.
도 1 은 Sqle에서의 정지 코돈 돌연변이가 운동 및 수명 구조(motor and longevity rescue)를 부여한다는 것을 보여주는 것이다. a) Sqle Sum3Jus /+ 돌연변이의 존재에 의해 Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 마우스의 생존이 유의적으로 증가되었다; p=0.002. 129S6/SvEvTac에 대한 역교배 세대 N7에서의 Mecp2 tm1 . 1Bird /Y Sqle Sum3 /+ 동물은 b) P56에서 유의적으로 개선된 로타로드 수행을 보이고 (p=0.0001), c) P70에서 개선된 오픈 필드 활동을 보였다. 추가로, P70에서 선행 자극 억제 검정법이 수행된 129.Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 마우스에서 Sqle Sum3Jus 돌연변이는 d) 놀람 진폭을 증가시키지도, e) 놀람까지의 시간을 단축시키지도 않았다. nostim = 자극 없음; as50 = 50 dB의 자극 존재; pp8 = 8 dB의 선행 자극 존재; pp850 = 8 dB의 선행 자극 후, 이어서, 50 dB의 자극. 모든 오차 막대는 s.e.m.으로 표시되어 있다.
도 2 는 콜레스테롤 대사가 Mecp2 널 수컷 마우스에서 파괴되어 있음을 보여주는 것이다. a) 데스모스테롤을 통한 콜레스테롤 생합성에서 효소 및 생성물을 간략하게 나타낸 개략도가 제시되어 있다. b) Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 및 Mecp2 tm1 . 1Jae /Y에서 Hmgcr, Sqle 및 Cyp46a1의 발현은 뇌에서 유사하였다. c) P56 (N = 군당 8마리) 및 P70 (N = 군당 4마리)에서의 뇌 조직 1 g당 라노스테롤 (Lan), 데스모스테롤 (Des) 및 전체 콜레스테롤 (TC) 농도가 제시되어 있다. d) P56 (야생형 N=4; 널 N=5)에서 Mecp2 tm1 . 1Jae /Y 뇌에서의 콜레스테롤 합성은 감소되었다. e) Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 및 Mecp2 tm1 . 1Jae /Y에서 Hmgcr 및 Sqle의 발현은 간에서 상이하였다. f) P56 (N = 군당 6마리)에서의 간 조직 1 g당 트리글리세리드 (TAG) 및 TC 농도가 제시되어 있다. g) P56 (야생형 N=4; 널 N=5)에서 Mecp2 tm1 . 1Jae /Y 간에서의 조직 1 g당 콜레스테롤 합성은 약간 증가되었다. 혈청 h) 전체 콜레스테롤, i) LDL-콜레스테롤 및 j) 트리글리세리드 수준은 P56 (N = 군당 8-11마리)까지 Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 마우스에서 유의적으로 더 높았지만, Mecp2 tm1 . 1Jae /Y 마우스에서는 변함이 없었다 (N = 군당 6마리). 유전자 발현 데이터의 경우 (b,e) Bird: N = P28에서 1개의 유전자형당 6마리, 및 P56에서 1개의 유전자형당 12마리; Jae: N = P28에서 1개의 유전자형당 4마리, 및 P56에서 1개의 유전자형당 6마리. 조직 데이터 (b-g)는 야생형 수준으로부터의 변화율(%)을 나타낸다. *p≤0.05; 모든 오차 막대는 s.e.m.으로 표시되어 있다.
도 3 은 Mecp2 돌연변이체 마우스에서 대사 증후군이 발생한다는 것을 보여주는 것이다. 제시된 바와 같이, 수컷 및 암컷 Mecp2/Y 및 Mecp2/+ 마우스, 둘 모두 복강내 글루코스 부하 검사 (IPGTT)에서 글루코스를 적절하게 제거하지 못하는 무능력함을 보였고, 인슐린 볼루스 주사 (ITT) 후 인슐린 저항성을 보였다. 이러한 대사 조절 장애는 증상이 진행됨에 따라 악화되었다. 추가로, 수컷은 활동 기간 동안 글루코스보다는 지방을 연소시켰다. 대사 증후군의 모든 징후가 있었다. 따라서, 본 도 3에 제시되어 있는 데이터는 Mecp2 널 마우스에서 대사 증후군이 발생한다는 것을 확립시켜 준다.
도 4 는 스타틴 처리가 129.Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 수컷에서 건강을 개선시킨다는 것을 보여주는 것이다. 하기 검사를 위해 평가된 전체 동물은 Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 플루바스타틴으로 처리된 마우스 37마리, Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 로바스타틴으로 처리된 마우스 12마리, Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 비히클로 처리된 마우스 31마리, 야생형 +/Y 플루바스타틴으로 처리된 마우스 29마리, +/Y 로바스타틴으로 처리된 마우스 8마리, 및 야생형 +/Y 비히클로 처리된 마우스 29마리였다. a) 129.Mecp2 tm1.1Bird /Y의 플루바스타틴 처리가 수명 연장을 부여하였다: 중간값은 87일인 것과 비교하여 122일이고, 120일 이후에는 57%가 생존하였다 (p<0.0001). 활동적이고, 다르게는 건강하지만, 피부염에 기인하여 동물 3마리를 희생시켰다 (박스 표시). b) P56 처리된 널 수컷에서 로타로드 수행은 개선되었고 (플루바스타틴 p=0.015; 로바스타틴 p=0.009), c) 빔 차단에 의해 평가된 바, P70 처리된 널 수컷 오픈 필드 활동은 증가하였다 (플루바스타틴: p=0.026, 로바스타틴: p=0.011). 추가로, 플루바스타틴 처리는 P70에서 선행 자극 억제 검정법이 수행된 129.Mecp2 tm1.1Bird /Y 마우스에서 d) 놀람 진폭을 증가시키지도, e) 놀람까지의 시간을 단축시키지도 않았다. f) 스타틴 처리는 P70까지 혈장 콜레스테롤을 저하시켰다 (플루바스타틴: p=0.001, 로바스타틴: p=0.001). g) 스타틴 처리는 P70에서 129.Mecp2 tm1.1Bird /Y 간 중 상승된 지질 농도를 호전시켰다 (플루바스타틴 p=0.02; 로바스타틴: p=0.386). P70 (N = 군당 4마리; p=0.04)에서 플루바스타틴으로 처리된 129.Mecp2 tm1.1Bird /Y 마우스의 뇌에서 h) 라노스테롤의 농도는 약간 증가하였고, i) 데스모스테롤의 농도는 약간 증가하였다. j)는 스타틴 처리 전후의 지방간의 조직을 보여주는 것이다.
도 5 는 플루바스타틴 처리가 129.Mecp2 tm1 . 1Bird /+ 암컷에서 건강을 개선시킨다는 것을 보여주는 것이다. a) 플루바스타틴으로 처리된 129.Mecp2 tm1 . 1Bird /+ 암컷은 8개월 전에 사망하지 않았지만, 비히클로 처리된 암컷 3마리는 사망하였다. b) 로타로드 수행은 플루바스타틴으로 처리된, 5개월된 129.Mecp2 tm1 . 1Bird /+ 암컷에서 개선되었다 (p=0.001). c) 4개월째 평가된 오픈 필드 활동에 있어서 플루바스타틴 처리군 또는 비히클 처리군 사이에는 어떤 유의적인 차이도 나타나지 않았다. d) 플루바스타틴 처리는 8개월째 혈청 콜레스테롤 수준을 유의적으로 변화시키지 못했다. e) 플루바스타틴 처리는 8개월째 평가된 129.Mecp 2tm1 . 1Bird /+ 간에서 상승된 지질 농도를 호전시켰고 (p=0.045), f)는 스타틴 처리 전후의 간의 오일 레드 O 조직을 보여주는 것이다.
도 6 은 저스티스 라보라토리(Justice laboratory)에서 개발된 Mecp2 수컷 마우스에 대한 표준 약물 처리 프로토콜을 위한 예시적인 타임라인을 보여주는 것이다. 제시된 바와 같이, 암컷은 매주 1X로 투약받고, 검사는 연령에 기초하여 오프셋하였다. 그러나, 검사는 동일하였다. 암컷을 위한 타임라인은 6주째 시작하여 8개월째 종료되었고, 로타로드는 8주째 수행하고, 오픈 필드 활동 (OFA), 청각 놀람 반응의 선행 자극 억제 (PPI), 체적 변동 기록법 (Pleth), 체조성에 대한 DEXA는 5개월째 수행하였고, 부검을 수행하였고, 모든 임상 지질 패널 및 조직 지질은 6개월째 부검시 평가하였다.
도 7 은 친지성이 다른 4종의 상이한 스타틴 약물을 사용하여 마우스를 처리하였을 ?의 예시적인 그래프를 보여주는 것이다. 로타로드 및 오픈 필드 활동 (OFA)은 운동 수행의 척도이다 (각각 패널 b 및 c). 이중 X선 흡광 분석법 (DEXA)은 체지방 및 골 조성에 대한 검사이다 (패널 e). 마우스에 3 mg/kg 플루바스타틴, 2 mg/kg (체중)의 아토르바스타틴, 1.5 mg/kg 로바스타틴, 또는 6 mg/kg 심바스타틴인 용량으로 주당 2X로 투여하고, 도 6에 제시된 행동 검사 프로토콜을 수행하였다. 각 군당 검사된 마우스의 마리수는 관련 막대 아래에 표시되어 있다. 스타틴 처리 중 어느 것도 야생형의 임의 과제에 대한 수행을 변화시키지 못하였는 바, 검은색 점선 표시는 야생형 평균을 나타낸다. 처리군을 관련 대조군과 비교함으로써 ANOVA에 이어서, 던넷 사후검정(Dunnett PostHoc)을 사용하여 데이터를 분석하였다. * p≤0.05, # p≤0.10.
도 8 은 Mecp2 널 마우스가 말초 기관에서 글루코스를 이용할 수 없다는 것을 나타내는 예시적인 그래프이다. 8주령째에 Mecp2 널 및 야생형 한배 새끼에 대하여 고인슐린혈증-정상혈당 클램프를 수행하였다. Mecp2 널 수컷은 정상혈당을 유지시키기 위하여 유의적으로 더 느린 글루코스 주입 속도를 요구하였고 (패널 a에 제시), 이는 글루코스를 대사시키지 못하는 무능력함을 시사하는 것이다. 백색 지방 조직 (WAT) 및 가자미근에서의 14C 글루코스 측정을 통해 주요 글루코스 소비 말초 기관에서는 글루코스 흡수가 감소되었다는 것을 확인할 수 있었다 (각각 패널 B 및 C에 제시).
도 9 는 Mecp2/Y 마우스를 LXR 효능제 및 메트포르민으로 처리한 이후를 나타내는 예시적인 그래프를 보여주는 것이다. 각 군당 검사된 마우스의 마리수는 관련 막대 아래에 표시되어 있다. 스타틴 처리 중 어느 것도 야생형의 임의 과제에 대한 수행을 변화시키지 못하였는 바, 검은색 점선 표시는 야생형 평균을 나타낸다. 마우스를 주당 2X로 30 mg/kg 용량의 메트포르민 및 3 mg/kg 용량의 LXR 효능제 T0901917로 처리하고, 도 6의 프로토콜에 따라 분석하였다. 처리군을 관련 대조군과 비교함으로써 ANOVA에 이어서, 던넷 사후검정을 사용하여 데이터를 분석하였다. * p≤0.05, # p≤0.10.
도 10 은 Mecp2/Y 마우스를 글루코스 대사 조절제인 2,4-디니트로페놀-메틸 에테르 (DNPME)로 처리한 이후를 나타내는 예시적인 그래프를 보여주는 것이다. 마우스를 주당 2X로 5 mg/kg 용량으로 처리하고, 도 6의 프로토콜에 따라 분석하였다. 야생형 N = 4, Mecp2/Y N = 6이고, 비히클 대조군 널 마우스 1마리가 P70 이전에 사망하였다. 처리군을 관련 대조군과 비교함으로써 ANOVA에 이어서, 본페로니 사후검정(Bonferroni PostHoc)을 사용하여 데이터를 분석하였다. * p≤0.05, # p≤0.10.
MECP2 -관련 질환, 장애, 및 병증 (예컨대, 레트 증후군)
본 발명은 MECP2 활성 파괴와 관련된 질환, 장애, 및 병증 치료에 관한 것이다. MECP2 돌연변이는 각종 질환, 장애, 및 병증과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용의 교시는 그의 증상이 하나 이상의 MECP2 변경과 (예컨대, MECP2 단백질의 수준, 활성, 또는 형태의 변경과 및/또는 MECP2 유전자의 하나 이상의 특정 돌연변이와) 관련이 있고/거나, 상관관계가 있는 임의의 질환, 장애 또는 병증에 적용가능하다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다.
레트 증후군 사례의 95%가 하나 이상의 MECP2 돌연변이와 관련이 있다는 것을 유념하면서, 본 개시내용의 교시가 특히 레트 증후군 (RTT)에 적용가능하다는 것을 통상의 기술자는 이해할 것이다. 레트 증후군은 소녀 10,000명당 대략 1명이 걸리는 X 연관 장애이다. 환자는 4 단계를 거치게 된다: 단계 I) 출생으로부터 겉보기상으로는 정상적인 발달 기간 이후, 소아는 6개월 내지 18개월 사이에, 다른 자폐 범주성 장애에서 관찰되는 것과 유사한, 사회성 및 의사소통 부족을 보이기 시작한다. 소아는 그의 발달 이정표에서, 특히, 운동 능력, 예컨대, 앉기 및 기기에서 지연을 보인다. 단계 II) 1세 내지 4세를 시작으로, 소아는 상동적 중심선 손 움직임 및 보행 장애 발생과 함께 언어 및 운동 능력을 상실하는 퇴행기를 겪게 된다. 무호흡 및 과호흡을 비롯한, 불규칙한 호흡 또한 이 단계에서 발생한다. 이 단계에서 자폐 증상도 여전히 나타난다. 단계 III) 2세 내지 10세 사이에, 퇴행기가 끝나고, 증상은 플래토에 이른다. 사회성 및 의사소통 기술은 이 플래토 기간 동안 약간의 개선을 보일 수 있으며, 이는 환자 인생 대부분의 기간 동안 지속될 수 있다. 단계 IV) 운동 능력 및 근육 기능 악화가 계속된다. 다수의 소녀들에서 중증의 척추 측만증이 발생하고, 보행 능력을 상실하게 된다. 고전적 레트 증후군은 MECP2 돌연변이에 의해 유발되는 단일 유전자성이다.
