CN117122596A - 泛-fgfr抑制剂在调控炎症反应中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种泛‑FGFR抑制剂在调控炎症反应中的应用。本发明提供的泛‑FGFR抑制剂LY2874455能有效激活自噬，并抑制脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞的固有炎症。此外，本发明还揭示了免疫蛋白酶体通过选择性自噬进行降解，提供的免疫蛋白酶体抑制剂可以逆转自噬缺陷巨噬细胞的过度炎症，从而证实免疫蛋白酶体降解在自噬介导的炎症抑制中的关键作用。以上结果表明，本发明提供的泛‑FGFR抑制剂方案能有效调节免疫蛋白酶体的选择性自噬。

Description

泛-FGFR抑制剂在调控炎症反应中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种泛-FGFR抑制剂在调控炎症反应中的应用。
背景技术
炎症是一种基本的免疫反应，使生物在遭受病原微生物感染或组织损伤期间能够存活。各种外在和内在的炎症刺激物包括但不限于各种感染性微生物(如病毒和细菌)、癌细胞或死亡细胞。尽管炎症是宿主健康免疫反应的重要组成部分，但严重的炎症会导致各种疾病，如败血症、类风湿性关节炎、急性肺损伤、慢性呼吸道疾病、炎症性肠病(IBD)、癌症、衰老，甚至死亡。其中，病毒和致病性细菌感染是引起炎症和死亡的主要原因。重症监护病房(ICU)中约50％的患者因细菌感染而发生严重败血症，感染患者的死亡率为29％。死亡原因主要归因于脂多糖(LPS)内毒素的细胞毒性作用。现有研究表明，在LPS刺激的巨噬细胞中会产生多种炎症因子，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β) 和白细胞介素-6(IL-6)以及高水平的细胞内活性氧(ROS)等。
免疫蛋白酶体是巨噬细胞等免疫细胞中炎症的重要介质，由炎症信号触发其表达。现有研究表明，免疫蛋白酶体不仅可以将蛋白质水解成多肽，作为抗原载入MHC-I复合物，还与巨噬细胞极化、炎性细胞因子产生、各种炎性和自身免疫性疾病以及结肠炎和结肠炎相关癌症等有关。因此，免疫蛋白酶体抑制剂已成为各种疾病的候选药物，主要用于降解过量的免疫蛋白酶体。然而，目前尚不清楚免疫蛋白酶体是否以及如何降解。
巨自噬/自噬是一种分解代谢途径，通过双层膜囊泡(自噬体)进行大量运输，最终降解溶酶体中的细胞内成分。自噬途径是一个动态过程，其功能是通过选择性降解胞质物质(如有毒蛋白质聚集体、不必要或受损的细胞器和细胞内病原体) 来维持细胞内稳态。自噬功能障碍与几种促炎性疾病有关，如类风湿性关节炎、狼疮和炎症性肠病(IBD)。自噬基因ATG16L1、NOD2、IRGM、ATG5和ATG7 的种系变异与包括克罗恩病在内的慢性炎症性疾病有关。然而，自噬限制炎症的机制目前尚不清楚。
综上所述，阐明自噬是否以及如何以免疫蛋白酶体为降解靶点，以及免疫蛋白酶体的降解在限制炎症中的作用非常重要。为了解决这个问题，本发明提供了一种泛-FGFR抑制剂在调控炎症反应中的应用，以期缓解现有难题中的至少一种。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供泛-FGFR抑制剂在调控炎症反应中的应用，具体技术方案如下。
泛-FGFR抑制剂在制备抗炎药中的应用，所述泛-FGFR抑制剂可以抑制细胞炎症，所述泛-FGFR抑制剂为(R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-二氯吡啶-4- 基)乙氧基)-1H-吲唑-3基)乙烯基)-1H-吡唑-1-基)乙醇。
进一步，所述抗炎药可用于急性肺损伤炎症反应、败血症炎症反应和炎症性肠胃病。
进一步，所述泛-FGFR抑制剂通过激活细胞选择性自噬反应来促进免疫蛋白酶体降解以抑制炎症。
进一步，所述泛-FGFR抑制剂抑制FGFR活性和下游PI3K/AKT/mTOR 信号通路，导致所述选择性自噬的激活。
一种抗炎药，包含泛-FGFR抑制剂和免疫蛋白酶体抑制剂，所述泛-FGFR 抑制剂为(R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-二氯吡啶-4-基)乙氧基)-1H-吲唑-3基)乙烯基)-1H-吡唑-1-基)乙醇；所述免疫蛋白酶体抑制剂为ONX-0914。
进一步，所述抗炎药还包含药学上允许添加的辅料和/或助剂。
进一步，所述抗炎药可用于急性肺损伤炎症反应、败血症炎症反应和炎症性肠胃病。
泛-FGFR抑制剂在制备细胞炎症检测试剂盒中的应用，所述试剂盒至少还包含一种脂多糖，所述泛-FGFR抑制剂可以是(R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1- (3,5-二氯吡啶-4-基)乙氧基)-1H-吲唑-3基)乙烯基)-1H-吡唑-1-基)乙醇。
脂多糖可引起细胞炎症反应，可用作检测时的对照。
进一步，所述试剂盒可用于检测细胞的炎症水平，所述细胞包括单核巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和/或骨髓源性巨噬细胞。
进一步，所述试剂盒可以通过检测细胞中的NO、ROS和/或促炎细胞因子的含量水平来判断细胞炎症的程度。
进一步，所述试剂盒可以通过检测细胞的形态来判断细胞是否有炎症。
有益技术效果
在本发明中，通过激活自噬的实验验证，确定泛-FGFR(pan-FGFR)抑制剂LY2874455为一种有效的抗炎治疗应用。利用LPS诱导的巨噬细胞炎症反应作为功能筛选，进一步确定泛-FGFR抑制剂LY2874455是一种有效的细胞炎症抑制剂。本发明揭示了LY2874455对自噬的刺激促进了LPS诱导的巨噬细胞中免疫蛋白酶体的自噬降解。具体来说，LY2874455抑制AKT-mTOR轴激活了自噬，进一步引发由受体SQSTM1/p62介导的免疫蛋白酶体的降解。此外， LY2874455激活的自噬能显著抑制炎性细胞因子的产生，在本发明中，LY2874455 诱导的免疫蛋白酶体自噬降解通过LPS诱导的急性肺损伤和右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的炎症性肠病的活体小鼠模型得到验证。这些实验表明，免疫蛋白酶体的选择性自噬降解是先天性炎症信号的关键调节因子，而LY2874455通过激活细胞选择性自噬反应来促进免疫蛋白酶体降解，进而抑制炎症。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为LY2874455减轻LPS刺激的巨噬细胞的炎症反应；
图2为LY2874455抑制LPS刺激的巨噬细胞的炎症；
图3为LY2874455降低LPS刺激的巨噬细胞中免疫蛋白酶体特异性亚单位的蛋白质水平；
图4为免疫蛋白酶体在LPS诱导的NF-κB因子上游炎症中发挥作用；
图5为LY2874455激活自噬过程；
图6为LY2874455诱导巨噬细胞自噬；
