CN101583357B

CN101583357B - Mtor拮抗剂和血管生成抑制剂用于制备治疗癌症的药物的用途

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Publication number: CN101583357B
Application number: CN200780039570XA
Authority: CN
Inventors: 黄德鸿; 周嘉豪; 苏启智
Original assignee: National Cancer Centre of Singapore Pte Ltd
Current assignee: National Cancer Centre of Singapore Pte Ltd
Priority date: 2006-08-29
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2027-06-29
Also published as: CN101583357A; WO2008027013A2; WO2008027013A3

Abstract

提供了一种组合物，所述组合物包含一种为mTOR活性的拮抗剂的第一药剂，连同一种包含血管生成抑制剂的第二药剂。所述第一药剂可包含雷帕霉素，并且所述第二药剂可包含一种VEGF活性的抑制剂，如贝伐单抗(阿瓦斯汀)。这样的组合物可用于防止细胞或组织的生长和/或增殖。所述组合物还可用于治疗或预防癌症，例如肝细胞癌(HCC)。

Description

MTOR拮抗剂和血管生成抑制剂用于制备治疗癌症的药物的用途

技术领域

本发明涉及疾病的治疗和诊断方法，以及用于这些方法中的分子和组合物。

背景技术

肝癌(肝细胞癌，HCC)是全世界范围内第5大常见恶性肿瘤，并且是全球癌症死亡的第3大诱因(Ferley J，Bray F.Pisani P，Parkin DM.GLOBOCAN 2002：Cancer Incidence，Mortality and Prevalence Worldwide.IARC CancerBase No5 version 20.IARCPress，Lyon，France；2004)。

在新加坡男性中，肝细胞癌(HCC)已取代胃癌成为排序第3的癌症，在1998-2002年间占所有已确诊的癌症的8.1％(Seow A，K.W.，Chia KS，Shi LM，Lee HP，Shanmugaratnam K(2004).“Trends in Cancer Incidence in Singapore 1968-2002.”Singapore Cancer Registry(Report no.6))。在亚洲，仅中国就报道了约250,000个新病例/年，HCC是地方流行的。在全世界，它是癌症死亡的主要诱因(Bosch，F.X.，J.Ribes，et al.(2005).“Epidemiology of hepatocellular carcinoma.”Clin Liver Dis9(2)：191-211，v.)。甚至在像美国和欧洲这样HCC流行较低的国家，HCC的发病率也在上升(El-Serag，H.B.and A.C.Mason(1999).“Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States.”NEngl J Med 340(10)：745-50)。

在HCC的临床管理和治疗方面，存在重大的挑战。

超过90％的HCC是在晚期被诊断到的，经常伴有肝硬化。HCC一般表现出高度侵袭性的临床行为，并且大多数患者在诊断后的12个月内死亡(El-Serag HB.Hepatocellular carcinoma：an epidemiologic view.J Clin Gastroenterol 2002；35(5Suppl 2)：S72-8)。

一般而言，处于这种晚期疾病阶段的患者不应选择外科手术；在进行了外科手术切除的病例中，两年复发率仍高达50％(Nagasue N，Kohno H，Chang YC，Taniura H，Yamanoi A，Uchida M，et al.Liver resectionfor hepatocellular carcinoma.Results of 229 consecutive patients during11 years.Ann Surg 1993；217：375-84；Yamamoto J，Kosuge T，TakayamaT，Shimada K，Yamasaki S，Ozaki H，et al.Recurrence of hepatocellularcarcinoma after surgery.Br J Surg 1996；83：1219-22.)。

HCC是一种对化学疗法来说相对顽固的癌症。没有特别有效的单药剂或多药剂化学疗法。阿霉素是转移性HCC中最常用的化学疗法药剂，具有20％以下的反应率(response rate)(Johnson，P.J.，R.Williams，etal.(1978).“Induction of remission in hepatocellular carcinoma withdoxorubicin.”Lancet 1(8072)：1006-9)以及统计学上不显著的生存优势(survival advantage)。最近用3-药物的联合化学治疗和干扰素的试验结果显示20.9％的反应率和8.67个月的生存中值(Yeo，W.，T.S.Mok，et al.(2005).“A randomized phase III study of doxorubicin versuscisplatin/interferon alpha-2b/doxorubicin/fluorouracil(PIAF)combination chemotherapy for unresectable hepatocellular carcinoma.” J Natl Cancer Inst 97(20)：1532-8)。该方案与仅使用阿霉素的方案相比没有显示出更优的存活，并带来更大的毒性。

最近来自随机临床试验的结果已显示，标准的化疗方案对于延长HCC患者的存活仅有最小限度的作用(Yeo W，Mok TS，Zee B，LeungTW，Lai PB，Lau WY，et al.A randomized phase III study of doxorubicinversus cisplatin/interferon alpha-2b/doxorubicin/fluorouracil(PIAF)combination chemotherapy for unresectable hepatocellular carcinoma.JNatl Cancer Inst 2005；97：1532-38)。

除了肿瘤复发和转移外，在晚期HCC患者中腹腔积水是发病(morbidity)的另一个重要诱因，它通常是由于肝功能受损、门静脉堵塞和内皮细胞通透性增加所致。

因此，癌症研究领域所面临的突出挑战在于，鉴定新型的分子靶向的疗法来治疗HCC及其相关的共病。在HCC转移中很需要使用新药物的更加创新性疗法，或者现有药物的新方案。

发明内容

令人惊奇的是，已经发现一些分子(特别是血管生成抑制剂)，可与mTOR活性的拮抗剂或抑制剂结合使用，以在个体癌症治疗方面获得改良。具体而言，本文公开的结合物可用于治疗患有肝细胞癌(HCC)的个体，或者用于预防这种癌症的发病。

根据本发明的第一方面，我们提供了一种包含mTOR活性的拮抗剂的第一药剂和包含血管生成抑制剂的第二药剂的结合物。

所述第一药剂可包含mTOR转录、翻译、表达、合成或活性的抑制剂，或者所述第一药剂能够降低mTOR水平。

所述第一药剂可选自丁醇和雷帕霉素(rapamycin)。

所述第一药剂可选自RAD001(Novartis)和CCI-779(Wyeth)。

所述第一药剂可包含雷帕霉素(Sirolimusis)。

所述第二药剂可选自血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)、血小板反应素(thrombospondin)、干扰素、血小板因子4、催乳素16Kd片段、TIMP-1(金属蛋白酶1的组织抑制剂)、TIMP-2(金属蛋白酶2的组织抑制剂)、TIMP-3(金属蛋白酶3的组织抑制剂)或TIMP-4(金属蛋白酶4的组织抑制剂)、(Z，E)-3-(咪唑-4-基次甲基)吲哚-2-酮、(3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-吲哚-2-酮、(Z)-3-(2，4-二甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯--3-基)-丙酸、1，2-二巯基-3-硫酮衍生物、5-(2-吡嗪基)-1，2-二巯基-3-硫酮(ADT)、5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二巯基-3-硫酮(奥替普拉(Oltipraz))。

所述第二药剂可包含内皮细胞生长抑制剂，优选地选自考布他汀A4(combretastatin A4)、EMD121974、TNP470、角鲨胺(Squalamine)、考布他汀A4、沙利度胺(Thalidomide)和BMS-582664。

所述第二药剂可包含细胞外基质分解抑制剂，优选基质金属蛋白酶蛋白抑制剂，优选地选自Marimistat、AG3340、COL-3、新伐司他(Neovastat)和BMS-275291。

所述第二药剂可包含血管生成信号传递级联抑制剂，优选地选自干扰素α、SU5416、SU6668和PTK787/ZK 22584。

所述第二药剂可选自bFGF活性的抑制剂、bFGF拮抗剂、抗bFGF免疫球蛋白、抗bFGF抗体和抗bFGF单克隆抗体。

所述第二药剂可选自VEGF活性的抑制剂和VEGF拮抗剂。

所述第二药剂可选自抗VEGF免疫球蛋白、抗VEGF抗体、抗VEGF单克隆抗体和人源化的抗VEGF单克隆抗体。

所述第二药剂可包含贝伐单抗(Bevacizumab)(Avastin)。

所述第一药剂和所述第二药剂之一或两者都可以是药物组合物的形式，所述组合物包含所述药剂，连同可药用的载体、赋形剂或稀释剂。

所述第一药剂可以适宜于口服的形式提供，优选为片剂。

所述第二药剂可以适宜于静脉内给药的形式提供。

根据本发明的第二方面，提供了根据本发明第一方面的结合物用在治疗或预防个体中的疾病的方法中。

所述结合物可用在治疗或预防个体中的癌症的方法中。

所述结合物可以用于本发明所指定的用途，其中所述个体患有肝细胞癌(HCC)。

根据本发明的第三方面，我们提供了一种包含mTOR活性的拮抗剂的第一药剂，用在治疗或预防个体中的癌症(特别是肝细胞癌(HCC))的方法中，其中所述方法包括将mTOR活性的拮抗剂与包含血管生成抑制剂的第二药剂同时地或依次地给予。

根据本发明的第四方面，提供了一种包含血管生成抑制剂的第二药剂，用在治疗或预防个体中的癌症(特别是肝细胞癌(HCC))的方法中，其中所述方法包括将血管生成抑制剂与包含mTOR活性的拮抗剂的第一药剂同时地或依次地给予。

根据本发明的第五方面，我们提供了一种包含mTOR活性的拮抗剂的第一药剂在制备用于治疗或预防个体中的癌症(特别是肝细胞癌(HCC))的结合物中的用途，其中所述结合物包含一种包含血管生成抑制剂的第二药剂。

在第六方面中，本发明提供了一种包含血管生成抑制剂的第二药剂在制备用于治疗或预防个体中的癌症(特别是肝细胞癌(HCC))的结合物中的用途，其中所述结合物包含一种包含mTOR活性的拮抗剂的第一药剂。

所述第一药剂可具有任何所列出的特征；所述第二药剂可具有任何所列出的特征。

在本发明的第七方面中，提供的一种包含第一药剂和第二药剂的试剂盒，所述第一药剂包含mTOR活性的拮抗剂，所述第二药剂包含血管生成抑制剂。

所述第一药剂和所述第二药剂可以在不同的容器(container)中。所述第一药剂可具有任何所列出的特征；所述第二药剂可具有任何所列出的特征。

根据本发明的第八方面，我们提供了一种包含雷帕霉素和贝伐单抗的试剂盒。

所述试剂盒还包含用于指导将所述药剂给予一个个体以治疗或预防个体中的癌症(特别是肝细胞癌(HCC))的说明书。

根据本发明的第九方面，我们提供了一种制备所列出的结合物的方法，所述方法包括将一种包含mTOR活性的拮抗剂的第一药剂与一种包含血管生成抑制剂的第二药剂结合在一起。

所述mTOR活性的拮抗剂的存在量为可以提供约1mg/天至约10mg/天的剂量。

所述血管生成抑制剂的存在量为可以提供约5mg/kg/2周至约10mg/kg/2周或30-200mg/天的剂量。

根据本发明的第十方面，提供了一种治疗或预防个体中的癌症(特别是肝细胞癌(HCC))的方法，所述方法包括对一个个体给予一种包含mTOR活性的拮抗剂的第一药剂，并同时地或依次地给予一种包含血管生成抑制剂的第二药剂。

根据本发明的第十一方面，我们提供了一种防止细胞或组织的生长和/或增殖的方法，所述方法包括使所述细胞或组织与一种包含mTOR活性的拮抗剂的第一药剂和一种包含血管生成抑制剂的第二药剂接触。

所述方法可包括给予一个个体治疗上有效量的所列出的结合物。

所述mTOR活性的拮抗剂可以被以约1mg/天至10mg/天的频率给予。

所述血管生成抑制剂可以被以约5mg/kg/2周至约10mg/kg/2周或30-200mg/天的频率给予。

除非另外指出，本发明的实施将运用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些是本领域普通技术人员的能力所能及的。这些技术在文献中有说明。例如，参见J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，SecondEdition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.(1995 and periodic supplements；Current Protocols in MolecularBiology，ch.9，13，and 16，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNA Isolation and Sequencing：EssentialTechniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak and James O’D.McGee，1990，In Situ Hybridization：Principles and Practice；Oxford UniversityPress；M.J.Gait(Editor)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A PracticalApproach，Irl Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods ofEnzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis ofDNA Methods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：ALaboratory Manual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by EdHarlow(Editor)，David Lane(Editor)(1988，Cold Spring HarborLaboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855，Lars-Inge Larsson“Immunocytochemistry：Theory and Practice”，CRC Press inc.，BacaRaton，Florida，1988，ISBN 0-8493-6078-1，John D.Pound(ed)；“Immunochemical Protocols，vol 80”，in the series：“Methods inMolecular Biology”，Humana Press，Totowa，New Jersey，1998，ISBN0-89603-493-3，Handbook of Drug Screening，edited by RamakrishnaSeethala，Prabhavathi B.Fernandes(2001，New York，NY，MarcelDekker，ISBN 0-8247-0562-9)；Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use at the Bench，Edited JaneRoskams and Linda Rodgers，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3；和The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(17th Edition，Beers，M.H.，and Berkow，R，Eds，ISBN：0911910107， John Wiley&Sons)。这些一般性文本的每一篇都通过引用的方式纳入本文。

附图说明

图1示出贝伐单抗对皮下HCC异种移植物生长率的效应。按照材料和方法中所述将2-1318、26-1004、5-1318和2006异种移植物系经皮下植入至SCID小鼠中。对携带HCC异种移植物的小鼠每两周经腹腔内给予PBS或5mg/kg贝伐单抗，持续21天。处理开始于注入肿瘤细胞后第7天。按照材料和方法中所述对肿瘤的生长进行测量和计算。对PBS-处理的和贝伐单抗-处理的2-1318(A)、26-1004(B)、5-1318(C)和2006(D)异种移植物在给定时间的肿瘤体积进行作图并显示。通过ANOVA分析，治疗组中肿瘤重量和肿瘤体积的差异有p＜0.01的统计学显著性。实验重复至少3次，具有类似的结果。

图2示出贝伐单抗对HCC异种移植物中细胞周期调节基因的表达的效应。按照材料和方法中所述将2-1318异种移植物经皮下植入至SCID小鼠中。对携带HCC异种移植物的小鼠每两周经腹腔内给予PBS或5mg/kg贝伐单抗，持续21天。处理开始于注入肿瘤细胞后第7天。对来自载体处理肿瘤和贝伐单抗处理肿瘤的裂解物进行材料和方法中所述的蛋白印迹分析。将印迹与已标明的抗体孵育。示出了代表性的印迹。密度测量数据(倍数变化)显示于每组下方。从26-1004和30-1004异种移植物得到了类似的结果。实验重复至少3次，具有类似的结果。

图3示出贝伐单抗对腹腔内肿瘤负荷、肿瘤细胞向肝中扩散以及存活率的治疗效应。向雄性SCID小鼠腹腔中注入含5×10⁶个26-1004(Met)细胞的200μl PBS。将携带腹腔内肿瘤的小鼠随机分配并以200μl PBS(n＝14)或贝伐单抗(5mg/kg)(n＝14)每两周处理一次，持续标明的时间。每周监测3次存活率。在小鼠濒死时将其处死并进行尸检。所示为在接种26-1004(Met)细胞后第30-36天时的代表性的PBS-处理小鼠和贝伐单抗-处理的小鼠(A)以及PBS-处理的小鼠和贝伐单抗-处理的小鼠腹腔中的网膜肿瘤(B)，肿瘤块在肝中的扩散(C)。用Kaplan-Meier方法评估并显示存活率(D)。可发现，贝伐单抗通过抑制腹水形成、肿瘤扩散并降低腹腔内肿瘤负荷，显著延长了IP小鼠的存活期(p＜0.01)。箭头指示肿瘤。实验重复至少3次，具有类似的结果。

图4示出阿瓦斯汀(Avastin)、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素对5-1318、2006、2-1318和26-1004HCC异种移植物的肿瘤生长的效应。按照材料和方法中所述将所标明的异种移植物经皮下植入雄性SCID小鼠的右侧。将这些小鼠随机分配至4个处理组(n＝14)中的一个组，并且按照材料和方法中所述用载体、阿瓦斯汀(5mg/kg)、雷帕霉素(1mg/kg)或雷帕霉素(1mg/kg)结合阿瓦斯汀(5mg/kg)处理21天。所示为所标明的HCC异种移植物系的代表性的肿瘤样品。

图5示出阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素对HCC异种移植物的生长率的效应。按照材料和方法中所述将2-1318和26-1004异种移植物系经皮下植入至雄性SCID小鼠的右侧。将携带HCC异种移植物的小鼠用载体、阿瓦斯汀(5mg/kg)、雷帕霉素(1mg/kg)或雷帕霉素(1mg/kg)加阿瓦斯汀(5mg/kg)处理21天。处理开始于肿瘤细胞注入后第3天。按照材料和方法中所述对肿瘤生长进行测量和计算。肿瘤的生长如材料和方法中所述进行测量和计算。对PBS-、阿瓦斯汀、雷帕霉素或阿瓦斯汀结合雷帕霉素处理的2-1318(A)和26-1004(B)异种移植物在给定时间的肿瘤体积进行作图并显示。通过ANOVA分析，治疗组中的肿瘤体积差异是统计学显著的(p＜0.01)。实验重复至少3次，具有类似的结果。

图6示出阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素对HCC异种移植物中mTOR、p70S6激酶、S6R和4E-BP1(A)的磷酸化以及细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B1、Cdk-2、Cdk-4、p27和pRb(B)的水平的效应。按照材料和方法中所述将2006异种移植物经皮下植入至雄性SCID小鼠的右侧。按照材料和方法中所述将携带2006异种移植物的小鼠用载体、阿瓦斯汀(5mg/kg)、雷帕霉素(1mg/kg)或雷帕霉素(1mg/kg)加阿瓦斯汀(5mg/kg)进行处理。对来自载体-处理的肿瘤和药物-处理的肿瘤的裂解物进行材料和方法中所述的蛋白印迹分析。将印迹与标明的抗体孵育。示出了代表性的印迹。从2-1318、5-1318、26-1004和30-1004异种移植物得到了类似的结果。实验重复至少3次，具有类似的结果。

图7示出阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素对腹腔内肿瘤负荷、肿瘤细胞向肝脏中的扩散以及存活率的治疗效应。按照材料和方法中所述向雄性SCID小鼠腹腔中注入含5×10⁶个26-1004(Met)细胞的200μl PBS。按照材料和方法中所述将小鼠用载体、阿瓦斯汀(5mg/kg)、雷帕霉素(1mg/kg)或雷帕霉素(1mg/kg)结合阿瓦斯汀(5mg/kg)处理4-6周。在小鼠濒死时将其处死并进行尸检。所示为在接种26-1004(Met)细胞后第30-36天时的代表性的PBS-处理的小鼠和药物-处理的小鼠以及PBS-处理的小鼠和药物-处理的小鼠的腹腔中的网膜肿瘤(A)，肝脏中肿瘤块的扩散(B)。用Kaplan-Meier方法评估存活率并示出(C)。可发现，虽然对照组、阿瓦斯汀组和雷帕霉素组中的所有小鼠分别于第48、120和118天时濒死，但是阿瓦斯汀加雷帕霉素显著延长了IP小鼠的存活期(p＜0.01)，所有小鼠在第125天时仍存活。

图8所示为通过阿瓦斯汀加雷帕霉素疗法使IP小鼠中的腹水蓄积反转。按照材料和方法中所述给小鼠注射26-1004(Met)HCC异种移植物。对于治疗实验，从所述对照26-1004(Met)IP小鼠将腹水部分地排出。将它们分成载体-处理组(n＝14)以及雷帕霉素(1mg/kg)加阿瓦斯汀(5mg/kg)处理组(n＝14)。可发现，所述对照腹腔内小鼠很快形成腹水并变成了恶病质的(cachectic)。所述阿瓦斯汀-雷帕霉素组在治疗7天后没有腹水形成的迹象，并且在处理后第14天完全恢复。

图9所示为来自患者肿瘤的肝细胞癌(HCC)、原发异种移植物和细胞系的组织切片。

所有切片均经苏木精和伊红(H&E)染色，并由两位有资质的病理学家(MST和TPH)评估。(a)和(d)：系2-1318，来自确立的异种移植物(a)和原发患者肿瘤(d)，以200×的放大率。两种肿瘤都显示相同的窦状模式(sinusoidal pattern)。(b)和(e)：系26-1004，来自确立的异种移植物(b)和原发患者肿瘤(e)，以200×的放大率。两种肿瘤都包含具有局灶性窦状模式的肿瘤细胞片。(e)中出现了坏死。(c)和(f)：系2006，来自确立的异种移植物(c)和原发患者肿瘤(f)，以200×的放大率。两种肿瘤都包含具有联合的窦状模式且组织学分级相对低(1级)的肿瘤细胞。(g)：系30-1004，来自确立的异种移植物，以200×的放大率。该肿瘤细胞显示出特征性的肝样细胞学和中度的组织学分级(2级)。(h)：细胞系PLC/PRF/5。所示为200×的放大率下的异种移植物肿瘤，包含具有高度压缩的血管纤维核心(fibrovascular core)和坏死区域的固体片状肿瘤细胞。没有出现不同的肿瘤血管。(i)：细胞系HepG2。所示为200×的放大率下的异种移植物肿瘤，包含由细小窦状小管分开的肿瘤细胞的巢和腺泡，所述窦状小管中的一些是扩张的，包含红细胞。

图10所示为mTOR信号传递途径在HCC中的激活。

(A)通过蛋白质印迹法对5个独立的正常(N)和肿瘤(T)HCC对进行分析，使用的是针对该mTOR信号传递途径的组分(mTOR、p70S6K、RPS6和4EBP1)的总抗体和磷酸化特异性抗体。与相邻的非恶性的正常组织相比，HCC肿瘤表现出磷酸化的p70 S6K(Thr421/Ser424)、磷酸化的RPS6(Ser235/236和Ser 240/244)和总4EBP1(具有符号^＊的图)的表达水平的升高。

(B)对HCC中的PTEN和磷酸化的RPS6(Ser 235/236)的免疫组织化学分析。上部的图显示来自4个不同HCC患者的非恶性的本底肝脏样品，这些样品被抗PTEN的抗体(最左边两个格)和抗磷酸化RPS6的抗体(最左边两个图)染色。下部的图显示相应的HCC肿瘤。

(C)使用针对该mTOR信号传递途径的组分的总抗体和磷酸化特异性抗体对HCC异种移植物进行蛋白印迹分析。与原发性肿瘤类似，大多数异种移植物显示了可探测的磷酸化的p70 S6K(Thr421/Ser424)、磷酸化的RPS6(Ser235/236和Ser 240/244)和总4EBP1(具有符号^＊的图)的表达。系5-1318(1)与其他的系相比出现RPS6磷酸化的降低，并且对RAPA的敏感性比对2-1318、26-1004和2006的稍微低(数据未显示)。

图11示出RAPA、BEV和RAPA/BEV对HCC异种移植物的表型效应。

(a)对肿瘤总体形态和大小的效应。所示为HCC异种移植物系2-1318、5-1318(3)、2006和26-1004的代表性的剥离出的肿瘤。将异种移植物随机分配至4个处理组(每组n＝14)中的一个，并用载体(对照)、RAPA(1mg/kg)、BEV(5mg/kg)或结合的RAPA/BEV处理。所有处理起始于肿瘤细胞注入3天后。

(b)对生长率的效应。所示为用载体(对照)、RAPA(1mg/kg)、BEV(5mg/kg)或RAPA/BEV处理21天的过程中异种移植物系2-1318和26-1004的肿瘤生长率。通过ANOVA分析，处理组中肿瘤体积的差异是统计学上显著的(p＜0.01)。实验重复至少3次，具有类似结果。

图12示出HCC异种移植物中RAPA、BEV和RAPA/BEV的分子效应。

(a)使用针对mTOR途径的组分(mTOR、p70S6激酶、S6R和4E-BP1)和细胞周期组分(细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B1、Cdk-2、Cdk-4)的总抗体和磷酸化特异性抗体进行系2006的蛋白质印迹分析。与对照组和单处理组相比，所述结合的RAPA/BEV的处理使磷酸化的p70 S6K(Thr421/Ser424)和磷酸化的RPS6(Ser235/236和Ser 240/244)的水平产生了更大的减少。细胞周期蛋白D1的下调仅出现于结合处理组，而没有出现在单处理组中。从异种移植物系2-1318、5-1318(3)、26-1004和30-1004得到了类似的结果(数据未显示)。实验重复至少3次，具有类似的结果。

(b)VEGF(左图)和CD31(右图)表达的免疫组织化学分析。对于VEGF，最大的VEGF下调出现在所述结合处理组中。对于CD31，CD31阳性染色的血管数目的最大减少出现在所述结合处理组中。从异种移植物系2-1318、5-1318(3)、26-1004和30-1004得到了类似的结果(数据未显示)。实验重复至少3次，具有类似的结果。

图13示出RAPA、BEV和RAPA/BEV在原位肝内肿瘤、腹腔转移和腹水中的治疗效应。向雄性SCID小鼠的腹腔中注入26-1004细胞，随后用载体(对照)、RAPA(1mg/kg)、BEV(5mg/kg)或RAPA/BEV处理4-6周。

(A)粗解剖显示出对照小鼠和处理小鼠的腹腔中的网膜肿瘤(箭头)，以及对照的处理动物中肿瘤细胞向小鼠肝脏的扩散。未处理的小鼠呈现腹部肿胀和腹水蓄积。

(B)肝脏内肿瘤生长。通过用人特异性EGFR抗体进行免疫组织化学染色检测肿瘤。所示为代表性的样品。在以下动物中出现肝内肿瘤：14只对照模拟物处理小鼠中的14只(100％)，14只BEV或RAPA处理的小鼠中的2只(14.2％)，以及14只RAPA/BEV处理的小鼠中的0只(0％)。A和B中的图像时在接种26-1004细胞后第30-36天拍摄。

(C)Kaplan Meier生存分析。虽然对照组、RAPA处理组和BEV处理组中的所有小鼠分别在第48、120和118天濒死，但RAPA/BEV结合物处理的小鼠呈现显著延长的总存活期(p＜0.01，时序检验)，并且在第125天时仍都存活。

图14所示为原代HCC异种移植物的基因组谱

(a)阵列-CGH基因组拷贝数分析：基因组DNA分离自5对HCC异种移植物和与之关联的原代患者肿瘤(2-1318、5-1318(1)、2006、26-1004(cirr)和30-1004)，在Agilent 185K微阵列上对所述基因组DNA作谱，以确定基因组区的增加或减少。所示为所有染色体的基因组范围的拷贝数谱，拷贝数增加的区域表示为随y-轴的升高，拷贝数减少的区域表示为随y-轴的降低。异种移植物谱表示为红色，而原代肿瘤谱表示为蓝色。几个十分相似的区域由黑色箭头指示出(如系5-1318(1)的染色体1)。对在异种移植物和原代HCC中出现的特异性扩增和缺失的详细研究将在别处给出。

(b)使用前800条最高度变化的阵列探针，通过无监督的平均连锁层次聚类算法将HCC异种移植物(红色)、原代HCC肿瘤(蓝色)和HCC细胞系(绿色)的基因表达谱聚类。在热图(heat-map)中的颜色为红色(高表达)和绿色(低表达)。所述HCC异种移植物与所述原发性肿瘤掺杂在一块，并且在多种情况下，异种移植物与其同源的原发性肿瘤最紧密相关(如26-1004(cirr)和30-1004)。

图15所示为RAPA、BEV和RAPA/BEV处理的基因表达谱

a)RAPA/BEV诱导了基因表达的改变。将3个独立的异种移植物系(2-1318、5-1318(3)和26-1004)用RAPA/BEV处理，随后对表达进行作谱。在对照和RAPA/BEV处理的肿瘤的所有3个系中均受到共同调控的基因是经具有用于多假设的BH校正的配对t检验(paired t-test withBH correction for multiple hypotheses)鉴定的。148个显著的基因(p＜0.05)显示在热图直方图中，该直方图中红色表示高表达，绿色表示低表达(在a)-c)中比例棒相同)。将基因归至两个类中：I-仅在RAPA中受调节，II-调节是RAPA/BEV特异性的。

b)和c)RAPA和BEV诱导了基因表达的改变。在仅RAPA(b)和BEV(c)处理中比较所述148个RAPA/BEV调节的基因。约70％的基因(基因小类I)也在仅RAPA中被调节，并且有较少部分也在BEV中被调节。

d)对RAPA/BEV和RAPA调节的基因的比较。在RAPA/BEV处理和仅RAPA处理之间比较所述148个RAPA/BEV调节的基因的表达水平。在小类I中的多个基因(＞20)在RAPA/BEV和RAPA之间是显著不同的(P＜0.05，Y.K.数据未显示)。小类II中的基因的表达水平在RAPA/BEV处理和仅RAPA处理之间显示出明显的不同。需注意，d)的比例棒不同于a)-c)。

图16示出BEV、RAPA和BEV加RAPA对处死时的肿瘤的效应。按照材料和方法中所述将5-1318异种移植物系经皮下植入SCID小鼠中。将携带HCC异种移植物的小鼠每天经腹腔内给予200μl盐水(载体/对照)、0.8mg BEV/kg、1mg RAPA/kg或200μl的BEV/RAPA混合物(它提供每天每kg体重0.8mg BEV和1mg RAPA)。处理开始于肿瘤植入7天后当所述肿瘤约100mg时，并继续进行两周。所示为载体、BEV、RAPA和BEV加RAPA处理的5-1318异种移植物的肿瘤(A)和处死时的肿瘤重量(B)。实验重复至少3次，具有类似的结果。

图17示出RAPA、BEV和RAPA/BEV对mTOR的下游靶标的效应。按照材料和方法中所述将5-1318异种移植物经皮下植入SCID小鼠中。将携带HCC异种移植物的小鼠每天经腹腔内给予200μl盐水(载体/对照)、0.8mg BEV/kg、1mg RAPA/kg或200μl的BEV/RAPA混合物(它提供每天每kg体重0.8mg BEV和1mg RAPA)。系5-1315的蛋白印迹分析使用的是针对mTOR途径的组分(p70S6激酶、S6R和4E-BP1)的磷酸化特异性抗体。RAPA可下调Ser70处的磷酸化的4EBP1、Thr421/424处的p70S6和Ser 235/236处的S6R。与对照组和单处理组相比，所述结合的RAPA/BEV处理使Ser37/46处的磷酸化的4EBP1的水平产生更大程度的减少。

图18示出RAPA、BEV和RAPA/BEV对细胞周期调节基因的效应。按照材料和方法中所述将5-1318异种移植物系经皮下植入SCID小鼠中。将携带HCC异种移植物的小鼠每天经腹腔内给予200μl盐水(载体/对照)、0.8mg BEV/kg、1mg RAPA/kg或200μl的BEV/RAPA混合物(它提供每天每kg体重0.8mg BEV和1mg RAPA)。系5-1315的蛋白印迹分析使用的是细胞周期组分(p21、p27、cdc-2、存活素(survivin)、细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白B1、Cdk-2、Cdk-4和p130/Rb2)。在所述结合的处理组中出现了p21和cdk-2的下调，以及p130/Rb2的上调。

具体实施方式

本发明是基于下述的意外发现，即通过在个体中抑制mTOR活性连同血管生成，有可能治疗或预防癌症特别是肝细胞癌(HCC)。我们已经发现，使用能够拮抗mTOR的药剂和血管生成抑制剂可有效治疗个体中的癌症、新生物(neoplasm)和肿瘤。

我们已经证实，肿瘤组织的生长受雷帕霉素(一种mTOR的抑制剂)和贝伐单抗(一种血管生成抑制剂)的结合物抑制，其程度显著大于雷帕霉素或贝伐单抗的单独疗法。

我们证实了，所述结合物对肿瘤生长的降低与mTOR途径组分的改变、VEGF水平的降低和肿瘤微血管密度(MVD)有关。再者，在一种原位环境(orthotopic setting)中，雷帕霉素/贝伐单抗的结合物能够抑制肝脏内的肿瘤生长和腹腔内的肿瘤生长，降低腹水水平，并且显著地延长小鼠的存活期。

因此，所述结果可证实，一种能够拮抗mTOR的药剂连同一种血管生成抑制剂的结合物(以雷帕霉素/贝伐单抗的结合物为代表)可有效治疗特别是与肝细胞癌(HCC)相关的癌症、新生物和肿瘤。

我们还发现，一种能够拮抗mTOR活性的药剂与一种血管生成抑制剂相结合的结合物能够阻止或减缓细胞增殖。

我们描述了治疗患有癌症(特别是肝细胞癌(HCC))的个体的方法，包括给予(同时地或者以任意的次序依次地)药学有效量的一种能够拮抗mTOR活性的药剂和一种血管生成抑制剂。

药学有效量或治疗有效量是能在动物、人或个体中获得所需效应的组合物量。实际的量将依赖于多种因素而有所变化，这是本领域技术人员已知的。使用本文给出的教导和本领域的知识，对药学有效量的确定是普通医师的能力所能及的。为具体应用而设计的药学有效量可包装成单位剂量，以有利于给药。

术语“治疗”是指成功地治疗或减轻损伤、病理或病症的任意标志，包括任意的客观参数或主观参数例如减轻；缓和；减少症状或者使得患者更能忍受损伤、病理或病症；减缓退化或衰弱的速率；使得退化终点的虚弱减轻；提高患者的体质或精神健康；或者在某些情况下预防癌症的发作。

症状的治疗或改善可以基于客观参数或主观参数，包括体检的结果、实验室试验、活组织检验结果、生物化学谱等。例如，本文描述的方法和组合物可通过提高患者的健康以及/或者减缓或阻止衰弱的速率或程度，用于治疗他体内的癌症、肿瘤或新生物。