절단형 또는 기능 상실형 MECP2 돌연변이를 가진 반접합성 인간 남성은 RTT를 앓는 여성보다 더욱 중증의 표현형을 보이며, 보통은 2세일 때 사망하게 된다. MECP2가 관여하는 저차형 돌연변이 또는 중복 또한 다양한 지적 장애 ID, 자폐증, 및 다른 정신과적 특징과 관련이 있다.
추가로, MECP2가 콜레스테롤 대사에 관여한다는 점을 고려해 볼 때, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 지질 및/또는 콜레스테롤 생합성과 관련된 하나 이상의 대사 경로의 다른 성분이 본원에 기술된 바와 같은 대사 조절제로 치료가능한 MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증인 것으로 간주될 수 있음을 교시한다. 콜레스테롤 대사는 신경계 질환, 예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병 뿐만 아니라, 근위축성 측삭 경화증 및 취약 X 증후군에 연루되어 있다. 또한, 일부 실시양태에서, 특히 레트 증후군 중 하나 또는 그 둘 모두와 관련된 증후군-관련 자폐증을 비롯한, 특정 형태의 자폐증은 본원에 기술된 바와 같은 MECP2-관련 질환, 장애 또는 병증으로 간주될 수 있다. 자폐증은 그의 가장 광범위한 의미에서 단일 요법에 대해서는 반응하지 않는 복잡한 병인을 가진, 유전적으로 다양한 장애 군이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 상기 중 임의의 것 또는 그들 모두의 치료, 및/또는 요법의 확인, 특징 규명, 및/또는 용도, 및/또는 그를 위한 바이오마커를 기술한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증 치료를 필요로 하는 대상체에게 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사를 조절하는 1종 이상의 작용제 또는 방식을 투여하는 단계를 포함하는, MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 작용제 또는 방식은 스타틴, LXR 조절제, 글루코스 대사 조절제, SREBP 조절제, PPARG 조절제, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
대사 경로
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 특정 대사 경로 (예컨대, 지질 및/또는 콜레스테롤 생합성 경로)의 조절제가 레트 증후군 치료에서 유용할 수 있으며, 상기 경로의 하나 이상의 성분을 포함하는 시스템이 상기 조절제의 확인 및/또는 특징 규명에서 유용할 수 있다는 인식을 포함한다. 본 발명은 또한 일부 경우에서, 본원에 기술된 바와 같이 대사 경로의 하나 이상의 특징의 활성 또는 특질에 기초하여 개별 레트 증후군 환자를 서로 구별해내는 데 유용할 수 있다는 통찰력을 제공한다. 본 발명의 교시는 특히 뇌 및/또는 간에서의 콜레스테롤 및/또는 지질 생합성에 관여하는 대사 경로 및/또는 다른 전신성 대사 성분에 관련하는 것이다.
콜레스테롤은 뇌에서 반-비의존적 경로를 통해 합성이 되는 것인 뇌의 주요 성분으로서, 이는 식이성 흡수 또는 간 합성에 의해서는 공급될 수 없기 때문에 스쿠알렌 에폭시다제 (SQLE) 및 라노스테롤 신타제 (LSS)에 의한 스쿠알렌에서 라노스테롤로의 전환을 통해 동일의 것이 된다 (Dietchy, Turley and Spady J Lipid Res 34:1637-1659, 1993) (도 2a). 일반적으로, 혈중의 높은 순환 콜레스테롤에 관심이 기울여 지고 있는데, 그 이유는 심혈관 질환의 발병률 증가와 관련이 있기 때문이다. 그러나, 콜레스테롤은 막 수송, 신호 전달, 미엘린 형성, 수상돌기 리모델링, 신경펩티드 형성 및 시냅스생성을 비롯한, 신경 조직에서 많은 기능을 한다 (Pfrieger and Ungerer, Prog Lipid Res 50: 357-371, 2011). 뇌 콜레스테롤 대사의 조절 장애는, 과량으로 존재할 때, 정상적인 발생을 파괴하고, 헌팅턴병 및 알츠하이머병을 비롯한 노화 질환에 영향을 미치는 콜레스테롤 단백질 중간체를 축적시킬 수 있다 (Waterham, FEBS Lett 580: 5442-5449, 2006).
심혈관 질환에서의 콜레스테롤의 역할 때문에, HMG CoA 리덕타제 억제제 (스타틴)는 의학상 콜레스테롤 수준이 정상 수준보다 높은 경우에, 또는 콜레스테롤 수준이 상승하여 유해 효과를 일으키는 경우에 처방된다. 콜레스테롤의 정상 수준은 일반적으로는 HMG CoA 리덕타제 억제제의 치료학적 사용을 정당화하지 않는 수준이다. 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 정확한 "정상" 수준은 어느 정도는 대상체, 및 연령, 성별, 섭식 및 집단 유형과 관련하여 관찰되는 콜레스테롤 수준 변동에 의존할 수 있다. 일반적으로, 콜레스테롤 수준은 대상체가 급성 질환을 앓지 않고, 스트레스를 받지 않을 때, 및 임신 상태가 아닌 여성에 대해 측정된다.
다수의 실시양태에서, 본원에서 사용되는 바, 콜레스테롤 수준은 고밀도 지질단백질 (HDL), 중간 밀도 지질단백질 (IDL), 저밀도 지질단백질 (LDL) 및 초저밀도 지질단백질 (VLDL) 형태로 혈청 중에서 관찰되는 복합 콜레스테롤을 포함하는, 총 혈청 콜레스테롤 수준을 나타낸다. 콜레스테롤 수준은 보통 지질의 저장 형태인 트리글리세리드 또는 트리아실글리세롤과 함께 공동으로 측정된다. 콜레스테롤 수준은 복합 지질단백질 분획 중 총 콜레스테롤의 양에 기초할 수 있다. 혈청 중에서 발견되는 콜레스테롤 및 트리글리세리드는 다양한 성분: HDL, IDL, LDL, 및 VLDL로 분별된다. LDL 분획은 VLDL로부터 유도되고, 총 혈청 콜레스테롤 및 LDL 분획 중 콜레스테롤 (c-LDL)의 수준 상승은 죽상동맥경화증의 위험 증가와 상관관계가 있다.
성인 인간의 경우, 예시적인 정상 혈청 콜레스테롤 수준은 약 140 mg/dL 내지 200 mg/dL 미만인 범위이며, 다양한 인자, 예컨대, 대상체의 연령, 섭식 및 성별에 따라 대상체가 건강한 것으로 간주되는 수준이다. 소아 또는 청소년의 경우, 건강한 것으로 간주되는 수준은 약 120 mg/dL 내지 약 170 mg/dL이다. 본원의 방법을 사용하여 치료가능한 대상체 집단으로는 소아 또는 청소년을 포함한다. 인간에 대한 c-LDL의 정상 수준은 약 150 mg/dL 미만, 약 130 mg/dL 미만, 또는 약 110 mg/dL 미만으로, 하한은 건강한 수준인 것으로 간주되는 c-LDL 수준이다. 소아 또는 청소년의 경우, 건강한 것으로 간주되는 수준은 110 mg/dL 미만이다.
말초 대사와는 달리, 뇌 콜레스테롤 대사에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. 본 개시내용은 최초로 레트 증후군에서의 뇌 콜레스테롤 항상성의 중요성을 시사한다. 콜레스테롤이 뇌 기능에 중요하지만, 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과하지 못하기 때문에, 뇌는 그 자신의 콜레스테롤을 생산한다. 그러나, 이는 오래된 콜레스테롤을 순환으로 재순환시키거나 대사 변화(turnover)시켜 새로 생산하여야 하거나, 콜레스테롤은 산화되어 염증을 유발할 수 있다. 콜레스테롤 대사 변화는 뉴런 시냅스에서 요구되는 것으로 알려져 있으며; 미엘린에는 존재하지 않는, 성인 뇌에서의 대부분의 순환성 콜레스테롤은 성상 세포에 의해 생산되고, HDL 유사 입자로 패킹되어 세포내 공간을 거쳐 뉴런 상의 LDL 유사 수용체로 전달된다 (Pfrieger and Ungerer, Prog Lipid Res 50: 357-371, 2011). 뉴런이 콜레스테롤 또는 그의 중간체를 너무 많이 축적시킬 경우, 시토크롬 P450 옥시다제 Cyp46a1은 콜레스테롤을 히드록실화시켜 24SOHC를 생산하게 되고, 이로써, BBB를 통과하는 순환으로의 일방향 확산에 의한 대사 변화가 일어날 수 있다 (Lund, Guileyardo and Russell, Proc Natl Acad Sci USA 96: 7238-7243; Lund et al. J Biol Chem 278: 22980-22988, 2003).
대사 경로 조절제
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명은 특정 대사 경로 조절제가 레트 증후군 및/또는 다른 MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증 치료에서 유용하다는 인식하는 것을 포함한다. 특히, 본 발명은 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로, 및 특히 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 경로의 특정 조절제가 MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증 치료에 유용하다는 것을 확립한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 레트 증후군 치료에서의 MECP2 조절제의 용도를 교시한다.
일반적으로, 본원에 기술된 바와 같이 유용한 대사 경로 조절제는 예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물, 및/또는 소분자 작용제, 또는 그의 조합을 비롯한, 임의의 화학 부류의 작용제일 수 있거나, 또는 그를 포함할 수 있다. 통상의 기술자는 예를 들어, 다수의 단백질 표적은 항체 작용제에 의해 및/또는 표적화된 핵산 작용제 (예컨대, 안티센스 및/또는 siRNA 작용제)에 의해 억제될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시양태에서, 대사 경로 억제제는 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과할 수 있다.
스타틴
본원에 기술된 바와 같이, 스타틴 약물은 MECP2-관련 질환, 장애, 및 병증 치료에 유용하다.
예를 들어, 본 실시예는 스타틴 약물이 Mecp2 널 마우스에서 Sqle 억제인자 돌연변이에 의해 나타나는 증상의 호전을 재현한다는 것을 입증한다. 시험된 특정 조건하에서, 스타틴은 청각 놀람 반응 또는 청각 놀람 반응의 선행 자극 억제를 비롯한, 모든 증상을 호전시키지는 않았다.
본 출원인은 발명의 명칭이 "Treating Learning Deficits with Inhibitors of HMG-CoA Reductase"인, 실바(Silva)에 의한 공개 문헌 (각각 2004년 5월 24일 및 2005년 3월 15일 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 60/574442 및 60/661764을 우선권 주장하며, 2005년 5월 23일 출원된 미국 특허 출원 시리얼 번호 11/569426으로부터의 것인 미국 특허 출원 공개 번호 2007/0299096 (공개일: 2007년 12월 27일)) ("실바 공개 문헌")에서 HMG CoA의, 콜레스테롤 생합성에 사용되는 이소프레노이드 중간체인 메발로네이트로의 전환을 촉매화하는 효소 HMG-CoA 리덕타제의 억제제가 일반적으로 인지 장애 치료에 유용할 수 있다고 제안한 진술에 주목한다. 적어도 일부의 스타틴은 HMG-CoA 리덕타제 억제제인 것으로 간주되며, 실바 공개 문헌에서는 구체적으로 상기 치료를 위한 스타틴의 용도에 대해 권고하고 있다. 그러나, 관련 기술분야에서의 그에 대한 이해와 일관된 실바 공개 문헌 그 자체도 또한 인지는 복잡한 신경학적 과정이며, 매우 다양한 분자 기전이 인지 기능에 연루되어 있다고 언급하고 있다.
실바 공개 문헌에는 상이한 질환, 장애, 또는 병증과 관련된 학습 결핍에 관여할 수 있는 다수의 상이한 생물학적 경로가 정의되어 있다. 특히, 실바 공개 문헌에서는 신경섬유종증-1에 관여하는 바, 뉴로피브로민 신호전달 경로를 강조하고 있다. 실바 공개 문헌은 신경섬유종증-1 ("NF-1")에 대한 마우스 모델에서의 로바스타틴이 p21Ras/MAPK 활성, 장기간의 상승 작용, 공간 학습 결핍, 및 주의력 및 감각 동기 결핍에 미치는 중간 정도의 유익한 영향을 보여주는 데이터를 제공한다.
실바 공개 문헌에서는 레트 증후군에서 특히 스타틴은 고사하고, 일반적으로 HMG-CoA 리덕타제 억제제의 용도도 구체적으로 권고하고 있지 않다. 실제로, 레트 증후군 그 자체는 실바 공개 문헌상에 HMG-CoA 리덕타제 억제제로 적절하게 치료가능한 것으로 열거되어 있는 인지 장애 중에 포함되어 있는 것이 아니다. 그러나, 실바 공개 문헌은 그의 배경 및 그의 도입부에서 일부 레트 증후군 환자가 자폐 증상을 보이고/거나, 자폐 개체와 하나 이상의 유전적 특징을 공유한다고 언급하였다. 비록 자폐증 발생과 관련된 것으로 언급되는 생물학적 경로가 NF-1과 관련된 것과 완전히 상이하기는 하지만, 실바 공개 문헌에는 자폐증이 치료가능한 장애로 열거되어 있다.
불행하게도, 실바 참고 문헌에 의해 동기 부여되어, 학습 장애 및 주의력 결핍을 호전시키기 위해 디자인된 NF-1 환자에 대한 임상 시험은 실패인 것으로 입증되었고; 심바스타틴은 유의적인 효과를 보이는 것으로 관찰되지 않았다 (예를 들어, [Krab et al. JAMA 300:287, 2008] 참조). 유사하게, 심바스타틴을 이용한 알츠하이머병에 관한 임상 시험는 실패하였다 (Sano et al. Neurology 77:556, 2011). 이러한 시험의 실패로 NF-1 마우스 및/또는 상기 마우스에서 수행된 관련된 인지 검사는 인간 인지 기능에 적절한 모델이 아니라는 것이 입증되었다. 상기 실패는 또한 실바 참고 문헌에서 제안된, Ras 활성 조절을 통한 기전은 제안된 바와 같이 작동하지 못할 수도 있다는 것을 시사한다. 통상의 기술자는 이러한 실패에 정통할 것이며, 실바 참고 문헌의 교시에 대한 그의 함축성을 잘 이해할 것이다.