图7为LY2874455通过自噬和选择性受体p62促进免疫蛋白酶体的降解；
图8为LY287445通过自噬诱导免疫蛋白酶体亚单位降解；
图9为LY2874455通过自噬途径抑制炎症；
图10为LY287445通过自噬抑制炎症；
图11为LY2874455抑制小鼠模型的肺部和肠道炎症；
图12为LY2874455通过诱导免疫蛋白酶体自噬降解抑制炎症反应的示意图概述。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的 +/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从 2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
附图详细说明：
图1：(A)LY2874455的化学结构。(B)LY2874455抑制LPS刺激的RAW264.7 细胞释放一氧化氮(NO)。测量培养上清液中的NO浓度，与对照组相比，其显示为倍数变化。从至少三个独立的重复实验中获得类似的结果**P<0.01， ***P<0.001。(C)LY2874455消除了LPS刺激的RAW264.7细胞中活性氧(ROS) 的产生。经LPS或/和LY2874455处理后，清洗RAW264.7细胞，并用活性氧探针DCFH-DA标记。流式细胞术定量检测细胞DCFH-DA染色。从三个独立实验中获得了类似的结果。(D)代表性图像示出了DCFH-DA探针对活性氧的荧光染色。比例尺：10μm。(E)在LY2874455治疗下，巨噬细胞的极化形态(表明炎症状态)发生逆转。示出了RAW264.7细胞的形态学图像。比例尺：10μm。(F-H) LY2874455抑制LPS刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子和NO合成酶的表达。通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测促炎细胞因子基因(IL-6、TNF-α)和NO合成酶(iNOS)的表达。(I-K)从RAW264.7细胞中提取总蛋白，用于免疫印迹分析iNOS、IKK-β、p65和磷酸化p65(p-p65)的蛋白质水平。(L)LY2874455 抑制LPS刺激的巨噬细胞中磷酸化p65的核移位。RAW264.7细胞用LPS(20ng/ml) 刺激2小时，加入或不加入LY2874455(2μM)。示出了p65和细胞核(DAPI) 双重免疫染色的代表性图像。比例尺：10μm。
图2：(A)RAW264.7细胞与27种化学物质共培养，并用LPS(20ng/ml)刺激 24小时。测量培养上清液中的NO浓度，其表达呈倍数变化。(B-D)通过qRT-PCR 检测经LY2874455(2μM)和LPS(20ng/ml)处理24h的腹腔巨噬细胞(PM) 中促炎基因(IL-6、TNF-α)和iNOS的表达。(E)免疫印迹法检测PM中iNOS 和GAPDH的蛋白水平。(F-H)通过qRT-PCR检测经LY2874455(2μM)和LPS (20ng/ml)处理24h的骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中促炎基因(IL-6、TNF-α) 和iNOS的表达。(I)免疫印迹法检测BMDM中iNOS和GAPDH的蛋白水平。 (J-K)通过qRT-PCR检测经LY2874455(2μM)和LPS(20ng/ml)处理24h 的人THP-1单核细胞中促炎基因(IL-6和TNF-α)的表达。
图3：(A)上图是用LPS(20ng/ml)或/和LY2874455处理的RAW264.7细胞基于质谱的蛋白质组学分析方法图。下图是蛋白酶体亚单位蛋白质水平的热图。 LY2874455治疗可显著降低免疫蛋白酶体特异性亚单位(箭头所指)的蛋白质水平。(B-C)20s组成蛋白酶体和免疫蛋白酶体的特定亚单位的图和名称。(D) LY2874455降低了免疫蛋白酶体特异性亚单位的蛋白质水平。分析用LY2874455 (2μM)和LPS(20ng/ml)处理的RAW264.7中免疫蛋白酶体亚单位LMP2、 LMP7、LMP10和内在对照GAPDH的蛋白质水平。(E)LY2874455对组成型蛋白酶体特异性亚单位的蛋白质水平没有影响。组成性蛋白酶体亚基PSMB7、 PSMB6、PSMB5和对照GAPDH的蛋白质水平分析如(D)所示。(F)从C57BL/6J 小鼠获得腹腔巨噬细胞(PM)，并用LPS(20ng/ml)和/或LY2874455(2μM) 处理24h。提取总蛋白，检测免疫蛋白酶体亚单位LMP2、LMP7、LMP10和 GAPDH的蛋白水平。(G)检测组成性蛋白酶体亚基PSMB7、PSMB6、PSMB5 和GAPDH的蛋白质水平。(H)在RAW264.7细胞中测定免疫蛋白酶体亚基LMP2 和LMP7的酶活性。*P<0.05，***:P<0.01，***:P<0.001。(I-J)LY2874455不能通过抑制免疫蛋白酶体进一步抑制巨噬细胞的炎症。特异性免疫蛋白酶体抑制剂 ONX-0914抑制LPS刺激的巨噬细胞中炎性细胞因子的表达。LY2874455的额外治疗不能进一步抑制炎症。用LPS、免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914(1μM)和 LY2874455(2μM)处理24小时，通过qRT-PCR检测RAW264.7细胞中炎性细胞因子基因(TNF-α和IL-6)的表达。***：P<0.001。NS：没有统计学差异。
图4：(A)免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914抑制LPS刺激的巨噬细胞中 NF-κB因子p65的核移位。用LPS(20ng/ml)刺激RAW264.7细胞2小时，加入或不加入ONX-0914(1μM)。示出了代表性图像。比例尺：10μm。(B)从经 LPS(20ng/ml)和ONX-0914(1μM)处理的RAW264.7细胞中提取总蛋白，用 western blot分析磷酸化IκB-α(p-IκB-α)的蛋白质。(C)NF-κB炎症信号通路示意图。(D-E)提取用LPS(20ng/ml)和ONX-0914(1μM)或LY2874455(2μM) 处理的RAW264.7细胞的总蛋白，用于对NF-κB信号通路上游的指示因子功能的蛋白质水平进行western blot分析。