基因表达中的“表达”在本文中是指，转录和翻译一个基因以产生基因产物(为其RNA或蛋白质)的过程。因此，表达的抑制可发生在多个水平中的任意一个或多个，所述多个水平包括转录、转录后加工、翻译、翻译后修饰等。调节基因表达——包括转录或翻译——的药剂包括，例如下调或敲除内源基因的药剂；包括在可生成全动物或动物的一部分的多能细胞中敲除基因的药剂。

mTOR或VEGF“合成或活性”的抑制根据情况是指在蛋白水平抑制mTOR或VEGF，以阻止或下调所述蛋白质的产生或者已产生的蛋白质的至少一种生物活性。

结合物

作为一种mTOR活性的拮抗剂的所述第一药剂和包含一种血管生成抑制剂的所述第二药剂可被同时地给予，即在相同的时间。为此，可给予两种药剂的混合物，或者可在相同的时间将单独的第一药剂与单独的第二药剂一起给予个体。

可给予包含两种药剂的组合物以实现同时给药，或者在相同的时间将一个包含所述第一药剂且另一个包含所述第二药剂的单独的组合物给予个体。

所述第一药剂和所述第二药剂可被依次给予，即在不同的时间。可给予一种药剂，随后给予另一种。可依次给予所述药剂或每种药剂。所述药剂可能会是交替的，或者可以以相同剂量或不同剂量连续给予两次或多次相同的药剂。因此，我们给出例如A1-A2、A2-A1、A1-A2-A1、A2-A1-A2、A1-A2-A1-A2、A2-A1-A2-A1等的方案，其中A1是所述第一药剂，A2是所述第二药剂。其他的组合当然也是可能的。

在所有情况下，所述药剂的给药均可通过相同的或不同的途径。例如，所述第一药剂可通过经口途径给予。所述第二药剂可通过静脉内途径给予。

癌症的治疗

本文描述的方法和组合物适宜于使得实施治疗的个体中的一个可测量的判据与没有接受所述治疗的个体相比得到提高。

为此，可指定多种的判据，这些判据可反映患者的健康或癌症的进展。有用的判据可包括肿瘤大小、肿瘤尺寸、肿瘤的最大尺寸、肿瘤数目、肿瘤标记物的存在(例如甲胎蛋白)、转移的程度或数目等。

因此，作为一个实例，所治疗的个体可显示肿瘤大小或数目的减小或减少，这可通过合适的测定或试验测得。例如，所治疗的个体与没有被治疗的个体相比，可显示在以下方面减小或减少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高：特定肿瘤的肿瘤大小和/或肿瘤数目。

在某些实施方案中，所述治疗的效应适宜于用标准试验进行定量，所述标准试验例如由Response Evaluation Criteria in Solid Tumours(RECIST)Committee提出的国际标准，如Therasse，P.，S.G.Arbuck，etal.(2000)“New guidelines to evaluate the response to treatment in solidtumors.European Organization for Research and Treatment of Cancer，National Cancer Institute of the United States，National Cancer Instituteof Canada.”J Natl Cancer Inst 92(3)：205-16中详述的。

在另外的实施方案中，所述治疗的效应可通过以下临床试验(实施例E1至E8)中描述的给药方案和测试方案进行定量。因此，对所述治疗效应的评估可以使用实施例E8：效应的测量中所列的一种或多种方案(优选所有)进行。在这种情况下，所述治疗可产生部分反应(PR)或完全反应(CR)。

虽然上述的对照已被描述为没有接受治疗的个体，但在某些情况下，更合适的对照可以是接受治疗之前的所述患者本身。

对于本文而言，术语“癌症”可包含以下的任意一种或多种：急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、肾上腺皮质癌、肛门癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑肿瘤、乳房癌、女性生殖系统的癌症、男性生殖系统的癌症、中枢神经系统淋巴瘤、子宫颈癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童肉瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性髓细胞样白血病(CML)、结肠和直肠癌、结肠癌、子宫内膜癌、子宫内膜肉瘤、食道癌、眼癌、胆囊癌、胃癌、胃肠道癌、毛细胞性白血病、头颈癌、肝细胞癌、何杰金病(Hodgkin’s disease)、下咽癌、卡波氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、肾癌、喉癌、白血病、白血病、肝癌、肺癌、恶性纤维组织细胞瘤、恶性胸腺瘤、黑色素瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经系统癌症、神经母细胞瘤、非何杰金淋巴瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、呼吸系统、视网膜母细胞瘤、唾液腺癌、皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、胃癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、泌尿系统癌症、子宫肉瘤、阴道癌、血管系统、Waldenstrom氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)和肾母细胞瘤(Wilms’tumor)。

mTOR

术语mTOR用于本文中时，应被认为是指具有登记号NM_004958.2、P42345或NP_004949，特别是NM_004958.2的多肽序列。

优选地，mTOR是指人的序列。因此，该术语所涵盖的具体的同系物包括人的同系物，例如登记号NM_004958.2、NP_004949、Hs.509145。然而，该术语还涵盖与mTOR同源的其他肽，例如来源自其他物种(包括其他哺乳动物)的多肽。例如，可包括登记号为NM_020009.1、NP_064393、Mm.21158、Q9JLN9、AAF73196和AF152838的mTOR的小鼠同系物。mTOR的牛同系物和大鼠同系物也是已知的(登记号分别是NM_174319和NM_019906)。

mTOR也被称为FKBP12-雷帕霉素复合体-相关蛋白1、FRAP1、FK506-结合蛋白12-雷帕霉素复合体-相关蛋白1、FRAP、FRAP2、雷帕霉素的哺乳动物靶标和RAFT1。

优选地，mTOR包括这种核苷酸序列的片段、同系物、变体和衍生物。本文使用的术语“变体”、“同系物”、“衍生物”或“片段”包括从或向一种mTOR核苷酸序列的序列中任意取代、变异、修饰、置换、缺失或插入一个(或多个)核酸。除非上下文中另外说明，否则提及“mTOR”包括mTOR的这种变体、同系物、衍生物和片段。这些在下文中有更详细的描述。

优选地，所得的核苷酸序列编码具有mTOR活性的多肽，优选地至少具有与上文提及的人mTOR相同的活性。优选地，术语“同系物”意在涵盖与结构和/或功能相关的同一性，使得所得的核苷酸序列编码具有mTOR活性的多肽。就序列同一性(即相似性)而言，优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％的序列同一性。更优选至少95％，更优选至少98％的序列同一性。这些术语还涵盖所述序列的等位基因变异体。

以下对mTOR(指的是FRAP)的描述由Online MendelianInheritance in Man网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi？id＝601231)提供。

FKBP12-雷帕霉素相关蛋白(FRAP)是涉及细胞周期进程、DNA重组和DNA损伤检测的蛋白质家族中的一个成员。在大鼠中，它是一种245-kD的蛋白质(记作RAFT1)，与酿酒酵母蛋白TOR1显著同源，并且已经被证明以依赖于雷帕霉素的方式与亲免素(immunophilin)FKBP12(186945)关联(Sabatini et al.，1994)。Brown et al.(1994)注意到，在酵母中以及多个细胞类型中，已知FKBP12-雷帕霉素复合体可通过干扰G1进程中涉及的丝裂信号传导通路，来抑制整个G1细胞周期阶段的进程。这些作者声称，FRAP和FKBP12-雷帕霉素的结合与这些配体抑制细胞周期进程的能力有关。

雷帕霉素是一种有效的抑制实体瘤的抗癌剂。在低氧环境中，实体瘤块的增大依赖于促分裂原和营养物的募集。当营养物(特别是那些必需氨基酸)的浓度变化时，雷帕霉素(mTOR/FRAP)的哺乳动物靶标在控制核糖体生物生成和细胞生长的调节路径中发挥作用。在细菌中，核糖体的生物生成受氨基酸和ATP独立地调节。Dennis等人(2001)证明了，人的mTOR通路受ATP的胞内浓度影响，而不依赖于氨基酸的丰度，并且mTOR/FRAP本身是ATP传感器。

Castedo et al.(2001)描述了因以下条件引起的凋亡通路，即人类免疫缺陷病毒(HIV)-1包膜糖蛋白(Env)诱导的合胞体的体外和体内形成。免疫组织化学分析证明，在来自HIV-1-阳性而非HIV-1-阴性的供体的淋巴结的顶端明区(apical light zone)(T细胞区)中的以及外周血单核细胞中的合胞体中存在ser15被磷酸化的p53(191170)以及前凋亡标记物组织型转谷氨酰胺酶(TGM2；190196)。这些标记物的存在与病毒载量(viral load)(HIV-1 RNA水平)有关。定量的免疫印迹分析已表明，响应于HIV-1 Env而产生的p53的ser15的磷酸化受FRAP介导而不受其他磷脂酰肌醇激酶相关的激酶介导，并伴随有蛋白磷酸酶2A的下调(见176915)。所述磷酸化可被雷帕霉素显著地抑制。免疫荧光显微术表明，FRAP在合胞核内富集，并且所述核蓄积发生在p53的ser15的磷酸化之前。Castedo等人(2001)的结论是，HIV-1 Env-诱导的合胞体形成会导致经由以下通路的凋亡，即该通路涉及利用FRAP对p53的ser15进行的磷酸化，随后是BAX(600040)的活化、线粒体膜的透化、细胞色素C的释放和半胱氨酸蛋白酶(caspase)的活化。

Fang等人(2001)将磷脂酸鉴定为mTOR信号传递的关键组分。在他们的研究中，哺乳动物细胞的有丝分裂刺激导致了细胞磷脂酸的依赖于磷脂酶D的蓄积，所述磷脂酸是mTOR下游效应物的活化所必需的。磷脂酸直接与雷帕霉素所靶向的mTOR中的结构域相互作用，并且该相互作用与mTOR激活下游效应物的能力正相关。mTOR信号传递中涉及磷脂酸表明，该脂质在信号转导和蛋白合成中的重要作用，以及mTOR和促分裂原之间的直接联系。Fang等人(2001)的结论是，他们的研究表明了免疫抑制药雷帕霉素的体内作用的潜在机制。

Kim等人(2002)和Hara等人(2002)报道了mTOR可与RAPTOR(607130)结合，RAPTOR是一种在mTOR通路中至少有2种功能的进化保守的蛋白。Kim等人(2002)证明了，RAPTOR在营养物刺激的信号传递中对下游效应物S6K1(601684)、细胞大小的保持和mTOR蛋白表达有积极作用。RAPTOR与mTOR的联合还会负调节mTOR激酶活性。抑制所述通路的条件——例如营养物剥夺和线粒体解偶联——可稳定所述mTOR-RAPTOR联合体，并抑制mTOR激酶活性。Kim等人(2002)提出，RAPTOR是所述mTOR通路的一个组分，所述RAPTOR——通过与mTOR联合——响应于营养物水平细胞大小。

Hara et al.(2002)已证明，RAPTOR与mTOR的结合是mTOR催化的4EBP1(602223)的体外磷酸化所必需的，并且它强烈地增强mTOR对p70-α(S6K1)的激酶活性。雷帕霉素或氨基酸的消除增加了4EBP1和RAPTOR在7-甲基-GTP琼脂糖上的回收率，而胰岛素强烈地抑制该回收率。RNA干扰对RAPTOR表达的部分抑制减少了mTOR-催化的4EBP1体外磷酸化。对秀丽线虫(C.elegans)Raptor的RNA干扰产生一系列的表型，所述表型与将CE-Tor失活所产生的表型十分类似。因此，这些作者得出这样的结论，即RAPTOR是mTOR-催化的4EBP1磷酸化的必要支架，并在体内介导TOR的作用。

Vellai et al.(2003)证明了，秀丽线虫中的TOR缺乏使其自然寿命增加超过一倍。缺少Let363/TOR活性导致发育停止在L3幼虫阶段。在摄氏25.5度下，Let363突变体的平均生命期是25天，不同于野生型线虫的10天的生命期。

亨廷顿病(HD；143100)是一种由多聚谷氨酰胺序列延长引起的遗传的神经退行性障碍，其中延长的多聚谷氨酰胺蛋白质在细胞内聚集体中非正常地积聚。Ravikumar等人(2004)证明，在细胞模型、转基因小鼠和人脑中，雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶标在多聚谷氨酰胺聚集体中是多价螯合的(sequestered)。mTOR的多价螯合会损伤它的激酶活性并诱导自体吞噬，该自体吞噬是突变体亨廷顿片段的关键清除通路。这可防护多聚谷氨酰胺毒性，这是因为所述特异性mTOR抑制剂雷帕霉素减少HD的细胞模型中的亨廷顿蓄积和细胞死亡，并且对自体吞噬的抑制具有相反的作用。再者，雷帕霉素在HD果蝇(fly)模型中防护了神经退行，并且雷帕霉素类似物CCI-779在HD小鼠模型中提高了在4个不同行为任务上的表现并减少了聚集体的形成。这些数据提供了以下原理的证据，即诱导自体吞噬以治疗HD的潜力。

Moore等人(1996)通过荧光原位杂交(FISH)将FRAP基因指定至1p36。Lench等人(1997)通过下述方式将FRAP基因定位至1p36.2：先进行FISH，随后对该大体区域进行放射杂交作图。染色体1p36.2是在神经母细胞瘤中始终缺失的区域。考虑到PIK-相关的激酶蛋白在DNA修复、重组和细胞周期检查点中的作用，这些作者建议研究FRAP在1p36缺失的实体瘤中的可能功能。Onyango等人(1998)确认了所述1p36区——端粒至着丝粒——中的基因顺序为CDC2L1(176873)--PTPRZ2(604008)--ENO1(172430)--PGD(172200)--XBX1(604007)--FRAP2(FRAP1)--CD30(153243)。

对mTOR的详细描述参见Beugnet，et al.J.Biol.Chem.278(42)，40717-40722(2003)；Kristof，et al.，J.Biol.Chem.278(36)，33637-33644(2003)；Chen，Y.，et al.，Oncogene 22(25)，3937-3942(2003)；Garami，etal.，Mol.Cell 11(6)，1457-1466(2003)；Nojima，et al.，J.Biol.Chem.278 (18)，15461-15464(2003)；Kimura，et al.，Genes Cells 8(1)，65-79(2003)；McMahon，et al.，Mol.Cell.Biol.22(21)，7428-7438(2002)；Tee，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(21)，13571-13576(2002)；Hudson，et al.，Mol.Cell.Biol.22(20)，7004-7014(2002)；Choi，et al.，EMBO Rep.3(10)，988-994(2002)；Inoki，et al.，Nat.Cell Biol.4(9)，648-657(2002)；Zhang，et al.，J.Biol.Chem.277(31)，28127-28134(2002)；Castedo，et al.，EMBOJ.21(15)，4070-4080(2002)；Hara，et al.，Cell 110(2)，177-189(2002)；Kim，et al.，Cell 110(2)，163-175(2002)；Fingar，et al.，Genes Dev.16(12)，1472-1487(2002)；Reynolds，et al.，J.Biol.Chem.277(20)，17657-17662(2002)；Fang，et al.，Science 294(5548)，1942-1945(2001)；Dennis，et al.，Science 294(5544)，1102-1105(2001)；Onyango，et al.，Genomics 50(2)，187-198(1998)；Lench，et al.，Hum.Genet.99(4)，547-549(1997)；Choi，et al.，Science 273(5272)，239-242(1996)；Moore，et al.，Genomics 33(2)，331-332(1996)；Chen，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(11)，4947-4951(1995)；Chiu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91(26)，12574-12578(1994)；Brown，et al.，Nature 369(6483)，756-758(1994)。

mTOR活性的抑制剂

在某些实施方案中，本文描述的方法和组合物依赖于阻断、减少或降低mTOR蛋白的活性。根据本文描述的方法和组合物，这种对mTOR活性的抑制可与血管生成的抑制结合使用，以治疗癌症或者防止细胞或组织的生长或增殖。

一般而言，虽然可使用可做到这些的任意方法，但是本文描述的方法和组合物利用mTOR活性或表达的调节剂。能够降低mTOR蛋白活性的药剂被称为该活性的抑制剂或拮抗剂。就本文而言，如果上下文中需要，术语“抑制剂”和“拮抗剂”可被看作是同义词。

在优选的实施方案中，mTOR活性的拮抗剂能够使mTOR的相关的活性(例如激酶活性)降低10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多。优选地，按照下文“mTOR活性的测定”小节中所述测定mTOR活性。

如现有技术中所使用的，术语“拮抗剂”一般被用于指能够结合一种酶并抑制该酶活性的化合物。然而，本文使用的该术语意欲广义地指能抑制一个分子活性的任意药剂，并不必须与该分子结合。因此，它包括这样的药剂，即所述药剂作用于mTOR蛋白的表达、调节分子的生物合成或者mTOR活性的调节剂的表达。所述被抑制的特定活性可以是所述酶或分子表现的或特征性的任意活性，例如根据情况mTOR的任意活性可以是例如激酶活性。所述激酶活性可包括磷酸化S6K1和/或4E-BP1中之一或任一的能力。

所述拮抗剂可结合至及竞争相关分子上的一个或多个部位，优选所述酶的催化部位。优选地，这种结合可阻断所述分子和另一个实体的相互作用(例如酶和其底物的相互作用)。然而，所述拮抗剂不必直接与催化部位结合，并且可结合至例如邻近部位——所述细胞上或内的另一种蛋白(例如与所述酶形成复合体的蛋白)或其他实体，只要它的结合减少所述酶或分子的活性。

当所考虑的是一种酶例如mTOR的拮抗剂时，拮抗剂可包括所述酶的底物，或者其能够结合该酶的片段。另外，天然形成的或通过肽合成产生的整个底物或底物片段可用于与所述底物竞争所述酶上的结合部位。或者或此外，可使用能够结合所述酶的免疫球蛋白(例如，单克隆或多克隆抗体)。所述拮抗剂还可以包括能够干涉所述结合相互作用的肽或其他小分子。拮抗剂的其他实例在下文中更详细地列出，并且对本领域技术人员来说也是显而易见的。

还可以测验mTOR的非功能性同系物对mTOR活性的抑制，这是因为它们可与所述野生型蛋白竞争结合所述细胞机制的其他组分，同时使该蛋白失去其正常功能。或者，它们可阻断结合于所述细胞机器上的蛋白的功能。这种非功能性同系物可包括天然存在的突变体以及它们的经修饰的序列或片段。

或者，所述物质不是直接地阻止所述组分之间的联合，而是可以抑制mTOR的生物可用量。这可以通过例如在转录水平、转录物稳定性、翻译或翻译后稳定性上抑制该组分的表达。这种物质的一个实例是能够抑制mRNA生物合成量的反义RNA或双链干涉RNA序列。

因此，对所述mTOR蛋白的抑制剂活性的阻断也可以通过降低所述蛋白的表达水平或者一种抑制剂来在所述细胞中实现。例如，可以用反义化合物处理所述细胞，所述反义化合物例如具有对mTOR mRNA特异的序列的寡核苷酸。致病形式的粘附蛋白的表达水平也可以以该方式来调节。

一般而言，mTOR的激动物和拮抗剂可包括诸如原子或分子的药剂，其中分子可以是无机的或有机的；生物效应物分子和/或编码例如生物效应物分子的药剂的核酸；蛋白质；多肽；肽；核酸；肽核酸(PNA)；病毒；病毒样颗粒；核苷酸；核糖核苷酸；合成的核苷酸类似物；合成的核糖核苷酸类似物；修饰的核苷酸；修饰的核糖核苷酸；氨基酸；氨基酸类似物；修饰的氨基酸；修饰的氨基酸类似物；类固醇；蛋白聚糖；脂质；脂肪酸；及碳水化合物。药剂可在溶液或悬液(如以晶质、胶质或其他颗粒的形式)中。所述药剂可以为单体、二体、寡聚体等的形式，或者在复合体中。

术语“调节剂”、“拮抗剂”和“药剂”也意欲包括，蛋白质、多肽或肽，包括但不限于结构蛋白、酶、细胞因子(例如干扰素和/或白介素)、抗生素、多克隆抗体或单克隆抗体或者它们的效应部分例如Fv片段(所述抗体或其部分可以是天然的、合成的或人源化的)、肽激素、受体、信号传递分子、或者其他蛋白质；如下文定义的核酸，包括但不限于寡核苷酸或修饰的寡核苷酸、反义寡核苷酸或修饰的反义寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、人工或天然染色体(如酵母人工染色体)或其部分、RNA(包括mRNA、tRNA、rRNA或核酶)、或者肽核酸(PNA)；病毒或病毒样颗粒；核苷酸或核糖核苷酸或者它们的合成的类似物(可以是被修饰的或未被修饰的)；氨基酸或其类似物(可以是被修饰的或未被修饰的)；非肽激素(如类固醇)；蛋白聚糖；脂质；或者碳水化合物。还包括这样的小分子(包括无机化学物和有机化学物)，所述小分子结合并占据所述多肽的活性位点从而使底物无法接近催化位点，使得正常的生物活性被阻止。小分子的实例包括但不限于小肽或肽样分子。

在一个具体的实施方案中，RNA干涉(RNAi)技术可用于消除、敲除或降低基因的活性，例如mTOR的活性。整个策略是制备对每个目的基因特异的双链RNA(dsRNA)，并将其转染至目的细胞中以抑制所述特定基因的表达。

可使用以下的方案：将PCR产物的样品经水平凝胶电泳分析，并使用Qiagen QiaQuick PCR纯化试剂盒纯化所述DNA。在使用AmbionT7 Megascript试剂盒制备基因特异的单链RNA的过程中，将1μg DNA 用作模板。用该模板的双链产生单链RNA，将其纯化并立即通过下述方法退火：加热至90摄氏度持续15分钟，然后逐渐冷却至室温过夜。将该dsRNA样品经水平凝胶电泳分析，并通过常规的方法导入至相关的细胞中。

mTOR活性的拮抗剂

如上文所述，任何能够减少mTOR活性或表达的药剂均可用作mTOR的拮抗剂，用于减少其活性。

丁醇

正丁醇是一种mTOR活性的抑制剂，如Kam and Exton，FASEB J.2004 Feb；18(2)：311-9和Fang et al.，Science 294：1942-1945中所述。因此丁醇可用于本文描述的方法和组合物中，作为一种能够减少mTOR活性的药剂。

抗肽mTOR的抗体

可制备针对mTOR肽序列的抗肽抗体。所选择的序列可基于如下来自以下的mTOR参考序列的小鼠序列：

1 mlgtgpavat asaatssnvs vlqqfasglk srneetraka akelqhyvtm elremsqees

61 trfydqlnhh ifelvsssda nerkggilai asligveggn strigrfany lrnllpssdp

121 vvmemaskai grlamagdtf taeyvefevk ralewlgadr negrrhaavl vlrelaisvp

181 tfffqqvqpf fdnifvavwd pkqairegav aalraclilt tqrepkemqk pqwyrhtfee

241 aekgfdetla kekgmnrddr ihgallilne lvrissmege rlreemeeit qqqlvhdkyc

301 kdlmgfgtkp rhitpftsfq avqpqqpnal vgllgysspq glmgfgtsps pakstlvesr

361 ccrdlmeekf dqvcqwvlkc rssknsliqm tilnllprla afrpsaftdt qylqdtmnhv

421 lscvkkeker taafqalgll svavrsefkv ylprvldiir aalppkdfah krqktvqvda

481 tvftcismla ramgpgiqqd ikellepmla vglspaltav lydlsrqipq lkkdiqdgll

541 kmlslvlmhk plrhpgmpkg lahqlaspgl ttlpeasdva sitlalrtlg sfefeghslt

601 qfvrhcadhf lnsehkeirm eaartcscll tpsihlisgh ahvvsqtavq vvadvlskll

661 vvgitdpdpd irycvlasld erfdahlaqa enlqalfval ndqvfeirel aictvgrlss

721 mnpafvmpfl rkmliqilte lehsgigrik eqsarmlghl vsnaprlirp ymepilkali

781 lklkdpdpdp npgvinnvla tigelaqvsg lemrkwvdel fiiimdmlqd ssllakrqva

841 lwtlgqlvas tgyvvepyrk yptllevlln flkteqnqgt rreairvlgl lgaldpykhk

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961 dqslshhhtm vvqaitfifk slglkcvqfl pqvmptflnv irvcdgaire flfqqlgmlv

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因此，优选的抗肽抗体可以是用任意一条或多条的以下序列建立的：氨基酸22-139；氨基酸647-907；氨基酸937-1140；氨基酸1382-1982；氨基酸2019-2112或氨基酸2181-2549。

可选择来自人mTOR的相应的序列，用于从免疫的动物中激发抗肽抗体。抗体可通过注入至兔体内以及其他常规的方法来产生，如在例如Harlow and Lane(上文)中所述。

将抗体经Elisa测定法以及蛋白质印迹法进行检测，并用于实施例中所述的免疫染色。

雷帕霉素

在某些实施方案中，能够减少mTOR活性的药剂包含雷帕霉素。当术语“雷帕霉素”用于本文中的时候，该术语包括具体的化合物雷帕霉素(也被称为西罗莫司(Sirolimus)，C₅₁H₇₉NO₁₃，将在下文中描述)以及它的任意衍生物。这种衍生物将被详述，包括雷帕霉素前药、雷帕霉素二醛、雷帕霉素的结构类似物(雷帕类似物(rapalog))等。

因此，雷帕霉素(包括其衍生物等)被作为一种特异性的mTOR活性的拮抗剂提供。

雷帕霉素及其衍生物可以以超过1nM的浓度施用，所述浓度例如10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、100nM、500nM、1μm、10μm、100μm或更高。在某些实施方案中，雷帕霉素及其衍生物以约50nM使用。雷帕霉素及其衍生物可以以例如约1mg/天至10mg/天的剂量给予人类个体。

雷帕霉素(西罗莫司)

雷帕霉素(C₅₁H₇₉NO₁₃，分子量914.172g/摩尔)是一种抗真菌抗生素，可提取自链霉菌例如吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。

雷帕霉素的IUPAC名称为(3S，6R，7E，9R，10R，12R，14S，15E，17E，19E，21S，23S，26R，27R，34aS)-9，10，12，13，14，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十六氢-9，27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S，3R，4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-23，27-环氧-3H-吡啶并[2，1-c][1，4]-氧杂氮杂环三十一环烯-1，5，11，28，29(4H，6H，31H)-戊酮。

雷帕霉素可通过其CAS编号53123-88-9、ATC代码L04AA10、PubChem 6436030、DrugBank APRD00178来识别。雷帕霉素的结构式显示如下：

雷帕霉素也被称为西罗莫司。

用于制备雷帕霉素的方法在Sehgal et al.，U.S.Pat.Nos.3,929,992和3,993,749中公开。另外，雷帕霉素的单酰和二酰衍生物及用于制备它们的方法由Rakhit，U.S.Pat.No.4,316,885公开。再者，Stella et al.，U.S.Pat.No.4,650,803公开了雷帕霉素的水溶性前药，即包括以下雷帕霉素前药的雷帕霉素衍生物：甘氨酸盐前药、丙酸盐前药和吡咯烷丁酸盐前药(pyrrolidino butyrate prodrug)。

本文所述的方法和组合物包括使用天然的及合成的雷帕霉素、遗传工程的雷帕霉素以及雷帕霉素的所有衍生物和前药，例如前述的美国专利U.S.Pat.Nos.3,929,992；3,993,749；4,316,885；和4,650,803中所述的，这些专利的内容通过引用的方式纳入本文。

雷帕霉素是31元的大环内酯，C₅₁H₇₉NO₁₃，分子量为913.6Da。在溶液中，由于哌啶酸酰胺键(pipecolic acid amide bond)的转动受到阻碍，西罗莫司可形成比例为4∶1的两种构象的反式、顺式异构体(氯仿)。它微溶于水、脂肪烃和乙醚，然而它可溶于醇、卤代烃和二甲基亚砜。雷帕霉素在溶液中不稳定，并且在37摄氏度下在原生质(plasma)、低pH缓冲液和中性pH缓冲液中以＜10h的半衰期降解。所述降解产物的结构最近已经被表征。雷帕霉素是一种由吸水链霉素产生的大环三烯(macrocyclic triene)抗生素，它被发现在体外和在体内都具有抗真菌活性，特别是抑制白念珠菌(Candida albicans)[C.Vezina et al.，J.Antibiot.28，721(1975)；S.N.Sehgal et al.，J.Antibiot.28，727(1975)；H.A.Baker et al.，J.Antibiot.31，539(1978)；U.S.Pat.No.3,929,992；和U.S.Pat.No.3,993,749]。

雷帕霉素独自(美国专利4,885,171)或与picibanil结合(美国专利4,401,653)已经被证明具有抗肿瘤活性。R.Martel等人[Can.J.Physiol.Pharmacol.55，48(1977)]公开了，雷帕霉素在实验的变应性脑脊髓炎模型(一种多发性硬化的模型)和佐剂关节炎模型(一种类风湿关节炎模型)中是有效的；并且可有效地抑制IgE样抗体的形成。

雷帕霉素的免疫抑制效应已被记载于FASEB 3，3411(1989)中。其他的大环分子，环胞霉素A和FK-506也已经被证明可作为有效的免疫抑制剂，因此可用于预防移植排斥[FASEB 3，3411(1989)；FASEB 3，5256 (1989)；和R.Y.Calne et al.，Lancet 1183(1978)]。虽然雷帕霉素与免疫抑制剂他克莫司(tacrolimus)有结构同源性并在淋巴细胞中与相同的细胞内结合蛋白结合，但是它可抑制S6p70-激酶并因此具有不同于他克莫司的免疫抑制作用机制。已经发现雷帕霉素单独或与其他免疫抑制剂结合可在多个物种中延长不同的移植物的移植存活期。它在动物模型中的毒效应谱不同于环孢霉素或FK-506，包括葡萄糖稳态(glucosehomeostasis)的破坏、胃溃疡、体重减轻和血小板减少，但没有检测到肾毒性。

雷帕霉素衍生物

雷帕霉素衍生物包括雷帕霉素前药、雷帕霉素二醛、雷帕霉素的结构类似物(雷帕类似物)等，在下文中详述。

可用于本文描述的方法和组合物中的具体雷帕霉素衍生物包括RAD001(依维莫司(Everolimus))和CCI-779(Wyeth)。

RAD001(依维莫司)

RAD001(C₅₃H₈₃NO₁₄，分子量958.224g/摩尔)是一种雷帕霉素衍生物。RAD001可通过其CAS编号159351-69-6、ATC代码L04AA18和PubChem 6442177来识别。RAD001的结构式显示如下：

RAD001也被称为依维莫司，由Novartis AG制造。它现在被用作免疫抑制剂来防止器官移植的排斥反应。

RAD001被详细记载于O’Reilly TM，Wood JM，Littlewood-Evans A，et al.Differential anti-vascular effects of mTOR or VEGFR pathwayinhibition：a rational basis for combining RAD001 andPTK787/ZK222584.present at：96th Annual Meeting of the AmericanAssociation for Cancer Research.Anaheim，Calif；April 16-20，2005.Abstract 3038。

RAD001还被记载于105.Van Oosterom AT，Dumez H，Desai J，et al.Combination signal transduction inhibition：a phase I/II trial of the oralmTOR-inhibitor everolimus(E，RAD001)and imatinib mesylate(IM)inpatients(pts)with gastrointestinal stromal tumor(GIST)refractory toIM[abstract].Proc Am Soc Clin Oncol.2004；23：195.Abstract 3002。

CCI 779(西罗莫司脂化物(temsirolimus))

CCI 779(细胞周期抑制剂-779，C₅₆H₈₇NO₁₆，分子量1030.3)是一种雷帕霉素的酯类似物。

CCI 779也被称作雷帕霉素-28-N，N-二甲基甘氨酸甲磺酸盐、雷帕霉素、42-[3-羟基-2-(羟甲基)-2-甲基丙酸盐]、(3S，6R，7E，9R，10R，12R，14S，15E，17E，19E，21S，23S，26R，27R，34aS)-9，10，12，13，14，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十六氢-9，27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S，3R，4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-23，27-环氧-3H-吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一环烯-1，5，11，28，29(4H，6H，31H)-戊酮4′-[2，2-二(羟基甲基)丙酸盐]和雷帕霉素42-[2，2-二(羟基甲基)丙酸盐]。

CCI 779可通过其CAS登记编号162635-04-3来识别。CCI 779的结构式显示如下：

CCI 779也被称作西罗莫司脂化物，由Wyeth制造。西罗莫司脂化物与胞质蛋白FKBP结合，从而抑制mTOR(哺乳动物的雷帕霉素靶标)。

在人癌症的动物模型中，已经发现西罗莫司脂化物会抑制多种癌症类型的生长，甚至在使用的是间歇给药方案时也如此。该化合物还通过抑制T-细胞增殖，表现出阻断与自身免疫和风湿性疾病相关的炎症反应的潜力。

CCI 779是一种可溶于水的雷帕霉素的酯(前药)，所述酯在体内释放雷帕霉素。人们认为它在用于临床的时候比雷帕霉素更加耐受，并且现在正在被研究用于II期和III期临床的肿瘤学患者(包括脑肿瘤)。

CCI 779被详细记载于Nat Genet.2004；36：585-95和J Clin Oncol.2004；22：2336-47。还可参考K Yu，L Toral-Barza，C Discafani，WGZhang，J Skotnicki，P Frost，and JJ Gibbons(2001).mTOR，a noveltarget in breast cancer：the effect of CCI-779，an mTOR inhibitor，inpreclinical models of breast cancer.Endocrine-Related Cancer 8(3)249-258和Josep Maria Peralba，Linda deGraffenried，WilliamFriedrichs，Letitia Fulcher，Viktor Grünwald，Geoffrey Weiss andManuel Hidalgo(2003.Pharmacodynamic Evaluation of CCI-779，anInhibitor of mTOR，in Cancer Patients.Clinical Cancer Research Vol.9，2887-2892。