대조적으로, 본 개시내용은 스타틴이 신경계 결손에 기초가 될 수 있는 운동 결핍을 개선시킬 수 있다는 것을 입증하며, 추가로, 스타틴 작용은 지질 침착을 조절하는 있는 능력에 달려있다는 것을 확립한다. 본 발명자들이 아는 바로는, 본 개시내용은 지질- 또는 콜레스테롤-생합성 경로 조절제, 및 구체적으로 MECP2 조절제 (예컨대, 스타틴)가 레트 증후군 치료에서 유용하다는 첫번째 교시를 나타낸다. 본 개시내용이 자폐증 관련 유전자 돌연변이를 보유하지 않는 상기 레트 증후군 환자에서 (즉, MECP2 이외의 유전자좌에서) 상기의 용도를 제안한 최초의 것이라는 것은 분명하다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 MECP-2 관련 질환, 장애 또는 병증을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 관련 대상체에게 스타틴을 투여하는 단계를 포함하는, MECP-2 관련 질환, 장애, 또는 병증 (예컨대, 레트 증후군)을 치료하는 방법을 제공한다. 다양한 실시양태에 따라, 예를 들어, 아토르바스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 로바스타틴, 메바스타틴, 피타바스타틴, 프라바스타틴, 로수바스타틴, 심바스타틴을 비롯한, 임의의 스타틴이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 스타틴은 로바스타틴, 심바스타틴, 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
간 수용체 X ( LXR ) 조절제
스타틴은 신체에서의 콜레스테롤 생산을 저속화시킴으로써 고콜레스테롤을 치료하면서, 이는 또한 간 (여기서, 콜레스테롤은 배설을 위해 담즙산으로 전환될 수 있다)에 의한 혈액 콜레스테롤 재흡수를 유도함으로써 콜레스테롤 수준을 저하시킬 수도 있다. 이러한 재흡수는 LXR에 의해 매개된다. LXR은 또한, 비록 정확한 기전이 알려져 있지는 않지만, 뇌 특이 역할을 가진다. LXR 활성을 직접 조절하는 약물로는 히포콜라미드, T0901317, GW3965, SR9238 및 벡사로텐을 포함한다. 이들 LXR 효능제는 죽상동맥경화증 및 당뇨병의 마우스 모델을 치료하는 데 효과적이었고, 일부 화합물, 특히, 벡사로텐은 혈액 뇌 장벽을 통과하는 것으로 나타났다. 다수가 현재 개발 중에 있는 다른 약물들, 예컨대, Psck9 억제제는 LXR 수준에 간접적으로 영향을 미친다. 이중 임의의 것이 레트 증후군 및/또는 본원에 기술된 다른 MECP2-관련 질환, 장애, 및 병증의 모델에서 콜레스테롤을 조절하는 데 있어 스타틴에 대한 대안적 또는 보충적 접근법을 위한 우수한 후보 물질이 된다.
일부 실시양태에서, LXR 조절제는 임의의 옥시스테롤 또는 RXR 효능제일 수 있거나, 또는 그를 포함할 수 있다. 상기 기술된 것 이외의 비제한적인 예로는 히포콜라미드, 22(R)-히드록시콜레스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 24(S)-히드록시콜레스테롤 (뇌 특이), 24(S), 25-에폭시콜레스테롤 (간 특이), 콜레스텐산, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. LXR 효능제 5,6-24(S),25-디에폭시콜레스테롤 및 6알파-히드록시 담즙산은 LXR 알파에 대해 선택적이다.
글루코스 대사 조절제
글루코스 대사는, 소분자 전구체 및 에너지를 한 활성에서부터 또 다른 것으로 방향을 이동시키면서, 지질, 콜레스테롤, 글루코스, 및 단백질 대사의 핵심 조절 인자로서 작용하는, 5' AMP-활성화된 단백질 키나제 (AMPK)로 불리는 단백질의 작용을 통해 이루어지는 콜레스테롤 및 지질 대사와 불가분하게 연관되어 있다. FDA 승인을 받은 약물 메트포르민은 AMPK를 활성화시키고, 2형 당뇨병을 치료하는 데 사용되며; 이러한 경우, 그의 주된 역할은 간 글루코스 생산을 억제시키는 것이지만, 이는 또한 당뇨병 환자에서 흔한 콜레스테롤-관련된 심장병 합병증을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 본원에서 입증된 바와 같이 (도 2 및 3 참조), Mecp2 돌연변이체 마우스는 콜레스테롤 조절 장애, 및 2형 당뇨병과 유사한 글루코스 및 인슐린 대사의 조절 장애, 둘 모두를 보인다. 그러므로, 본 발명의 일부 실시양태에 따라, 메트포르민 및 다른 관련된 비구아니드 부류의 약물은 레트 증후군 및/또는 다른 MECP2-관련 질환, 장애, 및 병증 치료에서 유용한 작용제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 글루코스 대사 조절제, 예컨대, 2,4-디니트로페놀-메틸 에테르 (DNPME 또는 DNP-ME)는 Mecp2-관련된 기능장애의 하나 이상의 증상을 치료하는 데에도 유용할 수 있다.
따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명은 MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 글루코스 대사 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증 (예컨대, 레트 증후군)을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 글루코스 대사 조절제는 비구아니드 약물, 2,4-디니트로페놀-메틸 에테르 (DNP-ME), 2,4-디니트로페놀-에틸 에테르 (DNP-EE), 2,4-디니트로페놀-비닐 에테르 (DNP-VE), 상기 화합물의 유도체, 및/또는 그의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 비구아니드 약물은 메트포르민, 프로구아닐, 클로르프로구아닐로부터 선택된다
SREBP 조절제
SREBP는 HMG-CoA 리덕타제 상류이되, AMPK의 하류인 콜레스테롤 및 지질 대사를 조절한다. 적어도 1종의 간접 SREBP 억제제, 파토스타틴은 마우스 및 래트에서 비만, 고콜레스테롤혈증, 및 고혈당증을 효과적으로 예방하고 치료하는 것으로 밝혀졌다. 일부 실시양태에서, 파토스타틴 또는 또 다른 간접 SREBP 억제제는 본원에 기술된 바와 같이 대사 조절제로서 유용하다. 일부 실시양태에서, SREBP를 억제시키는 더욱 직접적인 작용 기전을 가지는 하나 이상의 작용제가 본원에 기술된 바와 같이 대사 조절제로서 유용하다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 파토스타틴, SREBP1, SREBP2, 및/또는 하나 이상의 비특이 SREBP 억제제는 MECP-2 관련 질환, 장애 또는 병증, 예컨대 레트 증후군을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 관련 개체에서 행동 및/또는 대상 증상을 개선시키는 데 사용된다.
PPARG 조절제
본 발명의 일부 실시양태에 따라, 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 감마 (PPARG)를 표적화하는 작용제는 본원에 기술된 바와 같이 사용하기 위한 대사 조절제로서 간주될 수 있다. 예를 들어, 2형 당뇨병 치료용으로 식품의약국(Food and Drug Administration: FDA) 승인을 받은 작용제로서, 그 중 일부는 PPARG 활성제인 것인 작용제는 MECP2-관련 질환, 장애 또는 병증 치료에서 유용하다. 특히, 티아졸리딘디온은 MECP2-관련 질환, 장애 또는 병증 치료에서 유용할 수 있다. 티아졸리딘디온은 췌장 인슐린 분비를 증가시키지 않으면서 혈중 글루코스 수준을 효과적으로 저하시키고, 그뿐만 아니라, 지방산, LDL-콜레스테롤, 및 트리글리세리드 생산도 감소시키는 것으로 나타났는 바, 이에 2형 당뇨병 치료에서 사용된다.
조합
본 발명의 일부 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 대사 경로 조절제는 서로 및/또는 MECP2-관련 질환, 장애 또는 병증의 하나 이상의 증상을 치료하고/거나, 요법의 하나 이상의 바람직하지 못한 부작용의 발생률, 빈도 및/또는 강도를 감소시키는 하나 이상의 다른 작용제 또는 치료학적 방식과 함께 조합하여 사용된다.
본원에서 사용되는 바, "조합하여"라는 어구는 대상체가 작용제 또는 방식 둘 다 (또는 모두)에 동시에 노출되도록 작용제 또는 방식이 하나 이상의 다른 원하는 치료제와 동시에, 그 이전에, 또는 그 이후에 투여된다는 것을 의미한다. 2개 이상의 작용제 또는 방식은 각각 다른 스케줄에 따라 투여될 수 있고; 개별 용량의 상이한 작용제가 동시에 또는 조성물로 투여되어야 할 필요는 없다. 대신, 제제 둘 다 (또는 그 초과의 제제)가 일정 기간 동안 대상체의 체내에 동시에 존재하는 한, 이는 "조합하여" 투여된 것으로 간주된다.
스타틴 및 에제티미브의 경우와 같이, 작용 기전이 다른 콜레스테롤 저하 약물은 조합하여 사용되는 것인 일반적이다. 추가로, 스타틴이 억제시키는 것인 HMG Co-A 리덕타제의 생성물은 단지 콜레스테롤 생산만을 위해서가 아니라, 다중의 생물학적 경로를 위해 요구되는 것이므로, 스타틴은 일반적으로 원하는 표적이 아닌 경로를 하향조절시킴으로써 유발되는 원치않는 효과를 예방하기 위해 보충제, 예컨대, 메발로네이트와 함께 제공된다.
본 발명의 다수의 실시양태에서, MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증 치료는 본원에 기술된 바와 같이, 2개 이상의 대사 경로 조절제 또는 다른 작용제 또는 방식의 조합을 포함하거나, 그를 필요로 할 수 있다. 일례로는 PPARG 효능제와 함께 또는 스타틴과 함께 조합되는 메트포르민이 될 것이다. 별법으로 또는 추가로, 다수의 실시양태에서, 하나 이상의 MECP2-관련 질환, 장애 또는 병증 (예컨대, 레트 증후군)을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 환자를 일반적인 동반질환, 예컨대, 간질 및 과잉행동을 다루는 작용제 또는 다른 치료 방식으로 처리된다. 실제로, 레트 증후군에서 콜레스테롤 및 지질 조절 장애를 다루는 것의 주된 이점은 대사 프로파일 및 운동 증상의 개선이기 때문에, 다수의 실시양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 대사 경로 조절제 요법은 현재의 증상-특이적 치료법을 대체하지는 못하지만, 그와 함께 작용하게 될 것이다.
제약 조성물
본원에 기술된 바와 같이 지질 및/또는 콜레스테롤 대사를 조절하는 제공된 작용제 및 방식은 제약 조성물 맥락에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 사용되는 제약 조성물은 1종 이상의 활성제 및 1종 이상의 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 상기 제약 조성물은 임의적으로 하나 이상의 추가의 치료학상 활성인 물질을 포함할 수 있고/거나, 그와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공하는 제약 조성물은 의약으로 유용하다. 일부 실시양태에서, 제공하는 제약 조성물은 예방제로서 유용하다. 일부 실시양태에서, 제공하는 제약 조성물은 치료학적 적용에서 유용하다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 인간 투여용으로 제제화된다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에서 제공하는 제약 조성물은 멸균 주사가능한 형태 (예컨대, 피하 주사 또는 정맥내 주입에 적합한 형태)로, 및/또는 주사에 적합한 다른 액체 투여 형태로 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 주사 이전에 수성 희석제 (예컨대, 물, 완충제, 염 용액 등)로 재구성되는, 임의적으로 진공하의 분제로서 (예컨대, 동결건조된 및/또는 멸균된 것으로서) 제공될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 물, 염화나트륨 용액, 아세트산 나트륨 용액, 벤질 알콜 용액, 인산 완충 염수 등 중에 희석 및/또는 재구성된다. 일부 실시양태에서, 분제는 수성 희석제와 함께 (예컨대, 진탕이 아닌) 온화하게 혼합되어야 한다.
일부 실시양태에서, 제공하는 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제 (예컨대, 보존제, 불활성 희석제, 분산화제, 계면활성제 및/또는 유화제, 완충제 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공하는 제약 조성물에서 사용하는 데 적절한 부형제로는 예를 들어, 원하는 특정 투여 형태에 적합화된 것과 같은, 하나 이상의 제약상 허용되는 용매, 분산 매질, 과립화 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 계면활성제 및/또는 유화제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제, 붕해제, 결합화제, 보존제, 완충제 등을 포함할 수 있다. 별법으로 또는 추가로, 제약상 허용되는 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및/또는 좌제 왁스, 착색제, 코팅제, 감미제, 향미제, 및/또는 방향제가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적절한 부형제는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 순수한 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 식품의약국 승인을 받은 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 제약 등급의 것이다. 일부 실시양태에서, 부형제는 미국 약전 (United States Pharmacopoeia: USP), 유럽 약전 (European Pharmacopoeia: EP), 영국 약전(British Pharmacopoeia), 및/또는 다른 국제 약전 표준을 충족시킨다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 보존제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉동 및/또는 냉동될 수 있는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 냉동 및/또는 냉동될 수 없는 형태로 제공된다. 일부 실시양태에서, 재구성된 용액 및/또는 액체 투여 형태는 재구성 후 일정 기간 동안 (예컨대, 예컨대, 2시간, 12시간, 24시간, 2일, 5일, 7일, 10일, 2주, 1개월, 2개월, 또는 더 장기간) 보관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 명시된 기간보다 더 긴 장기간 동안 조성물을 보관하게 되면 활성제는 분해된다.
일부 실시양태에서, 액체 투여 형태 (예컨대, 경구 및/또는 비경구적 투여용의 것)는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 액제, 현탁제, 시럽제, 및/또는 엘릭시르를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제공하는 가용성 지질화된 리간드 작용제 이외에도, 액체 투여 형태는 관련 기술분야에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예컨대, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예컨대, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유, 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 그의 혼합물을 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에도, 경구 조성물은 애주번트, 예컨대, 습유화제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미제, 및/또는 방향제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 비경구적 투여용인 경우 조성물은 가용화제, 예컨대, 크레모포르(CREMOPHOR)®, 알콜, 오일, 개질된 오일, 글리콜, 폴리소르베이트, 시클로덱스트린, 중합체, 및/또는 그의 조합과 혼합된다. 액체 투여 형태 및/또는 재구성된 용액은 투여 이전에 미립자 물질 및/또는 변색을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변색되었거나, 또는 혼탁할 경우, 및/또는 미립자 물질이 여과 후에도 여전히 그대로 남아있는 경우에 용액은 사용되지 않아야 한다.
일부 실시양태에서, 주사용 제제, 예를 들어, 멸균 수성 또는 유지성 현탁제는 적합한 분산화제, 습윤화제, 및/또는 현탁화제를 사용하여 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 액체 제제는 예를 들어, 1,3-부탄디올 중 액제와 같은, 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 및/또는 용매 중의 액제, 현탁제, 및/또는 에멀젼일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에는 예를 들어, 물, 링거액, U.S.P., 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 멸균, 고정유가 용매 또는 현탁화 매질로서 통상 사용된다. 본 목적을 위해, 합성 모노 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 블랜드 고정유가 사용될 수 있다. 지방산, 예컨대, 올레산 이 액체 제제의 제조에 사용될 수 있다.