图5：(A)蛋白酶体抑制剂MG132不能阻止LY2874455诱导的免疫蛋白酶体亚单位的减少。分析用LPS(20ng/ml)、LY2874455(2μM)和MG132(50μM) 处理的RAW264.7细胞中LMP2、LMP7和GAPDH的蛋白质水平。(B-C)自噬抑制剂阻断了LY2874455诱导的免疫蛋白酶体亚单位的减少。在用LPS (20ng/ml)、LY2874455(2μM)和自噬抑制剂氯喹(CQ，20μM)或渥曼宁(Wortmannin，100nM)处理的RAW264.7细胞中分析LMP2、LMP7和GAPDH 的蛋白质水平。(D)LY2874455增强了自噬通量。在RAW264.7细胞中，用 mCherry-EGFP-LC3转染24h，再用LPS(20ng/ml)或/和LY2874455刺激24h，固定后在共聚焦荧光显微镜下观察细胞内LC3的斑点。较高水平的mCherry-LC3 信号和较低水平的EGFP-LC3信号(合并中显示为红色)表明刺激了自噬通量，而mCherry-LC3和GFP-L3的相似信号水平(合并中显示为黄色)表明阻塞了自噬通量。示出了来自三个重复实验的代表性图像。比例尺：10μm。(E) LY2874455促进自噬体的形成。用透射电子显微镜分析用对照或LY2874455 (2μM)处理24小时的RAW264.7细胞。自噬体由箭头指出，并示出了三个重复实验的代表性图像。比例尺：1μm。(F)LY2874455促进底物受体p62的自噬降解。RAW264.7细胞用LPS(20ng/ml)和LY2874455(0.5,2,4μM)处理24小时，使用或不使用Wortmannin(100nM)，并通过western blot分析p62和GAPDH的蛋白质水平。(G)通过western blot检测用LY2874455(2μM)和LPS(20ng/ml)处理 24小时的RAW264.7细胞中p62和GAPDH的蛋白质水平。(H)在(G)中处理的C57BL/6J小鼠的腹膜巨噬细胞(PM)中通过western blot检测p62和GAPDH 的蛋白质水平。(I)在(G)中处理的C57BL/6J小鼠的骨髓衍生巨噬细胞 (BMDM)中通过western blot检测p62和GAPDH的蛋白质水平。(J)LY2874455 抑制AKT-mTOR信号。p-mTOR(Ser248)、mTOR、p-AKT(Ser473)、AKT和GAPDH 的蛋白质水平通过western blot在如(G)中处理的RAW264.7细胞中进行检测。
图6：(A)组成型蛋白酶体抑制剂MG132不能阻断LY2874455诱导的免疫蛋白酶体亚单位减少。RAW264.7细胞用LPS(20ng/ml)、LY2874455(2μM)和蛋白酶体抑制剂MG132(20μM)处理。通过western blot检测LMP2、LMP7和 GAPDH的蛋白质水平。(B)自噬抑制剂Wortmannin阻断了LY2874455诱导的免疫蛋白酶体亚基的减少。在用LPS(20ng/ml)、LY2874455(2μM)和自噬抑制剂 Wortmannin(100nM)处理的RAW264.7细胞中分析LMP2、LMP7和GAPDH的蛋白质水平。(C)用LY2874455处理的巨噬细胞中自噬体的定量结果如图5D所示。(D)LY2874455对自噬激活影响的模型方案。FGFRs是跨膜RTKs，被FGF 激活形成二聚体，导致下游FRS2复合物激活，随后激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。活化的mTOR随后磷酸化并抑制自噬，从而引发ULK1激酶复合物，从而抑制自噬。LY2874455抑制FGFR活性和下游PI3K/AKT/mTOR信号通路，导致自噬的释放和激活。
图7：(A)自噬缺陷导致免疫蛋白酶体亚单位水平升高。在野生型(WT) 或ATG7敲除(ATG7-KO，通过CRISPR-CAS9方法)的RAW264.7细胞中，通过western blot检测LMP2、LMP7和GAPDH的蛋白质水平。(B-C)LY2874455 不能降低自噬缺陷巨噬细胞中免疫蛋白酶体亚单位的蛋白质水平。野生型或 ATG7敲除的RAW264.7细胞单独用LPS(20ng/ml)或与LY2874455(2μM)联用24小时。western blot分析LMP2、LMP7、p62和GAPDH的蛋白质水平。(D) 免疫蛋白酶体亚单位与自噬体标记物LC3共定位。用LPS(20ng/ml)和 LY2874455(2μM)刺激表达mCherry标记的LC3和GFP标记的LMP2或LMP7 的RAW264.7细胞24小时。共聚焦荧光显微镜观察GFP-LMP2/GFP-LMP7与 mCherry-LC3的共定位。比例尺：10μm。(E)LY2874455降低选择性自噬受体p62 的蛋白质水平。RAW264.7细胞用LPS(20ng/ml)和LY2874455(2μM)处理 24h，然后通过western blot检测NBR1、Tollip、p62和GAPDH的蛋白水平。(F) 敲低p62导致免疫蛋白酶体亚基的蛋白质水平增加。LMP2、LMP7和GAPDH 的蛋白质水平通过western blot在对照shRNA或p62靶向shRNA转染的 RAW264.7细胞中检测，用LPS(20ng/ml)和LY2874455(2μM)处理24小时。(G) 免疫蛋白酶体亚单位被泛素化。表达GFP-LMP2或GFP-LMP7的RAW264.7细胞用LY2874455(2μM)处理24小时。然后用抗-GFP亲和珠对等量的蛋白质裂解物进行免疫沉淀，并用抗-GFP和抗泛素抗体通过western blot分析。(H-I)p62通过其泛素结合UBA结构域与免疫蛋白酶体亚基相互作用。表达GFP-LMP2、 GFP-LMP7和Flag标记的全长p62或截短的p62(泛素结合域UBA缺失)的 RAW264.7细胞用抗GFP亲和珠进行免疫沉淀，然后用抗GFP和抗Flag抗体进行western blot分析。
图8：(A)巨噬细胞中ATG7基因敲除的确认。ATG7基因在RAW264.7 细胞中通过CRISPR-CAS9方法被删除。培养基因缺失细胞的克隆并检测p62、 LC3、ATG7和内在对照GAPDH的蛋白质水平。(B)RAW264.7细胞中p62敲低的确认。
图9：(A)自噬抑制剂逆转LY2874455对LPS刺激的巨噬细胞ROS减少的影响。RAW264.7细胞在用LPS(20ng/ml)、LY2874455(2μM)和Wortmannin(100nm)处理24小时后用ROS-探针DCFH-DA染色。通过流式细胞术进行细胞活性氧的定量测量。(B-C)自噬抑制剂逆转LY2874455在LPS刺激的巨噬细胞中的作用。通过qRT-PCR在RAW264.7细胞中检查炎性细胞因子基因(iNOS和IL-6)的表达，如(A)处理。(D-E)通过qRT-PCR在腹腔巨噬细胞(PM)中检查炎症细胞因子IL-6和iNOS的表达，如(A)中所述。(F)自噬缺陷逆转了LY2874455在炎性巨噬细胞中的抑制作用。野生型(WT)或ATG7敲除(ATG7-KO)RAW264.7 细胞用LPS(20ng/ml)和LY2874455(2μM)处理24小时。通过qRT-PCR检查iNOS 和IL-6的表达，并显示为与WT细胞中的值相比的倍数变化。(G)p62敲低逆转了LY2874455在炎性巨噬细胞中的抑制作用。对照(sh-CTL，对照shRNA)或 p62敲低(sh-p62，p62靶向shRNA)RAW264.7细胞用LPS(20ng/ml)和LY2874455 (2μM)处理24小时。通过qRT-PCR检查iNOS和IL-6的表达，并显示为与对照细胞中的值相比呈倍数变化。(H-J)免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914抑制了自噬缺陷巨噬细胞中增强的炎症。野生型(WT)或ATG7敲除(ATG7-KO)RAW264.7 细胞用LPS(20ng/ml)和LY2874455(2μM)，加入或不加入ONX-0914(1μM)一起处理。通过qRT-PCR检查iNOS和炎性细胞因子基因(IL-6和TNF-α)的表达。