雷帕霉素前药

mTOR的抑制剂(特别是雷帕霉素)可以被以前药的形式提供。雷帕霉素前药的一种具体实例为上述的CCI 779。

本申请中使用的术语“前药”是指药物活性物质的这样一种前体形式或衍生形式，即其与母体药物相比对肿瘤细胞有较小的细胞毒性，但能通过酶法被激活或者能转化成更大活性的母体形式。参见例如，Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”Biochemical SocietyTransactions，14，pp.375 382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella et al.，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery，”DirectedDrug Delivery，Borchardt et al.，(ed.)，pp.247 267，Humana Press(1985)。本文所述的前药包括但不限于，能够被转化成活性更大的无细胞毒性药物的含磷酸根前药、含硫代磷酸根前药、含硫酸根前药、含肽前药、D-氨基酸修饰前药、糖基化前药、含β-内酰胺前药、含被任意取代的苯氧乙酰胺的前药、含被任意取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶前药和其他5-氟尿嘧啶前药。能够衍生成前药形式用于本文描述的方法和组合物中的药物的实例包括但不限于上述的那些化学治疗药剂。

雷帕霉素二醛

雷帕霉素前药例如美国专利6,680,330(Zhu，et al)中描述的雷帕霉素可应用于本文描述的方法和组合物中。

雷帕霉素的单醛和二醛衍生物(在位置28和43处酯化)已经被证明可用作抗真菌剂(U.S.Pat.No.4,316,885)，并可用于制备可溶于水的雷帕霉素前药(U.S.Pat.No.4,650,803)。最近，雷帕霉素的编号规则已改变；因此，依照Chemical Abstracts命名法，上述的酯应在位置31和42处。已经记载了羧酸酯(PCT申请号WO 92/05179)、氨基甲酸酯(U.S.Pat.No.5,118,678)、酰胺酯(U.S.Pat.No.5,118,678)、(U.S.Pat.No.5,118,678)、氟化的酯(U.S.Pat.No.5,100,883)、缩醛(U.S.Pat.No.5,151413)、硅醚(U.S.Pat.No.5,120,842)、二环衍生物(U.S.Pat.No.5,120,725)、雷帕霉素二聚体(U.S.Pat.No.5,120,727)以及O-芳基、O-烷基、O-烯基(O-alkyenyl)和O-炔基衍生物(U.S.Pat.No.5,258,389)。

雷帕霉素由细胞色素P-450 3A代谢成至少6种代谢产物。在与人肝脏和小肠微粒体孵育的过程中，西罗莫司被羟基化并被脱甲基化，并且 39-O-脱甲基西罗莫司的结构已被识别。在西罗莫司-处理的大鼠的胆汁中，检测到了＞16种羟基化的和脱甲基化的代谢产物。

在雷帕霉素中，C-7碳位置处甲氧基基团的脱甲基化将会由于所释放的C-7羟基基团与邻近的吡喃环系相互作用而导致雷帕霉素的构象改变，该构象改变与所述环系的开放形式是平衡的。该C-7羟基还将与三烯体系相互作用，并有可能改变雷帕霉素的免疫抑制活性。这可解释雷帕霉素分子的降解及其变化的活性。

雷帕霉素的结构类似物(雷帕类似物)

已经报道了大量的雷帕霉素结构变体，它们通常作为替代发酵产物出现，或者来自为提高该化合物作为免疫抑制剂的治疗指数而进行的合成研究。它们中的每种都可应用于本文所述的方法和组合物中。

例如，大量关于雷帕霉素结构相关的类似物、同系物、衍生物和其他化合物(“雷帕类似物”)的文献中包括了具有与雷帕霉素相关的一种或多种以下修饰的其他雷帕霉素变体：位置C7、C42和/或C29处的甲氧基的脱甲基化、消除或置换；位置C13、C43和/或C28处的羟基的消除、衍生化或置换；位置C14、C24和/或C30处的酮的还原、消除或衍生化；6-元的甲基哌啶(pipecolate)环被5-元的脯氨酰(prolyl)环置换；以及环己基环上的其他取代或环己基环被取代的环戊基环置换。在几乎所有情况下，报道了免疫抑制活性伴随有雷帕类似物的抗真菌活性。另外的历史信息见美国专利5,525,610；5,310,903和5,362,718的背景章节。

雷帕类似物

本文使用的术语“雷帕类似物”表示这样一类化合物，即该类化合物包括雷帕霉素的多种类似物、同系物和衍生物，以及与雷帕霉素在结构上相关的其他化合物。“雷帕类似物”包括包含式I中所示的亚结构的除雷帕霉素之外的化合物(或那些这样的雷帕霉素衍生物，即与雷帕霉素相比仅仅是改变了位置1、2、3、4或者5、6处的一个或多个碳-碳双键的饱和度)，除非在本文中另外明确指出，否则这些亚结构含有任意数目的多种取代基，并且任选地在一个或多个碳--碳键位置处不饱和。

雷帕类似物尤其包括相对于雷帕霉素具有一种或多种以下修饰的雷帕霉素变体：C7、C42和/或C29位置处甲氧基的脱甲基化、消除或置换；C13、C43和/或C28位置处羟基的消除、衍生化或置换；C14、C24 和/或C30位置处酮的还原、消除或衍生化；6-元的甲基哌啶环被5-元的脯氨酰环置换；以及环己基环上的一个或多个取代基的消除、衍生化或置换或者环己基环被取代的或未取代的环戊基环置换。本文使用的术语雷帕类似物不包括雷帕霉素本身，并优选在C1和C30之间不包含氧桥。示例性的雷帕类似物实例被公开于表I中所列的文本中。在C7处修饰的雷帕类似物实例显示于表II中。

表I

抗肽mTOR的抗体

制备针对mTOR肽序列的抗肽抗体。所选的序列可基于如下来自以下的mTOR参考序列的小鼠序列：

1 mlgtgpavat asaatssnvs vlqqfasglk srneetraka akelqhyvtm elremsqees

61 trfydqlnhh ifelvsssda nerkggilai asligveggn strigrfany lrnllpssdp

121 vvmemaskai grlamagdtf taeyvefevk ralewlgadr negrrhaavl vlrelaisvp

181 tfffqqvqpf fdnifvavwd pkqairegav aalraclilt tqrepkemqk pqwyrhtfee

241 aekgfdetla kekgmnrddr ihgallilne lvrissmege rlreemeeit qqqlvhdkyc

301 kdlmgfgtkp rhitpftsfq avqpqqpnal vgllgysspq glmgfgtsps pakstlvesr

361 ccrdlmeekf dqvcqwvlkc rssknsliqm tilnllprla afrpsaftdt qylqdtmnhv

421 lscvkkeker taafqalgll svavrsefkv ylprvldiir aalppkdfah krqktvqvda

481 tvftcismla ramgpgiqqd ikellepmla vglspaltav lydlsrqipq lkkdiqdgll

541 kmlslvlmhk plrhpgmpkg lahqlaspgl ttlpeasdva sitlalrtlg sfefeghslt

601 qfvrhcadhf lnsehkeirm eaartcscll tpsihlisgh ahvvsqtavq vvadvlskll

661 vvgitdpdpd irycvlasld erfdahlaqa enlqalfval ndqvfeirel aictvgrlss

721 mnpafvmpfl rkmliqilte lehsgigrik eqsarmlghl vsnaprlirp ymepilkali

781 lklkdpdpdp npgvinnvla tigelaqvsg lemrkwvdel fiiimdmlqd ssllakrqva

841 lwtlgqlvas tgyvvepyrk yptllevlln flkteqnqgt rreairvlgl lgaldpykhk

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因此，优选的抗肽抗体可以是用以下序列中的任意一条或多条建立的：氨基酸22-139；氨基酸647-907；氨基酸937-1140；氨基酸1382-1982；氨基酸2019-2112；或氨基酸2181-2549。

血管生成

血管生成过程需要正常地静止内皮的增殖及迁移、细胞周基质的受控的蛋白酶解，以及通过形成微血管进行的新细胞外基质组分的合成。新的细胞内连接和细胞间连接的确立以及内皮细胞向毛细管样管状网络的形态分化，可为这些内皮细胞之后的成熟、分支、重塑和选择性消退提供支持，以形成高度器官化的功能性微血管网络。所述血管内皮与以下物质的自分泌、旁分泌和双重分泌相互作用通常在空间和时间上都受到紧密地调节，即该血管内皮的周围基质成分以及协调生理学血管生成的前血管生成和血管生成抑制(angiostatic)的细胞因子和生长因子。

血管生成对于新生物组织的生长是至关重要的。多项实验研究已经表明，原始肿瘤生长和转移都需要新生血管形成。与上述的正常组织生长的高度有序的过程不同，用于活跃的肿瘤生长所必需的病理性血管生成通常被维持并持续进行，并以初始获得血管生成表型为形成多种实体瘤类型和造血系统瘤类型的共同机制。不能补充并维持血管网络的肿瘤一般作为无症状的损伤在原位蛰伏。转移也是血管生成依赖的：为了成功转移，肿瘤细胞通常必须在原始肿瘤中进入血管系统中，在循环中生存，被靶器官的微血管系统俘获，从该血管系统中出来，在所述靶器官中生长并诱导所述靶部位处的血管生成。因此，血管生成在所述转移级联的开始以及完成时明显都是必需的。

因此，合适的抗血管生成剂可通过延迟其开始(即阻断“血管生成开关”)或者通过阻断维持的和集中的新生血管形成来直接地或间接地发挥作用影响肿瘤相关的血管生成，所述新生血管形成是许多肿瘤类型的特征。抗血管生成的治疗也可以直接抑制肿瘤相关的内皮，以及维持病理性血管生成所涉及的多分子和细胞的过程和靶标。

现在，已经明确确定多种障碍的发病机制中涉及血管生成。这些障碍包括实体瘤、眼内新生血管综合症例如增生性视网膜病变或老年性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎和银屑病(Folkman et al.J.Biol Chem.267：10931 10934(1992)；Klagsbrun et al Annu.Rev.Physiol.53：217239(1991)；和Garner A，Vascular diseases.In：Pathobiology of oculardisease.A dynamic approach.Garner A，Klintworth G K，Eds.2ndEdition Marcel Dekker，NY，pp 16251710(1994))。对于实体瘤，新生血管形成使得肿瘤细胞与正常细胞相比获得生长优势和增殖自主性。因此，已经观察到了乳癌以及多种其他肿瘤中肿瘤区的微血管密度和患者的存活率之间的相关性(Weidner et al.N Engl J Med 324：16(1991)；Horaket al.Lancet 340：1120 1124(1992)；和Macchiarini et al.Lancet 340：145146(1992))。

血管生成抑制剂

血管生成的正调剂剂，包括aFGF、bFGF、TGF-α、TGF-β、HGF、TNF-α、血管生成素、IL-8等(Folkman et al.和Klagsbrun et al)，是现有技术中已知的。本文中使用的血管生成抑制剂一般包括能够降低任何这些分子的活性(通过任意方式)的任意分子，具体地包括任何这些分子的任意抑制剂或拮抗剂。

迄今为止鉴定的负调节剂包括血小板反应素(thrombospondin)(Good et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87：6624 6628(1990))、1.6万道尔顿的促乳素N末端片段(Clapp et al.Endocrinology，133：1292 1299(1993))、血管生长抑素(angiostatin)(O’Reilly et al.Cell，79：315 328(1994))和血管内皮抑素(endostatin)(O’Reilly et al.Cell，88：277 285(1996))。

因此，血管生成抑制剂可包括任意的以下物质：血管生长抑素、血管内皮抑素和血小板反应素。

再者，血管生成抑制剂通常可包括能够增加任何这些分子的活性(通过任意方式)的任意分子，具体地包括任何这些分子的任意激活剂或激动剂。

血管生成抑制剂还可以包括任意的以下物质：干扰素、血小板因子4、催乳素16Kd片段、TIMP-1(金属蛋白酶1的组织抑制剂)、TIMP-2(金属蛋白酶2的组织抑制剂)、TIMP-3(金属蛋白酶3的组织抑制剂)或TIMP-4(金属蛋白酶4的组织抑制剂)。

血管生成抑制剂可包括(Z，E)-3-(咪唑-4-基次甲基)吲哚-2-酮。该化合物是一种可通透细胞的吲哚酮化合物，表现出抑制血管生成的性质(在体外大鼠主动脉环模型中，以10μM的浓度抑制对照的30％)，同时具有与SU5416(3-[(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基]-吲哚-2-酮，10μM抑制对照的22％)相当的效价。它可作为hEGF-R酪氨酸激酶活性的中度的ATP-竞争性抑制剂(以10μM的浓度抑制54％)。(Z，E)-3-(咪唑-4-基次甲基)吲哚-2-酮记载于Braud，E.，et al.2003.J.Enzyme Inhib.Med.Chem.18，243中。

血管生成抑制剂可包含3-(2，4-二甲基吡咯-5-基)亚甲基-吲哚-2-酮或(Z)-3-(2，4-二甲基-5-(2-氧代-1，2-二氢-吲哚-3-亚基甲基)-1H-吡咯--3-基)-丙酸。

血管生成抑制剂还可以包含1，2-二巯基-3-硫酮衍生物或其代谢产物、5-(2-吡嗪基)-1，2-二巯基-3-硫酮(ADT)、5-(2-吡嗪基)-4-甲基-1，2-二巯基-3-硫酮(奥替普拉)或其代谢产物，如US 7,199,122(Ruggeri)中所述。

如上文所述，所述血管生成抑制剂可以被以前药的形式提供。

内皮细胞生长抑制剂

血管生成抑制剂可包含直接抑制内皮细胞生长的分子。该类别可包括内皮他丁——一种已知抑制动物中肿瘤生长的天然蛋白质。另一种药物——考布他汀A4，会引起生长中的内皮细胞自杀(凋亡)。

那些与被称为整联蛋白的分子相互作用的其他药物还可以促进增殖中的内皮细胞的破坏。

内皮细胞生长抑制剂还包括EMD121974、TNP470、角鲨胺、考布他汀A4、沙利度胺和BMS-582664。

沙利度胺是一种在20世纪50年代被用作镇静药的药物，由于它在被孕妇服用时会引起出生缺陷而在后来退出市场。虽然该药物明显不适宜于孕妇，但是其阻止内皮细胞形成新血管的能力使得它适合用于本文所述的方法和组合物中。

沙利度胺的详细描述参考Urologic Oncology(2006)24：260-268 andCancer Research(2006)66：11520-11530。这些分子中的每种都可在本文所述的方法和组合物中用作血管生成抑制剂。

BMS-582664(brivanib丙氨酸盐)是一种口服的VEGFR和FGFR酪氨酸激酶的二元抑制剂(VEGFR2、VEGFR3、FGFR1和FGFR2的IC50分别是34、10、145、125nM)。BMS-582664是Brivanib的丙氨酸盐，是一种具有潜在抗肿瘤活性的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的抑制剂。Brivanib很强地结合于并抑制VEGFR2，VEGFR2是一种几乎仅在血管内皮细胞上表达的酪氨酸激酶的受体；对 VEGFR2的抑制可导致对肿瘤血管生成的抑制、对肿瘤细胞生长的抑制以及肿瘤消退。

Brivanib是一种被取代的4-(4-氟-1H-吲哚-5-基氧基)吡咯并[2，1-f][1，2，4]三嗪，并且是一种血管内皮生长因子受体-2激酶的抑制剂。Brivanib及其L-丙氨酸盐前药BMS-582664记载于Bhide，et al.(2006).Discovery and Preclinical Studies of (R)-1-(4-(4-Fluoro-2-methyl-1H-indol-5-yloxy)-5-methylpyrrolo[2，1-f][1，2，4]triazin-6-yloxy)propan-2-ol(BMS-540215)，an In Vivo Active Potent VEGFR-2 Inhibitor.J.Med.Chem.，49(7)，2143-2146，2006中。

这些分子的每种都可在本文所述的方法和组合物中用作血管生成抑制剂。

细胞外基质降解抑制剂

由VEGF或bFGF对内皮细胞的激活启动了一系列建立新血管的步骤。首先，被激活的内皮细胞产生基质金属蛋白酶(MMP)——一类降解性的酶。然后，这些酶从内皮细胞释放至周围组织中。MMP降解细胞外基质——充满细胞之间的空间并且由蛋白质和多糖构成的支持材料。对这种基质的降解使得内皮细胞可迁移。

因此，血管生成抑制剂一般可包含能够减少对细胞外基质的降解的任意分子——一种细胞外基质降解抑制剂。它可降低基质金属蛋白酶的活性(通过任意方式)，具体地包括任何这些分子的任意抑制剂或拮抗剂，即一种基质金属蛋白酶(Matrix Metalloprotease)蛋白抑制剂。

例如，Marimistat、AG3340、COL-3、新伐司他或BMS-275291均可用作血管生成抑制剂。

血管生成信号传递级联抑制剂

血管生成抑制剂具体地可包括干扰或抑制血管生成信号传递级联中任何步骤的任意分子。

例如，它可包括VEGF活性的抑制剂。所述血管生成信号传递级联抑制剂可包含能够阻断VEGF受体与生长因子结合的分子。这种分子可包括免疫球蛋白，特别是抗VEGF抗体。

抗VEGF抗体贝伐单抗(阿瓦斯汀)已被证明可延迟肿瘤生长，并且更重要地可延长患者的生命。关于它的更详细描述见后文。

血管生成信号传递级联抑制剂的其他实例有干扰素-α、SU5416、SU6668和PTK787/ZK 22584。

干扰素-α是一种天然的蛋白，所述干扰素-α可抑制bFGF和VEGF的产生，阻止这些生长因子启动该信号传递级联。

关于干扰素-α、SU5416、SU6668和PTK787/ZK 22584的详细描述参见Cancer Research(2006)66：11520-11530。

VEGF活性

可用于本文所述的方法和组合物中的血管生成抑制剂具体地包括VEGF抑制剂。

血管内皮生长因子(VEGF)是一种参与血管发生(vasculogenesis)(胚胎循环系统的重新形成)和血管生成(血管从已有血管的生长)的重要信号传递蛋白。顾名思义，VEGF活性主要局限在血管内皮细胞，但它的确也对少数几种其他细胞类型有效应(如刺激单核细胞/巨噬细胞迁移)。在体外，VEGF已经被证明可刺激内皮细胞有丝分裂发生及细胞迁移。VEGF还可增强微血管通透性，并且有时候被称作血管通透性因子。

术语“VEGF”意欲涵盖通过选择性剪接8外显子的单VEGF基因的mRNA获得的多种蛋白中的每一种。所述不同的VEGF剪接变体由它们包含的氨基酸数目来表示(在人中：VEGF₁₂₁、VEGF₁₄₅、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆；这些蛋白的啮齿动物直系同源物(ortholog)少一个氨基酸)。这些蛋白的不同之处是存在或不存在由VEGF基因的外显子6a、6b和7编码的短C末端结构域。这些结构域对VEGF剪接变体的功能有重大影响，这是因为它们介导与细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和神经纤毛蛋白(neuropilin)辅助受体(co-receptor)的相互作用，增强它们结合并激活VEGF信号传递受体(VEGFR)的能力。

VEGF剪接变体作为糖基化的二硫键结合的同二聚体从细胞中释放。VEGF在结构上属于胱氨酸结生长因子的PDGF家族。随后，发现了几个紧密相关的蛋白(胎盘生长因子(PlGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D)，它们一起可构成生长因子的VEGF亚家族。术语VEGF意欲包括这些亚家族成员。VEGF有时被称作VEGF-A，以将它与这些相关的生长因子区分。许多VEGF相关的蛋白还已经被发现由病毒编码 (VEGF-E)以及在某些蛇的毒液中(VEGF-F)。术语VEGF还包括这些VEGF相关蛋白。

VEGF家族的所有成员都通过以下途径刺激细胞反应，即结合于细胞表面上的酪氨酸激酶受体(VEGFR)，引起它们二聚化并通过转磷酸作用而被激活。该VEGF受体具有一个由7个免疫球蛋白样结构域组成的细胞外部分、单个的跨膜区域和一个包含切割酪氨酸激酶结构域的细胞内部分。VEGF-A可结合于VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(KDR/Flk-1)。VEGFR-2明显可介导几乎所有的对VEGF的已知细胞反应。VEGFR-1的功能不完全清楚，但它被认为可调节VEGFR-2信号传递。VEGFR-1的另一种功能可能是作为假/诱饵受体(dummy/decoyreceptor)，将VEGF从VEGFR-2的结合中分离(这在胚胎的血管发生过程中明显是特别重要的)。已经发现了第三种受体(VEGFR-3)，然而，VEGF-A不是这种受体的配基。VEGFR-3在对VEGF-C和VEGF-D的反应中介导淋巴管生成。

过去几年中所做的工作已经确定血管内皮生长因子(VEGF)在调节正常和异常血管生成中的关键作用(Ferrara et al.Endocr.Rev.18：425(1997))。甚至失去单VEGF等位基因也会导致胚胎死亡的发现指出，该生长因子在血管系统的发育和分化中有不可替代的作用(Ferrara etal.)。

再者，VEGF已经被证明是一种与肿瘤和眼内障碍相关的新生血管形成的关键介导剂(Ferrara et al.)。VEGF mRNA被受检的人肿瘤中的大多数所过量表达(Berkman et al.J Clin Invest 91：153 159(1993)；Brown et al.Human Pathol.26：86 91(1995)；Brown et al.Cancer Res.53：4727 4735(1993)；Mattern et al.Brit.J.Cancer.73：931 934(1996)；和Dvorak et al.Am J.Pathol.146：1029 1039(1995))。同时，在患有糖尿病及其他缺血相关的视网膜病变的患者中，VEGF在眼液体中的浓度与存在活跃的血管增殖高度相关(Aiello et al.N.Engl.J.Med.331：14801487(1994))。再者，最近的研究已经证明，VEGF在患有AMD的患者的脉络膜新生血管膜中的定位(Lopez et al.Invest.Ophtalmo.Vis.Sci.37：855 868(1996))。

因此，VEGF活性的抑制剂可被用作根据本文所述方法和组合物的血管生成抑制剂。

VEGF抑制剂

血管生成抑制剂可包括VEGF抑制剂。

术语“VEGF抑制剂”应被认为包括能够抑制VEGF的一种或多种生物活性(例如其促有丝分裂活性或血管生成活性)的任意分子。VEGF抑制剂可包括VEGF的拮抗剂，并且可通过例如以下方式发挥作用，所述方式即妨碍VEGF与细胞受体的结合，使已经被VEGF激活的细胞失能或杀死这些细胞，或者在VEGF结合细胞受体后妨碍血管内皮细胞的激活。

本文使用的术语“VEGF受体”或“VEGFr”是指VEGF的细胞受体，通常是一种出现在血管内皮细胞上的细胞表面受体，以及这些受体的保持与hVEGF结合能力的变体。VEGF受体的一个实例是fms-样酪氨酸激酶(flt)——一种酪氨酸激酶家族的跨膜受体。DeVries et al.，Science 255：989(1992)；Shibuya et al.，Oncogene 5：519(1990)。该flt受体包含一个细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个具有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域。细胞外结构域涉及VEGF的结合，而细胞内结构域涉及信号转导。VEGF受体的另一个实例是flk-1受体(也被称作KDR)。Matthews et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.88：9026(1991)；Terman et al.，Oncogene 6：1677(1991)；Terman et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.187：1579(1992)。VEGF与适合的受体的结合导致了至少两种高分子量的复合体的形成，它们具有205,000和300,000道尔顿的表观分子量。该300,000道尔顿复合体被认为是二聚体，包含结合于单个VEGF分子上的两个受体分子。

在某些实施方案中，VEGF抑制剂可包括能够抑制人VEGF的生物活性的分子。本文使用的术语“人VEGF”是指165-氨基酸的人血管内皮生长因子，以及相关的121-、189-和206-氨基酸的血管内皮细胞生长因子，这与这些生长因子的天然等位基因形式和经处理的形式一起记载于Leung et al.，Science 246：1306(1989)，和Houck et al.，Mol.Endocrin.5：1806(1991)中。

抗VEGF抗体

VEGF活性的抑制剂包括抗VEGF抗体，例如抗VEGF单克隆抗体。

抗VEGF中和抗体可抑制多种人肿瘤细胞系在裸鼠中的生长(Kimet al.Nature 362：841844(1993)；Warren et al.J.Clin.Invest.95：17891797(1995)；Borgstrom et al.Cancer Res.56：4032 4039(1996)；和Melnyk et al.Cancer Res.56：921924(1996))，并且还可抑制缺血性视网膜障碍模型中的眼内血管生成(Adamis et al.Arch.Ophthalmol.114：66 71(1996))。

抗VEGF抗体——例如美国专利7,169,901(Baca)中所详述的那些——也可应用于本文所述的方法和组合物中。

这些参考文献中所述的任何抗体可用作根据本文描述的方法和组合物的血管生成抑制剂。

贝伐单抗(阿瓦斯汀)

在某些实施方案中，所述血管生成抑制剂可包括贝伐单抗。贝伐单抗也被称为阿瓦斯汀，是一种单克隆抗体，并且是第一种被FDA批准的抗VEGF抗体。

贝伐单抗记载于美国专利6,054,297(Carter)中。

贝伐单抗是一种重组人源化的VEGF单克隆抗体。贝伐单抗抑制与VEGF受体的结合以及下游信号传递的激活。贝伐单抗由IgG1框架区和来自鼠单克隆抗体并阻断人VEGF与其受体结合的抗原结合互补决定区组成(Presta，L.G.，H.Chen，et al.(1997).“Humanization of ananti-vascular endothelial growth factor monoclonal antibody for thetherapy of solid tumors and other disorders.”Cancer Res 57(20)：4593-9)。贝伐单抗具有约149000道尔顿的分子量，并且是被糖基化的。

贝伐单抗也被称作阿瓦斯汀，并且可以以该名称从Genentech，Inc(South San Francisco，USA)购得。

阿瓦斯汀是第一种可在癌症患者的治疗中产生疗效并且改善总反应率、进展时间和存活的血管生成抑制剂[综述参见Rhee J and Hoff PM.Angiogenesis inhibitors in the treatment of cancer. Expert OpinPharmacother 2005；6：1701-1711]。最近阿瓦斯汀在HCC中的数据表明，该药剂可被安全地给予至经仔细挑选的HCC患者中，并且已经证明了阿瓦斯汀对化学疗法的附加临床活性(Zhu AX，Sahani D，Norden-ZfoniN，et al.A phase I1 study of gemcitabine，Oxaliplatin in combination with bevacizumb(GEMOX-B)in patients with HepatocellularCarcinoma.2005.Presented at 2005 American Society of ClinicalOncology Annual Meeting，Orlando，FL；Schwartz JD，Schwartz M，Leher D，et al.Bevacizumab in hepatocellular carcinoma(HCC)inpatients without metastasis and without invasion of the portal vein.2005)。

其药代动力学的特征在于，在2室模型(2-compartment model)中的1-10mg/kg剂量范围内的剂量线性、低清除率以及与受限的血管外分布一致的分布量。群体PK分析表明了1.4天的初始半衰期和19-20天的终末半衰期(区间11-50天)，并且在大约100天时达到稳态。迄今为止，还没有在HCC中评估贝伐单抗的药代动力学，也没有评估其与雷帕霉素联合的药代动力学。

贝伐单抗已经被在多种实体瘤中进行了2期和3期测试。它被许可与5-氟尿嘧啶联合使用作为转移性结直肠癌的一线疗法(first linetreatment)。试验结果表明，甚至当与化学疗法联合时，也可以将贝伐单抗以5mg/kg或10mg/kg的剂量安全地给予患有不可切除HCC的患者。参见A.X.Zhu，D.S.，A.Norden-Zfoni，N.S.Holalkere，L.Blaszkowsky，D.P.Ryan，J.Clark，K.Taylor，J.V.Heymach，K.Stuart(2005).“A Phase II Study of Gemcitabine，Oxaliplatin in Combinationwith Bevacizumab(GEMOX-B)in Patients with HepatocellularCarcinoma.”ASCO Proceedings；J.D.Schwartz，M.S.，D.Lehrer，D.Coll，M.Kinkhabwala，M.Sung，S.B.Holloway，S.Wadler(2005).“Bevacizumab in hepatocellular carcinoma(HCC)in patients withoutmetastasis and without invasion of the portal vein.”ASCO Proceedings；Zhu，A.X.，L.S.Blaszkowsky，et al.(2006).“Phase II study ofgemcitabine and oxaliplatin in combination with Bevacizumab inpatients with advanced hepatocellular carcinoma.”J Clin Oncol 24(12)：1898-903。

在2期临床中，在贝伐单抗与吉西他滨(gemcitabine)和奥沙利铂(oxaliplatin)结合使用后，20％的患者具有疾病反应，27％的具有稳定的疾病。

其他分子

血管生成抑制剂还可包括任何以下物质：CAI-钙摄取抑制剂、白介素-12-干扰素-γ的上调节剂，以及IP-10和IM862-未知功能。

鉴别MTOR拮抗剂和血管生成抑制剂

拮抗剂(特别是小分子)可被用于特异地抑制mTOR。类似地，它们可被用于特异地抑制血管生成活性。

因此，我们公开了小分子的mTOR抑制剂，以及用于筛选它们的测定法。mTOR激酶的拮抗剂的筛选可通过检测对结合作用或其他活性的调节(优选下调)来实现。任何经鉴定的mTOR拮抗剂都可应用于本文所述的方法和组合物中。

我们还公开了血管生成的小分子抑制剂，以及用于筛选它们的测定法。血管生成抑制剂的筛选可通过检测对血管生成本身或对血管生成相关的任意活性的调节(优选下调)来实现，所述血管生成相关的活性例如内皮细胞生长、细胞外基质降解、血管生成级联信号传递(包括VEGF活性)等。

“下调”包括对所研究的行为的任意负效应；可以是全部的或部分的。因此，如果检测的是结合作用，那么候选拮抗剂应能够降低、改善或消除两实体之间的结合作用。优选地，与不存在所述候选分子时的结合作用(或任何一种活性)相比，由候选分子获得的结合作用(或任何其他活性)的下调为至少10％，优选至少20％，优选至少30％，优选至少40％，优选至少50％，优选至少60％，优选至少70％，优选至少80％，优选至少90％或更高。因此，适宜用作拮抗剂的候选分子是能够降低结合作用或其他活性10％以上的分子。

多肽结合作用的测定

mTOR活性或表达的调节剂和拮抗剂可通过本领域中已知的任意方法进行鉴定。这种推定的分子可在以下测定中通过它们与mTOR的结合作用而鉴定，即该测定可检测mTOR和该推定的分子之间的结合作用。

类似地，血管生成活性(包括VEGF活性)或表达的调节剂和拮抗剂可通过本领域中已知的任意方法进行鉴定。这种推定的分子可在以下测定中通过它们与VEGF的结合作用而鉴定，即该测定可检测VEGF和该推定的分子之间的结合作用。

一种类型的用于鉴定与多肽结合的物质的测定涉及，将一种固定在固体支持物上的多肽与一种非固定的候选物质相接触，确定所述多肽和候选物质是否相互结合以及/或者相互结合的程度。或者，所述候选物质可以是固定的，所述多肽是非固定的。这可用于检测能够结合于以下物质的物质：即根据情况为mTOR多肽或VEGF，或者它们的片段、同系物、变体或衍生物。

在一种优选的测定方法中，所述多肽被固定于诸如琼脂糖珠的珠子上。这通常可通过以下方式来实现，即在细菌、酵母或高等真核细胞系中，根据情况将mTOR多肽或VEGF，或者它们的片段、同系物、变体或衍生物表达为GST-融合蛋白，然后使用谷胱甘肽-琼脂糖珠从粗细胞提取物中纯化该GST-融合蛋白(Smith and Johnson，1988)。作为对照，在不存在所述多肽的情况下，确定非GST-融合蛋白的候选物质与所述固定的多肽的结合作用。然后确定所述候选物质与所述固定多肽的结合作用。这种类型的测定在本领域中称为GST下拉测定(GST pulldownassay)。同样，所述候选物质可以是固定的，所述多肽是非固定的。

还可以使用用于固定所述组分之一的不同的亲和性纯化体系来进行该类型的测定，例如Ni-NTA琼脂糖和组氨酸标记的组分。

mTOR多肽或VEGF多肽，或者它们的片段、同系物、变体或衍生物与候选物质的结合作用可通过本领域中熟知的多种方法来确定。例如，可标记非固定的组分(用例如放射性标记物、表位标签物或酶-抗体缀合物)。或者，结合作用可通过免疫检测技术来确定。例如，所述反应混合物可经蛋白质印迹，使用检测非固定组分的抗体标记印迹。还可以使用ELISA技术。

候选底物一般被以1至1000nmol/ml，更优选以1至100nmol/ml的终浓度添加。在抗体的情况下，所使用的终浓度一般是100至500μg/ml，更优选200至300μg/ml。

mTOR和VEGF的调节剂和拮抗剂还可以通过检测对mTOR和VEGF与任何它们所结合的分子之间的结合作用的调节来鉴定，所述结合分子例如(在VEGF的情况下)是VEGF受体。

活性的测定

对调节剂或拮抗剂进行检测的测定一般涉及，在存在一种候选分子的情况下检测mTOR的任何活性(优选激酶活性或VEGF活性)的调节，任选地在不存在候选分子的情况下也测定对活性的调节。

这些测定涉及，将一种具有多肽、编码该多肽的核酸或者包含它们的细胞、细胞器、提取物或其他材料形式的mTOR或VEGF的候选分子(例如以文库的形式)与一种候选调节剂相接触。可检测mTOR或VEGF的相关活性(如下文所述)，以确定所述候选调节剂的存在是否具有任何效应。还可以使用启动子结合测定，来检测与mTOR或VEGF的结合和/或作用于mTOR或VEGF的转录或表达的候选调节剂。然后可以将候选调节剂挑选出以进行进一步研究，或者分离出以应用。这些筛选过程的详情在本领域中是已知的，被记载于例如Handbook of DrugScreening，edited by Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Fernandes(2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)中。