액체 제제는 예를 들어, 박테리아 유지 필터를 통과시키는 여과에 의해, 및/또는 사용 이전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 멸균화제를 도입함으로써 멸균될 수 있다.
일부 실시양태에서, 전달 후 제공하는 가용성 지질화된 리간드 작용제의 효과를 연장 및/또는 지연시키는 데 하나 이상의 전략법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 고체 투여 형태 (예컨대, 경구 투여용의 것)는 캡슐제, 정제, 환제, 분제 및/또는 과립제를 포함한다. 상기 고체 투여 형태에서, 제공하는 가용성 지질화된 리간드 작용제(들)는 1종 이상의 불활성, 제약상 허용되는 부형제, 예컨대, 시트르산나트륨 또는 인산 이칼슘 및/또는 충전제 또는 증량제 (예컨대, 전분, 예컨대, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분; 당, 예컨대, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만닛톨, 소르비톨, 및 규산), 결합제 (예컨대, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리디논, 수크로스, 및 아카시아), 보습제 (예컨대, 글리세롤), 붕해제 (예컨대, 아가, 엑스플로탭(Explotab), 소듐 전분 글리콜레이트, 앰벌라이트(Amberlite), 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 울트라밀로펙틴, 오렌지 껍질, 천연 스폰지, 벤토나이트, 탄산칼슘, 감자 전분, 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 하나 이상의 불용성 양이온 교환 수지, 및 탄산나트륨), 용해 지연제 (예컨대, 파라핀), 흡수 가속화제 (예컨대, 4급 암모늄 화합물), 습윤화제 (예컨대, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트), 흡착제 (예컨대, 카올린 및 벤토나이트 점토) 및 윤활제 (예컨대, 탈크, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트), 및 그의 혼합물과 혼합될 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제인 경우, 투여 형태를 완충제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 유사 유형의 고체 조성물은 락토스 또는 유당 뿐만 아니라, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐제 중의 충전제로서 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐제, 환제, 및 과립제의 고체 투여 형태는 코팅제 및 쉘, 예컨대, 장용 코팅제 및 제약 제제화 분야에 주지되어 있는 다른 코팅제를 이용하여 제제화될 수 있다.
장용 코팅제의 예로는 하기: 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트; 메틸 아크릴레이트-메타크릴산 공중합체; 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트; 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트; 히드록시 프로필 메틸 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트 (히프로멜로스 아세테이트 숙시네이트); HP55; 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트 (PVAP); 유드라지트(Eudragit) L30D; 유드라지트 L; 유드라지트 S; 아쿠아테릭(Aquateric); 메틸 메타크릴레이트-메타크릴산 공중합체; 메타크릴산 공중합체, 셀룰로스 아세테이트 (및 그의 숙시네이트 및 프탈레이트 버전); 스티롤 말레산 공중합체; 폴리메타크릴산/아크릴산 공중합체; 히드록시에틸 에틸 셀룰로스 프탈레이트; 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 아세테이트 숙시네이트; 셀룰로스 아세테이트 테트라히드로프탈레이트; 아크릴산 수지; 셸락, 및 그의 조합 중 하나 이상의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 장용 코팅제는 실질적으로 pH 5.0 이상에 대해 불투과성이다.
일부 실시양태에서, 고체 투여 형태는 임의적으로 불투명화제를 포함할 수 있고, 제공하는 가용성의 지질화된 리간드 작용제(들)를 오직 또는 우선적으로 장관의 특정 부분에서 (예컨대, 십이지장, 공장, 또는 회장), 임의적으로, 지연된 방식으로 방출하는 조성물의 형태일 수 있다. 사용될 수 있는 포매 조성물의 예로는 중합체 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물은 락토스 또는 유당 뿐만 아니라, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하는 연질 및 경질 충전된 젤라틴 캡슐제 중의 충전제로서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 예컨대, 크림, 도포제, 연고, 오일, 폼, 스프레이, 로션, 액제, 분제, 증점화 로션, 또는 겔과 같은 국부 및/또는 경피 전달용 조성물을 제공한다. 특정의 예시적인 상기 제제는 예를 들어, 제품으로서, 예컨대, 스킨 소프트너, 영양 로션 타입 에멀젼, 클렌징 로션, 클렌징 크림, 스킨 밀트, 연화 로션, 마사지 크림, 연화 크림, 메이크업 베이스, 립스틱, 안면용 팩 또는 안면용 겔, 클리너 제제, 예컨대, 샴프, 린스, 바디 클렌저, 양모제, 또는 비누, 또는 피부과용 조성물, 예컨대, 로션, 연고, 겔, 크림, 도포제, 패치, 데오도런트, 또는 스프레이로서 제조될 수 있다.
본원에 기술된 제약 조성물은 제약 분야에 공지되어 있거나, 또는 이후 개발될 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 제조 방법은 활성 성분을 하나 이상의 부형제 및/또는 하나 이상의 다른 보조 성분과 함께 회합시키는 단계, 및 이어서, 필요할 경우 및/또는 원하는 경우, 생성물을 원하는 단일 또는 다중 투약 단위로 성형 및/또는 패킹하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 단일의 단위 용량으로 및/또는 복수 개의 단일 단위용량으로 제조, 패킹 및/또는 벌크로 판매될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "단위 용량"은 미리 결정된 양의 활성 성분을 포함하는 제약 조성물의 개별 양이다. 활성 성분의 양은 일반적으로 대상체엑 투여되는 용량 및/또는 상기 용량의 편의상의 분획량, 예컨대, 상기 용량의 ½ 또는 ⅓과 같다.
본 발명에 따른 제약 조성물의 활성 성분, 제약상 허용되는 부형제, 및/또는 임의의 추가의 성분의 상대적인 양은 치료받은 대상체의 신원, 크기, 및/또는 병증에 따라, 및/또는 투여되는 조성물의 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 일례로, 조성물은 0.1%(w/w) 내지 100%(w/w) 활성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 원하는 특정 투여 형태에 적합화된 것과 같은, 하나 이상의 용매, 분산 매질, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산 또는 현탁 보조제, 계면활성제, 등장제, 증점제 또는 유화제, 보존제, 고체 결합제, 윤활제 등을 추가로 포함할 수 있다. 문헌 [Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)]에는 제약 조성물을 제제화하는 데 사용되는 다양한 부형제 및 그의 제조를 위한 공지된 기법이 개시되어 있다. 예컨대, 임의의 바람직하지 못한 생물학적 효과를 일으키거나, 또는 다르게는 제약 조성물의 임의의 다른 성분(들)과 유해한 방식으로 상호작용함으로써 임의의 종래 부형제 매질이 물질 또는 그의 유도체와 비적합성인 한 이를 제외하면, 그의 용도는 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 고려된다.
투여 경로
일부 실시양태에서, 제공하는 작용제는 임의의 적절한 전달 경로용으로 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공하는 작용제는 근육내 (IM), 정맥내 (IV), 복강내 (IP), 피하 (SQ), 기관지 점적 주입, 및/또는 흡입; 협측, 장관, 진피간, 동맥내 (IA), 위내 (IG), 골수내, 비내, 경막내, 기관내 점적 주입 (by), 심실내, 관절내, 점막, 비강 분무제, 및/또는 에어로졸, 경구 (PO), 경구 분무제로서의 것, 직장 (PR), 설하; 국부 및/또는 경피 (예컨대, 로션, 크림, 도포제, 연고, 분제, 겔, 점적제에 의한 것), 경피, 질, 유리체, 및/또는 간문맥 카테터를 통한 것; 및/또는 그의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 전달 경로용으로 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 직접 주사 (예컨대, 특정 조직, 예컨대, 뇌로의 주사)를 통해 제공하는 작용제를 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 정맥내 투여를 통해 제공하는 작용제를 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 경구 투여를 통해 제공하는 작용제를 투여하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 피하 투여를 통해 제공하는 작용제를 투여하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 작용제는 조직 특이 방식으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 작용제는 뇌에 직접적으로 투여된다.
투약
다양한 용량 중 임의의 것이 다양한 실시양태와 상용성인 것으로 고려된다. 특정 적용에서 적절한 용량은 타당한 의학적 판단에 따라 결정될 것이라는 것이 고려된다. 다양한 작용제 및 가중 인자, 예컨대, 효능, 상대적인 생체이용률, 환자 체중, 유해한 부작용의 심각도 및 바람직한 투여 모드들 중에서 선택함으로써, 상당한 원치않는 독성을 유발하지 않지만, 특정 대상체를 치료하는 데 효과적인, 유효 예방학적 또는 치료학적 치료 요법을 계획할 수 있다. 임의의 특정 적용에 효과적인 유효량은 투여되는 본 발명의 특정 작용제, 대상체의 크기, 및/또는 질환 또는 병증의 중증도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시양태에서, 타당한 의학적 판단에 따라 안전한 최고 용량인 최대 용량을 사용하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 제공하는 작용제를 적절한 전신 수준으로 달성하기 위해서는 1일당 다회에 걸쳐 투약하는 것이 유용한 것으로 고려된다. 적절한 전신 수준은 예를 들어, 대상체의 작용제에 대한 최고 또는 지속되는 혈장 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 작용제의 1일 용량은, 인간 대상체인 경우, 약 0.01 mg/kg/일 내지 1,000 mg/kg/일 (예컨대, 약 1.5 - 30 mg/kg/일)이다. 구체적인 용량은 투여 모드에 따라 국소 또는 전신의 원하는 약물 수준을 달성하기 위해 적절하게 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제공하는 작용제를 적절한 전신 수준으로 달성하기 위해서는 1일당 다회에 걸쳐 투약하는 것이 유용한 것으로 고려된다. 제공하는 작용제는 방출 조절형 및/또는 서방성 형태로 제제화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 작용제는 FDA 승인을 받은 약물이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 약물에 대하여 FDA 승인을 받은 투약 요법에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 FDA 승인을 받은 투약 요법과 다른 투약 요법에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 FDA 승인을 받은 투약 요법과 비교하여 더 적은 저용량, 덜 빈번한 투약 스케줄, 및/또는 더 적은 총 투약 횟수 중 하나 이상의 것으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 상기 작용제는 FDA 승인을 받은 용량보다 10X 더 적은 용량 내지 FDA 승인을 받은보다 10X 더 많은 용량으로 투여된다.
대사 경로 조절제의 확인 및/또는 특징 규명
일부 실시양태에서, 본 발명은 예컨대, 비정상적인 MECP2와 관련된 질환, 장애, 또는 병증을 치료하는 데 사용하기 위한 유용한 대사 경로 조절제를 확인하고/거나, 그의 특징을 규명하기 위한 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로, 및 특히, 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 경로의 조절제의 확인 및/또는 특징 규명을 위한 시스템을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 대사 경로, 및 특히, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로, 가장 특히, 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사 (예컨대, 생합성) 경로의 하나 이상의 특정 성분에 대해 작용제가 미치는 효과에 기초하여 상기 작용제를 확인하고/거나, 특징을 규명한다. 일부 특정 실시양태에서, 본 발명은 스쿠알렌 모노옥시게나제로도 알려져 있는, 스쿠알렌 에폭시다제 (Sqle), 또는 Sqle이 참여하는 경로의 다른 성분에 대해 작용제가 미치는 효과에 기초하여 상기 작용제를 확인하고/거나, 특징을 규명한다. 일부 특정 실시양태에서, 본 발명은 24S-OHC의 존재, 수준, 활성, 및/또는 형태에 대해 작용제가 미치는 효과에 기초하여 상기 작용제를 확인하고/거나, 특징을 규명한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 작용제 또는 방식에 노출된 대상체에서의 24SOHC의 수준을 평가함으로써 상기의 하나 이상의 작용제 또는 방식이 지질 및/또는 콜레스테롤 대사에 미치는 효과(들)를 평가하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터의 혈액 샘플을 이용하여 24SOHC를 평가한다. 일부 실시양태에서, 혈액 샘플 이외의 다른 생물학적 샘플 (예컨대, 뇌척수액)을 이용하여 24SOHC를 평가한다. 24S-OHC의 검출/평가는 항체 기반 검출 (예컨대, ELISA), 방사성 표지화, 리간드 결합 검출법, 질량 분석법, 고압 액체 크로마토그래피, 및/또는 효소 활성 검출법을 포함하나, 이에 한정되지 않는 임의의 적합한 방법을 통해 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 상기 작용제를, 하나 이상의 상기 대사 경로 성분을 포함하는 시스템과 접촉시키고, 그가 하나 이상의 지표 (예컨대, 관련 경로(들)의 성분, 생성물, 및/또는 마커)의 존재, 수준, 활성, 및/또는 형태에 미치는 영향을 평가함으로써 상기 작용제를 확인하고/거나, 그의 특징을 규명하기 위한 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제공하는 시스템은 완전한 및/또는 활성 대사 경로 (예컨대, 지질 또는 콜레스테롤 생합성 경로)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제공하는 확인 및/또는 특징 규명 시스템은 하나 이상의 세포, 조직, 및/또는 유기체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 마우스 세포, 조직, 및/또는 유기체이거나, 또는 그를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 시스템은 (예컨대, 유전자 돌연변이 및/또는 화학적 변경의 결과로서) 감소된 MECP2 발현 및/또는 활성을 보이는 하나 이상의 마우스 세포, 조직, 및/또는 유기체이거나, 또는 그를 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따라, 잠재적인 조절제 작용제가 인지 능력, 운동 기능, 및/또는 생리학적 파라미터를 변경시키는 정도를 측정하는 특정 표현형 (증상) 평가가 확립되었다. 일부 실시양태에서, 모델 유기체 (예컨대, 조작된 마우스)가 사용된다. 일부 실시양태에서, MECP2-결핍 마우스가 사용된다. 일부 실시양태에서, 결과는 MECP2 결핍이 예컨대, Sqle의 돌연변이에 의해 보상되는 참조 마우스와 비교된다.
일부 실시양태에서, 잠재적인 조절제가 미치는 효과는 암컷 세포에서 또는 그에 대하여 (예컨대, 암컷 마우스에서) 평가된다. 최근 공개된 문헌에서는 이형접합성 Mecp2 tm1 . 1Bird/+ 암컷이, 또한 본 발명자들이 암컷에서 구조 정도를 평가할 수 있도록 허용하는 특정 검출법에서 우수하게 작용하는 것으로 나타났다 (Samaco et al. Hum Mol Genet 22: 96-109, 2013).
일부 실시양태에서, 잠재적인 조절제가 미치는 효과는 (예컨대, 마우스에서의) 청각 놀람 반응 (ASR), 놀람 반응의 선행 자극 억제 (PPI), 오픈 필드 활동, 3 챔버 사회적 상호작용 및/또는 그의 조합에 대한 행동 검정을 사용하여 평가된다. 일부 실시양태에서, 잠재적인 조절제가 체중 증가 및 전반적인 건강 상태에 미치는 효과가 (예컨대, 주기적으로, 예컨대, 매일, 매주, 격주로, 또는 매월) 평가된다.