图10：(A-B)自噬抑制剂Wortmannin逆转了LY2874455对LPS刺激的巨噬细胞炎症抑制的作用。骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)用LPS(20ng/ml)、 LY2874455(2μM)和Wortmannin(100nM)处理24小时。通过qRT-PCR检查iNOS 和炎性细胞因子基因IL-6的表达。(C-F)自噬ATG7或受体p62的缺乏导致 LY2874455在抑制NF-κB因子p65(磷酸化和核易位)中的功能受阻。(C,E)从 ATG7敲除或p62敲除的RAW264.7细胞中提取总蛋白，并用于p65、磷酸化p65(p-p65)和IKK-β的蛋白质水平的western blot分析。(D，F)ATG7敲除或p62 敲除的RAW264.7细胞在有或没有LY2874455(2μM)的情况下用LPS(20ng/ml) 刺激2小时。示出了p65和细胞核(DAPI)双重免疫染色的代表性图像。比例尺： 10μm。
图11：(A)LY2874455减少LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型肺组织的炎症损伤。对两个月大的雄性C57BL/6J小鼠进行LY2874455(1mg/kg)灌胃和/或 LPS(15mg/kg)腹腔注射6小时(n＝6)。之后，收集右肺上叶进行HE染色并示出代表性图像。比例尺：100μm。(B)LY2874455抑制LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中炎性细胞因子IL-6的表达。两个月大的雄性C57BL/6J小鼠按照(A)进行处理，并通过qRT-PCR(n＝6)分析肺组织(右肺下叶)中IL-6的相对mRNA水平。 (C)对两个月大的雄性C57BL/6J小鼠进行LY2874455(1mg/kg)灌胃和/或LPS(35mg/kg)腹腔注射(n＝8)。生存测试结果以Kaplan-Meier生存曲线表示。(D)LY2874455减少右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的炎症性肠道小鼠模型的肠组织炎症性损伤。两个月大的雄性C57BL/6J小鼠接受3％DSS灌胃7天，从第三天开始灌胃LY2874455(1mg/kg)(n＝8)。通过代表性图片和量化数据显示结肠的长度。 (E)LY2874455减少了由DSS诱导的结肠炎引起的肠道损伤。用指定小鼠的结肠组织进行HE染色。示出了代表性图像(n＝8)。比例尺：100μm。(F-G)LY2874455 降低了在DSS诱导的小鼠模型中诱导的炎症细胞因子基因的水平。通过qRT-PCR 在指定小鼠(n＝8)的结肠中检查炎性细胞因子基因IL-17和TNF-α的表达。
图12：在LPS刺激等炎症条件下，免疫蛋白酶体亚单位被诱导介导炎症并最终导致促炎细胞因子的高度表达。在LY2874455的存在下， FGFR-AKT-mTOR信号轴被抑制，导致诱导自噬。免疫蛋白酶体被选择性受体 p62介导的自噬体吞噬。免疫蛋白酶体被转移到溶酶体中进行降解，从而抑制炎症反应。
实施例一
方法与材料
材料
抗体SQSTM-1/p62(ab109012),LMP2(ab3328),LMP7(ab3329), Ubiquitin(ab7780),NBR1(ab55474),ATG7(ab133528),mTOR(ab87540), PSMB10(ab183506),PSMB5(ab90867)均购自Abcam公司。GAPDH(60004-1-Ig), p65(10745-1-AP),PSMB6(11684-2-AP)购自Proteintech公司。抗体LC3(2775S), phospho-AktSer473(4060S),phospho-mTORSer2448(2971S),p70S6K(9202S), phospho-p70S6KThr421/Ser424(9204S),Akt(4685S)购买于Cell Signaling Technology。抗体PSMB7(A14771),phospho-IκB-α(Ser32)(AP0707),TRIF (A1155),MYD88(A0980),TRAF6(A16991),TAK1(A19077),TAB2(A9867)购买于ABclonal Technology。抗体phospho-NF-kB p65(Ser536)(bs-0982R)购买于 Bioss。二抗HRP-conjugated anti-rabbit(D-110058)和HRP-conjugated anti-mouse(D-110087)购买于BBI Life Sciences。Fluor-conjugated(488和594) 二抗购买于Invitrogen。脂多糖LPS(E.coli,serotype 055:B5)购买自Sigma。 H2-2’,7’-dichlorodihydrofluoresceindiacetate(二氯二氢荧光素二乙酸酯) (DCFH-DA)(S0033S)以及NO检测试剂(S0021S)购买于Beyotime。蛋白酶抑制剂购买于Sigma(Roche 11697498001)。
巨噬细胞培养及分离
在37℃，5％CO2细胞培养箱中，利用含有10％胎牛血清的 RPMI-1640(Sigma)完全培养基对RAW264.7小鼠巨噬细胞进行培养。从6-8周的 C57BL/6J小鼠中分离原代腹腔(PM)及骨髓来源巨噬细胞(BMDM)。提前3天向6-8周龄小鼠腹腔注射3％巯基乙酸，3天后取腹水和骨髓。将从腹水中分离的细胞接种在含有RPMI1640完整培养基的细胞板中，并使其粘附4-6h。贴壁细胞是腹腔巨噬细胞。将骨髓来源的细胞接种于RPMI1640完整培养基中孵育的细胞板中，并添加M-CSF(10ng/ml，Sigma)，使其粘附7天。贴壁细胞是骨髓来源巨噬细胞。
质粒构建及转染
将靶基因p62、LMP2、LMP7分别克隆到pEGFP-C1载体中。将靶基因 p62和p62△UBA分别克隆到pFlag-CMV2载体中。将靶基因LC3克隆到 pLVX-mCherry-C1中。将靶向p62序列(CCGGGTCTCTACAGATGCCAGAATCCTCGAGGATTCTGGTAGAGAGACT TTG)的sh-RNA克隆到PLKO.1载体中。将靶基因ATG7的引导RNA(gRNA) 序列(TCTGCCCACCCGCTTGACGT)克隆到PX330载体中。将敲除位点的上下游800bp的序列以及筛选基因(puro)分别克隆到pUC19载体中。根据供应商说明书，使用jetprime试剂将无内毒素质粒转染到细胞中。