本文所述的筛选方法优选用于体内测定，但是可将它们设定用于体外应用。体内测定一般涉及，将包含mTOR或VEGF的细胞暴露于所述候选分子。在体外测定中，mTOR或VEGF被暴露于所述候选分子，并且任选存在其他组分，如粗细胞提取物或半提纯细胞提取物或者纯化的蛋白质。如果进行体外测定，那么优选采用候选分子的阵列(例如成阵列的文库)。优选体内测定。因此，优选地，所述mTOR或VEGF被包含在细胞中，并优选是异源的。这种细胞优选是转基因细胞，该细胞已经经过改造以表达上述的mTOR或VEGF。

如果采用了提取物，那么该提取物可包括细胞质提取物或核提取物，制备它们的方法在本领域中是熟知的。

应理解，可采用包含mTOR或VEGF的细胞的任何组分，例如细胞器。一个优选的实施方案利用这样的细胞质制品或核制品，即其包含例如含有所述mTOR的细胞核。参见Zhang，et al，Predominant NuclearLocalization of Mammalian Target of Rapamycin in Normal andMalignant Cells in Culture.J.Biol.Chem.，Jul 2002；277：28127-28134。所述核制品可包含一种或多种核，该核可通过例如洗涤剂处理被渗透化或半渗透化。

因此，在一个具体的实施方案中，测定形式可包括：准备多孔微量滴定板，以在每个孔中包括表达mTOR或VEGF的一种或多种细胞；可将来源自例如一个文库的单个候选分子或候选分子集合(pool)加入至各个孔中，并测量对mTOR或VEGF活性的调节作用。如果使用了集合，可将其细分成更多的集合，并以相同的方式进行测验。然后测定mTOR或VEGF活性，例如激酶活性。

可选地或者除上述测定方法外，还可以使用“消减(subtractive)”法来鉴定mTOR或VEGF的调节剂或拮抗剂。使用这种“消减”法时，可提供包含能发挥调节剂功能的一种或多种候选分子的分子群(例如细胞提取物、核提取物、分子文库等)，并且从该分子群中去除、耗尽或消减一种或多种组分。然后，通过暴露于所述包含mTOR或VEGF(或它们的组分)的细胞，对所述“消减的”提取物等进行活性测定。

因此，可按照下文所述进行例如“免疫耗尽”测定以鉴定这种调节剂。细胞质提取物或核提取物可从多能细胞例如多能EG/ES细胞制备。所述提取物可经耗尽或分馏以去除推定的调节剂，例如通过使用适当抗体的免疫耗尽。如果所述提取物的调节剂被耗尽，那么它将失去作用于mTOR或VEGF功能、活性或表达的能力。为鉴定所述调节剂或拮抗剂，可能需要一系列的消减和/或耗尽。

应理解，以上的“耗尽”或“消减”测定可用作预备步骤以鉴定推定的调节因子，用于进行进一步筛选。再者或另外，“耗尽”或“消减”测定可用于确定通过其他方法(例如本文别处所述的“阳性”筛选)鉴定为推定调节剂的分子的调节活性。

经受所述测定并且被发现是值得注意的候选分子可以被分离并被进一步地研究。分离目的分子的方法将依赖于所用的分子的类型，它是否为在文库中的形式，在任一时间多少候选分子被测试，是否采用批量步骤等。

所述候选分子可以被以文库的形式提供。在一个优选的实施方案中，同时地筛选一种以上的候选分子。通过现有技术中已知的方法，可产生候选分子的文库，例如小分子文库、多肽文库、核酸文库、化合物文库(例如组合文库(combinatorial library))、反义分子(例如反义DNA或反义RNA)文库、抗体文库等。这种文库适宜于高通量筛选。可将包含mTOR或VEGF的不同细胞暴露于所述文库的各个成员，并确定对所述mTOR活性(或者血管生成途径的组分例如VEGF的活性)的效应。可将阵列技术应用于该目的。所述细胞可以是在空间上分离的，例如在微量滴定板的孔中。

在一个优选的实施方案中，使用了一个小分子文库。“小分子”是指分子量优选低于约50kDa的分子。在具体的实施方案中，小分子的分子量优选低于约30kDa，更优选低于约15kDa，最优选低于大约10kDa。本文中被称为“小分子文库”的这种小分子的文库可包含多肽、小肽(例如20个氨基酸或更短例如15、10或5个氨基酸的肽)、简单化合物等。

此外或另外，如下文中进一步详述的，可就mTOR或VEGF的调节剂或拮抗剂对组合文库进行筛选。

mTOR活性的测定

mTOR的任何活性都可被用作该测定的基础。

具体而言，由mTOR介导的细胞活性可被测定，以鉴定拮抗剂。例如，mTOR负责磷酸化底物，包括真核起始因子4E(eIF4E)和核糖体S6激酶1(S6K1)、RNA聚合酶I和eEF2激酶。因此，所述推定的拮抗剂或激动剂对以下的激酶活性的效应可以使用例如本领域中已知的激酶测定进行测定，即该激酶活性是由mTOR在一种或多种的这些底物(或来源自它们的序列的肽)上介导的。

这些测定可采用4E-BP1和/或S6K1作为底物，或者使用来自于这些多肽的肽作为底物。已知mTOR在Thr37和Thr46处磷酸化4E-BP1并在Thr389处磷酸化S6K1(Schalm SS，Fingar DC，Sabatini DM，Blenis J.Curr Biol.2003 May 13；13(10)：797-806；Schalm SS，Blenis J.Curr Biol.2002 Apr 16；12(8)：632-9)，从而可使用已知的肽合成方法产生包含这些位置的肽底物。

一个用于mTOR激酶活性的测定实例记载于Gary G.Chiang，Robert T.Abraham.Determination of the Catalytic Activities of mTORand Other Members of the Phosphoinositide-3-Kinase-Related KinaseFamily.Checkpoint Controls and Cancer：Volume 2：Activation andRegulation Protocols，July 2004，pps.125-142(ISBN：1-59259-811-0)，Volume #：281，Series：Methods in Molecular Biology。

mTOR激酶测定

另一种mTOR测定公开于Molecular Mechanism of mTORDownstream Signalling(PhD Thesis，S.Schalm，17^th September 2003，Fachbereich Biologie，Chemie，Pharmazie，Freie

Berlin，http://www.diss.fu-berlin.de/2003/249/index.html)。

将细胞在含10％FBS的DMEM中培养48小时，在裂解缓冲液B(40mM HEPES、120mM NaCl、50mM NaF、1mM EDTA、50mMβ-甘油磷酸酯、0.2％CHAPS、1mM Na3VO4、40mg/ml PMSF、5μg/ml胃蛋白酶抑制剂、10μg/ml亮肽素、1mM DTT、ddH2O，pH 7.5)中裂解。将三分之一的来自150-mm板的总细胞裂解物与抗mTOR抗体(例如，Bethyl，Inc，Texas USA)孵育2h，随后与蛋白质-G-琼脂糖珠再孵育1小时。将免疫沉淀物(immunopreciptate)用1ml mTOR洗涤缓冲液A(溶于ddH₂O中的20mM Tris、500mM NaCl、1mM EDTA、20mM β-甘油磷酸酯、5mM EGTA、1mM DTT、1mM Na₃VO₄、40mg/mlPMSF、10μg/ml亮肽素、5μg/ml胃蛋白酶抑制剂，pH 7.4)洗涤两次，用mTOR洗涤缓冲液B(溶于ddH₂O中的10mM HEPES、50mM β-甘油磷酸酯、50mM NaCl、1mM DTT、1mM Na₃VO₄、40mg/ml PMSF、10μg/ml亮肽素、5μg/ml胃蛋白酶抑制剂，pH 7.4)洗涤一次，以及用ST(溶于ddH₂O中的50mM Tris-HCl、5mM Tris base、150mM NaCl，pH 7.28)洗涤一次。

对经洗涤的免疫沉淀物中的重组体GST-4E-BP1 WT或GST-4E-BP1 F114A(即人4E-BP1亚克隆至pGEX-2T/GST中，Pharmacia)的激酶测定是在30℃下在mTOR激酶测定缓冲液(10mMHEPES、50mM NaCl、50mM β-甘油磷酸酯、10mM MnCl₂、100μM未标记的ATP、10μCi[γ-₃₂P]ATP(New England Nuclear)，pH 7.4)中进行30分钟。该反应物经12％SDS-PAGE分离，整合进入GST-4E-BP1中的₃₂P是经放射自显影评估并经磷成像(phosphoimaging)定量(BioRad)。一个激酶单位是由激酶的量定义，也就是，在30℃下1分钟内，催化1pmol磷酸转化至底物中所需的蛋白/反应体积。

mTOR报告基因测定

激活或促进mTOR活性的分子和药剂可通过以下途径进行鉴定：为了筛选激活mTOR的分子，将一个编码这样的mRNA的杂交基因转移至哺乳动物细胞中，即该mRNA具有来源自TOP mRNA(例如L5核糖体蛋白mRNA)的5’UTR及来自报告基因(例如GFP或萤光素酶)的编码区。所述细胞经血清饥饿或雷帕霉素-处理，以关闭所述报告基因的翻译。将细胞暴露于一种候选分子或一个文库成员。添加激活mTOR的分子将上调所述报告基因的翻译(参见图8A和实施例8)。

抑制mTOR活性的分子和药剂可通过以下途径进行鉴定：为了筛选抑制mTOR的分子，将一个编码这样的mRNA的杂交基因转移至哺乳动物细胞中，即该mRNA具有来源自在帽介导的翻译(cap-mediatedtranslation)被抑制时翻译被上调的mRNA(例如p27Kip1 mRNA)的5’UTR及来自报告基因(例如GFP或萤光素酶)的编码区。所述细胞经血清饥饿或雷帕霉素-处理，以打开报告基因的翻译。然后添加血清或除去雷帕霉素，以激活mTOR或关闭报告基因的翻译。将细胞暴露于一种候选分子或一个文库成员。在所述报告基因关闭的时候，加入抑制mTOR的分子以上调所述报告基因的翻译(参见图8B和实施例9)。

细胞周期测定

再者，我们示出了mTOR活性能够延长细胞周期时间；从而，可在一种候选分子存在及不存在的情况测定细胞周期时间，以鉴定mTOR活性的拮抗剂或激动剂。

VEGF活性的测定

为了测定VEGF活性，可测量VEGF的其他各种生物化学活性的任意一种。因此，一种推定的拮抗剂或激动剂对VEGF活性的效应，可通过下列现有技术中已知方法的任意一种或多种进行测定。

VEGF活性的测定可涉及检测与VEGF受体的结合作用。该测定可检测由VEGF结合作用引起的受体二聚化。该测定还可通过对所述VEGF受体的磷酸根转移(transphorylation)来检测活化。

具体而言，可测定由VEGF介导的细胞活性来鉴定拮抗剂。因此，可通过利用本领域中已知的方法确定对内皮细胞有丝分裂发生、细胞迁移和微血管通透性中的任意一种或多种的刺激来测定VEGF活性。

具体而言，VEGF活性还可通过检测并定量血管发生和/或血管生成进行测定。因此，在一个实施方案中，VEGF活性通过在绒毛尿囊膜测定(chotioallantic membrane assay)(CAM)中检测其抗血管生成活性进行测定。如Kim et al(2000)Int.J.Cancer 87：269-275 or Deoanne atal.，(2002)Oncogene 21：427-436所描述，这种CAM测定可通过使用4.5日龄鸡胚进行。

文库

候选分子的文库(例如多肽或核酸文库)可被用于筛选本文所述的mTOR拮抗剂和血管生成抑制剂。将这种文库暴露于mTOR蛋白，并确定它们对所述蛋白活性的任何可能的效应。类似地，可将所述文库暴露于一个实验体系(根据情况，包括血管生成通路的组分，例如VEGF)，并确定它们对血管生成的任何可能的效应。

用于分离大文库中所需成员的筛选方案是本领域中已知的，以噬菌体展示技术为代表。这种体系(其中多种肽序列被展示在丝状噬菌体的表面上(Scott and Smith(1990见上文)))已被证明可用于形成抗体片段(及编码它们的核苷酸序列)文库，用于体外筛选及扩增与靶抗原结合的特异性抗体片段。使所述编码V_H和V_L区的核苷酸序列连接至编码将其定位至大肠杆菌壁膜间隙的前导序列的基因片段，因此所产生的抗体片段被展示于所述噬菌体的表面，通常为与噬菌体外壳蛋白(如pIII或pVIII)的融合体。或者，抗体片段被从外部展示于λ噬菌体壳体(噬菌体主体)。基于噬菌体的展示体系的一个优点是，由于它们是生物学的体系，所选择的文库成员可简单地通过在细菌细胞中培养包含所选文库成员的噬菌体进行扩增。再者，由于编码所述多肽文库成员的核苷酸序列被包含在噬菌体或噬粒(phagemid)载体上，所以测序、表达及随后的基因操作是相对简单的。

用于构建噬菌体抗体展示文库和λ噬菌体表达文库的方法在本领域中是熟知的(McCafferty et al.(1990)见上文；Kang et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：4363；Clackson et al.(1991)Nature，352：624；Lowman et al.(1991)Biochemistry，30：10832；Burton et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.，88：10134；Hoogenboom et al.(1991)Nucleic Acids Res.，19：4133；Chang et al.(1991)J.Immunol.，147：3610；Breitling et al.(1991)Gene，104：147；Marks et al.(1991)见上文； Barbas et al.(1992)见上文；Hawkins and Winter(1992)J.Immunol.，22：867；Marks et al.，1992，J.Biol.Chem.，267：16007；Lerner et al.(1992)Science，258：1313，通过引用的方式纳入本文)。可根据需要对这些技术进行修饰，用于通常的多肽文库的表达。

一种特别有用的方法是使用scFv噬菌体文库(Bird，R.E.，et al.(1988)Science 242：423-6，Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.，85：5879-5883；Chaudhary et al.(1990)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.，87：1066-1070；McCafferty et al.(1990)supra；Clackson et al.(1991)supra；Marks et al.(1991)supra；Chiswell et al.(1992)TrendsBiotech.，10：80；Marks et al.(1992)见上文)。已经描述了展示于噬菌体外壳蛋白上的scFv文库的多个实施方案。噬菌体展示方法的细分也是已知的，例如WO96/06213、WO92/01047(Medical Research Council etal.)和WO97/08320(Morphosys，见上文)中描述的，这些公开文本都通过引用的方式纳入本文。

另外的文库筛选技术包括噬菌体λ表达体系，该体系可作为噬菌体的噬斑或者溶源菌的菌落被直接地筛选，两者均如以前的记载(Huse etal.(1989)Science，246：1275；Caton and Koprowski(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87；Mullinax et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，87：8095；Persson et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：2432)，并且可用于本文描述的方法和组合物中。这些表达体系可用于筛选文库的大量不同的成员，以约10⁶或者更大的数量级。其他的筛选体系依赖于例如文库成员的直接化学合成。一种早期的方法涉及在一系列针状物或杆状物(pins or rods)上合成肽，例如WO84/03564中所描述的。涉及在珠子上合成肽的类似方法(它可形成其中每个珠子均是单独的文库成员的文库)记载于美国专利4,631,211，并且一种相关的方法记载于WO92/00091。对所述基于珠子的方法的一个显著改良涉及，用单独的鉴定标签(例如寡核苷酸)对每个珠子进行标记，目的是有利于对每个文库成员的氨基酸序列进行鉴定。这些以珠子为基础的改良方法记载于WO93/06121。

另一种化学合成方法涉及在一个表面上合成肽(或类肽物)的阵列，使用的方式是将每个不同的文库成员(如独特的肽序列)置于所述阵列中一个不连续的、预定的位置。每个文库成员的身份均是通过其在所述阵列中的空间位置进行确定。确定了所述阵列中发生了预定分子(如受体)和活性文库成员之间的结合相互作用的位置，从而基于空间位置识别所述活性文库成员的序列。这些方法记载于美国专利5,143,854；WO90/15070和WO92/10092；Fodor et al.(1991)Science，251：767；Dower and Fodor(1991)Ann.Rep.Med.Chem.，26：271。

用于产生多肽文库或核苷酸文库的其他体系涉及，将无细胞的酶学方法用于所述文库成员的体外合成。在一种方法中，通过针对靶配体的筛选和PCR扩增的交替轮换来筛选RNA分子(Tuerk and Gold(1990)Science，249：505；Ellington and Szostak(1990)Nature，346：818)。一种类似的技术可用于鉴定结合预定的人转录因子的DNA序列(Thiesenand Bach(1990)Nucleic Acids Res.，18：3203；Beaudry and Joyce(1992)Science，257：635；WO92/05258 and WO92/14843)。可以以一种类似的方式将体外翻译作为一种产生大文库的方法用于合成多肽。这些通常包含稳定化的多核糖体复合体的方法在WO88/08453，WO90/05785，WO90/07003，WO91/02076，WO91/05058，和WO92/02536中进一步描述。非基于噬菌体的另外的展示体系——例如WO95/22625和WO95/11922(Affymax)中公开的那些——使用所述多核糖体展示多肽以用于筛选。这些以及所有前述的文本也都通过引用的方式纳入本文。

所述文库可具体地包括锌指蛋白的文库；锌指蛋白在本领域中是已知的，并作为转录因子。合适的锌指蛋白文库公开于例如WO 96/06166和WO 98/53057。如例如WO 98/53058和WO 98/53060中所公开的，锌指蛋白文库的构建可利用用于确定与具体DNA序列相互作用的规则。能够特异性地与甲基化DNA相互作用的锌指蛋白在WO 99/47656中公开。上述锌指蛋白文库可以被以阵列的形式固定，例如如WO 01/25417中所公开的。因此，能够改变细胞潜能的优选的分子包括锌指蛋白。

组合文库

文库(特别是候选分子的文库)可能适合于为组合文库(也被称为组合化学物文库)的形式。

在本文中使用的术语“组合文库”是多种由随机选择的亚基组成的化学化合物的集合。可从组合文库筛选能够抑制mTOR或血管生成的分子。

现在可获得化学化合物的多种组合文库，包括有效抑制蛋白水解酶和非蛋白水解酶的文库、G-蛋白偶联受体(GPCR)的激动剂和拮抗剂的文库、有效抑制非-GPCR靶标(如整联蛋白、离子通道、域相互作用、核受体和转录因子)的文库、全细胞肿瘤学和抗感染药靶标的文库等。对组合文库的全面综述，特别是它们的构建和用途在Dolle and Nelson(1999)，Journal of Combinatorial Chemistry，Vol 1 No 4，235-282中提供。亦参考Combinatorial peptide library protocols(edited by Shmuel Cabilly，Totowa，N.J.：Humana Press，c1998.Methods in Molecular Biology；v.87)。具体的组合文库及构建它们的方法在美国专利6,168,914(Campbell，et al)、Baldwin et al.(1995)，“Synthesis of a Small Molecule LibraryEncoded with Molecular Tags，”J.Am.Chem.Soc.117：5588-5589和这些文本所提及的参考文献中被公开。

在一个优选的实施方案中，所述被筛选的组合文库是一种这样的文库，即它被设计以有可能包括与所述细胞的组分相互作用以影响基因表达的分子。例如，可筛选针对染色质结构蛋白的组合文库。可用于该实施方案的其他文库包括针对组蛋白修饰的酶(如组蛋白乙酰化的酶或组蛋白甲基化(metylation)的酶)或者DNA修饰(例如DNA甲基化或脱甲基化)的组合文库。

记载化学物组合文库、它们的产生和用途的更多参考文献包括可从URL http://www.netsci.org/Science/Combichem/获得的那些，包括TheChemical Generation of Molecular Diversity.Michael R.Pavia，SphinxPharmaceuticals，A Division of Eli Lilly(Published July，1995)；Combinatorial Chemistry：A Strategy for the Future-MDLInformation Systems discusses the role its Project Library plays inmanaging diversity libraries(Published July，1995)；Solid SupportCombinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization，Adnan M.M.Mjalli and Barry E.Toyonaga，Ontogen Corporation(Published July，1995)；Non-Peptidic Bradykinin Receptor AntagonistsFrom a Structurally Directed Non-Peptide Library.SarvajitChakravarty，Babu J.Mavunkel，Robin Andy，Donald J.Kyle^＊，SciosNova Inc.(Published July，1995)；Combinatorial Chemistry LibraryDesign using Pharmacophore Diversity Keith Davies and Clive Briant， Chemical Design Ltd.(Published July，1995)；A Database System forCombinatorial Synthesis Experiments-Craig James and DavidWeininger，Daylight Chemical Information Systems，Inc.(Published July，1995)；An Information Management Architecture for CombinatorialChemistry，Keith Davies and Catherine White，Chemical Design Ltd.(Published July，1995)；Novel Software Tools for Addressing ChemicalDiversity，R.S.Pearlman，Laboratory for Molecular Graphics andTheoretical Modeling，College of Pharmacy，University of Texas(Published June/July，1996)；Opportunities for Computational ChemistsAfforded by the New Strategies in Drug Discovery：An Opinion，YvonneConnolly Martin，Computer Assisted Molecular Design Project，AbbottLaboratories(Published June/July，1996)；Combinatorial Chemistry andMolecular Diversity Course at the University of Louisville：ADescription，Arno F.Spatola，Department of Chemistry，University ofLouisville(Published June/July，1996)；Chemically Generated ScreeningLibraries：Present and Future.Michael R.Pavia，SphinxPharmaceuticals，A Division of Eli Lilly(Published June/July，1996)；Chemical Strategies For Introducing Carbohydrate Molecular DiversityInto The Drug Discovery Process..Michael J.Sofia，TranscellTechnologies Inc.(Published June/July，1996)；Data Management forCombinatorial Chemistry.Maryjo Zaborowski，Chiron Corporation andSheila H.DeWitt，Parke-Davis Pharmaceutical Research，Division ofWarner-Lambert Company(Published November，1995)；和The Impactof High Throughput Organic Synthesis on R&D in Bio-Based Industries，John P.Devlin(Published March，1996)。

组合化学中的技术在用于产生新药物先导的现代方法中正逐渐获得广泛的肯定(Gallop，M.A.et al.，1994，J.Med.Chem.37：1233-1251；Gordon，E.M.et al.，1994，J.Med.Chem.37：1385-1401)。一种正在使用的组合方法是基于这样的策略，即其涉及在固相载体的每个颗粒上合成包含不同结构的文库，将该文库与一种可溶的受体相互作用，鉴定与所述大分子靶标相互作用的“珠子”，以及确定所述被鉴定的“珠子”携带的结构(Lam，K.S.et al.，1991，Nature 354：82-84)。这种方法的一个备选方案是从所述固体载体上相继释放所述化合物的定量等分试样，随后确定溶液中的活性，鉴定释放所述活性化合物的颗粒，并通过直接测序(Salmon，S.E.et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11708-11712)或读取其代码(Kerr，J.M.et al.，1993，J.Am.Chem.Soc.115：2529-2531；Nikolaiev，V.et al.，1993，Pept.Res.6：161-170；Ohlmeyer，M.H.J.et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10922-10926)阐明其结构。

可溶的随机组合文库可使用用于产生肽的等摩尔混合物的简单原理进行合成，这首先由Furka提出(Furka，A.et al.，1988，Xth InternationalSymposium on Medicinal Chemistry，Budapest 1988；Furka，A.et al.，1988，14th International Congress of Biochemistry，Prague 1988；Furka，A.et al.，1991，Int.J.Peptide Protein Res.37：487-493)。构建用于重复筛选的可溶性文库也已经被提出(Houghten，R.A.et al.1991，Nature354：84-86)。K.S.Lam公开了新的、出奇强有力的使用不溶性随机组合文库的技术。Lam在固相载体上合成随机组合文库，使得每个载体均具有一个有统一分子结构的试验化合物，并且在不事先通过固相结合方案除去所述试验化合物的情况下筛选所述文库(Lam，K.S.et al.，1991，Nature 354：82-84)。

因此，候选分子的文库可以是一种合成的组合文库(如组合化学物文库)、细胞提取物、体液(如尿、血液、泪、汗或唾液)或者合成产物或天然产物的其他混合物(如小分子文库或发酵混合物)。

分子文库可包括，例如氨基酸、寡肽、多肽、蛋白质或者肽或蛋白质的片段；核酸(如反义链；DNA；RNA；或肽核酸，PNA)；适体；或者碳水化合物或多糖。该文库的每个成员都可以是单独的或者可以是混合物(如压缩文库(compressed library))的一部分。该文库可包含纯化的化合物，或者可是“脏的”(即包含相当数量的杂质)。

市售的的文库(如来自Affymetrix、ArQule、Neose Technologies、Sarco、Ciddco、Oxford Asymmetry、Maybridge、Aldrich、Panlabs、Pharmacopoeia、Sigma或Tripose)也可以与本文所述的方法一块使用。

除了上述的文库之外，被称为多样性库(diversity files)的专用文库可用于评估所述新方法的专一性、可靠性或可重复性。多样性库包含大量这样的化合物(如1000种或更多的小分子)，即这些化合物代表在测定中可能导致非特异性检测的多类化合物。多样性库是市售的，或者还可以从通过上文列出的供应商处购得的各个化合物进行组合。

抗体

可用于调节mTOR活性的特异性mTOR拮抗剂(例如，用于治疗或预防疾病如癌症的方法)，可包括所述mTOR蛋白的抗体。

类似地，血管生成抑制剂可包括针对血管生成过程中涉及的任何分子例如VEGF的抗体。

本文使用的抗体是指，能够结合所选靶标的完全抗体或抗体片段，并包括Fv、ScFv、Fab’和F(ab’)₂、单克隆和多克隆抗体、改造的抗体(包括嵌合抗体、CDR-移植抗体和人源化抗体)以及使用噬菌体展示或其他技术产生的人工选择抗体。小片段(例如Fv和ScFv)具有用于诊断及治疗应用的有利性质，这是由于它们的小尺寸及因此较好的组织分布。

本文所述的抗体可以是包含效应物蛋白(例如标记物)的经修改的抗体。特别优选的是使得可在体内或体外对所述抗体分布进行成像的标记物。这种标记物可以是放射性标记物或不透射线(radioopaque)的标记物，例如金属颗粒，它们在胚胎或细胞块中是易于显像的。而且，它们可以是荧光标记物或可在组织样品上显影的其他标记物。

重组DNA技术可用于改良本文所述的抗体。因此，可构建嵌合抗体，目的是降低其在诊断或治疗应用中的免疫原性。而且，还可通过人源化所述抗体来使免疫原性最小，所述人源化是通过CDR移植[参见欧洲专利申请0 239 400(Winter)]，并且任选地通过框架修饰[EP 0 239 400]来实现。

抗体可来自动物血清，或者在单克隆抗体及其片段的情况下在细胞培养物中产生。，可依照已经确立的方法使用重组DNA技术在细菌培养物或优选地在哺乳动物细胞培养物中产生所述抗体。所选择的细胞培养物体系优选地分泌所述抗体产物。

因此，我们公开了一种用于产生抗体的方法，包括培养一种宿主例如大肠杆菌或哺乳动物细胞，该宿主已经被用包含以下表达盒的杂种载体转化，即该表达盒包含一个可操作地连接至编码信号肽的第一DNA 序列的启动子，并且该第一DNA序列以正确的阅读框连接至编码所述抗体蛋白质的第二DNA序列；分离所述蛋白质。

杂交瘤细胞或哺乳动物宿主细胞的体外繁殖是在合适的培养基中进行的，所述培养基为通常的标准培养基，例如达尔伯克氏改良的伊格尔培养基(DMEM)或RPMI 1640培养基，任选地补充有哺乳动物血清，如胎牛血清；或者微量元素及生长维持添加物，例如饲养细胞(如正常小鼠腹腔渗出细胞、脾细胞、骨髓巨噬细胞)、2-氨基乙醇、胰岛素、转铁蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。同样，细菌细胞或酵母细胞这样的宿主细胞的繁殖也在本领域已知的合适培养基中进行，例如细菌培养基有LB、NZCYM、NZYM、NZM、极品肉汤(Terrific Broth)、SOB、SOC、2×YT或M9基本培养基，酵母培养基有YPD、YEPD、基本培养基或完全基本省却成分培养基(Complete Minimal Dropout Medium)。

体外生产可提供相对纯的抗体制品，并且可被放大以得到大量的所需抗体。用于细菌细胞、酵母或哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的，包括均质悬液培养，例如在气升式反应器或者在连续搅拌反应器中；或者固定的或包埋的细胞培养，例如在中空纤维或微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷柱(ceramic cartridge)上。

大量的所需抗体还可以通过体内繁殖哺乳动物细胞而获得。为了该目的，将产生所需抗体的杂交瘤细胞注入至组织相容的哺乳动物中，以引起产生抗体的肿瘤的生长。任选地，在所述注入之前，对动物预注入碳水化合物，特别是矿物油如姥鲛烷(四甲基-十五烷)。在1-3周后，将所述抗体从这些哺乳动物的体液中分离出。例如，将通过将合适的骨髓瘤细胞与来自Balb/c小鼠的产生抗体的脾细胞融合得到的杂交瘤细胞，或者来源自产生所需抗体的杂交瘤细胞系Sp2/0的转染细胞经腹腔内注入至Balb/c小鼠(任选地经姥鲛烷预处理)中，在1-2周后，从所述动物中取腹水。

前述的技术及其他技术记载于例如Kohler and Milstein，(1975)Nature 256：495-497；US 4,376,110；Harlow and Lane，Antibodies：aLaboratory Manual，(1988)Cold Spring Harbor，该文献通过引用的方式纳入本文。用于制备重组抗体分子的技术记载于上述的参考文献中，也记载于例如EP 0623679；EP 0368684和EP 0436597中，它们通过引用的方式纳入本文。

从所述细胞培养上清液中筛选所需的抗体，优选通过对PGC或者其他多能细胞(例如ES或EG细胞)的荧光染色、通过免疫印迹、通过酶免疫测定(如夹心测定(sandwich assay)或斑点测定(dot-assay))或放射免疫测定。

为了分离所述抗体，可以通过例如用硫酸铵沉淀、对吸湿性物料如聚乙二醇透析、通过选择性膜过滤等将所述培养基上清液或所述腹水中的免疫球蛋白浓缩。如果必需和/或需要，将所述抗体经常规的色谱法进行纯化，所述色谱法例如凝胶过滤、离子交换色谱法、DEAE-纤维素色谱法和/或(免疫)亲和色谱法，例如与mTOR或其片段或者与蛋白A的亲和色谱法。

还提供了分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。优选的杂交瘤细胞是遗传稳定的，分泌具有所需特异性的单克隆抗体，并且可通过融化和再克隆从深度冰冻的培养物活化。

还包括的是一种用于制备分泌抗mTOR的单克隆抗体的杂交瘤细胞系的方法，其特征在于将合适的动物(例如Balb/c小鼠)经一种或多种mTOR多肽或其抗原片段免疫；将所述经免疫动物的产生抗体的细胞与合适的骨髓瘤细胞系的细胞融合，将所述融合得到的杂交细胞克隆，并筛选分泌所需抗体的细胞克隆。例如，将经mTOR免疫的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系PAI或骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14的细胞融合，就所需抗体的分泌对所得到的杂交细胞进行筛选，并克隆阳性的杂交瘤细胞。

优选的是一种用于制备杂交瘤细胞系的方法，其特征在于通过在数月内(如2-4个月)皮下和/或腹腔内注入10⁷-10⁸个表达mTOR的细胞及合适的佐剂数次(如4-6次)来免疫Balb/c小鼠，并且在最后一次注射后2-4天从所述免疫小鼠中取脾细胞，并在存在融合促进剂(优选聚乙二醇)的条件下将其与骨髓瘤细胞系PAI的细胞融合。优选地，所述骨髓瘤细胞与3-20倍过量的来自所述免疫小鼠的脾细胞融合，所用溶液包含约30％-约50％的分子量为大约4000的聚乙二醇。在融合之后，将所述细胞在如上文所述的合适培养培养基中扩大，在规则的间隔添加一种选择性培养基(例如HAT培养基)以防止正常骨髓瘤细胞的生长超过所需的杂交瘤细胞。

还公开了包含编码如上文所述的抗mTOR抗体的重链可变区和/或轻链可变区的插入片段的重组DNA。根据定义，这种DNA包括编码单链DNA、由所述编码DNA及其互补DNA组成的双链DNA或者这些互补(单链)DNA本身。

再者，编码抗mTOR抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA可以是酶法合成或化学合成的DNA，所述DNA具有编码重链可变区和/或轻链可变区的真实DNA序列或其变体。所述真实DNA的变体是编码有以下修饰的上述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA，即在所述抗体中一个或多个氨基酸被删除或者被一个或多个其他氨基酸替换。所述修饰优选位于所述抗体重链可变区和/或轻链可变区的CDR之外。这种突变体DNA还意欲是指一种沉默型突变体，其中一种或多种核苷酸被其他核苷酸置换且新密码子编码相同氨基酸。这种突变体序列也是简并序列。简并序列是在遗传密码子意义上的简并，这是因为无限数目的核苷酸可被其他核苷酸置换而不导致原始编码的氨基酸序列的变化。这些简并的序列可能是有用的，这是因为它们不同的限制位点以及/或者具体宿主(特别是大肠杆菌)为获得重链鼠可变区和/或轻链鼠可变区的最佳表达而首选的特定密码子频率。

术语突变体意欲包括，根据现有技术中已知的方法通过对所述真实DNA的体外诱变得到的DNA突变体。

为了组装完整的四重免疫球蛋白分子并表达嵌合抗体，将所述编码重链和轻链可变区的重组DNA插入片段与编码重链和轻链恒定区的相应DNA融合，然后例如在整合进入杂种载体之后，将所述融合物转移至合适的宿主细胞中。

还公开的是包含以下序列的重组DNA，即与人恒定区融合的编码抗mTOR抗体的重链鼠可变区的插入片段，所述人恒定区例如γ1、γ2、γ3或γ4，优选γ1或γ4。同时，还公开了包含以下序列的重组DNA，即与人恒定区κ或λ(优选κ)融合的编码抗mTOR抗体的轻链鼠可变区的插入片段。