일부 실시양태에서, 잠재적인 조절제가 미치는 효과는 호흡 이상과 관련하여 평가된다. 예를 들어, 7주령째인 수컷 및 암컷 마우스에 대해 수행된 북스코(Buxco) 전신 체적 변동 기록용 챔버에서의 메타콜린 유발 분석은 호흡 이상을 정확하게 평가하고, 이러한 결함은 또한 스타틴 약물 사용으로 호전된다.
하기 표에는 관심 작용제를 확인하고/거나, 특징을 규명하기 위해 본 발명에 따라 사용될 수 있는 일례의 대표적인 시간 경로 및 지시가 제시되어 있다.
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 혈청 화학, 및/또는 뇌 및 간 지질을 평가한다. 특히, 지질 조절에 대한 증가가 명백할 경우, 복강내 글루코스 부하 검사 (IPGTT), 인슐린 부하 (ITT) 및 열량 측정을 비롯한 대사 상태에 대한 추가의 검정을 수행할 수 있다.
일부 실시양태에서, 잠재적인 조절제가 미치는 효과(들)는 행동 검사, 인지 검사, 운동 기능 검사, 하나 이상의 생리학적 파라미터에 대한 검사, 및 그의 조합 중 하나 이상의 것을 통해 평가된다.
일부 실시양태에서, 관련 행동 검사는 청각 놀람 반응 검사, 놀람 반응의 선행 자극 억제 검사, 오픈 필드 활동 검사, 3 챔버 사회적 상호작용 검사, 홈 케이지 활동 검사, 및/또는 그의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 관련 운동 기능 검사는 호흡 유발 검사, 로타로드 검사, 오픈 필드 보행 활동 검사, 보행을 모니터링하는 디기게이트 시스템 (마우스 스페서픽스로부터 입수) 및 그의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 생리학적 파라미터에 대한 검사는 이중 X선 흡광 분석법 (DEXA) 검사, 메타콜린 유발을 이용한 전신 체적 변동 기록법 호흡 검사, 글루코스 부하 검사, 인슐린 부하 검사, 혈청 콜레스테롤 검사, 열량 측정 검사, 및 그의 조합으로부터 선택된다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허, 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 공개 문헌, 특허, 또는 특허 출원이 참조로 포함된다고 구체적으로 및 개별적으로 명시된 것과 같이 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 우선할 것이다.
실시예
물질 및 방법 : 달리 언급되지 않는 한, 하기의 실시예에서는 하기 물질 및 방법이 사용되었다.
동물 실험
동물에 대해 수행된 모든 실험은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 확립된 가이드라인에 따라 베일러 의과 대학(Baylor College of Medicine)의 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 것이었다. 약물 처료 실험은 유전자형 및 처리군과 관련하여 맹검화하였다. 달리 기술되지 않는 한, 모든 동물 실험은 문헌 [Buchovecky et al., A genetic suppressor screen in Mecp2 mice implicates cholesterol metabolism in Rett Syndrome, 2013, Nat. Genet., 45(9): 1013-1020]에 상세하게 기술되어 있고, 본원에 요약되어 있는 조건 및 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하면, 스타틴으로 처리되는 동물은 모두 129.Mecp2 tm1 . 1Bird/Y 또는 129.Mecp2 tm1.1Bird/+ 및 그의 성별 대응 야생형 한배 새끼였다. 달리 명시되지 않는 한, 마우스를 13 hr 및 11 hr씩 명기 및 암기로 교대로 번갈아 가면서 실내에서 콘콥 베딩이 있는 플라스틱 랩 프로덕츠(Lab Products) 케이지 내에 수용하고, 산성화된 물, 및 할란 테크래드(Harlan Teklad) 2920X 사료를 무제한 급여로 (19.1% 단백질, 6.5% 지방; 0% 콜레스테롤) 제공하였다. 처리군당 6마리의 Mecp2-널 마우스를 포함한, 플루바스타틴을 이용하여 수행한 파일럿 연구에 이어서, 처리군으로 맹검화된 실험으로 모든 행동 평가를 수행하였다. 다른 스타틴 처리에 대한 모든 행동 평가도 처리군으로 맹검화된 실험으로 수행하였다. 모든 화학적 검정은 유전자형 및 처리군으로 맹검화하여 수행하였다. 달리 명시되지 않는 한, 4-6시간의 공복 후 2시간 오후 윈도우 이내에 조직 및 혈액을 수집하였다. 뇌량, 선조체, 시상, 시상하부, 및 해마를 함유하는 피질하 영역 상에서 뇌 분석을 수행하였다.
Q- PCR 분석
제조사의 설명서에 따라 RNA이지 리피드 티슈 미니 키트(RNAeasy Lipid Tissue Mini Kit) (퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 뇌 RNA를 단리시키고, 트리아졸(Trizol) (인비트로겐(Invitrogen))을 사용하여 간 RNA를 단리시켰다. 제조사의 설명서에 따라 간 RNA를 37℃에서 1시간 동안 1 IU DNAse (암비온 인크.(Ambion Inc.))로 처리하였다. 제조사의 설명서에 따라 슈퍼스크립트 III 퍼스트 스트랜드 신테시스 시스템(SuperScript III First Strand Synthesis System) (인비트로겐)을 사용하여 5,000 ng의 총 RNA로부터 제1 가닥 상보성 DNA (cDNA)를 합성하였다. ABI 7900 (어플라이드 시스템즈(Applied Biosystems: 미국 캘리포니아주)) 상에서 각 샘플에 대하여 3중으로 RT-PCR을 수행하였다. QRT-PCR을 위한 유전자 프라이머를 프라이머3(Primer3) 소프트웨어를 사용하여 공개된 mRNA 서열에 대해 디자인하고, 인테그레이티드 DNA 테크놀러지즈(Integrated DNA Technologies: 미국 아이오와주)에 의해 합성하였다. 프라이머 서열은 요청시 제공될 것이다. ABI 7900 (어플라이드 시스템즈: 미국 캘리포니아주) 상에서 3중으로 QRT-PCR을 수행하였다. 반응물은 10 ng 총 RNA로부터의 cDNA, 0.1 ㎕ 정방향 및 역방향 프라이머, 5 ㎕ 파워 SYBR®그린 마스터 믹스(Power SYBR®Green Master Mix), 및 최종 부피가 10 ㎕가 되게 만드는 양의 물을 함유하였다. PCR 조건: 95℃에서 10 min 동안, 이어서, 95℃에서 15 sec 동안, 60℃에서 60 sec 동안의 40 사이클. 해리 곡선 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 단일 생성물 증폭을 확인하였다. 유전자 발현을 RpL19 (L19) 내부 로딩 대조군에 대해 정규화하고, 원시 2-( ΔΔCT )로서, 또는 WT에 대해 상대적인 Mecp2/Y 발현으로서 표시되는 2-( ΔΔCT ) 방법을 사용하여 분석하였다.
마우스 뇌 및 간 샘플의 탠덤 질량 분석법 분석
상기와 동일하게 처리된 마우스로부터 유래된 조직으로부터의 추출 후, 콜레스테롤 중간체를 앞서 공개된 프로토콜 (McDonald et al. J Lipid Res 53: 1399-1409, 2012)에 따라 탠덤 질량 분석법에 의해 측정하였다.
생체내 콜레스테롤 합성 분석
생체내 콜레스테롤 합성 연구를 위해, 12시간씩의 온/오프식 명암 주기 중 마지막 암기하의 급식 상태에 있는 마우스로부터 샘플을 수득하였다. 상기 마우스를 분석하기 전 P38을 출발로 하여 개별 하우징 및 할란 테크래드 7001 설치류용 사료 (저 콜레스테롤 0.02% w/w, 저지방 4% w/w)에 적응시켰다. 샘플링시 마우스의 연령은 P54-56이었다. 공개된 바와 같이 (Xie et al. J Lipid Res 44: 1780-1789, 2003) 복강내 주사 후 100 mCi 3H2O를 혼입한 이후에 비누화된 조직으로부터 콜레스테롤 합성을 평가하였다.
약물 투여
20 g 마우스에 바람직한 용량을 100 ul로 제공할 수 있도록 플루바스타틴 (셀렉켐(Selleckchem))을 멸균 초순수에 용해시키고, 피하로 투여하였다. 수컷 마우스에 단일의 3 mg/kg의 1주당 용량을 5, 6, 및 7주째에 제공한 후, 8주령째를 시작으로 3X 매주 (M,W,F) 3 mg/kg의 용량을 제공하였다. 암컷 마우스 또한 3 mg/kg의 용량을 받았지만, 이는 6주령째를 시작으로 1주당 단 1회 처리하였다. 로바스타틴 (토크리스 바이오사이언스(Tocris Bioscience)) 제제는 제품 정보 가이드라인에 따라 에탄올 중에서 활성화시킨 후, pH 7.2로 조정하여야 했다. 활성화된 스톡 용액을 에탄올로 20x 주사 용량으로 희석하고, 최대 1개월 동안 -20℃에서 보관하였다. 주사 당일, 20 g 마우스에 바람직한 용량을 100 ul로 제공할 수 있도록 스톡 용액을 멸균 염수 중에서 희석하여 1x 작업용 용액을 제조하였다. 수컷 마우스에는 5주령째를 시작으로 매주 2회에 걸쳐 1.5 mg/kg의 용량을 피하로 주사하였다.
가속 로타로드 과제
가속 회전 막대 (로타로드) (스토엘팅(Stoelting))를 사용하여 운동 수행 측면을 측정하였다. 8주령째 (수컷) 또는 12주령째 (암컷), 분당 회전수가 4인 속도로 회전하는 홈이 있는 막대에 마우스를 놓았다. 5분간의 시험 동안 회전 속도를 분당 회전수가 40인 최대치까지 지속적으로 증가시켰다. 각 4회씩 연이틀에 걸쳐 8회의 시험 동안 각 마우스가 막대 상에 머물러 있을 수 있는 시간을 기록하였고, 각 시험 사이에는 최소 30분의 간격을 두었다. 마우스가 막대에서 떨어졌을 때, 연속 2회전 동안 막대와 함께 회전하였을 때, 또는 성공적으로 5분을 완료하였을 때, 시험을 종료하였다.
오픈 필드 보행 활동
베르사맥스 애니멀 액티비티 모니터즈(Versamax Animal Activity Monitors)를 사용하여 오픈 필드 보행 활동을 평가하였다. 약광 (20-25 lux) 및 인공 백색 잡음 (55-60 dB)이 있는 격리실에서 기록하였다. 각각의 마우스를 오픈 필드 챔버 중앙에 놓고, 30분 동안 활동을 기록하였다. 마지막 주사 후 24시간 경과하였을 때인 10주령째 (수컷) 또는 5개월째 (암컷) 상기 측정을 수행하였다.
선행 자극 억제 검정법
SR-랩 스타틀 챔버즈(SR-Lab Startle Chambers) (샌디에고 인스트루먼츠(San Diego Instruments))를 사용하여 선행 자극 억제를 측정하였다. 15분간의 시험 동안 청각 놀람 반응 (50 데시벨)을 유도할 뿐만 아니라, 상기 데시벨 (dB) 자극 이전에 더 약한 자극 (4, 8, 또는 12 데시벨)이 가해졌을 때, 상기 반응을 완화시키도록 디자인된 랜덤한 일련의 청각 자극 또는 자극 쌍을 마우스를 노출시켰다. 시험을 진행하는 동안 내내 6회에 걸쳐 모든 가능한 배열로 각각의 마우스를 노출시켰다.
지질 측정
기체-액체 크로마토그래피에 앞서, CHCl3:CH3OH 추출을 사용한 후, N2 압력하에 유기상을 건조시킴으로써 지질을 조직으로부터 단리시켰다. 이어서, 지질을 500 ㎕의 PBS-5% 트리톤(Triton) X100 중에 다시 용해시켰다. 코바스 미라(Cobas Mira) 임상 화학 분석기에서 혈청 콜레스테롤을 측정하였다.
통계학적 분석
카플란-마이어(Kaplan-Meier) 분석에 의한 SPSS에 이어서, 로그 순위 비교를 이용하여 생존 곡선을 비교하였다. 독립, 양측 스튜던츠 t 검정을 이용하여 그래프패드 프리즘 5(GraphPad Prism 5)로 2개 군 (야생형을 Mecp2 돌연변이체와 비교)사이의 통계학적 비교를 수행하였다; 야생형과 비교하여 Mecp2 돌연변이체 군이 전형적으로 증가된 가변성을 보였기 때문에 등분산인 것으로 가정하지 않았다. 다중 비교를 필요로 하는 통계학적 검정은 SPSS로 분석하였다. 로타로드 데이터를 제외하고, 다중 군 사이의 비교는 일원 ANOVA에 의해 분석하였고, 구형성 가정은 없었고; 2개 초과의 유전자형을 비교할 경우에는 본페로니 조정을 적용하였고, 던넷 사후검정을 사용하여 스타틴 처리군을 비히클 대조군과 비교하였다. 로타로드 데이터는 반복 측정 ANOVA를 사용하여 분석하였다.
대사 검정법
수컷의 경우, 4 및 8주령째에, 및 암컷의 경우, 12 및 24주령째에 복강내 글루코스 부하 검사 (IPGTT)를 수행하였다. 4시간의 공복기 후, 이소플루란으로 동물을 가볍게 마취시켰다. 꼬리를 작게 절단하고, 0인 시점에 혈액을 수집하였다. 처리 이전, 및 이어서, 글루코스 주사 이후 15, 30, 60 및 120분째 (t = 15, t = 30, t = 60 및 t = 120) 알파트랙 블러드 글루코스 모니터링 시스템(AlphaTRAK Blood Glucose Monitoring System) (애보트 라보라토리즈(Abbott Laboratories: 미국 일리노이주))을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 혈중 글루코스를 샘플링하였다. 각 마우스에 글루코스 (2 g/kg (체중))를 복강내로 주사하였다.
복강내 인슐린 부하 검사 (IPITT)는 BCM의 당뇨 및 내분비 연구 센터(The Diabetes and Endocrinology Research Center at BCM) (P30 DK079638)에 의해 수행하였다. 간략하면, 4시간의 금식 후, 마우스에 인슐린 (0.75 밀리유닛/g (체중)) 을 투여하고, 0, 15, 30, 60 및 120분째에 글루코스 수준을 수득하였다.