活性氧检测
首先将LY2874455和/或LPS处理24小时的细胞用PBS洗涤三次，并用 10μM H2-DCFH-DA避光37℃孵育30分钟。然后用PBS洗涤细胞三次后，收集细胞，利用流式或者荧光显微镜方法进行检测。
一氧化氮检测
培养基中一氧化氮亚硝酸盐衍生物的含量依据试剂盒说明书利用Griess 反应(Beyotime)进行检测。在反应结束后，使用多功能酶标仪(Biotek)在540nm 处测量混合物的吸光度。
实时定量聚合酶链式反应
使用快速细胞/组织总RNA分离试剂盒(南京Vazyme Biotek)从细胞系、原代细胞或组织中提取总RNA。随后利用逆转录酶试剂盒(南京Vazyme)将1μ RNA反向转录成cDNA。然后说明书，使用SYBR green试剂(南京Vazyme) 将前面生成的cDNA作为模版进行实时定量聚合酶链反应(PCRs)。
蛋白酶体活性检测
利用亚基选择性荧光肽底物监测底物随时间推移的水解速率以测量单个催化亚基的催化活性。简而言之，首先使用惰性裂解缓冲液(25mM Tris PH 7.5， 100mM Nacl，5mMATP，0.2％NP40，20％甘油)制备蛋白质裂解物，并用20S 蛋白酶体测定缓冲液(20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.035％SDS，pH 8.0) 进行稀释。最后加入蛋白酶体底物在37℃下孵育2小时。底物和浓度如下： Ac-ANW-AMC(β5i，100μM)和Ac-PAL-AMC(β1i活性，100μM)。最后使用多功能酶标仪(Biotek)分别在345和445nm的激发和发射波长下测量荧光信号。
免疫印迹
用添加蛋白酶抑制剂(罗氏11697498001)的RIPA缓冲液裂解细胞或组织。根据制造商说明书，通过BCA蛋白质测定试剂盒(Sigma)对蛋白质进行定量。定量后，蛋白沉淀进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后将蛋白质转移到PVDF 膜上，然后用5％脱脂牛奶室温封闭1小时，封闭结束后4℃下孵育一抗过夜。然后将膜与二抗在室温下孵育1h。最后利用ChemidocMP成像系统(Bio-Rad) 采集的图片。
免疫沉淀
利用0.25％TX-100，1％NP-40，50mM Tris-HCl，pH 8，150mM NaCl 和1mM EDTA的缓冲液对细胞进行裂解。调整裂解物浓度和体积，并与 GFP-Beads(Shenzhen Sports LifeTechnology Company)在4℃下孵育过夜。然后，将样品在4℃下以2000rpm离心3分钟。取沉淀，用洗涤缓冲液A[50mM tris-HCl(pH 7.5),100mM氯化钠和2mM EDTA洗涤五次。将结合蛋白收集在 RIPA缓冲液(50mM Tris，pH 7.4，150mM NaCl，0.1％SDS，1％TritonX-100 和0.5％脱氧胆酸钠)中，并将沉淀的蛋白质进行SDS-PAGE电泳。
免疫荧光
首先用4％多聚甲醛将细胞固定10分钟，然后用含0.1％TritonX100的 PBS透化10分钟，并在室温下用含有3％BSA的PBS孵育1小时。封闭后，一抗孵育，然后进行PBS洗涤并与二抗(驴抗小鼠和抗兔Alexa Fluor 488或594) 孵育。最后利用DAPI对细胞核进行染色。最后使用蔡司LSM 880进行图像采集。
动物实验
所有涉及动物的程序均按照相关准则和规定进行，并经四川大学伦理委员会批准。
急性肺损伤
将8周龄雄性小鼠随机分为3组(对照组，LPS(10mg/kg)组，LPS(10mg/kg) +LY2874455(1mg/kg)组，每组6只小鼠。为了验证LY2874455对LPS诱导的肺损伤的影响，在LPS注射(15mg/kg)的同时，用生理盐水或LY2874455(1mg/kg) 给小鼠灌胃给药。LPS注射六小时后，处死小鼠并取出肺。随后将肺组织用于定量实时荧光定量PCR测定、蛋白质印迹测定和苏木精伊红(HE)染色。
脓毒血症
将8周龄的雄性小鼠随机分为3组，每组8只小鼠。为了评估LY2874455 对小鼠存活的影响，在注射LPS前2小时灌胃给予LY2874455(1mg/kg)，然后通过单次腹腔注射内毒素(LPS，35mg/kg)诱导脓毒血症。结果发现接受 LY2874455处理的动物存活率增高。
结肠炎
从第0天开始，在饮用水中添加3％葡聚糖硫酸钠(DSS；m.w.36，000-50， 000；MPBiomedicals，Solon，OH)对小鼠进行喂养。在DSS处理的第三天，小鼠接受生理盐水或LY2874455(1mg/kg)灌胃处理5天。此后，给老鼠正常饮用水。在整个实验过程中每天测量体重。然后处死小鼠并获取其肠道。最后将肠组织用于定量实时荧光定量PCR测定，蛋白质印迹测定和苏木精伊红(HE)染色。
透射电子显微镜
将处理后的巨噬细胞用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤三次，每次15分。在 2％四氧化锇水溶液中固定1小时，然后用去离子水洗涤三次，每次15分钟。将样品用2％乙酸铀酰染色30分钟，并通过梯度乙醇(50％-100％)和100％丙酮分别脱水15分钟。之后，将样品包埋在EPON 812树脂中，分别在37℃、45℃和60℃下固化24小时。采用超薄切片机制备超薄(70nm)切片，并用2％乙酸铀酰和0.3％柠檬酸铅染色。使用Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜(FEI公司) 采集样品的电子显微镜图像。
数据分析
本发明示出的所有数据均为来自至少三个独立重复实验的代表性结果。定量数据表示至少三个生物重复±SD的平均值。使用Prism5进行统计分析。使用具有Turkey多重比较检验的普通单向或双向方差分析，或双尾成对或不成对的t检验分析来确定统计显著性(*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，NS：无统计差异)。
结果
泛FGFR抑制剂LY2874455有效抑制LPS刺激的巨噬细胞的炎症