在另一个实施方案中，我们公开了编码重组体多肽的重组体DNA，其中所述重链可变区和所述轻链可变区通过一个间隔物基团连接，任选地包含一种有利于所述抗体在所述宿主细胞中加工的信号序列，以及/ 或者编码有利于所述抗体的纯化的肽和/或切割位点和/或肽间隔物和/或效应物分子的DNA。

编码一种效应物分子的DNA意欲是指编码在诊断或治疗应用中使用的效应物分子的DNA。因此，具体指出了为毒素或酶(特别是能够催化前药的活化的酶)的效应物分子。编码这种效应物分子的DNA具有编码天然存在酶或毒素的DNA的序列或其变体，并且可通过现有技术中熟知的方法来制备。

抗体的递送

可通过现有技术中已知的技术将抗所述mTOR蛋白的抗体或者抗血管生成过程中涉及的任何分子的抗体(例如VEGF抗体)递送至细胞中，例如通过使用脂质体、聚合物(如聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物、聚酰胺胺(PAMAM)树枝状聚合物(dendrimer)、HEMA、线性聚酰胺胺聚合物等)等。所述免疫球蛋白和/或抗体还可以被作为与能够穿越质膜和/或核膜的蛋白的蛋白融合物或缀合物而递送至细胞。例如，所述免疫球蛋白和/或靶标可与有易位活性的蛋白的结构域或序列融合或轭合。优选的易位结构域和序列包括来自HIV-1-反式激活蛋白(Tat)、果蝇触角足同源蛋白和单纯疱疹病毒1型VP22蛋白的结构域和序列。

给药

所述第一和/或第二药剂或者一种包含它们的组合物可以被以药物组合物的形式经常规的医学途径给药。本文上下文中的药物组合物是这样一种物质组合物，即该组合物包含至少一种mTOR抑制剂或拮抗剂，连同包含血管生成抑制剂的第二药剂，作为活性成分。

应考虑到，所述药物组合物的活性成分需要呈现优良的治疗活性，例如在癌症、肿瘤、新生物和其他相关疾病的缓和中。可调节剂量方案，以获得最佳的治疗反应。例如，可每天给予多个分开的剂量，或者可根据治疗情形紧迫性的需要按比例减小剂量。

所述活性化合物可被以常规的方式给予，例如通过口、静脉内(如果可溶于水)、肌肉内、皮下、鼻内、真皮内或者栓剂途径或植入(如使用缓释分子)。根据给药途径，所述活性成分可能需要被包被在一种材料中，以防止所述成分与可能使所述成分失活的酶、酸和其他天然条件的反应。

在某些实施方案中，所述mTOR活性的抑制剂被以口服组合物的形式提供，并被相应地给予。所述mTOR活性的抑制剂的剂量可以为约1mg/天-约10mg/天。

在某些实施方案中，所述血管生成抑制剂被以可注射组合物或静脉内组合物提供，并被相应地给予。所述血管生成抑制剂的剂量可以为约5mg/kg/2周-约10mg/kg/2周，例如在给予阿瓦斯汀的情况下。对于其他药物，所述血管生成抑制剂可以例如以下的剂量提供，即10-300mg/天，优选至少30mg/天，优选少于200mg/天，优选30mg/天-200mg/天。

为了通过非消化道给药之外的途径给予所述结合物，将该结合物用一种物质包被或与之一起给予，以防止其失活。例如，所述结合物可在一种佐剂中给予；与酶抑制剂共给予；或者在脂质体中给予。使用佐剂的最广义意义，其包括任意免疫刺激化合物如干扰素。本文考虑到的佐剂包括间苯二酚、非离子型表面活性剂如聚氧乙烯油基醚和正十六基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰脏胰蛋白酶。

脂质体包括水包油包水CGF乳剂以及常规的脂质体。

所述活性化合物还可以被经肠胃外途径或腹内途径给予。分散物还可以用甘油、液态聚乙二醇及它们的混合物，以及油制备分散液。在某些实施方案中，可用30％Capsitol(CyDex，Inc.，Lenexa，Kansas，USA)制备分散液。Capsitol是一种聚阴离子β-环糊精衍生物，即由丁醚间隔物基团或磺丁基醚(SBE)将磺酸钠盐与所述亲脂的洞隔离。所述环瑚精可以是SBE7-β-CD。

在普通的存储和使用条件下，这些制品可包含防腐剂以阻止微生物的生长。

适宜于注射用途的药物形式包括无菌的水性溶液(如果可溶于水)或分散液，以及用于即时制备无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是达到易于注射程度的流体。它在制造和存储条件下必须是稳定的，并且必须在防止微生物如细菌和真菌的污染作用的情况下保藏。所述载体可以是一种溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、它们合适的混合物以及植物油。适当的流动性可通过例如以下途径保持：通过使用包衣料如卵磷脂；在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小；以及通过使用表面活性剂(superfactant)。

微生物活动的预防可通过多种抗细菌药剂和抗真菌药剂实现，所述抗细菌药剂和抗真菌药剂例如对羟苯甲酸酯(parabens)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thirmerosal)等。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。对所述可注射组合物的延长吸收可通过以下途径实现，即使用延迟吸收的药剂的组合物，例如单硬脂酸铝和明胶。

无菌可注射溶液通过以下途径制备：根据需要，将所需量的活性化合物与上文列举的多种其他成分掺入合适的溶剂中，然后进行过滤灭菌。分散液一般通过以下方式制备：将所述灭菌的活性成分掺入一种包含基本分散介质和来自上文列举的那些其他所需成分的无菌载体中。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，用所述技术可从其预先无菌过滤的溶液获得含有所述活性物质加任何其他所需成分的粉末。

当将所述多肽结合物按照上文所述适当地保护起来，那么它可以与例如一种惰性稀释剂或者与一种可吸收的食用载体一起口服给药；或者它可以被封装于硬壳或软壳明胶胶囊中；或者它可以被压缩成片剂；或者它可以直接与日常饮食的食物整合。对于口服治疗给药，所述活性化合物可以与赋形剂整合，并且以可消化的片剂(tablet)、口含片剂、锭剂(troche)、胶囊、酏剂、悬液、糖浆剂、糯米纸囊剂(wafer)等形式使用。这种治疗有效的组合物中活性化合物的量使得将可以获得适合的剂量。

所述片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以包含以下组分：粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，例如硬脂酸镁；并且可加入增甜剂，例如蔗糖、乳糖或糖精；或者调味剂，例如薄荷、冬青油或樱桃调味料。当所述剂量单位形式为胶囊时，除包含以上类型的材料外，它还可包含一种液体载体。

多种其他材料可作为包衣料存在，或者要不然用于修饰所述剂量单位的外形。例如，片剂、丸剂或胶囊可被紫胶、糖或者它们二者同时包被。糖浆或酏剂可包含所述活性化合物，蔗糖作为增甜剂、甲基及丙基对羟苯甲酸(methyl and propylparabens)作为防腐剂、染料及调味料如樱桃调味剂或橙调味剂。当然，制备任何剂量单位形式中所使用的任何材料均应该是药用纯的，并且所采用的量基本上是无毒的。另外，所述活性化合物可被掺入至持续释放的制品和制剂中。

本文使用的“可药用的载体和/或稀释剂”包括任何及全部的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是已知的。除因为任何常规介质或药剂与所述活性成分不相容外，它们在所述药物组合物中的应用均被考虑。也可以将补充的活性成分整合到该组合物中。

为了方便给药及剂量的一致性，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是特别有利的。本文使用的剂量单位形式是指适宜作为用于待治疗的哺乳动物受试者单个剂量的物理上不连续单位；每个单位包含为产生所需治疗效果而计算得出的预定量的活性材料，以及所需的药物载体。所述新剂量单位形式的规格取决于或直接依赖于(a)所述活性材料的独特特征及需要达到的具体治疗效果，以及(b)在复合领域中的固有局限，例如用于治疗患有使身体健康受损的疾病病症的活体受试者体内的疾病的活性材料。

在剂量单位形式中将所述基本活性成分与合适的可药用载体复合，用于将其以有效量方便地且有效地给予。在组合物包含补充活性成分的情况下，该剂量通过参照通常剂量及所述成分的给药方式来确定。

在某些实施方案中，为mTOR活性的拮抗剂的所述第一药剂，和包含血管生成抑制剂(如别处详述)的所述第二药剂可以被以药物组合物的形式提供。

虽然有可能单独给予包含所述第一和第二药剂的组合物，但是优选将所述一种或多种活性成分配制成药物制剂。因此，我们还公开了包含一种为mTOR活性的拮抗剂的第一药剂，连同一种包含血管生成抑制剂的第二药剂的药物组合物。我们还公开了包含一种为mTOR活性的拮抗剂的第一药剂的药物组合物，该药物组合物适合于与一种包含血管生成抑制剂的第二药剂共同给予。我们还公开了包含一种包含血管生成抑制剂的第二药剂的药物组合物，该药物组合物适合于与一种所述的第一药剂共同给予。

这种药物组合物可用于递送所述第一或第二药剂或者它们二者(优选为所述组合物的形式)至个体中，用于治疗或减轻所述的症状。

所述组合物可包含为mTOR活性的拮抗剂的所述第一药剂，任选地连同一种包含血管生成抑制剂的第二药剂；或者两种药剂任一种的片段、同源物、变体或衍生物、结构相关的化合物或酸性盐。所述药物制剂包含有效量的所述第一和/或第二药剂或者它们的片段、同源物、变体或衍生物，连同一种或多种可药用载体。“有效量”是指足以减轻所述疾病的至少一种症状的量，所述疾病例如癌症、肿瘤和新生物，包括肝细胞癌(HCC)。

该有效量将依赖于待治疗或减轻的具体疾病或症状以及其他因素而变化，所述其他因素包括患者的年龄及体重、疾病等状态处于何种发展阶段、患者的一般健康状况、症状的严重度，以及所述第一和/或第二药剂或者它们的变体或衍生物是单独给予还是与其他治疗物结合给予。

合适的可药用载体在本领域中是熟知的，并且可根据所需的形式和所述药物制剂的给予模式而变化。例如，它们可包含稀释剂或赋形剂，例如填充物、粘合剂、湿润剂、分解剂、表面活性剂、润滑剂等。所述载体一般为固体、液体或可蒸发的载体或者它们的组合。在与所述制剂中的其他成分相容且对患者无害的意义下，每种载体都将是“可用的”所述载体在被给予宿主的时候应该是生物学上可用的，而不诱发不良反应(例如免疫应答)。

本文公开的所述药物组合物包括适宜于外用和口服给药的那些，当组织感染主要在皮肤或表皮(例如银屑病、湿疹或其他表皮疾病)时则优选外用制剂。所述外用制剂包括那些其中通过与待治疗的皮肤表面之间接触将所述组合物在外部施加的药物形式。常规的外用药物形式包括浸剂、软膏剂、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、棒剂(stick)、喷剂、气雾剂、浴油、溶液等。外用治疗物可通过多种载体递送，对载体的选择是重要的，并且一般与待治疗的疾病是急性还是慢性有关。作为一个实例，急性皮肤增殖疾病通常用水性干燥制品进行治疗，而慢性皮肤增殖疾病用水合的制品进行治疗。浸泡是最简单的对急性潮湿疹(acute moisteruption)进行干燥的方法。洗剂(水悬液中的粉剂)和溶液(溶解于溶剂中的药物)最适合于毛发及擦烂部位。软膏剂或油包水乳剂是最有效的水合剂，适合于干燥鳞状疹，但是是油腻的且取决于损伤部位，有时候是不利的。根据需要，它们可以与绷带结合使用，特别是在需要增加所述药剂组合物渗透进入损伤灶中的时候。霜剂或水包油乳剂和凝胶是可吸收的，并且最适合患者用于化妆。(Guzzo et al，in Goodman&Gilman’s Pharmacological Basis of Therapeutics，9th Ed.，p.1593-15950(1996))。霜剂制剂一般包括的组分例如：石油、羊毛脂、聚乙二醇、矿物油、甘油、异丙基棕榈酸酯、甘油基硬脂酸酯、鲸蜡醇(cetearylalcohol)、生育酚乙酸酯(tocopheryl acetate)、肉豆蔻酸异丙酯(isopropylmyristate)、羊毛脂醇、西甲硅油(simethicone)、卡波姆(carbomen)、甲基氯异噻唑啉酮(methylchlorisothiazolinone)、甲基异噻唑啉酮(methylisothiazolinone)、环甲基硅氧烷(cyclomethicone)和羟丙基甲基纤维素，以及它们的混合物。

另外的外用制剂包括洗发剂、肥皂、摇洗剂等，特别是那些为在下面的皮肤如头皮上留下残液而配制的(Arndt et al，in Dermatology InGeneral Medicine 2：2838(1993))。

一般而言，所述组合物在所述外用制剂中的浓度量是所述组合物重量的约0.5-50％，优选约1-30％，更优选约2-20％，并且最优选约5-10％。所使用的浓度在初始时可以是所述范围的较上部分，随着治疗的继续，可降低所述浓度或者可缩减所述制剂的应用频率。外用给药一般每天进行两次。然而，每天给予一次较大剂量，或者更频繁地给予较小剂量可能是有效的。角质层可作为储蓄池，使得药物经过延长的时间阶段逐渐渗透至活皮肤层中。

在外用给药中，为了获得所需的药理效果，必须使足够量的活性成分渗透患者皮肤。一般要理解，药物吸收至皮肤中是药物本性、载体性能及皮肤的函数。三个主要变量可解释不同外用药物或不同载体中同一种药物的吸收速率或流动速率中的差异；药物在载体中的浓度，药物在角质层和所述载体之间的分配系数，以及药物在角质层中的扩散系数。为了有效地用于治疗，药物必须透过起到皮肤屏障功能的角质层。一般而言，在体外有较大皮肤渗透能力的外用制剂在体内是有效的。Ostrenga等人(J.Pharm.Sci.，60：1175-1179(1971))已证明，外用的甾族化合物在体内的有效性与甾族化合物进入体外的人皮肤片中的渗透率成比例。

可以将可用于皮肤的且与所述药剂相容的皮肤渗透增强剂掺入所述制剂中，以增加所述一种或多种活性化合物从皮肤表面至表皮角质形成细胞中的渗透。增加所述一种或多种活性化合物吸收进入皮肤的皮肤增强剂可减少有效治疗所需的药剂量，并且可提供所述制剂的较长持续效应。皮肤通透增强剂在本领域中是熟知的。例如，二甲基亚砜(美国专利3,711,602)；油酸、1，2-丁二醇表面活性剂(Cooper，J.Pharm.Sci.，73：1153-1156(1984))；乙醇和油酸或油醇的结合物(EP 267,617)、2-乙基-1，3-己二醇(WO 87/03490)；十二烷基甲基亚砜和Azone.RTM。(Hadgraft，Eur.J.Drug.Metab.Pharmacokinet，21：165-173(1996))；alcohols，sulphoxides，fatty acids，esters，Azone.RTM.，pyrrolidones，urea andpolyoles(Kalbitz et al，Pharmazie，51：619-637(1996))。

已知萜例如1，8-桉油素、薄荷酮、柠檬烯和橙花叔醇(Yamane，J.Pharmacy&Pharmocology，47：978-989(1995))；Azone.RTM.andTranscutol(Harrison et al，Pharmaceutical Res.13：542-546(1996))；以及油酸、聚乙二醇和丙二醇(Singh et al，Pharmazie，51：741-744(1996))可提高活性成分的皮肤通透性。

药剂或组合物的通透水平可通过本领域技术人员已知的技术进行确定。例如，对所述活性化合物进行放射性标记，随后测量皮肤所吸收的经放射性标记的化合物的量，这样就使得本领域技术人员可确定所吸收的组合物的水平，可使用的方法是确定该测试化合物的皮肤通透性的多种方法中的任一种。与皮肤通透性研究相关的出版物包括Reinfenrath，W G and G S Hawkins.The Weaning Yorkshire Pig as an Animal Modelfor Measuring Percutaneous Penetration.In：Swine in BiomedicalResearch(M.E.Tumbleson，Ed.)Plenum，New York，1986和Hawkins，G.S.Methodology for the Execution of In Vitro Skin PenetrationDeterminations.In：Methods for Skin Absorption，B W Kemppainenand W G Reifenrath，Eds.，CRC Press，Boca Raton，1990，pp.67-80；andW.G.Reifenrath，Cosmetics&Toiletries，110：3-9(1995)。

对于某些应用，优选使用现有技术中已知的制剂(例如聚合物)来给予长效形式的药剂或组合物。可以将所述药剂掺入真皮片(dermalpatch)(Junginger，H.E.，in Acta Pharmaceutica Nordica 4：117(1992)；Thacharodi et al，in Biomaterials 16：145-148(1995)；Niedner R.，inHautarzt 39：761-766(1988))或者根据本领域中的已知方法的绷带中，以增加将所述药物送递至待治疗部位的效率。

任选地，本文所述的外用制剂可含有另外的赋形剂，例如，防腐剂，如甲基对羟苯甲酸酯(methylparaben)、苯甲醇、山梨酸或季铵化合物；稳定剂，如EDTA；抗氧剂，如丁羟甲苯或丁羟基茴香醚；以及缓冲剂，如柠檬酸盐和磷酸盐。

所述药物组合物可以被以片剂、胶囊剂或溶液形式的口服制剂给予。将有效量的所述口服制剂每天给予患者1-3次，直至疾病症状减轻。药剂的有效量依赖于患者的年龄、体重及病症。一般而言，药剂的日口服剂量为1200mg以下，并且100mg以上。优选的日口服剂量为约300-600mg。口服制剂可方便地以单位剂量形式存在，并且可通过药学领域中任何已知的方法制备。所述组合物可与合适的可药用载体一起被配制成任何所需的剂量形式。单位剂量形式一般包括片剂、丸剂、粉剂、溶液、悬液、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂。一般而言，所述制剂可通过下述方式来制备，使所述药剂组合物均匀地并紧密地(uniformly andintimately)与液态载体或细分的固态载体或者它们二者结合，并且根据需要将产品定形。可将所述活性成分掺入多种液体、粉剂、片剂、胶囊形式的基体材料中，以给予有效量的活性成分来治疗疾病。

适合用于本发明的其他治疗剂为可有效用于既定目的的任何相容的药物，或者与所述药剂制剂互补的药物。组合疗法中所使用的制剂可与其他治疗同时或序贯给予，使得结合效应出现。

实施例

实施例A1至A7证明，贝伐单抗可抑制异种移植物的生长，并延长人肝细胞癌的腹腔移植模型的存活期。

实施例A1.实施例A2至A7的材料和方法

试剂

抗cdc-2、Cdk-4、Cdk-2、Cdk-6、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1和α-微管蛋白的抗体购自Santa CruzBiotechnology Inc，Santa Cruz，CA。CD31/血小板内皮细胞粘着分子1(PECAM-1)、VEGF、p16^INK4a、p21^WAF1、p27^Kip1和Ki-67的抗体购自Lab Vision，Fremont，CA。缀合的二抗由Pierce，Rockford，IL提供。化学发光检测体系由Amersham，Pharmacia Biotech，Arlington Heights，IL提供。

贝伐单抗对皮下的HCC异种移植物生长的效应

本研究获得新加坡国立癌症中心和新加坡中央医院(NationalCancer Centre of Singapore and Singapore General Hospital)的伦理委员会的批准。所有小鼠均根据National Institute of Health，USA出版的“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”进行饲养。对它们不加限制地提供的灭菌食物和水，并且将它们置于12h光/暗周期的负压隔离室中。

用9-10周龄的雄性SCID小鼠(Animal Resources Centre，CanningVale，West Australia)进行HCC异种移植。如前文所述，将6个确立的HCC异种移植物系2-1318、5-1318、26-1004、30-1004、26-1004(Cirr)和2006移植至SCID小鼠中(参考文献A27)。这些异种移植物的形成及表征在别处有报道(参考文献A27)。

为了研究VEGF对HCC异种移植物生长的效应，将贝伐单抗以合适的浓度稀释于盐水溶液中。从肿瘤移植后第7天开始，每14天给携带HCC异种移植物的小鼠经腹腔内注入100μl的盐水(n＝12)或5mg/kg贝伐单抗(n＝12)。在此时，所述HCC异种移植物达到约100mg的大小。每周至少对确立的肿瘤异种移植物的生长监测两次，用游标卡尺测量肿瘤长度和宽度。肿瘤体积的计算方法如下：肿瘤体积＝[(长)×(宽²)×(π/6)]。在该实验结束后，将动物处死，记录体重和肿瘤重量，收集肿瘤用于分析。

贝伐单抗对HCC的腹腔移植模型的效应

将含5×10⁶的26-1004(Met)细胞的200μl磷酸盐缓冲液(PBS)经腹腔内(IP)注射到雄性SCID小鼠腹腔腔内。细胞可以在小鼠腹腔内扩散，并且在腹腔内注入后4周形成腹水。

在接种肿瘤细胞2周后，将携带IP肿瘤的小鼠随机分配至如下两个处理组中(n＝14)：(a)对照小鼠：每两周IP注射200μl PBS，(b)每两周在标明的时间IP注射5mg/kg贝伐单抗。每周3次监测存活情况及腹水形成。为了监测腹腔癌病的发展程度，定期地测量体重。在小鼠垂死时将其处死并进行尸检。记录每只小鼠中存在腹水的情况。我们还检查了肉眼可见的腹腔肿瘤扩散，以及腹部肿瘤的大小和数目。存活情况通过Kaplan-Meier方法进行评估。本研究至少重复2次。

免疫组织化学

将5μM的切片除蜡，再水化并用于抗原修复(antigen retrieval)。在阻断内源性过氧化物酶活性并阻断非特异性染色后，使所述切片与抗PECAM-1、VEGF、Ki-67(Lab Vision)和切割的半胱天冬氨酸酶-3(caspase-3)的一抗(Cell Signaling Technology)孵育(4℃下过夜)。依照制造商的说明书(Lab Vision)使用链霉亲和素-生物素过氧化物酶复合体方法并使用DAB作为色原(chromogen)进行免疫组织化学。在每一批中孵育已知阳性染色的切片，并且还通过用免疫前血清替换所述一抗制备阴性对照。对于Ki-67，仅核的免疫反应被认为是阳性的。在每个区域中计数至少500个细胞中的经标记的细胞数目，然后表示为百分比值。为了在CD31染色的切片中定量平均的血管密度，对于每个肿瘤在100×的放大率下随机地抓取10个0.159mm²视野，并定量微血管数目。对于VEGF表达，由两个独立的观察者对免疫定位进行评分如下：阳性染色、斑状染色(pathchy staining)和阴性染色，具体的染色分别为在60-100％、20-60％和0-20％的肝细胞中是可检测到的。

蛋白质印迹分析

并如前述(参考文献A27)制备组织裂解物，并对其进行蛋白质印迹分析。所有一抗都以1μg/ml的终浓度使用。

统计分析

使用ANOVA检验比较了体重、腹水形成、腹腔肿瘤负荷、肿瘤重量、Ki-67、VEGF表达、平均血管密度和切割的半胱天冬氨酸酶-3-阳性细胞。存活分析通过Kaplan-Meier方法进行计算，并用时序检验(Log-rank test)进行比较。

实施例A2.用贝伐单抗抑制异种移植物的生长

为了检验肿瘤诱导的VEGF在HCC生长中的作用，将携带异种移植物5-1318、2-1318、30-1004、2006、26-1004(Cirr)和26-1004的小鼠用贝伐单抗处理，贝伐单抗为重组人源化的抗VEGF单克隆抗体。确定贝伐单抗的动物毒性以及抑制肿瘤形成和进展的能力。在初步研究中，我们发现用相同IgG同种型的非特异性抗体的处理对肿瘤生长没有效应，基本上等价于仅使用载体(数据未显示)。

对于剂量反应实验，从肿瘤植入后第7天开始，每周给携带2-1318异种移植物的小鼠IP注射2.5、5和10mg贝伐单抗/kg体重。

肿瘤形成在对照和三个贝伐单抗-处理组中都是100％。在用2.5、5和10mg的贝伐单抗处理小鼠时，2-1318异种移植物的生长率分别被抑制15％、75％和80％(p＜0.01)。因为5mg/kg的剂量显示了最大的生长抑制，所以我们选择该剂量的贝伐单抗用于随后的研究。在以5mg/kg的剂量给予贝伐单抗时，也抑制了26-1004(图1B)、5-1318(图1C)和2006(图1D)异种移植物的生长(p＜0.01)。

表A1示出，贝伐单抗显著抑制6个皮下HCC肿瘤中的5个的生长。贝伐单抗对26-1004(Cirr)异种移植物生长几乎没有效应。生长抑制大约出现在处理的1周后。在所有贝伐单抗处理的异种移植物系中，均观察到肿瘤生长率的降低但没有导致消退(图1)。在处理过程中，没有观察到贝伐单抗对体重(表A1)、动物行为或严重毒性的显著效应(数据未显示)。

表1示出，贝伐单抗对6个HCC异种移植物的收集时肿瘤重量、微血管密度、细胞增殖、VEGF表达和凋亡的效应。如材料和方法中所述，将6个标明的HCC异种移植物系经皮下(s.c.)植入至雄性SCID小鼠的右侧。从肿瘤细胞注入后第7天开始，每2周给携带HCC异种移植物的小鼠IP给予载体或5mg/kg贝伐单抗，持续21天。在此时，所述HCC异种移植物达到约100mg的大小。肿瘤中平均血管密度、VEGF表达、Ki-67指标(Ki-67 index)和凋亡均通过免疫组织化学染色进行确定，使用的分别是抗CD31抗体、抗VEGF抗体、抗Ki-67抗体和抗切割的半胱天冬氨酸酶-3抗体。在载体-处理组和贝伐单抗-处理组之间，收集时肿瘤重量、微血管密度、VEGF阳性细胞的数目、Ki-67指标和切割的半胱天冬氨酸酶-3阳性细胞的差异通过ANOVA进行分析。符号^＊表示p＜0.01。

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实施例A3.贝伐单抗对异种移植中血管形成的抑制

我们接下来检测贝伐单抗的抗肿瘤活性与其抑制这些异种移植物中血管形成的能力的关联。在给予贝伐单抗或载体后21天时收集肿瘤。所述肿瘤中的平均血管密度通过用抗CD31抗体的组织化学染色进行确定。来自载体-处理小鼠和贝伐单抗-处理小鼠的CD-31-阳性肿瘤细胞的中值显示于表A1。

贝伐单抗的处理显著减少2-1318、5-1318、26-1004、30-1004和2006中的血管密度均值(p＜0.01)。表A1示出，在所有异种移植物系中检测到不同程度的VEGF表达，并且贝伐单抗对它的表达没有效应。耐贝伐单抗的26-1004(Cirr)异种移植物具有比其他HCC异种移植物系更低的VEGF表达(表A1)。

实施例A4.贝伐单抗在体内的抗增殖效应和抗凋亡效应

为了检验贝伐单抗在体内的抗增殖效应和抗凋亡效应，将来自载体-处理的HCC肿瘤和贝伐单抗-处理的HCC肿瘤的切片分别经Ki-67抗体和切割的半胱天冬氨酸酶-3抗体染色。

免疫组织化学分析显示，贝伐单抗-处理的异种移植物2-1318、5-1318、26-1004、30-1004和2006，但不包括26-1004(Cirr)中的Ki-67标记指标是显著降低的(p＜0.01)(表A1)。切割的半胱天冬氨酸酶-3所染色的细胞的百分数在载体-处理的异种移植物和贝伐单抗-处理的异种移植物之间没有显著差异，这说明贝伐单抗没有引起HCC细胞的凋亡(表A1和A2)。

这些结果支持这样的观点，即由贝伐单抗引起的HCC生长的减少与细胞增殖的抑制有关。

实施例A5.细胞周期调节蛋白在贝伐单抗-处理的肿瘤中的状态

细胞周期调节蛋白在HCC的发生和进展中起到重要作用。对于正的细胞周期调节蛋白，细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1相对于正常组织的改变已被与增加的细胞增殖和临床症状关联起来(在参考文献A18中综述)。

为了理解贝伐单抗作用的可能的机制，我们研究了细胞周期调节蛋白在贝伐单抗-处理的肿瘤中的状态。pRB以及细胞周期蛋白D1、p16^INK4a、 p21^WAF1和p27^Kip1的水平在伐单抗-处理的肿瘤中没有出现显著变化(数据未显示)。然而，cdc-2、Cdk-2、Cdk-4、细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B1的水平显著降低(p＜0.01，图2)，表明贝伐单抗除了抑制新生血管形成外还可抑制细胞周期。

实施例A6.贝伐单抗对IP肿瘤生长、肿瘤扩散和腹水形成的效应

现在认为VEGF通过增加内皮细胞通透性在恶性腹水形成中起到重要作用(参考文献A28)。在对SCID小鼠进行IP接种时，26-1004(Met)细胞有效地在腹腔内形成肿瘤，扩散至肝脏，并诱发腹水。我们利用该模型的优点，测试了贝伐单抗对肿瘤生长、肿瘤扩散和腹水形成的作用。

然而，无法直接监测腹腔内肿瘤生长，并且由于其在腹部的扩散，无法对其进行精确定量。因此，在死后检查时定性地评估IP肿瘤负荷。在所有动物中，处理起始于接种26-1004(Met)细胞后的14天，并且每两周重复一次。

图2A显示，所有接受PBS处理的腹腔内IP的小鼠均形成了肿大的腹部，表明在26-1004(Met)肿瘤注入的4-6周内形成腹水(表A2&图3A)。在出现腹部肿大后很快(在6-10天内)，载体处理的小鼠变得恶病质的，最后根据动物管理条例使其安乐死。直到实验结束，贝伐单抗-处理的小鼠均没有表现出明显的腹部肿胀(图3A)。在尸检中验证了这一点，而从载体-处理的小鼠中可采集到6-8毫升的腹水。在死后检验时，没有一个贝伐单抗-处理的IP动物表现出腹水形成或恶病质的迹象。

表A2示出在SCID小鼠的HCC腹腔模型中，贝伐单抗对腹腔内(IP)肿瘤负荷、肿瘤细胞向肝脏扩散、细胞增殖、VEGF表达和腹水形成的效应。给雄性SCID小鼠IP注入含5×10⁶的26-1004(Met)细胞的200μlPBS。将携带IP肿瘤的小鼠随机分至如下两个处理组(n＝14)中：(a)对照小鼠：每两周IP注入200μl PBS，或(b)每两周IP注入一次贝伐单抗(5mg/kg)，持续42天。每周3次监测存活情况及腹水形成。在小鼠垂死时将其处死并进行尸检。记录存在腹水的情况、肉眼可见的腹腔肿瘤向肝脏扩散以及IP肿瘤负荷。肿瘤中平均血管密度、VEGF表达、Ki-67指标和凋亡通过免疫组织化学染色进行确定，使用的分别抗是CD31抗体、抗VEGF抗体、抗Ki-67抗体和抗切割的半胱天冬氨酸酶-3抗体。在PBS-处理组和贝伐单抗-处理组之间，IP肿瘤负荷、Ki-67 指标、VEGF阳性细胞的百分数、切割的半胱天冬氨酸酶-3阳性细胞、肿瘤细胞向肝脏的扩散和腹水形成发生中的差异均通过ANOVA进行分析。符号^＊表示p＜0.01。

在对照小鼠的腹腔内出现了广泛扩散的肿瘤块(图3B；表A2)。肿瘤出现在肝脏、膈、肠和胃的表面上。然而，与对照相比，贝伐单抗-处理组中出现了肿瘤块的量显著减少(图3B&表A2，p＜0.01)。

贝伐单抗还在26-1004(Met)注入的位点抑制在某些IP动物内形成的小皮下肿瘤的生长(数据未显示)。在所有载体-处理的小鼠肝脏上检测到了肿瘤扩散(图3C&表A2)。当贝伐单抗浓度升高至10mg/kg时，所述抗体对腹腔内肿瘤负荷、腹水体积和肿瘤扩散没有剂量依赖效应(数据未显示)。

图3D显示，虽然所有对照组小鼠都在42天时是垂死的，但是所有贝伐单抗-处理小鼠在62天时仍是存活的。这些结果表明，贝伐单抗可通过抑制腹水形成、肿瘤扩散及降低的IP肿瘤负荷延长IP小鼠的存活期。

实施例A7.对实施例A1-A7的讨论

HCC是全球第二大致命癌症。临床中大多数患者处于晚期HCC，并且他们中的某些已有广泛的肿瘤扩散和腹水。所有确立的非外科治疗法都表现出较弱的有效性，并且虽然治疗法在最近的十年已经被进一步优化，由HCC引起的死亡率仍没有变化。因此，迫切需要HCC治疗的新治疗策略。VEGF在促进肿瘤血管生成和肿瘤转移中的作用——连同其在HCC中的阴性预后显著性(prognostic significance)——使得它可作为合适的治疗靶标。在本研究中，我们在皮下和IP小鼠中使用功能阻断性抗体贝伐单抗特异性地去除肿瘤诱导的VEGF活性。这个可阻碍VEGF与VEGF受体接近的中性抗体可抑制人VEGF活性，但不抑制小鼠VEGF活性，从而特异性地阻断肿瘤诱导的VEGF活性。我们发现，贝伐单抗可抑制人HCC异种移植物的生长(6个系中的5个)。该结果具有临床含意，这是因为现有技术已知以下的患者最可能形成原发性HCC或复发性HCC，即已知患有肝硬化、乙型或丙型肝炎病毒感染或其他原发性危险因素(primary risk factor)的患者，以及经过肝脏移植、切除或针对肝脏的治疗(liver-directed therapy)的HCC患者。因此，用贝伐单抗或其他血管生成抑制药剂(参考文献A26；A29)对血管生成的靶向抑制，可能代表一种具有较高价值的治疗HCC的替代方法。阻断血管生成还可用于维持微转移的休眠，并且可在外科切除原发性肿瘤后防止发生明显的复发或转移。