옥시맥스 디럭스 시스템(Oxymax Deluxe System) 간접 열량계 동급 유동 8 챔버 시스템 (콜럼버스 인스트루먼츠(Columbus Instruments: 미국 오하이오주 콜럼버스))을 이용하여 호흡 대사 기능을 평가하고, 옥시맥스 윈도우스 V3.32 소프트웨어(Oxymax Windows V3.32 Software)를 이용하여 분석하였다. 마우스를 3시간의 명기 순응기 (12:00-15:00)를 시작으로, 이어서, 연속하여 4시간의 명기 (15:00-19:00), 12시간의 암기 (19:00 - 07:00), 및 최소 5시간의 명기 (07:00-12:00)로 24시간 동안 열량 측정용 케이지에서 개별적으로 수용하였다. 누적 사료 섭취량, 온도, 산소 소비량 및 이산화탄소 생산량을 측정하였다. 상기 데이터로부터 호흡 교환율 및 에너지 소비량을 도출해내었다.
실시예 1: RTT에 대한 유전자 표적의 확인 및 특징 규명
본 실시예는, 레트 증후군에 대한 잘 허용되는 마우스 모델인 Mecp2 널 마우스 ("Mecp2 마우스")에서 수행되고 RTT 요법에 대한 특정의 새로운 표적을 확인하는 유전적 억제인자 스크린을 기술한다.
"억제인자" 유전자 (즉, 돌연변이화되었을 때, 특정 "질환" 유전자의 결함과 관련된 질환, 장애 또는 병증의 증상을 호전시키거나, 또는 그의 악화를 예방하는 유전자)를 확인하는 것이 질환 유전자가 어떻게 작용하는지, 및 상기 기능 상실시 관련 질환, 장애 또는 병증이 어떻게 발생하는지에 대해 이해하는 쪽으로 노력을 기울이는 데 도움이 된다. 추가로, 상기 억제인자 유전자는 표적화하여 증상의 진행을 역전시키거나, 또는 예방할 수 있는 새로운 경로를 밝혀낼 수 있다.
본 실시예는 Mecp2 마우스 (구체적으로, 더 잭슨 라보라토리(The Jackson Laboratory)로부터 입수된 Mecp2 tm1 . 1Bird 마우스)에서 RTT 증상을 억제시키는, 스쿠알렌 모노옥시게나제로도 또한 알려져 있는 스쿠알렌 에폭시다제 (Sqle)에서의 넌센스 (정지) 억제인자 돌연변이를 확인하는 것을 입증한다 (도 1 참조). Sqle는 콜레스테롤 합성에서 속도 제한 효소를 코딩하고; 따라서, 본 실시예는 RTT 요법에 적절한 표적으로서 콜레스테롤 생합성 경로를 확인한다.
특히, 본 실시예는 게놈 중 다수의 유전자를 동시에 변경시키는 강력한 돌연변이원으로 Mecp2 널 마우스를 돌연변이화시켰고, 단지 소수의 돌연변이만이 현존하는 MECP2 파괴와 관련된 표현형을 변경시킬 것으로 예상되는 것인 "변형제" 유전적 스크린을 기술한다. 구체적으로, 적절한 수준의 돌연변이 유발력을 제공하는 것으로 알려져 있는 화학적 초돌연변이원 N-에틸-N-니트로소우레아 (ENU)를 이용하여 야생형 C57BL/6J 수컷 마우스를 돌연변이화시켰다 (Justice Nat Rev Genet 1: 109-115, 2000). ENU는 전형적으로 점 돌연변이를 유발한다. ENU를 이용한 돌연변이유발법에 따른 가능한 유전적 결과로는 기능 상실, 기능 획득, 초활성, 및 부분적으로 활성인 코딩 영역 돌연변이 뿐만 아니라, 비코딩 RNA 및 조절 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는 서열분석에 의해 확인하였다.
마우스 유전적 스크린은, 미지의 유전자 중의 임의의 돌연변이가 증상 구조를 부여할 수 있는 것인 무작위 화학적 돌연변이유발법 스크린을 사용하였다. 후속되는 유전자 확인은 유전 및 서열분석 연구를 포함하였다. ENU-처리된 C57BL/6J 수컷을 암컷 129.Mecp2 tm1 . 1Brd /+ 마우스 (상기 계통은 129S6/SvEvTac 상에서 유사유전자형인 기능 상실 계통으로 유지되는 것이다)와 교배시켰다. 이유시 무증상인 제1 세대 (G1)의 수컷 자손을 돌연변이체 Mecp2의 존재에 대하여 유전자형을 분석하고, 신경계 증상을 구조할 것이며, 가능할 경우, 수명을 연장시킬 수 있는, 우성 돌연변이에 의한 질환 표현형의 억제에 대하여 조사하였다. 널 Mecp2 돌연변이체 대립유전자를 보유하는 679마리의 수컷을 신경계 결함 구조 및 생존 증가에 대해 스크리닝하였다. 스크린은 5가지 억제인자 중 MECP2 돌연변이체 마우스에서 콜레스테롤 대사를 변형시킴으로써 증상을 억제시키는 Sqle 돌연변이를 확인하였다. 추가의 3,700마리의 배우자를 스크리닝할 것이다; 돌연변이체 계통당 최대 300마리의 자손의 육종 및 평가에 의해 상기 계통에서의 증상 호전을 확인하였다.
예비 스크린에서, 마우스에서의 MECP2 증상의 5가지 억제인자를 확인하였다. 본 데이터는 RTT에서의 특정 대사 경로를 시사하였고, 대사 장애를 치료하기 위해 개발된 약물은 RTT 및/또는 MECP2와 관련된 다른 장애의 증상을 개선시킬 수 있는 가능성이 있다고 제안하였다.
특정의 한 관심 억제인자 돌연변이인 Sum3이 스쿠알렌 에폭시다제 (Sqle)에서의 정지 코돈 돌연변이인 것으로 확인되었다 (Buchovecky et al. Nature Genetics, in press 2013). Sqle는 콜레스테롤의 수임 생산에서 제1 산화 반응을 촉진시킨다. 콜레스테롤 수준은 피드백하여 둘 다 콜레스테롤 항상성에 중요한 것인 SQLE 및 HMG Co-A 리덕타제 (HMGCR) 둘 모두의 활성에 대하여 비의존적 기전에 의해 영향을 미친다 (Yamamoto and Bloch J Biol Chem 245: 1670-1674, 2008; Gill et al. Cell Metab 13: 260-273, 2011). Sqle는 광범위하게 발현되고, 그의 1차 생성물인 2,3-옥시도스쿠알렌은 라노스테롤 신타제 (Lss)에 의해서 즉시 라노스테롤로 폐환화되는 일시적 중간체이다 (Cory et al J Am Chem Soc 88: 4750-4751 (1966)). SQLE는 진화 전반에 잘 보존되고 있다; 마우스 및 인간 단백질은 84% 동일하다.
Mecp2 널 돌연변이체의 뇌에서의 상승된 콜레스테롤 생합성은 신경계 기능장애의 원인이 될 수 있다: 정지 코돈 돌연변이는 구조를 부여하는 경로를 하향 조절시킬 수 있는 가능성이 있다. 레트 증후군을 앓는 마우스 모델의 뇌 및 간에서는 콜레스테롤 대사가 파괴되어 있다는 것이 본원에서 제공하는 데이터를 통해 최초로 밝혀졌다. 두 Mecp2 널 대립 유전자: Mecp2 tm1 . 1Bird 및 Mecp2 tm1 . 1Jae 의 뇌 및 간에서의 콜레스테롤 대사를 Q-RT-PCR, 기체-액체 크로마토그래피, 질량 분석법, 및 콜레스테롤 합성의 정량화에 의해 (Xie et al. 2003) 평가하였다. Mecp2 tm1 . 1Bird /Y 마우스가 최소의 증상을 보일 때, Cyp46a1 발현은 널 뇌에서 이미 증가되어 있고 (야생형과 비교하여 38배; p> 0.05), 이는 질환의 조기 단계에서 콜레스테롤 대사 변화가 더욱 크게 요구되고 있음을 시사한다.
놀랍게도, 중간 정도의 증상을 보이는 마우스의 뇌에서 콜레스테롤 합성이 조직 1 g당 23%만큼 감소되었는데, 다양한 세포 유형이 많은 활동 상태로 존재한다고 고려할 때, 이는 이례적인 것이다. 흥미롭게도, 새로운 합성은 저하되었음에도 불구하고, 1 g당 뇌 콜레스테롤 농도는 약간 증가되었다. Cyp46a1 -/-는 감소된 뇌 콜레스테롤 합성을 보이는 유일의 다른 마우스 돌연변이체이지만, 이는 조직 1 g당 콜레스테롤 농도에서 있어서는 어떤 변화도 보이지 않고, 뇌 질량에 있어서도 어떤 변화도 보이지 않는다 (Lund et al. J Biol Chem 278: 22980-22988, 2003). Cyp46a1-/- 분석 결과, 신경계 기능을 위해서는 뇌 콜레스테롤 대사 변화가 중요하다는 것이 입증되었다. 콜레스테롤 대사 변화는 학습 및 시냅스 가소성에 있어서 필수적인, SQLE 상류의 HMGCR의 생성물인 게라닐게라니올을 생산하는 데 요구될 수 있고, 시냅스에서의 뉴런과 성상세포 사이의 상호작용에 중요할 수 있다. 그러므로 본 개시내용은 뉴런에서의 콜레스테롤 대사의 조절 장애가 잠재적으로는 Mecp2 널 수컷에서의 증상 발생에 대한 중요한 원인이라는 것을 확립한다. 콜레스테롤 대사 변화 실패가 아교세포 특이 Mecp2 발현이 비세포 자율 방식으로 RTT 증상 완화에 기여할 수 있다는 것을 설명할 수 있다 (Ballas et al. Nat Neurosci 12: 311-317 (2009).
수컷 및 암컷 Mecp2 널 마우스에서 이상지질혈증은 대사 증후군을 동반한다. 대사 및 내분비 부하 실험을 수행하여 Mecp2 널 이상지질혈증 표현형이 대사 질환을 유도하였는지 여부를 측정하였다. 4시간, 6시간, 및 16시간 동안 공복 상태인 Mecp2 마우스의 기초 글루코스 수준과 야생형 대조군 사이의 유의적인 차이는 없었으며, 이는 Mecp2 마우스가 과혈당성이 아니며, 따라서, 당뇨성이 아님을 제안하는 것이다. 그러나, Mecp2 마우스는 복강내 글루코스 부하 검사 (IPGTT) 동안 글루코스의 볼루스 투여에 대하여 감소된 감수성을 보였는데, 이는 인슐린을 생산하지 못하는 췌장의 선천적 무능력함 또는 인슐린 작용에 대한 조직의 감수성 감소를 시사하는 것이다. 글루코스 부하 이후 곡선하면적 (AUC)의 유의적인 증가에 의해 명백하게 나타나는 바와 같이, 4주령째인 조기 시점에 MECP2 널 수컷 마우스는 손상된 글루코스 내성을 보였으며, 상기 증가는 8주령째에 더욱 뚜렷이 나타났다 (P=0.003; 도 3). MECP2 마우스의 경우, 인슐린의 외인성 볼루스에 대한 반응으로 글루코스를 그의 혈액으로부터 제거할 수 있는 능력은 더 작은데, 이는 상기 마우스가 인슐린 저항성임을 시사하는 것이다. 그러므로, MECP2 마우스에서 관찰되는 글루코스 내성은 췌장 결함보다는 인슐린 작용에 대한 감수성 감소에 기인한다고 볼 수 있다. 정상적인 췌장 기능을 지지하면서, MECP2 마우스는 0시간, 6시간, 및 24시간 공복 후 필적하는 수준의 혈중 케톤체를 가진다. 지질 항상성은 섭식 및 활동 행동에 기초하여 일주 방식으로 조절된다. 주간에 야생형 마우스가 비활동성이고, 덜 섭식할 때, 지질 합성 및 격리에 관여하는 유전자는 억제된다. 이로써 간 내의 대사 전구체 풀은 정상혈당을 유지시키기 위해 글루코스 신생 합성 쪽으로 방향을 돌릴 수 있다. 야간에 마우스가 활동성이고, 섭식을 할 때, 지방생성 경로에 관여하는 유전자가 발현되고, 글루코스 신생 합성 전사체의 발현에는 직접적인 영향을 미치지 않으면서, 트리글리세리드로서 외부 대사물질의 저장을 유도한다. 간접 열량 측정법에 의해 에너지 소비량을 조사하였다. MECP2 널 수컷 마우스는 활동 기간에는 에너지원으로서 글루코스보다는 우선적으로 지방을 사용하였으며, 이는 글루코스를 사용할 수 있는 그의 능력이 손상되어 있으며, 대사 증후군의 징후임을 제안한다.
실시예 2: 마우스에서의 콜레스테롤 생합성 조절제를 이용한 RTT 유사 증상 치료
본 실시예는 스타틴을 이용하는 MECP2 돌연변이체 마우스 (본원에 기술된 바와 같이, 확립된 RTT 모델을 나타내는 것) 치료가 운동 증상을 개선시키고, 수명을 연장시킨다는 것을 입증한다. 본 실시예는 MECP2 수컷 및 암컷 마우스의 뇌 및 간에서의 지질의 비정상적인 합성 및 침착을 변형시킴으로써 특질이 호전된다는 것을 추가로 입증하며, 이로써, 상기와 같은 비정상적인 합성 및 침착이 RTT와 관련된 대사 결함 중 일부 또는 그들 모두를 유발한다는 것을 확립한다. 따라서, 본 실시예는 수컷 및 암컷 마우스에서 비정상적인 지질 침착을 완화시키고, 운동 증상을 개선시키는 데 스타틴 약물이 사용될 수 있다는 것을 확립한다. 본 실시예를 포함하는 본 명세서를 읽는 통상의 기술자는 특정 대사 장애 치료에 효과적인 화합물이 본원에 기술된 바와 같이 사용하기 위한 대사 조절제가 될 수 있다는 원리를 확립한다는 것을 이해할 것이다. 콜레스테롤 저하 약물이 도움이 될 수 있는 잠재적인 환자 집단은 MECP2 돌연변이를 가지거나, 또는 MECP2가 게놈으로 동원하거나, 그에 고정시키는 복합체의 용량, 기능, 또는 국재화를 변경시키는 돌연변이를 가지는 개체이다.