本实施例在LPS处理的巨噬细胞系RAW264.7中筛选了对炎症具有潜在抑制作用的化学物质。在炎症期间，NO生成水平会增加，因此通过测量NO水平，本发明团队确定LY2874455是最有效的抗炎化学物质(展示了包括 LY2874455在内的27种化学物质)(图2A)。LY2874455((R)-(E)-2-(4- (2-(5-(1-(3,5-二氯吡啶-4-基)乙氧基)-1H-吲唑-3基)乙烯基)-1H-吡唑-1- 基)乙醇(图1A)是一种新型泛-FGFR抑制剂，本发明发现，除了抑制LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中NO的生成外(图1B)，LY2874455也降低了LPS 刺激的RAW264.7中活性氧(ROS，通过DCFH-DA染色显示)的水平(图1C， D)。形态学上，LY2874455逆转了RAW264.7巨噬细胞从细长型(炎症状态) 到圆形(停滞型)(图1E)。LPS在RAW264.7中显著诱导促炎细胞因子水平，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)，LY2874455完全逆转了这种效应(图1F，G)。与LY2874455导致的NO生成抑制一致，通过LY2874455 处理的RAW264.7中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA和蛋白质水平显著降低(图1H，I)。在从小鼠(图2B-I)获得的腹腔巨噬细胞(PM)和骨髓源性巨噬细胞(BMDM)以及人类THP-1单核细胞(图2J，K)中反复观察到LY2874455 的炎症抑制作用。NF-κB信号是一种典型的促炎症调节因子，介导各种炎症细胞因子的诱导。含有IKK-α、IKK-β和IKK-γ的IκB激酶(IKK)复合物激活炎症转录因子NF-κB。IKK-β磷酸化抑制性IκBα以促进其泛素化和蛋白酶体降解，然后经典的p65/p50异源二聚体被释放到细胞核并介导NF-κB靶基因转录，其中包括各种细胞因子。LY2874455使LPS诱导的RAW264.7中IKK-β的蛋白水平减少(图1J)。在LPS刺激的RAW264.7中，p65(磷酸化)的激活形式及其向细胞核的易位也被LY2874455逆转(图1K，L)。综上所述，这些结果表明泛-FGFR 抑制剂LY2874455有效抑制LPS刺激的巨噬细胞的炎症反应。
LY2874455降低了LPS刺激的巨噬细胞中免疫蛋白酶体的蛋白质水平
为了确定LY2874455如何从分子层面来抑制炎症反应，对经LPS和 LY2874455处理的RAW264.7巨噬细胞进行了基于质谱的蛋白质组学分析(图 3A，上图)。改变蛋白质的聚集表明，LY2874455处理可下调免疫蛋白酶体特异性亚单位(图3A下，箭头所示)。免疫蛋白酶体是20s组成性蛋白酶体的一种特殊亚型，通过将20s蛋白酶体的β1、β2和β5亚基替换为不同的对应物，即β1i (低分子量多肽2，LMP2)，可快速形成β2i(多催化内肽酶复合物样-1，MECL-1，也称为LMP10)和β5i(低分子量多肽2，LMP7)。在LPS刺激等炎症条件下，免疫蛋白酶体特异性亚单位β1i/LMP2、β2i/MECL-1/LMP10和β5i/LMP7取代了 20s蛋白酶体的原始β1、β2和β5亚单位，导致免疫蛋白酶体的形成(如图3B、 C所示)。通过观察免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914有效阻断p65的核移位，证实了免疫蛋白酶体在NF-κB途径中的功能(图4A)。免疫蛋白酶体在NF-κB途径中的功能被认为不通过降解p-IκB-α实现(图4B)。相反，免疫蛋白酶体可能通过调节促进IκB-α磷酸化的上游信号步骤在NF-κB途径中发挥作用(图4B， C)。免疫蛋白酶体在调节NF-κB途径中的确切机制尚不清楚。本发明团队通过检测NF-κB通路中的组分功能，分析了LY2874455或ONX-0914存在时的NF-κB 通路。结果表明，LY2874455和ONX-0914同样导致TRAF6和TAK1的蛋白质水平降低，而对其他成分没有影响(图4C、D、E)。这些结果表明，免疫蛋白酶体可能调节NF-κB途径中的TRAF6-TAK1通路(TRAF6-TAK1 phase)。此外， LY2874455和ONX-0914的相同作用表明，LY2874455通过免疫蛋白酶体抑制炎症途径。
本发明团队证实了蛋白质组学的结果，并揭示了LY2874455确实降低了 LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中免疫蛋白酶体亚单位LMP2、LMP7和LMP10 的蛋白质水平(图3D)。相反，组成性蛋白酶体亚单位的蛋白质水平(PSMB1、 PSMB2和PSMB5)在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中不受LY2874455的影响(图3E)。在从小鼠分离的腹腔巨噬细胞(PM)中也获得了类似的结果(图3F，G)。此外，LPS中免疫蛋白酶体亚单位(LMP2和LMP7)的催化活性刺激RAW264.7巨噬细胞，也被LY2874455减少(图3H)。本团队证实ONX-0914能有效抑制LPS刺激的RAW264.7中的炎症反应。通过检测促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达来检测巨噬细胞(图3I，J)。LY2874455的额外加入并没有进一步抑制ONX-0914治疗的巨噬细胞的炎症(图3I，J)。这一结果表明，LY2874455 通过免疫蛋白酶体抑制抑制炎症，可能是通过降低免疫蛋白酶体的蛋白质水平介导的。
LY2874455激活自噬
本发明团队尝试确定LY2874455降低免疫蛋白酶体亚单位(相当于免疫蛋白酶体)蛋白质水平的机制，因为它们的mRNA水平不受LY2874455处理的影响。泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体系统被认为是细胞降解的两种机制。在两种细胞内降解途径(蛋白酶体途径和自噬途径)中，大底物通常是自噬降解的靶点。本团队使用蛋白酶体抑制剂MG132、自噬抑制剂氯喹(CQ)和渥曼宁(wortmannin) 阻断这两种降解途径，然后分析免疫蛋白酶体亚单位的蛋白质水平。Western blot 分析表明，MG132不能抑制LY2874455诱导的LMP2和LMP7的减少(图5A 和图6A)，而LY2874455诱导的减少被CQ或wortmannin显著逆转(图5B、C 和图6B)。因此，该结果表明LY2874455诱导的免疫蛋白酶体降解比泛素-蛋白酶体系统更依赖于自噬。
这些结果也表明LY2874455可以诱导自噬。通过测量融合蛋白 mCherry-EGFP-LC3的斑点信号进行自噬通量测定。LY2874455诱导的高强度 mCherry信号和低GFP信号表明LY2874455激活自噬(图5D)。透射电镜显示用LY2874455处理的RAW264.7巨噬细胞比对照细胞中有更多的自噬体(图5E 和图6C)。p62/SQSTM1是一种自噬受体，它将底物(通常为泛素化底物)招募到自噬体中，并在自噬体与溶酶体融合后与底物一起降解。在未添加Wortmannin 的分组中，随着LY2874455添加量的增加，p62的蛋白质水平逐渐降低(图5F)。LPS刺激导致p62的积累(图5G)，表明LPS阻断自噬，这与LPS降低自噬通量的观察结果一致(图5D，LPS细胞中的黄色信号)。LY2874455有效降低LPS 刺激的RAW264.7中p62的蛋白质水平(图5G)。在从小鼠分离的腹腔巨噬细胞 (PM)和骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中，LY2874455也降低了p62的蛋白质水平(图5H，I)。这些结果证实了LY2874455在激活自噬中的作用。