在本研究中，我们发现，与对照相比，贝伐单抗诱发了增殖细胞数目的显著减少以及平均血管密度的降低。贝伐单抗抑制皮下HCC肿瘤的确切机制是未知的。贝伐单抗的一种主要功能是，通过切断肿瘤细胞的新鲜营养物和生长因子的供给而阻止肿瘤块的扩大。已经报道了肿瘤相关的内皮细胞贝伐单抗的体内靶标。这些细胞表达VEGF-R并需要VEGF来增殖和存活(参考文献A22)。通过用贝伐单抗抑制VEGF活性，肿瘤相关的内皮细胞(其增殖频率比正常器官的内皮细胞高20-200倍)将对贝伐单抗治疗更加敏感(参考文献A30；A31)。已提出这样的观点，即CDK及CDK抑制剂两者的异常表达对于HCC的发生是重要的(在参考文献A18中综述)。如本研究中报道的由贝伐单抗引起的正细胞周期调节蛋白(如细胞周期蛋白B1、cdc-2、Cdk-4、Cdk-2和细胞周期蛋白A)下调可能有助于它的抑制增殖活性。

腹腔为肿瘤生长和扩散提供了显著不同于皮下空间的环境。在腹膜内，26-1004(Met)细胞不像它们被作为皮下推注给予时那样受限。因此，皮下肿瘤在皮肤下仅作为球状块生长，而肿瘤在腹膜中作为实体瘤病灶生长，向腹腔中扩展并扩散至多种内器官。在所有贝伐单抗-处理的小鼠中，IP肿瘤负荷的程度都显著小于PBS-处理的动物。这些小肿瘤可能通过从下面的宿主血管和周围的腹腔液扩散出的营养物维持生存。有意思的是，仅在14只贝伐单抗-处理的小鼠的2只中出现了肿瘤向肝脏的扩散，这表明肿瘤诱导的VEGF可导致IP肿瘤的生长和扩散。在IP注射的小鼠中，贝伐单抗对肿瘤诱导的VEGF活性的抑制显著延长了生命，并完全抑制腹水的形成。现在仍然不十分清楚贝伐单抗通过何种机制抑制26-1004(Met)向肝脏扩散。贝伐单抗可能通过中断以前描述的VEGF、CXCR4和CXCL12之间的相互作用(参考文献A32；A33)而阻断该过程。我们的数据表明，肿瘤诱导的VEGF可能通过增加血管的通透性，在HCC的IP模型的恶性腹水形成中起到关键作用。虽然该模型对于研究肿瘤诱导的VEGF在腹水形成中的作用是方便的，但是它与人HCC的过程不是特别相似。在人HCC患者中，腹水的主要诱因是肝脏功能障碍和门静脉高压。因此，仍需要确定贝伐单抗是否能够防止这些病症引起的腹水蓄积。

在本研究中，我们已发现在单独给予贝伐单抗时，它会抑制6个人HCC异种移植物系中的5个的生长。对这些系中VEGF表达的分析可表明，表达高水平VEGF的异种移植物比那些具有低水平VEGF的异种移植物对贝伐单抗更加敏感。我们以下的发现支持了该观点，即与其他异种移植物系相比，在贝伐单抗-不敏感的26-1004(Cirr)异种移植物中被VEGF抗体染色的细胞少于30％(表A1)。因此，在VEGF表达和贝伐单抗-诱导的生长抑制之间存在正相关。这些数据表明，至少某些患者适宜于单药剂治疗。因此设计基于在患者肿瘤中的VEGF表达水平来治疗患者的临床试验是特别有意义的。为了确定贝伐单抗的可能的体内效应，就这种特异的生物标记物对肿瘤样品进行分析是重要的。至于所有潜在的抗癌药物，VEGF通路的抑制剂可能不是十分有效的个体治疗药剂，这是因为HCC肿瘤拥有不止一种遗传缺陷(参考文献A34)。由于贝伐单抗通过使血管体系和功能正常化而降低血管通透性(参考文献A35)，贝伐单抗治疗可有助于增加化学治疗药向癌细胞的递送。为了使治疗效果最好，可能需要将贝伐单抗与其他信号转导抑制剂或常规的化学治疗药(例如阿霉素(doxorubicin)或5-FU)相结合。同时，已经存在许多的其他靶向药剂，这些药剂也应该与贝伐单抗结合进行测验。最佳的结合物可随时间而被阐明。

实施例B1-B7证明用雷帕霉素和阿瓦斯汀在肝细胞癌治疗中同时抑制mTOR通路和血管生成。

实施例B1.实施例B2-B7的材料和方法

试剂

p70S6激酶抗体、抗切割的半胱天冬氨酸酶-3抗体、抗mTOR抗体、抗S6R抗体、抗4E-BP1抗体，以及抗mTOR(Ser2448)、p70S6激酶(Thr421/Ser424)、p70S6激酶(Thr389)、S6R(Ser235/236)、S6R(Ser240/242)、4E-BP1(Ser37/46)、4E-BP1(Thr70)和4E-BP1(Ser65)的磷酸化特异性抗体均购自Cell Signaling Technology，Beverly，MA。抗α-微管蛋白抗体购自Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz，CA。CD31/血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、VEGF和Ki-67抗体购自Lab Vision，Fremont，CA。缀合的二抗由Pierce，Rockford，IL提供。化学发光检测体系由Amersham，Pharmacia Biotech，Arlington Heights，IL提供。

阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素的结合物对皮下的HCC异种移植物生长的效应

本研究获得新加坡国立癌症中心和新加坡中央医院的伦理委员会的批准。所有小鼠均根据National Institute of Health，USA出版的“Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals”进行饲养。对它们不加限制地提供的灭菌食物和水，并且将它们置于12h光/暗周期的负压隔离室中。

用9-10周龄的雄性SCID小鼠(Animal Resources Centre，CanningVale，West Australia)进行HCC异种移植。将7个确立的HCC异种移植物系(2-1318、5-1318、6-1205、26-1004、30-1004、26-1004(Cirr)和2006)在无菌条件下切碎。将通过18号针头的碎片与RPMI-1640混合，用于移植SCID小鼠。这些异种移植物系的形成及表征在别处有报道(参考文献B49)。

为了研究阿瓦斯汀和雷帕霉素(Rapamune，Wyeth PharmaceuticalsCompany，Guayama)对HCC异种移植物生长的效应，从肿瘤移植后第7天开始，每周给携带HCC异种移植物的小鼠经腹腔内注入100μl的盐水(n＝14)或5mg/kg贝伐单抗(n＝14)；或者每天口服给予1mg雷帕霉素/kg体重(BW)(n＝14)；或者将每周VEGF抗体和每天雷帕霉素相结合(n＝14)，持续3周。在此时，所述HCC异种移植物达到约100mg的大小。每周至少监测两次确立的肿瘤异种移植物的生长情况，并且如所述计算肿瘤体积(参考文献B49)。在该实验结束后，将动物处死，记录体重和肿瘤重量，收集肿瘤用于分析。

阿瓦斯汀、雷帕霉素和结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理对HCC的腹腔癌病的效应

将含5×10⁶的26-1004(Met)HCC细胞的200μl PBS经腹腔内注射到雄性SCID小鼠腹腔腔内。细胞可以在小鼠腹腔内扩散，并且在腹腔内注入后4-6周形成腹水。在接种肿瘤细胞2周后，将携带IP肿瘤的小鼠(n＝14)随机分组并且用盐水、阿瓦斯汀、雷帕霉素或阿瓦斯汀加雷帕霉素处理上文指定的时间。每周3次监测存活情况及腹水形成。为了监测腹腔癌病的进展程度，定期地测量体重。在小鼠垂死时将其处死并进行尸检。记录每只小鼠中存在腹水的情况。我们还检查了肉眼可见的腹腔肿瘤扩散，以及腹部肿瘤的大小和数目。存活情况通过Kaplan-Meier方法进行评估。

免疫组织化学

将5μM的切片除蜡，再水化并用于抗原修复。在阻断内源性过氧化物酶活性并阻断非特异性染色后，将所述切片与抗CD31/血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、VEGF、Ki-67(Lab Vision，Fremont，CA)和切割的半胱天冬氨酸酶-3(Cell Signaling Technology)的一抗孵育(4℃下过夜)。依照以前的描述进行免疫组织化学(参考文献B49)。对于Ki-67，仅核的免疫反应被认为是阳性的。在每个区域中计数至少500个细胞中的经标记的细胞数目，然后表示为百分比值。为了在CD31染色的切片中定量平均的血管密度，对于每个肿瘤在100×的放大率下随机地抓取10个0.159mm²视野，并定量微血管数目。对于VEGF表达，由两个独立的观察者对免疫定位进行评分如下：阳性染色、斑状染色和阴性染色，具体的染色分别为在60-100％、20-60％和0-20％的肝细胞中是可检测到的。

统计分析

使用ANOVA检验比较了体重、腹水形成、腹腔肿瘤负荷、皮下肿瘤重量、平均血管密度、Ki-67指标、VEGF表达和切割的半胱天冬氨酸酶-3阳性细胞的百分数。存活分析通过Kaplan-Meier方法进行计算，并用时序检验进行比较。

实施例B2.用阿瓦斯汀和雷帕霉素抑制异种移植物的生长

为了直接检验肿瘤诱导的VEGF和所述mTOR通路在HCC生长中的作用，我们建立了一个体内模型，其中HCC肿瘤异种移植物生长于SCID小鼠的胁腹中。清晰的皮下肿瘤在HCC肿瘤移植7天内形成，并且大小足够进行精确测量。在初步研究中，我们发现用相同IgG同种型的非特异性抗体的处理对肿瘤生长没有效应，基本上等价于仅使用载体(数据未显示)。

另外，我们发现，当以5mg/kg和1mg/kg的剂量将阿瓦斯汀和雷帕霉素给予多个HCC异种移植物系时，分别抑制了58.6％±7.5％和60％±9.6％的肿瘤生长。因此，我们选择这些剂量用于我们的结合研究。

将携带5-1318、2-1318、6-1205、30-1004、2006、26-1004(Cirr)和26-1004异种移植物的小鼠用阿瓦斯汀、雷帕霉素以及阿瓦斯汀加雷帕霉素处理。动物毒性以及这些处理抑制肿瘤形成和发展的能力均被确定。当分别以5mg/kg和1mg/kg的剂量给予阿瓦斯汀和雷帕霉素时，它们抑制了7个被检查的异种移植物[6-1205、2-1318、5-1318、26-1004、30-1004、26-1004(Cirr)和2006]中的6个(6-1205、2-1318、5-1318、26-1004、30-1004和2006)的生长(表B1)。

表B1示出，阿瓦斯汀、雷帕霉素和结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素治疗对7种HCC异种移植物的腹腔内肿瘤负荷、VEGF表达、微血管密度、细胞增殖和凋亡的效应。如材料和方法中所述，标明的HCC异种移植物系经皮下植入至雄性SCID小鼠的右侧。将携带HCC异种移植物的小鼠随机分配至4个处理组中(n＝14)，并如材料和方法中所述用载体、阿瓦斯汀(5mg/kg)、雷帕霉素(1mg/kg)或者结合的雷帕霉素(1mg/kg)和阿瓦斯汀(5mg/kg)处理。肿瘤中平均血管密度、VEGF表达、Ki-67指标和凋亡通过免疫组织化学染色进行确定，使用的分别是抗CD31抗体、抗VEGF抗体、抗Ki-67抗体和抗切割的半胱天冬氨酸酶-3抗体。经ANOVA的分析，在载体-处理组、阿瓦斯汀-处理组、雷帕霉素处理组和阿瓦斯汀-雷帕霉素-处理组之间，肿瘤重量、微血管密度、VEGF表达、Ki-67指标和切割的半胱天冬氨酸酶-3中的差异是显著的(p＜0.01)。不同的字母表示p＜0.01。

表B1：雷帕霉素、阿瓦斯汀和阿瓦斯汀加雷帕霉素对7个HCC异种移植物系的细胞增殖、凋亡、微血管密度和VEGF表达的效应。

在用雷帕霉素、阿瓦斯汀和阿瓦斯汀加雷帕霉素进行处理的过程中，第21天时的肿瘤重量分别是对照的39.6％±5.4％、39.4％±4.6％和10.8％±7％(图4和表B1)。虽然在以阿瓦斯汀或雷帕霉素处理的7个异种移植物系的6个中出现了肿瘤生长率降低，而不引起消退(图5)，但是在阿瓦斯汀加雷帕霉素处理的所有7个异种移植物系中均出现了生长抑制(表B1)。

虽然阿瓦斯汀和雷帕霉素对26-1004(Cirr)异种移植物生长几乎没有效应，但是当将阿瓦斯汀与雷帕霉素结合给予的时候，其生长率被抑制60％(表B1)。在处理过程中，没有出现阿瓦斯汀、雷帕霉素及结合治疗对体重的显著效应或严重毒性。

实施例B3.阿瓦斯汀和雷帕霉素对异种移植物中血管形成的抑制

我们接下来检验阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀-雷帕霉素处理的抗肿瘤活性与其抑制这些异种移植物中血管形成的能力之间的关联。在给予阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素后21天时收集肿瘤。所述肿瘤中的平均血管密度通过用抗CD31抗体的组织化学染色进行确定。来自载体-处理的2-1318肿瘤、雷帕霉素处理的2-1318肿瘤、阿瓦斯汀-处理的2-1318肿瘤和阿瓦斯汀-雷帕霉素-处理的2-1318肿瘤的CD-31-阳性肿瘤细胞的中值显示于表B1。

用阿瓦斯汀或雷帕霉素处理携带肿瘤异种移植物的小鼠显著地降低了平均血管密度(表B1)。在将阿瓦斯汀连同雷帕霉素给予的时候，血管数目进一步降低，约为出现于载体-处理的肿瘤中的10-15％(表B1)。26-1004(Cirr)肿瘤中的血管平均值仅在阿瓦斯汀-雷帕霉素处理中显著降低(p＜0.01)。

实施例B4.阿瓦斯汀和雷帕霉素的体内抗增殖效应和抗凋亡效应

为了检查阿瓦斯汀、雷帕霉素和结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理的体内抗增殖效应和抗凋亡效应，将来自载体-处理的HCC肿瘤、雷帕霉素处理的HCC肿瘤、阿瓦斯汀-处理的HCC肿瘤和阿瓦斯汀-雷帕霉素-处理的HCC肿瘤的切片经Ki-67抗体和切割的半胱天冬氨酸酶-3抗体分别染色。

免疫组织化学分析显示，与载体-处理的肿瘤相比，在阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀-雷帕霉素处理的2-1318、5-1318、26-1004、6-1205、30-1004和5-1318，但不包括26-1004(Cirr)异种移植物中的Ki-67标记指标是显著下降的(p＜0.01)(表B1)。Ki-67抗体染色的细胞数目在所有以阿瓦斯汀加雷帕霉素处理的异种移植物中进一步降低(表B1)。切割的半胱天冬氨酸酶-3染色的细胞百分数在这些处理中没有显著差异，这说明这些处理没有一种会引起凋亡(表B1)。

这些结果支持这样的观点，即阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素的抗肿瘤作用与细胞增殖的抑制有关。

实施例B5.阿瓦斯汀和雷帕霉素处理的肿瘤中磷酸化的p70S6激酶、S6R和4E-BP1的水平

由于mTOR的下游靶标在调节细胞增殖和血管生成中起到重要作用[在50中综述]，研究了磷酸化的p70S6激酶、S6R和4E-BP1的水平。

图6A示出，在Thr421/Ser424处的磷酸化-p70S6激酶以及在Ser235/236和Ser240/244处的磷酸化-S6R的水平在源自以雷帕霉素(而不是阿瓦斯汀)处理的小鼠的肿瘤中被显著抑制(p＜0.01)。阿瓦斯汀和雷帕霉素都导致了总4E-BP1及其在Ser37/46和Ser70处的磷酸化显著降低。

实施例B6.细胞周期调节蛋白在阿瓦斯汀和雷帕霉素-处理的肿瘤中的状态

结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理除了使p70S6激酶、S6R和4E-BP1完全失活之外，还抑制了细胞周期蛋白D1、Cdk-2和细胞周期蛋白B1的表达(p＜0.01，图6B)。

任何处理都没有显著改变在Ser2448处的磷酸化mTOR的水平(图6A)以及p27、pRb和Cdk-4的表达(图6B)。任何处理都不影响在Tyr705处的磷酸化的ERK1/2和磷酸化的STAT-3、在Tyr15处的磷酸化的cdc-2、在Ser473处的磷酸化的Akt和细胞周期蛋白A的水平(数据未显示)。

实施例B7.阿瓦斯汀和雷帕霉素对小鼠中实验的腹腔癌病的发生的效应

现在认为VEGF通过增加内皮细胞通透性而在恶性腹水形成中起到重要作用。在腹腔内接种的SCID小鼠上，26-1004(Met)异种移植物有效地产生腹腔癌病。我们利用该模型，测试了阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素对小鼠中实验的腹腔癌病的发生的效应。

然而，无法直接监测IP肿瘤生长，并且由于其在腹部的扩散，无法对其精确定量。因此，在死后检查时定性地评估IP肿瘤负荷。在所有动物中，处理起始于接种26-1004(Met)细胞后的14天。

图7A显示，所有接受PBS处理的IP注射的小鼠均形成了肿大的腹部，表明在26-1004(Met)注射的4-6周内形成腹水和腹腔癌病。在出现腹部肿大后很快(在6-10天内)，载体处理的小鼠变得恶病质的，最后根据动物管理条例使其安乐死。直到实验结束，没有阿瓦斯汀或阿瓦斯汀-雷帕霉素-处理的小鼠表现出明显的腹部肿胀(图7A)。在尸检中验证了这一点，而从载体-处理的小鼠中可采集大量的腹水(6-8ml)。14只雷帕霉素处理的IP小鼠中有1只发生了轻度腹水。在死后检查时，没有一个阿瓦斯汀或阿瓦斯汀-雷帕霉素-处理的腹腔内动物表现出腹水形成或恶病质的迹象。

表B2示出在SCID小鼠的HCC腹腔模型中，阿瓦斯汀、雷帕霉素和结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素对腹腔内(IP)肿瘤负荷、肿瘤细胞向肝脏扩散、细胞增殖、腹水形成和凋亡的效应。给雄性SCID小鼠经腹腔内注入含5×10⁶的26-1004(Met)细胞的200μl PBS。将携带腹腔内肿瘤的小鼠随机至4个处理组中(n＝14)，并如材料和方法中所述用载体、阿瓦斯汀(5mg/kg)、雷帕霉素(1mg/kg)或者结合的雷帕霉素(1mg/kg)和阿瓦斯汀(5mg/kg)处理。每周3次监测存活情况及腹水形成。在小鼠垂死时将其处死并进行尸检。记录每只小鼠中存在腹水的情况、肉眼可见的腹腔肿瘤向肝脏扩散以及腹腔内的肿瘤负荷。肿瘤中平均血管密度、Ki-67指标和凋亡通过免疫组织化学染色进行确定，使用的分别是抗CD31抗体、抗Ki-67抗体和抗切割的半胱天冬氨酸酶-3抗体。经ANOVA分析，在载体-处理组、阿瓦斯汀-处理组、雷帕霉素处理组和阿瓦斯汀-雷帕霉素-处理组之间，IP肿瘤负荷、微血管密度、Ki-67指标、腹水形成和切割的半胱天冬氨酸酶-3中的差异是显著的(p＜0.01)。不同的字母表示p＜0.01。

在对照小鼠的腹腔内出现了广泛扩散的肿瘤块(图7B)。肿瘤出现在肝脏、膈、肠和胃的表面上。然而，与对照相比，在雷帕霉素-处理组和阿瓦斯汀-处理组中出现了肿瘤块量的显著减少(图7A和表B2，p＜0.01)。腹腔肿瘤负荷在结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理中进一步被降低(表B2)。在全部14只载体-处理的小鼠(100％)的肝脏上检测到肿瘤扩散。14只用阿瓦斯汀或雷帕霉素处理的小鼠中仅2只(14,2％)出现肿瘤向肝脏扩散。在用阿瓦斯汀-雷帕霉素的结合物处理的小鼠中没有出现肿瘤向肝脏扩散(表B2)。图7C显示，载体-处理组、阿瓦斯汀-处理组和雷帕霉素处理组中的所有小鼠分别在第48、120和118天时是垂死的，但是所有阿瓦斯汀-雷帕霉素处理的小鼠在第125天时仍是存活的。这些结果说明，阿瓦斯汀-雷帕霉素可通过抑制腹水形成、肿瘤扩散及降低的腹腔内肿瘤负荷有效延长IP小鼠的存活期。

为了确定所述结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理是否能逆转IP小鼠中的腹水蓄积，从对照的26-1004(Met)IP小鼠中部分地排出腹水。将它们分成两组：载体-处理组和阿瓦斯汀-雷帕霉素处理组。与预期一致，该对照的IP小鼠迅速地形成腹水，并在一周内变得恶病质的(图8A)。阿瓦斯汀-雷帕霉素处理组在处理7天后没有腹水的迹象(图8B)，并且到处理后的第14天时几乎完全恢复(图8C)。它们活到被处死之前(处理后第8周)，并且腹腔内肿瘤生长显著消退(数据未显示)。这些数据表明，在HCC中，肿瘤诱导的VEGF和mTOR的下游靶标都是腹水形成、肿瘤扩散和IP肿瘤生长绝对需要的。

实施例B8.实施例B1-B7的讨论

HCC是全球第二大致命癌症，并且由于乙型肝炎和丙型肝炎的传播它在亚洲是流行的。临床中大多数患者处于晚期HCC，并且他们中的某些已有广泛的肿瘤扩散和腹水。尽管出现了新的抗癌药剂，已有的非外科治疗法仍表现出较弱的有效性。由HCC引起的死亡率仍没有变化。因此，迫切需要HCC治疗的新治疗策略。VEGF和mTOR通路的下游靶标在促进肿瘤血管生成、腹水形成和转移中的作用——连同其在HCC中的阴性的预后显著性——使得它们可作为合适的治疗靶标。在本研究中，我们发现，阿瓦斯汀或雷帕霉素在单独作为药剂给予时，抑制了7个HCC异种移植物中的6个的生长。HCC异种移植物的生长在同时给予两种药剂时被进一步抑制。迄今为止，所有测试的HCC异种移植物对这种结合治疗都是敏感的。这个现象具有临床含意，这是因为这种无细胞毒性的结合物如果被证明在转移疾病中是有效的，就可以研究其在切除HCC时作为辅助治疗。因此，用阿瓦斯汀对血管生成的靶向抑制以及用雷帕霉素对mTOR通路的靶向抑制，可能代表一种用于治疗这种致命疾病的有吸引力的且耐受良好的方法。除了蛋白合成和细胞周期调节蛋白的抑制外，结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素治疗对血管生成的抑制还被证明可用于维持微转移的休眠，并且可在外科手术切除原发性肿瘤后防止发生明显的复发或转移。

在本研究中，我们发现，mTOR在Ser2448处的磷酸化不会被雷帕霉素或阿瓦斯汀加雷帕霉素减少。还没有确定该位点的磷酸化是否是mTOR活性的较好的指示。虽然阿瓦斯汀和雷帕霉素都引起了总4E-BP1及其在Ser37/46和Ser70处的磷酸化的显著降低，但是p70S6激酶、S6R和4E-BP1的完全失活仅出现在结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理中。这种结合的处理还降低了细胞周期蛋白D1、Cdk-2和细胞周期蛋白B1的表达(图6B)。尽管在阿瓦斯汀、雷帕霉素和阿瓦斯汀加雷帕霉素处理中出现了显著的生长抑制，它们都没有引起凋亡，这通过切割的半胱天冬氨酸酶-3免疫染色确定。结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理在HCC异种移植物中强大抗肿瘤活性的确切机制仍有待于被阐明。该结合物的抗肿瘤活性可能是包括细胞周期、蛋白合成和血管生成的多种通路的积累效应。

在本研究中，我们已发现，雷帕霉素但非阿瓦斯汀显著减少了VEGF-阳性的肝癌细胞的数目。与仅载体相比，阿瓦斯汀和雷帕霉素都减少了增殖细胞的数目，并降低了平均的血管密度。这些可被结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理进一步减少或降低。该结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理通过何种精确机制来抑制HCC肿瘤的生长还不十分清楚。这种结合疗法可能通过切断肿瘤细胞的新鲜营养物和生长因子供给而阻止肿瘤块的扩大。已经报道了肿瘤相关的内皮细胞是阿瓦斯汀和雷帕霉素两者的体内靶标。这些细胞表达VEGF-R并需要VEGF来增殖和存活(参考文献B20)。通过用阿瓦斯汀抑制VEGF活性以及用雷帕霉素抑制VEGF产生，肿瘤相关的内皮细胞(其增殖频率比正常器官的内皮细胞高20-200倍(参考文献B51、B51))将对结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理更加敏感。

然而，HCC在人中不是一种天然的皮下疾病。HCC的转移通常局限于腹腔。因此，我们使用腹腔内(IP)模型进行了类似的实验。在IP注射的小鼠中，阿瓦斯汀对肿瘤诱导的VEGF活性的抑制或雷帕霉素对VEGF产生的抑制，可提高存活率并防止腹水形成。在大多数阿瓦斯汀-处理的IP小鼠和雷帕霉素-处理的IP小鼠中，腹腔内肿瘤负荷的程度比PBS-处理的动物中的显著轻，这表明肿瘤诱导的VEGF负责IP肿瘤生长。在阿瓦斯汀-雷帕霉素-IP处理的小鼠中，在腹腔内仍出现很少的小肿瘤(图7A)。这些小肿瘤可能通过从下面的宿主血管和周围的腹腔液扩散出的营养物维持生存。

作为连续的恶性过程的一部分，恶性腹水的形成在晚期HCC中代表较弱的预后(prognosis)。随着癌症发展到腹水形成阶段，生命质量和生存质量变得受限(参考文献B53)。对恶性腹水的处理是一个重要的临床问题。一种控制恶性腹水的方法是，通过作用于腹腔中的成因恶性细胞来限制腹水形成。多种化学治疗药剂(如卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、5-FU和亚叶酸钙(Leucovarin))在全身用药或腹腔内用药时对于减少恶性腹水仅有有限作用(参考文献B54)。在本研究中，阿瓦斯汀、雷帕霉素和结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理可有效地抑制腹腔癌病的HCC模型中腹水的发生。对于长时程治疗，结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素处理对于抑制腹水形成比仅阿瓦斯汀或雷帕霉素的处理有效的多。阿瓦斯汀-雷帕霉素处理对实验的腹腔癌病的抑制明显表现在对阿瓦斯汀-雷帕霉素-处理的小鼠中腹水的抑制和扩散肿瘤生长的抑制，作为对比的是阿瓦斯汀-处理的动物或雷帕霉素-处理的动物。再者，阿瓦斯汀-雷帕霉素处理能逆转腹水蓄积。这个发现表明，结合的阿瓦斯汀-雷帕霉素治疗可用于治疗腹腔癌病(一种不可治愈的HCC并发症)，并且特别有益于具有IP游离癌细胞且无肉眼可见的腹腔转移的患者。

由于VEGF对于HCC的形成、进展和转移是重要的并且mTOR对于VEGF产生是必需的，因此用阿瓦斯汀抑制VEGF活性以及用雷帕霉素抑制VEGF产生将是一种用于治疗HCC的合理的结合。

实施例C1-C7显示雷帕霉素和贝伐单抗对源自患者的肝细胞癌异种移植物中肿瘤生长的有效抑制。

实施例C1-C7表明雷帕霉素和贝伐单抗对源自患者的肝细胞癌异种移植物中肿瘤生长的有效抑制。

实施例C1.实施例C2-C7的材料和方法

试剂

抗总p70S6K抗体、抗切割的半胱天冬氨酸酶-3抗体、抗mTOR抗体、抗RPS6抗体、抗4EBP1抗体，以及抗磷酸-mTOR(Ser2448)、p70S6K(Thr421/Ser424、Thr389)、RPS6(Ser235/236、Ser240/242)、4E-BP1(Ser37/46、Thr70、Ser65)的抗体购自Cell Signaling Technology，Beverly，MA。α-微管蛋白抗体、细胞周期蛋白D1抗体、Cdk-2抗体、Cdk-4抗体、细胞周期蛋白B1抗体和p27抗体购自Santa CruzBiotechnology Inc，Santa Cruz，CA。CD31/血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)抗体、VEGF抗体、PTEN抗体和Ki-67抗体购自Lab Vision，Fremont，CA。缀合的二抗购自Pierce，Rockford，IL。化学发光检测体系购自Amersham，Pharmacia Biotech，Arlington Heights，IL。

来自患者的HCC异种移植物的产生和维持

本研究获得新加坡国立癌症中心和新加坡中央医院的机构审查和伦理委员会(Institutional Review and Ethics Boards)的批准。所有小鼠均根据“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals”的方案(National Institute of Health，USA)和Institutional Animal Care andUse Committee(IACUC)的指导方针进行饲养。原代的HCC异种移植物的确立已经在以前被记载(参考文献C18)。简言之，将在肝脏切除中获得的原代HCC研磨成能够通过18号针头的精细片段，与Matrigel(Collaborative Research，Bedford，MA)以1∶1(v/v)的比例混合，然后注射至8周龄的雄性严重联合免疫缺陷(SCID/SCID，The JacksonLaboratory，Harbor，ME)小鼠的胁腹皮下。将每个原代肿瘤注入6-8只小鼠。每周至少对确立的肿瘤异种移植物的生长监测两次，用游标卡尺测量肿瘤长(a)和宽(b)，且肿瘤体积按(a×b²)/2进行计算。连续传代的异种移植物系通过下述方式获得：从处死的动物中切割肿瘤并将分离的肿瘤细胞注入至上文所述SCID小鼠的相继代中。在本报道中研究了7个异种移植物系(2-1318、5-1318(1)、5-1318(3)、2006、26-1004、26-1004(cirr)和30-1004)。异种移植物2-1318和5-1318(1)来自于乙型肝炎阳性(Hep B-positive)的患者。

HCC异种移植物和原代肿瘤的组织病理学和免疫组织化学

苏木精和曙红(H&E)染色的HCC患者肿瘤的切片来自于医院的病理学档案。将异种移植物肿瘤经石蜡包埋并经切片(5μM)、除蜡、再水化，然后经过抗原修复和染色。将固定的切片与抗CD31/血小板内皮细胞粘附分子1(PECAM-1)、VEGF、Ki-67、切割的半胱天冬氨酸酶-3(4℃下过夜)、PTEN和RPS6(总的和磷酸化的(S240/242))的一抗孵育，以评估微血管密度。对于Ki-67，仅核的免疫反应被认为是阳性的，并且在每个区域中计数至少500个细胞中的经标记的细胞数目，然后表示为百分比值。对于CD31，通过计数100×的放大率下的10个随机0.159mm²视野中的微血管数目，定量每种肿瘤的平均血管密度(MVD)。对于VEGF，由两个独立的观察者依照以下类别对表达进行评分：阳性染色(60-100％肿瘤细胞)、斑状染色(20-60％)和阴性染色(0-20％)。

基于阵列的比较基因组杂交

使用Qiagen DNA提取试剂盒从原代肿瘤和异种移植物肿瘤分离基因组DNA，并依照制造商的说明书(Agilent，USA)对其进行处理以用于在Agilent 185K微阵列上的杂交。将正常的男性人基因组DNA用作参照。在杂交和洗涤后，在Agilent 2565BA微阵列扫描仪上对所述阵列进行扫描。图像的分析使用Feature Extraction软件(版本9.1，AgilentTechnologies)和CGHAnalytics软件(版本3.4，Agilent Technologies)，使用ADM-2(Aberration Detection Module-2)算法，该算法可基于统计值来识别给定的具有连续的高或低对数比值的样品中的所有异常区间。使用PROGENETIX CGH(www.progenetix.com)数据库将该aCGH数据与HCC中已知的扩增和缺失相比较。

基因表达谱

使用Trizol(Invitrogen，Carlsbad，CA)试剂从原代肿瘤和异种移植物肿瘤分离基因组RNA，并依照制造商的说明书对其进行处理以用于使用U133plus Genechips的Affymetrix Genechip(Affymetrix Inc.，Santa Clara，CA)的杂交。通过GeneSuite软件(Affymetrix Inc.，SantaClara，CA)扫描并处理所述芯片上的杂交信号。使用GeneDataTMRefiner(Genedata，Basel，Switzerland)对粗Genechip扫描进行质量控制。将使用Benjamini和Hochberg校正(对于多假设校正)的成对t- 检验用于识别在未处理样品和处理样品之间差异调节的基因(表C2)。使用GOSTAT工具(http://gostat.wehi.edu.au/)进行基因本体(GeneOntology)分析。这些微阵列数据可以以GEO登记号GSE6465获取。

突变基因定型

分析异种移植物样品中p53、PTEN、PIK3CA、TSC1、TSC2和HIF1A的突变。使用结合的DHPLC/测序方法(参考文献C19)可确定p53突变(外显子5-9)，并发现所述异种移植物系携带以下的p53突变：2-1318(R249S)、5-1318(1)(R249S)、5-1318(3)(R249S)、2006(P177L)和30-1004(H214R)。通过对基因组DNA直接测序确定mTOR相关基因中的突变(PTEN(外显子1-9)、PIK3CA(外显子9和20)、TSC1(外显子3-23)和TSC2(外显子1-41))。对所有PCR产物都进行双向测序。可能的突变经两个独立的PCR测序过程确定。

药物处理(皮下模型)

根据以下类型对HCC异种移植物系进行处理：1)IP注射100μl盐水(载体/对照)，2)口服1mg/kg雷帕霉素(RAPA，Rapamune，WyethPharmaceuticals Company，Guayama)，3)IP注射5mg/kg贝伐单抗(BEV，Avastin，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA)，以及4)口服RAPA和注射BEV相结合(BEV/RAPA)。对照和BEV注射以周为基础进行，而每天给予口服的RAPA。处理开始于肿瘤植入第7天后当肿瘤约100mg时，并持续接下来的3周。每个处理组包括14只代表相同异种移植物系的独立的肿瘤携带小鼠。肿瘤生长的监测如上述。在该处理方案结束后，将动物处死，记录体重和肿瘤重量，并收集肿瘤用于分子分析。