본 실시예는 구체적으로 스타틴을 비롯한, 콜레스테롤 저하 약물이 수컷 및 암컷 마우스에서 MECP2 돌연변이 증상을 완화시킨다는 것을 입증한다. 시험된 화합물로는 1) 플루바스타틴; 2) 심바스타틴, 3) 로바스타틴 및 4) 아토르바스타틴을 포함하였다. 약물을 그가 증상 구조에 미치는 효과를 시험하기 위해 상이한 용량으로 수컷 및 암컷 마우스에 투여하였다: 공개된 그의 설치류에서의 유효량과 등가, 및 그보다 10배 더 많은 양. 간 대사를 우회하도록 약물을 피하로 투여하였다. 지금까지 본 발명자들이 아는 바로는, 상기 약물이 이전에는 레트 증후군, 또는 Mecp2 돌연변이와 관련된 임의의 다른 질환, 장애 또는 병증을 치료하는 데 사용된 바가 없었다.
특질 호전의 결과는 체중 및 체지방 측정에 의해 뿐만 아니라, 신경계 및 호흡 활성 및 일반 건강 상태 평가에 의해 평가하였다 (도 6). 알 수 있는 바와 같이, 플루바스타틴, 로바스타틴, 심바스타틴 및 아토르바스타틴을 포함하는 스타틴 약물은 운동 특질 및 수명 구조를 다양한 정도로 부여하였고, 플루바스타틴 및 로바스타틴이 수컷 마우스에서 최상의 구조를 부여하였다 (도 4). 스타틴 약물 투여는 뇌 콜레스테롤 합성에 유익한 영향을 미칠 뿐만 아니라, 간에서의 지질의 축적을 경감시켰다.
스쿠알렌 신타제 ((E)-2-[2-플루오로-2-(퀴누클리딘-3-일리덴)에톡시]-9H-카르바졸 모노히드로클로라이드) 또는 스쿠알렌 에폭시다제 (1-(에틸술포닐)-2-피페리딜에탄)를 표적화하는 두 약물을 비롯한, 각종의 다른 약물은 증상을 유의적으로 개선시키지 못했다는 점이 주목할 가치가 있다. 그러나, 상기 약물의 유효량 및 투여 경로는 스타틴 약물보다 잘 확립되어 있는 것은 아니며, 이로써 보다 새로운 화합물이 적절한 투여량으로 콜레스테롤을 효과적으로 저하시킬 수 있게 될 것이다. MECP2 마우스에서의 결함이 콜레스테롤 및 지질 저장, 둘 모두에 영향을 미치는 바, HMGCR을 조절하는 것 (추가로, 상기 경로 중 상류에서)이 더욱 효과적일 수 있다. 이는 변형제가 특질을 최상으로 호전시키면서, Sqle의 무작위 돌연변이는 일으키지 않으면서 약물 표적화 가능한 경로를 겨냥하였다는 것을 제안한다.
스타틴 약물은 간에서의 지질 축적을 막고, 뇌 콜레스테롤 합성을 유지시킴으로써 운동 증상을 개선시킨다. FDA 승인을 받은 스타틴 약물은 HMGCR을 억제시킴으로써 콜레스테롤 생합성 경로를 하향 조절시키는 약리학적 수단을 제공한다. 예비 시험에서, 연령 대응의 129 Mecp2 tm1 . 1Bird/Y 및 +/Y 한배 새끼를 플루바스타틴을 피하 주사하여 처리하였다. 그 처리로 모의 용량을 받은 대조군 마우스과 비교하였을 때, 혈청 콜레스테롤은 감소하였고, 로타로드 행동 및 오픈 필드 활동은 개선되었으며, 수명은 연장되었다. 스타틴 약물이 청각 놀람 반응을 비롯한, 일반적으로 RTT 마우스 모델과 관련된 모든 건강상의 파라미터들을 모두 구조하지는 않았다. 그러나, 질량 분석법에 의해 평가된 바와 같이, 뇌에서 콜레스테롤 생합성 생성물 수준을 야생형 수준으로 개선시켰다. 상기 데이터는 콜레스테롤 생합성 경로를 조절하는 것이 마우스에서 Mecp2 돌연변이의 운동 증상을 호전시킬 수 있다는 착상을 지지한다. 인지 기능에 대한 학습 및 기억 검사는 포함하지 않았는데, 그 이유는 마우스에서 인지 기능은 운동 행동에 의존하고, 이는 잘못 해석될 수 있기 때문이다.
Mecp2 tm1 . 1Bird 널 수컷에서는 간 지방증을 유발하는 중증의 대사 질환이 발생하며, 이는 그를 조기 사망에 이르게 하는 데 있어 중요한 역할을 할 수 있다. 스타틴 약물 투여에 의해 증상을 호전시키는 것이 Mecp2 널 마우스에서 뇌 및 전신 콜레스테롤 항상성, 둘 모두에 영향을 준다. 플루바스타틴은 BBB를 효율적으로 통과하는 것으로 예측되지 않지만 (Guillot et al., J Cardiovasc Pharmacol 21: 339 - 346, 1993); 그러나, 스타틴 약물은 간 콜레스테롤 대사에 대해 전신 효과를 미침으로써 뇌 콜레스테롤 합성을 저하시킬 수 있다 (Cibickova L, J Clin Lipidol 5: 373-379, 2011). 로바스타틴은 더욱 친지성을 띠고, 더욱 효율적으로 BBB를 통과한다.
레트 증후군을 앓는 암컷과의 더 많은 관련성을 제공하기 위하여, 본 발명자들은 암컷 마우스에 플루바스타틴을 투여하고, 구조 정도를 측정하였다: 암컷을 6주령째부터 8개월째까지 매주 1X로 처리하였다. 수컷 마우스와 유사하게, 플루바스타틴은 운동 행동, 수명을 구조시키고, 지방간 질환을 개선시켰다 (도 5). 특히, 비록 수컷 Mecp2 /Y 마우스보다는 일생에서 더 후반에 발생하기는 하였지만, Mecp2/+ 암컷 마우스에서는 유사한 대사 질환이 발생하였는데, 발병 시점은 증상 중증도 증가와 상관관계가 있다.
스타틴 사용시의 긍정적인 데이터를 고려하여, LXR 억제제 및 대사 조절제를 비롯한 다른 지질 조절 약물을 서브-Q 또는 경구 투여 경로를 사용하는 본 발명자들의 약물 시험 프로토콜 (도 6)로 평가하여 레트 증후군 증상을 완화시킬 수 있는 그의 능력에 대해 평가하였다. 상기 약물로는 SREBP2 (콜레스테롤 경로 조절인자)를 조절하는 파토스타틴, AMPK를 활성화시키는 통상 사용되는 대사 조절제인 메트포르민, 및 SR9238 및 벡사로텐, LXR 조절제를 포함한다.
실시예 3: 대사 조절제를 이용하는 요법에 대해 감수성인 RTT 환자
본 실시예는 본원에 기술된 바와 같은 대사 조절제를 이용하는 요법이 도움이 될 가능성이 있는 개체 (예컨대, 레트 증후군 환자)의 특징을 정의한다.
구체적으로, 본 실시예는 Sqle가 Mecp2 널 수컷 마우스에서는 상승되어 있고, 콜레스테롤 생합성 경로가 Mecp2 널 수컷 마우스의 뇌 및 간, 둘 모두에서 교란되어 있음을 입증한다 (도 2). 특히, 상승된 콜레스테롤, 트리글리세리드 및 저밀도 지질단백질은 마우스에서 질환의 주변적 특징이었고, 이는 콜레스테롤 저하 약물에 반응할 수 있는 환자에 대한 바이오마커가 될 수 있다. MECP2 돌연변이를 보유하는 Rett 환자에서, 또는 Mecp2 널 마우스에서는 콜레스테롤 대사 경로의 교란이 앞서 보고된 바 없었다. 본 실시예는 교란된 지질 대사가 마우스에서 지방간 질환 뿐만 아니라, 대사 증후군도 발생시킨다는 것을 입증한다 (도 2 및 3).
Mecp2 돌연변이가 존재할 때, 한 근친계 마우스 (129S6/SvEv)에서 스타틴 약물은 상승된 말초 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 저하시키지만, 또 다른 계통 C57BL/6J에서는 Mecp2 돌연변이가 존재할 때, 상승된 콜레스테롤 및 트리글리세리드는 없다. 이러한 관찰 결과는 상승된 혈청 지질은 오직 환자의 서브세트에서만 바이오마커될 것이라는 것을 제안한다.
최근 제시된 증거들은 지방산 대사의 이상이 신경 발달 장애, 예컨대, 자폐증 및 레트 증후군의 원인이 될 수 있음을 시사한다 (Wiest et al. Fatty Acids 80: 221-227, 2009; Sticozzi et al. FEBS Letters doi.org/10.1016, 2013). 최근 논문에서 LDL- 및 HDL-콜레스테롤을 포함하는 총 콜레스테롤이 Rett 환자에서 통계학상 상승되어 있다는 것이 최초로 밝혀졌으며, 여기서 마우스 모델을 이용하여 제공한 데이터는 인간 집단으로 해석될 것으로 기대된다고 제안한다. 또한, 가장 중증의 MECP2 돌연변이를 가지는 것과 상관관계가 있는, RTT 환자 중 54%는 조기에 진행된 그의 진단에서 혈액 중에서 검출될 수 있는 높은 지질 파라미터를 가진다. 본 실시예는 비정상적인 지질 파라미터에 대한 증거를 가진 환자가 지질 대사를 조절하는 약물 투여로부터 도움을 받을 수 있고, 상승된 혈청 콜레스테롤 또는 LDL-콜레스테롤은 지질 조절 약물을 이용한 치료에 대하여 반응할 수 있는 상기 환자에 대한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다는 것을 교시한다.
그러므로, 본 실시예는 지방간 질환의 하나 이상의 증상을 보이고/거나, 뇌 및/또는 간 조직 중 상승된 콜레스테롤 트리글리세리드 (예컨대, 상승된 혈청 콜레스테롤) 및 저밀도 지질단백질을 나타내는 환자는 본원에 기술된 바와 같은 대사 조절제 (예컨대, 스타틴)를 이용하는 요법에 대한 후보가 된다는 것을 교시한다. 통상의 기술자는 지방간 질환의 상기 증상, 및/또는 뇌 및/또는 간 조직 중 상기와 같은 상승된 콜레스테롤 트리글리세리드 및 저밀도 지질단백질을 검출하는 데, 및/또는 그의 대용물 (즉, 상관관계가 있는 특징 또는 항목)을 검출하는 데 다양한 방법들 중 임의의 것이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
실시예 4: 다양한 친지성을 가지는 스타틴을 이용한 마우스에서의 RTT 유사 증상 치료
상기 실시예 2에 제시된 바와 같이, 스타틴은 Mecp2-관련 질환, 장애, 또는 병증, 예컨대, 레트 증후군 치료를 위한 것으로서, 이전에는 알려지지 않았던 부류의 요법을 나타낸다 (도 4 참조). 본 실시예는 상기 결과를 확대하여, 친지성 스타틴 사용이 본 발명의 다양한 실시양태에 따라 우수한 결과를 초래할 수 있다는 통찰력을 제공한다. 특히, 플루바스타틴은 Mecp2-관련 질환, 장애 또는 병증을 치료하는 데 특히 유용할 수 있다.
본 실시예에서는 플루바스타틴, 로바스타틴, 심바스타틴, 및 아토르바스타틴을 사용하였다. 플루바스타틴은 수용성이고, 처리 이전에 활성화되어야 할 필요가 없지만, 대다수의 스타틴 약물은 활성화되어야 한다. 다른 스타틴, 로바스타틴 (토크리스 바이오사이언스), 심바스타틴 (토크리스 바이오사이언스), 아토르바스타틴 (크레센트 케미칼(Crescent Chemical))을 제조사의 가이드라인에 따라 에탄올로 활성화시킨 후, pH를 생체내에서 사용하기에 적합한 수준으로 (pH 7-8) 조정하였다. 활성화된 스톡 용액을 에탄올로 20x 주사 용량로 희석시키고, 최대 1개월 동안 -20℃에서 보관하였다. 주사 당일, 1부의 스톡 용액을 18부 멸균 염수 및 1부 DMSO 중에 희석시켜 1x 작업용 용액을 제조하고, 20 g 마우스에 바람직한 용량을 100 ul로 제공하였다. 마우스에 5주령째를 시작으로 하여 하기 표 1에 제시된 용량을 주 2회에 걸쳐 피하로 주사하였다. 도 6의 도식에 따라 마우스를 평가하였다.
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표 1에 제시된 바와 같이, 본 실시예에서 사용된 스타틴 약물들은 각각 클리어런스율이 상이하고, 상이한 시토크롬 p450 효소에 의해 대사되며, 래트에 의해 측정된 바, 동물 중 50%가 사망하게 되는 치사량 (LD50)이 상이하다. 추가로, 각 스타틴 약물의 반감기는 상이한데, 로바스타틴의 경우, 반감기는 대략 9시간이고, 아토르바스타틴의 경우, 반감기는 대략 14시간이고, 심바스타틴의 경우, 반감기는 대략 2-3시간이고, 플루바스타틴의 경우, 반감기는 대략 96시간이다.
도 7은 5주 동안 스타틴 처리가 Mecp2 마우스에 미친 결과를 보여주는 것이다. 도 7에 제시된 바와 같이, 로바스타틴은 비히클 대조군 동물과 비교하였을 때, 유의적으로 개선된 로타로드 수행, 오픈 필드 활동, 혈청 콜레스테롤 수준, 및 간 지질 패널을 보였다. 추가로, 5주 경과 후 로바스타틴 마우스의 체중은 임의의 다른 군들보다 유의적으로 더 낮았다. 본 실시예에서 사용된 투약 스케줄 (1주당 2X)과 비교하였을 때 로바스타틴의 짧은 반감기 (~9시간)를 고려해 보면, 상기 결과는 특히 흥미롭다. 그러므로, 특정 이론을 고수하고자 하지 않으면서, 로바스타틴 (및 가능하게는 다른 스타틴들도 역시)은 더욱 빈번한 간격으로 투약될 경우, 유의적으로 증가된 효과를 나타낼 수 있는 가능성이 있다. 처리 전 5주령째를 출발로 하여 연구 종료시 10주령째를 종료로 매주 체중을 획득하였다. 도 7에는 처리 3주 후 (8주령째, 패널 a) 및 처리 5주 후 (10주령째, 패널 c) 체중이 제시되어 있다.
실시예 5: RTT 환자에서의 비정상적인 글루코스 흡수
실시예 3에서의 결과 (도 3 참조)를 확인하고, 그를 확대하는 것으로서 본 실시예는 Mecp2 기능장애를 앓는 개체가 고인슐린혈증-정상혈당 클램프의 사용을 통해 제시된 바와 같이, 비정상적인 글루코스 흡수 및 인슐린 저항성을 나타낸다는 것을 보여주는 것이다. 구체적으로, 도 8에 제시된 바와 같이, Mecp2 마우스는 인슐린 저항성이고, 대사 증후군을 앓는다.