FGFRs是跨膜RTK，被FGF激活形成二聚体，导致下游FRS2复合物激活，随后激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。活化的mTOR随后磷酸化并抑制自噬启动ULK1激酶复合物，从而抑制自噬。本发明揭示了LY2874455降低了 AKT-mTOR信号的水平，示出了低水平的mTOR和AKT磷酸化(图5J)。这种LY2874455介导的对AKT-mTOR信号通路的抑制进一步表明了其激活自噬的能力。LY2874455抑制FGFR活性和下游PI3K/AKT/mTOR信号通路，导致自噬的释放和激活(如图6D所示)。
LY2874455通过自噬和选择性受体p62促进免疫蛋白酶体的降解
为了进一步验证LY2874455通过自噬促进免疫蛋白酶体降解的作用，在 RAW264.7细胞中敲除了自噬中的关键基因ATG7，导致自噬受阻、p62增加和激活型LC3(LC3-II)缺乏(图8A)。然后，分析免疫蛋白酶体亚单位LMP2和 LMP7的蛋白质水平。在ATG7敲除(ATG7-KO)的RAW264.7细胞中，与WT 细胞相比，LMP2和LMP7的蛋白质水平增加(图7A)。虽然在WT细胞中 LY2874455使LMP2和LMP7的蛋白质水平降低了，但这种效应在ATG7-KO细胞中被消除(图7B，C)。本发明团队检测了自噬体和免疫蛋白酶体的定位。结果显示自噬体标记物(LC3点)与LMP2和LMP7共定位(图7D)。总之，这些结果表明LY2874455通过自噬诱导免疫蛋白酶体的选择性捕获和降解。
一般情况下，底物选择性靶向自噬体是由受体介导的，通过进一步分析已经研究的三种受体，发现p62的行为与RAW264.7细胞中的LMP2和LMP7 相似，LPS处理增加，LY2874455进一步处理减少(图7E)。敲低RAW264.7细胞中的p62导致LMP2和LMP7蛋白水平升高(图7F和图8B)。这些结果表明 p62是免疫蛋白酶体自噬降解的受体蛋白。底物泛素化是自噬受体p62选择性靶向所必需的。事实上，LMP2和LMP7是泛素化的(图7G)。此外，LMP2和LMP7 可以与p62相互作用，这种相互作用依赖于p62的UBA结构域(泛素结合的泛素相关结构域)(图7H，I)。因此，这些结果表明p62是介导免疫蛋白酶体自噬降解的受体。
LY2874455通过自噬途径抑制炎症
本试验旨在检测LY2874455对炎症的抑制作用是否通过自噬途径发生。 LPS诱导的RAW264.7细胞中ROS水平升高(通过DCFH-DA探针显示)被 LY2874455消除，然而，这种消除被自噬抑制剂wortmannin阻断(图9A)。此外，在wortmannin处理的RAW264.7细胞(图9B、C)、小鼠分离的原代巨噬细胞(图9D、E)和骨髓来源的巨噬细胞(图10A、B)中观察到iNOS和IL-6的 mRNA水平增加。这些结果表明LY2874455通过自噬抑制炎症。在LPS和 LY2874455存在的情况下，ATG7敲除或p62敲除导致iNOS和IL-6水平升高的观察进一步证实了这一结果(图9F，G)。LY2874455对NF-κB通路的抑制作用也依赖于自噬和受体p62，正如在自噬或p62缺陷的巨噬细胞中一样，LY2874455 不能抑制NF-κB通路(图10C-F)。
加上数据显示LY2874455诱导免疫蛋白酶体的自噬降解，这些结果表明自噬缺陷细胞中的炎症增加可能是由自噬底物免疫蛋白酶体的积累引起的。然后使用免疫蛋白酶体特异性抑制剂ONX-0914治疗ATG7-KO RAW264.7细胞，然后分析诱导型一氧化氮合酶、促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平。结果表明，免疫蛋白酶体抑制剂ONX-0914可显著降低自噬缺陷细胞的炎症反应(图 9H-J)。
因此，这些结果表明LY2874455对炎症的抑制作用依赖于诱导免疫蛋白酶体的自噬降解。
LY2874455在小鼠模型中抑制肺和肠道炎症
在证明了LY2874455在细胞水平上对炎症的抑制作用后，本发明团队随后分析了LY2874455是否会影响脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤和败血热以及右旋糖酐硫酸钠(DSS)诱导的炎症性肠病小鼠模型。LPS刺激的小鼠肺部组织学检查显示大量的炎性细胞浸润，这是肺部炎症的典型症状(图11A)。值得注意的是，LY2874455减少了炎性细胞浸润(图11A)。LPS诱导的小鼠肺组织中高水平的促炎细胞因子IL-6也被LY2874455显著降低(图11B)。此外，还检测了LPS刺激的小鼠在接受或不接受LY2874455治疗的情况下的存活情况。对照组的存活率为100％，但LPS处理组的存活率显著下降，而LY2874455治疗组的存活率显著增加(图11C)。这些结果表明，LY2874455抑制了LPS诱导的急性肺损伤和败血症小鼠的炎症反应，并促进了LPS刺激小鼠的存活。
此外，分析LY2874455在使用DSS诱导的结肠炎模型小鼠中的潜在胃肠保护作用。结果表明，LY2874455显著改善了DSS刺激小鼠结肠长度的减少(图 11D)。为了证实LY2874455对肠道炎症和组织损伤的影响，对小鼠结肠切片进行组织学检查。DSS对肠绒毛粘膜造成严重损伤，LY2874455治疗有效地减少了组织损伤(图11E)。LY2874455治疗的小鼠结肠组织中的促炎细胞因子IL-17 和TNF-α的表达水平降低(图11F，G)，这表明LY2874455对结肠炎模型小鼠的炎症有抑制作用。
综上所述，这些体内实验结果证实了LY2874455对炎症的抑制作用，以及LY2874455介导的免疫蛋白酶体更新的促进作用。
讨论
现目前，选择性自噬精确调节炎症的潜在的机制没有被完全研究透彻。在本发明中，研究团队揭示了泛-FGFR(pan-FGFR)抑制剂LY2874455在炎症抑制中的作用和机制(图12)。在LPS刺激的巨噬细胞中，免疫蛋白酶体被诱导，然后触发NF--κB介导的炎症反应，导致促炎细胞因子、ROS和NO的强烈表达和产生(图12，左图)。在LY2874455存在的情况下，自噬途径被激活，诱导自噬体靶点并捕获免疫蛋白酶体，这种效应由识别免疫蛋白酶体上的泛素信号的选择性受体p62介导。这种自噬降解降低了免疫蛋白酶体的数量，从而阻断了NF-κB的活性，并最终抑制了炎症(图12，右图)。通过上述发明，本发明实质上揭示了一种自噬抑制炎症的新机制，可能极大地促进炎症疾病新治疗方法的发展。
此外，目前尚不清楚免疫蛋白酶体的诱导和自噬降解是如何协调的。本发明假设LPS等炎症刺激可能诱导免疫蛋白酶体的表达、组装和数量增加，而 LPS抑制自噬途径，如受体p62的蛋白水平增加所示(图5F-I)。这一结果表明， LPS不仅诱导免疫蛋白酶体的产生，而且还抑制其自噬降解，从而导致免疫蛋白酶体的积累，最终导致严重的炎症。免疫蛋白酶体诱导的高水平炎症提供了有效的信号，提醒宿主有毒性刺激，从而激活宿主反应。然而，宿主受益于强烈的炎症诱导信号，同时也遭受炎症诱导的损伤，尤其是在严重/急性或慢性炎症条件下。因此，虽然中度和可控炎症之间的平衡对于维持宿主健康至关重要，但本发明提供的技术方案对控制严重的炎症具有指导意义。