药物处理(原位模型)

原位模型的建立是通过向雄性SCID小鼠腹腔注射来自26-1004异种移植物系的5×10⁶ HCC细胞。一般在腹腔内(IP)注入后4-6周检测到大量腹水。在肿瘤细胞接种2周后，将携带IP肿瘤的小鼠(每个处理组n＝14)随机分配，并用对照盐水、RAPA、BEV或RAPA/BEV处理。每周3次监测体重、腹水形成及总的存活情况。在携带肿瘤的小鼠垂死时将其处死，记录每只小鼠中存在腹水的情况。还记录了肉眼可见的腹腔肿瘤扩散的程度，以及腹部肿瘤的大小和数目。

药代动力学分析

使用所述的反相HPLC方法(参考文献C20)在小鼠全血(0.6mL)中确定RAPA浓度。

统计分析

使用ANOVA比较了体重、腹水形成、腹腔肿瘤负荷、皮下肿瘤重量、平均血管密度、Ki-67指标、VEGF表达和切割的半胱天冬氨酸酶-3阳性细胞的百分数。存活差异通过Kaplan-Meier方法进行计算，并用时序检验进行比较。

实施例C2.对源自患者的HCC异种移植物进行组织学作谱和分子作谱

在以前，我们已经制备了源自患者的HCC肿瘤异种移植物，以筛选新的治疗结合物(参考文献C18)。将从患者的外科手术得到的原代HCC肿瘤直接植入至SCID小鼠的胁腹，在肿瘤植入的7天内形成了清晰的皮下肿瘤。在本研究中检测了7个独立的异种移植物系。每个异种移植物以其自己特有的生长率生长，所述生长率在后续的传代中保持稳定(数据未显示)。两位独立的临床组织病理学家(TPH和MST)评估得到如下的结果，即所述异种移植物肿瘤在组织学水平与原始患者肿瘤的细胞结构(cellular architecture)和肿瘤级别非常类似——具体而言，实体细胞、梁状细胞或管状细胞的排布(solid，trabecular or tubularcellular arrangement)与肿瘤细胞的核多态性一起被维持(图9，A-G)。所有7个异种移植物都呈现了显著的血管形成性，这说明它们很可能表达血管生成因子。相反，从体外培养的癌细胞系建立的异种移植肿瘤与膨胀的血管结构(如HepG2)相关或者无可辨认的血管结构(如PLC/PRF/5，图1H和I)，这说明在后者中可能不存在血管生成因子表达。

为了把我们的分析扩展至显微术之外，我们还在源自患者的异种移植物上进行了基因组水平-基于阵列的比较基因组杂交和基因表达作谱。在通过使用Agilent 185K寡核苷酸微阵列的基于阵列的比较基因组杂交(aCGH)进行比较时，7个系中的5个在异种移植物和原代肿瘤之间呈现出非常相似的染色体扩增及缺失模式(图14A)，包括经常出现在HCC中的变化(例如染色体带1p32-36、4q13.2、6p21和17q21-22)。在早期传代系(传代1-2)和晚期传代系(传代9-10，代表可获得的最老系) 之间进行的主要基因组变异比较确认了该异种移植物核型在该时间窗中的稳定性(数据未显示)。我们还将异种移植的肿瘤的基因表达谱与原代肿瘤和HCC细胞系进行了比较。我们使用非监督的层次聚类算法发现，异种移植物的表达谱与原代肿瘤的谱相掺杂，而HCC细胞系整体地迁移到一个相关但不同的分支中(图14B)。这些结果可说明，尽管所述源自患者的HCC异种移植物生长于另一个物种(SCID小鼠)的非原位的位置(胁腹而不是肝脏)中，它们仍保持与临床HCC相当类似的组织学表达谱及分子表达谱。

实施例C3.HCC异种移植物和原代HCC中的mTOR通路的激活

为了研究mTOR通路在HCC中的作用，我们使用一组靶向mTOR通路(mTOR、S6K1、RPS6和4EBP1)的抗体来研究HCC或非恶性正常肝脏中的mTOR信号传递(图10A)。在非恶性肝脏和HCC之间，在总mTOR或在丝氨酸2448处(由Akt(参考文献C21)磷酸化的位点)的磷酸化mTOR没有显著差异。然而，mTOR通路激活相关的S2448磷酸化的功能显著性是不清楚的(参考文献C22)。事实上，我们观察到mTOR信号传递通路的多个下游组分的激活(特别是在肿瘤中)，所述下游组分包括磷酸化的S6K1和RPS6(S6K1的靶标)。在通过用抗磷酸化的RPS6和PTEN(mTOR通路的负调节蛋白)抗体的免疫组织化学进行检查时，非恶性的背景肝脏呈现较强的PTEN蛋白表达和极微量的磷酸化RPS6，而在HCC肿瘤中出现了极微量PTEN表达和大量的磷酸化RPS6的相反模式(图10B)。相似的mTOR激活模式还出现在该异种移植物系中(图10C)。对mTOR相关基因(PIK3CA、PTEN、TSC1、TSC2和HIF1A)的突变分析揭示，一个异种移植物系(26-1004)的PTEN基因的外显子8中呈现了16bp的缺失。总而言之，我们的结果表明，mTOR通路在相当比例的HCC和异种移植物系中可能都是被激活的。

实施例C4.RAPA/BEV的结合方案可抑制HCC异种移植物的生长

与临床HCC的耐药性(chemorefractory nature)相似，我们在以前已发现，源自患者的HCC异种移植物中的肿瘤生长对多种常用的化学治疗药物(奥沙利铂、顺铂、5-FU和阿霉素)和包括EGFR抑制剂gefitinib的小分子抑制剂是耐受的或者仅轻度敏感的(参考文献C16)。为了检验mTOR或VEGF抑制是否可以造成生长抑制，我们用RAPA(每天1mg/kg，口服)、BEV(每天5mg/kg，注入)或RAPA/BEV(与单药剂治疗同剂量)处理携带肿瘤的小鼠。在人类中，典型BEV静脉内剂量的范围为每2周5mg/kg-10mg/kg。对于RAPA，我们进行了药物代谢动力学分析，并确定了异种移植物中的循环RAPA水平的范围为20-80ng/ml(平均33ng/ml)，类似于在人类中可达到的治疗水平(5-20nM)(参考文献C23)。单药剂的RAPA和BEV分别抑制58.6％±7.5％和60％±9.6％的肿瘤生长，在21天后RAPA和BEV处理肿瘤的重量是对照的39.6％±5.4％(RAPA)和39.4％±4.6％(BEV)。用具有与BEV相同的IgG同种型的非特异性抗体对异种移植物的处理对肿瘤生长有极微的效应，并且基本上等价于仅使用载体(数据未显示)。然而，RAPA/BEV的结合处理诱导了比单药剂RAPA或BEV显著大的生长抑制。在处理后第21天时，所述处理的异种移植物的肿瘤重量与对照相比，RAPA为39.6±5.4％，BEV为39.4±4.6％，且RAPA/BEV为10.8±7％(图11A和表C1)。

表C1.RAPA、BEV和RAPA/BEV对HCC异种移植物中肿瘤重量、VEGF表达、MVD、细胞增殖和凋亡的效应。所示为来自4个代表性的异种移植物系的数据。经ANOVA分析，在对照组、RAPA-处理组、BEV-处理组和RAPA/BEV-处理组之间，肿瘤重量、MVD、VEGF表达、Ki-67指标和切割的半胱天冬氨酸酶-3中的差异是显著的(p＜0.01)(以不同的字母表示——^b表示与^a显著不同，^c表示与^a和^b显著不同)。

当随时间对处理进行监测的时候，单药剂的RAPA或BEV降低但不完全抑制异种移植物肿瘤的生长率。与之不同，随时间近乎稳定的生长抑制出现于用RAPA/BEV处理的所有7个异种移植物系中(图11B)。再者，虽然单药剂的RAPA和BEV对26-1004(Cirr)异种移植物的生长率几乎没有效应，但RAPA/BEV抑制了这种异种移植物系生长率达60％(表C1)。在RAPA、BEV和RAPA/BEV处理组中没有出现对体重、病态显著效应或严重毒性。因此，该组合方案对肿瘤生长抑制的程度明显高于标准化学治疗或仅RAPA和BEV，并且可以证明对于对单药剂治疗是耐受的肿瘤的抑制效力。

实施例C5.RAPA/BEV的靶标调节和潜在的协同作用

为了更好地理解RAPA/BEV作用的潜在分子机制，我们研究了mTOR通路在处理21天后的肿瘤中的状态。在所有三种处理中，总mTOR水平或磷酸化mTOR(S2448)水平中没有出现显著的的改变。然而，RAPA和RAPA/BEV而非仅BEV引起了磷酸化S6K1(Thr421/Ser424)水平和RPS6磷酸化(Ser235/236和Ser240/244)水平的显著降低(p＜0.01，ANOVA)，这表明在这些处理的异种移植物中的mTOR通路的抑制(图12A)。对mTOR抑制的特异性的确证是，磷酸化的ERK1/2、STAT-3(Tyr705)、cdc-2(Tyr15)、Akt(Ser473)和细胞周期蛋白A的水平不受这些处理的影响(数据未显示)。RAPA/BEV在所述mTOR组分中实现的靶标水平减少显著大于仅RAPA，这说明所述RAPA/BEV结合物可能会诱导比RAPA单药剂处理更高水平的 mTOR通路抑制(比较表C1中的RAPA列和RAPA/BEV列)。与之不同，BEV处理不会在mTOR通路组分中诱导类似的变化，这表明在这些体内浓度时BEV单一治疗不会抑制mTOR通路活性。需要注意的是，与对照相比，所有三种处理——RAPA、BEV和RAPA/BEV都诱导了总4E-BP1水平和磷酸化4E-BP1水平的显著降低。这项结果表明，RAPA/BEV抑制肿瘤生长所依赖的一个机制是通过抑制mTOR-信号传递通路的活性。

然后，我们研究了所处理的肿瘤的肿瘤血管中总体形态、VEGF表达和肿瘤微血管密度(MVD)的改变。与对照相比，RAPA、BEV和RAPA/BEV-处理的肿瘤都呈现出肿瘤相关血管的大量减少，RAPA/BEV处理的肿瘤具有最小数目的可见血管(图11A)。通过免疫组织化学，我们发现VEGF表达在RAPA和RAPA/BEV处理的肿瘤中(而不在BEV处理的肿瘤中)被显著地抑制(图12B)，这说明来自HCC肿瘤细胞的VEGF表达很可能依赖于mTOR通路活性。为了在微观水平上定量该结果，我们使用内皮细胞特异性抗CD31抗体测量所述处理肿瘤中的MVD。RAPA和BEV都显著地降低肿瘤MVD(图12B)，该肿瘤MVD被RAPA/BEV进一步降低至对照肿瘤的约10-15％(表C1)。需要注意的是，26-1004(Cirr)肿瘤对仅RAPA或BEV的生长抑制是耐受的，它的肿瘤MVD的显著减少仅出现在RAPA/BEV处理组中(p＜0.01，ANOVA)。因此，在RAPA/BEV抑制HCC生长的能力和抑制肿瘤血管生成的能力之间有良好的相关。

除了血管生成外，mTOR通路信号传递还与其他致肿瘤过程相关，所述过程包括肿瘤增殖和抗凋亡。我们通过用抗Ki-67(细胞增殖的标记物)抗体和切割的半胱天冬氨酸酶-3(凋亡的标记物)抗体在经处理的肿瘤切片上进行IHC，研究了RAPA、BEV和RAPA/BEV的可能的抗增殖和抗凋亡效应。与未处理的肿瘤相比，Ki-67标记在除26-1004(Cirr)之外的所有异种移植物系的RAPA、BEV和RAPA/BEV处理组中都显著降低(p＜0.01，ANOVA)(表C1)，最大的降低出现在RAPA/BEV组中。意料之外的是，在任何处理组与模拟处理的对照之间对切割的半胱天冬氨酸酶-3阳性的肿瘤细胞的百分数没有显著差异，这说明凋亡的水平可能不受所述处理的影响。总而言之，这些结果支持这样的模型，即其中RAPA/BEV的抗肿瘤效应可能涉及mTOR通路抑制和靶向肿瘤血管，这接下来导致第二次的细胞增殖抑制，但不增加肿瘤的凋亡。另外，我们的数据并不排除这样的可能性，即RAPA/BEV还可以发挥直接对肿瘤细胞的抑制增殖效应(见讨论)。

RAPA/BEV处理组中增强的肿瘤抑制水平可能同时涉及累积和协同两种效应。有明显的累积组分，这是因为在将RAPA和BEV以单药剂给予大多数的异种移植物系时二者均能够诱导生长抑制(图11)。然而，仅用累积效应不可能解释与RAPA/BEV处理特异性相关的多种分子变化的出现。例如，虽然RAPA/BEV抑制了多种细胞周期相关组分(包括细胞周期蛋白D1、Cdk-2和细胞周期蛋白B1)的的表达(p＜0.01，ANOVA，图12A)，但这些效应并不出现于RAPA或BEV作为单一治疗剂的时候。我们进行了对三个独立处理的异种移植物系(2-1318、5-1318(3)和26-1004)的微阵列分析，并且在进行多假设校正后鉴定了148个与对照相比在RAPA/BEV处理的肿瘤中被显著调节的基因(p＜0.05，使用Benjamini和Hochberg校正的成对t-检验)(图15)。这些RAPA/BEV调节的基因富集于与氨基酸代谢(p＝7.3E-6，校正的p-值)、大分子代谢(p＝0.0002)和类固醇生物合成(p＝0.058)有关的基因本体中。当与单一治疗相比时，相当部分的RAPA/BEV调节的基因(70％)也在仅RAPA处理中被调节，在仅BEV处理中这种程度较小。然而，这些重叠的基因中的许多在RAPA/BEV处理中的调节程度显著高于仅RAPA组(校正的p＜0.05)(图15)

除RAPA-调节的基因之外，我们还鉴定了一组较少的但明显表现出受RAPA/BEV调节的其他基因，这一组基因包括细胞生长和蛋白翻译中涉及的基因例如IRS1、CDC2和EIF4A1(表C2)。

这些发现——结合RAPA/BEV但非仅RAPA或BEV单一治疗抑制26-1004(Cirr)生长的能力——说明，RAPA/BEV的强大肿瘤抑制能力可能同时涉及累积和协同两种组分。需要进一步的研究以更好地理解RAPA/BEV作用的复杂性——例如BEV活性可导致血管结构的正常化以使得更多RAPA被递送至癌细胞，该机制以前已经被提出(参考文献C24)。

实施例C6.RAPA/BEV可抑制腹腔转移和恶性腹水，并延长存活期

最后，我们研究了RAPA/BEV处理在原代靶器官(即肝脏)中抗肿瘤生长的效力。为了建立HCC的原位模型，我们将来自26-1004异种移植物系的肿瘤细胞经腹腔内(IP)注入至SCID小鼠的腹部。由于我们无法直接地检测IP肿瘤的生长及随时间在腹腔中的扩散，我们在死后检查时评估IP肿瘤负荷。在引入肿瘤的4-6周内，被注入的小鼠形成了肿胀的腹部(标明腹水形成)，并变得高度恶病质的(图13A)。在尸检时，被注入的小鼠的腹部呈现大量的腹水(6-8ml)以及肿瘤向腹腔器官(膈、肠和胃)的广泛扩散，包括位于浆膜表面下的肝脏(图13B)。我们检验了RAPA、BEV或RAPA/BEV是否可以在这些动物中获得治疗效果，处理开始于IP接种后14天。与模拟-处理的对照不同，没有一只BEV或RAPA/BEV处理的小鼠表现出腹部肿大或恶病质(图13A)，14只RAPA处理的小鼠中仅1只形成轻微的腹水(表C3)。

与对照相比，RAPA-处理的动物和BEV-处理的动物都呈现了显著降低的肝脏和腹腔内肿瘤大小和负荷(图13A和表C3，p＜0.01)。然而，对RAPA处理的肿瘤和BEV处理的肿瘤的组织学检验显示，在该动物肝脏中存在微米级(micro-sized)的肿瘤(图13B)。这些小肿瘤可能通过从下面的宿主血管和周围的腹腔液被动扩散出的营养物维持生存。与之不同，RAPA/BEV处理诱发了最大水平的肿瘤大小减小，在处理的肝脏中检测不到微米级肿瘤(图13B和表C3)。用Kaplan-Meier存活率分析证实了，虽然对照组、RAPA-处理组和BEV-处理组中的所有小鼠在第48、120和118天时是濒死的，但是RAPA/BEV处理的小鼠有显著延长的总存活期，在第125天时仍存活(p＜0.01，时序检验，图13C)。这些结果表明，RAPA/BEV可通过有效地抑制腹水形成、肿瘤扩散及降低腹腔内肿瘤负荷，有效地延长腹腔内注入肿瘤的小鼠的存活期。

实施例C7.实施例C1-C6的讨论

晚期HCC患者的不乐观的预后——现有较少的治疗选择相结合——使得鉴定HCC的靶向治疗物成为一个重要的目标。在本报道中，我们使用了一组来自患者的早期代的异种移植物，以鉴定RAPA/BEV作为HCC的分子靶向的结合治疗物的潜力。这种源自患者的异种移植物可被证明对于评估新型结合物治疗的临床前研究是有用的，这是由于所述异种移植物和同源的原代肿瘤之间紧密的组织学相似性和分子相似性，以及在体内环境中测试药物组合物的能力(参考文献C25)。有意思的是，初步实验表明，RAPA/BEV在体外测试中对HCC细胞系的细胞增殖具有极弱的效应(未发表的结果)。然而，RAPA/BEV治疗对于HCC的最终效力只有在仔细地进行临床试验之后才能知道——这种试验现在正在我们的中心进行。

在我们的研究中，当将RAPA和BEV作为单药剂给予的时候，两者均降低但不完全抑制7个HCC异种移植物中6个的生长。然而，RAPA/BEV对HCC生长的抑制程度显著高于单药剂治疗，包括26-1004(Cirr)肿瘤，该肿瘤的生长不受仅RAPA或BEV的显著影响。因此，我们研究中测验的所有HCC异种移植物明显对该结合的治疗敏感。RAPA/BEV的作用机制可能是多因素的。首先，RAPA和BEV可能抑制VEGF表达和VEGF蛋白活性，以有效地减少肿瘤血管生成。剥夺生长中的肿瘤的循环营养物和生长因子可导致肿瘤增殖和细胞生长的再次减少。其次，BEV可直接作用于肿瘤相关的内皮细胞，以增加血管通透性(参考文献C24)，从而增加RAPA向癌细胞的递送并有利于RAPA对肿瘤增殖和生长的直接抑制。第三，如上文所述，不出现于单药剂治疗中的RAPA/BEV结合物的协同效应(例如细胞周期蛋白D1的减少)也可以促进肿瘤抑制。RAPA/BEV处理对HCC异种移植物的强抗肿瘤活性的精确机制应该被进一步研究。

实施例D1.药物治疗物(用于RAPA和BEV的IP递送)

将纯雷帕霉素(RAPA，Nacalai Tesque Inc.Kyoto，Japan)溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，得到12.5mg/ml的储备溶液。贝伐单抗(BEV，阿瓦斯汀)购自Genentech，Inc.，South San Francisco，CA。为了制备用于IP注入的BEV/RAPA混合物，将BEV和RAPA溶解于盐水中，得到100μg BEV和125μg RAPA的终浓度。

每天对5-1318异种移植物系IP给予200μl盐水(载体/对照)、0.8mg BEV/kg、1mg RAPA/kg或200μl的BEV/RAPA混合物(这提供每天每kg体重0.8mg BEV和1mg RAPA)。处理开始于肿瘤植入7天后当肿瘤约100mg时，并持续2周。每个处理组包括14只代表相同异种移植物系的独立的肿瘤携带小鼠。在该处理方案结束时，将动物处死，记录体重和肿瘤重量，并收集肿瘤用于分子分析。

结果

对携带5-1318 HCC异种移植物的小鼠体内IP给予BEV、RAPA或BEV和RAPA的结合物，分别形成了大约32％±12％、44％±11％和66％±9％的生长抑制(图16)。RAPA-抑制的肿瘤生长与以下过程相关，即p70S6、4EBP1和S6R的磷酸化的抑制(图17)；p27和p130/Rb2的上调；以及细胞周期蛋白(包括细胞周期蛋白D1、cdc-2、Cdk-2、Cdk-4、细胞周期蛋白B1、p21和存活素)的下调(图18)。该BEV-RAPA结合方案还可诱导累积效应，包括Ser37/46处的磷酸-4EBP1、cdk-2、p21的表达降低，p130/Rb2肿瘤抑制基因的表达升高(图16&17)。

实施例E1：雷帕霉素与贝伐单抗结合在患有不能切除的肝细胞癌的患者中的I期研究

基于从上述体内研究得到的结果，我们提出雷帕霉素的I期临床和药物动力学研究以回答以下的假设：雷帕霉素在与贝伐单抗结合用于治疗肝细胞癌时是安全的。实现抗肿瘤活性需要达到一个治疗血浆水平。在实体瘤中靶向所述激活的mTOR通路和血管生成通路将产生肿瘤消退。对雷帕霉素和贝伐单抗的敏感性与4EBP-1、S6K、CD31和VEGF的表达相关。DCE CT可评估雷帕霉素和贝伐单抗的抗血管生成效应，并且这与肿瘤反应和药物水平相关。

目标如下：

主要目的

确定雷帕霉素结合贝伐单抗在患有不能切除的肝细胞癌的患者中的最佳剂量，并确定毒性谱。

次要目的

评估雷帕霉素的药代动力学，并确定雷帕霉素的生物活性剂量的范围。描述该药物结合物的临床活性。检验磷酸化的p70S6K在外周血单核细胞(PBMC)中的活性和对研究药物的临床反应之间的关系。检验PTEN、4EBP-1、磷酸化p70S6K、CD31和VEGF在肿瘤组织中的表达和对研究药物的临床反应之间的关系。检验通过动态对比增强计算机体层摄影(DCE CT)测量的多个药物水平的血管生成水平和临床反应之间的关系。

临床试验方案显示如下：

方案

不能切除的肝细胞癌

ECOG 0-2

↓

雷帕霉素和贝伐单抗的I期研究

↓

确定生物学相关剂量和DLT

↓

肿瘤组织的S6-激酶、4EBP-1、CD31、PTEN和VEGFR的表达的免疫组织化学，以及p70S6K在外周血单核细胞中的活性

DCE CT以评估血管生成程度的变化

实施例E2.临床试验的患者选择

合格标准

患者必须具有组织学上确认不能切除的HCC。年龄≥18岁。ECOG体力状况(performance status)≤2(Karnofsky＞60％)(见附录A)。3个月以上的生命预期。仅具有A和B的肝硬化Child-Pugh评分的患者(见附录A)可进入该试验。患者必须具有如下定义的正常的器官和骨髓机能：白细胞3.0×10⁹/L；嗜中性粒细胞绝对计数≥1.5×10⁹/L；血小板≥100×10⁹/L；总胆红素≤3×惯例的正常上限值(institutionalupper limit of normal)；AST(SGOT)/ALT(SGPT)≤5×惯例的正常上限值；正常惯例极限值内的肌酸酐；少于正常惯例上限值的1.5的活化PTT。

许多具有HCC的患者是乙型肝炎的携带者。由于雷帕霉素对这些患者的免疫抑制效应是未知的，所以本研究中的所有乙肝携带者在本研究期间服用lamuvudine并在本研究结束后继续服用至少6个月。接受已知作用于或有可能作用于雷帕霉素的活性或药代动力学的任何药剂或物质的患者的资格，将由首席调研员(Principal Investigator)在阅读他们的病例后确定。尽量使正在服用诱导酶的抗惊厥剂的患者换服其他药剂。

雷帕霉素对发育中的人胎儿的效应是未知的。由于此原因，育龄女性和男性在进入研究前以及在参与研究过程中必须同意使用合适的避孕方法(节育的激素或屏障方法；禁欲)。如果女性在参与本研究时怀孕或疑似怀孕，那么她应立即告知她的治疗医生。

有理解能力并自愿签署书面的知情同意文书。

患者必须具有可测量的疾病，其定义为至少一种这样的损伤，即在至少一个维度(待记录的最长直径)可用常规技术准确测量为≥20mm，或者用螺旋CT扫描为≥10mm。

患者必须有≤9mmol/L(350mg/dL)的空腹血浆胆固醇和≤3.39mmol/L(300mg/dL)的甘油三酯。

患者的外科手术必须是在研究药物开始之前28天以上，并且任何外科创伤必须完全痊愈。

排除标准

具有骨髓转移且不存在任何其他可测量的疾病的患者。如果患者正接受任何其他研究药剂，将他们排除。具有已知的脑转移的患者将被从本临床试验排除，这是因为他们的预后不良(poor prognosis)并且因为他们经常发展成会混淆对神经的和其他不良事件的评估的进行性神经功能障碍。由与雷帕霉素或贝伐单抗类似的化学或生物组合物的化合物引起的过敏反应史。不可控的并发疾病，包括但不限于正发生的或活跃的感染、有症状的充血性心力衰竭、不稳定型心绞痛、心律失常或会限制对研究需求的顺应性的精神疾病/社会病症(psychiatric illness/socialsituations)。由于对胎儿或婴儿具有潜在的风险，从本研究中排除怀孕的女性或哺乳母亲。

由于具有免疫缺陷的患者在接受骨髓抑制治疗(marrow-suppressive therapy)时具有升高的致死感染的风险，本研究排除了HIV-阳性患者。由于考虑到与使用贝伐单抗相关的出血或凝血问题，排除了具有活跃的食道静脉曲张、出血障碍、深静脉血栓形成或其他血栓栓塞(除门静脉血栓形成外)的患者。排除具有呕血或咳血临床病史的患者。

由于有出血的风险，从本研究中排除需要长期用肝素或华法林(warfarin)抗凝的患者。2线或多线化疗失败的患者。排除不能进行口服的患者。具有基线蛋白尿的尿试纸值(Urine dipstick)≥2+和24小时尿蛋白超过1g的患者。

正常对照

本研究中将包括5名健康志愿受试者。从每名受试者抽取10ml全血，用作药效动力学(pharmacodynamic)研究的对照。

伴随的药剂和治疗

所有的伴随药剂必须在病例报告表(CRF)中报告。在雷帕霉素与伴随给予的其他药物之间可能有通过细胞色素P450体系的相互作用。

研究中患者应远离全身性抗真菌剂、克拉霉素、环孢素和CYP3A4诱导物(卡马西平(carbamezepine)、利福平、苯妥英、苯巴比妥、萘夫西林(nafcillin)、氨鲁米特)、CYP3A4抑制剂(双氯芬酸、多西环素(Doxycycline)、红霉素、伊马替尼、异烟肼、奈法唑酮(nefazodone)、尼卡地平(micardipine)、异丙酚、蛋白酶抑制剂、奎尼丁和维拉帕米)、地尔硫(diltiazem)、伏立康唑(voriconazole)和疫苗。所有这些药剂都可能会增加雷帕霉素的血浆浓度。(附录C)

患者还应远离贯叶连翘(St John’s wort)、紫锥菊(Echinacea)和猫爪草(cat’s claw)。

首席调研员应注意患者是否正在服用这些药剂。

在对使用贝伐单抗结合化学疗法的试验的结合分析中，低剂量阿司匹林使用者和不使用阿司匹林者中的出血发生率没有明显差异(Hambleton J 2005)。因此，给具有动脉血栓拴塞风险的患者使用的预防性的低剂量阿司匹林在本研究中是允许的。

由于未知的相互作用，在本研究中不允许患者服用中药。

实施例E3.临床试验的治疗计划

药剂给药

治疗将基于门诊患者进行。报告的雷帕霉素和贝伐单抗的不良事件和潜在风险描述如下。雷帕霉素和贝伐单抗的合适剂量变化描述如下。没有给予除了以下描述的药剂或疗法之外的其他用于治疗患者的恶性病的研究的或市售的药剂或疗法。

剂量方案

I期的剂量方案

雷帕霉素的剂量将依照下文所示的方案扩大，而以5mg/kg的固定剂量给予贝伐单抗。仅在雷帕霉素的最大耐受剂量下无肿瘤反应时扩大贝伐单抗剂量。(见表)

在早餐前口服给予一次的雷帕霉素(以每片1mg；Wyeth)。雷帕霉素的起始剂量是每天一次性给予1mg。所有的雷帕霉素剂量以3倍于第1天的维持剂量的口服加载剂量开始。雷帕霉素的剂量将在每个剂量水平增加。

贝伐单抗(100mg/4ml；Roche)与雷帕霉素同时开始。将其溶解于总计100ml的0.9％氯化钠中，经静脉内注射给予。第一剂量在90分钟内输注。如果所述第一次输注是耐受的且无任何输注相关的不良事件(发热和/或发冷)，那么可在60分钟内给予第二次输注。如果所述60-分钟的输注是很好地耐受的，那么后续的剂量可在30分钟内给予。

在给药过程中，应监测患者的腹部疼痛、便秘或呕吐的症兆/症状。还应密切监测高血压。如果在药物输注过程中出现可疑的过敏反应，那么终止药物，并且根据需要给予抗组胺药、肾上腺素及其他药剂并开始必要的医学复苏。

将标准的“3+3”规则用于剂量扩大。三名患者以2mg/天的起始剂量水平开始累加。如果没有出现高于2级的剂量限制性毒性，那么这3名患者进入下一剂量水平。如果在任何剂量水平该第一组3名患者中的一个出现DLT，那么另外3名患者在该剂量水平进入。如果6名患者中的2名在该剂量水平出现剂量限制性毒性，那么停止剂量扩大。

将最大耐受剂量(MTD)定义为一个这样的剂量水平，即低于该水平时2名或更多患者出现DLT。在确定MTD后，另外6名患者在该剂量水平累加(扩大的同龄组)。

如果DLT在1mg/天的初始水平下出现，那么结束试验。

对于出现任何DLT的患者，如果毒性在14天内消失，那么用降低一个的剂量水平对他们继续治疗。如果一个患者在该降低的剂量水平出现DLT，那么终止该患者的研究治疗。

不允患者内的剂量扩大。不允许将在较低剂量累加的患者再次进入较高的剂量同龄组。

预期的累加速率为每月3-4名患者。

登记标准

患者只有在完成所有治疗前评估并且符合所有的合格标准后才被登记。

会导致治疗延迟的问题应与首席调研员讨论。如果一个患者在登记后没有接受方案治疗(protocol therapy)，那么该患者在本研究中的登记将被取消。取消后尽可能快地通知研究协调员。

为了完成登记过程，协调员将指定患者研究数目，给患者指定剂量水平并将患者登记于本研究。

临床评估和安全性评估

临床评估

以下对肿瘤和安全性相关的评估将依照进度表(见研究日程表)完成：在以下时间点进行体检；生命体征、ECOG状态和身体测量(血压、脉率、体温和体重)；肿瘤评估(CT或MRI等)，所述时间即基线点(研究开始之前不超过4周)、8周、16周、24周、32周、40，以及之后每8周直至出现确定的疾病进展。如果治疗是由于疾病发展之外的其他原因而终止，那么每12周进行肿瘤评估直至疾病进展；在基线点计算中文大学预后指数(Chinese University Prognostic Index)(CUPI)(见附录A)。

还在出现任何不良事件时进行评估。

实验室评估

以下的参数将依照进度表(见研究日程表)并且在基线点——循环1的第1天的2周内——时测量：全血计数；PT/aPTT；血清化学；肝功能检验；基线点的甲胎蛋白(Alfa-feto protein)，每个循环的第1天及回访(study visit)结束后；基线点和每4周的空腹脂质(包括TG、LDL和总固醇)；以及基线点和每次给予贝伐单抗前蛋白尿的尿试纸值。如果基线试纸值阳性(即≥2+)，那么收集24小时尿蛋白；如果以前没有，那么在基线点加载(load)乙型肝炎表面抗原和e抗原以及HBVDNA；ECG；血清妊娠试验(孕期女性)。

另外的试验可根据研究人员的决定而进行。

关联性研究

药代动力学研究

在治疗开始第4天，取3ml血液用于雷帕霉素的波谷水平。只要有剂量的变化，就在第4天时获得血液雷帕霉素的波谷水平。

药代动力学研究将在第一循环的第8天达到稳定状态后进行。在治疗前以及第一剂量后1h、2h、3h、5h、24h和72h后提取3ml的全血。后续的前剂量雷帕霉素全血水平将在第8天、第29天以及每2周时确定，直至治疗结束。血液样品被收集于EDTA管中并于-20℃下保存至分析。在收集的3个月内分析样品以防止降解。将全血用于分析，这是因为95％的药物被螯合于红细胞中。峰药物浓度通过高效液相色谱确定，使用串联质谱仪进行检测。

取血方案

0h 1h 2h 3h 5h(第8天) 24h(第9天) 72h(第11天) 第29天循环2结束

药效学研究

药效学研究的目标是鉴定可作为有用的反应标记的合适的分子生物标记。由于p70^s6是mTOR的直接下游靶标并且还在外周血单核细胞(PBMC)中被组成性地激活，因此在用雷帕霉素处理之后定量p70^s6活性可作为一种有用的替代生物标记。

在从第0天(初次收集日期)、第4天(第0天收集后3天)和第8天(第0天收集后7天)的健康个体(N＝5)获得的PBMC中定量p70^s6激酶活性。这些系列测量的目的是，除了定义患者内和患者间的p70^s6活性变异性。

在以下时间点从癌症患者收集15ml用于PBMC的血用于定量p70^s6活性：0h、72h(第4天)、第8天和第29天。

肿瘤药效学

通过免疫组织化学研究肿瘤组织(归档的或者在进入本研究前获得的)的PTEN、4E-BP1、VEGF、p70S6K和CD31，以确定这些生物标记中的一种或者组合的表达是否可预测对雷帕霉素和贝伐单抗的反应。