본 실시예에서, 고인슐린혈증-정상혈당 클램프를 하기와 같이 삽입하였다. 8주령된 Mecp2tm1 . 1Bird /Y 수컷 마우스를 마취시키고, 목 정준선을 절개하여 경정맥을 노출시켰다. 마이크로캐뉼라를 경정맥 내로 삽입하고, 우심방으로 진행시키고, 정맥 절개 부위에 고정시켰다. 마우스가 식수 및 사료에 임의대로 접근할 수 있도록 하면서 4일 동안 회복할 수 있게 하였다. 밤새도록 금식시킨 후, 의식이 있는 마우스에 1차 주입한 후 (10 uCi), 이어서, 시린지 주입 펌프를 사용하여 크로마토그래피-정제된 [3-3H]-글루코스를 일정한 속도로 정맥내로 주입하였다 (0.1 uCi/min). 기초 글루코스 생산량을 측정하기 위해, 표지화된 글루코스 주입 후 50, 55, 및 60분이 경과하였을 때 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였다. (글루코스가 혈류 내로 유입되고, 글루코스 감응성 조직에 의해 흡수될 수 있는 시간을 허용하기 위해) 60분 경과 후, 마우스에 프라이밍 인슐린 볼루스 (40 mU/kg (체중))를 제공한 후, 2시간 동안 인슐린을 주입 (4 mU/kg/min)하였다. 동시에, 100-140 mg/dL의 혈중 글루코스 수준 (정상혈당)으로 유지시키기 위해 조정된 속도로 또 다른 주입 펌프를 이용하여 10% 글루코스를 주입하였다. 혈당측정기에 의해 매 10분마다 혈중 글루코스 농도를 측정하였다. 100, 110, 및 120분째, 혈액을 수집하여 클램핑된 조건하에서의 간 글루코스 생산량을 측정하였다. 개별 조직에서의 인슐린-자극성 글루코스 수송 활성을 평가하기 위해, 45분째에 클램프의 종료 전에 2-[14C]데옥시글루코스를 볼루스 (10 uCi)로서 투여하였다. 120분 경과 후, 마우스를 안락사시키고, 조직을 추출하였다. 가스 크로마토그래피-질량 분석법 (GCMS)에 의해 2-[14C]데옥시글루코스를 조직 농축시킴으로써 혈장으로부터 상이한 조직에서의 글루코스 흡수량을 계산하였다.
각 동물은 동량의 인슐린을 제공받았기 때문에, 100-140 mg/dL 글루코스의 정상 상태에 도달하기 위해 필요한 글루코스 주입량이 전신 인슐린 작용의 지표를 제공한다. 도 8에 제시된 바와 같이, 야생형 마우스와 비교하였을 때, Mecp2tm1.1Bird/Y 마우스는 100-140 mg/dL 글루코스의 정상 상태에 도달하기 위해 더 소량의 글루코스 주입량을 필요로 하는데, 이는 인슐린 저항성을 시사하는 것이다. 패널 A는 야생형 마우스 및 Mecp2tm1 . 1Bird / Y 마우스, 둘 모두에서 원하는 정상 상태 수준에 도달하는 데 필요한 전반적인 글루코스 주입 속도를 보여주는 것이고, 패널 B 및 C는 야생형 마우스 및 Mecp2tm1 . 1Bird / Y 마우스, 둘 모두의 백색 지방 조직 (WAT) 및 가자미근에서의 글루코스 흡수량을 보여주는 것이다. 본 데이터를 통해 Mecp2tm1 . 1Bird /Y 마우스가 인슐린 저항성이고, 대사 증후군을 앓는다는 것을 확인할 수 있었다. 특정 이론을 고수하고자 하지 않으면서, Mecp2tm1 . 1Bird /Y 마우스에서의 말초 지질의 과생산은 적어도 부분적으로는 관찰된 글루코스 대사 결손의 원인이 될 가능성이 있다.
실시예 6: 당뇨병 치료법 및/또는 지질 요법이 RTT 환자에게 미치는 효과
Mecp2tm1 . 1Bird /Y 마우스에서의 대사 기능장애를 보여주는 상기 실시예 5에 기술된 데이터를 고려하여, 대사 장애 치료에 사용된 요법이 미치는 효과에 대해 평가하였다. 구체적으로, 당뇨병 치료제인 메트포르민, LXR 효능제 T0901317, 및 미토콘드리아 언커플러 DNPME의 효과를 Mecp2tm1 . 1Bird / Y 마우스에서 평가하였다. 본 실시예에서는 Mecp2tm1 . 1Bird / Y 마우스에 대하여 도 6의 것을 비롯한, 상기 실시예 4에 기술된 프로토콜을 수행하고, 비히클, 메트포르민, LXR 효능제 T0901317, 또는 미토콘드리아 언커플러 DNPME 중 하나에 적용하였다.
본 실시예에서 사용된 작용제를 하기와 같이 제조하였다: 메트포르민 히드로클로라이드를 염수 (시그마(Sigma))에 용해시켰다. 주사 당일, 메트포르민을 18부 스톡 용액, 1부 DMSO, 및 1부 에탄올에 희석시켜 20 g 마우스에 바람직한 용량을 100 ul로 제공하였다. 용량 = 30 mg/kg, 복강내로 (IP) 주사. LXR 효능제 T0901317 (케이멘 케미칼즈(Caymen Chemicals)) 및 DNPME의 경우, 약물을 100% DMSO 중에 용해시킨 후, 멸균 염수 중 18부, 1부 스톡, 1부 에탄올에 희석시켰다. T090317이 최종 용량은 25 mg/kg으로, 이는 서브-Q 주사에 의해 전달되었고, DNPME의 경우는 5 mg/kg으로, 이는 IP로 전달되었다. 동물을 5주령째를 출발로 하여 10주령째가 될 때까지, 또는 5주 동안 처리하였다. 처리 전 5주령째를 출발로 하여 연구 종료시 10주령째를 종료로 매주 체중을 획득하였다. 도 9에는 처리 3주 후 (8주령째, 패널 A) 및 처리 5주 후 (10주령째, 패널 D) 체중이 제시되어 있다.
도 9는 비히클 투여와 비교하여 메트포르민 또는 T090317 투여가 Mecp2tm1.1Bird/Y 마우스에 미치는 결과를 보여주는 것이다. 메트포르민은 본 실시예에서 효과가 거의 없는 것으로 나타난 반면, 로타로드 및 오픈 필드 활동 검정에 의해 제시된 바와 같이, T090317은 운동 수행을 개선시켰다. 그러나, T090317은 말초 지방 측정값을 개선시키는 것으로 보이지는 않았다. 따라서, 특정 이론을 고수하고자 하지 않으면서, T090317에서 관찰된 개선은 전신 지질보다는 뇌 지질 (예컨대, 콜레스테롤)의 변경에 기인하는 것일 수 있다. 추가로, 메트포르민을 FDA가 권장하는 그의 1일 투약 스케줄에 따라 투여할 경우, 유의적인 효과를 발휘할 가능성도 있다.
DNPME는, ATP에 의한 에너지 생산을 글루코스로부터 언커플링시키고, 대신 지질이 사용될 수 있도록 허용하는 미토콘드리아 언커플러이다. 특정 이론을 고수하고자 하지 않으면서, Mecp2 기능장애 환자에게 DNPME를 투여하면, 체내에서 지질은 분해되고, 이로써, 뇌에서의 특정 지질 (예컨대, 콜레스테롤)의 이용가능성은 증가하게 되거나, 마우스는 에너지원으로서 글리코스보다는 지질을 사용할 수 있게 된다. DNPME의 미토콘드리아 언커플링 활성이 앞서 제시된 바 있지만 (문헌 [Perry RJ et al., Reversal of hypertriglyceridemia, fatty liver disease, and insulin resistance by a liver-targeted mitochondrial uncoupler, 2013, Cell Metabolism, 18: 740-748] 참조), 본 연구는 DNPME가 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 생합성의 상태에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다는 것을 최초로 나타낸다. 도 10에 제시되어 있는 바와 같이, DNPME를 투여한 결과, Mecp2tm1 . 1Bird /Y 마우스에 의한 로타로드 및 OFA 검정에서 수행은 유의적으로 개선되었다. 매일 투약하는 것이 더욱더 우수한 결과를 초래할 가능성도 있고, 예컨대, 스타틴 약물 또는 다른 치료학적 화합물과의 조합 요법이 또한 추가의 이익을 초래할 가능성이 있다.
본 실시예는 II형 당뇨병 및/또는 지질 침착을 치료하는 유효한 것으로 밝혀진 치료학적 화합물이 Mecp2-관련 질환, 장애, 또는 병증, 예컨대, 레트 증후군 치료를 위한 것으로 관심을 끄는 요법이 될 수 있다는 것을 제시한다.
요컨대, 상기 실시예를 통해 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사를 조절하는 작용제 또는 방식이 이전에는 알려지지 않았던 부류의 치료제로서, Mecp2-관련 질환, 장애 또는 병증, 예컨대, 레트 증후군을 치료하는 데 사용하기 위한 것을 나타낸다는 것이 명확하게 입증되고, 확인되었다. 다양한 실시양태에 따라, 상기 작용제는 Mecp2 기능장애를 앓는 대상체에서 운동 수행을 개선시키고, 지질 수준을 저하시키고, 수명을 연장시킬 수 있다.
다른 실시양태 및 등가물
통상의 기술자는 단지 통상의 실험만을 사용함으로써 본원에 기술된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 다수의 등가물을 이해하거나, 또는 그를 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 설명으로 제한되는 것으로 의도되지 않으며, 이는 하기 청구범위에 기재되는 바와 같다.

Claims (34)

  1. MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증 치료를 필요로 하는 대상체에게 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사를 조절하는 1종 이상의 작용제 또는 방식을 투여하는 단계를 포함하는, MECP2-관련 질환, 장애, 또는 병증을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 1종 이상의 작용제 또는 방식이 스타틴, LXR 조절제, 글루코스 대사 조절제, SREBP 조절제, PPARG 조절제, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 스타틴이 로바스타틴, 심바스타틴, 아토르바스타틴, 로수바스타틴, 및 플루바스타틴 중 하나 이상의 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, LXR 조절제가 옥시스테롤, LXR 효능제, 및/또는 RXR 효능제 중 1종 이상의 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, LXR 조절제가 히포콜라미드, T0901317, GW3965, SR9238, 22(R)-히드록시콜레스테롤, 24(S)-히드록시스테롤, 27-히드록시콜레스테롤, 콜레스텐산 및 벡사로텐 중 1종 이상의 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, 글루코스 대사 조절제가 비구아니드 약물 및 2,4-디니트로페놀-메틸 에테르 (DNP-ME) 또는 그의 유도체 중 1종 이상의 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 1종 이상의 비구아니드 약물이 메트포르민, 프로구아닐, 클로르프로구아닐로부터 선택되는 것인 방법.
  8. 제2항에 있어서, SREBP 조절제가 파토스타틴, N-(4-(2-(2-프로필피리딘-4-일)티아졸-4-일)페닐)메탄술폰아미드 (FGH10019), SREBP1, 및 SREBP2 중 1종 이상의 것인 방법.
  9. 제2항에 있어서, PPARG 조절제가 티아졸리딘디온인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 티아졸리딘디온이 로시글리타존, 피오글리타존, 트로글리타존, 네토글리타존, 리보글리타존, 및 시글리타존 중 1종 이상의 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 작용제 또는 방식이 1일 1회 이상 투여되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 작용제 또는 방식이 주 1회 이상 투여되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 작용제 또는 방식이 주 2회 이상 투여되는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 작용제 또는 방식이 피하로, 복강내로, 정맥내로, 또는 경구적으로 투여되는 것인 방법.
  15. 후보 치료제가 뇌에서의 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는, 레트 증후군 치료에 유용한 치료제를 확인하고/거나, 특징 규명하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면이 콜레스테롤 생합성인 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면이 3-히드록시-3-메틸-글루타릴-CoA 리덕타제 (HMGCR)의 억제인 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면이 스쿠알렌 모노옥시게나제의 억제인 것인 방법.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제가 지질 및/또는 콜레스테롤 대사의 하나 이상의 측면에 미치는 효과가 행동 검사, 인지 검사, 운동 기능 검사, 하나 이상의 생리학적 파라미터에 대한 검사, 및 그의 조합 중 하나 이상의 것을 통해 평가되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 행동 검사가 청각 놀람 반응 검사, 놀람 반응의 선행 자극 억제 검사, 오픈 필드 활동 검사, 3 챔버 사회적 상호작용 검사, 홈 케이지 활동(Home Cage Activity) 검사, 및/또는 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 제19항에 있어서, 운동 기능 검사가 로타로드 검사, 오픈 필드 보행 활동 검사, 디기게이트(DigiGait) 모니터링 시스템, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 하나 이상의 생리학적 파라미터에 대한 검사가 이중 X선 흡광 분석법 (DEXA) 검사, 메타콜린 유발을 이용한 전신 체적 변동 기록법 호흡 검사, 글루코스 부하 검사, 인슐린 부하 검사, 혈청 콜레스테롤 검사, 열량 측정 검사, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  23. 레트 증후군을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 스타틴을 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군을 치료하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 스타틴이 로바스타틴, 심바스타틴, 아토르바스타틴, 플루바스타틴, 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 스타틴이 1일 1회 이상 투여되는 것인 방법.
  26. 제23항 또는 제24항에 있어서, 스타틴이 주 1회 이상 투여되는 것인 방법.
  27. 제23항 또는 제24항에 있어서, 스타틴이 주 2회 이상 투여되는 것인 방법.
  28. 제23항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 스타틴이 피하로 또는 경구적으로 투여되는 것인 방법.
  29. 레트 증후군을 앓거나, 또는 그에 걸리기 쉬운 대상체에게 글루코스 대사 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 레트 증후군을 치료하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 글루코스 대사 조절제가 비구아니드 약물; 2,4-디니트로페놀-메틸 에테르 (DNP-ME), 2,4-디니트로페놀-에틸 에테르 (DNP-EE), 2,4-디니트로페놀-비닐 에테르 (DNP-VE), 또는 그의 유도체; 및 그의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 비구아니드 약물이 메트포르민, 프로구아닐, 클로르프로구아닐로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 대사 조절제가 주 1회 이상 투여되는 것인 방법.
  33. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 대사 조절제가 주 2회 이상 투여되는 것인 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 글루코스 대사 조절제가 피하로, 복강내로, 정맥내로, 또는 경구적으로 투여되는 것인 방법.
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