在各种情况下，选择性自噬的功能是通过受体实现的，这些受体特异性识别特定类型的底物。底物的降解主要表明自噬的特定作用。自噬基质的性质因细胞类型和刺激信号而异。在本发明的实施例中，通过自噬选择性靶向免疫蛋白酶体解释了自噬对巨噬细胞炎症的抑制作用。自噬阻断诱导免疫蛋白酶体的积累，伴随着强烈的炎症反应，免疫蛋白酶体抑制剂可以完全逆转这一结果，该结论得到了证实(图9H-J)。这一结果表明，免疫蛋白酶体的自噬降解主要是自噬在炎症抑制中的作用。
如本研究所示，介导免疫蛋白酶体自噬降解的受体是p62，而不是NBR1 或Tollip。实际上存在多种自噬受体，受体的多样性可能反映了多细胞生物体自噬的特异性和精细调控。换句话说，某些受体只能在特定的细胞类型中发挥作用。明确自噬作用的细胞类型，自噬的状态以及其底物可以提高对自噬作为动态和多功能过程的了解。免疫蛋白酶体亚单位能够被多泛素化，它们依赖于p62的泛素结合结构域从而与p62的结合，这表明泛素链是自噬体靶向免疫蛋白酶体的信号。明确负责免疫蛋白酶体泛素化的泛素连接酶可以有助于明确泛素连接酶是如何直接或间接促进p62对免疫蛋白酶体的特异性识别。
综上所述，本发明的结论描述了巨噬细胞异常炎症背景下免疫蛋白酶体的选择性自噬降解(图12)，并支持通过选择性自噬调节炎症的新机制。这些数据扩展了对自噬的理解，更重要的是，探索了选择性自噬和炎症之间的相互作用，这对于建立有效的炎症性疾病治疗方法是有意义的。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (11)

1.泛-FGFR抑制剂在制备抗炎药中的应用，其特征在于，所述泛-FGFR抑制剂可以抑制细胞炎症，所述泛-FGFR抑制剂为(R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-二氯吡啶-4-基)乙氧基)-1H-吲唑-3基)乙烯基)-1H-吡唑-1-基)乙醇。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗炎药可用于急性肺损伤炎症反应、败血症炎症反应和炎症性肠胃病。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述泛-FGFR抑制剂通过激活细胞选择性自噬反应来促进免疫蛋白酶体降解以抑制炎症。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述泛-FGFR抑制剂抑制FGFR活性和下游PI3K/AKT/mTOR信号通路，导致所述选择性自噬的激活。
5.一种抗炎药，其特征在于，包含泛-FGFR抑制剂和免疫蛋白酶体抑制剂，所述泛-FGFR抑制剂为(R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-二氯吡啶-4-基)乙氧基)-1H-吲唑-3基)乙烯基)-1H-吡唑-1-基)乙醇；所述免疫蛋白酶体抑制剂为ONX-0914。
6.如权利要求5所述的抗炎药，其特征在于，所述抗炎药还包含药学上允许添加的辅料和/或助剂。
7.如权利要求5所述的抗炎药，其特征在于，所述抗炎药可用于急性肺损伤炎症反应、败血症炎症反应和炎症性肠胃病。
8.泛-FGFR抑制剂在制备细胞炎症检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒至少还包含一种脂多糖，所述泛-FGFR抑制剂可以是(R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-二氯吡啶-4-基)乙氧基)-1H-吲唑-3基)乙烯基)-1H-吡唑-1-基)乙醇。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒可用于检测细胞的炎症水平，所述细胞包括单核巨噬细胞、腹腔巨噬细胞和/或骨髓源性巨噬细胞。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒可以通过检测细胞中的NO、ROS和/或促炎细胞因子的含量水平来判断细胞炎症的程度。
11.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒可以通过检测细胞的形态来判断细胞是否有炎症。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210322404A1 (en) * 2016-10-13 2021-10-21 Eth Zurich Fgfr regulation for the treatment of viral infections

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210322404A1 (en) * 2016-10-13 2021-10-21 Eth Zurich Fgfr regulation for the treatment of viral infections

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUANG, YUEYUE等: "Inhibition of Fibroblast Growth Factor Receptor by AZD4547 Protects Against Inflammation in Septic Mice", INFLAMMATION, vol. 42, no. 6, 18 July 2019 (2019-07-18), pages 1957 - 1967, XP036942247, DOI: 10.1007/s10753-019-01056-4 *
MICHAEL BASLER; ... ET. AL: "Prevention of Experimental Colitis by a Selective Inhibitor of the Immunoproteasome", JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 185, no. 1, 1 July 2010 (2010-07-01), pages 634 - 641, XP055028447, DOI: 10.4049/jimmunol.0903182 *
谢静文;刘群鹏;郑智伟;陈潜;李物兰;吴建章;仇佩虹;: "FGFR抑制剂的研究进展", 生物产业技术, no. 05, 15 September 2018 (2018-09-15), pages 52 - 68 *

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