血管生成的DCE CT评估

需要检验的假设是，DCE-CT是一种有用的血管生成生物标记，并且与药物水平和临床反应相关联。

在基线点(药物给予的1周内)和第29天进行DCE CT。

对每名患者选择一个靶损伤用于DCE-CT评估，并且所述靶损伤应满足以下标准：损伤最大直径要超过3cm并出现实体；要避免钙化的损伤或无增强中心的损伤；在随呼吸运动的器官中的损伤(肝脏转移或肺转移)中，优选在相对固定的位置的损伤，如颈淋巴结病(cervicaladenopathy)、纵隔淋巴结病、胸膜肿块(pleural masses)、腹膜后淋巴结病和腹腔结节；排除骨盆中的损伤。

使用一台64-探测器的多层面CT扫描器(General Electric，Milwaukee)。将20G细脉置于上肢处。将该患者放置于扫描器中。在初步扫描后，将4cm的板放置于选择的损伤之上并且使用以下的探测器设置：16个均为2.5mm的片(胸和腹部120kVp 70mA，颈部80kVp200mA)。需要一块造影强化前板(precontrast slab)。指示患者安静地进行呼吸。接下来，用一台电力注入器以每秒3-4ml给予70ml非离子的碘化造影剂(Omnipaque 300)，然后给予30ml盐水，并且在5-20秒的扫描延迟后在相同的工作台位置进行最高共30次的连续采集。指示患者摒住呼吸20秒，其后告诉其呼出，然后再次呼入，连续地摒住呼吸20秒。

用我们小组开发的软件进行数据分析。进行图象对齐以校正呼吸的运动。将目的区域(ROI)拉到涵盖损伤的位置。从大动脉或主动脉获得动脉输入函数。对ROI计算像素图并分析以下参数：Ktrans中位值(Median Ktrans)；平均IAUC90；通过分布参数模型(DistributedParameters model)得到的流速中值(Median Flow)、通透性-表面积的积、细胞外血管外体积分数(fractional extracellular extravascularvolume)和血管内体积分数。

分析上述参数的变化并与药物暴露和RECIST反应相关联。

还探索了与本研究中检查的其他生物标记的可能的相关性。

DCE CT的风险

CT造影剂的风险

CT造影剂的危及生命的变态反应的风险为40000分之1至1∶168000。严重反应的风险为2215分之1至6056分之1。(Katayama，Yamaguchi et al.1990)。这个风险通常较低。以前有造影剂变态反应的患者的风险会增加，不对这类患者进行检查。

溢出(extravasation)的风险

造影剂的溢出的出现率最高可达0.4％(每1000中4例)。对于已经发生过这种不常见现象的患者，严重损伤(如皮肤坏死)的出现率最高可达10分之一(或者每200次溢出出现1例)(Cohan，Ellis et al.1996)。因此，单溢出发生导致的严重反应的可能性是很低的(每10000次溢出出现约4例)。在其他的IRB批准的研究中使用较高注射速率(7ml/秒)(Van Beers，Leconte et al.2001)。

来自CT的辐射风险

我们在仿真人体模型上测量了我们的方案的辐射剂量，我们发现辐射负荷为69mSv(是常规多时相肝脏扫描的1.9倍)。一次DCE CT扫描的致命癌症的可能性为约0.51％，不同于常规多时相肝脏扫描的0.25％。预计最高对患者进行2次扫描，因此他们的诱导致命癌症的最大风险为1.02％。

然而，当与约1∶3的人致命癌症的自然风险进行对比考虑的时候(2001)，这种增大的风险是很小的。

此外，一般认为诱导的癌症显现所需的潜伏期是较长的(1991)。增大的辐射剂量较小，并且考虑到这些患者的晚期恶性病及预后不良，他们没有时间来显现诱导的癌症的风险。

这些方案(protocol)和风险类似于以下的那些方案和风险，即其已经在一个平台计划(platform grant)下被提交至NCC InstitutionalReview Board并获得批准。(NCC IRB Ref No：06-15-OTH)。

治疗持续时间

在不存在由于不良事件而导致的治疗延迟的情况下，治疗将持续6个循环或者直至满足以下标准中的一个：疾病进展；妨碍进一步给予治疗的并发疾病；一种或多种不合宜的不良事件；患者决定退出本研究；或者患者状况的一般的或特殊的变化，使得以研究人员的判断该患者不适宜接受进一步治疗。

随访的持续时间

在退出研究后对患者随访52周或者至死亡，选择先达到的时间。对由于不适宜的不良事件而被从研究中去除的患者随访至该不良事件消除或者稳定。

实施例E4.给剂量的延迟或剂量修正

贝伐单抗-特异的剂量延迟或剂量修正

不减少或改变贝伐单抗剂量(5mg/kg)。漏服的贝伐单抗过后不再给予。

然而，如果出现以下事件患者将不再继续服用贝伐单抗：胃肠道穿孔；动脉血栓栓塞事件；3/4级出血事件；4级血栓形成症状；4级高血压(高血压危象)；4级蛋白尿。

高血压的剂量调整

NCI-CTC级	高血压模式	采取的行动
			1	如果之前在正常范围内，无症状、DBP短暂地(＞24h) 升高＞20mmHg或者至＞150/100mmHg	继续用贝伐单抗
2	如果之前在正常范围内，复发或持续(＞24h)或者有症状地升高DBP＞20mmHg 或者至＞150/100mmHg	停止贝伐单抗。开始抗高血压药的治疗。在BP＜150/100 时继续贝伐单抗
			3	需要不止1种抗高血压药或者比之前更强化的治疗	如果持续高血压或有高血压症状则停止贝伐单抗，如果高血压未得到控制则永久停用贝伐单抗
4	高血压危象	永久停用贝伐单抗

蛋白尿的剂量调整

在开始贝伐单抗前3天内确定所有患者的蛋白尿的试纸值。蛋白尿＜2+，给予贝伐单抗治疗。第1次出现蛋白尿大于或等于2，按计划给予贝伐单抗，并且在下次贝伐单抗给予前3天以内收集24h尿蛋白：如果24h蛋白尿为2g或更少，继续使用贝伐单抗；如果24h尿蛋白超过2g，取消下一次既定的贝伐单抗，直至在下次循环中的重复24h尿蛋白少于或等于2g。如果是4级蛋白尿(肾病综合征)则永久停用贝伐单抗。

雷帕霉素-特异的剂量延迟或修正

在本研究过程中每2周进行治疗药物监测(TDM)。雷帕霉素水平不能决定使用的药物剂量，这是由于要监测对患者的毒性，并且如上文所解释的，剂量限制性毒性将决定使用的剂量。对雷帕霉素的免疫抑制效应的忧虑通过在治疗期间每2周监测全血计数来解决(见研究日程表)。由于肝脏毒性加剧的风险，如果胆红素高于正常临界值的3倍且AST高于正常临界值的5倍，则停止研究治疗。如果中性粒细胞计数少于1.5×10⁹/L且血小板少于100×10⁹/L，还应将雷帕霉素延迟。

剂量-限制性毒性和最大耐受剂量的定义

所有毒性依照National Cancer Institute Common Toxicity Criteria(NCI CTC第3版)进行分级。具体而言，详细记录以下的使用雷帕霉素时更倾向于出现的毒性：粘膜炎、腹泻、便秘、关节痛、皮疹、血液毒性(中性粒细胞减少、血小板减少、贫血)、空腹血脂升高、高血糖症、高血压、水肿、中性粒细胞减少感染、感染(包括肺炎(pneumonia)、尿路感染、菌血症、肝胆脓毒症)、肺炎(pneumonitis)、蛋白尿、胆红素/ALT/AST升高、肌酸酐增加、血栓形成、疲劳、体重减轻、恶心和呕吐。

血液剂量限制性毒性(Hematological Dose Limiting Toxicity)(DLT)的定义如下：在治疗的第一个月中出现的持续＞7天的4级中性粒细胞减少、中性粒细胞减少性发热(neutropenic fever)、4级贫血或3-4级血小板减少。

非血液DLT的定义为在治疗的第一个月中出现的任意3级或4级非血液毒性。

任何引起共14天延迟的毒性也被认为是剂量限制性的。

将毒性归类于与所述研究药物相关，除非它们可归因于潜在的肿瘤进展、并发的医学病症或并用的药剂。

任何异常的毒性必须向首席调研员报告。

实施例E5.不良事件：列表及报告要求

雷帕霉素可能的不良效应(列表见附录C)

许多不良效应的发生是剂量相关的。

雷帕霉素与多种可能的不良效应相关联，所述不良效应包括白细胞减少、血小板减少、贫血、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、腹泻等。

血液效应——可出现贫血、血小板减少和白细胞减少(Augustine，Knauss et al.2004)。在临床试验中，据报道在患者的百分之27至57中出现贫血，这种差异部分基于移植后的时间。血小板减少出现于百分之13至30的受试者中。血小板计数的减少是剂量相关的，并且通常出现于治疗起始后的第9-10天。在中止2周内可观察到血小板计数的正常化。白细胞减少没有明显的剂量相关性，在治疗起始的2周内显现，并且在中止时发生逆转。

HUS/血栓形成微血管病变——已有报道称溶血性尿毒症综合征(HUS)/血栓形成微血管病变出现于用结合物环孢素/雷帕霉素的免疫抑制方案中(Fortin，Raymond et al.2004)，并且这些药剂的中止在大多数患者中导致HUS的反转。

还已经报道了在肝脏移植受者中肝动脉血栓形成率、移植物失功率和死亡率的增加。在新的肝脏移植受体的两个随机的多中心(multicentre)试验中，雷帕霉素与环孢素或他克莫司的结合使用与肝动脉血栓形成率增加是相关联的。再者，在一项II期研究中，雷帕霉素和他克莫司的使用与死亡率和移植物失功率的增加是相关联的。

代谢效应——高脂血症(38％至57％)和高胆固醇血症(38％至46％)是雷帕霉素治疗的剂量-相关的效应，通过抑制脂蛋白脂肪酶而发生(Kraemer，Takeda et al.1998)。在一项对26名患者的研究中，75％的接受各种雷帕霉素剂量加基于环孢素的方案的患者中出现了超过5mmol/L(454mg/dL)的甘油三酯水平，在平均7周后出现14.5mmol/L(1272mg/dL)的平均峰值水平(Brattstrom，Wilczek et al.1998)。观察到了平行的总胆固醇增加，但较不显著(12mmol/L[469mg/dL]的平均峰值)。在接受波谷水平的受控雷帕霉素的患者中，在2个月后靶标波谷水平从30ng/mL降低至15ng/mL，导致甘油三酯水平的降低。所有接受雷帕霉素的患者中的甘油三酯水平在6个月后恢复至治疗前的状态。尽管有这些效应，雷帕霉素还是被证明有助于预防小鼠模型中和心脏移植受体中的动脉粥样硬化。

胃肠系统——常见的胃肠不良事件包括便秘(28％至36％)、腹泻(25％至42％)、消化不良(17％至25％)、恶心(25％至36％)和呕吐(19％至25％)。与单纯疱疹病毒无关的口腔疮(Mouth sores)已经在一些服用雷帕霉素口服溶液的患者中被报道。这可能是剂量相关的。

呼吸系统——进行性间质肺炎(Progressive interstitialpneumonitis)出现于大量的移植受体中(Morelon，Stern et al.2001)。临床症状包括呼吸困难、干咳、发热和疲劳。在一项15名患者的报道中，所有患者在药物中止或剂量减少3周内出现了临床上的和放射学上的改善。

肾功能——如动物中所示，雷帕霉素在单独使用时具有最低限度的肾毒性，但在人中没有结论性的数据。雷帕霉素已被与蛋白尿相关的肾小球病相关联(Izzedine，Brocheriou et al.2005)。在一项对68名其中以雷帕霉素替换钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurin-inhibitor)的肾脏移植受体的回顾性研究中，在该替换之前以及替换后第3月、第6月、第12月和第24月时评估蛋白尿。与蛋白尿的基线水平(平均值0.36克/天)相比，第3月、第6月、第12月和第24月时的蛋白尿显著升高(分别为1.35、1.67、1.27和1.14克/天)。蛋白尿在19名停用雷帕霉素的患者中逆转(1.95至0.9克/天)(Letavernier，Pe’raldi et al.2005)。

妊娠中的致畸性/效应——雷帕霉素在妊娠中是禁忌的，并且还应该在计划受孕前至少12周时中断其使用。

其他——在两个病例报告中，已将雷帕霉素与白细胞分裂性脉管炎的发生相关联。雷帕霉素还与手术后伤口并发症相关(Hardinger，Cornelius et al.2002)。还报告了在5名被给予高剂量雷帕霉素和血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的患者中出现舌水肿。在停用ACE抑制剂后症状消失，并且在再次给予低剂量的雷帕霉素和ACE抑制剂后不复发。使用雷帕霉素时可观察到大量不良的皮肤事件。在一项来自法国的研究中，80名肾脏移植患者中的79名报告有皮肤障碍；最常见是痤疮样疹(46％)、头皮毛囊炎(26％)、化脓性汗腺炎(12％)、水肿(55％)、血管性水肿(15％)、阿弗他溃疡(aphthous ulceration)(60％)和鼻出血(60％)。

贝伐单抗的可能的不良效应

胃肠穿孔、腹腔脓肿和伤口裂开已在接受贝伐单抗的患者中被报告(与治疗持续时间无关)；监测患者的腹痛、便秘或呕吐症兆/症状。对出现这些并发症的患者永久停止。在给予贝伐单抗和进行外科手术之间用于防止伤口愈合过程中的病损的合适间期还没有确立。不要在大手术28天内开始治疗，并且仅在切口完全愈合后进行治疗。在择期手术前应中止贝伐单抗，并要考虑所估计的半衰期(20天)。

避免在近期咯血的患者中使用；已有报告称在接受贝伐单抗的患者中有肺大出血(主要在患有非小细胞肺癌的患者中)。避免在具有CNS转移的患者中使用；由于担心出血，将具有CNS转移的患者从临床试验中排除。可能出现其他的严重出血事件，但频率较低；建议中止所有具有严重出血的患者中的治疗。

在患有心血管疾病的患者中使用时要当心；将近期患有重大心血管疾病的患者从临床试验中排除。动脉血栓拴塞事件(如中风、MI、TIA、心绞痛)风险的增加与化学治疗和贝伐单抗的结合使用相关。有动脉血栓拴塞病史或年龄≥65时可能会出现甚至更高的风险；如果出现严重的动脉血栓拴塞事件则永久停止。

可导致CHF并且/或者使蒽环类药物的心脏毒效应成为可能。贝伐单抗可引起高血压并且/或者使高血压明显恶化；在已患有高血压的患者中使用时要当心，并且严密地监测所有患者中的BP。建议在有高血压危象的患者中永久停止。在出现不可控高血压的患者中暂时地中止。在有严重输液反应的患者中中断治疗；现在没有数据建议在有CHF和/或严重输液反应的患者中重新建立治疗。已经将蛋白尿和/或肾病综合征与贝伐单抗关联起来；建议在患有肾病综合征的患者中停止治疗。还没有确认小儿患者中的安全性和有效性。

不良事件报告

将记载于修改的3.0版NCI Common Terminology Criteria forAdverse Events(CTCAE)中的说明和分级量表(grading scales)应用于AE报告。所有合适的治疗区域(treatment area)可查阅3.0版的CTCAE副本。3.0版的CTCAE副本可从CTEP网站(http://ctep.cancer.gov/reporting/ctc.html)下载。

不良事件的速报

所有报告的AE必须拷贝给研究协调员(e-mail)。研究协调员将AE报告提交给首席调研员以进行及时的审阅。

速报指导方针——一种研究中新药剂的I期研究：

注：所有在研究时死亡不究其原因必须用速报报告。应提供归因于治疗或是其他原因。

任何与相当于3、4或5级CTCAE的致使住院(或者延长现有的住院)的医疗事件必须报告，而不究其被指定为预期的或意外的。

在所有报告上使用NCI协议编号(NCI protocol number)。

那些不需要速报的AE必须在常规的研究数据提交中报告。

实施例E6.药学信息

雷帕霉素和贝伐单抗

不良事件和潜在风险

见附录B

可用性

雷帕霉素是一种由Wyeth International为研究人员提供的研究中的新药剂。贝伐单抗是Roche的经FDA-批准的药剂。

药剂排序

药物可由首席调研员(或者他们授权的指派人)要求。

药剂的衡算计量

研究者或者由研究者指派的责任方(responsible party)必须保留以下详细记录：从各个药物企业收到的所有药剂的清单和处置。

实施例E7.研究日程表

在方案治疗开始之前2周内进行基线评估。在治疗开始前4周必须进行扫描和x-射线。在患者病症恶化的事件中，在下一轮治疗起始之前48小时内重复进行实验室评估(参见附录D)。

实施例E8.效应的测量

虽然反应不是本试验的主要目的，但是可通过标准的判据对患有可测量疾病的患者进行评估。对于本研究而言，应每8周对患者再次评估。除了基线扫描外，在最初记录到目标反应后4周，还将获得确证扫描。

定义

在本研究中将使用新的国际标准来评估反应和进展，该标准由Response Evaluation Criteria in Solid Tumors(RECIST)Committee(Therasse，Arbuck et al.2000)提出。变化仅仅是将肿瘤损伤的最大直径(单维量测量)应用于RECIST标准中。注：使用下文提供的标准，损伤是可测量的或不可测量的。术语“可评估的”不被用于修饰可测量性，这是因为它不提供额外的意义或准确性。

对可测量疾病的评估

所有测量均使用尺或卡尺进行并周度量符号(metric notation)记录。所有基线评估应尽可能在治疗开始时进行，绝不超过治疗开始前的 4周。

在基线以及随访过程中，应使用相同的评估方法和相同的技术来表征每种经鉴定并报告的损伤。在已经使用两种方法评估治疗物的抗肿瘤效应的时候，基于成像的评估优于通过临床检验的评估。

临床损伤。仅当临床损伤是在表面上时(如皮肤小结和有触感的淋巴结)认为它们是可测量的。对于皮肤损伤，推荐通过彩色摄影(包括一个估量损伤大小的尺)进行记录。

常规CT。这些技术应以片厚10mm或更小的连续切片进行。这是优选的测量模式。

甲胎蛋白(AFP)肿瘤标记物不单独用于评估反应。

实施例E9.反应标准

对靶损伤的评估

完全反应(CR)：所有靶损伤都消失。

部分反应(PR)：靶损伤的最大直径(LD)和至少降低30％，

以基线LD的和为参照。

进行性疾病(PD)：靶损伤的LD和至少降低20％，以从治疗开始或者从出现一个或多个新损伤以来记录到的最小的LD和为参照。

稳定疾病(SD)：既没有收缩到足以符合PR，也没有增大到足以符合PD，以从治疗开始以来记录到的最小的LD和为参照。

对最佳总体反应的评估

最佳总体反应是从治疗开始直至疾病进展/复发期间记录到的最佳的反应(以从治疗开始以来记录到的最小测量值为进行性疾病的参照)。患者最佳反应的指定将依赖于同时达到测量标准和确证标准。

注：

健康状态整体衰退、需要停止治疗而在当时没有疾病进展的外在证据的患者应该被分类成具有“症状的衰退”。应尽量记录客观的进展，甚至是在停止治疗后。

在某些情况下，可能难以分辨残余的疾病和正常组织。如果对完全反应的评估依赖于这项确定，那么建议在确证完全反应状态之前研究残余的损伤(细针抽吸/活检)。

确证的测量/反应的持续时间

确证

为了指定PR状态或CR状态，肿瘤测量中的变化必须通过重复评估来确证，该重复评估应在反应初次满足标准后4周进行。对于SD，进入研究后随访测量必须满足SD标准至少一次，最小间隔为6-8周。

总体反应的持续时间

对总体反应的持续时间的测量为从测量标准符合CR或PR(不管哪个首先被记录到)的时间至客观地记录到复发性疾病或进行性疾病的第一天(以从治疗开始以来记录到的最小测量值为进行性疾病的参照)。

对总体CR的持续时间的测量为从测量标准首次符合CR的时间至客观地记录到疾病复发的第一天。

稳定疾病的持续时间

对稳定疾病的测量为从治疗开始至符合进展的标准，以从治疗开始以来记录到的最小测量值为参照。

无进展生存期

无进展生存期被定义为从治疗开始(第1天)至疾病进展的持续时间。无进展的患者将在末次随访日接受检查。

总体存活期

总体存活期被定义为从治疗开始(第1天)至死亡的持续时间。存活者在末次随访日接受检查。

实施例E10.数据报告/管理规定(Regulatory Considerations)

方法

计划进行无中间时期的分析。一名来自临床试验顺应性机构(Clinical Trials Compliance Unit)的监视员定期地检查所收集的数据和研究人员的文件。所有的监测活动都记录在监测报告中。

提交的责任

数据管理员负责编辑并提交所有参与者的数据，并负责将数据提交给首席调研员审阅。

实施例E10.统计学考虑(Statistical Considerations)

这是I期确定剂量的研究。对所有登记在本研究中的患者评估毒性和反应。

本研究的主要目的是，在患有肝细胞癌的患者中确定雷帕霉素与贝伐单抗结合的剂量限制性毒性以及该药物结合物的最大耐受剂量(MTD)。如上文所述对毒性谱进行分级，并与相应的剂量水平一起报告。

在给予MTD的剂量时应出现不超过2个DLT。计算雷帕霉素在每名患者中的稳态血浆药物浓度、曲线下面积、分布体积和清除率，并与剂量相关联。总结所有患者的这些量。将连续的血液水平与毒性进行关联描述。

将基于RECIST标准对研究治疗的反应速率(完全反应、部分反应、稳定疾病)进行描述，并按剂量进行总结。

对无进展的生存期和总体生存期的测量将从开始治疗的第1天起，并通过Kaplan-Meier方法对其进行分析。

将重复测量ANOVA用于比较正常对照(n＝5)和研究患者之间PBMC中p70S6K活性的分布(在第1天、第4天和第8天时)。根据由于研究的剂量将患者分组。

如果观察到足够数目的反应，则使用重复测量的ANOVA将PBMC中的p70S6K活性与肿瘤反应相关联。

按剂量描述肿瘤组织生物标记物(PTEN、4EBP-1、CD31、pS6K和VEGF)的表达。

为了将肿瘤数据与反应剂量相关联，将进行Wilcoxon秩和检验，以比较对雷帕霉素反应者和非反应者之间的肿瘤标记物。将所有剂量组合用于该分析。

可将最佳总体反应分类至三个组中：CR/PR、SD和进行性疾病(PD)。在每个最佳总体反应的组(如所述)中，对血管生成的DCE CT评估在基线和第8天之间的变化进行探索性分析。

血管生成的DCE CT评估的变化还与第8天获得的药物水平相关联。

样本量考虑：在3个剂量水平均观察3-6名患者，并且在MTD观察6名患者的扩大的同龄组。本研究预期的增加为6名患者(如果在剂量水平1有不合适的DLT)至36名患者(如果达到剂量水平5并包括扩大的同龄组)和5名健康对照。

实施例E11.附录A

CUPI得分

得分区间-7至12。

AFP，甲胎蛋白；CUPI，中文大学预后指数；TNM，肿瘤、结和转移。

Karnofsky体能状况(Karnofsky Performance status)得分

Karnofsky得分是另一种测量患者日常活动体力的方法。已经证明，该得分不仅可用于跟踪疾病过程(通常为进行性缺陷并最终死亡)，而且还是一种预示物：在肿瘤诊断时具有最高(最好)Karnofsky得分的患者在其疾病过程中具有最佳的生存期和生命质量。

得分函数

100：正常，无疾病迹象。90：能进行正常活动，仅出现小症状。80：正常活动吃力，有一些症状。70：能照顾自己但不能进行正常活动。60：大多数需求需要偶尔的帮助、照顾。50：需要大量的帮助。40：残疾，需要特殊帮助。30：重度残疾。20：病重，需要积极支持治疗(activesupportive treatment)。10：垂死的。

ECOG/Zubrod得分体能状况

Zubrod得分类似于“体能状况”表：

0：无症状。1：有症状，完全步行。2：有症状，白天卧床＜50％。3：有症状，白天卧床＞50％，但非卧床不起。4：卧床不起。

实施例E12.附录B.药物信息

雷帕霉素的药效学/药代动力学

吸收：快

分布：12L/kg(区间：4-20L/kg)

蛋白结合：92％，主要结合至白蛋白

代谢：主要在肝，经CYP3A4；由P-糖蛋白介导流出至肠腔中

生物可利用率：口服溶液：14％；口服片剂：18％

消除的半衰期：平均：62小时

峰值时间：1-2小时

排泄：粪便(91％)；尿(2％)

雷帕霉素的不良效应：

＞20％：

心血管的：高血压(39％至49％)、周围水肿(54％至64％)、水肿(16％至24％)、胸痛(16％至24％)

中枢神经系统：发热(23％至34％)、头痛(23％至34％)、痛(24％至33％)、失眠(13％至22％)

皮肤的：痤疮(20％至31％)

内分泌的&代谢的：高胆固醇血症(38％至46％)、低磷酸盐血症(15％至23％)、高脂血症(38％至57％)、低钾血症(11％至21％)

胃肠的：腹痛(28％至36％)、恶心(25％至36％)、呕吐(19％至25％)、腹泻(25％至42％)、便秘(28％至38％)、消化不良(17％至25％)、体重增加(8％至21％)

泌尿生殖的：尿路感染(20％至33％)

血液的：贫血(23％至37％)、血小板减少(13％至40％)

神经肌肉的和骨骼的：关节痛(25％至31％)、虚弱(22％至40％)、腰痛(16％至26％)、振颤(21％至31％)

肾脏的：血清肌酐升高(35％至40％)

呼吸器官的：呼吸困难(22％至30％)、上呼吸道感染(20％至26％)、咽炎(16％至21％)

3％至20％(限于重要的或生命胁迫的)：

心血管的：心房颤动、CHF、体位性低血压、晕厥、血栓形成、静脉血栓拴塞

中枢神经系统：焦虑、意识错乱、抑郁、情绪不稳、神经病、嗜睡皮肤的：多毛症、瘙痒症、皮肤肥厚、皮疹(10％至20％)

内分泌的和代谢的：Cushing综合征、糖尿病、高钙血症、高血糖症、高磷酸盐血症、低钙血症、低血糖症、低镁血症、低钠血症、高钾血症(12％至17％)

胃肠的：食道炎、胃炎、牙龈增生、肠梗阻

泌尿生殖的：阳萎

血液的：TTP、溶血性尿毒症综合征、出血、白细胞减少(9％至15％)

肝脏的：转移酶升高、腹水

神经肌肉的和骨骼的：CPK升高、骨坏死、手足抽搐、感觉异常

耳的：耳聋

肾脏的：急性肾小球坏死、肾病(中毒性)、尿潴留

呼吸器官的：哮喘、肺水肿、胸腔积液

杂的：流感样综合征、感染、腹膜炎、脓毒症

上市后报告和/或病例报告：过敏样反应、过敏反应、吻合口破裂(anastomotic disruption)、血管性水肿、筋膜裂开(fascial dehiscence)、肝坏死、过敏性血管炎；没有经鉴定的传染性病因的间质性肺疾病(肺炎、肺纤维化和闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎)、淋巴水肿、中性白细胞减少、全血细胞减少。在肝脏移植患者中(非认可的应用)，在临床试验中观察到肝动脉血栓形成增加和移植物失效增加。在肺移植患者中(非认可的应用)，已经观察到支气管吻合口裂开。

贝伐单抗的药效学和药代动力学

分布：Vd：46mL/kg

消除的半衰期：20天(区间：11-50天)

排泄：清除率：2.75-5mL/kg/天

贝伐单抗的不良效应：

＞10％：

心血管的：高血压(23％至34％相对于14％，重度的/生命胁迫的12％相对于2％)；低血压(7％至15％相对于7％)；血栓栓塞(18％相对于15％)

中枢神经系统的：痛(61％至62％相对于55％，重度的8％相对于5％)；头痛(26％相对于19％)；头晕(19％至26％相对于20％)

皮肤的：脱发(6％至32％相对于26％)、皮肤干燥(7％至20％相对于7％)、剥脱性皮炎(3％至19％相对于3％)、皮肤变色(2％至16％相对于3％)

内分泌的&代谢的：体重减轻(15％至16％相对于10％)、低钾血症(12％至16％相对于11％)

胃肠的：腹痛(50％至61％相对于55％，重度的/生命胁迫的8％相对于5％)；腹泻(重度的/生命胁迫的34％相对于25％)；呕吐(47％至52％相对于47％)；食欲缺乏(35％至43％相对于30％)；便秘(29％至40％相对于29％，重度的/生命胁迫的4％相对于2％)；口腔炎(30％至32％相对于18％)；消化不良(17％至24％相对于15％)；肠胃气胀(11％至19％相对于10％)；味觉障碍(14％至21％相对于9％)

血液的：白细胞减少(重度的/生命胁迫的37％相对于31％)、胃肠出血(19％至24％相对于6％)、中性白细胞减少(重度的/生命胁迫的21％相对于14％)

神经肌肉的和骨骼的：虚弱(73％至74％相对于70％，重度的/生命胁迫的10％相对于7％)；肌痛(8％至15％相对于7％)

眼睛的：眼泪增多(6％至18％相对于2％)

肾脏的：蛋白尿，包括某些患者中的肾病综合征(36％相对24％)

呼吸器官的：上呼吸道感染(40％至47％相对于39％)、鼻出血(32％至35％相对于10％)、呼吸困难(25％至26％相对于15％)

1％至10％：

心血管的：DVT(6％至9％相对于3％；重度的/生命胁迫的9％相对于5％)；动脉内血栓形成(重度的/生命胁迫的4％相对于2％)、晕厥(重度的/生命胁迫的3％相对于1％)、心脏-/脑血管动脉血栓形成事件(2％相对于1％)

中枢神经系统的：意识错乱(1％至6％相对于1％)、步态异常(1％至5％相对于0％)

皮肤的：皮肤溃疡(6％相对于1％)、指甲障碍(2％至8％相对于3％)

内分泌的和代谢的：输液反应(＜3％)

胃肠的：口干(4％至7％相对于2％)、结肠炎(1％至6％相对于1％)

血液的：血小板减少(5％相对于0％)

肝脏的：高胆红素血症(1％至6％相对于0％)

肾脏的：尿频/尿急(3％至6％相对于1％)

呼吸器官的：声音改变(6％至9％相对于2％)

＜1％(限于重要的或生命胁迫的)：吻合口溃疡、高血压脑病、低钠血症、肠坏死、肠梗阻、肠系膜静脉阻塞、全血细胞减少、多发性浆膜炎、蛛网膜下腔出血、输尿管狭窄

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本文件中提及的每件申请和专利，上述每件申请和专利中引用或参考的每个文件(包括每件申请和专利的申请和审查过程中的(“申请引用的文件”))，以及在每件申请和专利中以及在申请引用的任意文件中引用或提及的任意产品的任何厂商说明书或目录，据此通过引用纳入本文。再者，本文中引用的所有文件，本文引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文引用或提及的任意产品的任何厂商说明书或目录，据此通过引用纳入本文。

只要不偏离本发明的范围和主旨，本发明所述方法和系统的多种修改和变化对本领域技术人员来说将是显而易见的。虽然本发明是结合具体优选的实施方案来描述的，但应理解所要求保护的发明不应被不适当地局限于这种具体的实施方案，并且在本发明的范围内可以以它们进行多种修改和添加。事实上，对所述用于实现本发明的模式的多种修改意欲被包括在权利要求的范围内，所述修改对分子生物学或相关领域的技术人员来说显而易见的。再者，只要不偏离本发明的范围，以下的从属权利要求中特征的多种结合可以用独立权利要求的特征实现。

Claims

1.雷帕霉素和贝伐单抗的结合物在制备用于治疗或预防个体中的肝细胞癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述药物是药物组合物的形式，所述组合物包含雷帕霉素和贝伐单抗以及可药用的载体、赋形剂或稀释剂。

3.根据权利要求1或2的用途，其中所述药物以适宜于口服的形式提供或以适宜于静脉内给药的形式提供。

4.根据权利要求1或2的用途，其中所述药物以片剂提供。

5.根据权利要求1或2的用途，其中所述治疗或预防肝细胞癌包括给予一个个体雷帕霉素，并同时地或依次地给予贝伐单抗。

6.根据权利要求1的用途，其中所述雷帕霉素以可提供1mg/天至10mg/天的剂量的量存在于所述药物组合物中。

7.根据权利要求1的用途，其中所述贝伐单抗以可提供5mg/kg/2周至10mg/kg/2周的剂量的量存在于所述药物组合物中。

8.一种防止离体肝细胞或组织的生长和/或增殖的方法，所述方法包括使所述肝细胞或组织与一种包含雷帕霉素的第一药剂和一种包含贝伐单抗的第二药剂接触。

9.根据权利要求8的方法，所述方法包括使所述肝细胞或组织与所述第一药剂和所述第二药剂同时地或依次地接触。

10.根据权利要求8或9的方法，其中所述第一药剂是药物组合物的形式，所述组合物还包含可药用的载体、赋形剂或稀释剂。

11.根据权利要求8或9的方法，其中所述第一药剂以适宜于口服的形式提供。

12.根据权利要求8或9的方法，其中所述第一药剂以片剂提供。

13.根据权利要求8或9的方法，其中所述雷帕霉素以可提供1mg/天至10mg/天的剂量的量存在于所述第一药剂中。

14.根据权利要求8或9的方法，其中所述第二药剂是药物组合物的形式，所述组合物还包含可药用的载体、赋形剂或稀释剂。

15.根据权利要求8或9的方法，其中所述第二药剂以适宜于静脉内给药的形式提供。

16.根据权利要求8或9的方法，其中所述贝伐单抗以可提供5mg/kg/2周至10mg/kg/2周的剂量的量存在于所述第二药剂中。